Đồ án tốt nghiệp: Cải thiện điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens SH1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SERRATIA MARCESCENS SH1 VÀ PHƯƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƯỜNG”.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương

Sinh viên thực hiện

: Hồ Thị Bích Phương

MSSV: 1151100246 Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi đƣợc thực hiện tại phòng

thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, trƣờng đại học Công

nghệ TP.Hồ Chí Minh. Các số liệu và kết quả là trung thực, chƣa ai công bố.

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về lời cam đoan của mình trƣớc quý thầy cô

và nhà trƣờng.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8, năm 2015

Sinh viên thực hiện

Hồ Thị Bích Phƣơng

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Tận đáy lòng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ đã gian lao nuôi

dạy con thành ngƣời và là ngƣời thầy đầu đời của con. Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững

chắc nhất của con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã, là nguồn động

viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống.

Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Khoa

Công nghệ sinh học – Môi trƣờng – Thực phẩm, cùng toàn thể Thầy Cô Trƣờng Đại

học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những

kiến thức quý báu về cơ sở ngành cũng nhƣ chuyên ngành từ ngày em bƣớc chân vào

giảng đƣờng đại học.

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hƣơng ngƣời đã luôn tận

tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực nghiệm của

đồ án.

Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng

đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công

nghệ sinh học - Môi trƣờng – Thực phẩm, Trƣờng Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí

Minh.

Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH04 và các bạn làm đồ án tại phòng thí nghiệm

Khoa Công nghệ sinh học - Môi trƣờng – Thực phẩm đã luôn khích lệ, động viên và

giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trƣờng và trong quá trình làm đồ án tốt

nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn!

TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015

SVTH: Hồ Thị Bích Phƣơng

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. v

DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... vi

MỤC LỤC BẢNG ................................................................................................ viii

LỜI MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 9

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 12

1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ........................................................... 12

1.1.1. Hợp chất thứ cấp .......................................................................................... 12

1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật .............. 12

1.2 Tổng quan prodigiosin ...................................................................................... 15

1.2.1. Khái niệm về prodigiosin ............................................................................. 15

1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin .......................................................... 16

1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin .............................................................. 18

1.3. Tổng quan về Serratia marcescens .................................................................... 24

1.3.1. Phân loại Serratia marcescens ..................................................................... 24

1.3.2. Đặc điểm của Serratia marcescens ............................................................. 25

1.3.4 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens ............................ 29

1.3.5 Tổng quan về quorum sensing trong S. marcescens ..................................... 31

1.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin ....................................................................... 32

1.4.1. Cơ chế tổng hợp prodigiosin ........................................................................ 32

1.4.2. Yếu tố ảnh hƣởng đến tổng hợp prodigiosin................................................ 34

i

Đồ án tốt nghiệp

1.4.3. Điều kiện tổng hợp prodigiosin .................................................................... 38

1.4.4. Thu nhận, tinh sạch và định lƣợng prodigiosin............................................ 39

1.5 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens ................................... 42

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU45

2.1. Thời gian và địa điểm .......................................................................................... 45

2.1.1. Thời gian ...................................................................................................... 45

2.1.2. Địa điểm ....................................................................................................... 45

2.2. Vật liệu ................................................................................................................ 45

2.2.1. Nguồn vi sinh vật ......................................................................................... 45

2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất sử dụng .................................................... 45

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 46

2.4 Bố trí thí nghiệm .................................................................................................. 47

2.5.1 Khảo sát chủng nuôi cấy ................................................................................... 49

2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết ................................................................................. 49

2.5.2 Kháng sinh đồ ............................................................................................... 49

2.6 Xác định điều kiện lên men .................................................................................. 49

2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc trong nuôi cấy .............................................................. 52

2.7.2 Xác định pH tối ƣu cho môi trƣờng lên men ................................................ 53

2.7.3 Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl .......................................... 53

2.7.4 Khảo sát sự ảnh hƣởng của phƣơng pháp đồng nuôi cấy ............................ 54

2.7.5 Khảo sát sự ảnh hƣởng của sản phẩm Quorum sensing................................ 55

2.8 Thu hồi sản phẩm thô ........................................................................................... 56

ii

Đồ án tốt nghiệp

2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung môi đồng thời khảo sát thể tích lên men .......... 56

2.8.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ ......................................... 56

2.9 Các phƣơng pháp phân tích .................................................................................. 56

2.9.1 Xác định protein có trong mẫu ...................................................................... 57

2.9.2 Xác định lipid có trong mẫu .......................................................................... 57

2.10 Sắc ký bản mỏng TLC........................................................................................ 57

2.11 Phƣơng pháp phân tích ....................................................................................... 59

2.11.1. Phƣơng pháp định lƣợng hợp chất prodigiosin .......................................... 59

2.11.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê ........................................................... 59

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 60

3.1 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết ........................................................................... 60

3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin ........................................................ 65

3.2.1 Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp ........ 65

3.2.2 Xác định vận tốc lắc ...................................................................................... 67

3.2.3 Kết quả xác định pH tối ƣu cho môi trƣờng MT3 ........................................ 69

3.2.4 Ảnh hƣởng của nồng độ muối lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp ............ 71

3.2.5 Kết quả thí nghiệm đồng nuôi cấy ................................................................ 73

3.2.6 Sử dụng dịch trong nuôi cấy ......................................................................... 76

3.3 Thu hồi sản phẩm lên men từ canh trƣờng ........................................................... 77

3.3.1 Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng: dung môi trích ly lên hàm lƣợng

prodigiosin thu hồi ................................................................................................. 77

3.3.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia nhiệt canh trƣờng .................................. 78

iii

Đồ án tốt nghiệp

3.4 Xác định thành phần hóa học trong mẫu .............................................................. 84

3.4.1. Phản ứng Biuret’s test .................................................................................. 84

3.4.2 Xác định lipid có trong mẫu .......................................................................... 86

3.5 Sắc ký bản mỏng TLC .......................................................................................... 88

Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 91

4.1 Kết luận ............................................................................................................. 91

4.2 Kiến nghị .......................................................................................................... 92

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 93

PHỤ LỤC ................................................................................................................. 1

iv

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

EPN: Entomopathogenic nematodes

OD: mật độ quang (Optical Density)

λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại

TLC: Thin Layer Chromatogarphy

v

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) .............................................. 19

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học prodigiosin (Krishna,2008) ............................................... 20

Hình 1.3. Cơ chế kháng tế bào ung thƣ của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011) 23

Hình 1.4. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) ................. 29

Hình 1.5. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở 250C sau

48 giờ (David, 2012) ..................................................................................................... 28

Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC

39.600, Sma 274 và các cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử

Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001) ........................................ 35

Hình 1.7. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi

Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009) ........................................... 37

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ................................................................................... 51

Hình 2.2 Sơ đồ trích ly .................................................................................................. 54

Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký ..................................................................... 61

Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuôi cấy trên môi trƣờng NA ..................................... 63

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng và soi nghiêng dƣới kính hiển vi vật kính 10X

...................................................................................................................................... .64

Hình 3.3 Kết quả nhuộm Gram chủng SH1 .................................................................. 65

Hình 3.4 Kết quả kháng kháng sinh của chủng SH1 .................................................... 65

vi

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp ........ 69

Hình 3.6 Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc ............................................ 71

Hình 3.7 Ảnh hƣởng của pH lên sự tổng hợp prodigiosin của S. marcescens SH1. .... 73

Hình 3.8 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung NaCl. ....................................... 75

Hình 3.9 Đồng nuôi cấy Serratia marcescens SH1 và Bacillus sp. .............................. 77

Hình 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy E. coli ...................................................................... 78

Hình 3.11. Hàm lƣợng prodigiosin thu hồi sau trích ly nhờ tỷ lệ canh trƣờng: dung môi

khác nhau....................................................................................................................... 81

Hình 3.12 Canh trƣờng sau khi ly tâm .......................................................................... 82

Hình 3.13. Sắc tố đỏ sau khi trích ly với dung môi Etanol:HCl (95:5) ........................ 83

Hình 3.14. Vi khuẩn S. marcescens đƣợc cấy trên môi trƣờng NA. ............................. 84

Hình 3.15. Hàm lƣợng prodigiosin so với đối chứng. .................................................. 85

Hình 3.16. Kết quả quét quang phổ của sắc tố canh trƣờng không đun và đun 1000C 86

Hình 3.17 Biuret’s test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thô 87

Hình 3.18 Ninhydrin test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thô

ở thí nghiệm đun và không đun canh trƣờng. ............................................................... 88

Hình 3.19. Kết quả mẫu phản ứng Coomassie brilliant blue trƣớc và sau khi phun thuốc

thử. ................................................................................................................................. 90

Hình 3.20. Kết quả sắc ký bản mỏng sử dụng hệ dung môi Petrolium ether: Ether :

Acetic acid (70 : 40 : 2, v : v :v).................................................................................... 92

Hình 3.21 Sơ đồ quy trình S. marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin...........................93

vii

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật ............... 15

Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) .. 19

Bảng 1.3. Các sản phẩm prodigiosin thƣơng mại hóa (Santa Cruz Biotechnology,

Merck Millipore, Biovision incorporated).....................................................................25

Bảng 1.4. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010) 29

Bảng 1.5. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các

môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009). ....... 40

Bảng 2.1. Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của máy lắc và chế độ lắc. ........................ 55

Bảng 3.1 Kết quả kháng kháng sinh ............................................................................. 66

Bảng 3.2 % Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp so với đối chứng (thí nghiệm A) ........ 69

Bảng 3.3. Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc. ......................................... 70

Bảng 3.4 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu .................................................... 73

Bảng 3.5 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung muối NaCl ............................... 75

Bảng 3.6. % prodigiosin tổng hợp so với đối chứng ..................................................... 77

Bảng 3.7. Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp khi bổ sung dịch nuôi cấy. ...................... 79

Bảng 3.8. % Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng : dung môi trích ly .............................. 80

Bảng 3.9. Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong thí nghiệm ........................................ 84

Bảng 3.10. Kết quả xác định protein và lipid ............................................................... 91

viii

Đồ án tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn nhƣ thực vật, vi sinh vật, động vật

có xƣơng sống và không xƣơng sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất hoạt

tính sinh học. Một số lƣợng lớn các loại thuốc đã đƣợc phát triển trong ngành y từ

các sản phẩm tự nhiên. Kể từ khi phát hiện và thành công trong việc điều trị của

peniciline, các vi sinh vật đã đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn đặc biệt của các tác nhân

hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng. Các ứng dụng điều trị của các chất chuyển

hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát hiện ra kháng sinh (ví dụ

peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy ghép, các tác nhân giảm

cholesterol (ví dụ lovastain và mevastatin) và tác nhân chống ung thƣ (ví dụ

doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin).

Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đƣợc

chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ,… đã đƣợc sử dụng trong việc làm thuốc đông y,

mỹ phẩm, thực phẩm,... Nhƣng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đã đƣợc nghiên

cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng nhƣ cách tổng hợp bằng phƣơng pháp hóa học,

bởi ngƣời ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên quy mô lớn và chi phí sản

xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng xấu đến sức

khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu đƣợc chú ý đến. Chính vì

thế so với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh

vật ngày càng đƣợc quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên

và an toàn dễ sử dụng, sản xuất đƣợc quanh năm trong các điều kiện địa lý khác

nhau và do sự tăng trƣởng nhanh chóng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời gian sản

xuất xuống còn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc động vật

thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật có thể dễ dàng đƣợc kiểm soát và dự đoán sản

9

Đồ án tốt nghiệp

lƣợng (Francis, 1987; Taylor, 1984). Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì hợp chất

prodigiosin đƣợc biết đến với ý nghĩa quan trọng.

Một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp

sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene)

(C20H25N30 = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996;

Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005).

Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu

nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều quan tâm do khả năng sử

dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lãnh vực bảo vệ thực vật cũng nhƣ hoạt

chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và

cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự,

1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997).

Sớm nhận thấy đƣợc lợi rất quan trọng của hợp chất prodigiosin đƣợc tách từ

việc nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, Nguyễn Hoàng Anh Kha đã thu nhận sắc

tố đỏ prodigiosin từ việc nuôi cấy trong môi trƣờng peptone glycerol đạt 10,575 mg/ml

sắc tố ( ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2014). Sau đó ĐATN Trần Lâm Tú Quyên

(2014) đã khảo sát trong quá trình lên men thu prodigiosin, môi trƣờng huyền phù

đậu phộng MT1 (10%) cho hàm lƣợng prodigiosin là 248,4% so với môi trƣờng

peptone glycerol là 100%. Cũng trong ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) kết luận môi

trƣờng MT3 chứa 10% huyền phù đậu phộng 5% pepton và 1% dầu hƣớng dƣơng, tỉ

lệ cấy giống 3%, lắc 180 vòng phút trong 24 giờ đầu sau đó giảm còn 150 vòng/phút

là môi trƣờng và điều kiện tối ƣu nhất để tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin. Nhƣng quá

trình lên men còn ở quy mô sản xuất nhỏ 20 ml/bình và còn nhiều yếu tố cần cải thiện.

Dựa trên cơ sở này đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Serratia

mercescens SH1 VÀ PHƢƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ

CANH TRƢỜNG” đƣợc tiến hành nhằm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp.

10

Đồ án tốt nghiệp

2. Mục tiêu đề tài

Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, cũng nhƣ

phƣơng pháp thu hồi sắc tố thô.

3. Nội dung đề tài

Khảo sát chủng Serratia marcescens xem xét độ thuần khiết, khảo sát kháng

sinh đồ.

Cải tiến điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin: tăng thể

tích lên men, ảnh hƣởng của vận tốc lắc, pH nuôi cấy, nồng độ muối % NaCl, thử áp

dụng phƣơng pháp đồng nuôi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung dịch nuôi

cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing.

Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thô từ canh trƣờng nuôi cấy.

4. Ý nghĩa khoa học

Áp dụng các kiến thức về công nghệ lên men sản xuất hợp chất thứ cấp vào tổng

hợp prodigiosin.

Xem xét khá năng sử dụng chủng Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến

trùng EPN vào sản xuất prodigiosin qua kháng sinh đồ khác biệt với chủng phân lập từ

bệnh phẩm.

Góp phần vào việc tăng quy mô và nồng độ sản phẩm prodigiosin tổng hợp

bằng phƣơng pháp lên men.

5. Ý nghĩa thực tiễn

Cung cấp sản phẩm prodigiosin thô cho nghiên cứu tinh sạch và khảo sát hoạt

tính sinh học.

11

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

1.1.1. Hợp chất thứ cấp

Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lƣợng phân

tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ

sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trƣờng xung quanh.

Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ quá

trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp.

1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử

sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự

quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các

thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp, đƣợc xem là

tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực vật hoặc vi sinh

vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến

cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên

có tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống oxy hóa. Ngành công nghiệp

hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ

phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản

xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh

12

Đồ án tốt nghiệp

vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin,

quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse,

2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn

giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình

công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997).

Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất

cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams và

cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter,

Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp

(Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kìm

hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật nhƣ nấm mốc, xạ khuẩn và vi

khuẩn tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ

cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt

về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật.

Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật

Vi sinh vật Hợp chất thứ cấp Ứng dụng Kiểu tác động ức chế

Penicillium Penicillin Ức chế tụ cầu khuẩn, Ức chế tạo polymer

notatum, nhiễm trùng kỵ khí, vách tế bào vi khuẩn,

giang mai, hen suyễn. ức chế hấp thu amino Penicillium acid và protein, ức chế chrysogenum tạo enzyme

13

Đồ án tốt nghiệp

Streptomyces Streptomycin Ức chế vi khuẩn Ức chế ghép nối một

griceus Gram âm và ram số amino acid vào

dƣơng. Trị bệnh lao, protein, tác động lên

bệnh viêm màng não, hệ enzyme của vi

khuẩn tham gia ho gà

chuyển pyruvate vào

chu trình Creb…

Steptomyces Chloramphenicol Ức chế đối với bệnh Ức chế đặc hiệu sinh

venezuelae lỵ, sốt cao, sốt phát tổng hợp protein vi

khuẩn liên quan đến ban

peptidyl transferase

trong tiểu đơn vị

Ribosome 50s, ngăn

không cho tạo liên kết

peptide

Streptomyces Tetracilin Ức chế phổ rộng vi Ức chế tổng hợp

aureomycin khuẩn Gram âm, protein

Gram dƣơng

Streptomyces Erythromycin Chữa bệnh do tụ cầu ức chế vi khuẩn Gram

erythraeus khuẩn streptococcal âm và Gram dƣơng

gây ra

14

Đồ án tốt nghiệp

Streptomyces Neomycin Tác dụng vi khuẩn Hơi độc

fradiae Gram âm và Gram

dƣơng

Streptomyces Kanamycin Điều trị lao, ức chế vi Tác động giống nhƣ

kanamycetius khuẩn Gram âm và streptomycin và

neomycin Gram dƣơng

Streptomyces Cycloserine Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hợp vách

lavendulae tế bào

1.2 Tổng quan prodigiosin

1.2.1. Khái niệm về prodigiosin

Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc

trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc

từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở

dạng túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế

bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991).

Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, đƣợc sản xuất bởi các vi khuẩn

nhƣ Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous,

Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các

xạ khuẩn Gram dƣơng, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces

longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006). Hình 1.1 trình bày cấu trúc hóa học của

các hợp chất đại diện của prodigiosin.

15

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)

1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin

Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin đƣợc tổng

hợp bởi Serrattia marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự

tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo,

mà cấu trúc của prodigiosin dần đƣợc nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000).

Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-

ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N30 và

trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006;

Williamson và cộng sự, 2006).

Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole

tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp

với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và

Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc

miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).

16

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1 .2. Cấu trúc hóa học prodigiosin (Krishna, 2008).

Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan đƣợc trong nƣớc. (Krishna

Prodigiosin có thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan

trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977;

Khanafari và cộng sự, 2006).

Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)

Loài Tên sắc tố Danh pháp prodigiosin Trọng lƣợng

phân tử và

công thức

Serratia marcescens Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 323,4 Da

methoxy prodigiosene C20H25N30

Serratia marcescens Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6- 309,4 Da

hydroxy-prodigiosene C10H23N30

Nocardia Nonylprodigiosin 2-Nonly-6- 363,5 Da

(Actinomadura) methoxyprodigiosene C23H31N30 madurae

17

Đồ án tốt nghiệp

Nocardia Cyclononylprodig 2,10-Nonano-6- 265,5 Da

(Actinomadura) iosin melhoxy-prodigiosene C23H33N30 madurae

Nocardia(Actinomadura) Methylcyclodc 2,10-Nonano-6- 391,5 Da

cyl-prodigiosin pellctieri Methoxy-prodigiosene C25H33N30

Streptomyces Undccylprodigios 2-Undecyl-6- 393,6 Da

longisporusruber và in Rnethoxyprodigiosene C25H35N30 Nocardia(Actinomadura)

pelletieri

Streplonlyces Metacycloprodig 2,4-(9-Ethylnonano)-6- 391,6 Da

longisporusruber iosin methoxyprodigiosene C25H33N30

1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin

1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn

Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loài vi

khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là

do khả năng thấm qua màng tế bào và khả năng ức chế các enzyme nhƣ DNA

gyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi

khuẩn (Ramina và Samira, 2009).

Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể

kháng một số vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Staphylococcus

saprophyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes,

Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus

18

Đồ án tốt nghiệp

mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus,... Tuy nhiên, hoạt động kháng

khuẩn của prodigiosin đối với các vi khuẩn Gram dƣơng lại cao hơn so với

các vi khuẩn Gram âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012).

1.2.3.2. Hoạt tính chống tế bào ung thư

Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dòng

tế bào ung thƣ ở ngƣời, nhƣng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng

sự,2009; Pérez-Tomás và Viñas, 2010). Vì khả năng gây độc chọn lọc này,

prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thƣ. Các

hoạt động chống ung thƣ trong cơ thể của prodigiosin đƣợc chứng minh lần đầu tiên

bằng những ác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7

hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng sự, 1999). Một mô hình khối u ác

tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn, bằng cách

nó đã giảm sự di căn trên tế bào ung thƣ phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này

đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thƣ thông qua

nhiều cơ chế.

Các khả năng gây độc dẫn đến sự tự hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin

chủ yếu là do ảnh hƣởng từ proapoptotic của chúng chống lại các tế bào ác tính.

Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đƣờng prodigiosin gây sự tự hủy của các

tế bào (Chia-Che và cộng sự, 2011). Cơ chế kháng tế bào ung thƣ của prodigiosin

đƣợc mô tả cụ thể nhƣ sau:

19

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3. Cơ chế kháng tế bào ung thƣ của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011)

Quá trình acid hóa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích hoạt quan trọng

của quá trình tự hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng sự, 2004). Acid hóa

nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích quá trình tự hủy trong tế bào

HL-60 (Yamamoto và cộng sự, 2000), cũng tƣơng tự nhƣ prodigiosin gây ra sự tự

hủy ở tế bào ung thƣ ruột (Castillo-Avila và cộng sự, 2005).

Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành con đƣờng tự hủy

của ty thể bằng cách điều hòa tính thấm của màng ty thể bên ngoài. Tăng tính thấm

của màng ty thể bên ngoài sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c,

nhằm kích hoạt caspase-9 bắt đầu caspase để tạo ra quá trình tự hủy. Prodigiosin

đƣợc biết là tác nhân gây ra sự kích thích quá trình tự hủy của protein BCL-2 BAX

trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng sự, 2004). Tƣơng tự nhƣ vậy, các nghiên

cứu cũng đã chứng minh trƣớc đó undecylprodigiosin giảm sự ngăn chặn tự

hủy BCL-XL nhƣng nâng kích thích tự hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và

cộng sự, 2007).

Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase. Survivin hoặc XIAP

cao sẽ tạo ra sự đề kháng, điều này rất phổ biến trong các tế bào ung thƣ (Schimmer

20

Đồ án tốt nghiệp

và cộng sự, 2006; Altieri, 2008). Một nghiên cứu trƣớc đó của các tác giả thấy rằng

cả survivin và XIAP đều đƣợc giảm đi bởi sự có mặt của undecylprodigiosin trong

tế bào MCF-7 (Ho và cộng sự, 2007).

Ngừng chu kỳ tế bào: bên cạnh việc gây sự tự hủy của các tế bào ung thƣ,

prodigiosin cũng ngăn chặn sự phát triển ung thƣ bằng cách gây ra quá trình ngừng

chu kỳ tế bào ở nồng độ không gây độc cho tế bào. Để làm điều này,

undecylprodigiosin làm giảm sự phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế

CDK4 và CDK2 (Songia và cộng sự, 1997). Tƣơng tự nhƣ vậy, prodigiosin gây ra

ngừng tăng trƣởng của các tế bào Jurkat tại quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách

giảm phosphoryl hóa Rb thông qua sự ức chế hoạt động của kinase cyclin E-CDK2

và cyclin A-CDK2, cũng nhƣ bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và

p27KIP1 (Pérez-Tomás, và Montaner, 2003). Một nghiên cứu gần đây của

SotoCerrato và cộng sự (Soto-Cerrato và cộng sự, 2007) đã cung cấp một cái nhìn

sâu sắc vào cách prodigiosin điều chỉnh p21CIP1/WAF1.

Chống sự xâm nhập và chống sự di căn: di căn là một nguyên nhân hàng đầu

dẫn đế sự tử vong do bệnh ung thƣ và làm tăng nhu cầu về thuốc chống di

căn. Những lợi ích chữa bệnh của prodigiosin đã đƣợc chứng minh trong một mô

hình khối u ác tính ở chuột, bằng cách giảm sự di căn phổi (Zhang và cộng sự, 2005).

Cơ chế hoạt động chống di căn của prodigiosin có thể là do tác dụng ức chế của nó

trên các tế bào di căn và xâm nhập, có thể thông qua quá trình down-

regulation của RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và cộng sự,

2005).

Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng

tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở ngƣời, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận,

buồng trứng, ung thƣ não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu. Ức chế tăng sinh tế

21

Đồ án tốt nghiệp

bào cũng nhƣ cảm ứng cho tế bào tự hủy đã đƣợc quan sát trong các dòng

tế bào (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

Ngoài ra, prodigiosin cũng đƣợc tìm thấy gây độc tế bào ung thƣ phổi và các

tế bào biểu mô kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng

thuốc (Llagostera và cộng sự, 2005).

1.2.3.3. Hoạt tính ức chế miễn dịch

Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên đƣợc mô tả

bởi Nakamura và cộng sự, họ đã cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và

metacycloprodigiosin trong canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát sự

ức chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so với các tế bào

lympho B (Han và cộng sự, 2001). Sau đó, hoạt động ức chế miễn dịch đã đƣợc

chứng minh cho các chất tƣơng tự prodigiosin khác nhƣ: undecylprodigiosin, cPrG,

MAMPDM, nonylprodigiosin,…

22

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.3. Các sản phẩm prodigiosin thƣơng mại hóa (Santa Cruz Biotechnology,

Merck Millipore, Biovision incorporated)

STT GIÁ THÀNH ĐỘ THÔNG SỐ KỸ THUẬT ỨNG DỤNG

SẢN PHẨM TINH

SẠCH

1 95% Độ hòa tan : DMSO hoặc Hoạt động nhƣ 95 $/ 250 g

Ethanol. một mTORC1 và HPLC = 2000000 mRTOC2 ức chế Nhiệt độ lƣu trữ: -20 0C VNĐ/250 g chất phát triển

Điều kiện vận chuyển : gói gel, phức tạp. Chỉ sử 355 $/ 1 mg = tránh không khí ánh sáng. dụng cho nghiên 7100000 VNĐ/ cứu, không sử Dạng thành phẩm: rắn màu đỏ 1mg dụng cho ngƣời. đậm.

2 349 $/500 µg = >95% Trạng thái vật lý: rắn Hoạt động nhƣ

6980000 một kháng sinh. Có nguồn gốc từ: Serratia VNĐ/500 µg Chỉ sử dụng cho marcescens nghiên cứu, không

Độ hòa tan: Hòa tan trong sử dụng cho điều

ethanol, methanol, DMF hoặc trị ở ngƣời.

DMSO.Tan trong nƣớc hạn chế

Bảo quản: ở nhiệt độ -20°C

Điểm nóng chảy: 151-152ºC

23

Đồ án tốt nghiệp

3 159 GBP/200 >95% Nguồn: Serratia marcescens Một ứng dụng

µg = 3975000 hợp chất tế bào HPLC Xuất hiện: rắn, màu đỏ đậm VNĐ/200 µg thẩm thấu có hiển

Lƣu trữ dài hạn: -20°C thị ức chế miễn

dịch và chống Độ hòa tan: Hòa tan trong

khối u đặc tính ethanol, methanol, DMF hoặc

không phân biệt DMSO. Tan trong nƣớc hạn

tình trạng p53 và chế.

kháng đa thuốc. Đóng gói khí trơ.

Một trong những vi sinh vật tổng hợp prodigiosin và analog đƣợc nghiên cứu

nhiều nhất là Serratia marcescens.

1.3. Tổng quan về Serratia marcescens

1.3.1. Phân loại Serratia marcescens

Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan

với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi

Serratia là Serratia marcescens.

Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gramma proteobacteria

Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

24

Đồ án tốt nghiệp

Chi: Serratia

Loài: Serratia marcescens

1.3.2. Đặc điểm của Serratia marcescens

1.2.2.1 Đặc điểm sinh lý

Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia

marcescens có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC

và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012).

Hình 1.4. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011)

Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar đƣợc mô tả

là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính

là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens

thƣờng bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012).

25

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.5. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở

250C sau 48 giờ (David, 2012).

Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch, tạo

thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8%), các cụm tế bào này có chiều dài từ 530 μl.

Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.

1.3.2.2 Đặc điểm sinh hóa

Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng có oxy hoặc trong

trƣờng hợp không có oxy. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men

để lấy năng lƣợng và nhờ có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatase,

peroxidase,… bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi

trƣờng oxy hóa.

Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ

Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase

(Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia

marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease,

protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Một số đặc điểm sinh hóa của

Serratia marcescens đƣợc thể hiện qua bảng 1.4.

26

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.4. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010).

STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả

1 Di động +

2 Indole -

3 Methyl Red -

4 Voges Proskauer +

5 Citrate +

6 Dnase +

7 Catalase +

8 Oxidase -

9 Urease -

10 Gelatinase +

11 Chitinase +

12 Triple sugar iron Môi trƣờng chuyển sang

acid, không sinh khí và

không sinh H2 S

27

Đồ án tốt nghiệp

13 Hydrogen sulphide -

peoduction

14 Lysine decarboxylase +

15 Ornithine decarboxylase +

16 Lên men glucose +

17 Lên men sucrose +

18 Lên men sorbitol +

19 Lên men fructose +

20 Lên men xylose -

22 Lên men lactose -

23 Lên men arabinose -

1.3.2.3. Đặc điểm phân bố

Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nƣớc, trong đất, trong thực

vật, côn trùng, cũng nhƣ trong ống tiêu hóa của ngƣời và động vật có xƣơng sống.

Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sông

và Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể đóng

một vai trò quan trọng trong chu trình sinh địa hóa của kim loại, thông qua việc

khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng nhƣ hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964).

28

Đồ án tốt nghiệp

Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn

trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế.

Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối

với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết

sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006).

Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm,

nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng

của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001).

Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong

các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo

cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữ

Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae.

1.3.4 Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens

1.3.4.1. Sắc tố

Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi

khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), đƣợc biết đến nhƣ là một yếu tố

đặc biệt, nhƣng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này bao

gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin,

metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn

dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin

hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008).

Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin đƣợc sản xuất bởi biogroup

A1 và A2/6, nó không đƣợc sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT

(Grimont, 1977). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6

thƣờng gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont,

29

Đồ án tốt nghiệp

1977; Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hóa sinh tổng hợp prodigiosin đã

đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Các dòng

đƣợc tạo thành này có khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn MAP và MBC, hoặc

tổng hợp giai đoạn MAP ở bên ngoài (Francine và Patrick, 2006). Prodigiosin đƣợc

biết đến là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào

T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể ngƣời, có thể chúng sẽ không

tổng hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch

(Hejazi và Falkiner, 1997).

Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic

semialdehyde acid, đƣợc sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid

(3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự, 1988). Enzyme

này đƣợc cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens.

Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a, đã bị mất khả năng phát triển

trên các hợp chất thơm, để có thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick,

2006).

1.3.4.2. Biosurfactants

Các chủng sinh sắc tố và một số chủng không sinh sắc tố của Serratia

marcescens đều sản xuất biosurfactants có thể hoạt động nhƣ một chất thấm. Chất

thấm này đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn ở 30°C nhƣng không đƣợc sản

xuất ở 37°C trong phase cân bằng của quá trình tăng trƣởng. Ba aminolipid, từ W1

đến W3, có các hoạt động thấm ƣớt và đã đƣợc tách bằng sắc ký lớp mỏng

(Matsuyama và cộng sự, 1986). Trong đó, W1 đƣợc xác định là serratamolide,

một cyclodepsipeptide mà trƣớc đó đã từng đƣợc phát hiện bởi Wasserman và cộng

sự (1961).

30

Đồ án tốt nghiệp

1.3.4.3. Acid béo

Các acid béo chủ yếu trong toàn bộ tế bào của các chủng Serratia

marcescens là 3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic, và

octadecanoic acid. Các acid béo này chiếm khoảng 50 – 80% thành phần tế

bào, trong đó, ntetradecanoic acid chiếm Tỷ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983).

1.3.4.4. Enzyme

Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease,

chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,...

Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có

chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng nhƣ kiểm soát sinh

học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc,… (Joshi và cộng sự,

1989).

Serratia marcescens có khả năng tiết ra các loại enzyme: Protease thủy phân

casein. Đây là đặc điểm phân biệt Serratia marcescens từ 438 chủng vi khuẩn đƣờng

ruột và tập hợp Pseudomonadaceae. Tƣơng tự nhƣ vậy, một protease khác là gelatinase

phân hủy gelatin, một loại protein không đầy đủ mà thiếu tryptopan.

1.3.5 Tổng quan về quorum sensing trong S. marcescens

Cảm biến định mức (quorum sensing) là một quá trình truyền tín hiệu gian bào

qua đó vi khuẩn nhận diện mật độ tế bào và điều chỉnh sự biểu hiện gen một cách

tƣơng ứng. Tế bào vi khuẩn sản sinh ra những phân tử tín hiệu để tập hợp lại xung

quanh chúng nhƣ việc gia tăng quần thể. Khi sự tập trung của tín hiệu vƣợt quá ngƣỡng

của nó, thì việc đánh dấu hành trình đƣợc bắt đầu và phản ứng sinh lý đƣợc sắp đặt sẽ

đƣợc thực hiện thông qua quần thể này. Quorum sensing sẽ điều chỉnh nhiều quá trình

xử lý quan trọng, trong các loài vi khuẩn khác nhau, ví dụ nhƣ tính độc hại, sự sản sinh

31

Đồ án tốt nghiệp

trao đổi thứ cấp, cộng sinh, sự hình thành bào tử và màng sinh học ( Whitehead et al.,

2001). Những hệ thống quorum sensing đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất trong khuẩn

gram âm là những hệ thống sử dụng phân tử tín hiệu aHSL, trong đó đồng đẳng LuxI

tổng hợp nhiều tín hiệu aHSL và những protein điều hòa phiên mã loại LuxR tập hợp

tín hiệu cùng loại của chúng ở mật độ tế bào dày đặc và thay đổi sự biểu hiện gen

(Labbate et al., 2004; Riedel et al., 2001).

1.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin

1.4.1. Cơ chế tổng hợp prodigiosin

Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon

lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC

39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens, ATCC 274 (Sma 274)

đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001).

Prodigiosin đƣợc hình thành qua hai giai đoạn: 2-methyl-3-amylpyrrole

(MAP) và 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất

tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene. Có rất ít thông tin

về con đƣờng sinh tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC, ngoại trừ việc mô tả về

phân tử proline kết hợp nguyên vẹn thành một trong những nhóm pyrrole của MBC.

Quá trình tổng hợp sắc tố này cần có không khí và phân tử oxy (Williams và Qadri,

1980).

32

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia

ATCC 39.600, Sma 274 và các cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm

màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001).

Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để thực hiện thử nghiệm trong các

chất chuyển hóa của Serratia marcescens và có thể hữu ích đối với việc nghiên cứu

một hệ thống mô hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hóa thứ cấp trong vi

khuẩn. Tách các phân tử tái tổ hợp mã hóa cho quá trình tổng hợp prodigiosin sẽ là

một cách tiếp cận để xác định sản phẩm gene và sự hiểu biết về enzymology và di

truyền học của quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. Việc tách trình tự của DNA mã

hóa một phần trong quá trình tổng hợp prodigiosin bằng cách sử dụng hệ thống nhân

bản vector ở Escherichia coli cosmid đã đƣợc báo cáo (Dauenhauer và cộng sự,

1984).

Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong

Erwinia carotovora sub sp. carotovora (25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm),

mặc dù nó đã không đƣợc biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn khác thuộc

Enterobacteriaceae, bao gồm cả Escherichia coli (Thomson và cộng sự, 2000).

Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi nhiều yếu tố,

33

Đồ án tốt nghiệp

bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR

(Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất

prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc

vào sự biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora, mặc dù sau này, việc

sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson

và cộng sự, 2000).

Nhóm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và

Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí trong pigA đến pigN, trong đó có năm gene

tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mô tả ở hình

1.4. Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại

(PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ tự

gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và14 protein thể hiện kích thƣớc

và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno và cộng sự, 2001).

1.4.2. Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin

Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai

đoạn phát triển của vi khuẩn (Harris và cộng sự, 2004). Bản chất màu đỏ

tƣơi của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn

(Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Nhiều yếu tố, chẳng hạn nhƣ: nhiệt độ, pH,

độ oxy hòa tan, ánh sáng, phosphate vô cơ và thành phần môi trƣờng ảnh hƣởng đến

quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự, 1994;

Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005).

Quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens rất nhạy cảm với

nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004). Hơn

nữa, môi trƣờng thông thƣờng đƣợc sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi các

chủng Serratia marcescens là môi trƣờng phức tạp và rất giàu dinh dƣỡng

34

Đồ án tốt nghiệp

(Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Một số chất

dinh dƣỡng nhƣ thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng

đối với sản xuất prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự, 1977),

adenosine triphosphate và ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại có tác dụng

ức chế sản lƣợng prodigiosin.

Hình 1.7. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi

Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009)

Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của Serratia marcescens trên

các môi trƣờng khác nhau nhƣ: môi trƣờng hạt mè, nutrient broth và peptone glycerol

broth,... Các môi trƣờng cũng đƣợc so sánh tốc độ tăng trƣởng và khả năng xuất

prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan sát vai trò

của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần

trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều prodigiosin hơn. Trên môi trƣờng peanut broth thì prodigiosin có thể tổng hợp ở nhiệt độ 37oC trong

khi trên các môi trƣờng nhƣ nutrient broth, peptone glycerol broth có hoặc không

có bổ sung đƣờng cũng không thể làm đƣợc điều này (Chidambaram và

Perumalsamy, 2009).

