TNU Journal of Science and Technology
230(05): 231 - 238
http://jst.tnu.edu.vn 231 Email: jst@tnu.edu.vn
ISOLATION AND SELECTION OF ENDOPHYTIC FUNGI IN Syzygium cumini
WITH IN VITRO ANTIOXIDANT CAPACITY
Phan Ngoc Thuy Ngan1,2, Tran Chi Linh3, Truong Thi Phuong Thao1, Tran Hong Quan1,
Dai Thi Xuan Trang1*
1Can Tho University, 2Cuu Long University, 3Nam Can Tho University
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received:
04/10/2024
The study is conducted to select endophytic fungal strains in Syzygium
cumini (SC) possesing in vitro antioxidant capacity. The study isolated and
preliminary identified the morphological characteristics of 23 strains of
endophytic fungi in SC. The in vitro antioxidant activity of endophytic
fungal strains in SC was determined using the method of reducing power
and neutralizing free radicals 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, and 2,2-azino-
bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid). In addition, the study also
determined the content of polyphenols and flavonoids produced by
endophytic fungal strains in SC based on Folin-Ciocalteu and alumi
chloride reagents. Endophytic fungal strains in SC were capable of
producing antioxidants with concentrations ranging from 0.19±0.05 to
27.36±4.87 mg TE/100 mL of fermentation. Fermentation broths from 23
isolated fungi in SC were capable of producing polyphenols with
concentrations ranging from 0.27±0.06 đến 21.27±2.11 mg GAE/100 mL
of fermentation and flavonoids with concentrations ranging from 0.60±0.06
đến 22.60±2.57 mg QE/100 mL of fermentation. Research results show
that the in vitro antioxidant activity of endophytic fungal strains in SC
depends on polyphenol and flavonoid content. Endophytic fungal strains in
SC reveal the potential to produce antioxidant secondary metabolites.
Revised:
06/02/2025
Published:
07/02/2025
KEYWORDS
Antioxidant
Syzygium cumini
Endogenous fungi
Flavonoids
Polyphenols
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI NẤM NỘI SINH TRONG CÂY TRÂM
(Syzygium cumini) CÓ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO
Phan Ngọc Thùy Ngân1,2, Trần Chí Linh3, Trương Thị Phương Thảo1, Trần Hồng Quân1,
Đái Thị Xuân Trang1*
1Trường Đại học Cần Thơ, 2Trường Đại học Cửu Long, 3Trường Đại học Nam Cần Thơ
TÓM TẮT
Ngày nhận bài:
04/10/2024
Nghiên cứu được thực hiện nhằm tuyển chọn các dòng vi nấm nội sinh
trong cây Trâm có khả năng kháng oxy hoá in vitro. Nghiên cứu đã phân
lập và nhận diện sơ bộ các đặc điểm hình thái của 23 dòng VNNS trong
cây Trâm. Hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của các dòng VNNS được xác
định nhờ vào phương pháp năng lực khử, trung hòa gốc tự do 2,2-
diphenyl-1-picrylhydrazyl và 2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-
sulfonic acid). Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng đã xác định hàm lượng
polyphenol, flavonoid do các dòng VNNS tạo ra dựa vào thuốc thử
Folin-Ciocalteu và alumi clorua. Các dòng VNNS có khả năng sản sinh
chất kháng oxy hóa với hàm lượng dao động từ 0,19±0,05 đến
27,36±4,87 mg TE/100 mL dịch nổi. Các dòng VNNS trong cây Trâm
có khả năng sản sinh polyphenol với hàm lượng dao động từ 0,27±0,06
đến 21,27±2,11 mg GAE/100mL dịch nổi và flavonoid với hàm lượng
dao động từ 0,60±0,06 đến 22,60±2,57 mg QE/100mL dịch nổi. Kết quả
nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của các dòng
VNNS phụ thuộc vào hàm lượng polyphenol và flavonoid. Các dòng
VNNS trong cây Trâm cho thấy tiềm năng sản sinh các hợp chất chuyển
hóa thứ cấp có khả năng kháng oxy hóa.
