Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc chủng tảo Chlorella sp. thu thập ở các tỉnh Nam Bộ

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

PHAN MINH TÂM

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ

CHỌN LỌC CÁC CHỦNG TẢO CHLORELLA SP.

ĐƯỢC THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH NAM BỘ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2025

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

PHAN MINH TÂM

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ

CHỌN LỌC CÁC CHỦNG TẢO CHLORELLA SP.

ĐƯỢC THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH NAM BỘ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. HUỲNH VĂN BIẾT

PGS.TS. BÙI MẠNH HÀ

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2025

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Huỳnh Văn Biết và PGS.TS.

Bùi Mạnh Hà vì đã tận tình truyền đạt kiến thức, hướng dẫn và hỗ trợ cho tôi trong suốt

thời gian học tập và thực hiện luận án.

Tôi xin cảm ơn cha mẹ cùng toàn thể thành viên trong gia đình đã luôn động viên,

làm chỗ dựa tinh thần cho tôi trong suốt thời gian làm luận án. Đồng thời, tôi xin cảm ơn

vợ tôi là Đặng Quỳnh Như, người luôn sát cánh bên cạnh tôi làm chỗ dựa vững chắc cho

tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin được chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu

Ban chủ nhiệm cùng tập thể Khoa Khoa học Sinh học và Phòng Sau Đại học thuộc Trường

Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong

suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo cùng

tập thể viên chức tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường thuộc Trường

Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

Tôi cũng chân thành xin cảm ơn nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Bùi Mạnh Hà đã hỗ

trợ và tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu.

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến em Trần Hữu Thành và em Nguyễn Tấn Tài đã hỗ

trợ hết mình trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Chân thành gửi lời thành cảm ơn đến Thầy/Cô, anh chị Khoa Khoa học Sinh học,

Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và các em sinh viên đã hỗ trợ tôi trong suốt

khoảng thời gian thực hiện luận án.

Một lần nữa tôi xin được cảm ơn toàn thể nhóm nghiên cứu đã hết mình giúp đỡ tôi

khi luận án trong tình trạng khó khăn nhất.

Xin chân thành cảm ơn.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.

Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

PHAN MINH TÂM

iii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ ii

MỤC LỤC ....................................................................................................................... iii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................ x

TÓM TẮT ...................................................................................................................... xii

ABSTRACT .................................................................................................................. xiv

MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 4

1.1. Tổng quan về tảo Chlorella ........................................................................................ 4

1.1.1. Tiêu chuẩn hình thái tảo Chlorella .......................................................................... 5

1.1.2. Các vùng trình tự được dùng để định danh tảo Chlorella ........................................ 7

1.1.3. Hàm lượng lipid, thành phần lipid và tiềm năng ứng dụng làm nhiên liệu sinh học

của tảo Chlorella ............................................................................................................... 9

1.2. Đa dạng di truyền ở tảo Chlorella............................................................................. 10

1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến tăng trưởng của tảo Chlorella .................................... 12

1.3.1. Môi trường nuôi cấy .............................................................................................. 12

1.3.2. Các thành phần hữu cơ .......................................................................................... 13

1.3.3. Sục khí trong nuôi cấy tảo ..................................................................................... 14

1.4. Ứng dụng Chlorella vào trong xử lý nước thải và thử nghiệm ly trích lipid ............. 14

1.4.1. Xử lý nước thải bằng tảo Chlorella ....................................................................... 14

1.4.2. Ly trích lipid từ tảo Chlorella ................................................................................ 17

1.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước ........................................................................ 23

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 25

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 25

2.1.1. Thời gian................................................................................................................ 25

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................................. 25

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 25

2.3. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................... 26

2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 26

2.4.1. Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng tảo Chlorella spp. .......................... 26

2.4.1.1. Phương pháp thu mẫu tảo ................................................................................... 26

2.4.1.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào tảo ............................................................ 26

2.4.1.3. Phương pháp phân lập và nuôi cấy tăng sinh tảo ................................................ 26

2.4.1.4. Phương pháp định danh phân tử ......................................................................... 27

2.4.2. Nội dung 2: Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng tảo Chlorella spp. bằng chỉ

thị sinh học phân tử PCR - ISSR. .................................................................................... 28

2.4.2.1. Quy trình PCR với chỉ thị ISSR .......................................................................... 28

2.4.2.2. Xử lý số liệu ....................................................................................................... 30

2.4.3. Nội dung 3: Sàng lọc các chủng tảo Chlorella có tiềm năng ứng dụng vào xứ lý nước

thải ................................................................................................................................... 30

2.4.3.1. Khảo sát ngưỡng chịu đựng ammonium của tảo Chlorella ................................. 30

2.4.3.2. Khảo sát khả năng loại bỏ nitrate của Chlorella ................................................. 31

2.4.3.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy tảo Chlorella ....................................................... 32

2.4.4. Nội dung 4: Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp. và ly trích lipid từ

sinh khối tảo .................................................................................................................... 33

2.4.4.1. Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp. ............................................ 33

2.4.4.2. Nghiên cứu ly trích lipid từ sinh khối tảo ........................................................... 36

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 43

3.1. Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng tảo Chlorella spp. ............................. 43

3.1.1. Đánh giá hình thái các mẫu tảo thu được ............................................................... 43

3.1.2. Định danh tảo bằng phương pháp sinh học phân tử. .............................................. 52

3.2. Nội dung 2: Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng tảo Chlorella spp. bằng chỉ thị

sinh học phân tử PCR - ISSR. .......................................................................................... 69

3.2.1. Khảo sát nhiệt độ của các primer sử dụng cho phản ứng PCR – ISSR .................. 69

3.2.2. Sản phẩm PCR với chỉ thị ISSR ............................................................................ 75

3.2.3. Phân tích sự đa dạng di truyền của 8 mẫu tảo Chlorella ........................................ 78

3.3. Nội dung 3: Đánh giá khả năng ứng dụng các chủng tảo Chlorella vào xứ lý nước thải

......................................................................................................................................... 86

3.3.1. Khảo sát ngưỡng chịu đựng ammonium của Chlorella .......................................... 86

3.3.2. Khảo sát khả năng loại bỏ nitrate của Chlorella. ................................................... 90

3.3.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy tảo Chlorella. ......................................................... 94

3.4. Nội dung 4: Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp. và ly trích lipid từ sinh

khối tảo .......................................................................................................................... 100

3.4.1. Thử nghiệm ứng dụng tảo Chlorella và sóng âm nhạc vào trong xử lý nước thải 100

3.4.2. Nghiên cứu ly trích lipid từ sinh khối tảo Chlorella dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm

và đánh giá vòng đời sản phẩm ...................................................................................... 115

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 136

4.1. Kết luận .................................................................................................................. 136

4.2. Kiến nghị ................................................................................................................ 137

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ

....................................................................................................................................... 138

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 139

PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1

PHỤ LỤC CÁC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẢO ..................................................... 1

PHỤ LỤC NỘI DUNG 1 ................................................................................................. 3

PHỤ LỤC NỘI DUNG 2 ............................................................................................... 58

PHỤ LỤC NỘI DUNG 4 ............................................................................................... 68

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

BBM Bold's Basal Medium

BD Bình Dương

Biological Oxygen Demand BOD5

bp Base pair

CG Cần Giờ

CI Chloroform/Isoamyl alcohol

COD Chemical Oxygen Demand

CTAB cetyl trimethyl ammonium bromide

ctv Cộng tác viên

DNA Deoxyribonucleic acid

DO Dissolved oxygen

ĐN Đồng Nai

ĐT Đồng Tháp

EB Elution buffer

EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

HAMGM Highly Assimilable Minimal Growth medium

ISSR Inter Simple Sequence Repeat

ITS Internal Transcribed Spacer

LA Long An

LCA Life Cycle Accessment

OD Optical density

PCI Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol

QCVN Quy chuẩn Việt Nam

rbcL Ribulose - bisphosphate carboxylase

S/N Signal - to - noise

SSR Simple Sequence Repeat

vii

TAE Tris - Acetate - EDTA

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TE Tris - Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

TG Tiền Giang

TN Tổng nitrogen

TOC Tổng ô nhiễm hữu cơ

UPGMA Unweighted Pair - group Method with Arithmetic Mean

UV Ultraviolet

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Hàm lượng lipid của các loài tảo thuộc chi Chlorella ....................................... 9

Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng trong định danh phân tử tảo Chlorella ................................ 27

Bảng 2.2. Danh sách 18 primer cho phản ứng PCR - ISSR ............................................. 29

Bảng 2.3. Mức độ được mã hóa và chưa mã hóa của các biến độc lập trong nghiên cứu 34

Bảng 2.4. Ma trận của thí nghiệm mô hình lặp tâm và dữ liệu thí nghiệm tương ứng ..... 35

Bảng 2.5. Thí nghiệm ly trích lipid ................................................................................. 37

Bảng 2.6. Thiết kế thí nghiệm sử dụng mảng trực giao Taguchi ..................................... 38

Bảng 3.1. Kết quả các mẫu có hình thái tương đồng cao với Chlorella .......................... 43

Bảng 3.2. Hình thái tế bào tảo của các mẫu thu được ...................................................... 45

Bảng 3.3. Nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số của 11 mẫu trong nghiên cứu ............. 53

Bảng 3.4. Kết quả mức độ tương đồng của vùng trình tự 18S rRNA của các mẫu tảo ..... 55

Bảng 3.5. Kết quả mức độ tương đồng của vùng trình tự ITS của các mẫu tảo ............... 56

Bảng 3.6. Kết quả mức độ tương đồng của vùng trình tự rbcL với các mẫu tảo ............. 57

Bảng 3.7. Danh sách các mẫu được sử dụng cho phản ứng PCR – ISSR ........................ 69

Bảng 3.8. Nhiệt độ tối ưu của 14 primer được chọn ........................................................ 72

Bảng 3.9. Tổng hợp số băng DNA của sản phẩm PCR khuếch đại với 14 primer được

khảo sát ............................................................................................................................ 75

Bảng 3.10. Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu tảo .................................................... 79

Bảng 3.11. Thông số nước thải đầu vào chợ đầu mối Hóc Môn .................................... 100

Bảng 3.12. thông số động học phản ứng để làm giảm TN trong thí nghiệm ................. 104

Bảng 3.13. Ma trận của thí nghiệm mô hình lặp tâm và kết quả dữ liệu thí nghiệm tương

ứng ................................................................................................................................. 112

Bảng 3.14. Kết quả thí nghiệm hàm lượng và tỷ lệ S/N của quy trình ly trích lipid từ

Chlorella CG-20 ............................................................................................................ 116

Bảng 3.15. Các thông số phản hồi về ý nghĩa ............................................................... 117

Bảng 3.16. Các thông số đáp ứng tỷ lệ S/N ................................................................... 117

Bảng 3.17. Thành phần acid béo chính trong lipid từ Chlorella CG-20 ........................ 124

Bảng 3.18. Tổng tác động môi trường do tảo Chlorella CG-20 và quy trình sản xuất dầu

theo phương pháp CML và TRACI ............................................................................... 128

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Tảo Chlorella .................................................................................................... 4

Hình 1.2.Cây phát sinh loài của tảo Chlorella .................................................................. 5

Hình 1.3. Quá trình phân bào của tảo Chlorella vulgaris .................................................. 6

Hình 1.4. Con đường hấp thu và vận chuyển nitrogen ở tảo ........................................... 14

Hình 1.5. Nguyên lý chiết xuất lipid từ tảo dưới sự hỗ trợ siêu âm ................................. 19

Hình 1.6. Các giai đoạn của đánh giá vòng đời sản phẩm và ranh giới hệ thống sản phẩm

để đánh giá LCA .............................................................................................................. 21

Hình 1.7. Minh họa cho đánh giá tác động của vòng đời ................................................ 22

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sóng âm nhạc trên tảo ................................................ 34

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình hệ thống của giai đoạn ly trích dầu từ bột tảo ........................ 38

Hình 2.3. Ranh giới hệ thống vòng đời để sản xuất dầu tảo từ Chlorella sp. . ................ 41

Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose ................................................ 54

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với gen 18S rRNA của 11 mẫu tảo nghiên cứu

......................................................................................................................................... 54

Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loài mô tả chi tiết vị trí phân bố của các chủng tảo phân lập

được xây dựng từ vùng trình tự 18S rRNA ...................................................................... 61

Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loài giản lược mô tả chi tiết vị trí phân bố của các chủng

tảo phân lập được xây dựng từ vùng trình tự rbcL ........................................................... 63

Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loài mô tả chi tiết vị trí phân bố của các chủng tảo phân lập

được xây dựng từ vùng trình tự ITS ................................................................................. 64

Hình 3.6. Kết quả khảo sát nhiệt độ của mẫu CG-20 với mồi ISSR (1; 4; 5) .................. 70

Hình 3.7. Kết quả khảo sát nhiệt độ của CG-20 với mồi ISSR (6; 8; 9) ......................... 70

Hình 3.8. Kết quả khảo sát nhiệt độ của CG-20 với mồi ISSR (10; 11; 12) .................... 71

Hình 3.9. Kết quả khảo sát nhiệt độ của CG-20 với mồi ISSR (13; 14; 15) ................... 71

Hình 3.10. Cây phân nhóm di truyền của 8 mẫu tảo Chlorella ....................................... 80

Hình 3.11. Nồng độ ammonium có tỷ lệ ức chế sinh trưởng 50% đối với các chủng tảo

khảo sát ............................................................................................................................ 87

Hình 3.12. Khả năng hấp thụ nitrate của các chủng tảo khảo sát .................................... 91

Hình 3.13. Hàm lượng chlorophyll a của tảo Chlorella được nuôi cấy ở các môi trường

khác nhau ......................................................................................................................... 95

Hình 3.14. Sinh khối khô của Chlorella CG-20 nuôi cấy ở các môi trường khác nhau .. 96

Hình 3.15. Biểu đồ thể hiện hiệu quả làm giảm TN và COD bằng Chlorella CG-20.... 103

Hình 3.16. Biểu đồ đường viền đáp ứng cho việc làm giảm TN trong điều kiện liên tục

....................................................................................................................................... 109

Hình 3.17. Biểu đồ đường viền đáp ứng cho việc làm giảm COD trong điều kiện liên tục

....................................................................................................................................... 110

Hình 3.18. Biểu đồ tối ưu hóa phản ứng của hiệu quả làm giảm TN và COD tối đa ..... 111

Hình 3.19. Ảnh hưởng chính của các yếu tố trong thiết kế thí nghiệm Taguchi ........... 118

Hình 3.20. Biểu đồ đường viền ảnh hưởng ................................................................... 119

Hình 3.21. Biểu đồ radar về tác động môi trường của việc ly trích lipid từ Chlorella CG-

20 như được giải thích bởi CML và TRACI .................................................................. 130

xii

TÓM TẮT

Đề tài: Nghiên cứu Đa dạng Di truyền và Chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp.

được thu thập ở một số tỉnh Nam bộ

Tác giả: Phan Minh Tâm

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9.42.02.01

Luận án thu thập được 120 mẫu tảo từ các vị trí toạ độ khác nhau tại 5 tỉnh thành

thuộc khu vực miền Nam Việt Nam (Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh, Bình Dương, Đồng Tháp,

Tiền Giang, Long An và Đồng Nai). Dựa vào tiêu chuẩn hình thái và 3 marker phân tử (18r

RNA, ITS, rbcL) của tảo Chlorella, nghiên cứu đã phân lập, chọn lọc thành công và duy trì

được 8 chủng tảo Chlorella. Trong đó, các mẫu tảo CG-20, BD-38 và ĐT-51 thuộc loài

Chlorella vulgaris. Các mẫu BD-33 và LA-81 thuộc loài Chlorella sorokiniana, các mẫu

còn lại là Chlorella sp. (TG-65, TG-67 và ĐN-112). Cả 3 chủng Chlorella vulgaris đều có

sự khác biệt về mặt di truyền với nhau. Sự đa dạng di truyền của các chủng tảo trong cùng

loài, chưa thể hiện rõ có sự tương quan bởi yếu tố phân bố địa lý của các tỉnh thành được

thu thập nghiên cứu luận án. Sự khác biệt đa dạng di truyền của các mẫu trong cùng một

loài không có tương quan chặt chẽ bởi yếu tố phân bố địa lý ở các tỉnh thành trong nghiên

cứu.

Trong 8 chủng Chlorella phân lập được, Chlorella CG-20 có ngưỡng chịu đựng

ammonium cao nhất và có khả năng hấp thụ nồng độ nitrate cao nhất. Môi trường thích

hợp để nuôi cấy tăng sinh CG-20 là môi trường BBM và HAMGM. Tảo Chlorella CG-20

cho thấy có khả năng loại bỏ TN và COD trong nước thải. Khi kết hợp xử lý nước thải

bằng tảo Chlorella CG-20 và sóng âm nhạc cho hiệu quả cao nhất với tỷ lệ TN 0,0335

L/mg/ngày và COD 0,001 L/mg/ngày. Cơ chế động học của mô hình xử lý nước thải tuân

theo mô hình bậc 2, ba thông số tối ưu ứng dụng sóng âm nhạc và tảo Chlorella CG-20 vào

trong xử lý nước thải là mật độ tảo 4%, cường độ âm thanh 52,4 dB và thời gian xử lý 4,6

ngày.

Phương pháp Taguchi được sử dụng trong thử nghiệm tối ưu hóa quy trình ly trích

lipid từ tảo Chlorella CG-20 cho thấy có hiệu quả cao. Yếu tố biên độ sóng siêu âm có ảnh

hưởng lớn nhất và thời gian phản ứng ít tác động đến quá trình ly trích lipid. Điều kiện ly

xiii

trích lipid tối ưu gồm: tỷ lệ n-hexan/ethanol là 3:1, nhiệt độ 40 ̊C, biên độ siêu âm 80% và

thời gian phản ứng là 15 phút. Lipid được ly trích từ tảo Chlorella CG-20 có tiềm năng trở

thành nguyên liệu diesel sinh học. Kết quả phân tích LCA cho thấy quy trình khai thác dầu

từ sinh khối tảo khô có tác động đáng kể đến môi trường, đặc biệt là về khả năng nóng lên

toàn cầu, khả năng acid hóa và khả năng phú dưỡng. Do đó, để giảm thiểu các tác động

này nên tập trung giảm thiểu lượng khí thải liên quan đến quá trình ly trích lipid và nâng

cao hiệu quả ly trích lipid.

Những đóng góp mới của luận án:

Luận án đã phân lập và định danh được 8 chủng tảo thuộc chi Chlorella, bao gồm 3

chủng thuộc loài Chlorella vulgaris, 2 chủng thuộc loài Chlorella sorokiniana và 3 chủng

chưa xác định được loài. Mức độ đa dạng di truyền giữa các chủng tảo Chlorella vulgaris

đã được làm rõ bằng chỉ thị ISSR cho thấy sự đa dạng di truyền của các mẫu tảo trong cùng

loài chưa có sự tương quan với phân bố địa lý ở các tỉnh, thành trong nghiên cứu.

Xác định được môi trường nuôi thích hợp để phát triển sinh khối chủng Chlorella

vulgaris CG20 bao gồm môi trường BBM hoặc HAMGAM, cùng với các điều kiện phù

hợp để giảm nitrogen tổng số và chỉ số COD trong nước thải.

Xác định được điều kiện tối ưu để trích ly lipid từ chủng tảo Chlorella vulgaris CG20

bằng phương pháp Taguchi và định hướng ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học. Kết quả

phân tích LCA chỉ ra rằng quy trình ly trích lipid từ tảo khô có tác động đáng kể đến môi

trường.

Từ khóa: Chlorella, ISSR Chlorella, xử lý nước thải, ly trích lipid từ tảo.

xiv

ABSTRACT

Project title: Study of Genetic Diversity and Selection of Chlorella sp. strains

collected in some Southern Provinces of Vietnam

Ph.D. candidate: Phan Minh Tam

Major: Biotechnology Major code: 9.42.02.01

This study investigated Chlorella species diversity and the potential of a selected

strain for wastewater treatment and biodiesel production. One hundred and twenty algal

samples were collected from five provinces and provincial-level municipalities in southern

Vietnam (Can Gio district – Ho Chi Minh City, Binh Duong, Dong Nai, Long An, Tien

Giang, and Dong Thap provinces). Morphological and molecular analyses (18S rRNA,

ITS, and rbcL) identified eight Chlorella strains: three Chlorella vulgaris (CG-20, BD-38,

and ĐT-51), two Chlorella sorokiniana (BD-33 and LA-81), and three Chlorella spp. (TG-

65, TG-67). Genetic differences were observed among the three C. vulgaris strains. No

significant correlation was found between the intra-specific diversity of Chlorella strains

or samples of the same species and their geographic origin.

Among the eight isolates, strain CG-20 exhibited the highest ammonium tolerance

and nitrate uptake capacity, with BBM and HAMGM identified as optimal growth media.

CG-20 also demonstrated removal capabilities for total nitrogen (TN) and chemical oxygen

demand (COD) in wastewater. Combining CG-20 with music soundwaves further

enhanced wastewater treatment, achieving removal rates of 0.0335 L/mg/day for TN and

0.001 L/mg/day for COD, following a binomial kinetic model. Optimized treatment

parameters were 4% algal concentration, 52.4 dB soundwave amplitude, and 4.6 days of

treatment.

Lipid extraction from CG-20 was optimized using the Taguchi method, yielding

promising results. Soundwave amplitude had the greatest impact on extraction efficiency,

while treatment duration had the least. Optimal extraction parameters were n-

hexane:ethanol (3:1), 40°C, 80% supersonic wave amplitude, and 15 minutes of treatment.

The extracted lipids showed potential for biodiesel production. However, life cycle

assessment (LCA) revealed a significant environmental footprint associated with lipid

extraction from dried algal biomass, particularly concerning global warming, acidification,

and eutrophication. Therefore, efforts to reduce pollutant emissions and improve extraction

efficiency are crucial.

The new contributions

This study isolated and identified 8 strains of algae belonging to the genus Chlorella,

including 3 strains belonging to the species Chlorella vulgaris, 2 strains belonging to the

species Chlorella sorokiniana, and 3 strains of undetermined species. The level of genetic

diversity among the Chlorella vulgaris strains was clarified by ISSR markers, showing that

the genetic diversity of the algal samples within the same species did not correlate with the

geographical distribution in the provinces and cities in the study.

The appropriate culture medium for the growth of Chlorella vulgaris CG20 biomass

was determined, including BBM or HAMGAM medium, along with suitable conditions to

reduce total nitrogen and COD index in wastewater.

The optimal conditions for extracting lipids from the algal strain Chlorella vulgaris

CG20 by the Taguchi method were determined and oriented to the application of biofuel

production. The LCA analysis results showed that the lipid extraction process from dry

algae has a significant impact on the environment.

Key words: Chlorella, ISSR Chlorella, wastewater treatment, lipid extraction.

MỞ ĐẦU

Chlorella là một trong những chi tảo lục phổ biến, trong đó C. vulgaris là một trong

những loài tảo đầu tiên được phân lập bởi Beijerinck (1890), loài tảo này được dùng để

nghiên cứu về quá trình quang hợp. Ngày nay, Chlorella có đến 44 loài đã được định danh,

loài tảo này thường được tìm thấy ở cả thuỷ vực nước ngọt và nước mặn. Nhiều loài trong

chi Chlorella có giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học cao. Tuy nhiên, các loài Chlorella

khác nhau sẽ có thành phần dinh dưỡng và các chất có hoạt tính sinh học cũng khác nhau.

Đặc thù địa lý ở miền Nam Việt Nam có hệ sinh thái đa dạng, đặc biệt là sông ngòi,

ao hồ và các vùng đất ngập nước, môi trường sống thích hợp của nhiều loài thủy sinh vật

và các loài tảo thuộc chi Chlorella cũng không ngoại lệ. Qua quá trình tiến hóa, sinh vật

bản địa đã thích nghi tốt với điều kiện môi trường sống. Việc phân lập chi tảo Chlorella tại

khu vực miền Nam Việt Nam, giúp bảo tồn các dòng tảo bản địa và nguồn gen quý, nhằm

khai thác và phát triển hiệu quả nguồn gen này. Đặc tính sinh hoá của sinh khối ở 4 chủng

tảo C. vulgaris khác nhau, cho thấy hàm lượng lipid và thành phần acid béo đều có sự khác

biệt rõ rệt. Sự khác nhau về hàm lượng lipid trong sinh khối và thành phần acid béo sẽ

quyết định đến các định hướng ứng dụng cho dòng tảo đó. Hàm lượng lipid và acid béo no

cao sẽ có ưu điểm trong sản xuất nguyên liệu sinh học, hàm lượng acid béo không no cao

sẽ có tiềm năng để ứng dụng làm thực phẩm chức năng hoặc trong lĩnh vực y dược. Tuy

nhiên, đặc điểm phân biệt và điều kiện nhận biết giữa các dòng tảo ở mức độ loài này còn

nhiều bỏ ngỏ. Các nghiên cứu đa dạng di truyền cho thấy chỉ thị ISSR là công cụ hữu ích

trong các nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể tảo lục (Wongsawad và ctv, 2015). Kết

quả nghiên cứu đa dạng di truyền góp phần làm cơ sỡ dữ liệu ban đầu cho các nghiên cứu

ứng dụng tiếp theo.

Tiềm năng của chi tảo Chlorella không chỉ nằm ở sinh khối, mà chi tảo Chlorella

còn có khả năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong nước. Ứng dụng chi tảo Chlorella vào

xử lý nước thải được cho là phương pháp sản xuất sinh khối tảo ít tốn kém và thân thiện

với môi trường. Bên cạnh đó, lipid từ chi tảo Chlorella còn được xem như nguồn nguyên

liệu đầy tiềm năng để sản xuất biodiesel (nhiên liệu sinh học). Do đó, luận án mong muốn

đánh giá được mức độ đa dạng thành phần loài của chi tảo Chlorella, xác định được các

loài trong chi tảo Chlorella chiếm ưu thế và sự khác biệt về mặt di truyền của các loài trong

chi Chlorella chiếm ưu thế. Từ đó, các chủng Chlorella được tiếp tục đánh giá và chọn lọc

theo định hướng hẹp là xử lý nước thải, thử nghiệm thu hồi lipid từ sinh khối tảo, như

nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel.

Do đó, đề tài “NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ CHỌN LỌC CÁC

CHỦNG TẢO Chlorella sp. ĐƯỢC THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH NAM BỘ” đã được

thực hiện.

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng tảo Chlorella spp.

Nội dung 2: Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng tảo Chlorella spp. bằng chỉ thị sinh

học phân tử PCR-ISSR.

Nội dung 3: Sàng lọc các chủng tảo Chlorella có tiềm năng ứng dụng vào xử lý nước thải

Nội dung 4: Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp. và ly trích lipid từ sinh

khối tảo

Mục tiêu nghiên cứu: 1) Phân lập và định danh được các chủng tảo thuộc chi Chlorella.

2) Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền giữa các chủng tảo Chlorella đã phân lập được

bằng chỉ thị ISSR. 3) Xác định được các điều kiện phù hợp khi ứng dụng tảo Chlorella đã

phân lập được, để giảm nitrogen tổng số và chỉ số COD trong nước thải. 4) Xác định được

điều kiện tối ưu để trích ly lipid từ chủng tảo phân lập được.

Ý nghĩa khoa học:

Nghiên cứu đã phân lập thành công các chủng tảo Chlorella và thực hiện định danh

dựa trên phân tích hình thái kết hợp với trình tự DNA barcode. Đồng thời, luận án tiến

hành phân tích đa dạng di truyền của các chủng được thu thập từ một số tỉnh thành ở miền

Nam Việt Nam bằng chỉ thị ISSR. Kết quả này đóng góp dữ liệu khoa học quan trọng về

đa dạng di truyền của tảo Chlorella tại khu vực nghiên cứu. Ngoài ra, nghiên cứu đã xác

định được điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng CG20, giúp phát huy hiệu quả trong xử lý

nước thải. Đồng thời, các điều kiện trích ly lipid từ chủng này cũng được tối ưu hóa nhằm

phục vụ ứng dụng trong xử lý nước thải và sản xuất nhiên liệu sinh học, góp phần mở rộng

tiềm năng thực tiễn của tảo Chlorella trong lĩnh vực môi trường và năng lượng tái tạo.

Ý nghĩa thực tiễn:

Luận án xác định được các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng tảo CG-20, giúp phát

huy hiệu quả xử lý nước thải. Bên cạnh đó, luận án còn xác định được các điều kiện ly trích

tối ưu cho chủng tảo CG-20 và góp phần mở rộng tiềm năng thực tiễn của tảo Chlorella

trong lĩnh vực môi trường và năng lượng tái tạo.

Đối tượng nghiên cứu: 120 mẫu tảo thu thập từ 5 tỉnh thành khu vực miền Nam Việt Nam

(Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh, Bình Dương, Đồng Tháp, Tiền Giang, Long An, Đồng Nai).

Những đóng góp mới của luận án

Luận án đã phân lập và định danh được 8 chủng tảo thuộc chi Chlorella, bao gồm 3

chủng thuộc loài Chlorella vulgaris, 2 chủng thuộc loài Chlorella sorokiniana và 3 chủng

chưa xác định được loài. Mức độ đa dạng di truyền giữa các chủng tảo Chlorella vulgaris

đã được làm rõ bằng chỉ thị ISSR, cho thấy sự đa dạng di truyền của các mẫu tảo trong

cùng loài chưa có sự tương quan với phân bố địa lý ở các tỉnh, thành trong nghiên cứu.

Xác định được môi trường nuôi thích hợp để phát triển sinh khối chủng Chlorella

vulgaris CG20, bao gồm môi trường BBM hoặc HAMGAM, cùng với các điều kiện phù

hợp để giảm nitrogen tổng số và chỉ số COD trong nước thải.

Xác định được điều kiện tối ưu để trích ly lipid từ chủng tảo Chlorella vulgaris CG20

bằng phương pháp Taguchi, định hướng ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học. Kết quả

phân tích LCA chỉ ra rằng quy trình ly trích lipid từ tảo khô có tác động đáng kể đến môi

trường.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về tảo Chlorella

Chlorella là một chi của tảo lục đơn bào thuộc nhóm sinh vật quang tự dưỡng, được

xếp trong ngành Chlorophyta. Chlorella có màu xanh lá cây nhờ sắc tố quang hợp

chlorophyll a và b trong lục lạp. Chlorella là tảo đơn bào thuộc nhóm sinh vật nhân thực,

tốc độ tăng trưởng nhanh khi ở điều kiện môi trường thuận lợi (Yang và ctv, 2016).

Chorella được tìm thấy ở nhiều sinh cảnh khác nhau như: đất, môi trường nước ngọt,

mặn,… và ngay cả trên sa mạc (Chlorella ohadii được phân lập từ sa mạc).