35

Đồ án tốt nghiệp

Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bởi glucose và các

loại đƣờng khác do sự giảm pH trong canh trƣờng nuôi cấy Khanafari và cộng sự,

2006). Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon trong quá trình sản xuất

sắc tố. Điểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ bản là môi trƣờng này không

có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose làm tăng cƣờng việc sản xuất

sắc tố, trong trƣờng hợp sử dụng môi trƣờng sesame broth thì nguồn carbon ở dạng

các acid béo. Maltose và glucose đƣợc thêm vào nutrient broth làm tăng gấp đôi năng

suất so với chỉ sử dụng môi trƣờng nutrient broth hoặc peptone glycerol broth. Điểm

thứ hai là sự sản xuất sắc tố đƣợc tăng cƣờng trong môi trƣờng peptone glycerol broth ở 30oC và trong nutrient broth ở 28oC, điều này có thể là do sự hiện diện của

glycerol nhƣ là một nguồn carbon. Rõ ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ

tăng trƣởng tế bào và sản xuất prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

Ngoài ra, một báo cáo đã chứng minh việc bổ sung silica gel vào môi trƣờng

lỏng của Serratia marcescens cũng dẫn đến sự tăng trƣởng tế bào, sản xuất

prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001). Hơn nữa, prodigiosin

thƣờng nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn nhƣ

SDS và môi trƣờng nuôi cấy cũng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin

(Feng và cộng sự, 1982; Wei và Chen, 2005).

36

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.5. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các

môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

37

Đồ án tốt nghiệp

1.4.3. Điều kiện tổng hợp prodigiosin

Helvia và cộng sự (2010), đã tối ƣu hóa quá trình sản xuất proodigiosin bởi

Serratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nƣớc thải từ công nghiệp chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho thấy

Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l.

Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hóa sản xuất

prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của

prodigiosin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ƣu cho việc sản xuất prodigiosin trong môi trƣờng Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và

quá trình chiết xuất prodigiosin đƣợc thực hiện bằng ethanol: hydrochloric acid

(9,5: 0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận đƣợc có

tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm.

Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng

kháng khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh

nhƣ Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp.,hơn nữa,

prodigiosin có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng

nhuộm, cùng với việc không bị ảnh hƣởng bởi acid, kiềm , chất tẩy rửa, mà có thể

ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu.

Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất

prodigiosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các môi trƣờng

dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và có

thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp.

San và cộng sự (2012), đã sử dụng chất thải chế biến thủy sản nhƣ một nguồn

carbon và nitơ để sản xuất prodigiosin từ Serratia marcescens TKU011. Hơn nữa,

nghiên cứu của các tác giả này cũng cho thấy prodigiosin có khả năng diệt côn trùng.

38

Đồ án tốt nghiệp

Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ

chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas sp.

và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và nồng độ

diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự cũng đã sử

dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 μg/ml.

1.4.4. Thu nhận, tinh sạch và định lượng prodigiosin

1.4.4.1. Thu nhận và tinh sạch

Các sắc tố không tan trong nƣớc mà tan trong dầu thƣờng đƣợc chiết xuất

bằng dung môi hữu cơ pha nƣớc nhƣ: acetone, methanol, ethanol, hoặc các hỗn hợp

của các dung môi, để giúp các dung môi này hoạt động tốt hơn. Chiết xuất thƣờng có

chứa một lƣợng nƣớc đáng kể, do đó, có thể đƣợc loại bỏ bằng cách phân lớp nhờ

hexane, petroleum ether, diethyl ether, dichloromethane hoặc hỗn hợp các dung môi.

Sắc ký, quang phổ hấp thụ ở vùng khả kiến là cơ sở đầu tiên dùng để xác định các

chất màu. Quang phổ sẽ đƣợc thực hiện, lƣu giữ và sau đó tiến hành so sánh với các

phổ chuẩn (Amaya. 2001).

Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đây đƣợc đề xuất là nên thực hiện để xác định một

hợp chất chƣa biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng sự, 1994).

Phổ khả kiến (𝜇max ).

Sắc ký lớp mỏng (Rf).

Sắc ký lỏng cao áp (thời gian lƣu mẫu).

Phƣơng pháp phổ khối (khối lƣợng phân tử).

NMR (chuyển hóa về mặt hóa học).

39

Đồ án tốt nghiệp

Các nhà khoa học đã thực hiện nhiều nghiên cứu về quá trình thu nhận và tinh sạch

prodigiosin nhƣ sau:

Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) đƣợc chiết xuất từ môi

trƣờng nutrient broth nuôi cấy Serratia marcescens sau 72 giờ, với ethanol và

petroleum ether, tiếp theo loại bỏ dung môi trong một cốc nƣớc sôi (hay trong một bể

cách thủy) và hòa tan phần còn lại vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky, 1980).

Các sắc tố từ tế bào của Serratia marcescens phân lập từ đất đƣợc chiết xuất bằng

acetone, hòa với một ít ethyl acetate, và đƣợc sấy khô bằng natri sulfat. Các chất chiết

xuất đƣợc hòa tan và đƣợc thực hiện quét từ bƣớc sóng 200 – 700 nm. Hỗn hợp dung

môi dichloromethane, chloroform và acetone với tỷ lệ 2,5: 2,5: 0,5 đã đƣợc sử dụng để

tách một cách hiệu quả các tạp chất từ chiết xuất cùng với các sắc tố bằng sắc ký lớp

mỏng. Cột silica có kích thƣớc từ 80 – 100 mesh đã đƣợc sử dụng để phân tách các

tạp chất không màu từ các sắc tố. Mẫu tinh khiết cho thấy có độ hấp thụ cao duy nhất

tại 535 nm trong quang phổ UV. Nó đƣợc tiếp tục phân tích để xác định trọng lƣợng

phân tử bằng việc sử dụng máy quang phổ khối. Các sắc tố prodigiosin tinh khiết đƣợc

đem phân tích quang phổ khối cho thấy chúng có trọng lƣợng phân tử là 324 Da (Giri

và cộng sự, 2004).

Prodigiosin đƣợc chiết xuất bằng cách lắc môi trƣờng nuôi cấy tế bào Serratia

marcescens 2170 với methanol có tính acid (1ml dung dịch HCl 1N: 24 ml methanol)

và dịch trong suốt đƣợc làm cho bay hơi trong chân không. Sắc ký lỏng cao áp của các

chiết xuất đƣợc thực hiện trên silica gel với dung môi chloroform và methanol. Các sắc

tố thu đƣợc sẽ đƣợc rửa giải trong methanol và phân tích bởi phƣơng pháp phổ khối

(ESI-MS). Sau đó, các sắc tố chƣa tinh khiết đã thu đƣợc sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện

phƣơng pháp HPLC. Một cột đảo pha Nucleosil C18 (250x4 mm, 10 m) đã đƣợc sử

dụng với một gradient tuyến tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10mM amoni

acetate, pH 7,0, B: 100% acetonitrile). Việc rửa giải đƣợc theo dõi bằng cách sử dụng

40

Đồ án tốt nghiệp

cả hai máy dò UV diode-array và ESI-MS (Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và

Montaner, 2003).

Sau khi lên men Serratia marcescens phân lập từ đất, canh trƣờng đƣợc lấy từ

những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đó, 1 lít ethanol 95% (v/v) đã acid

hóa (pH 3,0) đƣợc thêm vào IAB. Các sắc tố đƣợc chiết xuất bằng cách sử dụng một

vòng tròn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ, rồi đem cô đặc và ly

tâm. Sau đó, nó đƣợc thu bằng cách sử dụng nƣớc và chloroform để tách pha.

Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dƣới của pha chloroform và đƣợc cô

đặc bằng cách cho bốc hơi. Prodigiosin đƣợc phân tách bằng sắc ký cột silica gel (2,5

× 30 cm). Nó đƣợc rửa với một hỗn hợp hexane: ethyl acetate (2: 1, v/v). Các sắc tố

cô đặc đã đƣợc tách ra bởi việc sử dụng hỗn hợp chloroform: methanol 95:5

(v/v) trong TLC. Sau đó, màu đỏ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã đƣợc

thu nhận và hòa tan trong acetone. Các sắc tố chƣa tinh khiết sẽ tiếp tục đƣợc thực

hiên phƣơng pháp TLC (với tỷ lệ dung môi chloroform: methanol: diethyl ether

là 6: 2: 2), và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm)). Sau đó, nó

đƣợc tách rửa với hỗn hợp methanol: nƣớc (7:3, v/v) đã đƣợc điều chỉnh pH= 3,0 bằng

0,1N HCl với tốc độ dòng chảy là 20 ml/ phút. Một lƣới thép không gỉ lớn với kích

thƣớc lỗ 0,5 cm đã đƣợc sử dụng nhƣ sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong. Nồng

độ của các prodigiosin đỏ sản xuất ra đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ ở 535

nm sử dụng chùm quang phổ tia UV khả kiến trong methanol đã đƣợc acid hóa

(0,01N HCI 4ml + 96ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối lƣợng

phân tử của chất màu tinh khiết đƣợc xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối. Các 1H- và 13C-NMR của các mẫu màu đƣợc ghi nhận sau khi hòa tan trong CDCl3. Các

dịch chuyển hóa đã đƣợc đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu. Phổ FT-IR

của các sắc tố đƣợc ghi nhận (Song và cộng sự, 2006).

41

Đồ án tốt nghiệp

1.4.4.2. Định lượng

Mẫu tinh khiết của prodigiosin cho thấy nó có độ hấp thụ cao và duy nhất tại

bƣớc sóng 535nm trong quang phổ UV (Giri và cộng sự, 2004). Chính vì vậy, nồng độ

của các prodigiosin đỏ sản xuất ra đƣợc thu nhận trong methanol đã acid hóa (với

0,01N HCI 4ml và 96ml methanol) sẽ đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ ở bƣớc

sóng 535 nm và sử dụng quang phổ UV khả kiến (Goldschmidt và Williams, 1968).

Tổng số các sắc tố đƣợc ƣớc tính theo công thức sau (Chen và cộng sự, 2006; Williams

và cộng sự, 1960):

TP(µg/L)=

Trong đó:

TP: Biểu thị tổng số sắc tố thu đƣợc (μg/L).

A: Độ hấp thụ của sắc tố đƣợc chiết xuất trong methanol ở 535 nm.

D: Hệ số pha loãng.

V1: Thể tích methanol bổ sung vào. V2: Thể tích canh trƣờng ban đầu.

7.07×104 : Hệ số hấp thụ của prodigiosin.

1.5 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens

Trong nhiều thập kỷ qua, prodigiosin đƣợc biết đến là một hợp chất tự nhiên

có thể gây độc tế bào (Furstner, 2003) và đƣợc sản xuất bởi các vi sinh vật nhƣ

Vibrio psychroerythrus (D’Aoust và Gerber,1974), Serratia marcescens,

Pseudomonas magnesiorubra và một số vi khuẩn khác (Lewis và Corpe, 1964).

Đặc trƣng của Serratia marcescens là sản xuất sắc tố đỏ không có khả năng

khuếch tán prodigiosin nên có khuẩn lạc với màu đỏ rất đẹp (Kalesperis và cộng sự,

42

Đồ án tốt nghiệp

1975; Gargallo và cộng sự, 1987; Gargallo-Viola, 1989). S. marcescens cũng là một

tác nhân gây bệnh cơ hội ở ngƣời với những chủng không sản xuất sắc tố gây

đe dọa sức khỏe cộng đồng (Gargallo-Viola, 1989). Những chủng sản xuất sắc tố

phân lập từ tự nhiên ít liên quan đến nhiễm trùng và thật thú vị là những sắc tố đỏ

không tan trong nƣớc này lại đƣợc báo cáo là có hoạt tính kháng sinh (Tsuji và cộng

sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji và cộng sự, 1992; Songia và cộng sự,

1997). Các prodigiosin tốt nhất đƣợc biết đến là một chất màu đỏ nondiffusible gắn

với lớp màng bên trong tế bào (Iranshahi và cộng sự, 2004). S. marcescens cũng

sản xuất một chất hòa tan trong nƣớc, có màu đỏ hồng-tím superoxidase dismutase

(Hardjito và cộng sự, 2002).

Ở S. marcescens khuẩn lạc rất nhỏ và ban đầu không có màu, màu đầu tiên

xuất hiện gần đƣờng kính khuẩn lạc khoảng 1mm (Haddix và Werner, 2000). S.

marcescens chỉ tổng hợp sắc tố trong một điều kiện nhất định. Bizio và Sette đã phân

lập đƣợc sắc tố đỏ sản xuất bởi các chủng Serratia và cố gắng sử dụng nó nhƣ là một

loại thuốc nhuộm cho mục đích thƣơng mại. Tuy nhiên, ở dạng tinh khiết nó quá

nhạy cảm với ánh sáng khi đƣợc sử dụng thực tế (Furstner, 2003).

Serratia, giống các vi sinh vật họ Enterobacteriaceae khác, có thể phát

triển tốt trong điều kiện môi trƣờng kỵ khí và hiếu khí. Nó phát triển tốt trên các môi

trƣờng tổng hợp, sử dụng các hợp chất khác nhau nhƣ một nguồn carbon duy nhất.

Giri và cộng sự (2004) đã thực hiện thử nghiệm trên một loạt các môi trƣờng và phát

hiện ra trên môi trƣờng từ hạt đậu phộng làm tăng một lƣợng đáng kể prodigiosin.

Hơn nữa, một báo cáo chứng minh việc bổ sung silica gel vào môi trƣờng lỏng

của S. marcescens cũng dẫn đến sự tăng trƣởng tế bào, sản xuất prodigiosin và

serrawettin (Yamashita và cộng sự,2001). Ngoài ra, prodigiosin thƣờng nằm trên

màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn nhƣ sodium dodecyl

sulface (SDS) cũng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Wei và Chen,

43

Đồ án tốt nghiệp

2005). Hardjito và cộng sự (2002) báo cáo rằng việc sản xuất sắc tố bởi chủng phi

lâm sàng (non-clinical) có ý nghĩa khoa học và quan trọng, có một mối quan hệ giữa

quá trình sản xuất sắc tố với sự vắng mặt của plasmid. Do đó, sản xuất sắc tố do

chủng phi lâm sàng của S. marcescens đã đƣợc quan tâm nghiên cứu sâu hơn để

xác định mối quan hệ của quá trình sản xuất sắc tố và khả năng gây bệnh. Đặc điểm

sắc tố của S. marcescens cũng khác nhau (Hardjito và cộng sự, 2002), chịu ảnh

hƣởng của cả hai yếu tố di truyền và môi trƣờng. Sản xuất các sắc tố tan trong nƣớc

đƣợc tăng cƣờng bằng cách bổ sung polymyxin B (Suzuki và cộng sự, 2001),

gramicidin và valinomycin vào môi trƣờng tăng trƣởng (Hardjito và cộng sự, 2002).

Không nghi ngờ gì nữa, sản xuất sắc tố bởi S. marcescens sẽ tiếp tục hấp

dẫn các nhà vi sinh vật học, bác sĩ và kỹ sƣ công nghệ sinh học. Gần đây,

prodigiosin đã đƣợc xem là hiệu quả nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học với tảo có

hại trong môi trƣờng biển tự nhiên, do đó, prodigiosin phải sản xuất với số lƣợng lớn

để có thể đáp ứng nhu cầu trong tƣơng lai (Someya và cộng sự, 2001).

44

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm

2.1.1. Thời gian

Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 25/05/2015 đến ngày 15/08/2015.

2.1.2. Địa điểm

Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực

phẩm - Môi trƣờng, Trƣờng Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.

2.2. Vật liệu

2.2.1. Nguồn vi sinh vật

Nguồn vi khuẩn thử nghiệm là chủng Serratia marcescens_SH1 do Nguyễn

Hoàng Anh Kha phân lập từ tuyến trùng diệt sâu (EPN) Heterorhabditis indica CP

16 (H.CP 16) tại phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học, khoa Công nghệ Sinh

học-Thực phẩm-Môi trƣờng, Đại học Công nghệ TP. HCM, đƣợc định danh bằng

phƣơng pháp sinh học phân tử có số đăng kí trên genbank là KF534508.1.

Vi khuẩn sử dụng đồng nuôi cấy gồm Bacillus sb, E. coli do phòng thí nghiệm

khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cung cấp.

2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng

2.2.2.1. Môi trường nuôi cấy ( thành phần môi trƣờng xem phụ lục)

- Môi trƣờng Nutrient agar (NA);

45

Đồ án tốt nghiệp

- Môi trƣờng Nutrient broth (NB);

- Môi trƣờng Peptone glycerol broth (PG);

- Môi trƣờng huyền phù đậu phộng, pepton, dầu hƣớng dƣơng (MT3);

- Môi trƣờng huyền phù đậu phộng, pepton, dầu hƣớng dƣơng, muối NaCl (MT4).

2.2.2.2. Hóa chất sử dụng

- NaCl; HCl; NaOH; H2SO4

- Pepton, meat extract, agar

- Nƣớc muối sinh lý 0,85%; nƣớc muối bão hòa

- Ethanol 96%; Petrolium ether; Bismuth nitrate; KI; Ether; Acetic acid; Aceton;

- Coomassie brilliant blue; Methanol; N-hexan; Etyl Acetate

2.2.2.3. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị

Nồi tiệt trùng Autoclave, cân kỹ thuật, cân phân tích, máy lắc, máy ly tâm,

máy đo độ hấp thụ quang học, tủ lạnh thƣờng, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, kính hiển vi…

Dụng cụ

Cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, pipet, micropipet, ống nghiệm, đĩa

petri, Eppendorf, vi quản, bản mỏng TLC, đũa thủy tinh, que cấy,cuvet thủy tinh, đèn

cồn…

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phƣơng pháp luận

46

Đồ án tốt nghiệp

Dựa trên mục tiêu đề tài “Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng

hợp prodigiosin, cũng nhƣ phƣơng pháp thu hồi sắc tố thô”, các nội dung nghiên cứu

đã đƣợc đề ra với các phƣơng pháp luận nhƣ sau:

Khảo sát chủng Serratia marcescens SH1 xem xét độ thuần khiết, khảo sát

kháng sinh đồ so sánh chủng sử dụng với công bố về các chủng có khả năng gây bệnh.