Ngày hoàn thiện:
06/02/2025
Ngày đăng:
07/02/2025
DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.11235
* Corresponding author. Email: dtxtrang@ctu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 231 - 238
http://jst.tnu.edu.vn 232 Email: jst@tnu.edu.vn
1. Giới thiệu
Vi nấm nội sinh (VNNS) là nhóm vi sinh vật cư trú bên trong tế bào hoặc mô khỏe mạnh của
thực vật, có thể ở dạng cộng sinh, không gây ảnh hưởng đến sức sống của cây chủ [1]. Nhiều
nghiên cứu cho thấy VNNS tồn tại đa dạng bên trong các bộ phận của cây chủ, giúp cây chủ chống
lại điều kiện sống bất lợi, và tạo ra những sản phẩm sinh học có ý nghĩa trong lĩnh vực y học. Chất
chống oxy hóa được tạo bởi cây chủ và VNNS giúp thực vật có thể tồn tại trong những tình huống
bất lợi như stress sinh học và phi sinh học [2]. Chất oxy hóa là một trong những nguyên nhân chính
gây tổn thương tế bào bên trong cơ thể người. Sự mất cân bằng giữa chất oxy hóa và chất chống
oxy hóa được gọi là stress oxy hóa. Môi trường sống ngày càng ô nhiễm, cùng với áp lực công việc,
căng thẳng gây suy nhược cơ thể, chế độ ăn không lành mạnh, lạm dụng rượu bia, thuốc lá là những
nguyên nhân chính dẫn đến stress oxy hóa. Stress oxy hóa tăng sẽ dẫn đến sự lão hóa nhanh, gây
tổn thương oxy hóa lipid, protein, DNA và RNA, nguy cơ bệnh tim mạch, xơ vữa động mạch, đái
tháo đường, Alzheimer và các bệnh khác [3]. Do đó việc bổ sung chất chống oxy hóa từ các nguồn
tự nhiên đang được phát triển vì tính an toàn và có giá trị trị liệu.
Cây Trâm (Syzygium cumini) thuộc họ Sim (Myrtaceae), là loài cây thân gỗ phân bố ở vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới như Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam [4]. Trâm được xem là cây thuốc
dân gian ở nhiều quốc gia, các bộ phận như lá, thân, đặc biệt là quả và hạt được sử dụng như loại
thảo dược quí [5]. Dịch ép lên men từ quả Trâm chứa hàm lượng vitamin C cao, cao chiết từ lá và
hoa Trâm có khả năng chống oxy hóa do có chứa các nhóm chất hữu cơ flavonoid, polyphenol
[6], [7]. Trâm là cây có nhiều tác dụng dược lý như kháng viêm, kháng nấm, chống viêm, chống
loét, bảo vệ tim, chống dị ứng, chống ung thư, bảo vệ phóng xạ, chống oxy hóa và bảo vệ gan [8]
và là cây thân gỗ sống lâu năm cung cấp môi trường sống thuận lợi cho nhiều vi sinh vật nội sinh
[9], [10]. Từ những nghiên cứu trên cho thấy, Trâm là cây chủ thích hợp để tìm kiếm nguồn
VNNS có khả năng chống oxy hóa.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu
Cây Trâm được thu thập vào tháng 4 năm 2024 tại Tiền Giang, cây có chiều cao hơn 5 m được
trồng trong vườn nhà cùng nhiều cây khác nhau. Cây Trâm được Phùng Thị Hằng nhận diện dựa
vào đặc điểm hình thái theo mô tả trong bộ sách Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ [11].
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập và nuôi cấy in vitro VNNS trong cây Trâm
Mẫu cây Trâm sau khi thu thập được vận chuyển về phòng thí nghiệm, phân loại, chọn lọc
mẫu lá, thân, hoa sạch bệnh và rửa sạch dưới vòi nước, sau đó tiến hành khử trùng bề mặt theo
khuyến cáo của Sahu và cộng sự [12]. Mẫu lá, thân, chồi, nụ của cây Trâm được cắt thành từng
mảnh nhỏ bằng dụng cụ vô trùng. Đặt mẫu lên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) có bổ
sung kháng sinh streptomycin nồng độ 100 mg/L [10] đã được khử trùng, ủ ở điều kiện nhiệt độ
phòng hoặc 30ºC±2, trong 7 ngày, sau đó tiến hành quan sát sự phát triển của nấm. Nấm mới phát
triển từ mẫu được chuyển sang môi trường PDA mới. Các dòng vi nấm được phân lập dựa vào sự
khác biệt đặc trưng về hình thái, màu sắc và đặc điểm bề mặt, hoa văn, sắc tố và bìa của khuẩn
lạc vi nấm trên mặt thạch. Quan sát sự phát triển của sợi nấm, tế bào mầm, bào tử của vi nấm
bằng kính hiển vi (Nikon YS100, Nikon, Japan).
