Đại hc Nguyn Tt Thành
45
Tp chí Khoa hc & Công ngh Vol 7, No 5
Phân lập và xác định đặc điểm các dòng nấm men từ men rượu
trên địa bàn thành phố Cần Thơ
Hunh Quc Huy1*, Nguyn Th M Trinh1, Trn Th Như Ngọc1, Lưu Minh Châu1,
Nguyn Ngc Thnh1, Đoàn Thị Kiu Tiên2, Hunh Xuân Phong1,**
1Vin Công ngh Sinh hc Thc phẩm, Trường Đại hc Cần Thơ
2Khoa Công ngh Sinh hóa - Thc phẩm, Trường Đại hc K thut - Công ngh Cần Thơ
*huym0522003@gstudent.ctu.edu.vn, **hxphong@ctu.edu.vn
Tóm tt
Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập các dòng nấm men từ các mẫu men rượu
trên địa bàn thành phố Cần Thơ xác định một số đặc điểm của các dòng nấm men
được phân lập như khả năng chịu cồn, khả năng chịu nhiệt, khả năng kết lắng khả
năng sinh H2S. Từ đó có thể lưu trữ được nguồn nấm men thuần dòng để ứng dụng vào
quá trình lên men rượu gạo tại địa phương. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 12
dòng nấm men từ 5 mẫu men rượu. Khi đánh giá hoạt tính chịu cồn, các dòng nấm men
này đều chịu được nồng độ cồn mức 8 % v/v, trong đó có 10 dòng chịu được nồng độ
cồn ở mức 12 % v/v. Tất cả dòng nấm men phân lập được đều có khả năng phát triển ở
nhiệt độ 30 oC 37 oC, 8 dòng khả năng phát triển nhiệt độ 40 oC 3 dòng
khả năng phát triển nhiệt độ 45 oC. Ngoài ra, 12 dòng nấm men phân lập được đều
không sinh H2S và có khả năng kết lắng tốt.
® 2024 Journal of Science and Technology - NTTU
Nhn 04/09/2024
Đưc duyt 12/11/2024
Công b 28/12/2024
T khóa
chu cn, chu nhit,
lên men ethanol,
men rượu, nm men
1 Đặt vấn đề
ợu được s dụng như là một nét văn hóa của người
Việt đã từ lâu đời, mang đậm du n truyn thng,
gn vi nhng tp tc sinh hot ca cộng đồng. Mi
vùng min, tộc người có cách lên men rượu khác nhau,
mang bn sc riêng ca tng dân tc, trong đó phổ biến
nht th k đến đó rượu go. T xưa, quá trình sản
xuất rượu thường da vào h vi sinh vt bên ngoài môi
trường để cho lên men t nhiên. Tuy nhiên,
phương pháp này thường cho kết qu không ổn định.
Bng nhiu kinh nghiệm, người ta đã chọn khi tt
nht gi li mt phần để sn xut cho m sau. Mc
dù phương pháp này ổn định hơn so vi vic ph thuc
vào h vi sinh vt t nhiên, ngun ging không th bo
quản được lâu. Do đó, bánh men đã được to ra t
nhng khi tt nht, bng cách to hình chúng với
cht, sy khô bo quản đ s dng dn. Bánh men
ợu thường cha các vi sinh vật như nấm men, nm
mc các vi khun khác, kh năng chuyển hóa
đường thành cn và các sn phm ph khác.
Quá trình sn xuất u go th được thc hin bng
cách nghin bánh men thành bột và đưc trn vào go
nu chín, hiếu khí (1-2) ngày. Sau đó, thêm nước vào
thc hin quá trình lên men k khí khong (3-4)
ngày. Sau khi kết thúc quá trình lên men, toàn b
nguyên liệu lên men được chưng cất để thu sn phm.
Chất lượng bánh men rượu là mt trong nhng yếu t
quyết định đến sản lượng, chất lượng cũng như đặc
https://doi.org/10.55401/je7tmb84
Tp chí Khoa hc & Công ngh Vol 7, No 5
46
trưng ca sn phẩm rượu. Do đó, việc s dng ngun
ging vi sinh vt thun dòng có hot tính cao và có tính
ổn định trong quá trình lên men rượu rt cn thiết [1].
