Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2024. ISBN: 978-604-82-8175-5
532
ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS R1
PHÂN LẬP TỪ RƠM CÓ HOẠT TÍNH PHÂN HUỶ HUYẾT KHỐI
Trịnh Đình Khá, Vũ Minh Tiến, Nguyễn Thị Lành, Đỗ Đức Cảnh
Trường Đại học Thuỷ lợi, email: trinhdinhkha@tlu.edu.vn
1. GIỚI THIỆU CHUNG
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) hằng
năm có khoảng 18,6 triệu người tử vong liên
quan đến bệnh tim mạch, trong đó đột quỵ là
nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và gây tàn
phế ở các nước đang phát triển. Ở Việt Nam,
theo thống kê của Bộ Y tế có khoảng 200.000
người bị đột quỵ mỗi năm Trong các dạng đột
quỵ thì có 85% nguyên nhân là do huyết khối
[1]. Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn
Gram dương đã được phát hiện trong sản
phẩm natto lên men truyền thống từ đậu tương
ở Nhật Bản năm 1980 bởi Sumi Hyroiuki. Vi
khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp ra nhiều
loại enzyme có ý nghĩa trong công nghiệp,
nông nghiệp và y học. Đặc biệt, Bacillus
subtilis có khả năng sinh tổng hợp enzyme
nattokinase có khả năng làm tan huyết khối
trong cơ thể từ đó tạo các sản phẩm hỗ trợ
người bị đột quỵ do huyết khối [5].
Bacillus subtilis phân bố ở nhiều môi trường
khác nhau như: đất, nước, thực phẩm, thực
vật,... trong đó rơm khô là một môi trường có
sự phân bố nhiều các chủng Bacillus subtilis.
Trong lịch sử phát hiện và hình thành món
natto truyền thống của Nhật Bản cũng xuất
phát từ việc phát hiện các hạt đậu tương luộc
rơi vãi trong các bó rơm được lên men [5]. Việt
Nam là quốc gia có nhiều rơm từ nền nông
nghiệp trồng lúa nước nên rất có thể có sự phân
bố đa dạng các loài Bacillus subtilis trong rơm
có hoạt tính sinh học tốt. Vì vậy, rơm là nguồn
vật liệu tốt để phân lập các chủng vi khuẩn này.
Trong nghiên cứu này trình bày kết quả định
danh chủng Bacillus subtilis R1 có hoạt tính
phân huỷ huyết khối phân lập từ rơm khô.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Chủng vi khuẩn R1 phân lập từ mẫu rơm
khô thu thập tại Huyện Đông Anh, Tp. Hà
Nội năm 2021 được cung cấp bởi phòng thí
nghiệm Công nghệ sinh học - Trường Đại
học Thuỷ lợi.
Chủng vi khuẩn Bacillus natto được cung
cấp bởi công ty Kawashimaya-Nhật Bản làm
đối chứng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái:
Chủng vi khuẩn R1 được nuôi cấy trên
môi trường LB thạch đĩa để quan sát, mô tả
đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào
và nhuộm Gram theo phương pháp mổ tả
trong tài liệu của Nguyễn Thị Minh Đức [2].
Phương pháp xác định khả năng phân huỷ
casein và phân huỷ máu đông:
Chủng vi khuẩn R1 và chủng đối chứng
cùng được nuôi cấy trên môi trường MPA dịch
thể trong 24h ở 37C, lắc 150 vòng/phút với
lượng tiếp giống như nhau. Dịch lên men được
ly tâm loại bỏ sinh khối và lọc qua màng lọc
0,2µm. Sau đó 100µl dịch lên men nhỏ giếng
thử phân huỷ casein và đĩa máu đông. Tiến
hành ủ 24h ở 37C sau đó quan sát sự phân
huỷ máu đông; quan sát sự phân huỷ casein
bằng cách nhuộm Commasie Briant Blue.
Phương pháp xác định khả năng hoà tan
tan huyết khối:
Cân 2 g huyết heo tươi cho vào ống
nghiệm, bổ sung thêm 2 mL dịch lên men vi
khuẩn R1 và chủng đối chứng thu được ở
trên vào ống nghiệm. Ủ ở 37C, sau 2 giờ và
Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2024. ISBN: 978-604-82-8175-5
533
4 giờ, cân lại khối lượng khối huyết còn lại
và tính tỷ lệ hòa tan huyết khối. Mỗi thí
nghiệm lặp lại ba lần [3].
Phương pháp định danh chủng vi khuẩn
R1 bằng chỉ thị gen 16S-rRNA:
DNA chủng R1 được tách chiết theo
phương pháp mô tả của Sambrook and
Russell, [4].
Chủng R1 đã được định danh dựa vào chỉ
thị gen 16S-rRNA theo phương pháp đã được
mô tả trong tài liệu của Trương Quang Vinh
và công sự [6].