Các dòng VNNS sau khi phân lập được nuôi tăng sinh trong môi trường Potato Dextrose
Broth (PDB) theo mô tả của Soni và cộng sự [13], có hiệu chỉnh. Dòng vi nấm thuần chủng được
đặt vào bình erlenmeyer có chứa 100 mL PDB, lắc 140 vòng/ phút, 7 ngày ở 30±2ºC. Sau đó,
môi trường tăng sinh của từng loại vi nấm nội sinh được lọc qua giấy lọc, loại bỏ sợi nấm, để thu
lấy phần dịch nổi. Phần dịch nổi của các dòng VNNS được đựng trong bình thủy tinh, bảo quản ở
4ºC cho đến khi sử dụng.
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 231 - 238
http://jst.tnu.edu.vn 233 Email: jst@tnu.edu.vn
Hình 1. Cây Trâm được lấy mẫu phân lập VNNS
2.2.2. Tuyển chọn các dòng VNNS có khả năng sản sinh polyphenol và flavonoid
Phần dịch nổi chiết xuất từ các dòng VNNS được tiến hành xác định hàm lượng polyphenol
bằng phương pháp Folin-Ciocalteu theo mô tả của Huang và cộng sự [14], có hiệu chỉnh. Phần
dịch nổi 0,25 mL được thêm 0,25 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu 0,5 N cho phản ứng xảy ra ở
nhiệt độ phòng, lắc đều, tiếp tục phản ứng được trung hòa bằng thêm 0,25 mL Na2CO3 10%, ủ 30
phút ở 40ºC trong bể điều nhiệt. Kết thúc phản ứng được đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng
756 nm. Hàm lượng polyphenol có trong dịch nổi của các dòng VNNS được xác định dựa trên
phương trình đường chuẩn số (1), xây dựng dựa trên nồng độ chất chuẩn gallic acid (mg
GAE/100 mL dịch nổi).
y = 0,0152x + 0,1357 (R² = 0,9961) (1)
Với y là độ hấp thụ quan phổ tại bước sóng 756 nm
x là nồng độ chất gallic acid (mg GAE/100 mL dịch nổi)
Phần dịch nổi chiết xuất từ các dòng VNNS được tiến hành xác định hàm lượng flavonoid với
thuốc thử alumi clorua theo mô tả Praptiwi và cộng sự [15] có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng
gồm 1 mL nước cất, 1mL dịch nổi, 0,2 mL NaNO2 5%, ủ hỗn hợp trong 5 phút, ở nhiệt độ phòng.
Sau khi ủ, hỗn hợp được thêm 0,2 mL AlCl3 10%, lắc đều hỗn hợp, ủ trong 6 phút, thêm 2 mL
NaOH 1N, nước cất 0,6 mL và tiếp tục ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Kết thúc phản ứng tiến
hành đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 510 nm. Hàm lượng flavonoid có trong dịch nổi của
các dòng VNNS được xác định dựa trên phương trình đường chuẩn số (2), xây dựng dựa trên
nồng độ chất chuẩn quercetin (mg QE/100 mL dịch nổi)
y = 0,0009x + 0,0462 (R² = 0,9846) (2)
Với y là độ hấp thu quan phổ tại bước sóng 510 nm
x là nồng độ chất quercetin (mg QE/100 mL dịch nổi)
2.2.3. Tuyển chọn các dòng VNNS có hoạt tính kháng oxy hóa in vitro
Khảo sát khả năng trung hòa gốc tự do 2, 2-diphenyl- 1 – picrylhydrazyl (DPPH)
Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH được xác định dựa theo mô tả của Sharma & Bhat [16]
có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 0,96 mL phần dịch nổi của VNNS và 0,04 mL DPPH
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 231 - 238
http://jst.tnu.edu.vn 234 Email: jst@tnu.edu.vn
(1000 µg/mL), phản ứng xảy ra ở 30oC trong 30 phút. Gốc tự do DPPH có màu tím hấp thu ở
bước sóng 517 nm khi phản ứng với chất chống oxy hóa màu tím giảm dần theo khả năng chống
oxy hóa của chất thử nghiệm. Hàm lượng chất có chống oxy hóa trong dịch nổi của các dòng
VNNS được xác định dựa trên phương trình đường chuẩn trolox (mg TE/100 mL dịch nổi).
