TNU Journal of Science and Technology
230(05): 3 - 10
http://jst.tnu.edu.vn 3 Email: jst@tnu.edu.vn
EVALUATION OF PROBIOTIC PROPERTIES AND IMPROVING VIABILITY
OF Lactobacillus acidophilus CP1 BY CHITOSAN COATED ALGINATE MICROCAPSULES
Nguyen Thi Thanh Ngoc1, Vu Thi Hanh Nguyen2, Phi Quyet Tien2, Quach Ngoc Tung2*
1East Asia University of Technology, 2Institute of Biotechnology - Vietnam Academy of Science and Technology
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received:
30/9/2024
To date, maintaining probiotic cell viability during storage and
gastrointestinal transit remains a challenge. The present study was
conducted to evaluate probiotic properties and improve viability of
Lactobacillus acidophilus CP1 by using the microencapsulation
method. L. acidophilus CP1 had the ability to grow at pH 3.0, tolerate
4 mM H2O2, and synthesize protease. Moreover, Mycobacterium
smegmatis MC2 155, Escherichia coli ATCC 11105 và Pseudomonas
aeruginosa ATTC 6538 were inhibited by the CP1 with the inhibition
zones ranging from 7,5-17,1 mm. Using the emulsification and
internal gelation method, the CP1 was encapsulated by alginate and
chitosan resulting in spherical microcapsules with sizes ranging from
5 – 50 µm. In simulated gastric fluid, the cell viability of
microcapsules reached 86.3 ± 1.4%, which was 11.9% higher than
free CP1 after 2 hours of incubation. Furthermore, freeze-dried
microencapsulation was shown to have a survival rate 1.5 times
higher than the free sample at 30°C after 45 days of storage. These
results have opened up guidelines for selecting downstream
processing and formulating probiotic preparations in food technology
and human health protection.
Revised:
17/12/2024
Published:
18/12/2024
KEYWORDS
Alginate
Chitosan
Lactobacillus acidophilus
Probiotic cell
Microencapsulation
ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH PROBIOTIC VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG SỐNG SÓT
CỦA Lactobacillus acidophilus CP1 BẰNG VI BAO ALGINATE-CHITOSAN
Nguyễn Thị Thanh Ngọc1, Vũ Thị Hạnh Nguyên2, Phí Quyết Tiến2, Quách Ngọc Tùng2*
1Trường Đại học Công nghệ Đông Á, 2Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
TÓM TẮT
Ngày nhận bài:
30/9/2024
Hiện nay, việc duy trì khả năng sống sót của probiotic trong quá trình
bảo quản và vận chuyển qua hệ tiêu hóa vẫn là một thách thức.
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá đặc tính probitotic và
nâng cao khả năng sống sót của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
CP1 bằng kỹ thuật vi bao. Chủng L. acidophilus CP1 có khả năng
sinh trưởng và phát triển ở pH 3,0, chống chịu với 4 mM H2O2 và
sinh tổng hợp protease. Hơn nữa, vi khuẩn kiểm định Mycobacterium
smegmatis MC2 155, Escherichia coli ATCC 11105 và Pseudomonas
aeruginosa ATTC 6538 bị ức chế với đường kính vòng ức chế dao
động từ 7,5-17,1 mm. Sử dụng kỹ thuật nhũ hóa và tạo gel, CP1 được
vi bao bằng alginate và chitosan để tạo ra vi bao hình cầu với kích
thước dao động từ 5 – 50 µm. Trong dịch dạ dày mô phỏng, tỷ lệ
sống sót của CP1 ở mẫu vi bao đạt 86,3 ± 1,4%, cao hơn 11,9% so
với mẫu tự do sau 2 giờ ủ. Hơn nữa, vi bao sau đông khô được chứng
minh có tỷ lệ sống sót cao hơn 1,5 lần so với mẫu tự do ở 30°C sau
45 ngày bảo quản. Kết quả nghiên cứu đã mở ra hướng lựa chọn công
nghệ thu hồi và tạo chế phẩm probiotic ứng dụng trong công nghệ
thực phẩm và bảo vệ sức khoẻ con người.