Cải tiến điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin:

tăng thể tích lên men, ảnh hƣởng của vận tốc lắc, pH nuôi cấy, nồng độ muối NaCl,

thử áp dụng phƣơng pháp đồng nuôi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung

dịch nuôi cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing. Prodigiosin

là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thƣờng trễ hơn pha tăng trƣởng tế bào. Điều

kiện nuôi cấy quyết định nồng độ prodigiosin tổng hợp. Nghiên cứu này dựa trên các

báo cáo trƣớc đó của các tác giả cùng nhóm (sinh viên năm trƣớc) và ngoài nƣớc để

cải thiện điều kiện nuôi cấy cho chủng phân lập của phòng thí nghiệm.

Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thô từ canh trƣờng nuôi cấy đáp ứng yêu cầu

tăng hiệu suất trích ly, tiết kiệm dung môi và an toàn sinh học.

2.4 Bố trí thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ trên hình 2.1

47

Đồ án tốt nghiệp

Chủng VK SH1

Khảo sát thể tích lên men và vận tốc lắc trong nuôi cấy.

Kiểm tra độ thuần khiết khuẩn và định S. marcescens

1. Khảo sát chủng nuôi cấy. Xác định pH nuôi cấy.

Kháng sinh đồ

Ảnh hƣờng của nồng độ muối NaCl 2. Cải tiến điều kiện lên men thu prodigiosin

Xác định tỷ lệ dung môi trích ly 3. Thu hồi prodigiosin từ

canh trƣờng

Khảo sát sự ảnh của hƣởng phƣơng pháp đồng nuôi cấy.

Cải thiện quá trình trích ly nhờ tiền xử lý gia nhiệt.

Khảo sát sự ảnh hƣởng của sản phẩm Quorum sensing. Prodigiosin thô (sắc tố thô – STT)

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

48

Đồ án tốt nghiệp

2.5.1 Khảo sát chủng nuôi cấy

2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết

Khảo sát hình thái khuẩn lạc

Cấy ria chủng vi khuẩn SH1 đã đƣợc phân lập trên môi trƣờng NA. Dùng

dao sắc, nhỏ, cắt một miếng thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc. Quan sát

dƣới kính hiển vi ở hai góc độ là từ trên xuống và soi nghiêng ở vật kính 4X và 10X.

2.5.2 Kháng sinh đồ

Sau khi kiểm tra độ thuần khiết, ngƣời thực hiện đề tài gửi chủng vi khuẩn đến

công ty Nam Khoa, 793/58 Trần Xuân Soạn - Phƣờng Tân Hƣng Quận 7 - Thành phố

HCM - Việt Nam để khảo sát kháng sinh đồ. Sử dụng các kháng sinh amoxicillin-

clavulanic acid, ampicillin, tetracycline, cefuroxime và cefotaxime,ciprofloxacin,

amikacin, ertapenem, ceftazidime, chloramphenicol, imipenem,

trimethoprim/sulfamethoxazole, cefepime, piperacillin/tazobactam, gentamicin khuếch

tán vào thạch Mueler-hinton. Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo

Enterobacteriaceae đƣợc trình bày ở bảng 1 phần phụ lục.

2.6 Xác định điều kiện lên men

2.6.1 Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên nồng độ prodigiosin tổng hợp

Lên men đƣợc thực hiện trong bình tam giác với các nghiệm thức: đối chứng: 20

ml/bình, thí nghiệm 200 ml/bình và 400 ml/bình. Thí nghiệm lặp lại ba lần.

Cách tiến hành

Bƣớc 1 (nhân giống): từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra đổ tinh khiết cũng nhƣ

khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống trong môi trƣờng Nutrient

broth trong 24, lắc 150 vòng/phút, ủ tối, nhiệt độ phòng.

49

Đồ án tốt nghiệp

Bƣớc 2. Chuẩn bị môi trƣờng lên men MT3 thành phần trong phụ lục 1 với thể tích

nhƣ nêu trên. Đem hấp khử trùng trong 15’ ở áp suất 1 atm, nhiệt độ 1210C.

Bƣớc 3: Cấy giống vi khuẩn thu từ canh trƣờng ở bƣớc 1, pha loãng sao cho OD

600 nm ≈ 0,7 vào môi trƣờng MT3 với tỷ lệ giống 3%. Lắc 200 vòng/phút ở 24h đầu,

150 vòng/phút ở 24h sau với nghiệm thức 20 ml/bình và lắc thêm 150 vòng/ phút với

nghiệm thức 200 ml/bình và 400 ml/bình.

Bƣớc 4: thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ trích ly hình 2.2 với tỷ lệ

canh trƣờng : dung môi (Ethanol : HCl 1N (95:5; v:v)) 1:2 (A:B 1:2).

50

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.2 Sơ đồ trích ly

51

Đồ án tốt nghiệp

Sau khi trích ly, loại bỏ dịch trong, gom dịch 1, dịch 2 và dịch 3 vừa trích ly,

tiến hành đo OD ở bƣớc sóng λ=535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn

sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu.

2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc trong nuôi cấy

Ngƣời thực hiện đề tài khảo sát vận tốc lắc cho bình lên men với thể tích 400

ml/bình ở các chế độ lắc đƣợc trình bày trên bảng 2.1

Bảng 2.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của máy lắc và chế độ lắc.

Thí nghiệm Ngày Loại máy lắc Tốc độ (vòng/phút)

1 Máy lắc ngang 180

Nghiệm thức 1 Máy lắc ngang 2 150

3 Máy lắc vòng 150

1 Máy lắc ngang 180

2 Máy lắc ngang 150

Nghiệm thức 2

3 Máy lắc ngang 150

4 Máy lắc vòng 150

1 Máy lắc ngang 180

Nghiệm thức 3

2 Máy lắc ngang 150

52

Đồ án tốt nghiệp

Máy lắc ngang 3 150

Không sử dụng 4 0

Máy lắc vòng 1 200

2 Nghiệm thức 4 Máy lắc vòng 150

Máy lắc vòng 3 150

Máy lắc vòng 1 200

2 Nghiệm thức 5 Máy lắc vòng 200

Máy lắc vòng 3 200

Cách tiến hành, trích ly sắc tố và xác định hàm lƣợng prodigiosin nhƣ trong thí

nghiệm 2.6.1.

2.7.2 Xác định pH tối ưu cho môi trường lên men

Chuẩn bị môi trƣờng lên men MT3 với thể tích 20 ml/bình, điều chỉnh pH ≈

7.2 lặp lại cho 3 bình thí nghiệm và 3 bình không điều chỉnh pH làm đối chứng. Đem hấp khử trùng trong 15’ ở áp suất 1 atm, 1210C. Các bƣớc nhân giống, lên men và xác

định hàm lƣợng prodigiosin tiến hành giống thí nghiệm 2.6.1 lắc 200 vòng/phút ở 24h

đầu và 150 vòng/phút ở 24h sau.

2.7.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl

Các bƣớc nhân giống và lên men tiến hành giống thí nghiệm 2.6.1 lắc 200

vòng/phút ở 24h đầu và 150 vòng/phút ở 24h sau, điều chỉnh pH phù hợp với kết quả

53

Đồ án tốt nghiệp

của thí nghiệm 2.7.2. Bổ sung nồng độ muối NaCl tỷ lệ với thể tích canh trƣờng lên

men lần lƣợt là 0% (đối chứng), 1%, 2%, 3%, lặp lại 3 lần với mỗi nghiệm thức.

Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa

vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. Đo pH canh

trƣờng sau nuôi cấy, xác định nồng độ NaCl cho nồng độ prodigiosin tổng hợp cao

nhất trong tƣơng quan với pH sau nuôi cấy.

2.7.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của phương pháp đồng nuôi cấy

2.7.4.1 Thí nghiệm đồng nuôi cấy với vi khuẩn Bacillus subtilis

Cách tiến hành

Bƣớc 1 ( nhân giống Serratia marcescens SH1) từ ống thạch nghiêng đã kiểm

tra độ tinh khiết cũng nhƣ khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống

trong môi trƣờng NB trong 24h, lắc 150 vòng/phút, ủ tối, nhiệt độ phòng.

Nhân giống cho vi khuẩn Bacillus subtilis: từ ống thạch nghiêng đã đƣợc cấy

thuần, tiến hành nhân giống trong môi trƣờng NB trong 24h, lắc 150 vòng/phút, nhiệt

độ phòng.

Bƣớc 2: Thu canh trƣờng, pha loãng sao cho OD 600 nm ≈ 0,7. Cấy giống vào MT4

(MT3 + %NaCl ở thí nghiệm 2.6.3 đƣợc điều chỉnh pH tối ƣu khảo sát ở thí nghiệm

2.6.2) với các nghiệm thức nhƣ sau:

Đối chứng: Cấy giống vi khuẩn S. marcescens vào môi trƣờng MT4, tỷ lệ giống

3% .

Nghiệm thức S/B = 2/1: Cấy giống đồng thời hai giống vi khuẩn S. marcescens

tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 1,5%.

54

Đồ án tốt nghiệp

Nghiệm thức S/B = 1/1: Cấy giống đồng thời hai giống vi khuẩn S. marcescens

tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 3%.

Nghiệm thức S/B = 1/2: Cấy giống đồng thời hai giống vi khuẩn S. marcescens

tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 6%.

Bƣớc 3: lắc 200 vòng/phút ở 24h đầu và 150 vòng/phút ở 24h sau, ủ tối, nhiệt độ

phòng. Sau 48h thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2 nhƣ trong thí

nghiệm 2.6.1.

Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa

vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu.

2.7.4.2 Thí nghiệm đồng nuôi cấy với vi khuẩn Echerichia coli

Các bƣớc tiến hành thực hiện giống thí nghiệm 2.7.4.1 và thay chủng vi khuẩn

Bacillus subtilis là vi khuẩn gram + bằng vi khuẩn gram – E. coli.

2.7.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của sản phẩm Quorum sensing.

Bƣớc 1 ( nhân giống cấp 2): từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra độ tinh khiết cũng

nhƣ khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống cấp 2 trong môi trƣờng

NB trong 24h, lắc 150 vòng/phút, ủ tối, nhiệt độ phòng.

Bƣớc 2: lên men S. marcescens môi trƣờng MT5 (đậu phộng 10%+ peptone 5%

+ dầu hƣớng dƣơng 1% + 10ml H2O cất + % NaCl tối ƣu khảo sát ở thí nghiệm 2.7.3

và điều chỉnh pH thích hợp theo thí nghiệm 2.7.2), tỷ lệ cấy giống 3%.

Đối chứng: MT5 + 10ml nƣớc cất.

Nghiệm thức 1: MT5 + 10ml dịch nuôi cấy S. marcescens đã loại bỏ tế bào.

Nghiệm Thức 2: MT5 + 10 ml dịch nuôi cấy E. coli đã loại bỏ tế bào.

55

Đồ án tốt nghiệp

Bƣớc 3: lắc 200 vòng/phút ở 24h đầu và 150 vòng/phút ở 24h sau, ủ tối, nhiệt độ

phòng. Sau 48h thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2.

Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa

vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu.

2.8 Thu hồi sản phẩm thô

2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung môi đồng thời khảo sát thể tích lên men

Trích ly sắc tố bằng dung môi Ethanol : HCl (95:5) với tỷ lệ canh trƣờng : dung

môi (A:B) nhƣ các nghiệm thức sau 2:3, 1:2, 2:5. Trích ly theo sơ đồ hình 2.1 ở thí

nghiệm 2.6.1.

Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa

vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu.

2.8.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ

Các bƣớc tiến hành lên men thực hiện tƣơng tự thí nghiệm 2.6.1 Sau đó gia nhiệt

canh trƣờng ở 1000C, 15 phút.

Tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2.

Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa

vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu.

2.9 Các phƣơng pháp phân tích

Phân tích prodigiosin

Quang phổ hấp thụ UV/VIS, thiết bị đo mật độ quang.

Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và

giá trị đo OD tại bƣớc sóng λ =535 nm.

56

Đồ án tốt nghiệp

2.9.1 Xác định protein có trong mẫu

2.9.1.1 Phản ứng Biuret’s test

Hút 1 ml mẫu thêm 5-8 giọt NaOH 10% sau đó thêm 1-2 giọt CuSO4 3%.

Đem đun cách thủy từ 1-2 phút. Nếu dƣơng tính (+) sẽ tạo phức màu tím và

ngƣợc lại.

2.9.1.2 Phản ứng Nynhydrin

Hút 1ml mẫu vào ống nghiệm sau đó thêm 1ml nynhydrin 1%, đun nóng 1-2

phút.

Mẫu sau khi đun nóng có màu tím thì đƣợc xem là dƣơng tính (+).

2.9.2 Xác định lipid có trong mẫu

Chấm mẫu trên bản mỏng sắc ký.

Dùng CBB (Coomassie brilliant blue) 0.03% trong methanol 20% xịt và sấy

100oC.

Mẫu có màu xanh trên nền sáng đƣợc coi là có lipid trong mẫu.

2.10 Sắc ký bản mỏng TLC

Sử dụng dung môi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70:40:2, v:v:v) và bản

mỏng silica gel.

Chuẩn bị bản sắc ký

Dùng bút chì và thƣớc kẻ vạch đƣờng xuất phát để chấm mẫu cách mép dƣới

2cm và vạch kết thúc cách mép trên bản sắc ký 0,5 cm (Hình ...). Lƣu ý: không chạm

tay lên bản silicagel. Dùng bút chì vạch và chấm nhẹ lên bản silicagel tránh trầy xƣớc

lớp silicagel.

57

Đồ án tốt nghiệp

0,5 cm

Vạch kết thúc

2 cm

Vạch xuất phát

Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký

Mẫu sắc tố đƣợc chấm lên bản sắc ký theo vị trí đã đƣợc xác định trên vạch xuất

phát. Dùng vi quản để chấm mẫu. Mẫu chấm phải gọn, không lan rộng, có thể dùng

máy sấy để làm khô ngay. Chấm lặp lại nhiều lần để số lƣợng mẫu nạp đủ mức cần

thiết.

Tiến hành chạy sắc ký

Tiến hành cho mẫu chạy sắc ký với hệ dung môi trên. Cho bản sắc ký vào

buồng sắc ký chứa sẵn dung môi. Đảm bảo dung môi tiếp xúc gần sát vạch xuất phát.

Đậy nắp bình để tránh thất thoát dung môi và tránh ảnh hƣởng đến sức khỏe. Dung môi

sẽ thấy lên bản sắc ký theo lực mao dẫn và phân tách các thành phần của mẫu. Chấm

dứt chạy sắc ký khi dung môi thấm đến vạch kết thúc.

58

Đồ án tốt nghiệp

2.11 Phƣơng pháp phân tích

2.11.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin

Mục đích

Xác định đƣợc lƣợng hợp chất prodigiosin có trong mẫu từ đó đƣa ra kết luận cho

thí nghiệm.

Nội dung

Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và giá

trị đo OD tại bƣớc sóng λ =535 nm.

2.11.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Các số liệu thô đƣợc xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion

XV. Các số liệu sau đó đƣợc phân tích ANOVA và đƣợc trắc nghiệm phân hạng

LSD với mức ý nghĩa 0,05.

Các số liệu đƣợc tính toán và xử lý trên phần mềm Microsoft Office

Excel 2010. Các biểu đồ cũng đƣợc thể hiện bằng phần mềm này.

59

Đồ án tốt nghiệp

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết

Hình thái khuẩn lạc

Chủng S. marcescens SH1 sau khi nuôi cấy trên môi trƣờng NA (hình 3.1) tạo

khuẩn lạc đặc trƣng tròn, lồi, màu đỏ, có quầng sáng bao quanh. Đây cũng chính là đặc

điểm hình thái S. marcescens theo mô tả của David (2002).

Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuôi cấy trên môi trƣờng NA

Chủng SH1 tổng hợp sắc tố đỏ trên môi trƣờng NA làm cho khuẩn lạc có

màu đỏ (Hình 3.1) nhƣ theo mô tả của các tài liệu về khả năng tổng hợp sắc tố của

Serratia marcescens (Grimont và Grimont, 2006; Anita và cộng sự, 2006;

Chidambaram và cộng sự, 2009; Antony và cộng sự, 2011).

60

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng và soi nghiêng dƣới kính hiển vi vật

kính 10X.

Kết quả nhuộm gram

Nhuộm Gram là hình thức quan sát vi thể hình thái tế bào vi sinh vật và là cách đơn

giản nhất, nhanh nhất để phân biệt vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dƣơng.

Kết quả hình 3.3 cho thấy chủng phân lập có lớp peptidoglycan mỏng nên không

giữ đƣợc phức hợp crystal violet – iodine sau khi tẩy cồn và tiếp tục bắt màu hồng

với thuốc nhuộm fuchsin. Điều này cho thấy hai chủng phân lập đƣợc là Gram

âm, phù hợp với những mô tả về Serratia marcescens (Williams và Qadri, 1980;

Grimont và Grimont, 2006; David R.C.,2012).

61

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.3 Kết quả nhuộm Gram chủng SH1

Sau khi khẳng định là S. marcescens SH1, gửi mẫu cho công ty Nam Khoa thực

hiện kháng sinh đồ đƣợc kết quả nhƣ hình 3.4.

Hình 3.4 Kết quả kháng kháng sinh của chủng SH1

62

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.1 Kết quả kháng kháng sinh

S(Sensitivity) - Nhạy cảm: nghĩa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn có thể điều trị đƣợc với

liều thông thƣờng đã đƣợc khuyến cáo.

I(Intermediate) - Trung gian: là kiểu kháng trong đó với những nồng độ ức chế tối

thiểu của một kháng sinh thƣờng đạt đƣợc trong máu và tổ chức cho đáp ứng thấp hơn

so với kiểu nhậy cảm (S). Kháng trung gian phản ánh hiệu quả lâm sàng tại các cơ

quan, bộ phận mà thuốc phân bố.

R(Resistan) - Đề kháng: chủng vi khuẩn không bị ức chế bởi bất cứ nồng độ nào của

thuốc mà cơ thể có thể chấp nhận đƣợc.

Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueler-hinton có chứa các

chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh đƣợc

biểu hiện bằng đƣờng kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.

Cũng giống nhƣ các chủng khác của Enterobacteriaceae, S. marcescens và các loài

Serratia khác đều kháng penicillin G, các macrolides, clindamycin, linezolid, các

glycopeptide, quinupristin-dalfopristin và rifampin (Department of Pathology and Area

Laboratory Services, Madigan Healthcare System, Tacoma, Washington, 2011).

