Câu 1: Nêu khái ni m v nuôi c y mô, t bào th c v t? Các k thu t nuôi c yệ ề ấ ế ự ậ ỹ ậ ấ
chính và ng d ng?ứ ụ
Khái ni mệ: nuôi c y mô t bào th c v t là ph m trù khái ni m chung cho t t cấ ế ự ậ ạ ệ ấ ả
các lo i nuôi c y nguyên li u th c v t hoàn toàn s ch các vi sinh v t, trên môiạ ấ ệ ự ậ ạ ậ
tr ng dinh d ng nhân t o, trong đi u ki n vô trùng.ườ ưỡ ạ ề ệ
Nuôi c y mô, t bào th c v t còn g i là nuôi c y th c v t in vitroấ ế ự ậ ọ ấ ự ậ
Nuôi c y mô, t bào th c v t bao g m hoang lo t các k thu t khác nhau và có khấ ế ự ậ ồ ạ ỹ ậ ả
năng ng d ng r ng rãi trong r t nhi u lĩnh v c.ứ ụ ộ ấ ề ự
Các k thu t nuôi c y chính và ng d ng c a nó:ỹ ậ ấ ứ ụ ủ
-- Nuôi c y h t gi ng: tăng kh năng n y m m c a các h t khó n y m m trong đi uấ ạ ố ả ả ầ ủ ạ ả ầ ề
ki n bình th ng. Thúc đ y quá trình này m m b ng cách b sung các ch t đi u tiêtệ ườ ẩ ầ ằ ổ ấ ề
sinh tr ng. T o ra cây con dùng cho nuôi c y merisrem ho c các b ph n khácưở ạ ấ ặ ộ ậ
-- Hoa cái: th ph n trong ng nghi m ph c v lai xa. T o đ n b i và t o đa phôiụ ấ ố ệ ụ ụ ạ ơ ộ ạ
-- Hoa đ c: t o mô s o và cây đ n b i. T o đ t bi n m c đ n b i. T o dòng đ ngự ạ ẹ ơ ộ ạ ộ ế ở ứ ơ ộ ạ ồ
h p tợ ử
-- Phôi h p t : nuôi c y c u phôi khi lai xa. Nhân các dòng lai xa. Phá ng ngh c aợ ử ấ ứ ủ ỉ ủ
h t.ạ
-- Mô s o: t o phôi vô tính. Nuôi c y t bào đ n và tách t bào tr n. T o cây có bi nẹ ạ ấ ế ơ ế ầ ạ ế
d somaị
-- T bào: t o đ t bi n m c đ t bào. T o t bào tr n đ lai vô tính. Bi n n pế ạ ộ ế ở ứ ộ ế ạ ế ầ ể ế ạ
gen. Nuôi c y t bào đ nấ ế ơ
-- Đ nh ch i: t o nhân nhanh dòng đ ng nh t v di truy n. Làm s ch virus. Nguyênỉ ồ ạ ồ ấ ề ề ạ
c u -sinh lý phát tri nứ ể
-- Phân hóa phôi vô tính: là đ ng h ng tái sinh ch y u. ng d ng: nhân nhanh,ườ ướ ủ ế ứ ụ
s n xu t h t nhân t o. Cung c p v t li u đ t o các protoplast có kh năng sinhả ấ ạ ạ ấ ậ ệ ể ạ ả
phôi. Cho phép c khí hóa quá trình nuôi c y và s d ng bioreactorơ ấ ử ụ
-- Đ t bi n soma: phân l p các bi n d có ích ki u hình lý t ng song còn thi uộ ế ậ ế ị ở ể ưở ế
m t s tính tr ng mong mu n. Phân l p các bi n d có tích đ s n xu t các h p ch tộ ố ạ ố ậ ế ị ể ả ấ ợ ấ
ch ng ch u stress t t h n. T o các bi n d di truy n không qua l i h u tính nh ngố ị ố ơ ạ ế ị ề ạ ữ ở ữ
dòng u túư
Câu 2: Nêu nh ng u đi m c a ph ng pháp nuôi c y mô – t bào th c v tữ ư ể ủ ươ ấ ế ự ậ