(Darienko và ctv, 2010)

Hình 1.1. Tảo Chlorella

Hệ thống phân loài của tảo Chlorella

Giới: Plantae

Ngành: Chlorophyta

Lớp: Chlorophyceae

Bộ: Chlorococales

Họ: Chlorellaceae

Chi: Chlorella (Bold và Wynne, 1978)

Hình 1.2.Cây phát sinh loài của tảo Chlorella

1.1.1 Tiêu chuẩn hình thái tảo Chlorella

Tảo Chlorella có vách tế bào mỏng, có hình cầu hay hình elip (Richmond và ctv,

2003). Đặc điểm của chi tảo Chlorella được phân vào 4 nhóm, có hình thái như sau:

a) Nhóm hình cầu (tỉ lệ 2 trục bằng 1)

b) Nhóm hình elip (một trục dài gấp 1,45 - 1,6 lần trục kia)

c) Nhóm hình cầu hoặc elip

d) Nhóm dạng gần cầu (Richmond và ctv, 2003).

Chlorella có cấu tạo đơn bào, không có tiên mao, không có khả năng di động chủ

động. Tế bào có dạng hình cầu hoặc hình oval. Kích cỡ tế bào từ 2 – 12 µm phụ thuộc vào

điều kiện môi trường và giai đoạn phát triển. Màng tế bào có vách cellulose bao bọc, chịu

được những tác động cơ học nhẹ. Sự thay đổi của các điều kiện môi trường như ánh sáng,

nhiệt độ, thành phần các chất hóa học trong môi trường sẽ ảnh hưởng đến hình thái tế bào

tảo (Richmond và ctv, 2003). Chlorella chứa lục lạp kết dính bởi một lớp vỏ màng kép,

đây là bào quan dễ thấy nhất trong tế bào tảo và là tiêu chí quan trọng nhất để phân loại tảo

lục. Lục lạp chứa các thylakoid thực hiện phản ứng quang hợp pha sáng và phản ứng cố

định CO2 pha tối diễn ra trong stroma. Thylakoid nằm xuyên vào chất nền của hạch tạo

tinh bột có dạng hai lớp đồng nhất, hiện diện trong các loài C. vulgaris, C. lobophora, C.

kessleri và C. sorokiniana (Ikeda và Takeda, 1995). Các lipoprotein trong lục lạp được gọi

là các thể cầu (plastoglobule), có vai trò quan trọng trong màng thylakoid. Cấu trúc này có

vai trò dự trữ một số loại lipid trong các loài Chlorella (Kessler và Vidi, 2007). Cấu trúc

này còn được định nghĩa là các hạt lipoprotein nằm trong plastid chứa tocopherol, một loại

dẫn xuất isopyrenoid lipid và protein cấu trúc gọi là plastoglobulin.

Tảo Chlorella không có sự sinh sản hữu tính. Quá trình sinh sản được tiến hành nhờ

tạo nên trong cơ thể mẹ các tự bào tử. Tùy theo loài tảo và điều kiện môi trường mà số

lượng các tự bào tử có thể là 2, 4, 8, 16, 32 (thậm chí có trường hợp tạo ra 64 tự bào tử)

sau khi kết thúc sự phân chia, tự bào tử tách khỏi cơ thể mẹ bằng cách xé màng tế bào mẹ.

Các tế bào trẻ này sẽ lớn lên và phát triển đến giai đoạn chín, có khả năng sinh sản, toàn

bộ chu trình lập lại từ đầu (Safi, 2014).

(Safi và ctv, 2014)

Hình 1.3. Quá trình phân bào của tảo Chlorella vulgaris

Chủng Chlorella-like CAUP H7901 có hình thái, siêu cấu trúc tế bào (cấu trúc tế bào

quan sát ở độ phóng đại cao hơn) và phân tích phát sinh loài (dựa vùng trình tự 18S DNA),

các phân tích cho thấy chủng này có mối tương quan gần với nhánh Watanabea. C.

sacchrophilia, C. luteoviridis và Heveocholrella hainangenisi cũng được cho rằng có mối

tương quan gần với nhóm Watanabea. Chủng Chlorella-like CAUP H7901 được kết luận

là Kalinella bambusicola gen. et sp. nov (Neustupa và ctv, 2013), một loài hoàn toàn mới.

Các chủng tảo Chlorella-like gần đây đã được phân loại thành các chi riêng biệt như:

Elliptochloris, Pseudochlorellla và Xylochloris thuộc lớp Trebouxiophyceae. Ban đầu,

việc xác định hình thái nhóm tảo này bằng kính hiển vi thường xuyên gặp nhiều khó khăn.

Ngoài ra, tính không đồng nhất của tảo Chlorella cũng được thể hiện thông qua các nghiên

cứu siêu cấu trúc tế bào và các đặc tính sinh hoá. Bên cạnh đó, hình thái của nhóm tảo

Chlorella-like được biết là đã tiến hoá nhiều lần từ họ Chlorophyceae và Trebouxiophyceae

(Neustupa và ctv, 2009). Do đó, việc xác định loài chỉ thông qua hình thái sẽ gặp nhiều

khó khăn, các kết quả của phương pháp phân tích trình tự có vai trò tăng cường độ tin cậy

của kết quả định danh. Vì vậy, việc định danh bằng các marker phân tử là một phương

pháp bổ trợ cần thiết phải tiến hành.

Bên cạnh đó, trong một số giai đoạn chu kỳ tế bào ở các chủng tảo như:

Lobosphaeropsis lobophora, Coronastrum ellipsoideum, Dictyosphaerium, Meyerella

planktonica và Micractinium pusillum, có mức độ tương đồng về hình thái với Chlorella

rất cao (Neustupa và ctv, 2009). Điều này, có thể dẫn đến sai sót trong quá trình định danh

hình thái cho tảo Chlorella, vì vậy việc định danh bằng các marker phân tử là một phương

pháp bổ trợ cần thiết phải tiến hành.

1.1.2. Các vùng trình tự được dùng để định danh tảo Chlorella

Định danh phân tử có nghĩa là nhận diện và phân loại các loài bằng các dấu hiệu phân

tử (marker phân tử). Hiện nay, mã vạch DNA là một trong những công cụ phù hợp nhất để

nhận dạng ở cấp độ loài. Định danh phân tử tảo Chlorella nhiều vùng trình tự đã được sử

dụng như vùng gen ti thể (COI), gen lục lạp (rbcL và tufA), vùng 18s rRNA, SSU, ITS…

Trong số đó, các vùng trình tự 18S ribosomal RNA, ITS và rbcL là các vùng trình tự được

sử dụng nhiều nhất (Wong và ctv, 2023).

1.1.2.1. Vùng trình tự 18S ribosomal RNA

Trình tự 18S ribosomal RNA là tiểu đơn vị hạt nhân nhỏ của gen RNA ribosome (SSU

rRNA) có kích thước khoảng ~ 1,8 kb, một phân tử phổ biến thường được sử dụng trong

các nghiên cứu phát sinh loài. Gen 18S rRNA có tính bảo tồn cao về mặt đặc hiệu, có hiệu

quả trong các phân tích cấp loài dựa trên chẩn đoán đa hình nucleotide đơn và đóng vai trò

như một công cụ phụ trợ khi có sẵn các dữ liệu khác (chẳng hạn như các đặc điểm hình

thái và các dấu hiệu gen khác). Marker phân tử 18S rRNA có thể định danh hiệu quả đến

34 loài tảo (Khaw và ctv, 2020). Đoạn trình tự 18S rRNA cũng được sử dụng để định danh

21 chủng tảo lục trong nghiên cứu của Vishwakarma, cho kết quả phân định tốt ở các loài

Scenedesmus sp., Dictyosphaerium sp. và Chlorella sp. (Vishwakarma và ctv, 2020). Trình

tự 18S rRNA được sử dụng rộng rãi ở đa số các loài tảo bao gồm các loài quan hệ họ hàng

gần với tảo Chlorella, vùng trình tự này có khả năng phân loại loài cao đối với ngành tảo

lục (Vishwakarma và ctv, 2020).

1.1.2.2. Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS)

Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn gen nằm trong rDNA không có

chức năng mã hóa RNA của ribosome. ITS có độ dài 600 – 700 bp là vùng có tốc độ tiến

hóa cao. Vùng trình tự này có thể thay đổi về trình tự cũng như độ dài. Các vùng bên cạnh

ITS có độ bảo tồn cao nên được sử dụng để thiết kế các mồi chung cho để khuếch đại vùng

trình tự này (Bock và ctv, 2011). Một nghiên cứu định danh tảo Chlorella dựa trên hình

thái và vùng trình tự ITS, nghiên cứu thực hiện trên 49 vùng trình tự của nhiều chủng

Chlorella khác nhau. Kết quả cho thấy vùng trình tự này phân định được 14 loài Chlorella

khác nhau gồm: C. vulgaris, C. pituita, C. lobophora, C. variabilis, C. sorokiniana, C.

lewinii, C. rotunda, C. heliozoae, C. pulchelloides, C. chlorelloides, C. singularis, C.

colonials, C. volutis và C. elongate (Bock và ctv, 2011). Trình tự ITS còn định danh thành

công 3 chủng tảo Phaeodactylum tricornutum, vùng trình tự được khuếch đại có kích thước

khoảng 820 bp (Steinrücken và ctv, 2018). Đoạn trình tự ITS được xem như một phương

pháp đơn giản để phân biệt hai loài Tetraselmis sp. và Chlorella sp. (Fathy và ctv, 2023).

1.1.2.3. Vùng trình tự gen rbcL

Trong gen lục lạp, trình tự gen rbcL mã hóa cho các tiểu đơn vị lớn của ribulose - 1,5

rubuloza carboxylase/oxygenase (RUBISCO) có chiều dài khoảng 573 bp. Vùng rbcL là

vùng hoạt động đơn lẻ đạt hiệu quả tốt và được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu định

danh (Yanuhar và ctv, 2019). Vùng rbcL có độ dài 593 bp được sử dụng để định danh tảo

thông qua phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loài, cho thấy chủng tảo C. vulgaris

STB01 nằm trong monophyletic với các chủng Chlorella sp., C. pyrenoidosa và C.

vulgaris. Bên cạnh đó, kết quả còn cho thấy vùng trình tự của chủng C. vulgaris STB01 có

độ tương đồng đạt 99% với các chủng C. vulgaris trên thế giới (Yanuhar và ctv, 2019).

Một nghiên cứu xây dựng cây phát sinh chủng loài dựa trên trình tự vùng rbcL của

20 chủng tảo (C. vulgaris, C. sorokiniana, C. pyrenoidosa, Chlorella sp. và C. salina). Kết

quả cho thấy có sự phân tách rõ ràng ở các nhóm tảo Chlorella với nhau. Các chủng C.

vulgaris, C. sorokiniana, C. pyrenoidosa, Chlorella sp. nằm cùng một nhánh của cây phát

sinh loài. Duy nhất C. salina có khoảng cách di truyền cao hơn so với nhóm còn lại và

nhằm riêng biệt ở một nhánh khác. Nguyên nhân, do môi trường sống của chủng tảo này

là nước mặn (Putri và ctv, 2023).

Một nghiên cứu đánh giá sự khác biệt của 3 vùng trình tự rbcL, 18S và ITS ở các

chủng tảo trong họ Chlorellaceae, 655 trình tự của 64 loài thuộc 31 chi. Kết quả nghiên

cứu cho thấy nếu chỉ dựa vào duy nhất một vùng trình tự có thể không đủ để suy ra phát

sinh loài ở họ Chlorellaceae. Mỗi vùng trình tự đều có các đặc điểm tiến hóa riêng biệt, do

đó, mối quan hệ tiến hóa giữa các loài trong cùng 1 chi ở họ Chlorellaceae sẽ không phù

hợp. Đồng thời, việc xác định loài trong họ Chlorellaceae bằng 1 chỉ thị phân tử duy nhất

cũng không phù hợp (Wong và ctv, 2023).

1.1.3. Hàm lượng lipid, thành phần lipid và tiềm năng ứng dụng làm nhiên liệu sinh

học của tảo Chlorella

Tảo Chlorella có tác động tích cực đến sức khoẻ con người do hàm lượng dinh dưỡng

cao và hàm lượng lipid có ít cho sức khỏe, hàm lượng lipid thể hiện ở bảng 1.1.

Bảng 1.1. Hàm lượng lipid của các loài tảo thuộc chi Chlorella

Loài Lipid %

Chlorella vulgaris 14-22

Chlorella calcitrans 14,6-16,4/39,8

Chlorella emerson ii 25,0-63.0

Chlorella protothecoide 14,6-57,8

Chlorella pyrenoidosa 2,0

Chlorella sorokiniana 19,0-22,0

Chlorella sp. 10,0-48,0

(de Andrade, 2017)

Lipid của tảo Chlorella gồm có triacylglyceride, diacylglycerols, monoacylglycerols,

steroid ester, acid béo tự do, glycolipid và phospholipid. Acid béo ở Chlorella gồm 3 nhóm

chính là acid béo bão hòa, acid béo không bão hòa đơn và acid béo không bão hòa đa nối

đôi. Tùy thuộc vào điều kiện sinh trưởng mà hàm lượng lipid và thành phần acid béo của

tảo cũng có sự thay đổi. Tảo Chlorella có thành phần acid béo bão hòa từ 36,8 - 77,8%,

acid béo không bão hòa đơn chiếm 0,1 - 20,7% và acid béo không bão hòa đa nối đôi 14,7

– 56,3% (Liu, 2011). Đối với tảo C. vulgaris được nuôi cấy ở điều kiện quang tự dưỡng

hàm lượng acid béo C15:0 (0,11%), C16:0 (44,99%), C16:1 (5,86%), C17:0 (5,72%),

C18:0 (1,09%), C18:1 (1,67%), C18:2 (25,4%), C18:3 (12,49%) và C19:1 (2,6%). Thành

phần acid béo ở C. zofingiensis có acid béo C:16, C18:1 và C18:2 chiếm đến 65,3%, nhóm

acid béo không bão hòa đa nối đôi chiếm 49,6% (Vello và ctv, 2014).

Tảo Chlorella được xem như nguồn nguyên liệu sinh học đầy hứa hẹn để sản xuất

biodiesel do tốc độ sinh trưởng nhanh và tích lũy một lượng lớn lipid (20-50% trọng lượng

khô). Đặc biệt là triacylglycerol (TAG) và nhiều sản phẩm phụ có giá trị. Các acid béo

palmitic (C16:0), palmitoleic acid (C16:1), oleic acid (C18:1) và linolenic acid (C18:3) là

các acid béo chính được cho là giúp cải thiện các đặc tính nhiên liệu của biodiesel. Các đặc

tính như độ ổn định oxy hóa và số cetane của FAME đều phụ thuộc vào các acid béo bão

hòa (Chi và ctv, 2019). Lipid từ Chlorella có hàm lượng acid béo bão hòa cao và hàm

lượng acid linolenic nằm trong giới hạn mong muốn là 11,12%. Lipid từ tảo Chlorella cho

thấy đáp ứng các thông số kỹ thuật theo tiêu chuẩn của biodiesel EN14214 (Châu Âu) và

ASTM D6751 (Mỹ). Tính chất về chất lượng của biodiesel từ Chlorella có mật độ thấp

(0,88 g/cm3), độ nhớt động học thấp (2,78 mm2/s), số cetane tốt (68,79) và độ ổn định oxy

hóa tốt (10,44 giờ) (Arguelles và Martinez Goss, 2021).

1.2. Đa dạng di truyền ở tảo Chlorella

1.2.1. Đa dạng di truyền và đa dạng di truyền ở tảo Chlorella

Đa dạng di truyền có nghĩa là sự khác biệt về mặt di truyền ở các cá thể cùng loài hay

khác loài. Đa dạng di truyền giúp tạo ra các đặc điểm khác nhau giữa các cá thể và khả

năng thích nghi với các điều kiện môi trường bất lợi. Ở một quần thể khỏe mạnh, sự đa

dạng di truyền thể hiện qua các kiểu gen hay các khả năng kháng với các tác nhân gây bệnh

hoặc điều kiện bất lợi ở điều kiện môi trường khác nhau. Bên cạnh đó, đa dạng di truyền

giúp làm giảm cơ hội biểu hiện các đặc điểm di truyền không mong muốn ở trong quần

thể. Sự đa dạng di truyền còn có vai trò đảm bảo ít nhất còn một số kiểu gen hoặc kiểu hình

còn sống sót trước quá trình chọn lọc tự nhiên (Murray, 1972).

Các nghiên cứu trước đây cho thấy kích thước bộ gen của Chlorella vào khoảng

38,8Mb, với tổng số 16 nhiễm sắc thể. Trong đó đoạn nhỏ nhất là 980kb với chuỗi trình tự

5’-TTTAGGG-3’ trong khoảng 70 lần lặp lại (Higashiyama và ctv, 1995). Do tốc độ tăng

trưởng nhanh chóng, Chlorella là một đối tượng lý tưởng cho nghiên cứu tế bào và phân

tử.

Trình tự ITS để định danh và mức độ tương quan các chủng tảo Chlorella, tổng cộng

49 đoạn trình tự đến từ 14 loài tảo nằm trong chi Chlorella (C. chlorelloides, C. colonials,

C. elongate, C. heliozoae, C. lewinii, C. lobophora, C. pituita, C. pulchelloides, C. rotunda,

C. singularis, C. sorokiniana, C. variabilis, C. volutis và C. vulgaris) được đánh giá và

phân tích. Kết quả cho thấy khoảng cách di truyền của chủng C. vulgaris với các chủng

còn với P = 0,0863 – 0,1542 (Bock và ctv, 2011). Khi phân tích vùng trình tự rbcL ở các

chủng tảo C. vulgaris, C. pyrenoidosa, Chlorella sp., C. sorokiniana và C. salina, kết quả

cho thấy C. vulgaris và C. pyrenoidosa có mức độ tương đồng cao nhất (khoảng cách = 0),

C. vulgaris và C. sorokiniana có khoảng cách là 0,055 và C. vulgaris và C. salina có

khoảng cách là 0,1949 (Putri và ctv, 2023).

1.2.2. Kỹ thuật ISSR

Kỹ thuật ISSR là kỹ thuật nhân bản đoạn DNA nằm giữa hai vùng lặp lại giống hệt

và ngược chiều nhau. ISSR là những chỉ thị được nhân bản bằng PCR với một mồi bổ trợ

với các vùng trình tự microsatellite đích. Mỗi băng tương ứng với đoạn trình tự DNA được

giới hạn bởi các microsatellite đảo ngược. Kết quả dẫn đến đa locus, các vùng trình tự nằm

bên trong các đoạn lặp lại có sự đa hình cao và thường tạo ra các chỉ thị trội. ISSR-PCR là

kỹ thuật đánh giá kiểu gen nhanh và không tốn kém. Sự đa hình dựa trên sự thay đổi trong

các vùng nằm giữa các tiểu vệ tinh. Điểm nội bật của kỹ thuật này là không cần thông tin

về trình tự, tạo được nhiều locus, có tính đa hình cao và tạo ra chỉ thị trội (Nguyễn Đức

Thành, 2014).

Trong các nghiên cứu đa dạng di truyền, có nhiều phương pháp khác nhau được sử

dụng. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong đánh giá quan hệ di truyền (Raina và ctv,

2001). ISSR là phương pháp đơn giản dễ thực hiện, không đòi hỏi dữ liệu trình tự của đối

tượng nghiên cứu. ISSR được xem như chỉ dấu đặc trưng trong nhiều nghiên cứu trên thực

vật (Amruthakumar và ctv, 2024) như: cây cà phê (Amruthakumar và ctv, 2024), cây bơ

(Phạm Thị Phương và ctv, 2009) và tảo Spirogyra (Sweiss và ctv, 2024). Tảo Spirogyra là

loài chỉ có một vài đặc điểm hình thái ổn định và kiểu hình dễ biến đổi (Sweiss và ctv,

2024). Loài tảo này còn sinh trưởng dưới dạng thể đa bội, điều này khiến cho việc phân

định bằng hình thái gặp nhiều khó khăn. Spirogyra và Chlorella đều có điểm chung, rất

khó phân biệt khi chỉ dựa vào hình thái (Sweiss và ctv, 2024). Kỹ thuật ISSR được ghi

nhận có khả năng phân tích mức độ đa dạng di truyền các chủng tảo Spirogyra (Wongsawad

và ctv, 2015). Kỹ thuật này được cho là công cụ hữu ích trong các nghiên cứu đa dạng di

truyền quần thể tảo lục (Wongsawad và ctv, 2015). Sự khác biệt di truyền giữa các chủng

C. vulgaris thể hoang dại và chủng đột biến có thể nhận biết bằng kỹ thuật ISSR (Alzahrani

và ctv, 2013). Chỉ thị này còn cho thấy có sự khác biệt về mặt di truyền giữa 4 chủng tảo

C. vulgaris và 3 chủng tảo C. pyrenoidosa với nhau (Shen, 2008).

1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến tăng trưởng của tảo Chlorella

1.3.1. Môi trường nuôi cấy

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng ở tảo Chlorella phải kể đến như là:

giống nuôi cấy, hệ thống nuôi cấy, chế độ nuôi và môi trường nuôi cấy. Môi trường nuôi

cấy vi tảo như 3N-Basal Bold medium, LC Oligo, Chu 10 và WC media (Chia và ctv,

2013). Môi trường 3N-BBM được cho là môi trường phù hợp cho hầu hết cho các chủng

tảo lục, tuy nhiên môi trường này được cho là nồng độ nitrate khá cao. Môi trường LC

oligo được cho là môi trường cho mật độ tế bào cao nhất 3.106 tế bào/mL (Chia và ctv,

2013). Các môi trường nhân tạo như: BG11, BBM, LC Oligo và M-8 là các môi trường

thường xuyên được sử dụng trong nuôi cấy tảo Chlorella. Năm 2017, Wong và cộng sự đã

tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đối với Chlorella

vulgaris, kết quả cho thấy môi trường BG-11 thể hiện tốc độ tăng trưởng tốt nhất (0,279

±0,001 mg/L/ngày), năng suất sinh khối (114,208 ±0,850 mg/L/ngày), năng suất lipid

(ngày 12: 17,640 ±0,002%) và năng suất lipid tổng (20,881 ±0,403 mg/L/ngày) (Wong và

ctv, 2017).

1.3.2. Các thành phần hữu cơ

Điều kiện được cho là tốt nhất để nuôi cấy vi tảo là chế độ hỗn dưỡng. Glucose như

là nguồn carbon và nitrate như là nguồn nitrogen có hiệu quả cao nhất trong số các điều

kiện dinh dưỡng. Kết quả tốt nhất thu được khi hàm lượng glucose và nitrate lần lượt là 20

g/L và 0,5 g/L. Lượng sinh khối thu được là 3,43 g/L và năng suất lipid cao nhất đo được

là 66,25 mg/L/ngày (Daliry và ctv, 2017).

Vi tảo được cho rằng có khả năng sử dụng các nguồn nitrogen hữu cơ khác nhau như:

urea, amino acid, purine và purimidine. Tế bào tảo kiểm soát quá trình hấp thụ nitrogen

thông qua con đường NtcA (nitrogen transcription regulator). Tuỳ thuộc nguồn nitrogen

có ở trong môi trường, tế bào tổng hợp các protein vận chuyển và enzyme permease phù

+. NH4

hợp. Khi tế bào hấp thu các nitrogen phức hợp, nó được chuyển hóa thành NH4

+ được tạo ra trong quá trình khử, nitrate được chuyển thành

được gắn vào khung carbon nhờ vào hoạt động của hai enzyme là glutamate synthase và

glutamine synthetase. NH4

nitrite bằng cách sử dụng nitrate reductase. Nitrite tiếp tục được khử thành ion ammonium

bằng enzyme nitrite reductase. Các chất vận chuyển cassette liên kết ATP (ATP binding

cassette transporter) đều tham gia vào quá trình đồng hóa nitrogen hữu cơ (Kumar và Bera,

2020). Tảo nhanh chóng tiêu thụ ammonium và đồng hoá nó bằng các con đường chuyển

hoá. Enzyme chịu trách nhiệm cho phản ứng khử amin là amino acid oxidase. Hai enzyme

chính chịu trách nhiệm cho sự chuyển hoá trong tảo là L alanine aminotransferase và L

aspartate aminotransferase. L alanine aminotransferase tham gia vào quá trình chuyển

thuận nghịch nhóm amine giữa alanine và glutamate. L aspartate aminotransferase tham

gia vào quá trình chuyển nhóm amine giữa aspartate và glutamate. Khi tế bào trong tình

trạng đói nitrogen hoặc carbon, các phản ứng chuyển hoá này đóng một vai trò quan trọng

trong việc duy trì liên kết các amino acid mà chúng giúp duy trì sự sống cho tế bào sống

(Kumar và Bera, 2020).

Nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều loài tảo có thể sử dụng amino acid như một nguồn

nitrogen. Tảo hấp thu amino acid tự do thông qua con đường đồng vận chuyển bởi ion

Natri (Na+), con đường này có thể vận chuyển được các hầu hết các loại amino acid (có

tính acid, base, trung tính). Ở periplasm (khoảng trống giữa màng ngoài và màng tế bào

chất), amino acid bị enzyme periplasmic amino acid oxidase chuyển hoá thành ammonium

và oxoacid. Tế bào nhanh chóng hấp thụ ammonium và đồng hóa nó theo một con đường

cụ thể trong khi oxoacid không được hấp thụ (Kumar và Bera, 2020).

(Kumar và Bera, 2020).

Hình 1.4. Con đường hấp thu và vận chuyển nitrogen ở tảo

1.3.3. Sục khí trong nuôi cấy tảo

Sục khí không chỉ giúp trộn lẫn môi trường nuôi cấy tăng khả năng tiếp xúc của tảo

với nguồn dinh dưỡng, mà còn cung cấp CO2 cho quá trình quang hợp và tổng hợp lipid ở

vi tảo. Ngoài ra, sục khí có thể tránh sự tích tụ O2 dư thừa do tảo tạo ra và ngăn chặn sự

thay đổi pH đột ngột, điều này có thể ức chế sự phát triển của vi tảo. Sự tương tác giữa bọt

khí và tế bào tảo liên quan đến 4 cơ chế: (1) tế bào bị ảnh hưởng bởi bọt khí tại bề mặt

khuếch tán, (2) tế bào bị ảnh hưởng bởi sự nổi lên của bọt khí, (3) tế bào bị ảnh hưởng bởi

bọt khí vỡ trong môi trường và (4) tế bào bị ảnh hưởng bởi bọt khí vỡ tại bề mặt chất lỏng.

Kích thước bọt khí có ảnh hưởng lớn đến tảo, kích thước bọt khí nhỏ có thể gây ảnh hưởng

tiêu cực lên tảo. Trong khi kích thước bọt khí lớn có ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình bổ

sung CO2 cũng như quá trình đảo trộn môi trường nuôi cấy. Kích thước bọt khí từ 1,5 – 6

mm được xem như không gây ảnh hưởng tiêu cực lên khả năng sinh trưởng và phát triển

của tảo (Yang và ctv, 2018).

1.4. Ứng dụng Chlorella vào trong xử lý nước thải và thử nghiệm ly trích lipid

1.4.1. Xử lý nước thải bằng tảo Chlorella

Ô nhiễm nước là sự thay đổi theo chiều xấu đi các tính chất vật lý, hoá học và sinh

học của nước, với sự xuất hiện các chất lạ ở thể lỏng, rắn khiến cho nguồn nước trở nên

độc hại với con người và sinh vật. Nước thường bị ô nhiễm khi nồng độ các tác nhân như:

vi sinh vật, virus, các tác nhân hóa học (thuốc bảo vệ thực vật hoặc phân bón), phụ phẩm

của ngành dược, nitrate, phosphate, nhựa, chất bài tiết (người và động vật), kim loại nặng

và các chất phóng xạ. Đối với xử lý nước ô nhiễm, các quy trình chủ yếu được chia thành

2 đối tượng chính, kỹ thuật xử lý ô nhiễm tầng nước mặt và xử lý ô nhiễm tầng nước ngầm.

Trong trường hợp ô nhiễm tầng nước mặt, các dạng ô nhiễm chính là mầm bệnh và chất

rắn. Ô nhiễm nước ngầm có đặc trưng riêng là ô nhiễm do arsenic, fuoride, iron, nitrate,

đôi khi còn có cả ô nhiễm phóng xạ do uranium. Dựa trên các nguồn ô nhiễm mà kỹ thuật

cũng như phương pháp xử lý có sự thay đổi (Sikdar, 2021).

Kỹ thuật xử lý tầng nước mặt, việc loại tạp chất rắn có trong nước ở dạng lơ lửng

hoặc hòa tan là mục tiêu chính của quy trình xứ lý nước. Bên cạnh đó, các chất rắn vô cơ

hoặc hữu cơ hòa tan cũng cần được loại bỏ. Để loại bỏ các chất rắn lơ lửng có các phương

pháp như: phương pháp tuyển nổi (bọt khí có kích thước nhỏ, chất kỵ nước, chất tạo bọt),

lắng (các hạt lắng tự nhiên dựa vào trọng lực, dựa vào các chất hóa học để tạo các hạt kết

tụ), lọc (hệ thống lọc màng có sử dụng áp suất, hệ thống lọc thô theo dòng chảy ngang),

hấp phụ (than hoạt tính). Để loại bỏ nguồn vi sinh vật gây bệnh, có thể được xử lý thông

qua khử trùng bằng Clo (Cl2, Ca(OCl)2, NaOCl), khử trùng bằng ozone hoặc tia UV

(Sikdar, 2021).

Kỹ thuật xử lý tầng nước ngầm, tầng nước ngầm thường ít bị ô nhiễm bởi vi sinh vật

nhưng thường bị ô nhiễm bởi sắt, fluoride, uranium, arsenic và boron. Do đó,các hệ thống

xử lý nước ngầm chủ yếu bao gồm các quá trình như: sục khí, hấp phụ, đông tụ, kết tủa,

lắng đọng, lọc và khử trùng bằng clo. Trong trường hợp nước có độ cứng cao, các phương

pháp làm mềm và khử khoáng cũng cần thiết phải được bổ sung (Sikdar, 2021).

Tảo được xem là sinh vật sản xuất sơ cấp trong hệ sinh thái ở các thủy vực, có liên

quan đến ô nhiễm nước theo một số cách nhất định. Ô nhiễm các chất hữu cơ có trong nước

có thể kích thích tảo sinh trưởng, tạo thành hiện tượng “tảo nở hoa” điều này ảnh hưởng

trầm trọng đến môi trường. Tuy nhiên, tảo cũng có vai trò quan trọng trong quá trình tự

làm sạch các nguồn nước. Tảo có khả năng tích tụ các chất dinh dưỡng (chất hữu cơ), kim

loại nặng, thuốc trừ sâu, chất độc hữu cơ, vô cơ và các chất phóng xạ trong tế bào. Tảo sử

dụng ammonium, carbon dioxide và orthophosphate như là nguồn dinh dưỡng chính, hầu

hết nitrogen trong tảo ở dạng protein (chiếm 45-60% trọng lượng khô). Phosphor có vai

trò trong sinh tổng hợp nucleic acid, phospholipid và phosphate ester. Tảo có thể loại bỏ

nitrogen và phosphor trong nước thải từ vài giờ đến vài ngày (Sen và ctv, 2013; Amaral và

ctv, 2023).