Hầu hết các chủng vi khuẩn thuộc chi Serratia, trong đó có S. marcescens thƣờng

kháng ampicillin, amoxicillin, amoxicillin-clavulanate, ampicillin-sulbactam,

63

Đồ án tốt nghiệp

cephalosporin phổ hẹp, cephamycins, cefuroxime, nitrofurantoin và colistin (CLSI,

2011; Stock và cộng sự, 2003). Cũng theo nghiên cứu của Stock và cộng sự thì một số

chủng Serratia nhƣ S. marcescens, S.odorifera, và S. rubidaea kháng nội với

tetracycline.

Thực tế là S. marcescens là một loại vi sinh vật đề kháng với rất nhiều loại kháng

sinh đã đƣợc công nhận ở nhiều trƣờng hợp. Ví dụ Wheat và cộng sự, trong báo cáo

chuyên đề của họ về 11 trƣờng hợp nhiễm trùng tiểu từ San Francisco vào năm 1951,

sau này xác định là S. marcescens, làm viêm màng trong tim gây tử vong do kháng

polymyxin B, Terramycin (oxytetracycline), chloramphenicol, streptomycin và

penicillin, nhạy cảm trung bình với sulfonamid.

Kết quả kháng sinh đồ ở bảng 3.1 và hình 3.4 cho thấy chủng S. marcescens

SH1 kháng 3 loại kháng sinh thông dụng là amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin,

tetracycline, đúng nhƣ mô tả ở các báo cáo trên. Sở dĩ S. marcescens SH1 kháng kháng

sinh amoxicillin-clavulanic acid bởi vì amoxicilin rất dễ bị phá hủy bởi beta -

lactamase, do đó không có tác dụng đối với những chủng vi khuẩn sản sinh ra các

enzyme này (S. marcescens SH1 thuộc chủng Enterobacteriaceae có khả năng sản sinh

ra enzyme này). Đối với 2 kháng sinh còn lại là ampicillin, tetracycline là 2 kháng sinh

phổ rộng thế hệ cũ chủng S. marcescens SH1 cũng gây ra tính kháng. Ngoài ra theo

bảng 3.1 thì chủng S. marcescens SH1 cũng kháng yếu với kháng sinh cefuroxime và

cefotaxime.

Một số loại kháng sinh nhạy cảm với Serratia rất phổ biến nhƣ quinolone và

trimethoprim-sulfamethoxazole. Qua khảo sát tất cả 110 chủng S. marcescens thu hồi

từ các mẫu bệnh 2008-2010 đều nhạy cảm với trimethoprim-sulfamethoxazole. Nói

chung, hầu hết các loài Serratia rất nhạy cảm với các kháng sinh nhóm

aminoglycosides. (Stock và cộng sự, 2003).

64

Đồ án tốt nghiệp

Qua bảng 3.1 và hình 3.4 thì chủng S. marcescens SH1 có tính nhạy cảm với các

kháng sinh ciprofloxacin, amikacin, ertapenem, ceftazidime, chloramphenicol,

imipenem, trimethoprim/sulfamethoxazole, cefepime, piperacillin/tazobactam,

gentamicin.

Serratia marcescens SH1 là chủng đƣợc phân lập từ tuyến trùng gây bệnh côn

trùng. Việc ứng dụng chủng phân lập từ môi trƣờng tự nhiên ứng dụng trong công nghệ

sinh học sản xuất các sản phẩm thuốc đã đƣợc nghiên cứu và thực hành trong nhiều

năm qua. Do Serratia marcescens là chủng tự thân kháng nhiều kháng sinh và nằm

trong danh sách đối tƣợng vi sinh vật gây bệnh cơ hội nên các biện pháp an toàn sinh

học cần đƣợc áp dụng khi nghiên cứu và sản xuất.

3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin

Quá trình này đƣợc thực hiện vì các nghiên cứu trƣớc đó của các bài báo nƣớc

ngoài cho nhiều kết quả khác nhau vì nhiều lý do, mà chủ yếu là các điều kiện môi

trƣờng. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này với mục đích tìm ra

đƣợc điều kiện nuôi cấy phù hợp với môi trƣờng phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

3.2.1 Ảnh hưởng của thể tích lên men lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp

Các thí nghiệm lên men tổng hợp prodigiosin từ S. marcescens SH1 trƣớc kia đƣợc

tiến hành với quy mô nhỏ phòng thí nghiệm, thể tích lên men là 20 ml/bình. Để có thể

cung cấp thông số kỹ thuật cho quá trình lên men việc tăng thể tích thí nghiệm là tất

yếu. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài thử thực hiện lên men với cùng thông số cung cấp từ

DATN Trần Lâm Tú Quyên 10DSH với quy mô 200 ml/bình và 400 ml/bình.

65

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.2 % Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp so với đối chứng (thí nghiệm A)

Tỉ lệ Thí nghiệm A Thí nghiệm B Thí nghiệm C

(20 ml/bình) (%) (200 ml/bình) (%) (400 ml/bình) (%)

Trung bình 100 ± 0 82,9 ± 3,2 47,8 ± 3,8

Kết quả cho thấy (hình 3.5) quy mô lên men tăng làm giảm hàm lƣợng prodigiosin

tổng hợp. Khi thể tích tăng từ 20 ml lên 200 ml thì hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp chỉ

bằng (82,9 ± 3,2) % so với đối chứng, khi thể tích là 400 ml thì tỷ lệ này chỉ còn (47,8

± 3,8) % so với đối chứng. Một điểm nữa cần nhận xét là màu hồng xuất từ 24-48 giờ

khi lên men 20 ml thì chỉ xuất hiện sau 48 giờ ở quy mô lên men lớn hơn. Vì vậy thời

gian lên men ở mẫu thí nghiệm là 72 giờ, tăng thêm 24 giờ so với đối chứng.

Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp

66

Đồ án tốt nghiệp

Phân tích nguyên nhân gây giảm hàm lƣợng prodigiosin khi tăng thể tích lên men

có thể dễ dàng nhận thấy yếu tố ảnh hƣởng mạnh nhất là oxy. Do môi trƣờng đậu

phộng có độ nhớt cao nên nhu cầu khuấy đảo (hoặc lắc) mạnh hơn để đạt đến cùng một

nhu cầu oxy cho vi sinh vật. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài khảo sát ảnh hƣởng của chế

độ lắc lên khả năng tổng hợp prodigiosin trong thí nghiệm tiếp theo.

3.2.2 Xác định vận tốc lắc

Quá trình lên men tạo sinh khối tế bào đề thu hợp chất thứ cấp rất cần oxi để cung

cấp cho vi khuẩn S. marcescens sinh tổng hợp. Khi chọn đƣợc số vòng lắc thích hợp sẽ

kích thích quá trình tăng trƣởng tế bào và đồng thời sinh tổng hợp prodigiosin. Kết quả

đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc.

Thí nghiệm Prodigiosin trung bình trích ly đƣợc từ

1ml canh trƣờng lên men mg/ml

1(180N/150N/150V) 8,9

2(180N/150N/150N/150V) 1,7

3(180N/150N/150N/0) 0,0

4(200V/150V/150V) 9,1

5(200V/200V/200V) 10,6

67

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.6 Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc

Từ kết quả ở hình 3.6 và bảng 3.3 nhận thấy việc sử dụng máy lắc ngang và máy

lắc vòng cũng nhƣ thay đổi vòng lắc có ảnh hƣởng đến hàm lƣợng prodigiosin. Trong 5

nghiệm thức ta thấy sử dụng máy lắc vòng ở chế độ lắc 200/200/200 vòng/phút thu

đƣợc kết quả tốt nhất. Do điều kiện cơ sở vật chất không cho phép nên việc lặp thí

nghiệm chƣa tốt, nhƣng qua thí nghiệm kết luận đƣợc rằng việc sử dụng máy lắc vòng

tốt hơn máy lắc ngang và tốt nhất ở chế độ lắc 200/200/200 vòng/phút. Môi trƣờng đậu

phộng có độ nhớt cao làm tăng nhu cầu oxy cung cấp. Quy mô lên men càng lớn thì đòi

hỏi lực khuấy đảo càng cao. Cũng do môi trƣờng nhƣ vậy và màu hồng canh trƣờng

xác định oxy hòa tan không thực hiện đƣợc bằng phƣơng pháp hóa học nhƣ phƣơng

pháp chuẩn độ iot – thiosunfat do L.W.Winkler đề xuất từ năm 1914, đã có nhiều cải

68

Đồ án tốt nghiệp

tiến để phù hợp với mẫu. Do đó nhu cầu oxy thực sự không xác định đƣợc, mà chỉ xác

định đƣợc số vòng lắc thích hợp trong điều kiện thí nghiệm.

3.2.3 Kết quả xác định pH tối ưu cho môi trường MT3

Quá trình tăng trƣởng của vi sinh vật rất nhạy cảm với pH, mỗi vi sinh vật thích

ứng với khoảng pH khác nhau. Vì vậy, tìm ra đƣợc pH phù hợp sẽ giúp cho quá

trình tăng trƣởng tế bào của vi sinh vật phát triển tốt hơn và tổng hợp hợp chất mong

muốn. S. marcescens có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012). Samrot

và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hóa sản xuất prodigiosin bởi

Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của prodigiosin. Kết

quả cho thấy điều kiện tối ƣu cho việc sản xuất prodigiosin trong môi trƣờng

Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Đối với điều kiện

nuôi cấy ở Việt Nam theo báo cáo đồ án tốt nghiệp của Trần Lâm Tú Quyên (2014) thì

khoảng pH của S. marcescens khá rộng nên không bị ảnh hƣởng trong khoảng 6,2 –

8,2, nhƣng cho mật độ tế bào cao nhất ở pH=7,2 nuôi trong môi trƣờng NB. Chính vì

vậy, ngƣời thực hiện đề tài quyết định khảo sát việc chỉnh pH =7,2, trong môi trƣờng

MT3 có chứa đậu phộng là môi trƣờng tối ƣu nhất đã đƣợc kết luận trong đồ án tốt

nghiệp của Trần Lâm Tú Quyên (2014), để nuôi cấy chủng vi khuẩn S. marcescens.

Prodigiosin là sắc tố gắn liền với sinh khối. Vì vậy điều kiện đầu tiên cần thiết cho

sinh tổng hợp prodigiosin là phát triển sinh khối. Kết quả cho thấy nếu nâng pH môi

trƣờng lên men ban đầu lên giá trị 7,2 là giá trị tối ƣu thu sinh khối S. marcescens, thì

nồng độ prodigiosin tổng hợp tăng thêm 63,3 %. Điều này tƣơng tự pH tối ƣu trong

môi trƣờng peptone glycerol để tổng hợp prodigiosin là 7,5 (DATN Nguyễn Hoàng

Anh Kha 09DSH).

69

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.4 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu

pH đầu Prodigiosin trong 1ml canh pH cuối

trƣờng lên men (mg/ml)

5,63 ± 0,13 2,0 ± 0,2 (a) 7,60 ± 0,13

7,2 ± 0.00 3,3± 0,2 (b) 8,19 ± 0,03

(Các giá trị có các chữ cái giống nhau ở cùng một cột thì không có sự khác

biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa 0,05)

Hình 3.7 Ảnh hƣởng của pH lên sự tổng hợp prodigiosin của S. marcescens SH1.

Chính vì vậy ngƣời thực hiện đề tài quyết định chỉnh pH =7,2 cho môi trƣờng MT3

trƣớc khi nuôi cấy S. marcescens cho các thí nghiệm tiếp theo.

70

Đồ án tốt nghiệp

3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp

Trong tài liệu có nhiều ý kiến khác nhau về ảnh hƣởng của nồng độ muối lên sinh

tổng hợp prodigiosin ở S. marcescens. Theo Sil Verman và Munoz (1973), 3% NaCl

trong môi trƣờng phức hợp chứa 10 ug/ml Fe ức chế tổng hợp prodigiosin ở S.

marcescens, nhƣng ở nồng độ thấp hơn là 0,1 % NaCl lại không xảy ra hiện tƣợng ức

chế. Theo Rjazantseva IN và cộng sự (1994) lại kết luận rằng nồng độ NaCl 4-5 % làm

tăng hàm lƣợng prodigiosin do S. marcescens tổng hợp, trong khi theo Wei và cộng sự.

(2005) thì không có NaCl trong môi trƣờng là điều kiện tổng hợp prodigiosin cao nhất.

Samrot và cộng sự (2011) cho biết đối với S. marcescens SU 10 nồng độ muối tối ƣu

để tổng hợp prodigiosin là 0,75%. Vì vậy thí nghiệm này nhằm khảo sát ảnh hƣởng

nồng độ muối lên khả năng tổng hợp prodigiosin của S. marcescens SH1 phân lập từ

tuyến trùng EPN.

Kết quả thí nghiệm cho thấy ở nồng độ NaCl 1% trong môi trƣờng đậu phộng bổ

sung peptone và dầu hƣớng dƣơng, hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp là cao nhất, cao

hơn 52,5 % so với đối chứng không bổ sung muối trong môi trƣờng. Tăng nồng độ

muối lên 2 % thì hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp thấp hơn so với bổ sung 1 % NaCl

nhƣng sai khác không có ý nghĩa thống kê với (p<0,05). Nồng độ NaCl 3% làm giảm

hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp, tuy nhiên không sai khác so với đối chứng với mức

so sánh p < 0,05.

Để giải thích cho ảnh hƣởng của nồng độ NaCl lên khả năng tổng hợp prodigiosin

của chủng nghiên cứu, chúng tôi so sánh pH giữa các nghiệm thức cuối kỳ lên men.

Mặc dù pH lúc đầu lên men đã đƣợc điều chỉnh về giá trị tối ƣu là 7,2 cho mọi nghiệm

thức, nhƣng pH sau lên men giảm khi tăng nồng độ NaCl trong môi trƣờng. Nhƣ trên

bảng 3.5 và hình 3.8.

71

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.5 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung muối NaCl

Nghiệm thức Prodigiosin tổng hợp (mg/ml) pH sau lên men

Đối chứng 12,1 ± 0,8 (a) 8,02 ± 0,10(a)

1% 18,5 ± 2,5 (b) 7,19 ± 0,16(b)

2% 13,00 ± 4,7 (ab) 6,89 ± 0,10(c)

3% 7,7 ± 3,8 (a) 6,52 ± 0,11(d)

Hình 3.8 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung NaCl.

72

Đồ án tốt nghiệp

Từ bảng 3.5 quả nhận thấy ở nồng độ muối NaCl làm thay đổi pH sau khi lên

men dẫn đến sự thay đổi hàm lƣợng prodigiosin trong quá trình lên men. Rõ ràng là khi

bổ sung muối NaCl 1% vào môi trƣờng lên men cho hàm lƣợng prodigiosin cao hơn

mẫu đối chứng 52,5%. Khi bổ sung hàm lƣợng muối NaCl ở nồng độ càng cao thì pH

càng giảm, làm môi trƣờng có tính acid điều này không thuận lợi cho sự phát triển của

S. marcescens. Vì vậy ngƣời thực hiện đề tài quyết định chọn nồng độ muối 1% để bổ

sung vào môi trƣờng nuôi cấy cho các thí nghiệm sau.

3.2.5 Kết quả thí nghiệm đồng nuôi cấy

Đồng nuôi cấy là phƣơng pháp gần đây thƣờng đƣợc sử dụng để kích thích sự

tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở vi sinh vật (Bartrand et al., 2014). Đồng nuôi cấy tạo

ra điều kiện stress sinh học lên chủng tổng hợp hợp chất thứ cấp, bắt chƣớc điều kiện

trong tự nhiên. Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có

thể kháng một số loài vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Staphylococcus

saprophyticus, Bacillus subtilus, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes,

Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis,

Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus…(Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng

sự, 2012). Ngoài ra theo Nguyễn Hiếu Dân, DATN 09DSH S. marcescens SH1 đối

kháng yếu Bacillus sp. và E. coli, từ đấy có thể thấy hai vi khuẩn chị thị này có thể gây

stress đối với S. marcescens SH1. Từ đó chúng tôi quyết định đồng nuôi cấy S.

marcescens SH1 và Bacillus sp. hoặc E. coli.

3.2.5.1 Đồng nuôi cấy với Bacillus subtilis

Bacillus sp. có đặc điểm phát triển là kị khí tùy nghi, không cạnh tranh nhiều oxy

với S.marcecens. pH tăng trƣởng và sinh protease trong điều kiện pH 7-7,4. Điều kiện

thí nghiệm là giữ nguyên mật độ S. marcescens SH1, chỉ thay đổi mật độ Bacillus sp.

theo tỷ lệ 2:1; 1:1; và 1:2 so với S. marcescens.

73

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.6 % prodigiosin tổng hợp so với đối chứng

Đối chứng (%) S/B 1:2 (%) S/B 1:1 (%) S/B 2:1 (%)

Prodigiosin tổng 100 ± 50,6 (a) 66,8 ± 34,5 (a) 64,6 ± 28,4 (a) 96,7 ± 22 (a) hợp (% ĐC)

Hình 3.9 Đồng nuôi cấy Serratia marcescens SH1 và Bacillus sp.

Hình 3.9 cho thấy đồng nuôi cấy S. marcescens SH1 với Bacillus sp giữ ngƣợc lại

với kỳ vọng không làm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp, mà còn có xu hƣớng làm

giảm mặc dù sai khác không có ý nghĩa thống kê. Hai vi khuẩn này đều có khả năng

thủy phân protein, có cùng điều kiện nuôi cấy. Tuy nhiên giá trị trung bình trong

nghiệm thức tỷ lệ S/B = 2:1 là lớn nhất đạt 96,7 % và sai số tƣơng đối nhỏ nhất so

74

Đồ án tốt nghiệp

với đối chứng và các nghiệm thức còn lại. Điều này cũng hợp lý do tỷ lệ S. marcescens

càng lớn thì khả năng cạnh tranh càng cao. Trong thiết kế thí nghiệm này chƣa thấy

đƣợc hiệu quả của đồng nuôi cấy lên sự tổng hợp hợp chất thứ cấp. Có thể hiệu quả

này sẽ đƣợc phát huy khi giảm mật độ Bacillus sp. đến một giá trị thích hợp.

3.2.5.2 Kết quả đồng nuôi cấy vi khuẩn E. coli

Sau khi tiến hành thử nghiệm ở vi khuẩn Gram dƣơng, ngƣời thực hiện đề tài

tiến hành thử nghiệm ở vi khuẩn Gram âm, để tìm ra giải pháp tăng hàm lƣợng

prodigiosin tổng hợp.