so v i các ph ng pháp truy n th ng khác?ớ ươ ề ố
Th nh t: vi nhân gi ng (micropropagation)ứ ấ ố
- Th c hi n trong phòng thí nghi m, không ch u nh h ng c a th i ti t, mùaự ệ ệ ị ả ưở ủ ờ ế
v . Ch đ ng s n xu t cây gi ng.ụ ủ ộ ả ấ ố
- Sinh s n vô tính t o ra m t l ng l n cây gi ng gi nguyên b n ch t di truy nả ạ ộ ượ ớ ố ữ ả ấ ề
nh cây m .ư ẹ
- H s nhân cao, t c đ tăng tr ng nhanh và rút ng n th i gian ra hoa quệ ố ố ộ ưở ắ ờ ả
v i nh ng cây lâu năm.ớ ữ
- S n xu t h t nhân t o.ả ấ ạ ạ
Th hai, ch n và t o gi ng in vitroứ ọ ạ ố
- Ch n các dòng kháng vi rút, ch u l nh, ch u h n, ...ọ ị ạ ị ạ
1
- T o dòng thu n nhanh b ng cách nuôi c y bao ph n r i đa b i hoá nh hoáạ ầ ằ ấ ấ ồ ộ ờ
ch t.ấ
- T o cây tr ng bi n đ i gen mang nhi u tính tr ng quý.ạ ồ ế ổ ề ạ
- Dung h p t bào tr nơ ế ầ
Th ba, s n xu t các hoá ch t có ho t tính sinh h cứ ả ấ ấ ạ ọ
- S n xu t ch đ ng và liên t c trong phòng thí nghi m không ph thu c vào tả ấ ủ ộ ụ ệ ụ ộ ự
nhiên và mua v .ụ
- Nhi u h p ch t sinh h c ph c t p nhân đ c t t bào nuôi c y.ề ợ ấ ọ ứ ạ ượ ừ ế ấ
- Ch n các dòng t bào s n xu t các ch t v i năng su t cao h n cây ngoài tọ ế ả ấ ấ ớ ấ ơ ự
nhiên
- Thu nhân nhi u ch t quý hi m mà t ng h p hoá h c r t đ t. B n thân cây đóề ấ ế ổ ợ ọ ấ ắ ả
tăng tr ng ch m, sinh s n khó khăn thì nuôi c y mô và kh ng ch t o môưở ậ ả ấ ố ế ạ
(mô r ) s n sinh ra nhi u ch t đóễ ả ề ấ
-
Câu 3: Trình bày c s khoa h c c a ph ng pháp nuôi c y mô – t bào?ơ ở ọ ủ ươ ấ ế
*C u trúc chung c a t bào th c v tấ ủ ế ự ậ
-H c thuy t t bào:ọ ế ế Schleiden và Schwann (1839) đã đ c l p đ a ra k t lu n:ộ ậ ư ế ậ
- C th th c v t v đ ng v t đ u do các t bào h p thành và t bào là đ n v c uơ ể ự ậ ầ ộ ậ ề ế ợ ế ơ ị ấ
trúc và ch c năng c a t t c m i c th s ngứ ủ ấ ả ọ ơ ể ố
- T bào là đ n v c u trúc và ch c năng c a c th th c v t b i t bào r t đa d ngế ơ ị ấ ứ ủ ơ ể ự ậ ở ế ấ ạ
nh ng t ch c theo nguyên tác c u trúc th ng nh t và có t t c các đ c tính c a thư ổ ứ ấ ố ấ ấ ả ặ ủ ệ
th ng s ng:ố ố
-Trao đ i ch t và năng l ngổ ấ ượ
-Sinh tr ng, phát tri n và sinh s nưở ể ả
-Di truy n cho th h sau đ c tính c a mìnhề ế ệ ặ ủ
-Có kh năng t n t i đ c l p và phân chia trên môi tr ng dinh d ng. Trongả ồ ạ ộ ậ ườ ưỡ
đi u ki n nuôi c y thích h p t bào có th tái sinh và phát tri n thành c thề ệ ấ ợ ế ể ể ơ ể