Khảo sát năng lực khử
Năng lực khử được đánh giá theo mô tả của Oyaizu [17] có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng lần
lượt gồm 0,1 mL phần dịch nổi của VNNS, 0,1 mL đệm phosphate (0,2 M, pH 6,6) và 0,1 mL
K3Fe(CN)6 1%. Sau khi hỗn hợp phản ứng được ủ ở 50ºC trong 20 phút, thêm 0,1 mL
CCl3COOH 10%, ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3000 vòng/ phút trong 10 phút. Phần dịch sau khi ly
tâm được rút 0,1 mL cho vào 0,1 mL nước và 0,1 mL FeCl3 0,1%, lắc đều. Độ hấp thu quang phổ
của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 700 nm. Hàm lượng chất có năng lực khử trong dịch
nổi của các dòng VNNS được xác định dựa trên phương trình số (3), xây dựng dựa trên nồng đồ
chất chuẩn trolox (mg TE/100 mL dịch nổi).
y = 0,0927x + 0,0188 (R² = 0,9976) (3)
Với y là độ hấp thu quan phổ tại bước sóng 700 nm
x là nồng độ chất chuẩn trolox (mg TE/100 mL dịch nổi)
Khảo sát khả năng trung hòa gốc tự do 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
Khả năng trung hòa gốc tự do ABST+ được thực hiện theo mô tả của Nenadis và cộng sự[18]
có hiệu chỉnh. Phản ứng gồm 0,99 mL dung dịch ABTS+ (500 µg/mL) phản ứng với 0,01 mL
phần dịch nổi của VNNS, ủ 6 phút trong tối ở 30C. Độ hấp thu quang phổ của hỗn hợp phản ứng
được xác định ở bước sóng 734 nm. Hàm lượng chất có năng lực khử trong dịch nổi của các dòng
VNNS được xác định dựa trên phương trình đường chuẩn trolox (mg TE/100 mL dịch nổi).
2.2.4. Định danh một số dòng VNNS trong cây Trâm
Các dòng VNNS có khả năng sản sinh polyphenol, flavonoid và chất chống oxy hóa tiềm
năng được lựa chọn để định danh. Trình tự gene ITS-rDNA của các dòng vi nấm nội sinh được
khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR). Trình tự gene
ITS-rDNA của các dòng VNNS được khuếch đại bằng cách sử dụng các đoạn mồi ITS1 (5′-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) và ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) được sử
dụng để khuếch đại một đoạn DNA ~600 cặp bazơ (bp) của vùng ITS [16]. Sản phẩm PCR của
gene ITS-rDNA được giải trình tự tại công ty TNHH DNA Sequencing (U34C Đường số 6,
KĐTM Hưng Phú, P. Hưng Thạnh, Q. Cái Răng, TP. Cần Thơ). Các so sánh BLAST được thực
hiện tại Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology
Information) để chọn ra các dòng VNNS có độ tương đồng cao. Các đặc điểm hình thái của
VNNS được quan sát bằng kính hiển vi quang học (Olympus, Japan).
2.2.5. Thống kê phân tích số liệu
Các số liệu trong nghiên cứu được trình bày dưới dạng MEANSD. Kết quả được xử lý thống
kê theo phương pháp ANOVA (kiểm định Tukey’s) bằng phần mềm Minitab 16.0.
3. Kết quả và bàn luận
3.1. Kết quả phân lập và nuôi cấy in vitro vi nấm nội sinh trong cây Trâm
Từ các bộ phận của cây Trâm đã phân lập được 23 dòng VNNS. Trong đó, từ chồi phân lập
được 7/23 dòng VNNS chiếm tỉ lệ 30,43%, từ lá phân lập được 8/23 chiếm tỉ lệ 34,78%, từ thân
phân lập được 8/23 chiếm tỉ lệ 34,78%. Như vậy, kết quả cho thấy số lượng các dòng VNNS
được phân lập từ chồi, lá và thân nhiều tương đương nhau. VNNS thể hiện sự đa dạng, khác biệt
về màu sắc, bề mặt khuẩn lạc, hình dạng bào tử và cấu trúc sợi khuẩn ty. Các dòng VNNS trong
cây Trâm có sợi khuẩn ty thuộc nhóm có vách ngăn chiếm tỷ lệ 91,3% trong đó chủng nấm có
màu xanh, trắng cùng với bào tử hình tròn chiếm tỷ lệ cao nhất 21,74%. Các dòng VNNS được
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 231 - 238
http://jst.tnu.edu.vn 235 Email: jst@tnu.edu.vn
ký hiệu là Sc.B.x, Sc.L.x, Sc.T.x. Trong đó, Sc là Syzygium cumini, B là bud (chồi non), L là leaf
(lá), T là trunk (thân), x là số thứ tự phân lập. Đặc điểm hình thái của một số dòng VNNS trong
cây Trâm được trình bày trong Bảng 1 và Hình 1.