Chính vì tm quan trng ca bánh men trong quy trình
sn xuất rượu, mt s nghiên cứu đã đưc thc hiện để
nâng cao chất lượng của bánh men cũng như chất lượng
của rượu làng ngh. Kết qu nghiên cu quy trình sn
xut men ring tại phường Qung Long, th xã Ba Đồn
tnh Qung Bình và kết qu cho thấy rượu thành phm
chất lượng tốt hơn so với men truyn thng ti th
trn Quán Hàu [2]. Trong nghiên cu phân lập và đánh
giá hot nh ca các dòng nm men, nm mc trong
các loi bánh men ca các làng ngh sn xuất rượu ti
các huyn Hoàng Su Phì Qun B (tnh Giang)
đã tuyển chọn được nm mc Aspergillus niger
NLN.218 nm men Saccharomyces cerevisiae
RLN.168 có hiu suất lên men đt 93,07 % nồng độ
đường 18,14 %, độ cồn đạt 11,2 % v/v. Kết qu đánh
giá cm quan cho thy, tt c các mu th nghim
điểm cm quan th hiếu cao hơn mẫu đối chứng được
sn xut t loi bánh men truyn thng [3].
Nm men vi sinh vật điển hình trong vic lên men
chuyển hóa đường thành rượu. Bên cnh kh năng này,
trong sn xuất rượu, người ta còn quan tâm đến mt s
hot tính khác ca nấm men như khả năng chịu nhit,
cn, kh năng kết lng sinh H2S. Hin nay, hiu ng
nhà kính đang làm cho trái đt m dn lên và nhiệt độ
vn tiếp tục tăng dần trong tương lai. Vit Nam có khí
hu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ tăng khá cao vào mùa
khô, càng gây khó khăn trong việc sn xut ethanol
bng nm men do quá trình lên men thường din ra tt
trong khong (28-33) °C. Vic s dng nm men chu
nhiệt độ cao có th giúp cho quá trình lên men din ra
nhanh, nguy cơ nhiễm vi sinh vt gim, gim nồng độ
oxy, cht khí khác,..., [4] và giảm được chi phí đầu
cho thiết b làm mát, mang li li ích kinh tế [5]. Ngoài
ra, nồng độ cồn trong môi trường cũng tác động đáng
k đến hoạt động ca nm men, nm men không chu
được nồng độ cn cao s d b c chế trong quá trình
lên men dẫn đến hiu qu lên men không cao. Hơn nữa,
nm men kh năng kết lng s mt li thế trong
quá trình sn xuất rượu, giúp làm trong sn phm
nâng cao chất lượng sn phm cui cùng. Cui cùng,
cn kiểm tra đặc tính sinh H2S ca nấm men để tránh
gây mùi không mong muốn trong rượu.
Mc tiêu ca nghiên cu nhm phân lp và tuyn chn
nm men t men rượu kh năng chu nhit, chu cn,
lng tt và không sinh H2S để ng dng trong lên men
sn xuất rượu nhằm tăng hiệu sut lên men, nâng cao
chất lượng sn phẩm, cũng như lưu trữ ngun gen tt
ca bn địa, góp phn làm phong phú thêm s hiu biết
v đa dạng sinh hc.
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Vt liu và hóa cht
Năm mẫu men rượu được thu thp tại các sở sn xut
u ti huyện Phong Đin qun Ninh Kiu (thành
ph Cần Thơ). Các sở thu mu bao gồm: sở
Màng (CM, khu dân 91B, phưng Xuân Khánh,
qun Ninh Kiều); cơ sở i Lc (ML, p Thi Giai,
xã Giai Xuân, huyện Phong Điền); cơ sở Út Bình (UB,
p Thi Giai, xã Giai Xuân, huyện Phong Điền); cơ sở
Tư Vũ (TV, ấp Tân Long B, huyn Phong Điền); cơ sở
Ba (CB, đường Nguyễn Văn Cừ, phường Cái Khế,
qun Ninh Kiu).
Hóa chất: môi trường s dng trong nghiên cu bao
gồm: môi trường YPD (yeast extract 0,5 % - peptone
0,5 % - D-glucose 2 %), môi trường Sabouraud, môi
trưng LA (lead acetate 0,1%, ammonium sulfate 0,02
%, yeast extract 0,5 %, peptone 0,3 %, glucose 4 %).