nguyên v n.ẹ
* Tính toàn năng c a t bào (totipotency):ủ ế Haberlandt (1902), l n đ u tiên quan ni mầ ầ ệ
răng: M i m t t bào b t kỳ c a m t c th sinh v t đa bào đ u có kh năng ti mỗ ộ ế ấ ủ ộ ơ ể ậ ề ả ề
tàng đ phát tri n thành m t cá th hoàn ch nh.ể ể ộ ể ỉ
-Theo quan ni m c a sinh h c hi n đ i: M i t bào riêng r đã phân hóa đ uệ ủ ọ ệ ạ ỗ ế ẽ ề
mang toàn b l ng thông tin di truy n c n thi t và đ c a c c th sinh v tộ ượ ề ầ ế ủ ủ ả ơ ể ậ
đó. Khi g p đi u ki n thích h p, m i t bào đ u có th phát tri n thành m t cáặ ề ệ ợ ỗ ế ề ể ể ộ
th hoàn ch nh.ể ỉ
-Tính toàn năng c a t bào mà Haberlandt nêu ra chính là c s lý lu n c aủ ế ơ ơ ậ ủ
ph ng pháp nuôi c y mô - t bào.ươ ấ ế
*S bi u hi n tính toàn năng c a t bào trong nuôi c y in vitro:ự ể ệ ủ ế ấ
•Quá trình t ngu n v t li u ban đ u là t bào ho c mô th c v t nuôi c y phânừ ồ ậ ệ ầ ế ặ ự ậ ấ
hóa thành cây hoàn ch nh đ c g i là s bi u hi n v tính toàn năng c a tỉ ượ ọ ự ể ệ ề ủ ế
bào th c v t.ự ậ
2
• Kh năng bi u hi n tính toàn năng c a các t bào, mô c a c th là khácả ể ệ ủ ế ủ ơ ể
nhau.
• Tính toàn năng c a t bào nuôi c y in vitro bi u hi n tr i qua 3 giai đo n:ủ ế ấ ể ệ ả ạ
+ T bào ph n bi t hóa v i s phát sinh t bào kh bi nế ả ệ ớ ự ế ả ế
+ Đ nh h ng phân hóa t bàoị ướ ế
+ Phát sinh hình thái, phát sinh c quanơ
*S phân hóa, ph n phân hóa t bào và s hình thành t bào kh bi n:ự ả ế ự ế ả ế S phân hóaự
t bào : ế
–T bào phôi sinh ế◊ t bào mô chuyên hóa, đ m b o ch c năng chuyênế ả ả ứ
bi t.ệ
–Vd: mô d u, mô bì, mô m m, mô d nậ ề ẫ
•S ph n phân hóa:ự ả
- S ph n phân hóa là quá trình t bào đã phân hóa (chuyên hóa) trong m t đi uự ả ế ộ ề
ki n nh t đ nh, khôi ph c kh năng phân chia chuy n thành t bào phân sinh vàệ ấ ị ụ ả ể ế
hình thành mô s o. ẹ
Trong đó có m t b ph n t bào hình thành t bào c m ng phát sinh hình thái, t cộ ộ ậ ế ế ả ứ ứ
là t bào có th c m th tín hi u kích thích phân t , t đó xác đ nh đ ng h ngế ể ả ụ ệ ử ừ ị ườ ướ
m i c a s sinh tr ng và phát tri n t bàoớ ủ ự ưở ể ế
•Đi u khi n s phân hóa và ph n phân hóa t bào th c v t d n đ n s phátề ể ự ả ế ự ậ ẫ ế ự
sinh hình thái trong nuôi c y mô t bào th c v t.ấ ế ự ậ
•Nuôi c y mô t bào th c v t chính là đi u khi n s phát sinh hình thái c a tấ ế ự ậ ề ể ự ủ ế
bào, mô nuôi c yấ