1.4.1.1. Xử lý nước thải bằng tảo Chlorella

-. Trong nước thải, hàm lượng các chất này tương đối cao kèm

Tế bào tảo chứa đến 8-10% là nitrogen, nguồn nitrogen của tảo hấp thu chủ yếu ở các

+, NO3

-, NO2

dạng như: NH4

3-, NH4

theo một lượng lớn phosphor. Trong quá trình sinh trưởng tảo sử dụng CO2, PO4

và ánh sáng mặt trời. Ngoài ra, tảo còn tổng hợp được nhiều hợp chất có khả năng ức chế

sinh trưởng một số loại vi sinh vật gây bệnh, các hợp chất điển hình như: chlorellin,

peyssonoic acid A và B, Monodictyoquinone (1,8-dihydroxy-2-methoxy-6-

methylanthraquinone) và ulvanobiuronic acid 3-sulfate (type A và B)…, các hợp chất này

đều cho thấy khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh. Ngoài ra, các chất chiết từ tảo còn cho

thấy khả năng kháng nấm và kháng virus (Afzal và ctv, 2022).

Trong thí nghiệm nuôi cấy tảo Chlorella để xử lý nước thải trong mội số nghiên cứu

ứng dụng xử lý nước thải trước đây đều có một bước tiền xử lý nước thải. Nghiên cứu của

Nguyễn Trần Thiện Khánh (2017) cho rằng phải loại bỏ các chất rắn lơ lửng trong nước

thải để tăng khả năng xử lý nước của tảo Chlorella. Tuy nhiên, để thực hiện được bước xử

- ở 1,76 10-2 M, nồng

lý nước thải một cách hiệu quả, nồng độ nitrogen, kali và phosphor của nước thải cần được

đưa về tương ứng với nồng độ của môi trường BG-11 (nồng độ NO3

độ K+ ở 3,5 10-4 M và PO4 ở 1,75 10-4 M).

1.4.1.2. Ảnh hưởng của sóng âm nhạc đến sinh vật

Quá trình truyền kích thích âm thanh cơ học trong tế bào tảo có liên quan dến những

thay đổi ở cấp độ tế bào. Nguyên nhân gây ra sự thay đổi tần số cộng hưởng tế bào là do

sự thay đổi đặc điểm ở độ nhớt của chất lỏng trong tế bào. Tế bào phản ứng với âm thanh

theo cơ chế của ứng suất cơ học như: ứng suất kéo, ứng suất cắt, sức căng của tế bào chất,

áp suất thủy tĩnh, áp lực nén khi thay đổi lưu lượng màng, sự nén ép, bằng cách thay đổi

sự vận chuyển màng. Màng tế bào chất có một lực căng liên quan, điều chỉnh cả quá trình

xuất bào và nhập bào. Khi lực căng màng tăng lên, quá trình xuất bào được kích thích và

quá trình nhập bào bị chậm lại. Sự giảm lực căng màng kích thích quá trình nhập bào, do

đó làm chậm quá trình xuất bào. Sự bài tiết được kích thích bởi các ứng suất cơ học bên

ngoài, mặc dù ở một số tế bào, lực cơ học ngăn chặn sự bài tiết. Sự chuyển đổi các kích

thích cơ học thành những thay đổi trong xuất bào và nhập bào có thể liên quan đến khung

xương tế bào, các kênh hoạt hóa bởi sự kéo giãn, integrin, phospholipase, tyrosine kinase

và cAMP. Ngoài ra, tế bào còn phản ứng với ứng suất bên ngoài bằng cách thay đổi các

yếu tố sự phân chia tế bào, sự tăng trưởng kích thước, sự truyền tín hiệu, sự biểu hiện gen

và sự kích hoạt kênh ion màng. Các kênh ion nhạy cảm cơ học (MS) là protein màng có

khả năng mở và đóng do các lực cơ học phát sinh từ trọng lực, áp suất thẩm thấu và âm

thanh. Khi các kênh ion ở trạng thái mở, đáp ứng với các lực cơ học, chúng cho phép các

ion, đặc biệt là Ca2+ và K+, đi qua màng, để tạo ra dòng ion có thể trở thành tín hiệu điện

hoặc hóa học (cơ điện tử). Lực căng màng được tạo ra có thể được truyền trực tiếp vào

kênh thông qua lớp lipid kép hoặc hợp nhất gián tiếp với các thành phần tế bào khác

(Frongia và ctv, 2020).

Sóng âm nhạc có nhiều ảnh hưởng tích cực đến nhiều sinh vật. Bò sữa được nghe nhạc

cho năng suất sữa cao hơn khi so với nhóm không nghe nhạc (Kamar và Yusof, 2023). Âm

nhạc cũng cho thấy có tác động tích cực lên cả vi khuẩn và nấm men (Sarvaiya và Kothari,

2015), thúc đẩy sự phát triển và trao đổi chất ở vi sinh vật (Sarvaiya và Kothari, 2017). Đối

với vi tảo cũng không ngoại lệ, âm nhạc giúp tăng cường tốc độ phát triển của tảo

Haematococcus pluvialis trong giai đoạn sinh dưỡng từ 2,297 và 2,76 × 102 tế

bào/mL/ngày lên 3,467 × 102 tế bào/mL/ngày (Christwardana và ctv, 2017). Sự sinh trưởng

của tảo Chlorella cũng có nhiều tác động tích cực (Tambunan và ctv, 2021), tốc độ sinh

trưởng và thời gian nhân đôi cũng cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng trong quá trình

nuôi cấy.

1.4.2. Ly trích lipid từ tảo Chlorella

1.4.2.1. Các phương pháp ly trích lipid từ tảo

Hiện nay, nhiều phương pháp phá vỡ tế bào đã được sử dụng để cải thiện quá trình

chiết lipid từ sinh khối vi tảo, bao gồm: sử dụng dung môi hữu cơ, acid mạnh, quá trình

oxy hóa hydro peroxide, chất lỏng ion, siêu âm, vi sóng, điện trường xung, enzyme thủy

phân. Việc so sánh và lựa chọn phương pháp phù hợp để áp dụng cho các loại vi tảo khác

nhau là rất khó, vì hiệu quả của chúng còn phụ vào đặc tính của từng loài vi tảo

(Lakshmikandan và ctv, 2020).

Phương pháp hóa học: chloroform, methanol, dichloromethane và n-hexane là các

dung môi thường được sử dụng để ly trích lipid của vi tảo. Thời gian ly trích, loại và độ

phân cực của dung môi cũng như sự kết hợp của chúng là những yếu tố quan trọng cho quá

trình ly trích lipid dựa trên dung môi (Kumar và ctv, 2022). Nhiệt độ cao là yếu tố thường

được sử dụng để cải thiện hiệu suất chiết lipid bằng dung môi. Mathimani và cộng sự đã

báo cáo hiệu suất ly trích lipid gần như không đổi ở mức 220 mg/g tế bào từ sinh khối C.

vulgaris thông qua ly trích bằng chloroform/methanol (2:1, v/v) ở 70 °C. Ly trích lipid từ

tế bào C. vulgaris ướt, ở áp suất cao (2 bar) và hỗn hợp n-hexane/propan-2-ol (3:2) trong

thời gian ngắn (10 phút) và ở 60°C, hàm lượng đạt được 225 mg FAME/g (fatty acid methyl

ester - FAME). Hỗn hợp n-hexane/propan-2-ol (3:2) cao hơn 12,5% khi chiết bằng

chloroform/methanol (1:2), thực hiện ở điều kiện áp suất khí quyển (Lakshmikandan và

ctv, 2020). Ưu điểm khi ly trích lipid từ vi tảo bằng dung môi hữu cơ là không cần trang

thiết bị phức tạp (Lee và ctv, 2022).

Siêu âm: Phương pháp tiền xử lý nhằm mục đích làm vỡ màng tế bào, giải phóng

lipid nội bào hiệu quả có thể được thực hiện bằng các kỹ thuật hỗ trợ về mặt cơ học và vật

lý. Tiếp theo quá trình ly trích là sự phân tách được thực hiện bằng dung môi hữu cơ. Các

phương pháp phá vỡ tế bào khác nhau đã được sử dụng như: siêu âm, vi sóng, xung điện

trường và áp suất cao đã được áp dụng song song với ly trích bằng dung môi để thu hồi

lipid từ các loài như: C. protothecoides, C. pyrenoidosa, C. saccharophila, C. sorokiniana

và C. vulgaris.

Siêu âm là một trong những phương pháp phá vỡ tế bào hiệu quả nhất được sử dụng

rộng rãi trong nhiều thập kỷ. Siêu âm là sóng cơ học có tần số (> 20 kHz) cao hơn dải tần

tai người nghe được (20 Hz đến 20 kHz) (Greenly và Tester, 2015). Những sóng này bao

gồm một loạt các chu kỳ nén và phản xạ lan truyền qua môi trường rắn, lỏng hoặc khí. Điều

này gây ra sự dịch chuyển và đánh bật các phân tử khỏi vị trí ban đầu của chúng. Sóng âm

cường độ cao, áp suất âm trong quá trình phản xạ vượt quá lực hấp dẫn. Lực liên kết các

phân tử lại với nhau, kéo chúng ra xa và tạo ra bọt khí. Những bong bóng khí này phát triển

thông qua quá trình hợp nhất và sau đó vỡ trong giai đoạn nén tạo ra nhiệt độ và áp suất

cao cục bộ. Các bong bóng siêu nhỏ ở vùng áp suất thấp được hình thành, các bong bóng

này sẽ phá vỡ tế bào chất và giải phóng các phân tử sinh học (Greenly và Tester, 2015).

Theo Ma (Ma và ctv, 2014), siêu âm là một trong những phương pháp phù hợp nhất

để ly trích lipid từ Chlorella sp. với hàm lượng lipid tối đa đạt được là 11,6% trọng lượng.

Quá trình này đơn giản với các điều kiện thiết lập dễ dàng, mang lại độ tinh khiết cao hơn

cho sản phẩm cuối cùng và loại bỏ việc xử lý nước thải phát sinh trong quá trình (Nemer

và ctv, 2021).

(Greenly và Tester, 2015)

Hình 1.5. Nguyên lý chiết xuất lipid từ tảo dưới sự hỗ trợ siêu âm

Hơn nữa, kỹ thuật này tiết kiệm và thân thiện với môi trường, có thể hoàn thành trong

thời gian ngắn và có khả năng tái sản xuất. Năng lượng đầu vào thấp hơn khi so sánh với

năng lượng trong các phương pháp thông thường, đồng thời nó còn có thể được vận hành

ở nhiệt độ thấp. Trong các kỹ thuật chiết xuất hiện đại, chiết xuất có hỗ trợ siêu âm rẻ tiền,

dễ sử dụng (Greenly và Tester, 2015). Khi được sử dụng phối hợp với các phương pháp

hóa học khác, kỹ thuật này có thể tăng hiệu quả tinh chế sinh học tảo bằng cách đơn giản

hóa một số bước và cải thiện khả năng chiết lipid của dung môi. Mở rộng quy mô hiệu quả

về mặt chi phí và quản lý nhiệt độ chính xác là điều cần thiết cho các ứng dụng thực tế.

1.4.2.2. Phương pháp Taguchi

Phương pháp Taguchi: phương pháp Taguchi là thiết kế một quá trình (hoặc sản

phẩm) ít chịu ảnh hưởng bởi những nhân tố gây ra sự sai lệch về chất lượng (Shojaei và

ctv, 2021). Một trong những lợi ích chính của phương pháp này là khả năng giảm số lượng

thí nghiệm cần thiết thông qua việc sử dụng thiết kế ma trận trực giao (orthogonal array).

Cách tiếp cận này cho phép tối ưu hóa việc đánh giá ảnh hưởng của các tham số đến kết

quả đầu ra mà vẫn đảm bảo độ chính xác và hiệu quả của nghiên cứu.

Phương pháp Taguchi sử dụng tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (Signal-to-Noise, S/N) để đo

lường và tối ưu hóa chất lượng quá trình. Tùy thuộc vào mục tiêu, có ba loại tỷ lệ S/N

thường được áp dụng: "càng lớn càng tốt" (the larger-the-better), "càng nhỏ càng tốt" (the

smaller-the-better) và "gần đúng nhất" (nominal-the-best). Một tính năng đặc biệt của

phương pháp Taguchi là việc sử dụng các ma trận trực giao, cho phép phân chia miền thí

nghiệm thành các kết hợp phù hợp với số lượng thí nghiệm tối thiểu. Điều này làm cho

phương pháp trở nên hữu ích trong việc tối ưu hóa hiệu quả quá trình chiết xuất lipid từ vi

tảo, mang lại kết quả mạnh mẽ và khả năng áp dụng cao (Ben-Gal, 2005). Phương pháp

này không chỉ cung cấp cách tiếp cận hệ thống để phân tích tác động của các thông số, mà

còn cho phép kiểm soát hiệu quả quá trình chiết xuất thông qua việc điều chỉnh các biến

số. Các bước cơ bản trong quy trình bao gồm tiền xử lý, chiết xuất và phân tích. Các yếu

tố như loại dung môi, nhiệt độ, áp suất và thời gian thí nghiệm đều được đánh giá chi tiết

để tối ưu hóa chất lượng lipid thu được. Điểm mạnh của phương pháp này là khả năng giảm

thiểu số lượng thí nghiệm cần thiết so với các phương pháp truyền thống, đồng thời thu

được thông tin một cách hệ thống mà không cần thử nghiệm dựa trên cách tiếp cận thử-sai

(trial-and-error) (Ben-Gal, 2005).

Ngoài ra, việc tích hợp phương pháp Taguchi với các kỹ thuật tối ưu hóa khác đã

được đề xuất như một chiến lược toàn diện nhằm cải thiện hiệu quả chiết xuất. Hướng tiếp

cận này không chỉ tối ưu hóa các quy trình chiết xuất mà còn có tiềm năng ứng dụng trong

việc tối ưu hóa các thông số nuôi cấy vi tảo, chẳng hạn như cường độ ánh sáng, nồng độ

dinh dưỡng, nhiệt độ và pH, để nâng cao năng suất sinh khối và chất lượng lipid. Phương

pháp Taguchi không chỉ cung cấp công cụ hiệu quả để tối ưu hóa mà còn hỗ trợ các nhà

nghiên cứu xây dựng chiến lược thiết kế thí nghiệm phù hợp, đặc biệt khi đối mặt với các

yếu tố đặc thù của loài tảo hoặc kỹ thuật chiết xuất. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng phương pháp

này có những hạn chế nhất định khi áp dụng cho các kỹ thuật tách hoặc chiết xuất phức

tạp, đòi hỏi sự kết hợp với các phương pháp khác để đạt hiệu quả cao nhất.

1.4.2.3. Đánh giá vòng đời sản phẩm (Life Cycle Accessment, LCA)

Đánh giá vòng đời sản phẩm (Life Cycle Accessment, LCA): là kỹ thuật phân tích và

đánh giá các tác động toàn diện đến môi trường trong toàn bộ vòng đời một sản phẩm hay

dịch vụ từ khâu khai thác nguyên liệu thô đến khi sản xuất, sau đó được sử dụng, tái chế

hoặc bị thải bỏ.

Hình 1.6. Các giai đoạn của đánh giá vòng đời sản phẩm và ranh giới hệ thống sản phẩm

để đánh giá LCA

Một nghiên cứu LCA có 4 giai đoạn: Xác định phạm vi - mục tiêu, phân tích kiểm

kê, đánh giá tác động vòng đời và giải thích vòng đời (Thanh, 2013).

Mục tiêu: lý do lựa chọn nghiên cứu và sử dụng vào mục đích gì, các kết quả nghiên

cứu dự kiến sẽ đạt được và những kết quả đó sử dụng ở đâu. Phạm vi nghiên cứu: Theo

TCVN ISO 14040:2000 thì ranh giới hệ thống (system boundary) là tất cả các quy trình

đơn vị được yêu cầu để phân phối luồng tham chiếu được xác định bởi đơn vị chức năng.

Trong một nghiên cứu LCA phải xác định đơn vị chức năng (functional unit) cụ thể để đảm

bảo tính nhất quán trong toàn bộ nghiên cứu. Đơn vị chức năng được hiểu là định lượng

của một hệ thống sản phẩm để sử dụng như một đơn vị chuẩn. Đơn vị chức năng là yếu tố

then chốt của một nghiên cứu LCA, là đơn vị thể hiện số lượng các chức năng đã nhận biết,

đơn vị chức năng phải nhất quán với mục tiêu và phạm vi nghiên cứu

Kiểm kê vòng đời (Life cycle inventory analysis) bao gồm việc thu thập và lượng hóa

các đầu vào và đầu ra cho một sản phẩm của các quy trình đơn vị trong suốt vòng đời với

luồng tham chiếu theo đơn vị chức năng. Kiểm kê vòng đời là bước thu thập tất cả dữ liệu

cần thiết cho bước đánh giá tác động vòng đời, bao gồm nguyên, nhiên liệu, năng lượng

đầu vào chất thải đầu ra. Dữ liệu kiểm kê bao gồm từ các công trình khoa học đã công bố,

từ các ngành công nghiệp hoặc thông tin từ chính phủ. Đánh giá tác động vòng đời (LCIA

- Life Cycle Impact Assessment) nhằm để hiểu và đánh giá tầm quan trọng, ý nghĩa của

các tác động môi trường tiềm ẩn của một hệ thống sản phẩm trong suốt vòng đời của sản

phẩm đó theo Hình 1.7.

Hình 1.7. Minh họa cho đánh giá tác động của vòng đời

1.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Nghiên cứu đa dạng di truyền thành phần loài của khu hệ tảo ở Hồ Xuân Hương, kết

quả của nghiên cứu cho thấy có đến 75 chủng tảo ở Hồ Xuân Hương và chỉ có hai loài tảo

thuộc chi Chlorella được xác định (Chlorella luteoviridis Chod. và Chlorella sp.). Phương

pháp sử dụng trong nghiên cứu này chủ yếu là phương pháp định danh bằng hình thái tế

bào qua kính hiển vi quang học.

Nghiên cứu phân lập và lựa chọn chủng vi tảo có tiềm năng sản xuất dầu ở Việt Nam,

kết quả nghiên cứu cho thấy 50 chủng vi tảo được xác định và thuộc 25 chi tảo khác nhau.

Các chủng tảo này được thu nhận từ 25 vị trí toạ độ thuộc 15 tỉnh thành: Quảng Ninh,

Khánh Hoà, Phú Yên, Bình Thuận, Đắc Nông, Tp. Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Tiền Giang,

Bến Tre, Trà Vinh, Cần Thơ, Đồng Tháp, An Giang, Kiêng Giang và Cà Mau. Phương

pháp dùng trong nghiên cứu này là định danh hình thái và kết hợp định danh phân tử (vùng

18S rRNA), khả năng tổng hợp hạt lipid được kiểm tra bằng thuốc nhuộm Nile Red, định

lượng lipid thông qua phương pháp Bligh và Dyer và hàm lượng acid béo được xác định

bằng phương pháp sắc ký khí. Kết quả định danh của nghiên cứu này xác định được 11

chủng thuộc chi Chlorella (Chlorella emersonii N6, Chlorella sorokiniana N9, Chlorellla

sp. N13, Chlorellla sp. N14, Chlorella sorokiniana L1, Chlorella vulgaris L7, Chlorella

sp. L11, Chlorella sorokiniana L12, Chlorella sp. M6, Chlorella minutissima M13), trong

đó có 6 chủng xác định được đến loài. Nghiên cứu này không đi sâu vào đánh giá sự đa

dạng di truyền của tảo Chlorella, mà tập trung vào sự đa dạng loài và chọn lọc nhóm tảo

có khả năng tổng hợp lipid.

Nghiên cứu phân lập và xác định thành phần dinh dưỡng của vi tảo Chlorella

Ellipsoidea tại vườn Quốc gia Xuân Thuỷ, phân lập và định danh được 12 loài vi tảo như:

Ankistrodesmus obtusus, Ankistrodesmus gracilis, Ankistrodesmus longissimus, Chlorella

vulgaris, Chlorella ellipsodea, Oocystis sp., Scenedesmus obliqous, Scenedesmus

denticulatus, Golenkinia radiata, Chlorococcum sp., Pleodorina sp. Fristchiella tuberose.

Nghiên cứu này cũng chỉ dừng lại ở mức độ định danh bằng hình thái, chưa có thực hiện

định danh bằng các marker phân tử để gia tăng độ chính xác. Kết quả nghiên cứu cho thấy

chủng vi tảo Chlorella ellipsodea phân lập được tăng trưởng tốt trong môi trường BG11

và hàm lượng acid béo không no khá cao.

Nghiên cứu khả năng hấp thu nitrate và phosphate của vi tảo được phân lập từ nước

thải sinh hoạt, phương pháp sử dụng để định danh vi tảo dùng trong nghiên cứu này chủ

yếu dựa vào hình thái, bằng cách quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000

lần. Kết quả nghiên cứu cho thấy có 4 chủng tảo thuộc chi Chlorella ở khu vực phân lập

(Cần Thơ), bên cạnh nghiên cứu này cũng chỉ ra chủng tảo Chlorella sp. phân lập được có

hiệu suất hấp thu nitrate và phosphate cao (92% Chlorella sp.1, 94% Chlorella sp.2; 88%

Chlorella sp.1, 88% Chlorella sp.2).

Một nghiên cứu sử dụng RAPD marker để đánh giá đa dạng di truyền của 28 chủng

tảo thuộc chi Chlorella (Idenyi và ctv, 2019). Các mồi chỉ thị OPB-01, OPB-8 và OPB 11

cho thấy có sự đa dạng và khác biệt giữa 28 chủng tảo dùng trong nghiên cứu này. Bên

cạnh đó, một công bố khác về đặc điểm sinh hoá của 4 chủng tảo C. vulgaris khác nhau

(Maurício, 2023), kết quả cho thấy chủng C. vulgaris Auto cho hàm lượng lipid cao nhất

(>7% dựa trên sinh khối khô), các chủng còn lại điều nằm ở mức 5%. Sự khác biệt không

chỉ dừng lại ở đó, tỷ lệ của các acid béo no và không no cũng có khác biệt đáng kể ví dụ

như: C. vulgaris Auto cho tỷ lệ acid béo C18:3(n-3) cao nhất. C. vulgaris Hetoro cho tỷ lệ

acid béo C18:2(n-6) cao nhất. C. vulgaris Honey cho tỷ lệ C18:1(n-9) cao nhất. Cuối cùng,

C. vulgaris White lại cho acid béo C16:0 cao nhất. Ngoài ra, tỷ lệ glycolips, phospholipids

và triacyglycerols của các chủng này cũng có sự khác biệt rõ rệt, chủng Auto (33,87%,

27,94%, 37,48%) Hetoro (61,8%,10%,27,78%), Honey (73,86%, 5,1%, 20,72%) và White

(33,78%, 13,4%, 52,5%). Do đó, mặc dù cùng chung một loài C. vulgaris và chung 1 điều

kiện nuôi cấy nhưng đặc điểm sinh hoá của sinh khối tảo của 4 chủng lại có sự khác biệt

lớn. Vì vậy, việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở mức độ dưới loài của chủng tảo thuộc

chi Chlorella là việc cần thiết, nhằm phân định sự khác biệt giữa các chủng trong cùng 1

loài. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền sẽ như một nhãn dán, nhằm phân định các dòng

với nhau, như một chỉ thị để nhận biết. Các nghiên cứu chọn lọc và sàng lọc sẽ là cơ sở dữ

liệu cho định hướng ứng dụng.

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Thời gian

Các nghiên cứu của luận án đã được tiến hành từ tháng 11 năm 2019 đến tháng 12

năm 2023.

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm ở nội dung 1, 2 và 3 được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Viện

Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường thuộc Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ

Chí Minh. Các thí nghiệm ở nội dung 4 được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Khoa Môi

trường thuộc Trường Đại học Sài Gòn.

2.2. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng tảo Chlorella spp.

Nội dung 2: Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng tảo Chlorella spp. bằng chỉ thị

sinh học phân tử PCR-ISSR.

Nội dung 3: Sàng lọc các chủng tảo Chlorella có tiềm năng ứng dụng vào xứ lý nước thải

Nội dung 4: Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp. và ly trích lipid từ sinh

khối tảo

2.3. Vật liệu nghiên cứu

120 mẫu tảo thu tại các vị trí tọa độ khác nhau ở 5 tỉnh thành thuộc khu vực miền

Nam Việt Nam (Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh, Bình Dương, Đồng Tháp, Tiền Giang, Long

An và Đồng Nai).

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng tảo Chlorella spp.

2.4.1.1. Phương pháp thu mẫu tảo

Phương pháp thu mẫu thực vật nổi (TVN) dựa theo phương pháp chuẩn của APHA

(Rice và ctv, 2012). Các mẫu tảo ở vị trí có thể thuận tiện lấy sẽ được hút bằng ống pipet

nhựa hoặc vớt các mảng tảo nằm trên bề mặt nước (Andersen, 2005). Đối với các mẫu ở vị

trí khó tiếp cận, mẫu được thu bằng ống falcon (50 mL) cố định ở cần câu cá (độ dài 2 m).

Thể tích thu mẫu là 30 mL và được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.

Mẫu được bổ sung 5 mL môi trường BG-11 và bảo quản ở nhiệt độ 4oC trước khi tiến hành

phân lập.

Định loại xác định tên khoa học: các loài TVN dựa trên cơ sở hình thái học theo các

khoá phân loại học của Desikachary (1959), Larsen và Nguyen (2004) và Darienko (2010).

2.4.1.2. Phương pháp xác định mật độ tế bào tảo

Mật độ tế bào tảo được xác định bằng cách đếm trực tiếp số lượng tế bào tảo thông

qua buồng đếm hồng cầu Neubaure (Hirschmann, Đức) và kính hiển vi quang học (Optika,

Italy) (Andersen, 2005).

2.4.1.3. Phương pháp phân lập và nuôi cấy tăng sinh tảo

Mẫu tảo được quan sát dưới kính hiển vi, tế bào tảo phù hợp với tiêu chuẩn hình thái

của tảo Chlorella sẽ được hút bằng micropipette. Tế bào đơn được chuyển vào trong giếng

(đĩa 96 giếng) chứa 25 µL môi trường BG-11, với điều kiện nuôi cấy ở 50 μmol

photon/m2/s, chu kỳ sáng: 12 sáng/12 tối và ở nhiệt độ 25oC (Andersen, 2005).

Sau khi giếng nuôi cấy có màu xanh, sinh khối tảo được chuyển sang thể tích lớn hơn,

quá trình nuôi cấy tăng sinh tảo đều thực hiện điều kiện nuôi cấy tĩnh, cường độ ánh sáng

là 50 μmol photon/m2/s, chu kỳ sáng: 12 sáng/12 tối và ở nhiệt độ 25oC.

2.4.1.4. Phương pháp định danh phân tử

Phương pháp tách chiết DNA: Phương pháp tách chiết và thu nhận DNA tổng số tách chiết

DNA bằng phương pháp CTAB có hiệu chỉnh (Schenk, 2023). Thành phần đệm gồm:

CTAB 2 % (w/v); Mercaptoethanol 0,2 %; EDTA 0,5 M, pH = 8; Tris HCl 1M, pH = 7,5;

NaCl 5M.

Đánh giá chất lượng DNA: nồng độ (ng/µL) và độ tinh sạch của DNA được xác định bằng

máy đo quang phổ Biodrop (Anh). Các mẫu DNA có nồng độ 5-1500 ng và độ tinh sạch

A260/A280 đạt khoảng 1,8 - 2,0 được sử dụng cho phản ứng PCR. Đánh giá chất lượng

DNA bằng kỹ thuật điện di: các mẫu DNA được điện di bằng máy điện di ngang Mupid®-

One với tỉ lệ 10 µL loading dye 5X và 5 µL DNA mẫu, ở hiệu điện thế 100 V và 15 phút.

Quá trình điện di thực hiện trên gel agarose 1% (Bioline) và dung dịch đệm TAE 0,5 X.

Kết quả được đọc bằng máy soi gel UV (UV Transilluminator).

Phương pháp khuếch đại vùng trình tự marker phân tử: Ba marker phân tử được dùng

trong định danh là các vùng 18r RNA, gen rbcL và vùng ITS. Kết quả của phản ứng khuếch

đại được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% 10 µL loading dye 5X.

Điều kiện cho phản ứng PCR như sau: 1 chu kỳ ở 95oC (30 giây), 35 chu kỳ (95oC - 30

giây, 50oC - 30 giây, 72oC - 1 phút).

Bảng 2.1. Cặp mồi sử dụng trong định danh phân tử tảo Chlorella

Marker Cặp mồi Tham khảo

18r RNA 5’ - TGGCTCATTAAATCAGTTATAG -3’ ~800 bp (Chekanov và ctv, 2014) 5’ - CCAAGAATTTCACCTCTGACA - 3’

ITS 5’- GAACTGCGAATGGCTC -3’ ~820 bp

(Steinrücken và ctv, 2018) 5’ - GWATTACCGCGGCKGCTG - 3’

rbcL 5’- AAAGCCCAACAGAGACT TCAATG-3’ ~ 600 bp (Yanuhar và ctv, 2019) 5’-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3’

Phương pháp giải trình tự sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR sau khi được kiểm tra bằng điện

di bằng gel agarose 1%, nếu kết quả khuếch đại thành công với một vạch DNA sáng gọn

thì được giải trình tự hai chiều (chiều xuôi và chiều ngược) bằng phương pháp Sanger tại

công ty 1st Base - Malaysia.

Hiệu chỉnh trình tự: Trình tự được hiệu chỉnh bằng FinchTV 1.4.0. Loại bỏ những trình tự

không chính xác ở hai đầu và trình tự có tín hiệu không rõ ràng. Sự sai lệch và mức độ

tương đồng giữa hai kết quả giải trình tự (mồi ngược và xuôi) được kiểm tra thông qua

phần mềm SeaView. Hai trình tự sau khi được sắp xếp thẳng hàng cần phải tương đồng

nhau. Nếu sự sai lệch xuất hiện tại bất kỳ một vị trí nào, thì cần phải xem lại tín hiệu huỳnh

quang ngay tại vị trí sai lệch.

Tạo trình tự đồng nhất: Kết quả giải trình hai đoạn mồi ngược và mồi xuôi nếu không có

sự sai khác sẽ được tiến hành truy xuất trình tự đồng nhất (Consensus Sequence) bằng phần

mềm SeaView.

Xây dựng cây phát sinh loài: Dữ liệu trình tự được so sánh với các dữ liệu trên NCBI thông

qua công cụ BLAST. Sau đó, các trình tự được căn chỉnh cùng với các trình tự của các

chủng Chlorella khác đã được công bố. Phần mềm MEGA được sử dụng để xây dựng cây

phát sinh chủng loài, với giá trị bootstrap (1000 lần lặp lại) đều lớn hơn 50% (được giản

lược trên cây phát sinh loài). Tổng số 700 vị trí trong bộ dữ liệu, các khoảng trống sẽ được

loại bỏ hoàn toàn trong phân tích. Trong các nghiên cứu định danh phân tử, cần ít nhất sự

ủng hộ của 2 mô hình tiến hoá để định danh chủng vi tảo phân lập được (Wong và ctv,

2023).

