Đề cương nuôi cấy mô tế bào

Chia sẻ: Huongdt Biotech | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:20

Thêm vào BST

Báo xấu

430
lượt xem 124
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề cương nuôi cấy mô tế bào

Câu 1: Nêu khái niệm về nuôi cấy mô, tế bào thực vật? Các kỹ thuật nuôi cấy chính và ứng dụng? Khái niệm: nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro Nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm hoang loạt các kỹ thuật khác nhau và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực. Các kỹ thuật nuôi cấy chính và ứng dụng của nó: -- Nuôi cấy hạt giống: tăng khả năng nảy mầm của các hạt khó nảy mầm trong đi ều kiện bình thường. Thúc đẩy quá trình này mầm bằng cách bổ sung các chất đi ều tiêt sinh trưởng. Tạo ra cây con dùng cho nuôi cấy merisrem hoặc các bộ phận khác -- Hoa cái: thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa. Tạo đơn bội và tạo đa phôi -- Hoa đực: tạo mô sẹo và cây đơn bội. Tạo đột biến ở mức đơn bội. Tạo dòng đồng hợp tử -- Phôi hợp tử: nuôi cấy cứu phôi khi lai xa. Nhân các dòng lai xa. Phá ng ủ ngh ỉ c ủa hạt. -- Mô sẹo: tạo phôi vô tính. Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trần. Tạo cây có bi ến dị soma -- Tế bào: tạo đột biến ở mức độ tế bào. Tạo tế bào trần để lai vô tính. Bi ến nạp gen. Nuôi cấy tế bào đơn -- Đỉnh chồi: tạo nhân nhanh dòng đồng nhất về di truy ền. Làm sạch virus. Nguyên cứu -sinh lý phát triển -- Phân hóa phôi vô tính: là đường hướng tái sinh chủ yếu. ứng dụng: nhân nhanh, sản xuất hạt nhân tạo. Cung cấp vật liệu để tạo các protoplast có khả năng sinh phôi. Cho phép cơ khí hóa quá trình nuôi cấy và sử dụng bioreactor -- Đột biến soma: phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song còn thi ếu một số tính trạng mong muốn. Phân lập các biến dị có tích để sản xuất các hợp chất chống chịu stress tốt hơn. Tạo các biến dị di truyền không qua lại hữu tính ở những dòng ưu tú Câu 2: Nêu những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào th ực v ật so với các phương pháp truyền thống khác?  Thứ nhất: vi nhân giống (micropropagation) - Thực hiện trong phòng thí nghiệm, không chịu ảnh hưởng của thời ti ết, mùa vụ. Chủ động sản xuất cây giống. - Sinh sản vô tính tạo ra một lượng lớn cây giống giữ nguyên bản chất di truy ền như cây mẹ. - Hệ số nhân cao, tốc độ tăng trưởng nhanh và rút ngắn thời gian ra hoa qu ả với những cây lâu năm. - Sản xuất hạt nhân tạo.  Thứ hai, chọn và tạo giống in vitro - Chọn các dòng kháng vi rút, chịu lạnh, chịu hạn, ... 1
Tạo dòng thuần nhanh bằng cách nuôi cấy bao phấn rồi đa bội hoá nh ờ hoá - chất. Tạo cây trồng biến đổi gen mang nhiều tính trạng quý. - Dung hơp tế bào trần - Thứ ba, sản xuất các hoá chất có hoạt tính sinh học  Sản xuất chủ động và liên tục trong phòng thí nghiệm không phụ thuộc vào tự - nhiên và mua vụ. Nhiều hợp chất sinh học phức tạp nhân được từ tế bào nuôi cấy. - Chọn các dòng tế bào sản xuất các chất với năng suất cao hơn cây ngoài t ự - nhiên Thu nhân nhiều chất quý hiếm mà tổng hợp hoá học rất đắt. Bản thân cây đó - tăng trưởng chậm, sinh sản khó khăn thì nuôi cấy mô và khống chế tạo mô (mô rễ) sản sinh ra nhiều chất đó - Câu 3: Trình bày cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào? *Cấu trúc chung của tế bào thực vật -Học thuyết tế bào:Schleiden và Schwann (1839) đã độc lập đưa ra kết luận: - Cơ thể thực vật vầ động vật đều do các tế bào hợp thành và tế bào là đ ơn v ị c ấu trúc và chức năng của tất cả mọi cơ thể sống - Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của cơ thể thực vật bởi tế bào rất đa dạng nhưng tổ chức theo nguyên tác cấu trúc thống nhất và có tất cả các đặc tính của th ệ thống sống: - Trao đổi chất và năng lượng - Sinh trưởng, phát triển và sinh sản - Di truyền cho thế hệ sau đặc tính của mình - Có khả năng tồn tại độc lập và phân chia trên môi trường dinh d ưỡng. Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp tế bào có thể tái sinh và phát tri ển thành c ơ th ể nguyên vẹn. * Tính toàn năng của tế bào (totipotency): Haberlandt (1902), lần đầu tiên quan niệm răng: Mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đ ều có kh ả năng ti ềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. - Theo quan niệm của sinh học hiện đại: Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đ ều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. - Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sơ lý luận c ủa phương pháp nuôi cấy mô - tế bào. *Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy in vitro: • Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy phân hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng c ủa t ế bào thực vật. 2
Khả năng biểu hiện tính toàn năng của các tế bào, mô của cơ thể là khác • nhau. • Tính toàn năng của tế bào nuôi cấy in vitro biểu hiện trải qua 3 giai đoạn: + Tế bào phản biệt hóa với sự phát sinh tế bào khả biến + Định hướng phân hóa tế bào + Phát sinh hình thái, phát sinh cơ quan *Sự phân hóa, phản phân hóa tế bào và sự hình thành tế bào khả biến: Sự phân hóa tế bào : – Tế bào phôi sinh ◊ tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo chức năng chuyên biệt. – Vd: mô dậu, mô bì, mô mềm, mô dẫn • Sự phản phân hóa: - Sự phản phân hóa là quá trình tế bào đã phân hóa (chuyên hóa) trong một đi ều kiện nhất định, khôi phục khả năng phân chia chuyển thành tế bào phân sinh và hình thành mô sẹo. Trong đó có một bộ phận tế bào hình thành tế bào cảm ứng phát sinh hình thái, t ức là tế bào có thể cảm thụ tín hiệu kích thích phân tử, từ đó xác đ ịnh đường hướng mới của sự sinh trưởng và phát triển tế bào • Điều khiển sự phân hóa và phản phân hóa tế bào thực vật dẫn đến sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. • Nuôi cấy mô tế bào thực vật chính là điều khiển sự phát sinh hình thái c ủa t ế bào, mô nuôi cấy Câu 4. Nêu các thành phần chính của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô – tế bào thực vật in vitro M«i trưêng nu«i cÊy lµ ®iÒu kiÖn tèi cÇn thiÕt, lµ yÕu tè quyÕt ®Þnh cho sù ph©n hãa tÕ bµo vµ c¬ quan trong nu«i cÊy. Cã nhiÒu lo¹i m«i tr ưêng nu«i cÊy cho c¸c lo¹i thùc vËt kh¸c nhau vµ môc ®Ých nu«i cÊy kh¸c nhau. M«i tr ưêng thưêng bao gåm c¸c thµnh phÇn chÝnh sau ®©y: • Nguyªn tè ®a lưîng • Nguyªn tè vi lưîng • Nguån c¸c bon h÷u c¬ • C¸c vitamin • ChÊt ®iÒu tiÕt sinh trưëng thùc vËt • C¸c hçn hîp chÊt tù nhiªn • ChÊt lµm ®«ng m«i trưêng C¸c nguyªn tè ®a lưîng: C¸c nguyªn tè kho¸ng chÊt mµ thùc vËt cÇn thiÕt khi nång ®é lín h¬n 0,5 mM/l gäi lµ nguyªn tè ®¹i lưîng C¸c nguyªn tè: N, P, K, S, Mg, Ca, lµ cÇn thiÕt vµthay ®æi tïy theo ®èi t ưîng nu«i cÊy. Nãi chung, nång ®é mçi nguyªn tè nãi trªn trong m«i tr ưêng > 30ppm. Chóng lµ nguyªn liÖu ®Ó tÕ bµo x©y dùng nªn thµnh phÇn cÊu tróc cña m×nh. C¸c nguyªn tè vi lưîng: C¸c nguyªn tè kho¸ng mà thùc vËt cÇn thiÕt cã nång ®é nhá h¬n 0,5 mM/l gäi là nguyªn tè vi lưîng.Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, I, Co là c¸c nguyªn tè 3