Câu 4. Nêu các thành ph n chính c a môi tr ng dinh d ng nuôi c y mô – tầ ủ ườ ưỡ ấ ế
bào th c v t in vitroự ậ
M«i trưêng nu«i cÊy lµ ®iÒu kiÖn tèi cÇn thiÕt, lµ yÕu tè quyÕt ®Þnh cho sù ph©n
hãa tÕ bµo vµ c¬ quan trong nu«i cÊy. Cã nhiÒu lo¹i m«i trưêng nu«i cÊy cho c¸c lo¹i
thùc vËt kh¸c nhau vµ môc ®Ých nu«i cÊy kh¸c nhau. M«i trưêng thưêng bao gåm c¸c
thµnh phÇn chÝnh sau ®©y:
• Nguyªn tè ®a lưîng
•Nguyªn tè vi lưîng
•Nguån c¸c bon h÷u c¬
•C¸c vitamin
•ChÊt ®iÒu tiÕt sinh trưëng thùc vËt
•C¸c hçn hîp chÊt tù nhiªn
•ChÊt lµm ®«ng m«i trưêng
C¸c nguyªn tè ®a lưîng:
C¸c nguyªn tè kho¸ng chÊt mµ thùc vËt cÇn thiÕt khi nång ®é lín h¬n 0,5 mM/l gäi
lµ nguyªn tè ®¹i lưîng
C¸c nguyªn tè: N, P, K, S, Mg, Ca, lµ cÇn thiÕt vµthay ®æi tïy theo ®èi tưîng nu«i
cÊy. Nãi chung, nång ®é mçi nguyªn tè nãi trªn trong m«i trưêng > 30ppm. Chóng
lµ nguyªn liÖu ®Ó tÕ bµo x©y dùng nªn thµnh phÇn cÊu tróc cña m×nh.
C¸c nguyªn tè vi lưîng: C¸c nguyªn tè kho¸ng mà thùc vËt cÇn thiÕt cã nång ®é nhá
h¬n 0,5 mM/l gäi là nguyªn tè vi lưîng.Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, I, Co là c¸c nguyªn tè
3
vi lưîng thưêng ®ưîc dïng trong m«i trưêng nu«i cÊy in vitro. C¸c nguyªn tè nμy ®ãng
vai trß quan träng trong c¸c ho¹t ®éng cña enzym. Chóng ®ưîc dïng víi nång ®é mçi
nguyªn tè <30ppm và tuú thuéc vào lo¹i m«i trưêng mà hàm lưîng và tû lÖ cña chóng
sÏ thay®æi
Trong m«i trưêng nu«i cÊy, Fe thưêng ®ưîc dïng dưíi d¹ng muèi phøc (chelat): Fe-
EDTA, Fe-citrate
Nguån c¸c bon h÷u c¬:
Khi nu«i cÊy in vitro tÕ bào, m« thùc vËt sèng chñ yÕu theo phư¬ng thøc dÞ dưìng.
V× vËy, cÇn nguån cac bon h÷u c¬ và thưêng dïng là ®ưêng saccaroza và víi liÒu
lưîng 20 -30g/lÝt. Trong mét sè trưêng hîp ®Æc biÖt, cã thÓ sö dông nguån ®ưêng
kh¸c như glucoza, maltoza , galactoza và lactoza
C¸c vitamin.
M«, tÕ bào nu«i cÊy in vitro cã thÓ tù tæng hîp vitamin nhưng kh«ng ®ñ cho ho¹t
®éng sèng cña chóng nªn cÇn bæ sung thªm vitamin vào m«i trưêng nu«i cÊy §¸ng
chó ý là c¸c vitamin: thiamin, axit nicotinic, pyridoxin và riboflavin. Nång ®é thưêng
dïng kho¶ng 1mg/lÝt. C¸c vitamin này ®ãng vai trß quan träng trong tÕ bào v× chóng
là c¸c co-enzym. Myo-inositol cÇn ®ưîc bæ xung vμo mét lưîng kh¸ lín 50 -
100mg/lÝt, chÊt này tá ra cã t¸c dông kh¸ râ ®Õn sù ph©n chia cña tÕ bμo.