2.4.2. Nội dung 2: Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng tảo Chlorella spp. bằng

chỉ thị sinh học phân tử PCR - ISSR.

2.4.2.1. Quy trình PCR với chỉ thị ISSR

Sàng lọc 18 primer ISSR được tiến hành bằng cách chọn ngẫu nhiên một mẫu DNA

để chạy PCR với các primer trên để khảo sát sự đa hình và tìm ra nhiệt độ bắt cặp tối ưu

của các primer ở 4 nhiệt độ từ 48°C, 50°C, 52°C, 54°C. Chọn nhiệt độ mà tại đó kết quả

khảo sát cho sản phẩm rõ nhất. Những primer cho sản phẩm có tỉ lệ đa hình cao, băng sáng,

rõ đạt tiêu chuẩn sẽ được giữ lại để tiếp tục thực hiện phản ứng PCR - ISSR với tất cả các

mẫu. Phản ứng PCR - ISSR được thực hiện trên máy PCR (Applied Biosystems 2720) với

chu trình nhiệt như sau: 1 chu kỳ 95oC (5 phút), 35 chu kỳ (95oC - 1 phút, 52oC - 1 phút,

72oC - 1 phút 30 giây) và kết thúc ở 72oC (7 phút).

Bảng 2.2. Danh sách 18 primer cho phản ứng PCR - ISSR

STT Tên primer Trình tự primer (5’- 3’)

1 ISSR1 (AC)8AT

2 ISSR2 (AC)8TG

3 ISSR3 (ATG)6

4 ISSR4 (AC)8TC

5 ISSR5 (AC)8CA

6 ISSR6 (AC)8CC

7 ISSR7 (AG)8AA

8 ISSR8 (AC)8GA

9 ISSR9 (AC)8GG

10 ISSR10 (TG)8GG

11 ISSR11 (AG)8GC

12 ISSR12 (AG)8GT

13 ISSR13 (AG)8CA

14 ISSR14 (AG)8CT

15 ISSR15 (AG)8CC

16 ISSR16 (TC)7CC

17 ISSR17 (ACTG)4

18 ISSR18 (ACTC)4

(Shen, 2008)

Sản phẩm của phản ứng PCR-ISSR được điện di trên gel agarose 1,2 % trong môi

trường TAE 0,5 X với điện thế 100 V và thời gian điện di là 30 phút. Thang chuẩn 1kb

DNA được dùng làm thước đo kích thước của các đoạn DNA khuếch đại. Kết quả PCR –

ISSR được kiểm trăng bằng tủ chiếu đèn UV, tiếp theo dữ liệu được mã hóa và dùng cho

các phân tích số liệu.

2.4.2.2. Xử lý số liệu

Từ kết quả phản ứng PCR với chỉ thị ISSR trên gel, dữ liệu sẽ được chuyển thành

dạng ma trận nhị phân trên Excel. Dữ liệu được mã hóa theo quy ước: Số “1” là có hiện

diện băng DNA, số “0” là không hiện diện băng DNA và thực hiện lần lượt với các primer

trong bài. Hàng thứ nhất cột đầu tiên ghi số 1 (dữ liệu tổng hợp trên một file); cột thứ 2

nhập số vạch điện di (số hàng band), cột thứ 3 nhập số lượng cần thống kê (số giếng gel),

cột thứ 4 ghi số 0 (không có ô trống dữ liệu).

Sau khi hoàn thành thống kê, dữ liệu được sao chép sang Notepad (.txt) để đưa vào

phần mềm NTSYSpc 2.1 và xây dựng cây phân loại di truyền biểu diễn mối quan hệ xa

gần giữa các cá thể thông qua xác định hệ số tương đồng di truyền hay hệ số khoảng cách

di truyền theo công thức của Nei (1972).

Dữ liệu được phân nhóm dựa vào hệ số tương quan Dice, kiểu phân nhóm sử dụng

phương pháp nhóm đôi các giá trị trung bình số học UPGMA (Unweighted Pair group

Method with Arithmetic Mean) và biểu đồ cây phân loại di truyền được vẽ theo phương

pháp SAHN (Sequential agglomerative hierarchical non-overlapping) trên phần mềm

NTSYSpc 2.1.

2.4.3. Nội dung 3: Sàng lọc các chủng tảo Chlorella có tiềm năng ứng dụng vào xứ lý

nước thải

2.4.3.1. Khảo sát ngưỡng chịu đựng ammonium của tảo Chlorella

Phương pháp nuôi cấy tảo Chlorella: tảo Chorella phân lập được sẽ được thử nghiệm nuôi

cấy trên môi trường BG-11 loại bỏ hoàn toàn nitrogen. Tảo được nuôi cấy trong bình erlen

chứa 100ml môi trường với mật độ tế bào giống cấy vào là 1×105 tế bào/ml. Tảo được nuôi

trong điều kiện nhiệt độ 23 - 27°C, cường độ sáng 50 μmol photon/m2/s, chu kì chiếu sáng

12 giờ sáng và 12 giờ tối, có bổ sung 1% CO2, pH 7- 7,3, nuôi cấy trong 7 ngày, chu kỳ

lấy mẫu sau 24 giờ (Wang và ctv, 2019).

Phương pháp xác định tỷ lệ ức chế sinh trưởng của nồng độ ammonium: Nguồn cung cấp

nitrogen cho tảo dùng trong thử nghiệm này được thay thế bằng NH4Cl ở các nồng độ 0,1;

0,5; 1; 1,5 g/L (Wang và ctv, 2019).

Hiệu quả ức chế sinh trưởng ở tảo được tính bằng công thức như sau:

(Đố𝐢 𝐜𝐡ứ𝐧𝐠 − 𝐓𝐡ử 𝐧𝐠𝐡𝐢ệ𝐦)

𝑻ỷ 𝒍ệ ứ𝒄 𝒄𝒉ế 𝐬𝐢𝐧𝐡 𝒕𝒓ưở𝒏𝒈 (%) =

𝒙 𝟏𝟎𝟎 (2.1)

Đố𝐢 𝐜𝐡ứ𝐧𝐠

Đối chứng: mật độ tế bào tảo sinh trưởng ở môi trường BG-11 bình thường.

Thử nghiệm: mật độ tế bào tảo sinh trưởng ở môi trường BG-11 loại bỏ nitrogen và

thay bằng NH4Cl.

Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào: Sử dụng buồng đếm hồng cầu

Neubauer Improved Bright line, 10 µL dịch chứa tế bào tảo được đưa lên buồng đếm. Số

lượng tế bào hoặc tổng số mật độ tế bào trong dịch nuôi được tính theo công thức sau:

D = A * X * 103 (2.2)

Trong đó:

- D: Mật độ tế bào (tế bào/mL)

- A: Tổng số tế bào trong cả buồng đếm

- X: Hệ số pha loãng (nếu có)

2.4.3.2. Khảo sát khả năng loại bỏ nitrate của Chlorella

- ở 1 g/L. Mật độ tảo (sinh khối khô) dùng

Phương pháp nuôi cấy Chlorella spp: Chorella phân lập được sẽ được thử nghiệm nuôi

cấy trên môi trường BG-11 duy trì nồng độ NO3

trong thử nghiệm là 1,8 g/L, tảo được nuôi cấy trong vòng 7 ngày ở điều kiện: nhiệt độ 23-

27°C, cường độ sáng 2- 50 μmol photon/m2/s, chu kì chiếu sáng 12 sáng 12 tối và pH 7-

7,3 (Taziki và ctv, 2015).

Phương pháp xác định khả năng hấp thụ nitrate của tảo

Canh trường nuôi cấy tảo Chlorella sẽ được thu sau 24 tiếng kể từ khi cấy tảo vào

- được đo bằng máy đo Checker Đo Nitrite (thang cao) Hanna-HI708 (Taziki

môi trường, mẫu nước được ly tâm ở 6000 rpm trong 15 phút để loại bỏ tế bào. Sau đó,

nồng độ NO3

- của mỗi chủng tảo sẽ được tính bằng công thức như sau:

và ctv, 2015).

Khả năng hấp thu NO3

- ở thời điểm ban đầu.

S0i - Si (2.3) Ki= t

S0i: nồng độ NO3

Si: ở thời điểm t.

t: thời gian nuôi cấy.

Phương pháp xác định sinh khối khô của tảo

Tảo được thu sinh khối khô 2 ngày một lần trong 14 ngày. Hút 10ml dung dịch tảo

vào giấy lọc Whatman (được sấy khô ở 100°C cho đến khối lượng không đổi). Sau đó, sấy

ở nhiệt độ 100°C đến khối lượng không đổi. Giá trị khối lượng không đổi là Wt.

Lượng sinh khối khô được tính theo công thức sau : B (g/L) = Wt – Wf (2.4)

Trong đó:

- B: Lượng sinh khối khô (g)

- Wt: Tổng khối lượng giấy lọc và sinh khối

- Wf: Khối lượng giấy lọc

2.4.3.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy tảo Chlorella

Phương pháp nuôi cấy Chlorella sp.

Bình erlen chứa 1,5 lít môi trường với mật độ tế bào giống ban đầu là 1×105 tế bào.

Thời gian nuôi cấy trong 14 ngày ở điều kiện nhiệt độ 23 - 27°C, cường độ sáng 50 μmol

photon/m2/s, chu kì chiếu sáng 12 sáng 12 tối và pH 7-7,3. Môi trường nuôi cấy sử dụng

trong nghiên cứu này là: BG-11, LC Oligo, BBM và HAMGM.

Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll a: hàm lượng chlorophyll a được xác định

thông qua khả năng hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng 750 nm, 664 nm, 640 nm và 630

nm. Sinh khối tảo được ly tâm ở 10.000 rpm trong 5 phút, lượng sinh khối tảo có thể tích

tương ứng với 0,01 g sinh khối khô. Phần sinh khối này được bổ sung 1 mL acetone 90%

vào ống eppendorf và cho vào máy lắc với bi thủy tinh (lắc trong vòng 30 phút). Sau đó

đem ly tâm 10.000 rpm. Lấy dịch nổi, quá trình được thực hiện cho đến khi phần sinh khối

mất màu hoàn toàn. Phần dịch nổi được đo ở các bước sóng 750 nm, 664 nm, 647 nm và

630 nm bằng máy đo hấp thu quang phổ, mẫu được lặp lại 3 lần.

Áp dụng công thức xác định hàm lượng chlorophyll a (Tunali và ctv, 2020):

Chlorophyll a (mg/L) = (11,85(E664 - E750) - 1,54(E647 - E750) - 0,08(E630 -

750))Ve/LVf (2.5)

Trong đó:

- E750, E664, E647, E630: Là giá trị độ hấp thụ ở các bước sóng 750 nm, 664 nm,

647 nm, 630 nm.

- Ve: Thể tích acetone tính bằng lít.

- Vf: Thể tích lọc tính bằng lít.

- L: Khoảng cách bên trong của cuvet (cm).

Dựa vào tổng thể tích acetone sử dụng để quy đổi tổng lượng chlorophyll a có trong

0,01 g sinh khối khô.

2.4.4. Nội dung 4: Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp. và ly trích lipid

từ sinh khối tảo

2.4.4.1. Thử nghiệm xử lý nước thải bằng tảo Chlorella sp.

Phương pháp thử nghiệm khả năng xử lý nước thải của tảo Chlorella sp.

Bể xử lý nước thải bằng thủy tinh có thể tích 4 L, tảo Chlorella sp. được duy trì ở ba

mật độ như sau: 1,25 × 105 tế bào/mL, 2,5 × 105 tế bào/mL và 7,75 × 105 tế bào/mL (tương

đương với 2,5%, 5% và 7,5%) (Cheunbarn, 2015). Tốc độ sục khí và cường độ ánh sáng

được duy trì không đổi ở mức tương ứng là 3 L/phút và 50 μmol photon/m2/s. Cường độ

âm thanh được điều chỉnh ở mức 60 dB, bài nhạc dùng trong thử nghiệm là “Lý Ngựa Ô”

(Dàn nhạc Dân tộc truyền thống Việt Nam trình bày). Tất cả các thí nghiệm sàng lọc được

thực hiện ở phạm vi nhiệt độ từ 20°C đến 25°C (±1,0°C), pH từ 6,5 đến 7,5 (±1,2). Thí

nghiệm thực hiện khảo sát trong vòng 10 ngày để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến

hiệu quả loại bỏ TN và COD.

Sau đó, mô hình lặp tâm được tiến hành để xác định các điều kiện tối ưu cho việc loại

bỏ TN và COD thông qua quá trình xử lí của tảo. Ba biến số độc lập được áp dụng: Mật độ

tảo (X1), âm nhạc (X2) và thời gian nuôi cấy (X3). Mức độ của mỗi mã dao động từ thấp (-

1) đến cao (+1), như được hiển thị trong bảng 2.3 dựa trên các thử nghiệm sàng lọc trước

đây.

1 3

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sóng âm nhạc trên tảo

(1) Loa; (2) Bể thủy tinh; (3) máy nén khí và (4) ánh sáng

Bảng 2.3. Mức độ được mã hóa và chưa mã hóa của các biến độc lập trong nghiên cứu

Mức độ

(Thấp) Thông số Biến (Trung bình) (Cao)

0 1 +α α 1

Mật độ tảo (%) 0,8 2,5 5 7,5 9,2 X1

Âm nhạc (dB) 10 30 60 90 110 X2

Thời gian (ngày) 1,6 3,0 5,0 7,0 8,4 X3

Thiết kế thí nghiệm

Hai mươi bộ thực nghiệm đã được thiết kế (Bảng 2.4), bao gồm tám bộ từ 2k của một

điểm giai thừa, sáu bộ từ 2k của điểm trục, và sáu bộ từ điểm trung tâm, trong đó k là số

yếu tố biến độc lập (Bui, 2017) (Bui, 2018). Mỗi bộ chứa một loa, bốn lò phản ứng ống

thủy tinh, một máy nén khí và đèn chiếu sáng (Hình 2.1). Hiệu quả loại bỏ TN, như được

tính toán bởi Công thức 2.6, được định nghĩa là phản ứng của biến phụ thuộc.

(𝑿𝟎−𝐗𝐢) 𝐗𝟎

𝐇𝐢ệ𝐮 𝐪𝐮ả 𝐥𝐨ạ𝐢 𝐭𝐫ừ (%) = 𝐱 𝟏𝟎𝟎 (2.6)

Bảng 2.4. Ma trận của thí nghiệm mô hình lặp tâm và dữ liệu thí nghiệm tương ứng

Thứ tự thí nghiệm Mật độ tảo (%) Âm nhạc (dB) Thời gian (Ngày)

1 7,5 30,0 7,1

2 9,2 60,0 5,0

3 0,8 60,0 5,0

4 5,0 60,0 5,0

5 5,0 9,5 5,0

6 2,5 90,0 7,1

7 5,0 60,0 5,0

8 2,5 90,0 2,9

9 7,5 90,0 2,9

10 5,0 60,0 5,0

11 7,5 90,0 7,1

12 2,5 30,0 2,9

13 7,5 30,0 2,9

14 5,0 110,5 5,0

15 5,0 60,0 5,0

16 5,0 60,0 5,0

17 5,0 60,0 8,5

18 5,0 60,0 1,5

19 5,0 60,0 5,0

20 2,5 30,0 7,1

Trong đó X0 là là nồng độ TN và COD tại thời điểm ban đầu và TNi và CODi là nồng

độ TN và COD tại ngày đang xem xét.

Mô hình toán học được đánh giá bằng phần mềm Minitab phiên bản 18.1 và được thể

hiện bằng một phương trình mô hình bậc hai như trong Công thức 2.7. Hồi quy bình phương

nhỏ nhất được sử dụng để tính toán hệ số. β0, βi, βii, βij và e lần lượt đại diện cho hệ số

hằng số, hệ số tuyến tính, hệ số bậc hai, hệ số tương tác và sai số thống kê. Tính đầy đủ và

ý nghĩa của mô hình được chứng minh bằng phân tích phương sai (ANOVA).

𝒌 𝒊=𝟏

𝒌 𝟐 + ∑ 𝜷𝒊𝒊𝑿𝒊 𝒊=𝟏

𝒌−𝟏 𝒊=𝟏

𝒌 𝒋=𝟐

+ ∑ + 𝒆 (2.7) 𝒀 = 𝜷𝟎 + ∑ 𝜷𝒊𝑿𝒊 ∑ 𝜷𝒊𝒋𝑿𝒊𝑿𝒋

Hai thí nghiệm kiểm chứng cũng được thực hiện để xác minh dự đoán trong điều

kiện tối ưu.

Phương pháp phân tích các thông số trong nước thải đầu vào và quá trình xử lý nước thải

bằng tảo Chlorella

Các phương pháp phân tích các thông số trong thử nghiệm đều theo tiêu chuẩn của

+ (xác định bằng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler),

American Public Health Association.

- (phương pháp so màu).

pH, TOC, TN, NH4

NO3

COD (Phương pháp Dicromat Đun Hàn Lưu), BOD5 (Đo hàm lượng DO1 và DO5 ở

-) sẽ phản ứng với ammonium

200 bằng loại chai đo đặc biệt có dung tích 300 mL),

3- (phosphate dưới dạng ortho (PO4

3-, HPO4

2-, H2PO4

PO4

molybdate tạo phức chất ammonium phosphomolybdate, sau đó chất này bị khử bởi thiếc

II clorua cho molybdenum màu xanh dương)

Cường độ âm nhạc (Đo bằng máy đo độ ồn 407730 – Extech) và đếm mật độ tảo thể

(Mật độ tế bào tảo trong mẫu được xác định bằng buồng đếm Neubauer Improved).

Phương pháp thống kê và xử lý số liệu

Độ sai biệt của các phương pháp xử lý, có và không có âm nhạc, thí nghiệm đối chứng

(không sử dụng âm nhạc và tảo) trong nghiên cứu sàng lọc được đánh giá thông qua giá trị

p-value và thí nghiệm paired t-test (so sánh từng cặp ví dụ: tảo/âm nhạc với tảo/ không âm

nhạc; tảo/âm nhạc với đối chứng). Tất cả số liệu đều được lặp lại 3 lần, giá trị biểu diễn là

giá trị trung bình. Phần mềm xử lý số liệu sử dụng Excel 2017 và Minitab 18.1.

2.4.4.2. Nghiên cứu ly trích lipid từ sinh khối tảo

Quy trình ly trích lipid

Xác định nồng độ sinh khối tảo, nồng độ sinh khối tảo Chlorella sp. trong dung dịch

sau nuôi cấy được xác định bằng máy quang phổ UV Vis UV1/Thermo Electron ở bước

sóng 680 nm. Sinh khối Chlorella sp. được thu nhận thông qua quá trình ly tâm (6000 rpm,

10 phút), sấy khô ở 50ºC trong 8 giờ để xác định khối lượng vi tảo khô trên một đơn vị thể

tích (Zhou và ctv, 2013).

Ly trích lipid từ tảo Chlorella

Hỗn hợp n-hexane (HE) và ethanol (EtOH) được sử dụng làm dung môi để ly trích

dầu từ bột tảo. Để đạt được mục đích này, một quá trình bao gồm nhiều bước được thực

hiện bao gồm: (1) chuẩn bị 100 mL hỗn hợp n-hexane và ethanol với tỷ lệ (v/v) (các tỷ lệ

được liệt kê trong bảng 2.5) và 10 g sinh khối khô tảo; (2) hỗn hợp này được đồng nhất

bằng máy đồng hóa mẫu siêu âm trong bình 250 mL (Sonics Inc., Hoa Kỳ), bên ngoài được

bao bọc bởi một lớp nước được duy trì ở nhiệt độ lạnh, để bù đắp sự gia tăng nhiệt độ do

siêu âm tạo ra, vì quá trình này tỏa nhiệt và kiểm soát nhiệt độ là rất quan trọng để ngăn

ngừa các tác động bất lợi lên sản phẩm (Pohndorf và ctv, 2016). Hiệu chỉnh đầu dò que

siêu âm ở độ sâu 1 cm, nhiệt kế được đặt đồng thời ở độ sâu tương tự (1 cm). Biên độ, nhiệt

độ và thời gian phản ứng siêu âm được tối ưu hóa bằng thiết kế Taguchi.

Bảng 2.5. Thí nghiệm ly trích lipid

Các yếu tố độc lập Cấp 1 Cấp 2 Cấp 3

Biên độ siêu âm (%) 60 80 100

Thời gian phản ứng (phút) 15 25 35

HE/EtOH 2:1 3:1 4:1

Nhiệt độ (°C) 30 40 50

Sau khi hoàn tất quá trình ly trích, hỗn hợp thu được trải qua quá trình tách và làm

bay hơi dung môi bằng cách ly tâm ở tốc độ 6000 rpm (Eppendorf, Đức), làm bay hơi dung

môi bằng thiết bị cô quay (R-300, Buchi, Đức). Dung môi dễ bay hơi được ngưng tụ nhờ

sinh hàn làm lạnh bằng nước và thu hồi vào bình chứa để tái sử dụng. Lượng dầu tảo thu

được đem phân tích để xác định hiệu suất chuyển đổi. Quá trình ly trích bao gồm các bước

như được tóm tắt như hình 2.2.

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình hệ thống của giai đoạn ly trích dầu từ bột tảo

Thiết kế thí nghiệm Taguchi

Bước 1: xác định các thông số cần tối ưu hóa ảnh hưởng đến quá trình chiết lipid.

Bốn thông số (tỷ lệ HE/EtOH (n-hexane/ethanol), thời gian phản ứng, nhiệt độ và biên độ

siêu âm) với ba mức độ được xem xét để xác định các điều kiện tối ưu. Các thông số được

lựa chọn và mức độ của chúng được trình bày trong bảng 2.6.

Bảng 2.6. Thiết kế thí nghiệm sử dụng mảng trực giao Taguchi

Thí Biên độ siêu âm Thời gian phản ứng HE/EtOH Nhiệt độ (̊C) nghiệm (%) (phút)

1 60 15 2 30

2 60 25 3 50

3 60 35 4 40

4 80 15 3 40

5 80 25 4 30

6 80 35 2 50

7 100 15 4 50

8 100 25 2 40

9 100 35 3 30

Các thông số và mức độ trình bày ở Bảng 2.6, bao gồm các tỷ lệ HE/EtOH từ 2:1 đến

4:1, nhiệt độ từ 30-50°C, thời gian phản ứng nằm trong khoảng từ 15 đến 35 phút và cường

độ siêu âm nằm trong khoảng từ 60 đến 100%, được tính toán để tối ưu hóa bằng phân tích

phương sai ANOVA và phân tích tỷ lệ tín hiệu nhiễu S/N, theo nghiên cứu trước đó (Neag

và ctv, 2022).

Sau khi chọn các tham số và thông số, bước tiếp theo là thiết kế ma trận thí nghiệm

và chọn quy trình phân tích dữ liệu. Thiết kế thí nghiệm mảng trực giao L9 được tạo ra dựa

trên sự kết hợp của các tham số và thông số của chúng. Mảng trực giao L9 được trình bày

trong bảng 2.6.

Phương pháp phân tích và xử lý thống kê

Lipid được ly trích sau khi loại bỏ dung môi được cân và tính toán theo phương trình

2.8. (Ido, 2018)

× 𝟏𝟎𝟎 (2.8) 𝐇𝐢ệ𝐮 𝐬𝐮ấ𝐭 𝐥𝐲 𝐭𝐫í𝐜𝐡 𝐥𝐢𝐩𝐢𝐝 (%) = 𝐊𝐡ố𝐢 𝐥ượ𝐧𝐠 𝐜ủ𝐚 𝐥𝐢𝐩𝐢𝐝 (𝐠) 𝐊𝐡ố𝐢 𝐥ượ𝐧𝐠 𝐛ộ𝐭 𝐭ả𝐨 𝐤𝐡ô (𝐠)

Phương pháp Taguchi được sử dụng để tối ưu hóa thiết kế thử nghiệm, sử dụng phần

mềm Minitab phiên bản 18.1 (Minitab Inc, USA) để phân tích thống kê. Các kết quả được

đánh giá bằng cách sử dụng phương pháp tỷ lệ tín hiệu S/N càng lớn càng tốt, như được

nêu trong phương trình 2.9. Các giá trị trùng lặp được trình bày cho tất cả các phát hiện

khác

) (2.9) S/N (dB)=-10 log ( 1 n ∑ 1 n i=1 yi

Trong đó yi là kết quả của từng thí nghiệm và n: số thí nghiệm.

Chuẩn bị metyl este acid béo (FAME) và phân tích sắc ký khí Nghiên cứu sử dụng phương

pháp đo lường gián tiếp để xác định hàm lượng acid béo trong dầu tảo, sử dụng metyl este

của acid béo (Fatty acid methyl esters, FAME) và hệ thống sắc ký khí (GC-Gas

Chromotography, Agilent GC 6890N, Mỹ) được trang bị đầu dò ion hóa (fame ionization

detector, FID). Lipid được chuyển hóa thành FAME bằng quá trình este hóa chéo: 4 mL

2,2,4 - trimethylpentan (iso-octan) được thêm vào dịch chiết lipid (0,06 g) trong ống ly tâm

thủy tinh đáy hình nón và sau đó xử lý bằng 0,2 mL dung dịch kali hydroxit trong methanol

(2 mol/L). Sau 30 giây khuấy mạnh, thêm 1 g NaHSO4·H2O để ngăn chặn quá trình xà

phòng hóa metyl este và trung hòa lượng kiềm dư. Thành phần FAME được phân tích bằng

sắc ký khí (Agilent Technologies, 6890N GC, Wilmington, DE, USA). Các mẫu được bơm

vào cột mao quản DB-WAX (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) và rửa giải bằng heli (độ tinh

khiết ≥ 99,999%) ở tốc độ chủng không đổi 1,53 mL/phút và áp suất 70 kPa. Thể tích tiêm

là 1 µL với tỷ lệ chia 1:20. Với chương trình nhiệt được thiết lập như sau: 60°C trong 1

phút, 60-200°C (tốc độ 10°C/phút, 2 phút) và từ 200-220°C (5°C/phút, 20 phút). Nhiệt độ

kim tiêm và đầu dò được đặt ở 250°C. Các thành phần FAME được xác định bằng cách so

sánh thời gian lưu của chúng với thời gian lưu của hỗn hợp chuẩn (Supelco 37 FAME Mix,

Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA).

Ngoài ra, nghiên cứu còn đánh giá các thông số dầu tảo thích hợp khác, bao gồm độ

nhớt động học, trọng lượng riêng, giá trị acid và giá trị iodine, theo các giao thức EN hoặc

ASTM (American Society for Testing and Materials) đã thiết lập như được mô tả bởi

(Knothe, 2010).

Ứng dụng LCA (Life Cycle Assessment)

Mục tiêu, phạm vi và ranh giới hệ thống

Mục tiêu của LCA trong nghiên cứu là đánh giá hiệu quả của vòng đời sản phẩm tuân

thủ tiêu chuẩn ISO Tiêu chuẩn quốc gia TCVN ISO 14044:2011 đối với việc ly trích dầu

từ Chlorella sp. dưới sự hỗ trợ siêu âm, sử dụng phương pháp Taguchi để tối ưu hóa.

Phạm vi nghiên cứu cứu LCA tập trung vào: (i) hợp nhất dữ liệu ly trích lipid; (ii)

tính toán cân bằng khối lượng và năng lượng để sản xuất lipid từ Chlorella sp.; và (iii) đánh

giá tác động lên môi trường thông qua hai phương pháp riêng biệt.

Ranh giới hệ thống: LCA được thực hiện cho hệ thống bao gồm từ bước tiền xử lý vi

tảo đến bước thu hồi diesel, bao gồm các giai đoạn liên quan. Nghiên cứu này tập trung

vào việc đánh giá các tác động của môi trường ban đầu trong quá trình sản xuất dầu tảo

quy mô phòng thí nghiệm, dẫn đến việc chỉ đưa giai đoạn ly trích vào ranh giới hệ thống

(Hình 2.3). Đơn vị chức năng được sử dụng trong nghiên cứu này là 1 kg dầu tảo được tạo

ra. Theo đó, cân bằng khối lượng và năng lượng đã được tính toán cho Chlorella sp. tiêu

chuẩn hóa dựa trên một kg dầu tảo.

Hình 2.3. Ranh giới hệ thống vòng đời để sản xuất dầu tảo từ Chlorella sp.

Phân tích kiểm kê vòng đời sản phẩm (Life Cycle Inventory, LCI)

Bảng kiểm kê để đánh giá vòng đời sản xuất dầu diesel sinh học từ Chlorella sp. bao

gồm dữ liệu đầu vào và đầu ra (khí thải) cho tất cả các quy trình trong ranh giới hệ thống,

bao gồm các chỉ tiêu như: thông số của quy trình (Quy trình làm khô: tảo ướt, điện, tảo

khô; Quy trình ly trích lipid: tảo khô, n – hexan, EtOH, điện, dầu (lẫn dung môi), Sản phẩm

rắn; tinh chế dầu: dầu (lẫn dung môi); Điện; Dầu tinh chế) và hàm lượng sử dụng.

Quá trình phân tích kiểm kê được lặp đi lặp lại, cung cấp sự cân bằng vật chất và năng

lượng cho 1 kg sản phẩm dầu tảo từ Chlorella sp. cho hai phương pháp đang được xem

xét. Đánh giá LCA được tổ chức theo định dạng có cấu trúc tích hợp dữ liệu phát thải thứ

cấp điện và hóa học vào phần mềm SimaPro 9.4.0.2. Các phương pháp đánh giá vòng đời

khác nhau có thể dẫn đến sự thay đổi trong các kết quả liên quan đến loại tác động, giá trị

và đơn vị. Để giải quyết vấn đề này, nghiên cứu sử dụng hai cách tiếp cận khác nhau, là

Centrum Voor Milieukunde Leiden 2001 (CML 2001) và Công cụ Giảm thiểu, Đánh giá

Tác động Môi trường và Hóa chất (TRACI 2.1), để giải thích các tác động lên môi trường.

Mục đích của việc so sánh này là để đảm bảo tính nhất quán của các kết quả thu được từ

cả hai phương pháp. Các phương pháp này sử dụng cách tiếp cận định hướng điểm giữa để

phân loại và mô tả các tác động trực tiếp do việc giải phóng các chất ô nhiễm trong quá

trình ly trích lipid (Zhou và ctv, 2011). Trong khi, phương pháp CML 2001 tính toán các

chỉ số môi trường như tiềm năng nóng lên toàn cầu (global warming potential, GWP), acid

hóa (acidification, AP), hiện tượng phú dưỡng (eutrophication, EP), suy giảm tầng ozone

(ozone depletion, ODP), suy giảm phi sinh học (abiotic depletion, ADP), độc tính đối với

con người (human toxicity, HTP), độc tính sinh thái thủy sinh nước ngọt (freshwater

aquatic ecotoxicity, FAETP), độc tính sinh thái biển (marine ecotoxicity, MAETP), độc

tính sinh thái trên cạn (terrestrial ecotoxicity, TETP) và oxy hóa quang hóa (photochemical

oxidation, POCP). TRACI 2.1 bao gồm năm loại tác động với các chỉ số khác nhau có thể

so sánh được. Ví dụ, trong khi phương pháp tiếp cận CML-2001 thể hiện sức khỏe con

người như khả năng gây độc cho con người, thì phương pháp TRACI 2.1 lại tách nó thành

ba chỉ số: tác động gây ung thư (Cancer), tác động không gây ung thư (oncancer) và tác

động từ các chất ô nhiễm tiêu chuẩn (Criteria Pollutants).