vi lưîng thưêng ®ưîc dïng trong m«i trưêng nu«i cÊy in vitro. C¸c nguyªn tè nμy ®ãng vai trß quan träng trong c¸c ho¹t ®éng cña enzym. Chóng ® ưîc dïng víi nång ®é mçi nguyªn tè
Agar là mét lo¹i polysaccarit cña t¶o. ë 80 0C th¹ch ngËm nưíc chuyÓn sang tr¹ng th¸i sol cßn ë 40 0C th× trë vÒ tr¹ng th¸i gel. Kh¶ n¨ng ngËm n ưíc cña th¹ch kh¸ cao: 6 - 12 gam/lÝt nưíc. Th¹ch ë d¹ng gel nhưng vÉn ®Ó cho c¸c ion vËn chuyÓn dÔ dung và cã ®é tho¸ng khÝ cao. Nång ®é trung b×nh 6 - 8g/lÝt Câu 5 Có mấy nhóm chất điều hòa sinh trưởng? Nêu vai trò của chúng trong điều khiển sự phát sinh hình thái của mô, tế bào thực vật nuôi cấy in vitro? Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một ho ặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thi ết đ ể kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đ ổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây: A. Nhóm auxin Môi trường nuôi cây được bổ sung cac auxin khac nhau như: 1H- indole-3-acetic acid ́ ́ ́ (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA) Vai trò: - Kích thích phân chia và kéo dài tế bào - Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. Ưu thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách. Nếu ngắt bỏ chồi đ ỉnh sẽ dẫn đ ến s ự phát chồi nách. Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một l ớp ch ất keo có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng. Cơ chế ức ch ế c ủa ch ồi đỉnh liên quan đến một chất điều hoà sinh trưởng khác là ethylene. Auxin (IAA) kích thích chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh. - IAA đóng vai trò kích thích sự phân hoá của các mô dẫn (xylem and phloem). - Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh ch ồi ph ụ trong nuôi cấy mô. - Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đ ậu qu ả, s ự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường. - Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus) - Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tạo phôi soma (2,4-D) B. Nhóm các cytokinin Cac cytokinin là dân xuât cua adenine, đây là những hormone liên quan chủ yêu đên ́ ̃ ́ ̉ ́ ́ sự phân chia tế bao, sự thay đôi ưu thế ngon và phân hoa chôì trong nuôi cây mô. ̀ ̉ ̣ ́ ́ Cac cytokinin được sử dung thường xuyên nhât là 6-benzylaminopurine (BAP) hoăc ́ ̣ ́ ̣ 6-benzyladenin (BA), 6-γ -γ -dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H- 5
purine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là cac cytokinin tự nhiên, con BA và kinetin là cac cytokinin ́ ̀ ́ ̣ nhân tao Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau: 1- Kích thích phân chia tế bào 2- Tạo và nhân callus 3- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô 4- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh 5- Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào 6- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài 7- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Ức chế sự hình thành rễ - Ức chế sự kéo dài chồi - Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo di ệp l ục 8 C. Gibberellin có các chức năng cơ bản sau : 1- Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đ ầu rễ, quả non, hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic axit. 2- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví d ụ kéo dài thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân. Các cây lùn thường bị thiếu gibberellin. 3- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch. 4- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. Năm đ ầu thân mầm n ằm in, sau mùa đông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hoá hoa 5- Ức chế sự hình thành rễ bất định 6- Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu hoá các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây 7- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ) 8- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn 9- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt 10 - Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi D. Abscisic axít (ABA) - Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự n ứt quả 6
- ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước và nhiệt độ thấp đóng băng - Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm ch ậm s ự n ảy mầm của hạt - Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành - Gây ra sự đóng khí khổng E. Ethylene - Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả 1 - Làm chín quả 1 - Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh 2- Điều khiển sự chín của một số loại quả 3- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, d ứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene. - Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá 4 5 Câu 6: Nêu khái niệm về nhân giống vô tính in vitro? Nêu các bước chính trong quy trình nhân giống vô tính in vitro a. Nhân giống vô tính in vitro Khái niệm chung: Nhân giống vô tính in vitro là quá trình sản xuất một lượng l ớn cây hoàn chỉnh, từ các bộ phận, cơ quan như: chồi, mắt ngủ, vảycủ, đoạn thân, lá,...của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Nhân nhanh in vitro được ứng dụng vào:  Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác gi ống.  Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt.  Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt gi ống cây rau, cây hoa và cây trồng khác.  Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.  Bảo quản nguồn gen in vitro b. Các bước chính: Bước 1. Chọn lọc và chuẩn bị cấy mẹ  Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy).  Các cây này cần phải sạch bênh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh.  Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế đ ộ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm gi ảm tỷ l ệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro. 7
Bước 2. Nuôi cấy khởi động  Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đ ảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.  Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên hoá (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ...)  Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp:th- ờng dùng các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl, Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br...  Bước 3. Nhân nhanh  Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh s ố l ượng thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất đ ịnh và tạo phôi vô tính.  Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoaị cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất.  