E. coli là vi khuẩn có khả năng sử dụng môi trƣờng protein và có điều kiện nuôi cấy

tƣơng tự S. marcescens. Tuy nhiên khi đồng nuôi cấy E. coli với S. marcescens SH1

với tỷ lệ E/S=2:1 thì hàm lƣợng sắc tố tổng hợp giảm hẳn, có thể nhận thấy bằng mắt

thƣờng

Hình 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy E. coli, A) Đối chứng, B) Nghiệm thức E/S =

1:2 (E. coli + S. marcescens (tỷ lệ E. coli : S. marcescens 1:2)).

Sau khi tiến hành lên men thu đƣợc kết quả nhƣ hình 3.10. Đồng nuôi cấy với vi

khuẩn E. coli đã cạnh tranh hết nguồn chất dinh dƣỡng với S. marcescens nên việc tạo

ra hàm lƣợng prodigiosin trong việc nuôi cấy là rất ít. Kết quả này ngƣợc lại với kết

75

Đồ án tốt nghiệp

quả đối kháng trong DATN Nguyễn Thị Hiếu Dân là S. marcescens SH1 có khả năng

lấn át E. coli trong phƣơng pháp cấy chéo trên đĩa thạch. So sánh đồng nuôi cấy S.

marcescens SH1 với Bacillus sp. và với E. coli thì đồng nuôi cấy với Bacillus sp. khả

quan hơn. Trong tài liệu có nói đến cơ chế truyền tín hiệu của vi khuẩn Gram âm (hiện

tƣợng quorum sensing) qua trung gian phân tử tín hiệu AHL. Tuy nhiên E. coli là vi

khuẩn có kết quả thử nghiệm Indol +, tƣơng đƣơng có sự tạo thành Indol trong môi

trƣờng khi nuôi cấy. Indol theo tài liệu mới gần đây là chất làm giảm độc lực của S.

marcescens qua ức chế quorum sensing (Hidalgo-Romano et al., 2014).

3.2.6 Sử dụng dịch trong nuôi cấy

Sau quá trình lên men thu sinh khối và thay vì loại bỏ dịch trong, ngƣời thực

hiện đề tài sử dụng lại nguồn dịch trong để tiến hành thí nghiệm. Tƣơng tự, dịch trong

vi khuẩn E. coli tăng sinh trong môi trƣờng NB trong 24h, sau khi ly tâm loại bỏ tế bào

cũng đƣợc sử dụng. Cơ sở của thí nghiệm này là các vi khuẩn Gram âm nhƣ Serratia

marcescens và E. coli đều đƣợc hoạt động theo cơ chế quorum sensing. Các phân tử tín

hiệu AHL đƣợc tổng hợp trong quá trình nuôi cấy có thể giúp tăng sinh khối nhanh và

cải thiện độc lực trong quá trình nuôi cấy. Các phân tử tín hiệu này nằm trong dịch

trong của canh trƣờng lên men vi khuẩn Gram âm. Từ đó chúng tôi thử sử dụng dịch

trong canh trƣờng nuôi cấy S. marcescens SH1 và E. coli bổ sung vào môi trƣờng mới

chuẩn bị.

Bảng 3.7 Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp khi bổ sung dịch nuôi cấy.

Đối chứng Dịch trong S. Dịch trong E. coli

(mg/ml) marcescens(mg/ml) (mg/ml)

Hàm lƣợng prodigiosin 26,0 ± 13,2 (a) 27,4 ± 10,4 (a) 26,7 ± 2,7 (a)

76

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.7 cho thấy hàm lƣợng prodigiosin không có sự sai khác giữa các nghiệm

thức. Nhƣ vậy trong khuôn khổ DATN, hàm lƣợng prodigiosin do S. marcescens tổng

hợp tăng nhờ áp dụng chế độ khuấy đảo lớn nhất có thể trong phòng thí nghiệm là máy

lắc vòng 200 vòng/phút trong 3 ngày. Nhờ điều chỉnh pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu

từ pH = 5,6 lên pH = 7,2, hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp tăng 63,3 %, bổ sung NaCl

1 % làm tăng hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp lên thêm 52,5%. Các cố gắng tiếp theo

nhằm tăng hàm lƣợng prodigiosin bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy hoặc bổ sung dịch

trong canh trƣờng vi khuẩn Gram âm đều không đạt kết quả mong đợi, cần đƣợc

nghiên cứu thêm.

3.3 Thu hồi sản phẩm lên men từ canh trƣờng

3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ canh trường: dung môi trích ly lên hàm lượng prodigiosin

thu hồi

Vi sinh vật tổng hợp sắc tố ở hai dạng: ngoại bào và liên kết trong tế bào (Allen

và cộng sự, 1983). Vì thế ta phải trích ly sắc tố từ trong tế bào ra ngoài môi trƣờng.

Sau khi tổng hợp sắc tố trên môi trƣờng MT3 quy trình lên men nhƣ thí nghiệm

2.6.1 sắc tố đƣợc trích ly bằng dung môi Ethanol:HCl (95:5) với tỷ lệ canh trƣờng :

dung môi là 2:3, 1:2, 2:5.

Bảng 3.8 % Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng : dung môi trích ly

Tỉ lệ 2:3 (đối chứng) (%) Tỉ lệ 1:2 (%) Tỉ lệ 2:5 (%)

Prodigiosin tổng hợp 100 ± 0 150,8 ± 17,7 139 ± 7,2 (% so với đối chứng)

77

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.11. Hàm lƣợng prodigiosin thu hồi sau trích ly nhờ tỷ lệ canh trƣờng:

dung môi khác nhau.

Hình 3.11 cho thấy tỷ lệ canh trƣờng : dung môi (Ethanol:HCl (95:5) (v:v)) tỷ lệ

1:2 và tỷ lệ 2:5 cho hàm lƣợng prodigiosin cao hơn đối chứng tỷ lệ 2:3 là (50,8 ± 17,7)

% và (39,0 ± 7,2) %. Sai khác giữa hai tỷ lệ thì nghiệm không có ý nghĩa thống kê

(p>0,05). Nhƣng vì tính kinh tế ngƣời thực hiện đề tài quyết định chọn tỷ lệ trích ly

canh trƣờng : dung môi (Ethanol:HCl = 95:5) là 1:2 cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.3.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia nhiệt canh trường

Theo nghiên cứu trƣớc đó (DATN Nguyễn Hoàng Anh Kha), prodigiosin bền nhiệt ngay cả ở 1000C. Nhận thấy trong quá trình trích ly việc loại bỏ dịch trong thƣờng gây

thất thoát hàm lƣợng prodigiosin trong thao tác tiến hành. Đồng thời việc trích ly trực

tiếp dễ bị nhiễm vi sinh vật đối với ngƣời thực hiện thao tác, nhất là khi đƣa ra sản xuất

ở quy mô công nghiệp.

78

Đồ án tốt nghiệp

Chính vì vậy ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đun cách thủy canh trƣờng trong vòng 15 phút, ở 1000C trƣớc khi đem trích ly. Điều này giúp canh trƣờng trƣớc khi

trích ly loại bỏ dịch trong mà không cần qua ly tâm, đồng thời cũng giết đƣợc vi khuẩn

tránh bị nhiễm môi trƣờng xung quanh và đặc biệt là ngƣời thao tác.

Tiến hành đun canh trƣờng sau lên men làm nƣớc trong canh trƣờng (dịch

trong) bốc hơi hầu nhƣ hoàn toàn. Quá trình này nhằm tránh thất thoát canh trƣờng khi

ly tâm loại bỏ dịch trong nhƣ quy trình bình thƣờng (hình 3.12).

Hình 3.12 Canh trƣờng sau khi ly tâm

A. Canh trƣờng không đun B. Canh trƣờng đun 1000C trong vòng 15 phút.

79

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.13. Sắc tố đỏ sau khi trích ly với dung môi Etanol:HCl (95:5).

A. Sắc tố của canh trƣờng không đun. B. Sắc tố của canh trƣờng đun 1000C trong vòng 15 phút.

Đồng thời trong quá trình đun sẽ giết chết đƣợc vi khuẩn, làm hạn chế nhiễm

khuẩn trực tiếp cho ngƣời thực hiện thao tác trích ly. Đƣợc tiến hành thử nghiệm bằng

cách cấy canh trƣờng sau khi đun lên môi trƣờng NA (hình 3.14).

80

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.14. Vi khuẩn S. marcescens đƣợc cấy trên môi trƣờng NA.

A. Đối chứng ( canh trƣờng chƣa đun). B. Canh trƣờng đƣợc đun 1000C trong vòng 15 phút.

Bảng 3.9. Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong thí nghiệm

Nghiệm thức Prodigiosin trong 1ml canh trƣờng lên men

Đối chứng 10,2 ± 4,3 (a)

Đun 1000C trong vòng 15 phút 26,2 ± 5,9 (b)

Điều quan trọng là trong quá trình đun hàm lƣợng prodigiosin đƣợc trích ly cao

hơn nhiều so với việc không đun. Cao hơn mẫu đối chứng là 157,12% (hình 3.15).

81

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.15. Hàm lƣợng prodigiosin so với đối chứng.

Mẫu tinh khiết của prodigiosin trong dung môi Ethanol : HCl (95:5) cho thấy

nó có độ hấp thụ cao và duy nhất tại bƣớc sóng 535 nm trong quang phổ UV (Giri và

cộng sự, 2004). Dựa vào đặc điểm này ngƣời thực hiện đề tài tiến hành đo phổ hấp thụ

của sắc tố trƣớc và sau khi đun để kiểm chứng.

3.3.3 Ảnh hƣởng của việc gia nhiệt canh trƣờng đến chất lƣợng prodigiosin

trong sản phẩm

Để khảo sát liệu gia nhiệt có làm ảnh hƣởng lên chất lƣợng sản phẩm không và

thành phần các chất trong sản phẩm sắc tố thô, các khảo sát sau đƣợc tiến hành.

82

Đồ án tốt nghiệp

Quang phổ hấp thụ UV/VIS:

Đối chứng (canh

trƣờng không

đun)

Canh trƣờng đun

Hình 3.16. Kết quả quét quang phổ của sắc tố canh trƣờng không đun và đun 1000C.

Qua kết quả quét quang phổ nhận thấy mẫu đun ở 1000C có bƣớc sóng λmax=

535 nm tƣơng đồng với phổ nhận đƣợc ở mẫu đối chứng không đun, trùng khớp với

báo cáo của Giri và cộng sự, 2004. Nguyễn Hoàng Anh Kha cũng đã khảo sát prodigiosin tổng hợp từ môi trƣờng peptone glycerol cho biết xử lý nhiệt 1000C, 15

phút không làm ảnh hƣởng lên prodigiosin. Điều này tạo cơ sở tin tƣởng rằng đây là

hợp chất prodgiosin. Nhƣ vậy trong quá trình đun không làm biến đổi hợp chất thứ cấp

là prodigiosin.

83

Đồ án tốt nghiệp

3.4 Xác định thành phần hóa học trong mẫu

3.4.1. Phản ứng Biuret’s test

Phản ứng Biuret’s test này nhằm nhận diện liên kết peptide có trong mẫu phản ứng. Ion Cu2+ sẽ tạo phức màu tím với liên kết peptide có trong mẫu. Ngƣời thực hiện đề tài

chọn BSA (Bovine sodium albumin) làm mẫu đối chứng. Và dùng thí nghiệm này để

xác định protein có trong mẫu dịch trong sau nuôi cấy và trong mẫu sau khi trích ly

bằng Ethanol: HCl (95:5).

Hình 3.17 Biuret’s test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly

prodigiosin thô.

1. Hợp chất thứ cấp prodigiosin sau khi trích ly Ethanol:HCl

2. Dịch nuôi cấy sau ly tâm

3. BSA

4. Peptone

84

Đồ án tốt nghiệp

Từ hình 3.17 nhận thấy ở 2 mẫu đối chứng là BSA và peptone cho màu tím đặc

trƣng. Sau khi thực hiện thí nghiệm ở mẫu 1 hợp chất thứ cấp prodigiosin có màu tím

khá giống mẫu đối chứng, chứng tỏ có liên kết peptide trong mẫu. Ở mẫu 2 là mẫu dịch

nuôi cấy sau ly tâm có màu đỏ đậm không giống mẫu đối chứng, kết luận rằng mẫu 2

không có liên kết peptide, tức là không còn chứa protein.

3.4.1.2 Phản ứng Nynhydrin

Phản ứng Nynhydrin giúp ta nhận diện đƣợc sự có mặt của các acid amin tự do

trong mẫu cần xác định. Ngƣời thực hiện đề tài sử dụng BSA, peptone, tyrosin làm đối

chứng. Cả ba mẫu sau phản ứng đều có màu tím đậm đƣợc thể hiện ở hình 3.18.

Đối chứng Mẫu thí nghiệm

Hình 3.18 Ninhydrin test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly

prodigiosin thô ở thí nghiệm đun và không đun canh trƣờng.

1. Đối chứng BSA

2. Đối chứng Peptone

85

Đồ án tốt nghiệp

3. Đối chứng Tyrosine

4. Dịch nuôi cấy sau ly tâm

5. Hợp chất thứ cấp prodigiosin sau khi trích ly Ethanol:HCl (canh trƣờng

không đun)

6. Hợp chất thứ cấp prodigiosin sau khi trích ly Ethanol : HCl (ở thí nghiệm

đun canh trƣờng).

Từ hình 3.18 nhận thấy rõ ràng là cả 3 mẫu thí nghiệm đều chuyển màu tím

đậm, giống với màu 3 mẫu đối chứng dƣơng. Vậy ta kết luận rằng ở cả ba mẫu dịch

trong, hợp chất thứ cấp prodigiosin đun và không đun đều có chứa các acid amin tự do,

có thể trong mẫu có protein hoặc amino acid.

3.4.2 Xác định lipid có trong mẫu

Phản ứng Coomassie brilliant blue giúp nhận diện lipid có trong mẫu. Ngƣời

thực hiện đề tài sử dụng dầu hƣớng dƣơng để làm mẫu đối chứng vì trong dầu có hàm

lƣợng chất béo rất cao. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.19.

86

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.19. Kết quả mẫu phản ứng Coomassie brilliant blue trƣớc và sau khi phun

thuốc thử.

1. Hợp chất thứ cấp prodigiosin sau khi trích ly Ethanol:HCl (canh

trƣờng không đun)

2. Hợp chất thứ cấp prodigiosin sau khi trích ly Ethanol:HCl (canh

trƣờng đun nóng)

3. Dịch trong sau khi lên men

4. Dầu hƣớng dƣơng

Từ kết quả hình 3.19 nhận thấy ở 3 mẫu thí nghiệm đều có vầng sáng trên nên

xanh dƣơng giống với mẫu đối chứng là dầu hƣớng dƣơng, chứng tỏ mẫu có chứa

lipid.

Kết quả khảo sát nhanh protein, lipid đƣợc ghi nhận ở bảng 3.10.

87

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.10. Kết quả xác định protein và lipid

Mẫu Biuret Nynhydrin Coomasie

blue (lipid)

+ Peptone +

+ BSA +

Tyrosine +

Dầu hƣớng dƣơng +

Dịch nuôi cấy sau ly - + +

tâm

Dịch trích ly sắc tố + + +

thô

Dịch trích ly sắc tố + +

thô (đã xử lý nhiệt)

3.5 Sắc ký bản mỏng TLC

Kết quả sắc ký bản mỏng sử dụng dung môi Petrolium ether: Ether : Acetic acid

(70:40:2, v:v:v) đƣợc trình bày trên hình 3.20.

88

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.20. Kết quả sắc ký bản mỏng sử dụng hệ dung môi Petrolium ether:

Ether : Acetic acid (70:40:2, v:v:v).

1. Prodigiosin thô trích ly bằng Ethanol :HCl (canh trƣờng không đun)

2. Prodigiosin thô trích ly bằng Ethanol :HCl (canh trƣờng đun)

3. Prodigiosin trích ly lỏng-lỏng (canh trƣờng không đun)

4. Prodigiosin trích ly lỏng-lỏng (canh trƣờng đun)

5. Mẫu prodigiosin trích ly từ môi trƣờng PG

Kết quả hình 3.20 cho thấy không có sự khác biệt giữa vệt màu ở canh trƣờng

thu hồi bằng phƣơng pháp đun so với không đun thu hồi từ canh trƣờng đậu phộng,

cũng không khác biệt với mẫu prodigiosin đƣợc thu hồi từ canh trƣờng peptone

glycerol đã qua trích ly lỏng lỏng.

89

Đồ án tốt nghiệp

Từ kết quả trên quy trình lên men và thu hồi sắc tố prodigiosin thô ngƣời thực

hiện đề tài xây dựng đƣợc quy trình lên men SH1 tổng hợp prodigiosin quy mô 400

ml/bình.

Đậu phộng 10%

Peptone 5%

Chủng SH1 từ ống thạch nghiêng tra độ đã kiểm thuần khiết Dầu hƣớng dƣơng 1% Chuẩn bị môi trƣờng MT4 với V= 400 ml/bình

NaCl 1%

Chỉnh pH =7,2

Nhân giống cấp 2 trong môi trƣờng Nutrient broth trong 24h Hấp khử trùng trong 15’ ở áp suất 1 atm, nhiệt độ 1210C. lắc 150 vòng/phút,

ủ tối, nhiệt độ phòng.

Cấy giống với tỷ lệ 3%,.

Pha loãng giống về OD600 ~ 0,7

lên men lắc 200 vòng/phút trong

72h, ủ tối, nhiệt độ phòng

Gia nhiệt 1000C trong 15 phút

Trích ly bằng dung môi Ethanol : HCl (95:5, v:v) tỷ lệ canh trƣờng : dung môi 1:2

Cô quay

.

Sắc tố thô

Hình 3.21 Sơ đồ quy trình S. marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin

90

Đồ án tốt nghiệp

Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

Chủng S. marcescens SH1 tự thân kháng nhiều kháng sinh và nằm trong danh sách

đối tƣợng vi sinh vật gây bệnh cơ hội nên các biện pháp an toàn sinh học cần đƣợc áp

dụng khi nghiên cứu và sản xuất.

Thể tích lên men càng lớn thì hàm lƣợng tổng hợp prodigiosin càng giảm khi nuôi

cấy ở cùng điều kiện. Màu hồng xuất hiện từ 24 - 48 giờ khi lên men 20 ml/bình và chỉ

xuất hiện sau 48 giờ ở quy mô lên men lớn hơn. Vì vậy thời gian lên men ở thể tích

200 ml/bình và 400 ml/bình là 72 giờ, tăng thêm 24 giờ so với đối chứng.

Sử dụng máy lắc vòng tốt hơn máy lắc ngang và tốt nhất ở chế độ lắc 200/200/200

vòng/phút ở quy mô 400 ml/bình.