Ngày hoàn thiện:
17/12/2024
Ngày đăng:
18/12/2024
DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.11204
* Corresponding author. Email: qn.tung@ibt.ac.vn
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 3 - 10
http://jst.tnu.edu.vn 4 Email: jst@tnu.edu.vn
1. Giới thiệu
Probiotic được định nghĩa là nhóm vi sinh vật an toàn giúp cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột
theo hướng có lợi cho vật chủ khi được bổ sung với một lượng đủ [1]. Theo phân tích của Tổ
chức IMARC, tổng giá trị của ngành probiotic toàn cầu trong năm 2023 đạt 63,4 tỷ đô la và ước
tính tăng đến 114,4 tỷ đô la vào năm 2032. Probiotic đã trở thành giải pháp hữu hiệu, toàn diện
nhằm tăng hiệu quả chuyển hóa thức ăn, nâng cao sức đ kháng, giảm thiểu tỷ lệ mc bệnh đường
ruột và ngăn ngừa các bệnh ung thư [2]. Hiệu quả của chế phẩm hay sản phẩm probiotic phụ
thuộc vào nhiu yếu tố như chủng loại vi sinh vật, khả năng sống của vi sinh vật, khả năng chịu
nhiệt và điu kiện bảo quản [3]. Do vậy, độ ổn định của probiotic luôn là một thách thức với các
nhà nghiên cứu và doanh nghiệp.
Vi bao được định nghĩa là quá trình đóng gói một chất trong một chất khác và tạo ra các hạt
có kích thước từ nanomet đến micromet [3]. Trong lĩnh vực chế biến thực phẩm, kỹ thuạt vi bao
đã đuợc sử dụng rọng rãi để bảo vẹ và giữ các thành phần thực phẩm như huong vị, tinh dầu,
chất bo, nhựa dầu và chất màu. Dịch chiết thô từ lá oliu được vi bao bằng hỗn hợp gelatin và
tragacanth gum giảm đáng kể quá trình oxy hoá chất béo khi bổ sung vào hamburger thịt cừu [4].
Ứng dụng quan trọng nhất của kỹ thuật vi bao là đặc tính bảo vệ vi khuẩn probiotic. Tế bào vi
khuẩn probiotic được bao phủ bởi các vật liệu tạo màng thích hợp để cách ly tế bào khỏi môi
trường xung quanh và đồng thời hỗ trợ giải phóng tế bào trong môi trường thích hợp [5]. Chất tạo
màng trong vi bao là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginate, chitosan hoặc có
nguồn gốc nhân tạo như polyamide, polystyrene, polyacrylate, polyacrylamide. Ngoài ra, vi bao
còn giúp ổn định và tăng giá trị v mặt cảm quan cho sản phẩm. Vi bao bằng κ‐carrageenan và
carboxymethyl cellulose làm tỷ lệ sống sót của Lactiplantibacillus plantarum ATCC 13463 đạt
lần lượt 7,3 và 7,5 Log CFU/g so với tế bào tự do (0 Log CFU/g) trong điu kiện dạ dày và mật
mô phỏng, tương ứng [5]. Tương tự, hỗn hợp natri caseinat và gellan gum làm tăng tỷ lệ sống sót
của Lacticaseibacillus casei 431 so với đối chứng trong điu kiện dạ dày và mật được mô phỏng
[6]. Ngoài ra, khả năng sống sót của L. casei trong quá trình bảo quản sữa chua cũng được cải
thiện rõ rệt khi sử dụng kỹ thuật vi bao [7]. Vi bao giúp tách probiotic ra khỏi môi trường, từ đó
có thể giảm thiểu tổn thất tế bào với tỷ lệ giải phóng được kiểm soát trong các điu kiện cụ thể
như hệ tiêu hóa, đồng thời kéo dài thời hạn sử dụng sản phẩm probiotic.