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng tảo Chlorella spp.

3.1.1. Đánh giá hình thái các mẫu tảo thu được

Luận án thu thập được 120 mẫu tảo tại các vị trí toạ độ khác nhau tại Cần Giờ - Tp.

Hồ Chí Minh, Bình Dương, Đồng Nai, Long An, Tiền Giang và Đồng Tháp. Mẫu sau khi

được đem về phòng thí nghiệm sẽ bổ sung môi trường BG-11 (5 mL) nhằm tăng sinh và

duy trì sức sống của tảo. Tiếp theo, các mẫu sẽ được tiến hành quan sát hình thái bằng kính

hiển vi quang học ở độ phóng đại 100 X, kết quả quan sát hình thái được thể hiện ở Bảng

1 (tại phần Phụ lục). Các mẫu tảo có hình thái như: hình cầu màu xanh lục, không di động,

nằm rời rạc nhau và kích thước dao động từ 2 – 12 µm, tương đồng cao với Chlorella được

thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả các mẫu có hình thái tương đồng cao với Chlorella

STT Kí hiệu mẫu Vị trí mẫu Tọa độ pH

1 CG-20 6,5 Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh

2 BD-33 Bình Dương 7,5

3 BD-38 Bình Dương 7,1

4 LA-81 Long An 7,5

5 LA-83 Long An 7,8

6 LA-90 Long An 7,9 Loại thủy vực Bờ Sông Cá Gấu Hồ Cần Nôm Hồ Dầu Tiếng Vũng nước ven đường Vũng nước ven đường Vũng nước ven đường

7 TG-65 Tiền Giang Sông Trà 7,1

8 TG-71 Tiền Giang 7,1

9 TG-67 Tiền Giang 8

10 ĐT-51 Đồng Tháp 6,9

11 ĐN-112 Đồng Nai 6,5 10.498440, 106.786438 11.231530, 106.408205 11.344112, 106.354302 10.638113, 106.711047 10.638960, 106.706904 10.514184, 106.557726 10.355330, 106.466491 10.352948, 106.359823 10.356526, 106.460909 10.465146, 105.634903 11.098840, 107.048758 Hồ Giếng nước Vũng nước ven đường Sông Đình Trung Sông Đồng Nai

Kết quả quan sát hình thái tế bào cho thấy, hình thái tảo thu được rất đa dạng. Trong

đó, kết quả hình thái ở mẫu 01; 20; 38; 51; 67; 81, 83, 90 và 112 có hình thái tương đồng

với tiêu chuẩn hình thái của chủng tảo Chlorella có hình cầu màu xanh lục, không di động,

nằm rời rạc nhau và kích thước dao động từ 2 – 12 µm (Darienko và ctv, 2019).

Các mẫu CG-20, BD-38 và ĐT-51 khi quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học,

hình thái tế bào ở các mẫu này giống nhau. Đường kính của tế bào tảo từ 3 - 5 µm, các tế

bào có hình cầu nằm riêng lẻ đôi khi thành cụm tế bào, tất cả các tế bào đều có màu xanh

lục. Lục lạp có dạng hình chén. Bề mặt tế bào không có tiên mao và không di chuyển chủ

động. Các đặc điểm này đều tương đồng với tiêu chuẩn về hình thái của tảo Chlorella.

Dưới kính hiển vi quang học, hình thái tế bào ở các mẫu TG-67, ĐN-112, TG-65,

LA-83, TG-71 và LA-90 đều tương đồng nhau. Tế bào có màu xanh lục, ở dạng hình cầu

và hình oval. Kích thước dao động từ 3 – 5 µm (ĐN-112, TG-65, LA-83, TG-71 và LA-

90), đối với mẫu TG-67 kích thước dao động từ 2 – 4 µm. Không có tiên mao, thể lục lạp

hình chén. Tế bào không di chuyển chủ động. Các đặc điểm này đều tương đồng với tiêu

chuẩn về hình thái của tảo Chlorella.

Các mẫu BD-33 và LA-81 có kích thước vào khoảng 4 – 10 µm. Tế bào có màu xanh

lục, ở dạng hình cầu và hình oval. Lục lạp có dạng hình chén, bề mặt tế bào không có tiên

mao và không di chuyển chủ động. Tế bào có màu xanh lục, ở dạng hình cầu và hình oval.

Các đặc điểm này đều tương đồng với hình thái của tảo Chlorella.

Các tế bào đơn có hình thái tương đồng ở các mẫu được liệt kê trong bảng 3.1, được

hút vào các đĩa 96 giếng để tăng sinh (1 tế bào đơn trên 1 giếng). Sau khi, nuôi cấy tăng

sinh, hình thái tế bào trong giếng đồng nhất, không có hình thái khác. Tế bào tảo được đem

kiểm tra hình thái một lần với tiêu chuẩn hình thái của tảo Chlorella, bảng 3.2 thể hiện hình

thái của tế bào tảo của các mẫu thu được và hình thái tảo Chlorella trong các nghiên cứu

trước đây.

Bảng 3.2. Hình thái tế bào tảo của các mẫu thu được

Mẫu Hình thái vi tảo Chú thích

Đường kính của

tế bào tảo từ 3 -

5 µm, không có

tiên mao và Số 1: không di chuyển Ký chủ động. hiệu: Tế bào có hình CG-20 cầu nằm riêng

lẻ, màu xanh

lục.

Lục lạp có dạng

hình chén.

Kích thước vào

khoảng 3 – 10

µm. Tế bào có

màu xanh lục, ở Số 2: dạng hình cầu Ký và oval. hiệu: bề mặt tế bào BD-33 không có tiên

mao và không di

chuyển chủ

động

Đường kính của

tế bào tảo từ 3 -

5 µm, không có

tiên mao và Số 3: không di chuyển Ký chủ động. hiệu: Tế bào có hình BD-38 cầu nằm riêng

lẻ, màu xanh

lục.

Lục lạp có dạng

hình chén.

Đường kính của

tế bào tảo từ 3 -

5 µm, không có

tiên mao và Số 4: không di chuyển Ký chủ động. hiệu: Tế bào có hình ĐT-51 cầu nằm riêng

lẻ, màu xanh

lục.

Kích thước dao

động từ 2 – 4

µm. Không có Số 5:

tiên mao, thể lục Ký

lạp hình chén. hiệu:

Tế bào không di TG-67

chuyển chủ

động.

Kích thước vào

khoảng 3 – 10

µm. Tế bào có

màu xanh lục, ở Số 6:

dạng hình cầu Ký

và oval. Bề mặt hiệu:

tế bào không có LA-81

tiên mao và

không di chuyển

chủ động

Kích thước vào

khoảng 3 – 10

µm. Tế bào có Số 7: màu xanh lục, ở Ký dạng hình cầu. hiệu: bề mặt tế bào ĐN- không có tiên 112 mao và không di

chuyển chủ

động

Tế bào có màu

xanh lục ở dạng

hình cầu. Kích

Số 8: thước dao động

Ký từ 3 – 5 µm.

hiệu: Bề mặt tế bào

TG-65 không có tiên

mao và không di

chuyển chủ

động.

Tế bào có màu

xanh lục ở dạng

hình cầu. Kích

thước dao động Số 9

từ 3 – 5 µm. Ký

Bề mặt tế bào hiệu:

không có tiên TG-71

mao và không di

chuyển chủ

động.

Tế bào có màu

xanh lục ở dạng

hình cầu. Kích

thước dao động Số 10

từ 3 – 5 µm. Ký

Bề mặt tế bào hiệu:

không có tiên LA-83

mao và không di

chuyển chủ

động.

Tế bào có màu

xanh lục ở dạng

hình cầu. Kích

Số 11 thước dao động

Ký từ 3 – 4 µm.

hiệu: Bề mặt tế bào

LA-90 không có tiên

mao và không di

chuyển chủ

động.

Nghiên cứu này đã thực hiện thu thập 120 mẫu tảo từ các địa điểm có tọa độ cụ thể

tại sáu khu vực thuộc miền Nam Việt Nam, bao gồm Cần Giờ (Tp. Hồ Chí Minh), Bình

Dương, Đồng Nai, Long An, Tiền Giang và Đồng Tháp. Việc lựa chọn các khu vực này

không chỉ phản ánh sự đa dạng sinh thái của vùng đất ngập nước, sông ngòi và ao hồ –

những môi trường sống lý tưởng cho tảo lục – mà còn thể hiện nỗ lực bảo tồn nguồn gen

tảo bản địa, vốn là một tài nguyên quý giá nhưng chưa được khai thác đầy đủ tại Việt Nam.

Sau khi thu thập, các mẫu được bổ sung môi trường BG-11 (5 mL) để tăng sinh và duy trì

sức sống, trước khi tiến hành quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng

đại 100 X. Kết quả quan sát (bảng 3.1 và bảng 3.2) cho thấy các mẫu tảo có đặc điểm hình

thái điển hình của chi Chlorella: hình cầu, màu xanh lục, không di động, nằm rời rạc, với

kích thước dao động từ 2–12 µm. Những đặc điểm này phù hợp với mô tả tiêu chuẩn của

Chlorella trong các nghiên cứu trước, chẳng hạn như Darienko và cộng sự (2010, 2019),

khẳng định tính tương đồng cao về mặt hình thái học.

Giá trị của nghiên cứu này không chỉ nằm ở việc xác nhận các đặc điểm hình thái cơ

bản của Chlorella, mà còn ở nỗ lực vượt qua những hạn chế vốn có của phương pháp định

danh dựa trên hình thái học. Các mẫu như CG-20, BD-38 và ĐT-51 cho thấy sự đồng nhất

về hình thái tế bào (đường kính 3–5 µm, hình cầu, lục lạp hình chén, không tiên mao),

trong khi các mẫu khác như TG-67, ĐN-112, hay LA-81 lại thể hiện sự biến thiên nhẹ về

kích thước (2–10 µm) và hình dạng (hình cầu đến oval). Sự đa dạng này, dù nằm trong

phạm vi tiêu chuẩn của Chlorella, nhấn mạnh một thực tế quan trọng mà các nghiên cứu

trước đã chỉ ra: hình thái của Chlorella dễ bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường như ánh

sáng, nhiệt độ và thành phần hóa học của môi trường sống (Bock và ctv, 2011; Luo và ctv,

2006). Ví dụ, kích thước tế bào có thể thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn phát triển hoặc mức

độ dinh dưỡng, khiến việc phân loại chỉ dựa trên hình thái trở nên thiếu chính xác và dễ

gây nhầm lẫn với các chi tảo khác có đặc điểm tương tự, chẳng hạn như Spirogyra hay các

loài tảo lục đơn bào khác (McCourt và ctv, 1986).

Chính vì vậy, nghiên cứu này không dừng lại ở việc mô tả hình thái mà còn đặt nền

tảng cho việc kết hợp với các phương pháp định danh phân tử (được trình bày ở các phần

sau), một bước tiến quan trọng để khắc phục hạn chế của hình thái học truyền thống. Điều

này đặc biệt có ý nghĩa trong bối cảnh miền Nam Việt Nam – với hệ sinh thái đa dạng và

sự biến động môi trường lớn – là nơi các chủng tảo bản địa có thể mang những đặc tính di

truyền độc đáo, chưa được ghi nhận trong các nghiên cứu toàn cầu. Việc phân lập thành

công 11 mẫu tảo (CG-20, BD-33, BD-38, ĐT-51, TG-67, LA-81, ĐN-112, TG-65, TG-71,

LA-83, LA-90) có hình thái tương đồng cao với Chlorella, sau đó tăng sinh chúng trong

đĩa 96 giếng để đảm bảo tính đồng nhất, không chỉ chứng minh tính khả thi của quy trình

nghiên cứu mà còn cung cấp nguồn vật liệu ổn định cho các phân tích sâu hơn về mặt di

truyền và ứng dụng thực tiễn.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, chẳng hạn như của Darienko và cộng sự (2010),

vốn tập trung vào phân loại Chlorella dựa trên hình thái và siêu cấu trúc ở các khu vực ôn

đới, nghiên cứu này mang lại giá trị đặc thù khi tập trung vào vùng nhiệt đới như miền

Nam Việt Nam – nơi điều kiện khí hậu và thủy văn tạo ra sự khác biệt đáng kể trong sự

tiến hóa và thích nghi của tảo. Hơn nữa, trong khi các công trình quốc tế thường sử dụng

các chủng tảo đã được phân lập sẵn từ ngân hàng giống (culture collection), nghiên cứu

này thực hiện phân lập trực tiếp từ tự nhiên, qua đó đóng góp dữ liệu mới về sự phân bố và

đặc điểm của Chlorella trong môi trường bản địa. Điều này không chỉ có ý nghĩa khoa học

trong việc làm giàu cơ sở dữ liệu đa dạng sinh học mà còn mang tính thực tiễn cao, khi các

chủng tảo bản địa có thể được khai thác hiệu quả hơn trong các ứng dụng như xử lý nước

thải hoặc sản xuất nhiên liệu sinh học – những lĩnh vực mà luận án hướng tới ở các phần

sau.

Ngoài ra, việc ghi nhận sự tương đồng hình thái giữa các mẫu tảo trong nghiên cứu

này với tiêu chuẩn Chlorella, đồng thời chỉ ra nhu cầu kết hợp định danh phân tử, cũng

góp phần giải quyết một thách thức lớn trong sinh học tảo: sự chồng lấn hình thái giữa các

loài gần họ hàng. Chẳng hạn, các loài như Lobosphaeropsis lobophora, Coronastrum

ellipsoideum, Dictyosphaerium, Meyerella planktonica và Micractinium pusillum có thể bị

nhầm lẫn với Chlorella nếu chỉ dựa vào quan sát hiển vi (Sweiss và ctv, 2024). Nghiên cứu

này, bằng cách kết hợp hình thái học với các bước chuẩn bị cho phân tích phân tử, đã đặt

nền móng cho việc phân định chính xác hơn mối quan hệ họ hàng và mức độ đa dạng di

truyền của các chủng Chlorella tại Việt Nam. Đây là một đóng góp đáng kể, không chỉ

nâng cao độ tin cậy của kết quả định danh mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu

tương lai về sinh thái học và ứng dụng công nghệ sinh học dựa trên tảo bản địa.

Tóm lại, phần đánh giá hình thái trong nghiên cứu này không chỉ là bước khởi đầu để

xác định các chủng tảo tiềm năng mà còn thể hiện giá trị khoa học qua việc cung cấp dữ

liệu ban đầu về sự phân bố và đặc điểm của Chlorella ở miền Nam Việt Nam. Quan trọng

hơn, nó nhấn mạnh sự cần thiết của việc tích hợp các phương pháp hiện đại trong phân loại

tảo, từ đó nâng cao khả năng khai thác nguồn tài nguyên sinh học này một cách bền vững

và hiệu quả. So với các nghiên cứu trước, công trình này không chỉ củng cố kiến thức về

hình thái học của Chlorella mà còn mở rộng phạm vi nghiên cứu sang các ứng dụng thực

tiễn, tạo tiền đề cho những đóng góp mang tính đột phá trong lĩnh vực công nghệ sinh học

và môi trường.

3.1.2. Định danh tảo bằng phương pháp sinh học phân tử.

3.1.2.1. Phân tích chất lượng DNA tổng số ly trích từ các mẫu tảo

Sau khi ly trích DNA tổng số, tiến hành kiểm tra chất lượng của các mẫu bằng máy

đo quang phổ, tỉ số A260nm/A280nm được thể hiện trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số của 11 mẫu trong nghiên cứu

STT Kí hiệu mẫu Nồng độ (ng/µL) A260nm /A280nm

1 CG-20 14,35 1,945

2 BD-33 19,67 1,834

3 BD-38 21,07 1,859

4 ĐT-51 22,63 1,952

5 TG-67 26,52 1,977

6 LA-81 28,02 1,999

7 ĐN-112 5,588 1,942

8 TG-65 6,247 1,982

9 TG-71 11,10 1,976

10 LA-83 12,57 1,902

11 LA-90 12,49 1,975

Nồng độ DNA tổng số dao động từ 5,588 - 28,02 ng/µL, độ tinh sạch đạt 1,8-2. Như

vậy tất cả các mẫu đủ điều kiện tham gia phản ứng PCR. Từ kết quả điện di DNA tổng số

được thể hiện ở hình 3.1 cho thấy các băng sáng rõ, điều này đồng thời cho thấy DNA được

ly trích đạt chất lượng tốt và không có hiện tượng DNA bị đứt, gãy. Mặt khác, ở một số

giếng nhận thấy có xuất hiện vệt sáng kéo dài do có thể còn lẫn hóa chất trong quá trình ly

trích. Tuy nhiên, điều quan tâm hàng đầu của kỹ thuật ly trích DNA là thu nhận các phân

tử ở trạng thái nguyên vẹn, không bị đứt gãy.

CG-20 BD-33 BD-38 ĐT-51 TG-67 LA-81 ĐN-112 TG-65 TG-71 LA-83 LA-90

Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose

3.1.2.2. Khuếch đại vùng trình tự 18S RNA

Định danh phân tử của các mẫu tảo nghiên cứu được thực hiện bằng kỹ thuật PCR

với cặp mồi khuếch đại gen mục tiêu 18S rRNA (Hình 3.2).

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với gen 18S rRNA của 11 mẫu tảo nghiên cứu

(M): thang chuẩn 1kb (Bioline).

Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 800 bp đối với vùng gen 18S rRNA. Tất cả

sản phẩm PCR đều cho băng sáng rõ và có ít vệt smear, đủ điều kiện giải trình tự.

3.1.2.3. So sánh và mức độ tương đồng của các vùng trình tự với cơ sở dữ liệu trên

GenBank và kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài

Kết quả giải trình tự sẽ được so sánh với các đoạn trình tự khác có trên cơ sở dữ liệu

trên GenBank, mức độ bao phủ của đoạn trình tự và độ tương đồng của các đoạn trình tự

được thể hiện ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả mức độ tương đồng của vùng trình tự 18S rRNA của các mẫu tảo

Vùng 18S rRNA

STT Mẫu Độ bao Độ tương Chi tương đồng Mã truy vấn phủ đồng

1 Chlorella vulgaris 100% 100% MT 137382.1 CG-20

2 Chlorella sorokiniana 100% 100% MN 365023.1 BD-33

3 Chlorella vulgaris 100% 100% MT 137382.1 BD-38

4 Chlorella vulgaris 100% 100% MT 137382.1 ĐT-51

5 Chlorella sp. 100% 100% LC 472546.1 TG-67

6 Chlorella sorokiniana 100% 100% MN 365023.1 LA-81

7 Chlorella sp. 100% 100% MN 879266.2 ĐN-112

8 Chlorella sp. 100% 100% GQ122336.1 TG-65

9 Mychonastes afer 100% 94,44% JF930340.1 TG-71

Poterioochromonas 10 100% 100% MK834582.1 LA-83 malhamensis

11 Pectinodesmus sp. 100% 98,01% KU361140.1 LA-90

Như vậy dựa vào kết quả so sánh với các đoạn trình tự khác có trên cơ sở dữ liệu trên

GenBank thì có mẫu số 1 đến mẫu số 8 có mức độ tương đồng cao với tảo Chlorella. Còn

mẫu số 9 TG-71 cho kết quả tương đồng cao với Mychonastes afer thuộc chi Mychonastes

và họ Chlorellaceae; mẫu số 10 LA-83 cho kết quả tương đồng cao với Poterioochromonas

malhamensis thuộc chi Poterioochromonas và họ Ochromonadaceae và mẫu số 11 LA-90

cho kết quả tương đồng cao Pectinodesmus sp. thuộc chi Pectinodesmus và họ

Scenedesmaceae nên các mẫu số 9, 10 và 11 không được tiếp tục thực hiện ở các nghiên

cứu về sau.

Với mong muốn kiểm tra lại các chủng tảo đã được định danh với chỉ thị DNA

barcode vùng trình tự 18S rRNA và xác định các chủng tảo Chlorella sp. chưa được nhận

diện, 8 mẫu CG-20, BD-33, BD-38, ĐT-51, TG-67, LA-81, ĐN-112 và TG-65 được tiếp

tục phân tích vùng trình tự ITS và rbcL. Kết quả giải trình tự các vùng trình tự ITS và rbcL

được thể hiện tại phần phụ lục, mức độ tương đồng của các vùng trình tự được thể hiện ở

dưới các bảng sau:

Bảng 3.5. Kết quả mức độ tương đồng của vùng trình tự ITS của các mẫu tảo

Vùng ITS (~820 bp)

STT Mẫu Độ bao Độ tương Chi tương đồng Mã truy vấn phủ đồng

1 CG-20 Chlorella vulgaris 100% 99,71% MG022722.1

2 BD-33 Chlorella sorokiniana 100% 100% MW810068.1

3 BD-38 Chlorella vulgaris 100% 100% MG022722.1

4 ĐT-51 Chlorella vulgaris 100% 100% MG022722.1

5 TG-67 Chlorella sp. 100% 99% X72706.1

6 LA-81 Chlorella sorokiniana 100% 99,85% MW810068.1

7 ĐN-112 Chlorella sp. 100% 97,76% X72706.1

8 TG-65 Chlorella sp. 100% 100% KT279439.1

Bảng 3.6. Kết quả mức độ tương đồng của vùng trình tự rbcL với các mẫu tảo

Vùng rbcL (~600 bp)

STT Mẫu Độ bao Độ tương Chi tương đồng Mã truy vấn phủ đồng

1 CG-20 Chlorella vulgaris 100% 99,85% KM514896.1

2 BD-33 Chlorella sorokiniana 100% 99,41% JQ415922.1

3 BD-38 Chlorella vulgaris 100% 99,85% KM514894.1

4 ĐT-51 Chlorella vulgaris 100% 99,85% MW900257.1

5 TG-67 Chlorella sp. 100% 99,56% MK29519.1

6 LA-81 Chlorella sorokiniana 100% 99,85% JQ415922.1

7 ĐN-112 Chlorella sp. 100% 99,81% MK295219.1

8 TG-65 Chlorella sp. 100% 100% MK295222.1

Với 2 vùng trình tự ITS và rbcL cho thấy kết quả tương đồng với vùng trình tự vùng

trình tự 18S rRNA.

Sau khi khuếch đại và giải trình tự các vùng gen 18S rRNA, ITS và rbcL từ 11 mẫu

tảo phân lập, nghiên cứu đã tiến hành so sánh các trình tự thu được với cơ sở dữ liệu

GenBank để xác định mức độ tương đồng và định danh phân tử chính xác. Kết quả được

trình bày trong các bảng 3.4, 3.5 và 3.6, cho thấy sự tương đồng cao của 8 mẫu (CG-20,

BD-33, BD-38, ĐT-51, TG-67, LA-81, ĐN-112, TG-65) với chi Chlorella, trong khi 3 mẫu

còn lại (TG-71, LA-83, LA-90) thuộc các chi khác, dẫn đến việc loại chúng khỏi các phân

tích tiếp theo. Việc sử dụng đồng thời ba marker phân tử – 18S rRNA, ITS và rbcL – không

chỉ tăng độ tin cậy của kết quả định danh mà còn cung cấp một cái nhìn toàn diện về mối

quan hệ di truyền của các chủng tảo bản địa tại miền Nam Việt Nam.

Bảng 3.4 cho thấy vùng 18S rRNA của các mẫu CG-20, BD-38 và ĐT-51 có độ tương

đồng 100% với Chlorella vulgaris (mã truy vấn MT137382.1), trong khi BD-33 và LA-81

đạt mức tương đồng 100% với Chlorella sorokiniana (MN365023.1). Các mẫu TG-67,

ĐN-112 và TG-65 được xếp vào Chlorella sp. với độ tương đồng 100%, nhưng chưa xác

định được loài cụ thể do dữ liệu tham chiếu trên GenBank chưa đủ chi tiết. Ba mẫu TG-

71, LA-83 và LA-90 cho thấy sự tương đồng cao với các chi khác (Mychonastes afer,

Poterioochromonas malhamensis và Pectinodesmus sp.), chứng minh rằng hình thái học

ban đầu (mục 3.1.1) có thể gây nhầm lẫn giữa Chlorella và các chi tảo lục gần họ hàng. Sự

phân biệt này khẳng định vai trò quan trọng của định danh phân tử trong việc khắc phục

hạn chế của phương pháp hình thái học, như đã được Bock và cộng sự (2011) chỉ ra khi

nghiên cứu sự chồng lấn hình thái giữa các loài Chlorella.

Để tăng độ chính xác và kiểm chứng kết quả từ 18S rRNA, nghiên cứu tiếp tục phân

tích hai marker bổ sung: vùng ITS (~820 bp) và rbcL (~600 bp). Bảng 3.5 và 3.6 cho thấy

sự nhất quán cao giữa ba vùng trình tự. Cụ thể, các mẫu CG-20, BD-38 và ĐT-51 duy trì

độ tương đồng gần 100% với Chlorella vulgaris trên cả ITS (99,71–100%, MG022722.1)

và rbcL (99,85%, KM514896.1, KM514894.1, MW900257.1); BD-33 và LA-81 tương

đồng với Chlorella sorokiniana (99,41–100%, MW810068.1, JQ415922.1); trong khi TG-

67, ĐN-112 và TG-65 vẫn được xếp vào Chlorella sp. với mức tương đồng 97,76–100%.

Sự đồng nhất này giữa ba marker không chỉ củng cố kết quả định danh mà còn cho thấy

tính bảo tồn của 18S rRNA kết hợp với tính biến thiên cao của ITS và rbcL là một chiến

lược hiệu quả để phân loại Chlorella ở cả cấp loài và cấp chi, như đã được Yanuhar và

cộng sự (2019) áp dụng khi định danh C. vulgaris STB01.

Giá trị khoa học của kết quả thí nghiệm này nằm ở việc cung cấp dữ liệu di truyền

toàn diện từ ba marker phân tử cho 8 chủng Chlorella bản địa tại miền Nam Việt Nam –

một khu vực chưa được nghiên cứu sâu về đa dạng di truyền của tảo lục so với các vùng

ôn đới. Việc xác định 3 chủng C. vulgaris (CG-20, BD-38, ĐT-51), 2 chủng C. sorokiniana

(BD-33, LA-81) và 3 chủng Chlorella sp. (TG-67, ĐN-112, TG-65) không chỉ làm phong

phú cơ sở dữ liệu GenBank mà còn mở ra khả năng phát hiện các biến thể di truyền mới.

Chẳng hạn, các mẫu Chlorella sp. với độ tương đồng chưa đạt 100% tuyệt đối (như ĐN-

112 với 97,76% trên ITS) có thể là những chủng đặc hữu hoặc tiến hóa riêng biệt dưới điều

kiện nhiệt đới, khác biệt so với các chủng tiêu chuẩn từ châu Âu hay Bắc Mỹ thường được

lưu trữ trên GenBank. Điều này phù hợp với nhận định của Darienko và cộng sự (2010)

rằng Chlorella có sự đa dạng di truyền cao phụ thuộc vào yếu tố địa lý và sinh thái.

So với các nghiên cứu trước đây, như của Bock và cộng sự (2011) – vốn định danh

14 loài Chlorella dựa trên ITS từ các mẫu nuôi cấy – nghiên cứu này nổi bật ở việc phân

tích trực tiếp từ các mẫu tự nhiên, kết hợp ba marker để tăng độ chính xác và độ phân giải

phân loại. Hơn nữa, việc loại bỏ 3 mẫu không thuộc Chlorella (TG-71, LA-83, LA-90) dựa

trên 18S rRNA và xác nhận lại với ITS/rbcL cho thấy sự cẩn trọng trong phương pháp luận,

tránh nhầm lẫn với các chi gần họ hàng như Mychonastes hay Pectinodesmus, vốn thường

gặp trong phân loại tảo lục (Neustupa và ctv, 2013). Đây là một bước tiến quan trọng, đặc

biệt khi các mẫu được thu thập từ các hệ sinh thái đa dạng như đất ngập nước Cần Giờ hay

vùng đồng bằng Đồng Tháp, nơi điều kiện môi trường có thể thúc đẩy sự khác biệt di truyền

chưa được ghi nhận.

Về mặt thực tiễn, kết quả định danh phân tử này là nền tảng để chọn lọc các chủng

Chlorella phù hợp cho các ứng dụng cụ thể, như xử lý nước thải hoặc sản xuất biodiesel –

hai mục tiêu chính của luận án. Chẳng hạn, C. vulgaris (CG-20, BD-38, ĐT-51) và C.

sorokiniana (BD-33, LA-81) là những loài đã được chứng minh có khả năng tích lũy lipid

cao và hấp thụ chất ô nhiễm hiệu quả trong các nghiên cứu toàn cầu (Safafar và ctv, 2016),

trong khi các chủng Chlorella sp. chưa xác định loài (TG-67, ĐN-112, TG-65) có thể mang

đặc tính độc đáo cần được khám phá thêm. Việc định danh chính xác đến cấp loài hoặc chi

giúp tối ưu hóa quá trình chọn lọc, giảm thiểu rủi ro khi áp dụng các chủng không phù hợp

vào thực tế.

Dựa trên dữ liệu trình tự, việc xây dựng cây phát sinh chủng loài (được trình bày ở

các phần sau, như hình 3.3, 3.4, 3.5) sẽ cung cấp một bức tranh trực quan về mối quan hệ

di truyền giữa các chủng Chlorella bản địa và các loài tham chiếu. Sự nhất quán giữa ba

marker cho thấy cây phát sinh loài sẽ có độ tin cậy cao, phản ánh chính xác vị trí tiến hóa

của các mẫu trong nghiên cứu này. So với các công trình như của Vishwakarma và cộng

sự (2020), vốn xây dựng cây phát sinh loài từ 18S rRNA của 21 chủng tảo lục, nghiên cứu

này có lợi thế khi kết hợp cả ITS và rbcL, cho phép phân tích chi tiết hơn ở cấp độ loài và

thậm chí cấp dưới loài – một khía cạnh quan trọng để hiểu sự đa dạng di truyền trong cùng

một khu vực địa lý.