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đặc điểm hình thái chủng R1
Kết quả phân tích đặc điểm hình thái
chủng R1 cho thấy chủng R1 có khuẩn lạc
màu trắng sữa, khô, bề mặt không nhăn, mép
có răng cưa. Tế bào chủng R1 có hình que, là
vi khuẩn thuộc nhóm Gram dương (Hình 1).
a b
Hình 1. Hình thái khuẩn lạc (a) và hình thái
tế bào (b) của chủng vi khuẩn R1
3.2. Kết quả xác định hoạt tính phân
huỷ casein và phân huỷ máu đông
Hoạt tính phân huỷ casein và phân huỷ máu
đông đã được xác định theo phương pháp đã
mô tả. Kết quả cho thấy dịch lên men ngoại
bào của chủng R1 có hoạt tính phân huỷ casein
và phân huỷ máu đông. Khi so sánh với chủng
Bacillus natto của Nhật Bản thì hoạt tính phân
huỷ casein và phân huỷ máu đông của chủng
R1 có vòng phân huỷ cao hơn (Hình 2).
a b
Hình 3. Hoạt tính phân huỷ casein (a) và
hoạt tính phân huỷ máu đông (b) của chủng R1
ĐC: Chủng Bacillus natto đối chứng; 1:
Chủng vi khuẩn R1.
3.3. Khả năng hoà tan huyết khối của
dịch lên men chủng R1
Kết quả xác định cho thấy dịch lên men
chủng vi khuẩn R1 có khả năng hoà tan huyết
khối. Khi so sánh với chủng Bacillus natto
của Nhật Bản thì chủng R1 có khả năng hoà
tan huyết khối cao hơn (Bảng 1).
Bảng 1. Khả năng hoà tan huyết khối
của dịch lên men chủng vi khuẩn R1
Mẫu dịch lên men % Hòa tan huyết khối
ĐC 13,87±1,1
R1 16,81±1,3
ĐC: Chủng Bacillus natto đối chứng; R1:
Chủng vi khuẩn R1.
3.4. Định danh chủng vi khuẩn R1
DNA tổng số của chủng R1 được tách
chiết theo phương pháp đã mô tả. Kết quả
điện di trên gel agarose cho thấy DNA không
bị đứt gãy, có thể dùng cho các nghiên cứu
về khuếch đại gene 16S-rRNA bằng PCR
(Hình 4a).
Sử dụng PCR với cặp mồi 27F/1492R đã
khuếch đại được đoạn DNA đặc hiệu có kích
thước khoảng gần 1500 bp (Hình 4b). Kích
thước của đoạn gene nhân bản được phù hợp
với tính toán lý thuyết. Sản phẩm PCR được
tinh sạch để đọc trình tự nucleotide.
a b
Hình 4. Hình ảnh điện di DNA tổng số (a)
và sản phẩm PCR (b) của chủng R1
M: Thang chuẩn 1 kb (GeneRuler 1 kb plus
DNA ladder); 1: Chủng R1; ĐC-: Đối chứng âm
không có khuôn DNA; ĐC+: Đối chứng dương
sản phẩm PCR gen 16S-rRNA
Kết quả giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm
PCR cho thấy đoạn gen mã hóa 16S-rRNA
của chủng R1 có chiều dài 1328 nucleotide.
Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2024. ISBN: 978-604-82-8175-5
534
So sánh trình tự nucleotide của chủng R1 với
các trình tự đã công bố trên Genbank cho
thấy có độ tương đồng cao với các chủng B.
subtilis. Trong đó, tương đồng 99,92% so với
trình tự gen 16S-rRNA của Bacillus subtilis
có số đăng ký trên Genbank là OP954413.1
(Hình 5). Chủng R1 được đặt tên là Bacillus
subtilis R1.
Hình 5. Hình ảnh so sánh độ tương đồng
trình tự nucleotide gen 16S-rRNA chủng R1
với các chủng trên Genbank
4. KẾT LUẬN
Đã xác định được đặc điểm hình thái
khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng vi
khuẩn R1 phân lập từ mẫu rơm. Chủng R1
được xác định là loài Bacillus subtilis dựa
vào trình tự gen 16S-rRNA và được đặt tên là
Bacillus subtilis R1. Chủng vi khuẩn R1 có
khả năng phân huỷ casein, phân huỷ máu
đông và hoà tan huyết khối cho thấy tiềm
năng dùng để sản xuất chế phẩm hỗ trợ điều
trị tan huyết khối.
Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện nhờ
một phần kinh phí hỗ trợ từ đề tài cấp Trường
Đại học Thuỷ lợi năm 2022.
5. TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Đặng Trung Anh, Hoàng Bùi Hải, Mai Duy
Tôn, 2021. Một số yếu tố liên quan đến thời
gian cửa kim ở bệnh nhân đột quỵ nhồi máu
não cấp được điều trị tiêu huyết khối. Tạp
chí y học Việt Nam, số 1: 126-131.
[2] Nguyễn Thị Minh Đức, 2000. Thực hành vi
sinh vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
[3] Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần
Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị
Hồng Vân và Lê Thị Hương, 2012. Phân lập
và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh
tổng hợp Nattokinase. Tạp chí Sinh học. 34
(3SE): 99-104.
[4] Sambrook, J. and Russell, D.W., 2001.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
3rd Edition, Vol. 1, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York.
[5] Sumi, H., Hamada, H., Nakanishi, K. and
Hiratani, H., 1990. Enhancement of the
fibrinolytic activity in plasma by oral
administration of Nattokinase. Acta
Haematologia. 84 (3): 139-143.
[6] Trương Quang Vinh, Trịnh Đình Khá,
Nguyễn Xuân Hưởng, 2019. Nghiên cứu
định danh chủng Bacillus subtilis LS6, Tạp
chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái
Nguyên, 202 (09): 29-36.