Lactobacillus acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn lactic và được chứng minh có tác dụng ức chế
sự phát triển của một số vi khuẩn gây bệnh, giảm sinh tổng hợp cholesterol, phân huỷ lactose, tác
động tích cực lên hệ miễn dịch và hỗ trợ điu trị các bệnh đường tiêu hóa như táo bón, tiêu chảy
[8], [9]. Tại Việt Nam, phần lớn các nghiên cứu đu tập trung tạo hạt vi bao L. acidophilus với kích
thước là milimet, điu này ảnh hưởng đến độ đồng nhất và cảm quan của chế phẩm. Nghiên cứu
này sẽ tập trung đánh giá đặc tính probiotic của L. acidophilus CP1 và tạo vi bao kích thước
micromet bằng vật liệu alginate và chitosan để nâng cao khả năng sống sót của L. acidophilus CP1.
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Chủng vi khuẩn L. acidophilus CP1 được lưu trữ và cung cấp bởi Trung tâm Giống và Bảo tồn
nguồn gen Vi sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các chủng vi khuẩn kiểm
định như Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 11105, Pseudomonas
aeruginosa ATTC 6538, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Mycobacterium smegmatis
MC2 155 do Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật cung cấp.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đánh giá khả năng chống chịu với pH axit và chất oxy hoá
Chủng L. acidophilus CP1 được hoạt hoá từ ống giống trong glycerin -80°C và nuôi cấy qua
đêm trên môi trường De Man–Rogosa–Sharpe (MRS) lỏng. Đối với khả năng chống chịu với pH
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 3 - 10
http://jst.tnu.edu.vn 5 Email: jst@tnu.edu.vn
axit, các bình tam giác chứa môi trường MRS được chỉnh pH v pH 3, pH 4, pH 5 và pH 6 được
chuẩn bị. Đối với khả năng chống chịu với tác nhân gây oxy hóa, H2O2 được bổ sung vào môi
trường MRS sao cho nồng độ cuối cùng đạt 2 mM và 4 mM. Giống CP1 được tiếp giống sang
môi trường MRS mới sao cho mật độ tế bào ở bước sóng 600 nm đạt 0,1 và quan sát sự phát triển
trong 2 giờ ở nhiệt độ 37°C. Ngoài ra, mật độ tế bào của CP1 được xác định bằng phương pháp
chang đĩa [10].
2.2.2. Đánh giá khả năng sinh enzym ngoại bào
Khả năng sinh enzym ngoại bào của L. acidophilus CP1 được xác định theo phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch [11]. Chủng CP1 được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng có bổ sung
0,1% (w/v) skim milk, tinh bột tan, CMC ở nhiệt độ 37°C trong 3 ngày. Sau đó, 100 µL dịch
trong sau ly tâm được nhỏ vào các giếng trên môi trường thạch chứa 0,5% skim milk, tinh bột tan
và CMC. Sau đó, các đĩa được để ở 4°C nhằm khuyếch tán enzym ra môi trường và ủ ở 37°C
trong 24 giờ để quan sát vòng thuỷ phân.
2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định
Hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định được xác định bằng phương pháp đục lỗ thạch có hiệu
chỉnh [12]. Vi khuẩn kiểm định gồm S. typhimurium ATCC 14028, E. coli ATCC 11105, P.
aeruginosa ATTC 6538, S. epidermidis ATCC 12228, M. smegmatis MC2 155 được hoạt hoá trên
môi trường thạch MPA. Chủng L. acidophilus CP1 được lên men trong môi trường MRS lỏng ở
37ºC trong 3 ngày, sau đó 100 µL dịch nuôi cấy sau ly tâm được bổ sung vào các giếng đã đục lỗ
có đường kính 6 mm trên b mặt môi trường thạch có vi sinh vật kiểm định. Các đĩa môi trường
thạch được ủ ở 37°C trong 24 giờ và quan sát kết quả. Đường kính vòng kháng khuẩn được xác
định bằng hiệu của đường kính vòng phân giải và đường kính giếng (D – d; mm).