Theo nguyên tắc chung môi trường có hàm lượng cytokinin> auxin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là: 25-270C, 16 giờ chi ếu sáng/ ngày, cường độ ánh sáng 2000- 4000 lux. Bước 4 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh  Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng.  Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi tr ường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của cytokinin để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh Bước 5. Huấn luyện và đưa cây ra trồng ở vườn ươm  Để đ-a cây từ ống nghiệm ra v-ờn -ơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh tr- ởng t ốt cần đảm bảo một số yêu cầu:  Cây trong ống nghiệm đ_ đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất đ ịnh (số lá, s ố rễ, chiều cao cây).  Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát n- ớc.  Phải chủ động điều chỉnh đ-ợc ẩm độ, sự chiếu sáng của v- ờn ươm cũng nh- có chế độ dinh d-ỡng phù hợp. Câu7: Nêu nguyên lí làm sạch virus và các kỹ thuật làm sạch virus trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật in vitro? Nguyên lý làm sạch virus qua nuôi cấy meristem 8
Virus tồn tại ở mọi tế bào sống. Tuy nhiên, những nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet (1950), Morel và Martin (1952) cho thấy:  Nồng độ virus trong tế bào các cây bị bệnh phụ thuộc và tốc độ phân chia tế bào và khả năng sinh trưởng của tế bào. Tế bào càng phân chia mạnh thì nồng độ virus càng thấp, nghĩa là những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn.  Từ đây các ông đã đề xuất kỹ thuật: nuôi cấy meristem (mô phân sinh đ ỉnh) đ ể tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã bị nhiễm bệnh.  White (1934) đã sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo đ ể nghiên c ứu s ự phân bố virus trong rễ cây cà chua bị bệnh virus Aucuba gây khảm lá. Kết qu ả cho thấy 2 cm ở đầu rễ hầu như không phát hiện ra virus.  Limasset và Cornuet (1950) đã dùng phương pháp huyết thanh định l ượng, chứng minh được sự tồn tại một gradient nồng độ virus từ các mô non đ ến các mô già ở cây thuốc lá bị bệnh. Nồng độ virus bằng không ở mô đỉnh và lá bao thứ nhất sau đó tăng dần, đạt cực đại ở lá thứ năm rồi gi ảm d ần ở các lá già phía dưới. Các kỹ thuật làm sạch virus trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật in vitro Nuôi cấy meristem Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt Nuôi cấy meristem kết hợp với bổ sung hóa chất Vi gép trong ống nghiệm Câu 8: Trình bày các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus ở thực vật? Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus 1. Chuẩn đoán bằng mắt :Đây là phương pháp chuẩn đoán dựa trên các triệu chứng bệnh của cây.  Phải có kinh nghiệm, dễ lẫn với triệu chứng khác.  Rất khó phát hiện khi cây bị nhiễm tổ hợp nhiều loài virus.  Phụ thuộc vào ngoại cảnh, tuổi cây, đặc điểm giống.  2. Chuẩn đoán bằng cây chỉ thị : Cây chỉ thị là cây khi bị nhiễm virus sẽ xuất hiện các triệu chứng đặc trưng. Phương pháp này đã được tiến hành từ 1940. Ưu điểm: - Nhạy, chính xác. - Có thể phát hiện ở nồng độ virus thấp. Hạn chế: - Thời gian chuẩn đoán dài, cần quá trình ủ bệnh. - Phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm - Phương pháp lây nhiễm phức tạp - Tốn công chăm sóc cây chỉ thị, môi giới truyền bệnh. - Một số bệnh virus không tiến hành được (bệnh cuốn lá). 9