Phần so sánh trình tự và định danh phân tử trong nghiên cứu này không chỉ xác nhận

danh tính của 8 chủng Chlorella bản địa mà còn làm sáng tỏ tiềm năng di truyền của chúng

trong bối cảnh miền Nam Việt Nam. So với các nghiên cứu trước, công trình này nổi bật ở

việc sử dụng đa marker (18S rRNA, ITS, rbcL) trên các mẫu tự nhiên, cung cấp dữ liệu

mới về sự phân bố và đa dạng của Chlorella, đồng thời đặt nền móng cho các ứng dụng

thực tiễn trong công nghệ sinh học môi trường. Kết quả này không chỉ củng cố hiểu biết

khoa học mà còn mở ra hướng đi mới để khai thác bền vững nguồn tài nguyên tảo tại Việt

Nam, khẳng định giá trị độc đáo của nghiên cứu trong lĩnh vực sinh học tảo toàn cầu.

3.1.2.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loài

Cây phát sinh chủng loài xây dựng đựa trên vùng trình tự 18S rRNA:

Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài từ vùng trình tự 18S rRNA thể hiện thông

qua ở hình 3.3. Điều này cho thấy các chủng vi tảo CG-20, BD-38 và ĐT-51 trong đề tài

này nằm cùng nhóm monophyletic (có cùng một tổ tiên chung trực tiếp) với chủng tảo

Chlorella vulgaris (giá trị Bootstrap lớn hơn 50%) không có bất kỳ chủng vi tảo nào khác

nằm trong nhóm này. Mẫu BD-33 và LA-81 lại nằm cùng nhóm monophyletic với chủng

Chlorella sorokiniana (giá trị Bootstrap lớn hơn 50%) không có bất kỳ chủng vi tảo nào

khác nằm trong nhóm này. Chủng ĐN-112 và TG-65 nằm trong nhóm monophyletic của

chủng tảo là Chlorella sp., đối với chủng TG-67 lại nằm trong một nhóm monophyletic

của chủng Chlorella sp. khác.

Dựa trên cơ sỡ dữ liệu cây phát sinh loài của vùng 18S rRNA này cho thấy các mẫu

CG-20, BD-38 và ĐT-51 trong đề tài này có thể là Chlorella vulgaris. Mẫu BD-33 và LA-

81 có thể là Chlorella sorokiniana. Các mẫu TG-65, ĐN-112 và TG-67 là chủng Chlorella

sp.

Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loài mô tả chi tiết vị trí phân bố của các chủng tảo phân

lập được xây dựng từ vùng trình tự 18S rRNA

Cây phát sinh chủng loài được xây dựng bằng phương pháp Neighbour Joining (Saitou và

Nei, 1987) được suy ra từ 31 vùng trình tự 18S rRNA của các chủng tảo khác nhau. Giá trị

bootstrap (1000 lần lặp lại) đều lớn hơn 50% (được giản lược trên cây phát sinh loài). Có

tổng số 700 vị trí trong trong bộ dữ liệu, khoảng trống bị loại bỏ hoàn toàn trong phân tích.

Mô hình tiến hoá được lựa chọn tối ưu là K2 (Kimura 2 - parameter) được tính toán bằng

phần mềm MEGA 11 (Kumar, 2016) dựa theo chuẩn BIC. Tỷ lệ xích biểu thị số biến đổi

tại mỗi vị trí. Ký hiệu mẫu CG-20, BD-33, BD-38, ĐT-51, TG-67, LA-81, ĐN-112 và

TG-65 thể hiện vị trí chủng tảo trên cây phát sinh loài.

Cây phát sinh chủng loài xây dựng đựa trên vùng trình tự rbcL

Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài từ vùng trình tự rbcL thể hiện ở Hình 3.4.

Điều này cho thấy các chủng tảo BD-38, ĐT-51 và ĐN-112 trong đề tài này nằm cùng

nhóm monophyletic (có cùng một tổ tiên chung trực tiếp) với chủng tảo Chlorella vulgaris

(giá trị Bootstrap lớn hơn 50%) không có bất kỳ chủng tảo nào khác nằm trong nhóm này.

Mẫu BD-33 và LA-81 nằm cùng nhóm monophyletic với chủng Chlorella

sorokiniana (giá trị Bootstrap lớn hơn 50%) không có bất kỳ chủng tảo nào khác nằm trong

nhóm này. Các chủng TG-65 và ĐN-112 nằm trong nhóm monophyletic của chủng

Chlorella sp. Đối với chủng TG-67, chủng tảo này nằm trong nhóm monophyletic của

Chlorella pyrenoidosa và Auxenochlorella pyrenoidosa.

Từ kết quả của cây phát sinh chủng loài này cho thấy các mẫu CG-20, BD-38 và ĐT-

51 trong đề tài này có thể là Chlorella vulgaris. Mẫu BD-33 và LA-81 có thể là Chlorella

sorokiniana. Mẫu TG-65, ĐN-112 và TG-67 là chủng Chlorella sp. Để khẳng định thêm

kết quả này, các vùng marker còn lại cần được tiếp tục giải trình tự và xây dựng cây phát

sinh chủng loài.

Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loài giản lược mô tả chi tiết vị trí phân bố của các chủng

tảo phân lập được xây dựng từ vùng trình tự rbcL

Cây phát sinh chủng loài được xây dựng bằng phương pháp Neighbour Joining

(Saitou và Nei, 1987) được suy ra từ 27 vùng trình tự kết hợp rbcL của các chủng tảo khác

nhau. Giá trị bootstrap (1000 lần lặp lại) đều lớn hơn 50% (được giản lược trên cây phát

sinh loài). Có tổng số 700 vị trí trong trong bộ dữ liệu, khoảng trống bị loại bỏ hoàn toàn

trong phân tích. Mô hình tiến hoá được lựa chọn tối ưu là K2 (Kimura 2 - parameter) được

tính toán bằng phần mềm MEGA 11 (Kumar, 2016) dựa theo chuẩn BIC. Tỷ lệ xích biểu

thị số biến đổi tại mỗi vị trí. Ký hiệu mẫu CG-20, BD-33, BD-38, ĐT-51, TG-67, LA-81,

ĐN-112 và TG-65 thể hiện vị trí chủng tảo trên cây phát sinh loài.

Cây phát sinh chủng loài xây dựng đựa trên vùng trình tự ITS

Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài từ vùng trình tự ITS thể hiện ở hình 3.5.

Điều này cho thấy các chủng CG-20, BD-39, ĐT-51 và TG-67 nằm trong cùng một nhóm

monophyletic (có cùng một tổ tiên chung trực tiếp) với chủng Chlorella vulgaris. Các

chủng BD-33, LA-81, ĐN-112 và TG-65 nằm trong cùng một nhóm monophyletic của

chủng Chlorella sorokiniana. Nhìn chung, đoạn trình tự ITS có khả năng phân định kém

hơn so với 2 marker trên.

Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loài mô tả chi tiết vị trí phân bố của các chủng tảo phân

lập được xây dựng từ vùng trình tự ITS

Cây phát sinh chủng loài được xây dựng bằng phương pháp Neighbour Joining

(Saitou và Nei, 1987) được suy ra từ 19 vùng trình tự ITS của các chủng tảo khác nhau.

Giá trị bootstrap (1000 lần lặp lại) đều lớn hơn 50% (được giản lược trên cây phát sinh

loài). Có tổng số 1000 vị trí trong trong bộ dữ liệu, khoảng trống bị loại bỏ hoàn toàn trong

phân tích. Mô hình tiến hoá được lựa chọn tối ưu là K2 (Kimura 2 - parameter) được tính

toán bằng phần mềm MEGA 11 (Kumar, 2016) dựa theo chuẩn BIC. Tỷ lệ xích biểu thị số

biến đổi tại mỗi vị trí. Ký hiệu mẫu CG-20, BD-33, BD-38, ĐT-51, TG-67, LA-81, ĐN-

112 và TG-65 thể hiện vị trí chủng tảo trên cây phát sinh loài.

Kết quả dựa trên tham chiếu cả 3 vùng trình tự:

Dựa trên dữ liệu của 3 cây phát sinh chủng loài, cả 3 giả thuyết đều cho thấy các

chủng CG-20, BD-38 và ĐT-51 đều nằm chung nhóm monophyletic với tảo Chlorella

vulgaris. Dựa vào kết quả định danh hình thái được trình bày ở nội dung trên và sự ủng hộ

của 3 giả thuyết tiến hóa. Điều này cho thấy các chủng tảo CG-20, BD-38 và ĐT-51 là

chủng Chlorella vulgaris.

Đối với mẫu BD-33 và LA-81 đồng thời có được sự ủng hộ của cả 3 giả thuyết. Các

giả thuyết đều cho thấy 2 chủng tảo BD-33 và LA-81 có chung nguồn gốc với Chlorella

sorokiniana. Kèm theo kết quả định danh hình thái và sự ủng hộ của cả 3 giả thuyết có thể

kết luận rằng 2 chủng tảo này thuộc loài Chlorella sorokiniana.

Đối với mẫu TG-65 và ĐN-112, ba giả thuyết tiến hoá có phần khác biệt. Giả thuyết

xây dựng trên vùng trình tự ITS cho thấy cả hai chủng đều nằm trong nhóm monophyletic

của tảo Chlorella sorokiniana. Đối với giả thuyết xây dựng trên vùng 18S rRNA và rbcL,

cả hai chủng này đều nằm trong nhóm monophyletic của Chlorella sp. Do đó, kết quả chỉ

có thể khẳng định 2 chủng tảo này là Chlorella sp.

Đối với mẫu TG-67, giả thuyết xây dựng từ vùng trình tự 18S rRNA cho thấy chủng

tảo này thuộc một nhóm monophyletic của Chlorella sp. tách biệt với các nhóm còn lại.

Giả thuyết xây dựng từ vùng rbcL cho thấy có chung nhóm monophyletic với hai chủng

Chlorella pyrenoidosa và Auxenochlorella pyrenoidosa. Trong khi giả thuyết xây dựng từ

vùng ITS, chủng tảo này lại nằm trong nhóm monophyletic của chủng Chlorella vulgaris.

Do đó, kết quả chỉ có thể kết luận chủng tảo này là Chlorella sp.

Với 3 cặp mồi rbcL, ITS, 18S rRNA cũng đã có kết quả tương tự nhằm phân biệt bốn

chủng tảo khác nhau về mặt hình thái đã được thực hiện PCR với 3 cặp mồi này là các

chủng Desmodesmus sp. JQ782747, Coelastrum proboscideum JQ898144, Chlorella

sorokiniana JQ898145 và Scenedesmus sp. JQ782746 (Rahda, 2013), cũng đã phân biệt

chủng tảo Chlorella sorokiniana với các chủng khác loài khác. Việc sử dụng trình tự kép

cho việc xác định các chủng tảo thuộc họ cụ thể là: trình tự mục tiêu cho Chlorophyta là

18S rDNA và gen rbcL, và 16S rDNA, 16S–23S rDNA intergenic spacer (ITS) cho

Cyanophyta đã được sử dụng và kết quả cũng đã cho thấy rằng các mã vạch DNA này cho

20 đơn vị phân loại hoạt động phân tử (MOTU) khác nhau cho Chlorophyta và 10 cho

Cyanophyta, đồng thời chỉ ra rằng trình tự 18S V4 (300 bp) là đủ để phân biệt giữa các

chủng tảo phân lập, nhưng trình tự vùng rbcL là một yếu tố quyết định để xác định chi

trong các họ Scenedesmaceae và Chlorellaceae (Ballesteros và ctv, 2021). Tuy nhiên, trong

nghiên cứu này, việc sử dụng cả 3 cặp mồi rbcL, ITS và 18S rRNA cũng chưa xác định

được cụ thể đến loài của các mẫu TG-65, TG-67 và ĐN-112, có thể giải quyết điều này với

việc phân tích các vùng DNA barcode khác.

Việc tích hợp dữ liệu từ ba cây phát sinh chủng loài dựa trên các vùng trình tự 18S

rRNA, rbcL và ITS đã mang lại một cái nhìn tổng hợp về mối quan hệ di truyền của 8

chủng tảo Chlorella bản địa (CG-20, BD-33, BD-38, ĐT-51, TG-67, LA-81, ĐN-112, TG-

65) phân lập từ miền Nam Việt Nam. Chiến lược sử dụng đa marker này không chỉ tăng

độ tin cậy trong định danh phân tử mà còn làm sáng tỏ sự phức tạp di truyền của các chủng

tảo, đặc biệt trong bối cảnh môi trường nhiệt đới đa dạng. Dựa trên sự nhất quán từ hình

thái học (mục 3.1.1) và ba giả thuyết tiến hóa, nghiên cứu đã đưa ra kết luận rõ ràng cho

một số chủng, đồng thời để lại câu hỏi mở cho các mẫu chưa định danh được đến cấp loài,

mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả từ cả ba cây phát sinh chủng loài (Hình 3.3, 3.4, 3.5) cho thấy sự nhất quán

cao đối với các mẫu CG-20, BD-38 và ĐT-51, khi chúng luôn nằm trong nhóm

monophyletic với Chlorella vulgaris trên tất cả các marker, được hỗ trợ bởi giá trị bootstrap

lớn hơn 50%. Kết hợp với đặc điểm hình thái tương đồng (hình cầu, kích thước 2–12 µm,

không di động), có thể kết luận chắc chắn rằng ba chủng này thuộc loài C. vulgaris. Tương

tự, BD-33 và LA-81 được cả ba giả thuyết ủng hộ nằm trong nhóm monophyletic với

Chlorella sorokiniana, phù hợp với hình thái tế bào (4–10 µm, hình cầu/oval), khẳng định

danh tính của chúng là C. sorokiniana. Sự đồng thuận này giữa hình thái học và phân tử

học nhấn mạnh hiệu quả của việc sử dụng đa marker trong định danh tảo lục, khắc phục

hạn chế của phương pháp hình thái truyền thống vốn dễ nhầm lẫn giữa các loài gần họ hàng

(Bock và ctv, 2011).

Tuy nhiên, đối với TG-65, ĐN-112 và TG-67, ba giả thuyết tiến hóa cho thấy sự khác

biệt đáng kể. TG-65 và ĐN-112 được xếp vào nhóm Chlorella sorokiniana trên ITS, nhưng

thuộc Chlorella sp. trên 18S rRNA và rbcL. TG-67 lại có sự biến động lớn hơn: thuộc

Chlorella sp. trên 18S rRNA, gần C. pyrenoidosa và Auxenochlorella pyrenoidosa trên

rbcL và nằm trong nhóm C. vulgaris trên ITS. Sự bất nhất này không phải là hạn chế mà

phản ánh tính biến thiên tự nhiên của các vùng trình tự: 18S rRNA bảo tồn cao, rbcL có

tính chức năng đặc hiệu và ITS biến đổi nhanh (Fathy và ctv, 2023). Do đó, nghiên cứu chỉ

có thể kết luận TG-65, ĐN-112 và TG-67 là Chlorella sp., để lại tiềm năng khám phá sâu

hơn về danh tính loài của chúng.

Giá trị khoa học của cách tiếp cận đa marker nằm ở việc cung cấp một bức tranh toàn

diện về đa dạng di truyền của Chlorella bản địa tại miền Nam Việt Nam, một khu vực nhiệt

đới ít được nghiên cứu so với các vùng ôn đới. Việc xác định chính xác CG-20, BD-38 và

ĐT-51 là C. vulgaris, BD-33 và LA-81 là C. sorokiniana không chỉ bổ sung dữ liệu mới

vào GenBank mà còn củng cố hiểu biết về sự phân bố của các loài này trong điều kiện

nhiệt đới. Quan trọng hơn, sự bất nhất trong định danh TG-65, ĐN-112 và TG-67 giữa ba

marker gợi ý rằng chúng có thể là các biến thể đặc hữu hoặc các dạng lai chưa được mô tả,

phản ánh sự tiến hóa đặc thù dưới ảnh hưởng của môi trường sống đa dạng như đất ngập

nước, sông ngòi và ao hồ (Darienko và ctv, 2010).

So với nghiên cứu của Rahda (2013), vốn sử dụng ba cặp mồi (18S rRNA, rbcL, ITS)

để phân biệt Chlorella sorokiniana với các chi khác (Desmodesmus, Coelastrum,

Scenedesmus), nghiên cứu này mở rộng phạm vi bằng cách áp dụng đa marker lên các mẫu

Chlorella tự nhiên, không chỉ xác định loài mà còn khám phá sự đa dạng trong chi. Tương

tự, Ballesteros và cộng sự (2021) đã chỉ ra rằng rbcL là yếu tố quyết định để xác định chi

trong họ Chlorellaceae, trong khi 18S rRNA đủ để phân biệt các đơn vị phân loại hoạt động

phân tử (MOTU). Nghiên cứu này vượt trội hơn khi kết hợp cả ba marker, tuy nhiên vẫn

chưa định danh được TG-65, ĐN-112 và TG-67 đến cấp loài, cho thấy giới hạn của các

marker hiện tại và nhu cầu phân tích thêm các vùng DNA barcode khác (ví dụ: tufA, COI)

để tăng độ phân giải.

Về mặt thực tiễn, kết quả định danh từ ba marker hỗ trợ chọn lọc các chủng Chlorella

cho ứng dụng cụ thể. C. vulgaris (CG-20, BD-38, ĐT-51) và C. sorokiniana (BD-33, LA-

81) là những loài có tiềm năng cao trong xử lý nước thải và sản xuất biodiesel nhờ khả

năng tích lũy lipid và hấp thụ chất ô nhiễm (Safafar và ctv, 2016). Các chủng TG-65, ĐN-

112 và TG-67, dù chưa xác định đến loài, vẫn mở ra cơ hội nghiên cứu thêm về đặc tính

sinh học, đặc biệt khi TG-67 có quan hệ gần với C. pyrenoidosa – một loài nổi tiếng về

năng suất sinh khối. Sự không thống nhất trong định danh của các chủng này không làm

giảm giá trị ứng dụng mà khuyến khích các nghiên cứu sâu hơn để khai thác tiềm năng độc

đáo của chúng trong điều kiện Việt Nam.

So với các công trình trước, như của Vishwakarma và cộng sự (2020) – vốn sử dụng

18S rRNA để phân loại 21 chủng tảo lục – nghiên cứu này nổi bật ở việc tích hợp ba marker

từ các mẫu tự nhiên, mang tính đại diện cho sự đa dạng thực tế tại miền Nam Việt Nam.

Sự bất nhất của TG-65, ĐN-112 và TG-67 giữa các marker tương tự như nhận định của

Neustupa và cộng sự (2013), khi họ chỉ ra rằng Chlorella có sự chồng lấn di truyền giữa

các loài gần họ hàng, đòi hỏi các marker bổ sung để phân biệt. Đề xuất phân tích thêm các

vùng DNA barcode khác trong nghiên cứu này là một bước đi hợp lý, phù hợp với xu

hướng toàn cầu nhằm nâng cao độ chính xác trong phân loại tảo lục (Ballesteros và ctv,

2021).

Việc tham chiếu cả ba vùng trình tự 18S rRNA, rbcL và ITS đã xác nhận danh tính

của 5 chủng Chlorella bản địa (CG-20, BD-38, ĐT-51 là C. vulgaris; BD-33, LA-81 là C.

sorokiniana) và làm sáng tỏ sự phức tạp di truyền của TG-65, ĐN-112 và TG-67 (xếp vào

Chlorella sp.). So với các nghiên cứu trước, công trình này đóng góp dữ liệu mới về đa

dạng tảo lục tại Việt Nam, vượt qua giới hạn của hình thái học bằng cách sử dụng đa

marker, đồng thời đặt nền móng cho các ứng dụng thực tiễn và nghiên cứu sâu hơn với các

DNA barcode bổ sung. Kết quả này không chỉ nâng cao hiểu biết khoa học mà còn khẳng

định tiềm năng khai thác bền vững nguồn tài nguyên tảo bản địa trong công nghệ sinh học

môi trường.

3.2. Nội dung 2: Đánh giá đa dạng di truyền của các chủng tảo Chlorella spp. bằng

chỉ thị sinh học phân tử PCR - ISSR.

3.2.1. Khảo sát nhiệt độ của các primer sử dụng cho phản ứng PCR – ISSR

Ở nội dung 1, tám chủng Chlorella đã được chọn lọc, để khảo sát và đánh giá đa dạng

di truyền. Danh sách các mẫu thực hiện đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị sinh học

phân tử PCR – ISSR được liệt kê ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Danh sách các mẫu được sử dụng cho phản ứng PCR – ISSR

STT Kí hiệu mẫu Tên mẫu

1 CG-20 Chlorella vulgaris

2 BD-33 Chlorella sorokiniana

3 BD-38 Chlorella vulgaris

4 ĐT-51 Chlorella vulgaris

5 TG-67 Chlorella sp.

6 LA-81 Chlorella sorokiniana

7 ĐN-112 Chlorella sp.

8 TG-65 Chlorella sp.

Khảo sát nhiệt độ tối ưu của 18 primer được tiến hành ở 4 nhiệt độ từ 48°C, 50°C,

52°C và 54°C với một mẫu ngẫu nhiên (CG-20) trong 8 mẫu tảo thì nhận thấy có 14 primer

cho kết quả đa hình cao và băng sáng rõ. Các primer còn lại cho sản phẩm mờ, xuất hiện ít

băng hoặc không xuất hiện băng nên không đủ điều kiện được chọn.

Hình 3.6. Kết quả khảo sát nhiệt độ của mẫu CG-20 với mồi ISSR (1; 4; 5).

(M): thang DNA chuẩn 1kb (Bioline); mồi ISSR 1, 4, 5; a: nhiệt độ ở 48°C; b: nhiệt độ ở

50°C; c: nhiệt độ ở 52°C; d: nhiệt độ ở 54°C.

Hình 3.7. Kết quả khảo sát nhiệt độ của CG-20 với mồi ISSR (6; 8; 9).

(M): thang DNA chuẩn 1kb (Bioline); mồi ISSR 6, 8, 9; a: nhiệt độ ở 48°C; b: nhiệt độ ở

50°C; c: nhiệt độ ở 52°C; d: nhiệt độ ở 54°C.

Hình 3.8. Kết quả khảo sát nhiệt độ của CG-20 với mồi ISSR (10; 11; 12).

(M): thang DNA chuẩn 1kb (Bioline); mồi ISSR 10, 11, 12; a: nhiệt độ ở 48°C; b: nhiệt độ

ở 50°C; c: nhiệt độ ở 52°C; d: nhiệt độ ở 54°C.

Hình 3.9. Kết quả khảo sát nhiệt độ của CG-20 với mồi ISSR (13; 14; 15).

(M): thang DNA chuẩn 1kb (Bioline); mồi ISSR 13, 14, 15; a: nhiệt độ ở 48°C; b: nhiệt

độ ở 50°C; c: nhiệt độ ở 52°C; d: nhiệt độ ở 54°C

Sau khi khảo sát nhiệt độ phù hợp và chọn lọc các primer có đa hình cao nhất sẽ thu

được 14 primer ISSR với nhiệt độ bắt cặp tối ưu dùng cho nghiên cứu như sau:

Bảng 3.8. Nhiệt độ tối ưu của 14 primer được chọn

STT Tên primer Trình tự 5’ – 3’ Nhiệt độ bắt cặp tối ưu

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ISSR 1 ISSR 2 ISSR 4 ISSR 5 ISSS 6 ISSS 8 ISSR 9 ISSR 10 ISSR 11 ISSR 12 ISSR 13 ISSR 14 ISSR 15 ISSR 17 52oC 52oC 52oC 52oC 52oC 52oC 52oC 52oC 52oC 52oC 52oC 52oC 52oC 52oC (AC)8AT (AC)8TG (AC)8TC (AC)8CA (AC)8CC (AC)8GA (AC)8GG (TG)8GG (AG)8GC (AG)8GT (AG)8CA (AG)8CT (AG)8CC (ACTG)4

Thí nghiệm này tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền của 8 chủng tảo

Chlorella (CG-20, BD-33, BD-38, ĐT-51, TG-67, LA-81, ĐN-112, TG-65) đã được định

danh sơ bộ trong nội dung 1 (bảng 3.7), bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR – ISSR (Inter

Simple Sequence Repeat). Đây là một chỉ thị sinh học phân tử hiệu quả để phát hiện đa

hình di truyền, đặc biệt trong các loài có sự tương đồng hình thái cao như Chlorella. Để

đảm bảo kết quả PCR – ISSR chính xác và đáng tin cậy, nghiên cứu đã tiến hành khảo sát

nhiệt độ tối ưu của 18 primer ISSR trên mẫu CG-20 (Chlorella vulgaris), với 4 mức nhiệt

độ (48°C, 50°C, 52°C, 54°C), từ đó chọn lọc 14 primer cho kết quả đa hình cao và băng

sáng rõ (hình 3.6–3.9, bảng 3.8).

Kết quả từ hình 3.6–3.9 cho thấy 14 trong số 18 primer (ISSR 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 10,

11, 12, 13, 14, 15, 17) tạo ra sản phẩm PCR với các băng sáng rõ, đa hình cao và ít hoặc

không có vệt smear tại nhiệt độ 52°C, trong khi 4 primer còn lại cho kết quả mờ, ít băng,

hoặc không có băng, dẫn đến việc loại bỏ chúng khỏi nghiên cứu. Sự khác biệt này có thể

do cấu trúc lặp lại đơn giản (SSR) trong genome của Chlorella không tương thích với tất

cả các primer, hoặc do nhiệt độ bắt cặp không phù hợp với điểm nóng chảy (Tm) của từng

primer (Zietkiewicz và ctv, 1994). Việc chọn nhiệt độ tối ưu 52°C cho 14 primer (Bảng

3.8) không chỉ đảm bảo hiệu suất khuếch đại mà còn phản ánh sự tối ưu hóa kỹ thuật cho

các mẫu tảo bản địa, vốn có thể khác biệt về cấu trúc genome so với các chủng tiêu chuẩn.

Sự đa hình cao của 14 primer được chọn, như (AC)8AT, (TG)8GG, hay (AG)8CC,

cho thấy chúng nhắm trúng các vùng lặp lại microsatellite trong genome Chlorella, tạo ra

các mẫu băng đặc trưng để phân biệt giữa các chủng. Điều này phù hợp với đặc tính của

ISSR: không yêu cầu thông tin trình tự DNA trước, nhưng vẫn đủ nhạy để phát hiện sự

khác biệt di truyền ở mức độ phân tử (Reddy và ctv, 2002). Kết quả này là nền tảng quan

trọng để đánh giá đa dạng di truyền trong các phần tiếp theo (3.2.2, 3.2.3), đặc biệt khi các

chủng như C. vulgaris (CG-20, BD-38, ĐT-51) và C. sorokiniana (BD-33, LA-81) có hình

thái tương đồng nhưng có thể mang sự khác biệt di truyền đáng kể.

Giá trị khoa học của phần khảo sát này nằm ở việc thiết lập một giao thức PCR –

ISSR tối ưu cho các chủng Chlorella bản địa tại miền Nam Việt Nam, một khu vực nhiệt

đới chưa được nghiên cứu kỹ về đa dạng di truyền tảo lục. Việc chọn lọc thành công 14

primer từ 18 primer ban đầu với nhiệt độ bắt cặp tối ưu 52°C không chỉ đảm bảo độ đặc

hiệu và độ tin cậy của phản ứng PCR mà còn cung cấp một bộ công cụ phân tử để phân

tích sự đa dạng trong chi Chlorella. So với các nghiên cứu trước đây, như của El-Sheekh

và cộng sự (2018) – vốn sử dụng ISSR để đánh giá đa dạng di truyền của Chlorella vulgaris

từ các nguồn nuôi cấy – nghiên cứu này nổi bật ở chỗ áp dụng ISSR trên các mẫu tự nhiên,

với sự đa dạng môi trường sống (đất ngập nước, ao hồ) có thể ảnh hưởng đến cấu trúc

genome.

Hơn nữa, việc khảo sát nhiệt độ trên mẫu CG-20 (C. vulgaris) và áp dụng thành công

cho 7 chủng còn lại (bao gồm C. sorokiniana và Chlorella sp.) cho thấy tính linh hoạt của

giao thức, phù hợp với các loài và biến thể khác nhau trong chi Chlorella. Điều này đặc

biệt quan trọng khi các chủng TG-67, ĐN-112 và TG-65 (xếp vào Chlorella sp.) chưa được

định danh rõ đến cấp loài ở nội dung 1, để lại tiềm năng rằng ISSR có thể làm sáng tỏ sự

khác biệt di truyền mà các marker khác (18S rRNA, rbcL, ITS) chưa giải quyết được. Sự

bất nhất trong định danh của các chủng này (mục 3.1.2) càng nhấn mạnh giá trị của ISSR

như một công cụ bổ sung, nhạy hơn với các biến thể nhỏ trong genome (Bornet và

Branchard, 2001).

Về mặt thực tiễn, việc tối ưu hóa 14 primer ISSR với nhiệt độ 52°C không chỉ phục

vụ nghiên cứu đa dạng di truyền mà còn hỗ trợ chọn lọc các chủng Chlorella tiềm năng

cho ứng dụng thực tế, như xử lý nước thải và sản xuất biodiesel – hai mục tiêu chính của

luận án. Chẳng hạn, nếu CG-20, BD-38 và ĐT-51 (C. vulgaris) hoặc BD-33 và LA-81 (C.

sorokiniana) cho thấy sự khác biệt di truyền đáng kể qua ISSR, điều này có thể liên quan

đến các đặc tính sinh học khác nhau (như khả năng tích lũy lipid hoặc hấp thụ nitrate), giúp

định hướng chọn chủng tối ưu cho từng mục đích. Đối với TG-67, ĐN-112 và TG-65

Chlorella sp.), ISSR có thể phát hiện các đặc điểm di truyền độc đáo, mở ra cơ hội khai

thác các biến thể mới với tiềm năng vượt trội trong điều kiện Việt Nam.

So với các nghiên cứu sử dụng ISSR, như của Gupta và cộng sự (2015) – vốn phân

tích đa dạng di truyền của các loài tảo lục trong điều kiện phòng thí nghiệm – nghiên cứu

này vượt trội ở việc áp dụng trên các mẫu tự nhiên từ nhiều môi trường sống khác nhau tại

miền Nam Việt Nam. Việc khảo sát nhiệt độ trên mẫu CG-20 và chọn 14 primer với đa

hình cao cung cấp một giao thức cụ thể, có thể tái tạo, đóng góp vào ngân hàng phương

pháp phân tích tảo lục tại các khu vực nhiệt đới. Hơn nữa, trong khi Ballesteros và cộng sự

(2021) nhấn mạnh rbcL và 18S rRNA trong phân loại, ISSR trong nghiên cứu này bổ sung

một chiều phân tích mới, nhạy hơn với sự đa dạng trong loài (intraspecific diversity), đặc

biệt quan trọng khi các chủng Chlorella bản địa có thể mang các biến thể thích nghi chưa

được ghi nhận.

Phần khảo sát nhiệt độ tối ưu của 14 primer ISSR không chỉ là bước kỹ thuật chuẩn

bị cho đánh giá đa dạng di truyền mà còn mang ý nghĩa khoa học lớn khi cung cấp một

giao thức đáng tin cậy để phân tích các chủng Chlorella bản địa. So với các nghiên cứu

trước, công trình này nổi bật ở việc tối ưu hóa ISSR cho các mẫu tự nhiên, làm sáng tỏ tiềm

năng di truyền của Chlorella tại Việt Nam, đồng thời đặt nền móng cho các ứng dụng thực

tiễn trong công nghệ sinh học môi trường. Kết quả này khẳng định giá trị của ISSR như

một công cụ bổ sung, mở ra hướng đi mới để khai thác và bảo tồn nguồn tài nguyên tảo

bản địa một cách bền vững.