2.2.4. Phương pháp vi bao vi khuẩn probiotic
Vi bao bằng kỹ thuật nhũ hóa và tạo gel được thực hiện theo phương pháp của Mandal và Hati
(2017). Cụ thể, tế bào L. acidophilus CP1 được ly tâm, rửa 2 lần bằng nước muối sinh lý 0,9% và
kiểm tra mật độ trước khi vi bao. Sau đó, 1 mL dịch tế bào CP1 được trộn với 9 ml dung dịch
alginate 4,0% sao cho mật độ tế bào cuối cùng đạt khoảng 109 CFU/mL. Dung dịch CP1-alginate
được bổ sung vào dịch nhũ hoá trong điu kiện khuấy 20 phút đến khi hỗn hợp CP1-alginate
phân tán đu trong dầu. Dung dịch tạo gel chứa 3% (w/v) CaCl2.2H2O được nhỏ từ từ vào hỗn
hợp nhũ hóa alginate-CP1 ở khoảng cách ~7 cm cách b mặt chất lỏng và khuấy đu trong 60
phút bằng máy khuấy từ. Sau khi hỗn hợp tách lớp, lớp dầu phía trên được loại bỏ và lớp gel dưới
đáy được lọc qua giấy lọc và ly tâm rửa 3 lần với nước cất khử trùng. Cuối cùng, sản phẩm
alginate-CP1 được hòa vào dung dịch chitosan 0,5% trên máy khuấy trong 40 phút. Tiếp theo, vi
bao phủ chitosan được lọc qua giấy lọc và rửa bằng nước cất 3 lần. Mẫu vi bao được quan sát
trên kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét (SEM) [13].
2.2.5. Đánh giá hiệu suất và năng suất vi bao
Sau quá trình vi bao, các hạt vi bao được làm cứng ở 4°C trong 1 giờ và hoà trong dung dịch
sodium citrate 2% (w/v) trong 20 phút trên máy lc để giải phóng L. acidophilus CP1 trên moi
truờng thạch MRS. Dịch sau vi bao bằng alginate được thu hồi và chang đĩa trên moi truờng
thạch MRS. Mật độ tế bào CP1 sống sót ở hai mẫu đuợc xác định nhằm tính toán hiệu suất vi bao
(Encapsulation efficiency, EE) [14]: EE (%) = NE/(NE + Nn) × 100. Trong đó, NE là mật độ tế bào
trong vi bao được giải phóng và Nn là mật độ tế bào trong dịch sau vi bao bằng alginate.
Bên cạnh đó, năng suất vi bao (Encapsulation yield, EY) được xác định bằng công thức
được mô tả trước đây [14]: EY (%) = (N/N0) × 100. Trong đó, NE là mật độ tế bào vi khuẩn
trong vi bao được giải phóng và N0 là mật độ tế bào vi khuẩn ban đầu được bổ sung trong quá
trình vi bao.
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 3 - 10
http://jst.tnu.edu.vn 6 Email: jst@tnu.edu.vn
2.2.6. Đánh giá tỷ lệ sống sót của vi khuẩn trong dịch dạ dày mô phỏng và điều kiện bảo quản
khác nhau
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Malmo và cộng sự (2013) có điu chỉnh.