C¸c chÊt ®iÒu tiÕt sinh truëng.
C¸c chÊt ®iÒu tiÕt sinh trưëng là yÕu tè quan träng nhÊt trong m«i trưêng quyÕt
®Þnh kÕt qu¶ nu«i cÊy auxin và xytokinin ®ưîc sö dông nhiÒu h¬n c¶ trong nu«i cÊy
invitro.
*Auxin kÝch thÝch sù h×nh thành m« sÑo và t¹o rÔ bÊt ®Þnh, kÝch thÝch sù d_n
cña tÕ bào. C¸c auxin thưêng sö dông là: 2,4 - Dicloro phenoxy axetic axit (2,4D), α-
naphtylaxetic axit (α - NAA), Indolaxetic axit (IAA). Nång ®é sö dông:10-5-10-7 M/l
*Xytokinin kÝch thÝch sù ph©n chia tÕ bào và quyÕt ®Þnh sù ph©n hãa chåi. C¸c
xytokinin thưêng ®ưîc sö dông là Benzyladenin (BA), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2
iP) và Zeatin (mét chÊt tù nhiªn). Nång ®é sö dông: 10-5 - 10-7 M
*Tû lÖ Auxin/Xytokinin quyÕt ®Þnh sù ph©n hãa cña mÉu cÊy theo hưíng t¹o rÔ,
chåi hay m«
sÑo.
C¸c hçn hîp chÊt tù nhiªn
Là thành phÇn thưêng ®ùoc sñ dông nhưng kh«ng ph¶i là thành phÇn b¾t buéc.
Chóng làm gia t¨ng thành phÇn dinh dưìng và chÊt cã ho¹t tÝnh sinh lý cho m«i
trưêng nªn kÝch thÝch sù sinh trưëng và ph©n ho¸ cña mÉu c©y.Thưêng bao gåm:
* Nưíc dõa: thưêng chøa c¸c axit amin, axit h÷u c¬, ®ưêng, ARN, AND. §Æc biÖt
trong nưíc dõa cã chøa nh÷ng hîp chÊt quan träng cho nu«i cÊy invitro ®ã là:
myoinositol, c¸c hîp chÊt cã ho¹t tÝnh auxin, c¸c glucosit cña xytokinin.
* DÞch nghiÒn cña 1 sè rau, qu¶ tư¬i (khoai t©y, cà rèt, chuèi, t¸o…): Thành phÇn
hãa häc cã: ®ưêng, axit nucleic, axit amin, vitamin, kho¸ng…
* DÞch thñy ph©n casein (casein hydrolysat) hay pepton : chñ yÕu ®ưîc sö dông làm
nguån bæ xung axit amin.
ChÊt làm ®«ng cøng m«i trưêng - Agar.