Các hóa cht s dng trong nghiên cứu được cung cp
t công ty Himedia (India) Xilong Scientific
(China).
2.2 Phương pháp
2.2.1 Phân lập và xác đnh hình thái ca các dòng nm
men t men rượu
Cho 5 g mẫu men rượu vào bình tam giác cha
95 mL môi trường YPD. lc nhiệt độ phòng (28-
32) trong (24-48) gi. Dịch tăng sinh đưc pha
loãng đến nồng độ thích hợp. Sau đó, 0,1 mL dịch pha
loãng được trải trên môi trưng thch YPD
30 °C trong (24-48) gi. Thc hin cy chuyn nhiu
lần đến khi thu được các dòng nm men thun. Ghi
nhận đặc điểm khun lc tế bào ca các dòng nm
men được phân lp.
2.2.2 Kho t kh năng chịu cn ca nm men
Đại hc Nguyn Tt Thành
47
Tp chí Khoa hc & Công ngh Vol 7, No 5
Các dòng nấm men được phân lập sẽ được nuôi cấy
trong 10 mL môi trường YPD chứa (8, 12, 16,
20) % v/v ethanol tinh khiết và ủ ở 30 °C trong (48-72)
giờ. Sau đó cấy lên môi trường YPD agar và ủ nhiệt
độ 30 °C trong (48-72) giờ. Nếu nấm men phát triển
trên môi trường YPD agar chứng tỏ khả năng chịu
được nồng độ cồn thử nghiệm [6].
2.2.3 Kho sát kh năng chịu nhit ca nm men
Các dòng nấm men được phân lập sẽ được cấy trên môi
trường YPD agar các nhiệt độ khác nhau gồm
(30, 37, 40 45) °C. Quan sát sự phát triển của nấm
men từ 24 giờ đến 96 giờ. Nếu nấm men phát triển trên
môi trường YPD agar chứng tỏ khả năng phát triển
ở nhiệt độ thử nghiệm [7].
2.2.4 Kho sát kh năng kết lng ca nm men
Các ng nấm men được phân lập sẽ được nuôi cấy
trong 10 mL môi trường Sabouraud được điều chỉnh 18
oBx bằng đường saccharose và ủ ở 30 °C trong 72 giờ.
Sau đó, ống nghiệm lấy ra được lắc đều, rồi bắt đầu đo
chiều cao đoạn lắng trong ở các ống nghiệm mỗi ngày.
Nếu nm men có kh năng lắng tt thì trong 7 ngày sau
khi lên men, chiều dài đoạn dch trong > 75 % chiu
cao ca khối môi trường lên men. Nm men kh
năng lắng trung bình, chiều dài đoạn dung dch trong
chiếm (50-75) % chiu cao ca khối môi trường lên
men. Nm men kh năng lắng yếu, chiều dài đoạn
dch trong chiếm (25-50) % chiu cao ca khi môi
trưng lên men, nếu chiều dài đoạn dch trong nh 25
% chiu cao ca khối môi trường lên men, tnm men
không lng [8].
2.2.5 Kho sát kh năng sinh hydrogen sulfide (H2S)
ca nm men
Các dòng nấm men được phân lập sẽ được cấy trên môi
trường LA agar 30 °C trong 10 ngày. Nếu nm
men không sinh H2S thì khun lc phát trin không biến
đổi màu, nm men sinh H2S ít thì rìa ca khun lc
màu nâu nht hoặc màu nâu đen, nấm men sinh nhiu
H2S toàn b khun lc s có màu đen [8].
2.2.6 Phương pháp phân tích và xử lí s liu
Kết qu được x v biểu đồ bng phn mm
Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, USA).
S liệu được x lý phân tích thng bng phn
mm thng Statgraphics Centurion XV (Statpoint
Technologies Inc., USA), khác biệt có ý nghĩa tại giá
tr p < 0,05.