Cụ thể, dịch dạ dày mô phỏng gồm dung dịch PBS 0,01M được điu chỉnh v pH 2,5 với HCl
1M và 3 g/L pepsin. Tỷ lẹ sống sót của mẫu vi bao và CP1 tự do đuợc đánh giá sau 2 giờ ủ trong
dịch dạ dày mô phỏng. Mẫu vi bao được hoà trong dung dịch sodium citrate 2% (w/v), đặt trên
máy lc trong 20 phút để phá vỡ hạt vi bao và chang đĩa tren moi truờng thạch MRS để kiểm tra
mật độ tế bào. Mẫu vi bao và CP1 tự do được điu chỉnh sao cho mật độ tế bào của 2 mẫu đạt
khoảng 108 CFU/mL sau khi hoà vào dịch dạ dày mô phỏng. Mật độ tế bào CP1 sống sót đuợc
xác định bằng phuong pháp chang đĩa tren moi truờng thạch MRS ở 37°C trong 48 giờ [14].
Các mẫu vi bao và tế bào CP1 hoà trong nước muối sinh lý 0,9%, xác định mật độ tế bào và
điu chỉnh sao cho mật độ tế bào CP1 ở 2 mẫu gần tương đương nhau. Dịch từ 2 mẫu được trộn
với dung dịch chất bảo vệ (20% trehalose, 10% skim milk, 2% vitamin C sodium, 68% nước)
theo tỷ lệ 1:1. Hai mẫu được đảo trộn đu và xử lý lạnh sâu ở -80°C trong 12 giờ. Sau đó, các
mẫu được đông khô trên thiết bị Micromodulyo 0230 (ThermoScientific, USA) với điu kiện
nhiệt độ -40°C trong 12 giờ và áp suất là 0,3 mbar. Sau đó, các mẫu được bảo quản ở 30°C trong
thời gian 45 ngày. Định kỳ sau 15, 30, 45 ngày bảo quản, các mẫu được kiểm tra mật độ tế bào.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mm Excel
2010. Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. Các phân tích thống kê được
thực hiện trên phần mm GraphPad Prism v.9.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Đánh giá đặc tính probiotic của chủng vi khuẩn L. aciddophilus CP1
3.1.1. Đặc tính chống chịu với pH axit
Đối với probiotic, một trong những đặc tính quan trọng nhất là khả năng chống chịu với môi
trường pH axit từ hệ tiêu hoá ở vật chủ. Probiotic cần tồn tại trong môi trường acid dạ dày cho tới
khi đến ruột non và phát triển trong vật chủ, từ đó phát huy lợi ích của chúng [15]. Kết quả Hình
1A cho thấy chủng L. acidophilus CP1 sinh trưởng và phát triển mạnh ở pH 4; pH 5 và pH 6 với
OD600nm đạt lần lượt 2,11 ± 0,03; 2,06 ± 0,01 và 1,96 ± 0,01 sau 12 giờ nuôi cấy. Đáng chú ý,
không có sự khác biệt đáng kể v giá trị OD600nm giữa pH 4 và pH 6 (p >0,05). Tuy nhiên, khi
nuôi cấy ở pH 3, pha sinh trưởng của chủng CP1 bị kéo dài và giá trị OD600nm giảm rõ rệt sau 12
giờ nuôi cấy (0,96 ± 0,01).
Hình 1. Ảnh hưởng của dải pH (A) và nồng độ H2O2 (B) tới sự sinh trưởng và phát triển
của chủng L. acidophilus CP1
TNU Journal of Science and Technology
230(05): 3 - 10
http://jst.tnu.edu.vn 7 Email: jst@tnu.edu.vn
Độ pH trong dạ dày có thể thay đổi tùy theo từng thời điểm. Khi tiêu hoá thức ăn dạ dày sẽ
axit hoá và tiết ra các protease nhằm thuỷ phân protein nên pH trong dạ dày sẽ dao động trong
khoảng pH 2-3. Sau khi thức ăn đã được tiêu hóa, độ pH sẽ trở v trạng thái ban đầu (pH 4-5).
Khả năng chịu pH axit của nhóm vi khuẩn lactic được cho là liên quan đến sự chênh lệch nồng độ
không đổi giữa pH ngoại bào và tế bào chất [1]. Nồng độ pH nội bào ở các chủng vi khuẩn lactic
được duy trì nhờ sự hoạt động của bơm proton F0F1 ATPase ở màng tế bào [15].