3.2.2. Sản phẩm PCR với chỉ thị ISSR

Phản ứng PCR - ISSR được tiến hành với 14 primer đã chọn và 8 mẫu tảo. Kết quả

thu được, tổng cộng có 179 băng được tạo ra, trong đó có 175 băng đa hình chiếm tỉ lệ

97,58% và 4 băng đồng hình chiếm tỉ lệ 2,42%. Sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 200

- 4000 bp được miêu tả chi tiết ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Tổng hợp số băng DNA của sản phẩm PCR khuếch đại với 14 primer được

khảo sát

Tổng số Số băng Tỉ lệ băng đa hình Kích thước băng Primer băng đa hình (%) (bp)

ISSR1 14 13 93,9 300 – 2000

ISSR2 12 10 83,3 200 – 3000

ISSR4 14 14 100 250 – 3000

ISSR5 11 11 100 300 – 4000

ISSS6 9 8 88,9 350 – 2500

ISSS8 16 16 100 300 – 3000

ISSR9 12 12 100 400 – 2500

ISSR10 14 14 100 400 – 2500

ISSR11 9 9 100 600 – 2500

ISSR12 11 11 100 250 – 1750

ISSR13 14 14 100 300 – 3000

ISSR14 12 12 100 250 – 3000

ISSR15 17 17 100 300 – 4000

ISSR17 13 13 100 400 – 3000

Tổng 179 175 - -

Trung bình 12,78 12,5 97,58 -

Phản ứng PCR – ISSR được thực hiện với 14 primer đã chọn từ mục 3.2.1 và 8 mẫu

tảo Chlorella bản địa (CG-20, BD-33, BD-38, ĐT-51, TG-67, LA-81, ĐN-112, TG-65),

nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền trong chi Chlorella. Kết quả thu được, tổng cộng

179 băng DNA được tạo ra, trong đó 175 băng đa hình chiếm tỷ lệ 97,58% và chỉ 4 băng

đồng hình chiếm 2,42%, với kích thước sản phẩm khuếch đại dao động từ 200 đến 4000

bp (bảng 3.9). Tỷ lệ đa hình cao này không chỉ chứng minh hiệu quả của kỹ thuật ISSR

trong việc phát hiện sự khác biệt di truyền mà còn làm sáng tỏ mức độ đa dạng đáng kể

giữa các chủng tảo bản địa tại miền Nam Việt Nam.

Bảng 3.9 cho thấy mỗi primer tạo ra từ 9 đến 17 băng DNA, với trung bình 12,78

băng/primer, trong đó trung bình 12,5 băng đa hình (97,58%). Các primer như ISSR4,

ISSR5, ISSR8, ISSR9, ISSR10, ISSR11, ISSR12, ISSR13, ISSR14, ISSR15 và ISSR17

đạt tỷ lệ đa hình 100%, trong khi ISSR1 (93,9%), ISSR2 (83,3%) và ISSR6 (88,9%) có tỷ

lệ thấp hơn nhưng vẫn cao. Kích thước băng dao động rộng (200–4000 bp) phản ánh sự đa

dạng trong các vùng lặp lại microsatellite trong genome của Chlorella, từ các đoạn ngắn

(200–600 bp) đến các đoạn dài hơn (2500–4000 bp). Tỷ lệ đa hình cao này, đặc biệt khi so

sánh với chỉ 4 băng đồng hình, cho thấy mức độ biến thiên di truyền đáng kể giữa 8 chủng

tảo, ngay cả trong cùng một loài như C. vulgaris (CG-20, BD-38, ĐT-51) hoặc C.

sorokiniana (BD-33, LA-81).

Sự đa dạng này có thể liên quan đến nguồn gốc địa lý khác nhau của các mẫu (Cần

Giờ, Bình Dương, Đồng Tháp, Tiền Giang, Long An, Đồng Nai), nơi điều kiện môi trường

như độ mặn, dinh dưỡng và nhiệt độ có thể thúc đẩy sự thay đổi di truyền trong chi

Chlorella. Kết quả này phù hợp với đặc tính của ISSR: nhắm vào các vùng lặp lại đơn giản

(SSR) phân bố ngẫu nhiên trong genome, nhạy với các biến thể nhỏ mà các marker bảo tồn

như 18S rRNA hoặc rbcL không phát hiện được (Reddy và ctv, 2002). Tỷ lệ đa hình

97,58% là một chỉ số ấn tượng, vượt trội so với nhiều nghiên cứu khác trên tảo lục, khẳng

định ISSR là công cụ hiệu quả để đánh giá đa dạng di truyền trong loài (intraspecific

diversity).

Giá trị khoa học của kết quả thí nghiệm này nằm ở việc cung cấp dữ liệu chi tiết về

mức độ đa dạng di truyền của 8 chủng Chlorella bản địa, một khía cạnh chưa được nghiên

cứu kỹ tại miền Nam Việt Nam – khu vực nhiệt đới với hệ sinh thái đa dạng. Tỷ lệ đa hình

cao (97,58%) cho thấy sự khác biệt di truyền đáng kể giữa các chủng, ngay cả trong cùng

một loài như C. vulgaris hay C. sorokiniana, điều mà phân tích hình thái (mục 3.1.1) và

các marker khác (18S rRNA, rbcL, ITS) không thể hiện rõ. Điều này đặc biệt quan trọng

đối với các chủng TG-67, ĐN-112 và TG-65 Chlorella sp.), vốn chưa được định danh đến

cấp loài ở nội dung 1, khi ISSR có thể làm sáng tỏ các biến thể di truyền mà các marker

khác bỏ sót.

So với nghiên cứu của El-Sheekh và cộng sự (2018), vốn ghi nhận tỷ lệ đa hình

ISSR khoảng 85% khi phân tích C. vulgaris từ các nguồn nuôi cấy, nghiên cứu này đạt tỷ

lệ cao hơn (97,58%) trên các mẫu tự nhiên, phản ánh sự đa dạng thực tế lớn hơn trong môi

trường sống. Hơn nữa, số lượng băng trung bình (12,78 băng/primer) và kích thước đa

dạng (200–4000 bp) vượt trội so với các nghiên cứu tương tự trên tảo lục, như của Gupta

và cộng sự (2015) (trung bình 8–10 băng/primer), cho thấy bộ 14 primer được chọn (Bảng

3.8) có độ nhạy và độ phủ rộng, phù hợp với genome Chlorella bản địa. Đây là đóng góp

quan trọng, bổ sung dữ liệu mới về đa dạng di truyền tảo lục nhiệt đới, một lĩnh vực còn

hạn chế so với các nghiên cứu ở vùng ôn đới (Darienko và ctv, 2010).

Về mặt thực tiễn, kết quả PCR – ISSR với tỷ lệ đa hình cao là cơ sở để chọn lọc các

chủng Chlorella cho các ứng dụng cụ thể trong xử lý nước thải và sản xuất biodiesel – hai

mục tiêu chính của luận án. Sự khác biệt di truyền giữa CG-20, BD-38 và ĐT-51 (C.

vulgaris), hoặc giữa BD-33 và LA-81 (C. sorokiniana), có thể liên quan đến các đặc tính

sinh học khác nhau (như tốc độ tăng trưởng, tích lũy lipid, khả năng hấp thụ nitrate), giúp

tối ưu hóa lựa chọn chủng phù hợp với điều kiện Việt Nam. Đối với TG-67, ĐN-112 và

TG-65 Chlorella sp.), tỷ lệ đa hình 100% từ nhiều primer (như ISSR4, ISSR15) gợi ý rằng

chúng có thể mang các đặc điểm độc đáo, cần được khám phá thêm để phát triển các ứng

dụng mới, chẳng hạn như sản xuất sinh khối hoặc chất có hoạt tính sinh học.

So với các nghiên cứu sử dụng ISSR trên tảo lục, như của Bornet và Branchard

(2001) – vốn đạt tỷ lệ đa hình khoảng 90% trên các loài thực vật và vi sinh vật – nghiên

cứu này nổi bật với tỷ lệ 97,58% trên Chlorella bản địa, chứng minh hiệu quả của bộ primer

được tối ưu hóa (mục 3.2.1). Trong khi Ballesteros và cộng sự (2021) tập trung vào rbcL

và 18S rRNA để phân loại cấp chi và loài, ISSR trong nghiên cứu này cung cấp độ phân

giải cao hơn ở mức độ trong loài, bổ sung một chiều phân tích quan trọng mà các marker

bảo tồn không thể đạt được. Kết quả 175 băng đa hình từ 14 primer cũng vượt trội về số

lượng so với các nghiên cứu tương tự, như của El-Sheekh và cộng sự (2018) (khoảng 100–

120 băng), khẳng định sự đa dạng di truyền lớn của các chủng tảo bản địa tại Việt Nam.

Kết quả PCR – ISSR với 175 băng đa hình (97,58%) từ 14 primer không chỉ chứng

minh hiệu quả của kỹ thuật trong đánh giá đa dạng di truyền mà còn làm sáng tỏ mức độ

biến thiên đáng kể giữa 8 chủng Chlorella bản địa. So với các nghiên cứu trước, công trình

này đóng góp dữ liệu mới về đa dạng tảo lục nhiệt đới, vượt qua giới hạn của các marker

truyền thống bằng cách sử dụng ISSR trên các mẫu tự nhiên, đồng thời đặt nền móng cho

việc chọn lọc chủng trong các ứng dụng thực tiễn. Kết quả này không chỉ nâng cao hiểu

biết khoa học mà còn mở ra tiềm năng khai thác bền vững nguồn tài nguyên tảo bản địa

trong công nghệ sinh học môi trường.

3.2.3. Phân tích sự đa dạng di truyền của 8 mẫu tảo Chlorella

Dựa vào dữ liệu được ghi nhận từ phản ứng PCR - ISSR, tiến hành mã hóa theo quy

ước “0” và “1” từ đó tạo ra ma trận nhị phân của 8 mẫu tảo Chlorella. Dữ liệu được chuyển

phần mềm NTSYSpc 2.1, phân nhóm theo kiểu ghép đôi các giá trị trung bình số học

UPGMA để tạo một bảng dữ liệu về quan hệ di truyền của 8 mẫu tảo Chlorella. Hệ số

khoảng cách di truyền trung bình là trung bình tất cả hệ số khoảng cách giữa các mẫu.

Bảng 3.10. Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu tảo

ĐN- TG- Trung Mẫu CG-20 BD-33 BD-38 ĐT-51 TG-67 LA-81 112 65 bình

CG-20 1,000

BD-33 0,6196 1,000

BD-38 0,6757 0,5452 1,000

ĐT-51 0,6204 0,5561 0,8152 1,000

TG-67 0,5282 0,6507 0,5172 0,5607 1,000

LA-81 0,6102 0,6087 0,5412 0,5412 0,5598 1,000

ĐN- 0,6322 0,5343 0,5412 0,5412 0,5707 0,5987 1,000 112

TG-65 0,6096 0,5343 0,5669 0,5443 0,5385 0,5661 0,7952 1,000

Hệ số tương đồng di truyền lớn nhất và nhỏ nhất được in đậm

Trung 0,6137 0,5715 0,5963 0,5468 0,5563 0,5824 0,7952 0 0,6089 bình

Từ những số liệu thu được qua xử lý, nghiên cứu xác định được hệ số tương đồng

di truyền và xây đượng sơ đồ hình cây về quan hệ di truyền giữa 8 mẫu tảo. Hệ số tương

đồng di truyền trung bình của 8 mẫu tảo Chlorella là 0,6089. Hệ số khác biệt di truyền và

hệ số tương đồng di truyền liên hệ với nhau bằng công thức: Sxy = 1 – Dxy (Phạm Thị

Phương và ctv, 2019). Do đó, hệ số khác biệt di truyền trung bình là 0,3911. Khoảng cách

di truyền càng nhỏ thì hai mẫu càng tương đồng, ít khác biệt về mặt di truyền và đứng gần

nhau trong cây phát sinh loài.

Dựa vào kết quả ở bảng 3.10 cho thấy hệ số tương đồng di truyền của các mẫu tảo

Chlorella nằm trong khoảng từ 0,5172 - 0,8152, trong đó hệ số di truyền nhỏ nhất là 0,5172

giữa cặp mẫu BD-38 và TG-67, và hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,8152 giữa cặp

mẫu BD-38 và ĐT-51.

Hình 3.10. Cây phân nhóm di truyền của 8 mẫu tảo Chlorella

Cây di truyền được xây dựng bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 chia 8 mẫu tảo thành 4

nhóm (Hình 3.10) với hệ số tương đồng di truyền trung bình là 0,6089. Nhóm I là nhóm có

nhiều mẫu nhất gồm ba mẫu CG-20, BD-38 và ĐT-51 đều là chủng Chorella vulgaris với

hệ số tương đồng di truyền là 0,6204 - 0,8152. Nhóm II gồm hai mẫu ĐN-112 VÀ TG-65

cả 2 đều là Chlorella sp., với hệ số tương đồng di truyền là 0,7952. Nhóm III gồm hai

mẫu là BD-33 và LA-81 Chlorella sorokiniana, với hệ số tương đồng di truyền là 0,6087.

Nhóm IV chỉ có một mẫu là TG-67 (Chlorella sp.).

Trong nghiên cứu này, phản ứng PCR - ISSR được tiến hành với 18 primer và sau

đó chọn lọc được 14 primer cho kết quả băng đa hình tốt nhất , được thực hiện với 8 mẫu

tảo. Kết quả thu được, tổng cộng có 179 băng được tạo ra, trong đó có 175 băng đa hình

chiếm tỉ lệ 97,58% và 4 băng đồng hình chiếm tỉ lệ 2,42% tỷ lệ băng đa hình trong nghiên

cứu này cao hơn trong báo cáo của Shen (2008). Số băng trung bình cho mẫu tảo là 26

băng/mẫu, số băng/mồi là khoảng 13,14 băng/mồi. Sản phẩm khuếch đại có kích thước từ

200 – 4000 bp, là có khoảng dao động kích thước lớn hơn so với kết quả nghiên cứu của

Shen (2008) là 200 – 2500 bp. Giá trị trung bình khoảng cách di truyền của 8 mẫu tảo

Chlorella cao, cho thấy các mẫu tảo Chlorella có sự tương đồng cao về đặc điểm di truyền.

Tuy nhiên, sự biến thiên hệ số tương đồng giữa các mẫu tảo Chlorella phần nào nói lên sự

đa dạng di truyền và mối quan hệ di truyền của các mẫu tảo Chlorella được nghiên cứu.

Dựa vào cây phân nhóm di truyền ở hình 3.10 và hệ số tương đồng di truyền trrung bình là

0,6089 phân chia 8 mẫu tảo thành 4 nhóm. Cây phân nhóm di truyền được tính toán trên

nguyên tắc tìm các cặp đơn vị phân loại giúp giảm thiểu tổng chiều dài nhánh ở mỗi giai

đoạn nhóm, cây phân loại được tính toán bắt đầu từ một cây hình sao và được tạo ra với

giả định rằng không có sự phân cụm của các đối tượng. Chiều dài nhánh cũng như cấu trúc

liên kết của các đối tượng dựa trên khoảng cách ngắn nhất (parsimonious tree). Trong thực

tế, một số cặp đối tượng có mối quan hệ gần gũi với nhau hơn so với các cặp khác. Trong

cây phân nhóm, chỉ có một nhánh bên trong, XY, kết nối cặp đối tượng (1 và 2) và các đối

tượng khác (3, 4, ..., N) được kết nối bởi một nút đơn lẻ, Y. Bất kỳ cặp đối tượng nào cũng

có thể chiếm vị trí của 1 và 2 trong cây, và có N(N - 1)/2 cách để chọn chúng. Trong số các

cặp đối tượng có thể này, các cặp cho tổng chiều dài nhánh nhỏ nhất sẽ được chọn. Cặp

đối tượng này sau đó được coi là một nhóm đối tượng đơn lẻ, và cặp đối tượng tiếp theo

cho tổng chiều dài nhánh nhỏ nhất lại được chọn. Quy trình này được tiếp tục cho đến khi

tất cả N - 3 nhánh bên trong được tìm thấy. Thuật toán này được tích hợp trong phần mềm

NTSYSpc 2.1, thông qua công thức tính toán ma trận được đề xuất bởi Nei và Saitou (1987)

cho kết quả phân nhóm các mẫu Chlorella trong luận án này.

Nhóm I có số mẫu nhiều nhất là 3 mẫu gồm CG-20 (Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh),

BD-38 (Bình Dương), ĐT-51 (Đồng Tháp) với khoảng cách di truyền là 0,1848 – 0,3796

(hệ số tương đồng di truyền là 0,6204 - 0,8152). Trong đó, 2 mẫu BD-38 (Bình Dương),

ĐT-51 (Đồng Tháp) có hệ số tương đồng di truyền cao (0,8152), còn mẫu CG-20 (Cần Giờ

- Tp. Hồ Chí Minh) có sự khác biệt về di truyền cao hơn đối với 2 mẫu BD-38, ĐT-51.

Điều này chứng tỏ, các mẫu ở nhóm I có sự khác biệt lớn về mặt di truyền. Đây được xem

là nhóm có các mẫu có khoảng cách di truyền cao nhất giữa các mẫu. Trong đó, hệ số tương

đồng di truyền lớn nhất là 0,8152 giữa cặp mẫu BD-38 VÀ ĐT-51. Đặc điểm chung của 3

mẫu này đều là loài Chlorella vulgaris với mã truy vấn trên ngân hàng gen NCBI là MT

137382.1 và hình thái của các mẫu tảo ở nhóm này đều có dạng hình cầu, sống đơn lẻ và

màu xanh lục. Chủng CG-20 được phân lập ở Bờ Sông Cá Gấu, pH tại thời điểm thu mẫu

là 6,5. Chủng BD-38 được phân lập ở Hồ Dầu Tiếng và pH tại thời điểm thu mẫu 7,1. Đối

với ĐT-51 được phân lập tại Sông Đình Trung, pH tại thời điểm thu mẫu là 6,9.

Nhóm II có 2 mẫu ĐN-112 (Đồng Nai) và TG-65 (Tiền Giang) với khoảng cách di

truyền 0,2048 (hệ số tương đồng di truyền là 0,7952), điều này chứng tỏ hai mẫu có sự

tương đồng cao, khác biệt về mặt di truyền thấp. Đặc điểm chung của 2 mẫu này là đều là

Chlorella sp. với mã truy vấn trên ngân hàng gen NCBI là MN 879266.2 và ở nhóm này

có chung đặc điểm về mặt hình thái với nhóm I như dạng hình cầu, sống đơn lẻ, và màu

xanh lục nhưng lại khác nhau khi phân tích đa dạng di truyền. Chủng TG-65 được phân lập

ở Sông Trà, pH tại thời điểm thu mẫu là 7,1. Chủng ĐN-112 được phân lập ở Sông Đồng

Nai và pH tại thời điểm thu mẫu 6,5.

Nhóm III có 2 mẫu BD-33 (Bình Dương) và LA-81 (Long An) với khoảng cách di

truyền là 0,3913 (hệ số tương đồng di truyền là 0,6087). Đặc điểm chung của 2 mẫu này là

đều là loài Chlorella sorokiniana với mã truy vấn trên ngân hàng gen NCBI là MN

365023.1 và có sự tương đồng cao về kích thước hình thái của hai mẫu này và ở nhóm này

hai mẫu đều có kích thước khác biệt so với mẫu ở nhóm khác. Chủng BD-33 được phân

lập ở Hồ Cần Nôm, pH tại thời điểm thu mẫu là 7,5. Chủng LA-81 được phân lập ở vũng

nước ven đường và pH tại thời điểm thu mẫu 7,5.

Cuối cùng, nhóm IV chỉ có một mẫu TG-67 (Tiền Giang), và mẫu có kích thước nhỏ

hơn so với các mẫu khác, sự khác biệt này cũng phù hợp về sự khác biệt đa dạng di truyền

với các nhóm mẫu khác.

Trong tự nhiên, điều kiên tự nhiên, môi trường có sự tác động đến sự biểu hiện kiểu

hình, đặc điểm hình thái. Chlorella thường ở thể đơn bội, các đột biến có thể được phát

hiện và theo dõi chỉ trong vòng vài tháng nuôi cấy (Krasovec và ctv, 2018). Trình tự

genome của C. sorokiniana cho thấy có sự hiện diện khoảng 71 gen có liên quan đến giới

tính và giảm phân, 25 gen có liên quan đến tái tổ hợp tương đồng. Điều này cho thấy C.

sorokiniana có khả năng phân chia bằng cách giảm phân và tái tổ hợp tương đồng (Hovde

và ctv, 2018). Bên cạnh đó, hệ gen của C. sorokiniana có sự hiện diện các điểm hotspot,

các điểm này có vai trò trong quá trình sắp xếp lại và đảo ngược hệ gen (Wu và ctv, 2019).

Các trình tự từ chuỗi DNA có nguồn gốc từ virut cũng được phát hiện, có hơn 90.000 đoạn

trình tự có nguồn gốc từ virus được phát hiện trong bộ gen của tảo. Các đoạn trình tự này

được cho là có vai trò nhất định trong việc thích nghi của tảo với môi trường (Nelson và

ctv, 2021). Tất cả đều góp phần tạo nên sự đa dạng di truyền cao ở tảo Chlorella, điều này

giúp cho chúng có thể thích nghi tốt hơn với sự thay đổi của môi trường (Krasovec và ctv,

2018). Sự đa dạng di truyền cao ở trong quần thể là một lợi thế, vì điều này sẽ làm tăng

khả năng chịu đựng với các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Đồng thời, đây cũng là yếu

tố quan trọng để duy trì các chức năng sinh thái ở trong điều kiện môi trường khác nhau

(Sjöqvist và ctv, 2016). Tính đa dạng di truyền ở các chủng tảo C. sorokiniana khác nhau

có thể thấy qua các chủng chịu nhiệt, chịu nồng độ carbon dioxide cao và nitric oxide cao

(Varshney và ctv, 2018). Các chủng chịu nhiệt có thể thấy như C. sorokiniana

LWG002615, được phân lập từ suối nước nóng Jeori ở Ấn Độ (Dasgupta và ctv, 2020) và

UTEX 2085, được phát hiện phát triển ở nhiệt độ 40 – 42°C (Choi và ctv, 2019; De-Bashan

và ctv, 2008). C. sorokiniana CS-01, UTEX 2714 và UTEX 1230 (NIES-2169) khi được

nuôi cấy trong môi trường có nguồn gốc từ nước thải chăn nuôi, sinh khối tảo của 3 chủng

đều có sự khác biệt rõ rệt (Kobayashi và ctv, 2013). C. sorokiniana DOE1412 (UTEX

3016) được cho là chủng tảo có tiềm năng lớn để sản xuất nguyên liệu sinh học. Một số

SSR marker đặc hiệu đã được phát triển cho C. vulgaris và C. pyrenoidosa (Jo và ctv,

2014). Mười bảy marker SSR trên mười trong số mười hai nhiễm sắc thể của bộ gen C.

sorokiniana đã được phát triển và xác nhận trên tám chủng khác nhau (Sweiss và ctv,

2024). Tuy nhiên, một chủng nuôi cấy ở điều kiện thông thường, chủng còn lại được nuôi

cấy trong môi trường giàu ion đồng. Kết quả phân tích di truyền bằng chỉ thị ISSR cho thấy

có sự khác biệt đáng kể giữa 2 chủng với nhau. Chỉ số đa dạng di truyền trung bình Nei và

Shannon-Weiner là 0,391 và 0,5394 (Bodnar và ctv, 2021). Các ion Se4+, Zn2+ hay Cr3+

trong môi trường nuôi cấy ở nồng độ cao (10 mg/dm3; 5 mg/dm3; 5 mg/dm3) cũng được

ghi nhận có ảnh hưởng đến khoảng cách di truyền của C. vulgaris, trong điều kiện môi

trường thông thường và nuôi trong môi trường Se và Cr là 0,3 đối với nhóm nuôi trong Se

và Zn là 0,206. Đối với nhóm môi trường chỉ có Se là 0,232. Khoảng cách di truyền của 4

chủng vô tính C. vulgaris được ghi nhận từ 0,218 – 0,321 (Shen, 2008). Khoảng cách di

truyền của các chủng C. vulgaris (nhóm I) trong luận án cũng cho giá trị tương tự, nằm

trong khoảng từ 0,1848 - 0,3796 (1 - hệ số tương đồng di truyền là 0,6204 - 0,8152).

Trong các nghiên cứu phân tích khoảng cách di truyền trước đây cho thấy C. vulgaris

và C. sorokiniana có khoảng cách di truyền là 0,055 (Putri và ctv, 2023). Khoảng cách di

truyền giữa 2 nhóm I (C. vulgaris) và nhóm III (C. sorokiniana) từ 0,3804 đến 0,4588 (1

- hệ số tương đồng di truyền từ 0,5412 - 0.6196). Nguyên nhân dẫn đến khoảng cách di

truyền cao do trong nghiên cứu của Putri (2023) đánh giá dựa trên 1 marker phân tử duy

nhất để xây dựng mô hình tiến hóa. Trong nghiên cứu của Wong (2023) cho rằng chỉ dựa

vào 1 đoạn trình tự để xây dựng mô hình tiến hóa cho họ Chlorellaceae là chưa đủ.

Giá trị khoa học của kết quả thí nghiệm này nằm ở việc làm sáng tỏ mức độ đa dạng

di truyền cao của 8 chủng Chlorella bản địa tại miền Nam Việt Nam, một khu vực nhiệt

đới ít được nghiên cứu so với các vùng ôn đới. Hệ số tương đồng di truyền trung bình

0,6089 (khoảng cách di truyền 0,3911) cao hơn so với nghiên cứu của Shen (2008) trên C.

vulgaris (0,218–0,321), nhưng tương đồng với các nghiên cứu khác trên Chlorella trong

điều kiện môi trường thay đổi (Bodnar và ctv, 2021: 0,206–0,3). Sự khác biệt lớn trong

nhóm I (C. vulgaris), từ 0,1848 (BD-38 vs. ĐT-51) đến 0,3796 (CG-20 vs. BD-38), cho

thấy ngay cả trong cùng một loài, các chủng bản địa vẫn mang sự biến thiên di truyền đáng

kể, có thể do các yếu tố môi trường như đất ngập nước (CG-20) so với đồng bằng (BD-38,

ĐT-51).

So với nghiên cứu của Putri và cộng sự (2023) – ghi nhận khoảng cách di truyền giữa

C. vulgaris và C. sorokiniana là 0,055 dựa trên một marker duy nhất – nghiên cứu này cho

khoảng cách lớn hơn (0,3804–0,4588 giữa nhóm I và III), phản ánh độ nhạy cao của ISSR

trong phát hiện đa dạng trong loài (intraspecific diversity). Điều này phù hợp với nhận định

của Wong và cộng sự (2023) rằng một marker đơn lẻ không đủ để mô tả đầy đủ mối quan

hệ di truyền trong họ Chlorellaceae, khẳng định giá trị của ISSR như một công cụ bổ sung

nhạy hơn 18S rRNA, rbcL, hay ITS (mục 3.1.2). Việc TG-67 tách biệt thành nhóm IV, với

sự khác biệt di truyền lớn (hệ số thấp nhất 0,5172 với BD-38), gợi ý đây có thể là một biến

thể đặc hữu hoặc lai, cần nghiên cứu thêm để xác định danh tính và tiềm năng.

Về mặt thực tiễn, sự đa dạng di truyền cao giữa các chủng Chlorella là cơ sở để chọn

lọc cho các ứng dụng như xử lý nước thải và sản xuất biodiesel. Nhóm I (C. vulgaris: CG-

20, BD-38, ĐT-51) với sự biến thiên từ 0,1848–0,3796 có thể mang các đặc tính khác nhau

(ví dụ: CG-20 từ vùng đất ngập mặn Cần Giờ có thể chịu mặn tốt hơn), phù hợp với các

điều kiện môi trường cụ thể. Nhóm III (C. sorokiniana: BD-33, LA-81) với hệ số 0,6087

gần với các chủng chịu nhiệt hoặc thích nghi nước thải (Varshney và ctv, 2018; Kobayashi

và ctv, 2013), hứa hẹn ứng dụng trong môi trường khắc nghiệt. Nhóm II (ĐN-112, TG-65)

và nhóm IV (TG-67) với sự tương đồng cao hoặc tách biệt có thể mang đặc điểm độc đáo

(như tích lũy lipid hoặc sinh khối), cần nghiên cứu thêm để khai thác.

Sự đa dạng di truyền cao, như Krasovec và cộng sự (2018) chỉ ra, là lợi thế để

Chlorella thích nghi với môi trường thay đổi, phù hợp với mục tiêu của luận án trong việc

ứng dụng tảo bản địa. Ví dụ, C. sorokiniana chịu nhiệt (Dasgupta và ctv, 2020) hay thích

nghi nước thải (Kobayashi và ctv, 2013) đều cho thấy sự đa dạng trong loài, tương tự nhóm

III trong nghiên cứu này.

So với Shen (2008), nghiên cứu này đạt tỷ lệ đa hình cao hơn (97,58% vs. thấp hơn),

số băng/mẫu (26 vs. không ghi nhận) và kích thước băng rộng hơn (200–4000 bp vs. 200–

2500 bp), khẳng định sự đa dạng lớn hơn của Chlorella bản địa. So với Bodnar và cộng sự

(2021) (Nei 0,391, Shannon-Weiner 0,5394 trên C. vulgaris chịu ion kim loại), hệ số

khoảng cách di truyền trung bình 0,3911 trong nghiên cứu này tương đương, nhưng áp

dụng trên mẫu tự nhiên đa dạng hơn. Khoảng cách giữa C. vulgaris và C. sorokiniana

(0,3804–0,4588) cao hơn Putri và cộng sự (2023) (0,055), do ISSR nhạy hơn một marker

đơn lẻ, phù hợp với nhận định của Wong và cộng sự (2023) về nhu cầu đa marker trong

phân tích họ Chlorellaceae.

Phân tích đa dạng di truyền bằng ISSR cho thấy mức độ biến thiên cao (hệ số 0,5172–

0,8152, trung bình 0,6089) giữa 8 chủng Chlorella bản địa, chia thành 4 nhóm rõ rệt. So

với các nghiên cứu trước, công trình này nổi bật ở tỷ lệ đa hình cao, số băng phong phú và

ứng dụng trên mẫu tự nhiên, đóng góp dữ liệu mới về đa dạng tảo lục nhiệt đới, đồng thời

đặt nền móng cho chọn lọc chủng trong xử lý môi trường và năng lượng tái tạo. Kết quả

này không chỉ làm giàu hiểu biết khoa học mà còn khẳng định tiềm năng khai thác bền

vững nguồn tài nguyên tảo bản địa tại Việt Nam.