Chỉnh pH =7,2 cho hàm lƣợng prodigiosin cao hơn việc không chỉnh là 63,3 %.

Bổ sung muối NaCl 1% vào môi trƣờng lên men cho hàm lƣợng prodigiosin cao

hơn mẫu đối chứng 52,5%.

Sử dụng tỷ lệ trích ly canh trƣờng : dung môi (Ethanol:HCl (95:5) (v:v)) tỷ lệ 1:2

cho hàm lƣợng prodigiosin cao hơn đối chứng tỷ lệ 2:3 là (50,8 ± 17,7) %.

Tiến hành đun canh trƣờng ở 100oC trong 15 phút trƣớc khi trích ly Ethanol :HCl

cho hàm lƣợng prodigiosin cao hơn mẫu đối chứng là 157,12%. Đồng thời tiêu diệt vi

sinh vật và tối ƣu hóa quá trình trích ly mà không làm thay đổi bản chất hợp chất thứ

cấp trích ly là prodigiosin.

Trong tất cả các mẫu trích ly prodigiosin bằng Ethanol : HCl, không bổ sung hay

bổ sung muối NaCl, đun hay không đun đều cho kết quả chứa lipid và protein.

91

Đồ án tốt nghiệp

4.2 Kiến nghị

Phƣơng pháp đồng nuôi cấy hoặc bổ sung dịch trong canh trƣờng vi khuẩn

Gram âm đều không đạt kết quả mong đợi, cần đƣợc nghiên cứu thêm.

Nghiên cứu lên men quy mô fermenter.

Khảo sát thêm việc bổ sung enzyme protease vào môi trƣờng đậu phộng để

giảm hàm lƣợng peptone trong môi trƣờng.

92

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2013. Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng hợp

bởi vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN. Đồ án tốt nghiệp.

Nguyễn Hiếu Dân, 2013. Khảo sát hoạt tính sinh học của vi khuẩn Serratia

marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và hợp chất màu dạng

prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn này. Đồ án tốt nghiệp.

Trần Lâm Tú Quyên, 2014. Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để

sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn S. marcescens SH1. Đồ án tốt nghiệp.

Võ Hồng Thi, 2012. Bài giảng thực hành hóa kỹ thuật môi trường. Trƣờng ĐH Công

nghệ Tp.HCM

Tài liệu tiếng anh

Aguilera M.M. and Smart J.R.(1993). Development, reproduction, and pathogenicity

of Steinernema scapterisci in monoxenic culture with different species of

bacteria, J. Invertebr, Pathol, 62: 289-294.

Amaya D.B.R. (2001). A Guide to Carotenoid Analysis in Foods, OMNI Research,

ILSI Press, United States of America, pp. 1 -71.

Anita Khanafari, Mahnaz Mazaheri Assadi and Fatemeh Ahmadi Fakhr (2006).

Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens, Online Journal of

Biological Sciences, 6 (1): 1-13.

Antony V. S., Chandana K., Senthilkumar P., Narendra K. G. (2011). Optimization

of prodigiosin production by Serratia marcescens SU-10 and evaluation of its

93

Đồ án tốt nghiệp

bioactivity. International Research Journal of Biotechnology, Vol.2(5), 128-

133.

Bauernfeind J.C. (1981) Natural food colors. Carotenoids as Colorants and

Vitamin A Precursors, Bauernfeind J.C., Academic Press, New York, 1-45. Bizio B.

(1823). Lettera di Bartolomeo Bizio al chiarissimo canonico Angelo Bellani

sopra il fenomeno della polenta porporina Biblioteca Italiana o sia Giornale

di Letteratura, Scienze e Arti, 30: 275-295.

Brigida P.V. de Q. and Itamar S. de M. (2006). Antagonism of Serratia marcescens

towards Phytophithora parasitica and its effects in promoting the growth of

Citrus, Brazilian Journal of Microbiology, 37: 448-450.

Casullo de Araújo, Helvia W., K. Fukushima, and Galba M. Campos Takaki.

"Prodigiosin production by Serratia marcescens UCP 1549 using renewable-

resources as a low cost substrate." Molecules 15.10 (2010): 6931-6940.

Cerdeno A. M., Bibb M. J., Challis G. L. (2001). Analysis of the prodiginine

biosynthesis gene cluster of Streptomyces coelicolor A3 (2): new mechanisms

for chain initiation and termination in modular multienzymes. Chem. Biol, 8,

817-829.

Chang, Chia-Che, et al. "Development of natural anti-tumor drugs by

microorganisms." Journal of bioscience and bioengineering 111.5 (2011):

01-511.

Chandni Gulani, Sourav Bhattacharya and Arijit Das (2012). Assessment of process

parameters influencing the enhanced production of prodigiosin from Serratia

marcescens and evaluation of its antimicrobial, antioxidant and dyeing

potentials.

94

Đồ án tốt nghiệp

Chen D., Han Y., Gu Z. (2006). Application of statistical methodology to the

optimization of fermentative medium for carotenoids production by

Rhodobacter sphaeroides. Process Biochem, 41, 1773-1778.

Chidambaram K.V., Perumalsamy L. (2009). An Insightful Overview on Microbial

Pigment, Prodigiosin, Electronic Journal of Biology, Vol. 5(3): 49-61.

CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA), (2011). Performance

standards for antimicrobial susceptibility testing; 21st informational supplement.

CLSI document M100–S21.

Counsell J.N., Jeffries G.S. and Knewstubb C.J. (1979). Some other natural colors

and their applications, Natural Colors for Foods and Other Uses, Counsell

J.N. and Dunastable J.A., Eds Applied Science, London, 122-151.

D'Alessio R., Bargiotti A., Carlini O., Colotta F., Ferrari M., Gnocchi P., Isetta A.,

Mongelli N., Motta P., Rossi A., Rossi M., Tibolla M., Vanotti E. (2000).

Synthesis and immunosuppressive activity of novel prodigiosin derivatives. J.

Med. Chem, 43, 2557-2565.

Dauenhauer S.A., Hull R.A. and Williams R.P. (1984). Cloning and expression in

Escherichia coli of Serratia marcescens genes encoding prodigiosin

biosynthesis, Journal of Bacteriology, 158: 1128-1132.

David R. Caprette (2012). Enterobacteriaceae: Serratia marcescens. Rice

University. Houston, Texas, US.

Department of Pathology and Area Laboratory Services, Madigan Healthcare System,

Tacoma, Washington (2011). Serratia Infections: from Military Experiments to

Current Practice, p. 755–791 Vol. 24, No. 4

95

Đồ án tốt nghiệp

Doi, Y., et al. (2004). Plasmid-mediated 16S rRNA methylase in Serratia marcescens

conferring high-level resistance to aminoglycosides. Antimicrob. Agents

Chemother. 48:491–496.

Estrada, Castro, Regina Basurto-Ríos, Jorge Toledo, Jorge E. Ibarra (2012).

Phoresis between Serratia marcescens and Steinernema carpocapsae (Rhabditida:

Steinernematidae) during Infection of Galleria mellonella (Lepidoptera:

Pyralidae) Larvae, Florida Entomologist, 95(1):120-127.

Feng J.S., Webb J.W. and Tsang J.C. (1982). Enhancement by sodium dodecyl

sulfate of pigment fonnation in Serratia marcescens O8, Appl, Environ,

Microbiol, 43: 850-853.

Florencio J.A., Soccol C.R., Furianetto L.F., Bonfim T.M.B., Krieger N., Baron M.

and Fontana J.D. (1998). A factorial approach for a sugarcane juice-

based low cost culture medium: increasing the astaxanthin production by

the red yeast Phaffia rhodozyma, Bioprocess Eng, 19,161-164.

Fodor A., Fodor A.M., Forst S., Hogan J.S., Klein M.G., Lengyel K., Saringer G.,

Stackebrandt E., Taylor R.A.J. and Lehoczky E. (2010). Comparative

analysis of antibacterial activities of Xenorhabdus species on related and

non-related bacteria in vivo, J. Microbiol, Antimicrob, 2: 36-46.

Furstner A. (2003). Chemistry and biology of roseophilin and the prodigiosin

alkaloids: A survey of the last 2500 years, Chem Int Ed Engl, 42: 3582-3603

Khanafari, Anita, Mahnaz M. Assadi, and Fatemeh A. Fakhr. "Review of prodigiosin,

pigmentation in Serratia marcescens." Online Journal of Biological

Sciences 6.1 (2006): 1.

96

Đồ án tốt nghiệp

Gaughran, E. R. L. (1969). From superstition to science: the history of a bacterium.

Trans. N. Y. Acad. Sci. 31:3–24.

Gargallo D., Loren J.G., Guinea J., Vinas M. (1987). Glucose-6-phosphate

dehydrogenase alloenzymes and their relationship to pigmentation in

Serratia marcescens, Appl Environ Microbiol, 53: 1983-1986.

Gaughran E.R.L. (1969). From superstition to science the history of a

bacterium,Transactions of the New York Academy of Sciences, 31:3-24.

Gauthier, M. J. "Alteromonas rubra sp. nov., a new marine antibiotic-producing

bacterium." International Journal of Systematic Bacteriology 26.4 (1976):

459-466.

Gillen A.L. and Gibbs R. (2011). Serratia marcescens: The Miracle Bacillus,

Department of Biology and Chemistry, Liberty University.

Giri, Anuradha V., et al. “ A novel medium for the enhanced cell growth and

production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil”, BMC

microbiology 4.1 (2004): 11.

Goldschmidt M.C. and WiIliams R.P. (1968). Thiamine-induced Formation of

the Monopyrrole Moiety of Prodigiosin, J. Bacteriol, 96: 609-616.

Grimont, Patrick AD, and Francine Grimont. "The genus Serratia." Annual Reviews in

Microbiology 32.1 (1978): 221-248.

Gulani, Chandni, Sourav Bhattacharya, and Arijit Das. Assessment of process

parameters influencing the enhanced production of prodigiosin from Serratia

marcescens and evaluation of its antimicrobial, antioxidant and dyeing

potentials. Malaysian Journal of Microbiology 8.2 (2012): 116-122.

97

Đồ án tốt nghiệp

Han S.B., Park S.H., Jeon Y.J., Kim Y.K., Kim H.M., Yang K.H. (2001).

Prodigiosin blocks T cell activation by inhibiting interleukin - 2Rα

expression and delays progression of autoimmune diabetes and collagen

induced arthritis, J Pharm Exp Ther, 299: 415-425.

Hardjito L., Huq A., Colwell R.R. (2002). The influence of environmental

conditions on the production of pigment by Serratia marcescens, Biotechnol

Bioprocess Eng, 7: 100-104.

Harris K.P., Williamson R., Slater H., Cox A., Abbasi S., Foulds I., Simonsen T.,

Leeper J. and Salmond P.C. (2004). The Serratia gene cluster encoding

biosynthesis of the red antibiotic, prodigiosin, shows species and strain

dependent genome context variation, Microbiol, 150: 3547-3560.

Heinemann B., Howard A. J., Pa1ocz. H. J. (1970). Influence of Dissolved Oxygen

Levels on Production of L-Asparaginase and Prodigiosin by Serratia

marcescens. Appl. Microbiol, 19, 800-804.

Helvia W.C. de A., Fukushima K. and Gallba M.C.T. (2010). Prodigiosin

Production by Serratia marcescens UCP 1549 Using Renewable-Resources as a

Low Cost Substrate, Molecules, 15: 6931-6940.

Hidalgo-Romano B., Benjamin. Microbiology (2014). Indole inhibition of N-acylated

homoserine lactone-mediated quorum signalling is widespread in Gram-negative

bacteria, 160,2464–2473.

Hiroaki M., Hiroyuki A., Masakatsu F., Takeji S., Teisuya T. (1996). Industrial

production of optically active intermediate in the synthesis of dialtizem

with lipase, Seibutsu kogaku, 74: 273-288.

98

Đồ án tốt nghiệp

Kataoka T., Magae J., Kasamo K., Yamanishi H., Endo A., Yamasaki M., Nagai K.

(1992). Effects of prodigiosin 25-c on cultured cell lines: Its similarity to

monovalent polyether ionophores and vacuolar type H+-ATP ase inhibitor, J

Antibiot, 45: 1618-1625.

Khanafari A., Assadi M.M. and Fakhr F.A. (2006). Review of prodigiosin,

pigmentation in Serratia marcescens, Online J Biol Sci, 6: 1-13.

Krishna J.G. (2008) Pigment production by marine Serratia sp. BTWJ8, PhD

dissertation, Microbial Technology Laboratory, Department of Biotechnology

Cochin University of Science and Technology, Kerala, India.

Labbate, M., Queck, S. Y., Koh, K. S., Rice, S. A., Givskov, M. & Kjelleberg,

S.(2004). rum sensing-controlled biofilm development in Serratia liquefaciens

MG1. J Bacteriol 186, 692–698.

Lawanson A.O. and Sholeye F.O. (1975). Inhibition of prodigiosin formation in

Serratia marcescens by adenosine triphosphate, Experientia, 32: 439-440.

Lewis S.M., Corpe W.A. (1964). Prodigiosin producing bacteria from marine

sources, Appl Microbiol, 12: 13-17.

Liaaen-Jensen S. (1971). Isolation, reactions. In: Isler O. (ed). Carotenoids.

Birkhauser Verlag, Basel, 61-188.

Llagostera E., Soto-Cerrato V., Joshi R., Montaner B., Gimenez-Bonafe P., Perez

Tomas R. (2005). High cytotoxic sensitivity of the human small cell lung

doxorubicin resistant carcinoma (GLC4/ADR) cell line to prodigiosin

through apoptosis activation. Anticancer Drugs, 16, 393-399.

Iranshahi M., Shahverdi A.R., Mirjani R., Amin G., Shafiee A. (2004).

99

Đồ án tốt nghiệp

Umbelliprenin from Ferula persica roots inhibits the red pigment

production in Serratia marcescens, Z Naturforsch, 59: 506-508.

Johnson E.A., Lewis M.J. and Grau C.R. (1980). Pigmentation of Egg Yolks

with Astaxanthin from the Yeast Phaffia rhodozyma. Poultry Science,

59,1777-1782.

Malpartida F., Niemi J., Navarrete R. and Hopwood D.A. (1990). Cloning and

expression in a heterologous host of the complete set of genes for the

biosynthesis of the Streptomyces coelicolor antibiotic undecylprodigiosin, Gene,

93: 91-99.

Mandarville R.A. (2001). Synthesis, Proton affinity and Anticancer properties of the

prodigiosin group of natural product, Curr Med Chem, 1: 195-218.

Montaner B., Perez-Tomas R. (2001). Prodigiosin-induced apoptosis in

human colon cancer cells. Life Sci, 68, 2025-2036.

Ortega-Estrada, María De Jesús, et al. "Phoresis between Serratia marcescens and

Steinernema carpocapsae (Rhabditida: Steinernematidae) during Infection of

Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) Larvae." Florida

Entomologist95.1 (2012): 120-127.

Pérez-Tomás R., Montaner B. (2003). Effects of the proapoptotic drug prodigiosin

on cell cycle-related proteins in Jurkat T cells. Histol, Histopathol, 18,379-

385.

Pérez-Tomás R. and Viñas M. (2010) New insights on the antitumoral properties of

prodiginines, Curr. Med. Chem., 17: 2222-2231.

Pfander H., Riesenz R. and Nigglil U. (1994). HPLC and SFC of carotenoids

100

Đồ án tốt nghiệp

- scope and limitations, Pure Appl, Chem. 66: 947-954.

Phonnok, Sirinet, Wanlaya Uthaisang-Tanechpongtamb, and Benjamas Thanomsub

Wongsatayanon. "Anticancer and apoptosis-inducing activities of microbial

metabolites." Electronic Journal of Biotechnology 13.5 (2010): 1-2.

Qadri S.M.H. and Williams R.P. (1972). Induction of Prodigiosin Biosynthesis

after Shift-Down in Temperature of Nonproliferating Cells of Serratia

marcescens, Appl. Microbiol, 23: 704-709.

Ramina M. và Samira Y.Y. (2009). The role of red pigment produced by Serratia

marcescens as antibacterial and plasmid curing agent, University of Duhok,

vol 12: 268-274.

Rjazantseva IN1, Andreeva IN, Ogorodnikova TI, (1994). Effect of various growth

conditions on pigmentation of Serratia marcescens.

Riedel, K., Ohnesorg, T., Krogfelt, K. A., Hansen, T. S., Omori, K., Givskov, M. &

Eberl, L. (2001). N-acyl-L-homoserine lactonemediated regulation of the lip

secretion system in Serratia liquefaciens MG1. J Bacteriol 183, 1805–1809.

Rosenzwcig W.D. and Stotzky G. (1980). Prodigiosin and the inhibition of

Aspergillus niger by Serratia marcescens in soil, Soil Bioi. Biochent, 12: 295- 296.

Shahitha S. and Poornima K. (2012). Enhanced Production of Prodigiosin

Production in Serratia Marcescens, Journal of Applied Pharmaceutical Science,

02 (08): 138-140.

Slater H., Crow M., Everson L. and Salmond G.P.C. (2003). Phosphate availability

regulates biosynthesis of two antibiotics, prodigiosin and carbapenem, in

101

Đồ án tốt nghiệp

Serratia via both quorum sensing-dependent andindependent pathways, Mol.

Microbiol, 47: 303-320.

Song M. J., Bae J., Lee D. S., Kim C. H., Kim J. S., Kim S. W., Hong S. I. (2006).

Purification and Characterization of Prodigiosin Produced by Integrated

Bioreactor from Serratia sp. KH-95. J. Biosci. Bioeng, 101, 157-161.

Soto-Cerrato V., Llagostera E., Montaner B., Scheffer G. L., Pérez-Tomás R.

(2004). Mitochondria-mediated apoptosis operating irrespective of multidrug

resistance in breast cancer cells by the anticancer agent prodigiosin. Biochem.

Pharmacol., 68, 1345-1352.

Stock, I., S. Burak, K. J. Sherwood, T. Gru¨ger, and B. Wiedemann (2003). Natural

antimicrobial susceptibilities of ‘unusual’ Serratia species: S. ficaria, S.

fonticola, S. odorifera, S. plymuthica, and S. rubidaea. J. Antimicrob. Chemother.

51:865–885.

Stock, I., T. Grueger, and B. Wiedemann (2003). Natural antibiotic susceptibility of

strains of Serratia marcescens and the S. liquefaciens complex: S. liquefaciens

sensu stricto, S. proteamaculans, and S. grimesii. Int. J. Antimicrob. Agents

22:35–47.

Tariq A.L. and John J.P. (2010). Molecular Characterization of Psychrotrophic

Serratia marcescens TS1 Isolate form Apple Garden at Badran Kashmir,

Journal of Agriculture and Biological Sciences, 6(3): 364-369.