3 Kết qu và tho lun
3.1 Kết qu phân lập xác định hình thái ca các dòng
nm men t men rượu
Trong nghiên cu này, t 5 mẫu men u khác nhau
được thu thp tại 5 sở trên địa bàn thành ph Cn
Thơ, tổng cng 12 chng nấm men đã được phân lp
kết qu mt s đặc điểm hình thái được th hin trong
Bng 1. Kết qu cho thy 12 chng nm men thun đã
được phân lp chia thành 4 nhóm hình dng tế bào
khác nhau, bao gm hình cu ln, cu nh, oval ln và
oval nh. Tế bào nm men các hình dng ph biến
như hình cầu, hình oval, hình elip, hình tr đôi khi
kéo dài thành hình si. Nm men th thay đổi hình
dạng kích thước tùy thuộc vào giai đoạn phát trin
và điều kiện môi trường. Điều này cho thy s đa dạng
v hình dng tế bào ca các dòng nm men phân lp t
men rượu. Khi phân lập trên môi trường YPD, khun
lc nấm men đều hình tròn đều, b mặt trơn láng
hoc xù xì, bìa nguyên hoặc bìa răng cưa, với màu sc
ch yếu trng sa hoc trắng trong. Quan sát dưới
kính hin vi cho thy tt c các dòng nấm men này đều
ny chi theo một hướng.
Nghiên cứu trước đây đã tiến hành phân lp các chng
nm men t 12 mu bánh men kết qu đã xác định
được các loài như S. cerevisiae, Hyphopichia burtonii,
Saccharomycopsis fibuligera, Pichia anomala
Candida sp. dựa vào đặc tính hình thái sinh [9].
Đến năm 2007, trong một nghiên cu v các loi bánh
men Việt Nam đã phân lp 119 chng vi sinh vt t
29 mu bánh men ca Vit Nam, bao gm 53 chng
nm mc, 51 chng nm men 15 chng vi khun.
Nghiên cứu đã xác định các dòng này bng cách gii
trình t, c th gm Amylomyces rouxii,
Amylomyces aff. rouxii, Rhizopus oligosporus, R.
oryzae, S. cerevisiae, C. glabrataP. anomala [10].
Bên cạnh đó, các dòng nấm men cũng đưc tìm thy
trong loog-pang-lao (men u ngun gc t Thái
Lan) như P. anomala, P. burtonii, P. fabianii, P. heimii,
S. cerevisiae, S. fibuligera, C. rhagii, C. glabrata,
Torulaspora globosa, T. delbrueckii, Trichosporon
asahii, Issatchenkia orientalis, Rhodotorula philyla
Tp chí Khoa hc & Công ngh Vol 7, No 5
48
[11]. Các chng nấm men được xác định hin din
trong “hamei”, một loi men khởi động thc hin quá
trình lên men rưu t go nếp của các gia đình tại các
làng b lc ca Manipur (Ấn Độ) bao gm S.
cerevisiae, P. anomala, Trichosporon sp., C. tropicalis,
P. guilliermondi, C. parapsilosis, T. delbrueckii, P.
fabianii C. montana [12]. Mt loại men rượu khác
ca Ấn Độ dùng trong lên men, được gọi “xaj-pitha”,
đã cho thấy s đa dạng vi sinh vt ca cộng đồng vi
sinh vật thông qua phương pháp metagenomics đã tìm
thy s tn ti nhóm sn xut ethanol gm Meyerozyma
guilliermondii, Wickerhamomyces ciferrii, S.
cerevisiae, C. glabrata, Debaryomyces hansenii,
Ogataea parapolymorpha Dekkera bruxellensis
[13].
Nhìn chung, t kết qu ca nghiên cu này các
nghiên cứu trước đây cho thấy s đạng v vi sinh vt
hin diện trong các “men khởi động” nói chung bánh
men nói riêng. Tuy nhiên, đ lưu trữ các ngun gen
các đặc tính tt thì vic phân lập là điều cn thiết và to
tiền đề trong vic chn lc nhng dòng vi sinh nhm
định hướng ng dng cho hiu qu sn xut cao.