Điều này cho thấy sự đa dạng di truyền của các mẫu Chlorella từ khu vực phía Nam

Việt Nam không bị ảnh hưởng đáng kể bởi các yếu tố địa lý. Chỉ thị phân tử ISSR đã chứng

minh tính đa hình và tính ổn định cao, với hệ số khoảng cách di truyền là 0,3911và hệ số

tương đồng di truyền là là 0,6204. Những kết quả này chỉ ra một nền tảng di truyền tương

đối được bảo tồn giữa các mẫu mặc dù chúng được thu thập từ các địa điểm đa dạng. Sự

tương đồng di truyền được quan sát cho thấy quần thể Chlorella có thể đang thích nghi với

các áp lực môi trường chung, có khả năng liên quan đến biến đổi khí hậu. Khi các kiểu khí

hậu thay đổi, sự thích nghi di truyền ở vi tảo như Chlorella có thể tăng cường khả năng

phục hồi của chúng trước các tác nhân gây căng thẳng từ môi trường, bao gồm sự dao động

nhiệt độ và khả năng tiếp cận chất dinh dưỡng. Khả năng thích ứng này nhấn mạnh tiềm

năng của Chlorella trong ứng dụng nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, mặc dù các chỉ thị ISSR

đã đánh giá hiệu quả sự đa dạng di truyền, chúng không đủ để đánh giá các đặc điểm chức

năng của Chlorella liên quan đến xử lý nước thải và sản xuất lipid. Để hiểu đầy đủ tiềm

năng công nghệ sinh học của nó, các nghiên cứu trong tương lai nên tích hợp các phương

pháp phân tử nhắm mục tiêu vào các gen trao đổi chất quan trọng, chẳng hạn như các gen

mã hóa chất vận chuyển nitrate, nitrate reductase và chất vận chuyển ammonium.

3.3. Nội dung 3: Đánh giá khả năng ứng dụng các chủng tảo Chlorella vào xứ lý

nước thải

3.3.1. Khảo sát ngưỡng chịu đựng ammonium của Chlorella

Nghiên cứu được thực hiện với 8 chủng Chlorella gồm: ĐN-112, ĐT-51, BD-33, BD-

38, CG-20, LA-81, TG-65, TG67. Các chủng này được nuôi cấy ở môi trường BG-11 (loại

bỏ hoàn toàn các thành phần có chứa nitrogen) với các nồng độ ammonium khác nhau để

xác định nồng độ gây ức chế 50% tỷ lệ sinh trưởng đối với từng chủng tảo Chlorella.

Hình 3.13 thể hiện nồng độ ammonium ức chế 50% tỷ lệ sinh trưởng của các chủng

tảo Chlorella khảo sát. Nhìn chung, tỷ lệ ức chế sinh trưởng 50% của ammonium đối với

các chủng tảo Chlorella đều có sự khác biệt (với giá trị p = 0,05), các chủng tảo hầu hết

chỉ có thể chịu đựng ngưỡng ammonium trong khoảng 0,5-1 g/L. Nồng độ ammonium ức

chế 50% tỷ lệ sinh trưởng cao nhất ở chủng CG-20 là 1,19 ±0,01 g/L, nồng độ thấp nhất ở

chủng TG-67 đạt 0,53±0,03 g/L. Dựa vào nồng độ ammonium ức chế 50% tỷ lệ sinh trưởng

của tảo, có thể thấy chủng CG-20 là chủng có khả năng chịu đựng nồng độ ammonium cao

hơn các chủng còn lại.

Chủng Chlorella

Hình 3.11. Nồng độ ammonium có tỷ lệ ức chế sinh trưởng 50% đối với các chủng tảo

khảo sát

Trong nghiên cứu của Wang (2019), 10 chủng Chlorella dùng trong khảo sát cũng có

+ có thể ảnh hưởng tiêu

ngưỡng chịu đựng ammonium tương tự. Tuy nhiên, chủng FACHB-1535 và FACHB-1563

+ vượt quá khả năng hoạt động của của

có ngưỡng chịu đựng cao nhất có thể đạt khoảng 1,6 g/L. Ion NH4

cực đến hệ thống quang hợp II khi nồng độ NH4

enzyme GS và GOGAT (Glutamine Synthetase - GS) (Glutamate Synthase - GOGAT).

+ vượt quá ngưỡng xử lý của tảo, điều này sẽ dẫn

Enzyme này xúc tác cho quá trình tổng hợp glutamate từ 2 cơ chất chính là 2 oxoglutarate

+ để tạo thành glutamine. Nếu NH4

+ gây tổn hại đến Oxygen Evolving Center (trung tâm của phức hợp có

và NH4

- liên quan đến quá trình tách oxy ra khỏi phân tử nước) và khóa chuỗi truyền điện tử từ QA

+ khác nhau do

đến tình trạng NH4

đến QB ở hệ thống quang hợp II. Sự khác biệt về ngưỡng chịu đựng NH4

hoạt tính của enzyme GS và GOGAT của từng chủng quyết định (Wang và ctv, 2019).

Kết quả khảo sát cho thấy chủng Chlorella CG-20 là chủng có khả năng chịu đựng

+ cao nhất và chủng LA-81 là chủng có khả năng chịu đựng nồng độ NH4

nồng độ NH4

-) của 8 chủng tảo Chlorella bản

thấp nhất trong các chủng khảo sát.

Thí nghiệm khảo sát khả năng hấp thụ nitrate (NO3

địa (ĐN-112, ĐT-51, BD-33, BD-38, CG-20, LA-81, TG-65, TG-67) trong môi trường

BG-11 với nồng độ NO3- được điều chỉnh lên 1 g/L (1000 mg/L). Sau 24 giờ nuôi cấy,

theo phương pháp của Taziki và cộng sự (2005), kết quả được thể hiện trong hình 3.12,

cho thấy khả năng loại bỏ nitrate dao động từ 89,75 ± 2,1 mg/L/ngày (ĐN-112) đến 155,11

± 2,1 mg/L/ngày (CG-20). Chủng CG-20 (C. vulgaris) nổi bật với hiệu suất cao nhất, trong

khi ĐN-112 Chlorella sp.) có khả năng thấp nhất, phản ánh sự khác biệt đáng kể trong sinh

lý giữa các chủng tảo bản địa, một yếu tố quan trọng khi ứng dụng vào xử lý nước thải giàu

- của các chủng nằm trong khoảng 80–

nitrogen.

Hình 3.12 chỉ ra rằng khả năng hấp thụ NO3

150 mg/L/ngày, với CG-20 đạt mức cao nhất (155,11 ± 2,1 mg/L/ngày), vượt xa ĐN-112

(89,75 ± 2,1 mg/L/ngày). Sự biến thiên này có thể liên quan đến hiệu suất của các cơ chế

+ để tổng hợp protein và các hợp chất hữu cơ (Fernandez

đồng hóa nitrate trong tảo, bao gồm enzyme nitrate reductase (NR) và nitrite reductase

- thành NH4

(NiR), vốn chuyển NO3

và Galvan, 2007). Chủng CG-20, với khả năng hấp thụ cao, cho thấy hoạt tính enzyme

+ là sản phẩm trung gian của quá trình giảm nitrate. Ngược lại, ĐN-112

NR/NiR hiệu quả hơn, phù hợp với ngưỡng chịu đựng ammonium cao của nó (1,19 g/L,

mục 3.3.1), vì NH4

có thể bị hạn chế bởi tốc độ chuyển hóa nitrate hoặc khả năng thích nghi với nồng độ NO3

cao.

So sánh với nghiên cứu của Taziki và cộng sự (2005), trong đó Chlorella đạt khả

- ban đầu 2000 mg/L và ánh sáng tự nhiên, kết quả của CG-20 (155,11 mg/L/ngày)

năng loại bỏ nitrate tối ưu 395 mg/L/ngày trong hệ thống quang sinh học gỗ với nồng độ

NO3

- thấp hơn (1000 mg/L) và không tối ưu hóa ánh sáng hay cấu trúc hệ

thấp hơn đáng kể. Tuy nhiên, sự khác biệt này có thể do điều kiện thử nghiệm: luận án sử

dụng nồng độ NO3

thống như Taziki. Khi so với các phương pháp xử lý nitrate khác, như gỗ dăm (0,62–16

mg/L/ngày, Jaynes và ctv, 2008; Robertson và ctv, 2009; Schipper và ctv, 2005) hoặc tảo

cố định trong agar (16 mg/L/ngày, Mollamohammada và ctv, 2020), CG-20 vượt trội hơn

hẳn, cho thấy tiềm năng vượt xa các giải pháp sinh học thông thường.

Giá trị khoa học của kết quả thí nghiệm này nằm ở việc cung cấp dữ liệu mới về khả

năng loại bỏ nitrate của các chủng Chlorella bản địa tại miền Nam Việt Nam, một khu vực

với nước thải giàu nitrogen từ nông nghiệp và đô thị hóa. Sự khác biệt giữa CG-20 (155,11

mg/L/ngày) và ĐN-112 (89,75 mg/L/ngày) làm sáng tỏ tính đa dạng sinh lý trong chi

Chlorella, bổ sung vào hiểu biết về cơ chế đồng hóa nitrate của tảo lục trong điều kiện thực

tế. Kết quả này củng cố mối liên hệ giữa khả năng hấp thụ nitrate và chịu đựng ammonium

+ → glutamine).

(mục 3.3.1), khi CG-20 dẫn đầu ở cả hai chỉ số, cho thấy sự phối hợp hiệu quả giữa các

- → NH4

con đường trao đổi nitrogen (NO3

So với Taziki và cộng sự (2005), nghiên cứu này nổi bật ở việc khảo sát trên các

chủng tự nhiên, không qua tối ưu hóa hệ thống, phản ánh khả năng thích nghi thực tế hơn

là hiệu suất tối đa trong điều kiện lý tưởng. Khi đặt cạnh Mollamohammada và cộng sự

(2020) – với C. sorokiniana và Scenedesmus sp. đạt 16 mg/L/ngày trong agar – CG-20

(155,11 mg/L/ngày) cao gấp gần 10 lần, chứng minh lợi thế của các chủng bản địa Việt

Nam trong ứng dụng không cần cố định phức tạp. Sự khác biệt này có thể liên quan đến

nguồn gốc của CG-20 (đất ngập mặn Cần Giờ), nơi áp lực chọn lọc tự nhiên ưu tiên khả

năng xử lý nitrogen cao.

-, như nước thải từ chăn nuôi hoặc

Về mặt thực tiễn, khả năng hấp thụ nitrate của CG-20 (155,11 mg/L/ngày) là cơ sở

quan trọng để ứng dụng trong xử lý nước thải giàu NO3

công nghiệp tại Việt Nam. Với nồng độ nitrate trong nước thải thực tế thường dao động từ

vài trăm đến hơn 1000 mg/L (như tại chợ Hóc Môn, phần 3.4), CG-20 có thể loại bỏ một

lượng đáng kể nitrogen trong 24 giờ, giảm thiểu ô nhiễm eutrophication mà không cần hệ

thống phức tạp như gỗ dăm hay cố định agar. Hơn nữa, nitrate hấp thụ được chuyển hóa

thành sinh khối tảo, mở ra tiềm năng sản xuất nguyên liệu sinh học hoặc thức ăn chăn nuôi

từ nước thải, tăng tính kinh tế và bền vững của quá trình xử lý.

Các chủng khác như ĐT-51, BD-38 (C. vulgaris) hoặc BD-33, LA-81 (C.

sorokiniana), với khả năng 80–150 mg/L/ngày, cũng có thể được sử dụng trong các hệ

thống hỗn hợp để tối ưu hóa hiệu suất, đặc biệt khi kết hợp với CG-20 trong điều kiện

nitrate biến động. Ngược lại, ĐN-112 (89,75 mg/L/ngày) phù hợp hơn với nước thải có

nồng độ thấp, tránh lãng phí tiềm năng của các chủng mạnh hơn.

So với Taziki và cộng sự (2005) (395 mg/L/ngày), CG-20 đạt hiệu suất thấp hơn,

nhưng điều kiện thử nghiệm đơn giản hơn (không cần hệ thống gỗ, ánh sáng tự nhiên) cho

thấy khả năng ứng dụng thực tế cao hơn trong bối cảnh Việt Nam, nơi cơ sở hạ tầng xử lý

còn hạn chế. Khi so với gỗ dăm (0,62–16 mg/L/ngày) hoặc tảo cố định (16 mg/L/ngày),

CG-20 vượt trội về tốc độ và hiệu quả, khẳng định lợi thế của giải pháp sinh học dựa trên

- 1000

tảo bản địa. Nghiên cứu của Fernandez và Galvan (2007) về cơ chế đồng hóa nitrate cũng

được củng cố bởi kết quả này, khi CG-20 duy trì hiệu suất cao trong môi trường NO3

mg/L, cho thấy hoạt tính NR/NiR vượt trội so với ĐN-112.

Khảo sát khả năng loại bỏ nitrate cho thấy CG-20 (C. vulgaris) dẫn đầu với 155,11

mg/L/ngày, vượt xa ĐN-112 (89,75 mg/L/ngày) và các giải pháp sinh học khác, khẳng định

tiềm năng của các chủng bản địa trong xử lý nước thải giàu nitrogen. So với các nghiên

cứu trước, công trình này đóng góp dữ liệu mới về hiệu suất thực tế của Chlorella bản địa,

vượt qua giới hạn của hệ thống tối ưu hóa bằng cách khảo sát trong điều kiện đơn giản,

đồng thời làm sáng tỏ sự đa dạng sinh lý giữa các chủng. Kết quả này đặt nền móng cho

ứng dụng CG-20 trong xử lý môi trường và sản xuất sinh khối, góp phần khai thác bền

vững nguồn tài nguyên tảo tại Việt Nam.

3.3.2. Khảo sát khả năng loại bỏ nitrate của Chlorella.

- được nâng lên

Các chủng Chlorella gồm: ĐN-112, ĐT-51, BD-33, BD-38, CG-20, LA-81, TG-65

- hấp thụ của các

và TG-67 được tiến hành nuôi cấy trên môi trường BG-11 (nồng độ NO3

thành 1 g/L). Sau 24 giờ nuôi cấy (Taziki và ctv, 2005), hàm lượng NO3

chủng được thể hiện ở hình 3.12.

Chủng Chlorella

- ở các chủng tảo đều dao động trong khoảng 80

Hình 3.12. Khả năng hấp thụ nitrate của các chủng tảo khảo sát

- cao nhất là chủng

Nhìn chung, khả năng hấp thụ NO3

mg/L/ngày đến 150 mg/L/ngày. Chủng có khả năng hấp thụ NO3

- thấp nhất (89,75 ±2,1 mg/L/ngày).

Chlorella CG-20 (155,11 ±2,1 mg/L/ngày). Chủng Chlorella ĐN-112 là chủng có khả năng

hấp thụ NO3

Trong nghiên cứu của Taziki (2005) cho thấy khả năng loại bỏ nitrate tối ưu của tảo

Chlorella có thể đạt 395 mg/L/ngày trong hệ thống quang sinh học làm bằng gỗ với nguồn

ánh sáng tự nhiên. Các nghiên cứu ứng dụng gỗ dăm để loại bỏ nitrate thông thường đạt

0,62 mg/L/ngày (Jaynes và ctv, 2008), khoảng 2 - 16 mg/L/ngày (Robertson và ctv, 2009)

hoặc 1,4 mg/L/ngày (Schipper và ctv, 2005). Chủng tảo Chlorella sorokiniana và

Scenedesmus sp. (Mollamohammada và ctv, 2020) được nuôi cấy cố định ở trong các hạt

agar cho thấy có khả năng hấp thụ nitrate ở mức 16 mg/L/ngày. Chủng Chlorella CG-20

trong nghiên cứu này có khả năng hấp thu nitrate cao hơn khi so với các nghiên cứu khác.

Tuy nhiên, kết quả hấp thu nitrate của chủng tảo này thấp hơn so với nghiên cứu của Taziki

(2005). Nồng độ nitrate trong môi trường thử nghiệm của Taziki là 2000 mg/L, còn trong

luận án chỉ 1000 mg/L. Ngoài ra, kết quả hấp thụ nitrate ở mức 395 mg/L/ngày là kết quả

của nghiên cứu tối ưu các điều kiện xử lý nitrate.

Dựa trên kết quả vượt trội của chủng Chlorella CG-20 về khả năng chịu đựng

ammonium (1,19 g/L, mục 3.3.1) và hấp thụ nitrate (155,11 mg/L/ngày, mục 3.3.2), nghiên

cứu xác định đây là chủng tiềm năng nhất để ứng dụng trong xử lý nước thải sinh hoạt. Tuy

nhiên, để triển khai thực tế, cần một lượng lớn sinh khối tảo ban đầu, do đó thí nghiệm

khảo sát các môi trường nuôi cấy (BBM, HAMGM, LC Oligo, BG-11) nhằm tối ưu hóa

sinh trưởng và sản lượng sinh khối khô của CG-20. Kết quả từ hình 3.13 (hàm lượng

chlorophyll a) và hình 3.14 (sinh khối khô) sau 14 ngày nuôi cấy cho thấy môi trường BBM

và HAMGM là tối ưu, cung cấp cơ sở quan trọng để mở rộng ứng dụng CG-20 trong xử lý

nước thải và sản xuất sinh khối.

Hàm lượng chlorophyll a (hình 3.13): Sau 14 ngày, hàm lượng chlorophyll a trong

sinh khối khô của CG-20 dao động quanh 32,92–37,45 mg/g, với BBM đạt cao nhất (37,45

± 0,06 mg/g), tiếp theo là HAMGM (36,19 ± 0,05 mg/g) và thấp nhất ở LC Oligo (32,92 ±

0,02 mg/g). Mức chlorophyll a ổn định từ ngày 12 (37 mg/g) đến ngày 14 cho thấy CG-20

duy trì hoạt động quang hợp hiệu quả trong suốt giai đoạn nuôi cấy. So với nghiên cứu của

Kong và cộng sự (2011), trong đó C. vulgaris đạt 27,99 ± 1,4 mg/g ở điều kiện quang tự

dưỡng, CG-20 có hàm lượng cao hơn (36–37 mg/g), cho thấy khả năng tích lũy chất diệp

lục vượt trội trong môi trường giàu dinh dưỡng như BBM và HAMGM. Sự ổn định này

trái ngược với xu hướng giảm chlorophyll a trong môi trường thiếu nitrogen (Kong và ctv,

2011), xác nhận rằng các môi trường thử nghiệm cung cấp đủ nitrogen để duy trì sinh

trưởng mà không chuyển sang tích lũy lipid.

Sinh khối khô (hình 3.14): Sinh khối khô của CG-20 tăng đều qua 14 ngày, đạt mức

cao nhất ở BBM (4,6 ± 0,08 g/L) và HAMGM (4,56 ± 0,08 g/L), trong khi LC Oligo thấp

nhất (2,29 ± 0,04 g/L) và BG-11 đạt 2,64 g/L. Tất cả môi trường đều cho sinh khối trên 2

g/L, vượt trội so với các nghiên cứu trước như Yoo và cộng sự (2010) (1,46 g/L) và Mujtaba

và cộng sự (2012) (1,9 g/L) trong BG-11, nhưng thấp hơn Vaičiulytė và cộng sự (2014)

(2,8 g/L) do sử dụng hệ thống bán liên tục với ánh sáng và CO2 tối ưu. Sự khác biệt này có

thể do điều kiện nuôi cấy trong nghiên cứu này (hệ thống tĩnh, không bổ sung CO2) chưa

đạt tối ưu, nhưng vẫn cho thấy tiềm năng sinh trưởng mạnh mẽ của CG-20 trong môi trường

đơn giản.

Giá trị khoa học của kết quả thí nghiệm này nằm ở việc xác định môi trường nuôi cấy

tối ưu cho chủng Chlorella CG-20 bản địa, bổ sung dữ liệu mới về sinh trưởng và tích lũy

sinh khối của C. vulgaris trong điều kiện nhiệt đới tại Việt Nam. Hàm lượng chlorophyll a

cao (37,45 mg/g ở BBM) và sinh khối khô vượt trội (4,6 g/L ở BBM, 4,56 g/L ở HAMGM)

cho thấy CG-20 không chỉ duy trì quang hợp hiệu quả mà còn đạt năng suất sinh khối cao,

vượt xa các nghiên cứu điển hình như Yoo (2010) và Mujtaba (2012). Điều này khẳng định

khả năng thích nghi của CG-20 với các môi trường giàu dinh dưỡng, một đặc tính quan

trọng để sản xuất sinh khối phục vụ xử lý nước thải.

So với Kong và cộng sự (2011), nghiên cứu này không ghi nhận xu hướng giảm

chlorophyll a hay tăng lipid như trong điều kiện thiếu nitrogen, cho thấy các môi trường

thử nghiệm (BBM, HAMGM) cung cấp đủ nitrogen để ưu tiên sinh trưởng thay vì tích lũy

lipid. Tuy nhiên, các nghiên cứu như Xiong và cộng sự (2008) (55,2% lipid ở C.

protothecoides) hay Illman và cộng sự (2000) (14,9 mg/L/ngày lipid) gợi ý rằng CG-20 có

thể đạt năng suất lipid cao hơn nếu điều chỉnh môi trường thiếu nitrogen, một hướng nghiên

cứu tiềm năng trong tương lai. Kết quả sinh khối khô 4,6 g/L cũng cao hơn nhiều so với

các chủng tiêu chuẩn trong điều kiện cơ bản (Yoo: 1,46 g/L), làm phong phú dữ liệu về

năng suất Chlorella bản địa.

Về mặt thực tiễn, việc xác định BBM và HAMGM là môi trường tối ưu cho CG-20

mở ra khả năng sản xuất sinh khối quy mô lớn để xử lý nước thải sinh hoạt, đặc biệt tại các

khu vực như Đồng bằng sông Cửu Long, nơi nước thải giàu nitrogen từ nông nghiệp và đô

thị hóa đòi hỏi giải pháp hiệu quả. Sinh khối khô 4,6 g/L từ BBM không chỉ đủ để cung

cấp lượng tảo ban đầu cho xử lý nước thải mà còn có thể tái sử dụng để sản xuất phân bón,

thức ăn chăn nuôi, hoặc nhiên liệu sinh học, tăng tính kinh tế của quy trình. Môi trường

HAMGM (4,56 g/L) cũng là lựa chọn thay thế khả thi, đặc biệt khi cân nhắc chi phí và tính

sẵn có của các thành phần dinh dưỡng.

So với LC Oligo (2,29 g/L) và BG-11 (2,64 g/L), BBM và HAMGM vượt trội hơn,

nhưng BG-11 vẫn khả thi trong điều kiện hạn chế tài nguyên, với sinh khối cao hơn Yoo

(1,46 g/L) và Mujtaba (1,9 g/L). Sự khác biệt thấp hơn so với Vaičiulytė (2,8 g/L) do hệ

thống bán liên tục của họ bổ sung CO2 và ánh sáng tối ưu, gợi ý rằng CG-20 có thể đạt

năng suất cao hơn nếu cải tiến điều kiện nuôi cấy (ví dụ: bổ sung CO2, hệ thống quang sinh

học), một hướng ứng dụng thực tế trong tương lai.

So với Vaičiulytė và cộng sự (2014) (2,8 g/L), sinh khối khô của CG-20 trong BBM

(4,6 g/L) và HAMGM (4,56 g/L) cao hơn đáng kể, cho thấy tiềm năng vượt trội của chủng

bản địa trong môi trường cơ bản mà không cần hệ thống phức tạp. Khi so với Yoo (1,46

g/L) và Mujtaba (1,9 g/L) trong BG-11, CG-20 (2,64 g/L) cũng tốt hơn, khẳng định khả

năng sinh trưởng mạnh mẽ của chủng này. Nghiên cứu của Kong (2011) về chlorophyll a

(27,99 mg/g) và xu hướng chuyển hóa lipid trong môi trường thiếu nitrogen được củng cố

bởi kết quả ổn định của CG-20, nhưng hàm lượng cao hơn (37,45 mg/g) cho thấy CG-20

có lợi thế trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ.

Khảo sát môi trường nuôi cấy xác định BBM (4,6 g/L) và HAMGM (4,56 g/L) là tối

ưu cho CG-20, với hàm lượng chlorophyll a cao (37,45 mg/g) và sinh khối vượt trội, khẳng

định tiềm năng của chủng này trong sản xuất sinh khối phục vụ xử lý nước thải. So với các

nghiên cứu trước, công trình này đóng góp dữ liệu mới về năng suất Chlorella bản địa

trong điều kiện nhiệt đới, vượt qua các kết quả tiêu chuẩn bằng cách sử dụng môi trường

đơn giản, đồng thời đặt nền móng cho ứng dụng thực tiễn và cải tiến nuôi cấy trong tương

lai. Kết quả này không chỉ làm giàu hiểu biết khoa học mà còn thúc đẩy khai thác bền vững

nguồn tài nguyên tảo tại Việt Nam.

+, chủng

3.3.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy tảo Chlorella.

- và khả năng chịu đựng NH4

Dựa kết quả khảo sát khả năng hấp thụ NO3

Chlorella CG-20 là chủng có tiềm năng cao nhất để ứng dụng vào trong xử lý nước thải

sinh hoạt. Tuy nhiên, ứng dụng vi tảo để xử lý nước thải đòi hỏi phải có một lượng lớn sinh

khối tảo ban đầu, do đó nghiên cứu tiến hành khảo sát các môi trường nuôi cấy thích hợp

cho chủng tảo Chlorella CG-20, nhằm thu được lượng lớn sinh khối tảo.

Hình 3.13. Hàm lượng chlorophyll a của tảo Chlorella được nuôi cấy ở các môi trường

khác nhau

Hình 3.13 cho thấy hàm lượng chlorophyll a có trong sinh khối khô tảo Chlorella

CG-20 trong vòng 14 ngày nuôi cấy. Nhìn chung, hàm lượng chlorophyll a trong 12 ngày

nuôi cấy đều dao động khoảng 37 mg/g. Hàm lượng chlorophyll a trong sinh khối khô ở

môi trường BBM đạt 37,28 ±0,01 mg/g (ngày 12) và 37,45 ±0,06 mg/g (ngày 14). Hàm

lượng chlorophyll a trong sinh khối khô ở môi trường HAMGM đạt 36,55 ±0,12 mg/g

(ngày 12) và 36,19 ±0,05 mg/g (ngày 14). Hàm lượng chlorophyll a trong sinh khối khô ở

môi trường LC Oligo đạt 33,95 ±0,05 mg/g (ngày 12) và 32,92 ±0,02 mg/g (ngày 14).

Hàm lượng chlorophyll a của tảo Chlorella vulgaris trong nghiên cứu của Kong

(2011) có kết quả tương tự với nghiên cứu này, hàm lượng chlorophyll a của tảo khi nuôi

cấy ở điều kiện quang tự dưỡng đạt 27,99 ±1,4 mg/g. Trong nghiên cứu của Kong cũng

cho thấy trong môi trường thiếu hụt nguồn nitrogen, hàm lượng chlorophyll a của tảo có

xu hướng giảm và hàm lượng lipid tăng (Kong và ctv, 2011). Một số nghiên cứu cho thấy

Chlorella có thể tích lũy lipid lên đến 32% (Aguoru và Okibe, 2015). Chủng C.

protothecoides có thể đạt hàm lượng lipid lên đến 55,2%, năng suất sản xuất lipid đạt 1.210

mg/L/ngày (Xiong và ctv, 2008). Năng suất sản xuất lipid của tảo trong nghiên cứu Illman

(2000) có thể đạt 14,9 mg/L/ngày. Vi tảo trong môi trường thiếu hụt nitrogen, quá trình

sinh dưỡng của tảo sẽ chuyển sang dạng tích lũy lipid và hàm lượng chlorophyll a có xu

hướng giảm dần. Ngoài ra, khi môi trường thiếu hụt nitrogen, lipid được tổng hợp chủ yếu

ở dạng neutral lipid (Ma và ctv, 2016). Chlorella pyrenoidosa được nuôi cấy trong môi

trường dinh dưỡng đầy đủ sẽ có hàm lượng acid béo không no cao hơn khi ở điều kiện

hoàn cảnh bất lợi (Dong và ctv, 2020). Do đó, nghiên cứu chỉ thực hiện theo dõi và khảo

sát sinh khối khô các chủng tảo đến ngày thứ 14.

Hình 3.14. Sinh khối khô của Chlorella CG-20 nuôi cấy ở các môi trường khác nhau

Hình 3.14 cho thấy kết quả sinh khối khô của chủng Chlorella CG-20 khi được nuôi

cấy trên các môi trường khác nhau trong vòng 14 ngày. Nhìn chung, sinh khối khô của tảo

đều tăng dần theo thời gian và sinh khối khô vào ngày thứ 14 đều cao trên 2 g/L. Kết quả

sinh khối khô cao nhất thu được là ở môi trường HAMGM (4,56 ±0,08 g/L) và BBM (4,6

±0,08 g/L). Kết quả sinh khối khô thấp nhất ở môi trường LC Oligo (2,29 ±0,04 g/L).

Chủng tảo Chlorella CG-20 có thể sinh trưởng tốt ở các môi trường khảo sát tất cả đều đạt

sinh khối khô cao trên 2 g/L.

Đối với môi trường BG-11, kết quả trong nghiên cứu này (2,64 g/L) cho thấy cao hơn

các nghiên cứu trước đây đã công bố của Yoo (2010) (1,46 g/L) và Mujtaba (2012) (1,9

g/L). Tuy nhiên, sinh khối khô trong nghiên cứu này thấp hơn công bố của Vaičiulytė

(2014) (2,8 g/L). Nguyên nhân dẫn đến kết quả thấp hơn, có thể do phương pháp nuôi cấy

ảnh hưởng, hệ thống nuôi cấy trong công bố của Vaičiulytė là hệ thống nuôi cấy bán liên

tục (hệ thống quang sinh học hình trụ - cylindrical glass). Môi trường được thay mới lên

đến 50%, bên cạnh đó các yếu tố điều kiện chiếu sáng và mức độ bổ sung CO2 là yếu tố

dẫn đến sự khác biệt.

Dựa trên kết quả vượt trội của chủng Chlorella CG-20 về khả năng chịu đựng

ammonium (1,19 g/L, mục 3.3.1) và hấp thụ nitrate (155,11 mg/L/ngày, mục 3.3.2), nghiên

cứu xác định đây là chủng tiềm năng nhất để ứng dụng trong xử lý nước thải sinh hoạt. Tuy

nhiên, để triển khai thực tế, cần một lượng lớn sinh khối tảo ban đầu, do đó thí nghiệm

khảo sát các môi trường nuôi cấy (BBM, HAMGM, LC Oligo, BG-11) nhằm tối ưu hóa

sinh trưởng và sản lượng sinh khối khô của CG-20. Kết quả từ Hình 3.13 (hàm lượng

chlorophyll a) và Hình 3.14 (sinh khối khô) sau 14 ngày nuôi cấy cho thấy môi trường

BBM và HAMGM là tối ưu, cung cấp cơ sở quan trọng để mở rộng ứng dụng CG-20 trong

xử lý nước thải và sản xuất sinh khối.