Bảng 1. Đặc điểm hình thái của các dòng VNNS
Cấu trúc
sợi khuẩn
ty
Màu sắc
khuẩn lạc
Hình
dạng
bào
tử
Tỷ lệ
phần
trăm
Có vách
ngăn
xanh
tròn
21,74%
trắng
tròn
21,74%
elip
4,35%
liềm
8,70%
xám
tròn
4,35%
elip
8,70%
đen
tròn
8,70%
elip
4,35%
vàng
liềm
4,35%
cam
liềm
4,35%
Không vách
ngăn
vàng
trụ
4,35%
trắng
trụ
4,35%
Hình 1. Tỷ lệ đặc điểm hình thái của các dòng
VNNS
3.2. Kết quả khả năng sản sinh polyphenol và flavonoid của các dòng VNNS phân lập được
Polyophenol tổng (total polyphenol content, TPC) và flavonoid tổng (total flavonoid content,
TFC) là những nhóm chất có hoạt tính sinh học có thể được chiết xuất từ VNNS. Các hợp chất
thuộc nhóm polyphenol và flavonoid như: kaempferol, caffeic acid, para-hydroxybenzoic acid,
para-coumaric acid, vanillic acid, syringic acid, gallic acid, chlorogen acid, ferulic acid và
rosmarinic acid đã được phân lập từ nhiều dòng VNNS khác nhau [19], [20]. Trong 23 dòng
VNNS phân lập từ cây Trâm có 19 dòng có khả năng sản sinh polyphenol và flavonoid. Hàm
lượng polyphenol và flavonoid của 19 dòng VNNS trong cây Trâm lần lượt từ 0,27±0,06 đến
21,27±2,11 mg GAE/100 mL và 0,60±0,06 đến 22,60±2,57 mg QE/100 mL dịch nổi (Bảng 2),
tương đồng với kết quả nghiên cứu của Praptiwi và cộng sự [15] về hàm lượng polyphenol trên
các dòng VNNS từ 0,52 đến 13,95 mg GAE/100 mL dịch nổi. Dòng vi nấm Sc.B.7; Sc.B.4,
Sc.T.4 và Sc.L.2 có TPC cao nhất (lần lượt là 21,27±2,11; 19,30±1,65; 16,67±1,89 và 16,62±1,07
mg GAE/100 mL dịch nổi). Kết quả định lượng flavonoid cũng chỉ ra rằng dòng vi nấm Sc.B.4;
Sc.B.7, Sc.L.2 có khả năng sản sinh TFC số cao nhất, lần lượt là với 22,60±2,57; 22,23±1,11;
17,78±2,22 mg QE/100 mL dịch nổi. Hàm lượng polyphenol và flavonoid không được tìm thấy ở
4/23 dòng vi nấm gồm có dòng Sc.B.6, Sc.L.8, Sc.T.2.
3.3. Kết quả về khả năng chống oxy hóa in vitro của các dòng VNNS phân lập được
Các gốc tự do là các hợp chất có các electron đơn lẻ dễ dàng phản ứng với lipoprotein, lipid,
carbohydrate, nucleic acid, protein và amin acid tự do. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có
nguồn gốc từ VNNS trong nghiên cứu được chứng minh có khả năng trung hòa hoặc khử các gốc
tự do/ ion kim loại chuyển tiếp. Hoạt tính chống oxy hóa của các dòng VNNS được xác định dựa
vào hàm lượng chất chống oxy hóa được trình bày trong Bảng 2. Phương pháp DPPH, ABTS+ và
RP đã được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của các dòng VNNS, vì đây là những
phương pháp phổ biến được sử dụng trong sàng lọc chất chống oxy hóa mới.
DPPH là một gốc tự do, có khả năng nhận electron và hydro của chất chống oxy hóa. Do đó,
DPPH thường được sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc tác nhân chống oxy hóa. Kết quả trình
bày trong Bảng 2 cho thấy, các dòng vi nấm Sc.L.2, Sc.B.7, Sc.B.4 có khả năng trung hòa gốc tự