Bảng 1 Đặc điểm của các chủng nấm men được phân lập từ men rượu
Mu men
u
Chng
nm
men
Đặc điểm khun lc
Đặc điểm tế bào
Hình nh tế bào nm men
( vt kính 40×)
Cô Màng
CM1
Tròn, màu trng sa, b mt
khô, bìa nguyên
Cu ln,
ny chi một hướng
CM2
Tròn, nhô, màu trng sa, b
mt khô, bìa nguyên
Oval ln,
ny chi một hướng
i
Lc
ML1
Tròn, màu trng đục, b mặt ướt
trơn láng, bìa nguyên
Cu ln,
ny chi một hướng
ML2
Tròn, màu trng trong, b mt
khô, bìa nguyên
Oval nh,
ny chi mt ng
Út Bình
UB1
Tròn, màu trng trong, b mt
xù xì, bìa nguyên
Cu nh,
ny chi một hướng
UB2
Tròn, màu trng sa, b mt
khô, bìa nguyên
Oval ln,
ny chi một hướng
UB3
Tròn, màu trng đục, b mt
trơn láng, bìa nguyên
Oval nh,
ny chi một hướng
TV1
Tròn, màu trng sa, b mt
trơn láng, bìa nguyên
Cu ln,
ny chi một hướng
TV2
Tròn, màu trng đục , b mt xù
xì, bìa nguyên
Oval ln,
ny chi một hướng
Đại hc Nguyn Tt Thành
49
Tp chí Khoa hc & Công ngh Vol 7, No 5
TV3
Tròn, màu trng trong, b mt
khô, bìa nguyên
Oval nh,
ny chi một hướng
Ba
CB1
Tròn, màu trng trong, b mt
trơn láng, bìa nguyên
Cu ln,
ny chi một hướng
CB2
Tròn, màu trng đục, b mt
khô, bìa nguyên
Oval ln,
ny chi một hướng
3.2 Kết qu đánh giá khả năng chịu cn ca các dòng nm men phân lp t men rượu
Kh năng chu cn ca nm men quyết định xem chúng có th tiếp tc phát trin và lên men hiu qu khi nồng độ
cồn trong môi trường tăng cao. Nếu nm men không chịu được nồng độ cn cao, quá trình lên men có th b dng
lại trước khi hoàn tt, dẫn đến sn phẩm không đạt được nồng độ cn mong mun. Chính vì vy, trong thí nghim
này tiến hành kho sát kh năng chịu cn ca 12 dòng nấm men đã phân lập và kết qu đưc trình bày Bng 2.
Bng 2 Kh năng chịu ethanol (% v/v) ca các dòng nm men phân lp
Chú thích: Sinh trưởng rất nhiều: ++++, Sinh trưởng nhiều: +++, Sinh trưởng ít: ++, Có sinh trưởng: +, Không sinh trưởng: -
Một trong các phương pháp xác định kh năng chịu cn
ca nm men theo dõi s phát trin ca nm men
trong môi trường có cha các nồng độ cn khác nhau.
Nm men chịu được cn mt nồng độ nào đó nghĩa
th duy trì hoạt động trao đi cht trong môi
trưng lên men và chịu được ti nồng độ cồn đó trong
giai đon lên men. Kết qu thí nghim cho thy, độ
cn 8 % v/v, tt c các dòng nấm men đều sinh trưởng
phát triển bình thường. nồng độ cồn cao hơn t
các dòng nm men bắt đầu có s phân hóa v kh năng
chu cồn, theo đó nồng độ cn 12 % thì 10 dòng
sinh trưởng được nồng độ này. Không dòng nm
men nào sinh trưởng được mc nồng đ cn (16
20) % v/v.
Hình 1 Chng nm men chu cn CM1 phát trin trên môi
trường thch YPD
Tên cơ sở
Dòng nm men
Hàm lượng ethanol (% v/v)
Đặc điểm tế bào
8
12
16
20
Cô Màng
CM1
++++
+++
-
-
Hình cu ln
CM2
++++
+++
-
-
Hình oval ln
i Lc
ML1
++++
-
-
-
Hình cu ln
ML2
++++
+++
-
-
Hình oval nh
Út Bình
UB1
++++
+++
-
-
Hình oval ln
UB2
++++
+++
-
-
Hình cu nh
UB3
++++
+++
-
-
Hình oval nh
Tư Vũ
TV1
++++
+++
-
-
Hình oval nh
TV2
++++
+++
-
-
Hình oval ln
TV3
++++
-
-
-
Hình cu ln
Cô Ba
CB1
++++
++
-
-
Hình cu ln
CB2
++++
+++
-
-
Hình oval ln