Thomson R.H. (1962a). Melanins, Comparative Biochemist'y, Florkin M. and

Mason H.S., Vol. III: Constituents of Life. Part A, Academic Press, New

York, 727-753.

102

Đồ án tốt nghiệp

Thomson N.R., Crow M.A., McGowan S.I., Cox A. and Salmond G.P.C. (2000).

Biosynthesis of carbapenem antibiotic and prodigiosin pigment in Serratia is

under quorum sensing control, Mol. Microbial, 36: 539-556.

Tomas R. P., Montaner B. (2003). Effects of the proapoptotic drug prodigiosin on

cell cycle-related proteins in lurkat T cells. Histol, Histopathol, 18, 379-385.

Tomas R. P., Montaner B., LIagostera E., Soto-Cerrato V. (2003). The prodigiosins,

proapoptotic drugs with anticancer properties. Biochem, Pharmacal,66, 1447-

1452.

Turner J.M. and Messenger A.J. (1986) Occurrence, biochemistry, and physiology of

phenazinc pigment production, Adv. Microbial Physiol, 27, 211-275.

Venil, Chidambaram Kulandaisamy, and Perumalsamy Lakshmanaperumalsamy. "An

insightful overview on microbial pigment, prodigiosin." Electronic Journal

of Biology 5.3 (2009): 49-61.

Wei Y.H., Chen W.C. (2005). Enhanced production of prodigiosin-like pigment

from Serratia marcescens SMΔR by medium improvement and oil

supplementation strategies, J Biosci Bioeng, 99: 616-622.

Whitehead, N. A., Barnard, A. M., Slater, H., Simpson, N. J. & Salmond, G. P. (2001).

Quorum-sensing in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol Rev 25, 365–404.

Williams R.P., Gott C.L. and Qadri S.M.H. (1971). Induction of pigmentation in

non proliferating cells of Serratia marcescens by addition of single

amino acids, J. Bacteriol, 106,444-448.

Williams R.P. (1973). Biosynthesis of prodigiosin, a secondary metabolite of

Serratia marcescens, Appl. Microbiol, 25: 396-402.

103

Đồ án tốt nghiệp

Williamson N.R., Simonsen H.T., Ahmed R.A., Goldet G., Slater H., Woodley L.,

Leeper F.J., Salmond P.C. (2005). Biosynthesis of the red antibiotic,

prodigiosin, in Serratia: identification of a novel 2-methyl-3-n-amyl-

pyrrole (MAP) assembly pathway, definition of the terminal condensing

enzyme, and implications for undecylprodigiosin biosynthesis in

Streptomyces, Mol Microbiol, 56: 971-989.

Williamson N.R., Fineram P.C., Leeper F.J., Salmond G.P.C. (2006). The

biosynthesis and regulation of bacterial prodiginines. Nat. Rev. Microbiol, 4:

887-899.

Witney F.R., Failia M.L., Weinberg E.D. (1977). Phosphate inhibition of

secondary metabolism in Serratia marcescens. Appl Environ Microbiol, 33,

1042-1046.

Zhang J., Shen Y., Liu J. and Wei D. (2005). Antimetastatic effect of prodigiosin

through inhibition of tumor invasion, Biochem. Pharmacol., 69: 407-414.

104

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1 THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG VÀ CÁC THUỐC THỬ

Thành phần môi trƣờng Nutrient agar (Gram/Lít)

Meat extract 3,00

Peptone 5,00

Agar 20,00

Thành phần môi trƣờng Nutrient broth (Gram/Lít)

Meat extract 3,00

Peptone 5,00

Môi trƣờng huyền phù đậu phộng

Hạt đậu phộng khô luộc khoảng 10 phút, bóc vỏ và xay nhuyễn.

Môi trƣờng MT3

Huyền phù đậu phộng 10%

Peptone 5%

Dầu hƣớng dƣơng 1%

Môi trƣờng MT4

Huyền phù đậu phộng 10%

Peptone 5%

Dầu hƣớng dƣơng 1%

Muối NaCl 1%

1

Đồ án tốt nghiệp

ách pha thuốc thử : Dragendorff

Dung dịch A: cân 0,8 g bismuth nitrate hòa tan trong 10 ml acid acetic đậm đặc

định mức lên 50 ml bằng nƣớc cất. Bảo quản chai màu trong tủ lạnh.

Dung dịch B: Cân 20 g KI và hòa tan trong 50 ml H2O, Bảo quản 4oC.

Hút 5 ml dd A và 5 ml dd B vào bình định mức 50 ml. Định mức bằng acid sulfuric

10% đã pha sẵn.

Khoanh giấy kháng sinh

- Sử dụng khoanh giấy kháng sinh của các hãng sản xuất có bán trên thị trƣờng

cho kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch.

- Các khoanh giấy kháng sinh phải đƣợc bảo quản trong hộp riêng trong điều

kiện khô ráo, ở trong tủ lạnh nhiệt độ 80C hoặc -200C.

- Khi sử dụng xong khoanh giấy còn thừa phải đƣợc đóng kín và cất giữ trở lại

tủ lạnh.

PHỤ LỤC 2 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP

Phƣơng pháp khảo sát tính kháng của Serratia marcescens SH1 bằng cách

sử dụng đĩa kháng:

Chủng nấm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng NA trong đĩa petri sau 2 ngày. Sau

đó quan sát hình dạng khuẩn lạc, chọn khuẩn lạc đặc trƣng.

Tăng sinh trên môi trƣờng NB

Tiến hành pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý tới nồng độ 10-6

Cấy trãi chủng vi khuẩn trên đĩa petri bằng tăm bông vô trùng.

Đặt đĩa kháng sinh lên mặt môi trƣờng đã đƣợc cấy trãi .

2

Đồ án tốt nghiệp

Ủ trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Quan sát và đọc kết quả sau 2 ngày.

Phƣơng đo oxy hòa tan DO

Lấy mẫu vào đầy chai DO.

Thêm vào chai 1mL dung dịch MnSO4 và 1mL dung dịch Iodide-Azide kiềm.

Đậy nút chai, đảo chai vài lần.

Khi kết tủa đã lắng xuống còn khoảng 1/2 chai, thêm vào chai 1mL H2SO4 đậm

đặc.

Đậy nút và đảo chai vài lần đến khi kết tủa tan hoàn toàn.

Đổ bớt 99mL dung dịch từ chai sang ống đong.

Tiến hành chuẩn độ phần dung dịch mẫu còn lại trong chai (201mL) bằng dung

dịch Na2S2O3 0,025M với chỉ thị hồ tinh bột và kết thúc chuẩn độ khi dung dịch vừa

mất màu xanh. Lƣu ý chỉ thêm hồ tinh bột vào giai đoạn cuối, khi dung dịch trong chai

đã chuyển từ màu vàng đậm sang vàng nhạt. Ghi nhận thể tích dung dịch chất chuẩn

(V mL) đã sử dụng. (ThS. Võ Hồng Thi, 2012)

3

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC 3 ĐƢỜNG CHUẨN SẮC TỐ

Đƣờng chuẩn Sắc tố

0.4

0.35

y = 1.100x + 0.004 R² = 0.999

0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0

O D 53 5

Nồng độ sắc tố (mg/ml)

PHỤ LỤC 4 SỐ LIỆU THỐNG KÊ.

Ảnh hƣởng của pH đến hàm lƣợng sắc tố

ANOVA Table for Prodigiosin by pH

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 2.4576 2.4576 50.68 0.0021 1

Within groups 0.193979 0.0484949 4

4

Đồ án tốt nghiệp

Total (Corr.) 2.65158 5

Summary Statistics for Prodigiosin

pH Count Average Standard Coeff. of Minimum Maximum Range

deviation variation

7.2 3 3.3012 0.19277 5.83939% 3.1055 3.4909 0.3854

không 3 2.0212 0.244601 12.1017% 1.7763 2.2655 0.4892

chỉnh

Total 6 2.6612 0.728228 27.3646% 1.7763 3.4909 1.7146

Multiple Range Tests for Prodigiosin by pH

Method: 95.0 percent LSD

pH Count Mean Homogeneous Groups

không chỉnh 3 2.0212 X

7.2 3 3.3012 X

Khảo sát ảnh hƣờng của nồng độ muối NaCl

Summary Statistics for Prodigiosin

% Count Averag Standard Coeff. of Minimum Maximum Range Stnd.

NaCl e deviation variation skewness

5

Đồ án tốt nghiệp

0% 3 12.103 0.750165 6.19816% 11.3091 12.8 1.4909 -0.4044

1% 3 18.460 2.53651 13.7402% 15.5454 20.1636 4.6182 -1.1733

2% 3 12.987 4.71475 36.3012% 8.0727 17.4727 9.4 -0.2880

3% 3 7.7454 3.82559 49.3915% 4.6909 12.0363 7.3454 0.9209

Total 12 12.824 4.88085 38.0596% 4.6909 20.1636 15.472 -0.0849

ANOVA Table for Prodigiosin by % NaCl

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 174.328 58.1094 5.30 0.0264 3

Within groups 87.7213 10.9652 8

Total (Corr.) 262.049 11

Multiple Range Tests for Prodigiosin by % NaCl

Method: 95.0 percent LSD

% NaCl Count Mean Homogeneous Groups

3 3 7.74543 X

0 3 12.103 X

6

Đồ án tốt nghiệp

2 3 12.9879 XX

1 3 18.4606 X

Đồng nuôi cấy S. marcescens và Bacillus subtilis tỷ lệ S/B 2:1

ANOVA Table for Prodigiosin by đồng nuôi cấy

Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value

Squares

Between groups 0.101873 1 0.101873 0.02 0.8848

Within groups 17.096 4.27399 4

5 Total (Corr.) 17.1979

Summary Statistics for Prodigiosin

dong nuoi Count Average Standard Coeff. of Minimu Maxim Range Stnd.

cay deviation variation m um skewness

S/B 2:1 3 7.53333 1.71541 22.7709% 5.9091 9.3273 3.4182 0.31176

Đối chứng 3 7.79403 2.36773 30.3787% 5.9818 10.473 4.4912 1.00872

Total 6 7.66368 1.8547 24.2011% 5.9091 10.473 4.5639 0.76131

Đồng nuôi cấy S. marcescens và Bacillus subtilis tỷ lệ S/B 1:1, S/B 1:2

Summary Statistics for Prodigiosin

7

Đồ án tốt nghiệp

NT Count Average Standard Coeff. of Minimum Maximum Rang Stnd.

deviation variation e skewness

1:1 3 16.8545 7.40232 43.9189% 9.05455 23.7818 14.72 -0.36993

1:2 3 17.4273 9.00178 51.6534% 7.03636 22.8545 15.81 -1.22109

ĐC 3 26.0818 13.2061 50.6335% 11.6727 37.6091 25.93 -0.6613

Total 9 20.1212 9.87946 49.0997% 7.03636 37.6091 30.57 0.38955

ANOVA Table for prodigiosin by nghiệm thức

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 160.372 2 80.1859 0.78 0.5017

Within groups 620.458 6 103.41

Total (Corr.) 780.829 8

Multiple Range Tests for prodigiosin by nghiệm thức

Method: 95.0 percent LSD

NT Count Mean Homogeneous

Groups

1:1 3 16.8545 X

8

Đồ án tốt nghiệp

1:2 3 17.4273 X

DC 3 26.0818 X

Sử dụng dịch trong trong nuôi cấy

ANOVA Table for prodigiosin by nghiệm thức

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 2.49983 2 1.24992 0.01 0.9872

Within groups 579.421 6 96.5702

Total (Corr.) 581.921 8

Table of Means for PRO by NT with 95.0 percent LSD intervals

Count Mean Stnd. error (pooled s) Lower limit Upper limit NT

26.0818 5.67363 16.2651 35.8985 3 DC

E. coli 26.7182 5.67363 16.9015 36.5349 3

27.3727 5.67363 17.556 37.1894 3 S.

marcescens

Total 9 26.7242

Multiple Range Tests for Prodigiosin by nghiệm thức

9

Đồ án tốt nghiệp

NT Count Mean Homogeneous

Groups

DC 3 26.0818 X

Dịch 3 26.7182 X

nuôi

cấy E.

coli

Dịch 3 27.3727 X

trong

S.

marces

cens

Xác định vận tốc lắc

So sánh kết quả giữa các thí nghiệm với nhau

ANOVA Table for Prodigiosin by TN

Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value

Squares Square

Between groups 48.365 2 24.1825 8.89 0.0161

Within groups 16.3287 6 2.72145

10

Đồ án tốt nghiệp

Total (Corr.) 64.6937 8

Multiple Range Tests for Prodigiosin by TN

Method: 95.0 percent LSD

TN Count Mean Homogeneous Groups

TNC 3 5.185 X

TNB 3 8.8848 X

TNA 3 10.7653 X

Summary Statistics for Prodigiosin

TN Count Average Standard Coeff. of Minimum Maximum Range

deviation variation

TNA 3 10.7653 2.08945 19.409% 8.376 12.25 3.874

TNB 3 8.8848 1.42031 15.9859% 7.2545 9.8545 2.6

TNC 3 5.185 1.33464 25.7405% 3.736 6.364 2.628

Total 9 8.27838 2.84372 34.3511% 3.736 12.25 8.514

Thí nghiệm xử lý nhiệt canh trƣờng

Summary Statistics for Prodigiosin

11

Đồ án tốt nghiệp

NT Count Average Standard Coeff. of Minimum Maximum Range

deviation variation

DC 4 10.168 4.34639 42.7458% 6.291 14.8 8.509

DUN 4 26.15 5.89949 22.5602% 18.655 33.054 14.399

Total 8 18.159 9.79748 53.9538% 6.291 33.054 26.763

ANOVA Table for Prodigiosin by NT

Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value

Squares Square

Between groups 510.849 1 510.849 19.03 0.0048

Within groups 161.085 6 26.8475

Total (Corr.) 671.934 7

Multiple Range Tests for Prodigiosin by NT

Method: 95.0 percent LSD

NT Count Mean Homogeneous

Groups

DC 4 10.16 X

8

12

Đồ án tốt nghiệp

DUN 4 26.15 X

PHỤ LỤC 4 BẢNG

Bảng 1 Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo Enterobacteriaceae

Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo Enterobacteriaceae

Kháng sinh S I R Hàm lƣợng Ký

hiệu Đĩa

Ampicillin Am ≥ 17 14 – 16 ≤ 13 10μg

Gentamicin Ge ≥ 15 13 – 14 ≤ 12 10 μg

Cefuroxime Cu ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg

Cefoxitin Cn ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg

Cefotaxime Ct ≥ 26 23 – 25 ≤ 22 30 μg

Amoxicillin-clavulanic 20 μg /10 μg Ac ≥ 18 14 – 17 ≤ 13

acid

15 – 16 ≤ 14 30 μg Amikacin Ak ≥ 17

Piperacillin/tazobactam 18 – 20 ≤ 17 100 μg /10 μg Pt ≥ 21

Ciprofloxacin Ci ≥ 21 16 – 20 ≤ 15 5 μg

Ertapenem En ≥ 22 19 – 21 ≤ 18 10 μg

Ceftazidime Cz ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 30 μg

Chloramphenicol Cl ≥ 18 13 – 17 ≤ 12 30 μg

Imipenem Im ≥ 23 20 – 22 ≤ 19 10 μg

Trimethoprim / Bt ≥ 16 11 – 15 ≤ 10 1.25 μg

sulfamethoxazole /23.75 μg

Cefepime Cm ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg

Tetracycline Te ≥ 15 12 – 14 ≤ 11 30 μg

13

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2 Đánh giá nồng độ oxy hòa tan.

Đánh giá Nồng độ O2

2 mg/l Nguy hiểm, oxy trong nƣớc không đủ cho cá, tôm

4 mg/l Nƣớc đủ oxy cung cấp ch0 cá, tôm

6 -8 mg/l Tốt, nƣớc có nhiều oxy

Bảng 3 Hàm lƣợng prodigiosin thu hồi bằng trích ly ở các tỷ lệ canh trƣờng:dung môi

(mg/ ml canh trƣờng) và quy mô lên men khác nhau.

A (thể tích lên B (thể tích lên C (thể tích

Tỷ lệ canh trƣờng: men 20 ml/ men 200 ml/ lên men 400

dung môi bình) bình) ml/ bình)

Tỷ lệ 2:3 8,4 7,3 3,7

Tỷ lệ 1:2 12,3 9,9 6,4

Tỷ lệ 2:5 11,7 9,5 5,5

14

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 4 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi đồng nuôi cấy S. marcescens SH1 với

Bacillus sp.

Nghiệm thức Đối chứng S/B = 2:1 Đối chứng 2 S/B = 1:1 S/B = 1:2

1

Hàm lƣợng 7,8 ± 2,4(a) 7,5 ± 1,7 (a) 26,1 ± 13,2 (a) 16,9 ± 7,4 17,4 ± 9,0

(a) (a) prodigiosin tổng

hợp (mg/ml canh

trƣờng)

% prodigiosin 100 ± 96,7 ± 22 % 100 ± 50,6 % 64,6 ± 66,8 ±

28,4 % 34,5% tổng hợp so với 30,4%

đối chứng (%)

PHỤ LỤC 6 HÌNH ẢNH

Thí nghiệm đo oxy hòa tan DO

15

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1. Chai DO chứa canh trƣờng MT3 trong thí nghiệm đo oxy hòa tan.

Hình 2. Mẫu đo oxy hòa tan lên men 24h lắc 200 vòng/phút.

1. Môi trƣờng PG; 2.Môi trƣờng MT3

Canh trƣờng MT3 (6 mg/l) Môi trƣờng PG (4 mg/l)

Hình 3. Đo oxy hòa tan sử dụng kit đo oxy hòa tan bán sẵn trên thị trƣờng

Thí nghiệm đồng nuôi cấy S. marcescens và Bacillus subtilis

16

Đồ án tốt nghiệp

A. Đối chứng; B. Nghiệm thức S/B = 2:1 A.Đối chứng; B. S/B = 1:1; C. S/B = 1:2.

Hình 4. Thí nghiệm lên men đồng nuôi cấy S. marcescens SH1 với Bacillus sp

Thí nghiệm nuôi cấy có bổ sung dịch trong S. marcescens SH1 và E. coli

Hình 5. Sử dụng dịch trong trong nuôi cấy

17

Đồ án tốt nghiệp

A. Đối chứng; B. Dịch trong S. marcescens; C. Dịch loại bỏ tế bào E. coli

Hình 6. Canh trƣờng đun ở 1000C.

18