4
Agar là mét lo¹i polysaccarit cña t¶o. ë 80 0C th¹ch ngËm nưíc chuyÓn sang tr¹ng th¸i
sol cßn ë 40 0C th× trë vÒ tr¹ng th¸i gel. Kh¶ n¨ng ngËm nưíc cña th¹ch kh¸ cao: 6 -
12 gam/lÝt nưíc. Th¹ch ë d¹ng gel nhưng vÉn ®Ó cho c¸c ion vËn chuyÓn dÔ dung
và cã ®é tho¸ng khÝ cao. Nång ®é trung b×nh 6 - 8g/lÝt
Câu 5 Có m y nhóm ch t đi u hòa sinh tr ng? Nêu vai trò c a chúng trongấ ấ ề ưở ủ
đi u khi n s phát sinh hình thái c a mô, t bào th c v t nuôi c y in vitro?ề ể ự ủ ế ự ậ ấ
Bên c nh các ch t cung c p dinh d ng cho mô nuôi c y, vi c b sung m t ho cạ ấ ấ ưỡ ấ ệ ổ ộ ặ
nhi u ch t đi u hòa sinh tr ng nh auxin, cytokinin và giberellin là r t c n thi t đề ấ ề ưở ư ấ ầ ế ể
kích thích s sinh tr ng, phát tri n và phân hoá c quan, cung c p s c s ng t t choự ưở ể ơ ấ ứ ố ố
mô và các t ch c. Tuy v y, yêu c u đ i v i nh ng ch t này thay đ i tuỳ theo loàiổ ứ ậ ầ ố ớ ữ ấ ổ
th c v t, lo i mô, hàm l ng ch t đi u hòa sinh tr ng n i sinh c a chúng. Các ch tự ậ ạ ượ ấ ề ưở ộ ủ ấ
đi u hoà sinh tr ng th c v t đ c chia thành các nhóm chính sau đây:ề ưở ự ậ ượ
A. Nhóm auxin
Môi tr ng nuôi cây đ c bô sung cac auxin khac nhau nh : 1H- indole-3-acetic acidươ) * ươ+ , * * ư
(IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-
dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) va naphthoxyacetic acid (NOA))
Vai trò:
- Kích thích phân chia và kéo dài t bào ế
- Ch i đ nh cung c p auxin gây ra c ch sinh tr ng c a ch i bên. u th ch iồ ỉ ấ ứ ế ưở ủ ồ Ư ế ồ
đ nh làm c ch sinh tr ng c a ch i nách. N u ng t b ch i đ nh s d n đ n sỉ ứ ế ưở ủ ồ ế ắ ỏ ồ ỉ ẽ ẫ ế ự
phát ch i nách. N u thay th vai trò c a ch i đ nh (đã b ng t b ) b ng m t l p ch tồ ế ế ủ ồ ỉ ị ắ ỏ ằ ộ ớ ấ
keo có ch a IAA thì ch i nách v n b c ch sinh tr ng. C ch c ch c a ch iứ ồ ẫ ị ứ ế ưở ơ ế ứ ế ủ ồ
đ nh liên quan đ n m t ch t đi u hoà sinh tr ng khác là ethylene. Auxin (IAA) kíchỉ ế ộ ấ ề ưở
thích ch i bên s n sinh ra ethylen làm c ch sinh tr ng c a ch i đ nh. ồ ả ứ ế ưở ủ ồ ỉ
- IAA đóng vai trò kích thích s phân hoá c a các mô d n (xylem and phloem). ự ủ ẫ
- Auxin kích thích s m c r cành giâm và kích thích s phát sinh ch i ph trongự ọ ễ ở ự ồ ụ
nuôi c y mô. ấ
- Auxin có các nh h ng khác nhau đ i v i s r ng lá, qu , s đ u qu , s phátả ưở ố ớ ự ụ ả ự ậ ả ự
tri n và chín c a qu , sể ủ ả ự
ra hoa trong m i quan h v i đi u ki n môi tr ng. ố ệ ớ ề ệ ườ
- T o và nhân nhanh mô s o (callus) ạ ẹ
- Kích thích t o ch i b t đ nh ( n ng đ th p) ạ ồ ấ ị ở ồ ộ ấ
- T o phôi soma (2,4-D) ạ
B. Nhóm các cytokinin
Cac cytokinin la dân xuât cua adenine, đây la nh ng hormone liên quan chu yêu đên* ) / * , ) ư/ , * *
s phân chia tê bao, s thay đôi u thê ngon va phân hoa chôi trong nuôi cây mô.ư+ * ) ư+ , ư * + ) * ) *
Cac cytokinin đ c s dung th ng xuyên nhât la 6-benzylaminopurine (BAP) hoăc* ươ+ ư, + ươ) * ) +
6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-
5