3.1.2. Khả năng kháng với tác nhân oxy hóa
Bên cạnh đó, chủng CP1 cũng có khả năng chống chịu mạnh với tác nhân oxy hoá H2O2. Môi
trường MRS chứa 2 mM H2O2 (89,4 ± 2,5%) làm giảm nhẹ mật độ tế bào CP1 so với mẫu đối
chứng (100%) (Hình 1B). Tại nồng độ 4 mM H2O2, tỷ lệ tế bào sống giảm xuống còn 66,6 ±
6,9%. Ở mức độ thấp hơn, 0,5 mM H2O2 làm giảm 60% mật độ tế bào vi khuẩn probiotic
Limosilactobacillus reuteri PL503 [16]. Kết quả này minh chứng rằng đặc tính chống chịu với
các gốc oxy hoá tự do của chủng CP1 là khá cao. Khả năng chống chịu với H2O2 của chủng CP1
có thể do sự có mặt của các chất thiol có khối lượng phân tử nhỏ glutathione đóng vai trò quan
trọng trong việc giữ tế bào chất luôn ở trạng thái khử, bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi các chất oxy
hoá và tăng cường khả năng sống sót của vi khuẩn trong môi trường khc nghiệt. Ngoài ra, khi
gặp điu kiện oxy hoá, hệ thống enzym chống oxy hoá như alkyl hydroperoxide, thioredoxin,
thioredoxin reductase, superoxide dismutasem peroxidase đã được kích hoạt [15].
3.1.3. Khả năng ức chế vi khuẩn kiểm định và sinh enzyme ngoại bào
Khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định là một đặc tính rất quan trọng của vi khuẩn
probiotic để cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Chủng L.acidophilus CP1 thể hiện hoạt tính
kháng khuẩn đối với 3/5 chủng vi khuẩn khảo sát, thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn đạt
7,5 ± 1,8 mm đối với P. aeruginosa ATTC 6538; 14,0 ± 1,7 mm đối với E. coli ATCC 11105 và
17,1 ± 1,2 mm đối với M. smegmatis MC2 155 (Bảng 1). Tại một nghiên cứu khác, các chủng L.
acidophilus phân lập từ các mẫu mật ong chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với S. aureus ATCC
25923, S. epidermis ATCC 12228 và Bacillus subtilis ATCC 21322 [17]. L. acidophilus ATCC
4356 phân lập từ hầu của con người có khả năng kháng các dòng E. coli gây bệnh đường tiết niệu
[18]. Những kết quả này cho thấy các hoạt tính kháng khuẩn có sự dao động giữa các chủng L.
acidophilus khác nhau tuỳ thuộc nguồn phân lập. Cơ chế ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây
bệnh nhiu khả năng do các chất kháng khuẩn như bacteriocin [17].
Bảng 1. Đặc tính kháng vi khuẩn kiểm định và sinh enzym ngoại bào của chủng L. acidophilus CP1
Chỉ tiêu
Đường kính vòng kháng khuẩn/thuỷ phân (mm)
Vi khuẩn kiểm định
S. typhimurium ATCC 14028
-
S. epidermidis ATCC 12228
-
M. smegmatis MC2 155
17,1 ± 1,2
E. coli ATCC 11105
14,0 ± 1,7
P. aeruginosa ATTC 6538
7,5 ± 1,8
Cơ chất sinh enzym
Skim milk
14,3 ± 0,6
CMC
-
Tinh bột tan
-
Ghi chú: (-): âm tính
Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn L. acidophilus CP1 được xác định
thông qua đường kính vòng phân giải các cơ chất như tinh bột tan, skim milk và CMC trên môi
trường thạch. Chủng L. acidophilus CP1 có khả năng sinh protease với đường kính vòng phân
giải là 14,3 ± 0,6 mm (Bảng 1). Trong khi đó, CP1 không có khả năng sinh amylase và cellulase.