3. Phương pháp huyết thanh Ưu điểm: - Nhạy, đặc hiệu (kết quả thu được trong 48 giờ), chi phí thấp. - Không cần có nhà cách ly nuôi cây chỉ thị Hạn chế: - Có thể lẫn với một số dạng kết tủa khác. - Phản ứng khó xảy ra ở nồng độ virus trong dịch cây bệnh thấp. 4. Phương pháp kính hiển vi điện tử Ưu điểm  Thao tác đơn giản, nhanh  Khá chính xác Hạn chế:  Chỉ phát hiện được các loại hình đũa, hình sợi  Nhiều loài virus có cùng hình dạng, kích thước. 5. Phương pháp ELISA Dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể nhưng ở đây kháng thể được liên kết với một enzyme (enzyme linked). Phức kháng nguyên – kháng th ể – enzyme d ễ dàng nhận biết qua phản ứng tạo mầu do chính enzyme đó xúc tác. 6. Phương pháp lai AND  Xác định trực tiếp sự có mặt của ARN lõi của virus.  Chính xác, đắt tiền. Sơ đồ nguyên lý:  ARN virus lai với mẫu dò >>> Phản ứng lai nhận biết khi mẫu dò gắn đồng v ị phóng xạ hoặc chất phát huỳnh quang . Câu 9. Trình bày kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro? §©y lµ gi¶i ph¸p c«ng nghÖ cã triÓn väng trong viÖc b¶o qu¶n nguån gen thùc vËt nhÊt lµ víi c¸c c©y nh©n gièngv« tÝnhvµ cã h¹t mÊt søc n¶y mÇm ë nhiÖt ®é vµ Èm ®é thÊp (recalcitrant). Trong vßng 20 n¨m gÇn ®©y c«ng nghÖ nµy ®· ® ưîc ph¸t triÓn réng vµ ¸p dông víi h¬n 1000 loµi thực vËt kh¸c nhau (F. Engelmann,1997) Qu¸ tr×nh chuÈn bÞ mÉu bảo quản: - Thu thËp nguån gen trong tù nhiªn hoÆc th«ng qua qu¸ tr×nh trao ®æi gièng - ChÈn ®o¸n bÖnh, khö bÖnh. - Nu«i cÊy in vitro và nh©n nhanh cho ®ñ sè lưîng mÉu ®Ó b¶o qu¶n. Sau ®ã tuú thuéc vào ®èi tưîng với mục ®Ých mà lùa chän c¸ch b¶o qu¶n in vitro thÝch hîp. Cã 2 c¸ch b¶o qu¶n nguån gen thùc vËt in vitro : 1. B¶o qu¶n sinh truëng chËm §Æc ®iÓm cña phu¬ng ph¸p này là kÐo dài thêi gian gi÷a 2 lÇn cÊy chuyÓn nhê øc chÕ sù sinh truëng cña mÉu cÊy nh»m gi¶m ®Õn møc tèi thiÓu chi phi trong qu¸ tr×nh b¶o 10
qu¶n. Trong thêi gian b¶o qu¶n m« và tÕ bào thùc vËt vÉn tiÕp tôc sinh tr ưëng nhưng víi tèc ®é rÊt chËm (thưêng gi¶m tõ 15 - 20 lÇn so víi b×nh th ưêng). Thêi gian b¶o qu¶n sinh trưëng chËm cã thÓ kÐo dài mét vài n¨m. Ph ư¬ng ph¸p này thưêng ¸p dụng ®Ó b¶o qu¶n c©y non hoàn chØnh, chåi mÇm, ph«i... ®Ó Ýt g©y c¸c biÕn dÞ sinh dưỡng và c¸c ®Æc tÝnh di truyÒn kh«ng bÞ mÊt hay thay ®æi trong thêi gian b¶o qu¶n. C¸c nh©n tè øc chÕ sinh trưëng(trong b¶o qu¶n sinh trưëng chËm) - NhiÖt ®é thÊp: gi¶m nhiÖt ®é cña phßng nu«i c©y ChÊt øc chÕ sinh trưëng: bæ sung vào m«i trưêng nu«i cÊy axit abcisic(ABA), Clo cholin clorit (CCC)C¸c chÊt g©y ¸p suÊt thÈm thÊu: bæ sung vào m«i trưêng nu«i cÊy manitol, sorbitol, saccarose… - Thay ®æi ®iÒu kiÖn nu«i cÊy nh ư: gi¶m cuêng ®é chiÕu s¸ng, gi¶m nång ®é oxy… Chó ý: Khi kÕt thóc mét giai ®o¹n b¶o qu¶n c¸c mÉu b¶o qu¶n ® ưîc chuyÓn sang m«i trưêng tư¬i v ®Æt mét thêi gian g¾n trong ®iÒu kiÖn tèi thÝch ®Ó kÝch thÝch sù t¸i sinh trưëng trưíc khi b¨t ®Çu mét chu kú b¶o qu¶n míi. X¸c ®Þnh thêi gian tèi ®a an toμn cho tõng lo¹i c©y trång trong qu¸ tr×nh b¶o qu¶n sinh tr ưëng chËm. 2. B¶o qu¶n ngõng sinh trưởng t¹m thêi §Æc ®iÓm cña kü thuËt nµy lµ mÉu nu«i cÊy ® ưîc b¶o qu¶n trong nit¬ láng (- 196 C ) vµ trong thêi gian b¶o qu¶n tÕ bµo, m« hoµn toµn ngõng sinh tr ưëng. §©y lµ kü thuËt b¶o qu¶n dµi h¹n vµ trưíc khi ®ưa vµob¶o qu¶n cÇn ph¶i tiÕn hµnh xö lý tr¸nh sù kÕt tinh nưíc trong tÕ bµo lµm chÕt c¸c mÉu b¶o qu¶n. Kü thuËt nµy hiÖn ®· ®ưîc ¸p dông cho kho¶ng 100 loµi thùc vËt kh¸c nhau vµ mÉu ®ưa vµo b¶o qu¶n thưêng gåm tÕ bµo huyÒn phï, m« sÑo, ph«i hîp tö, ph«i soma, mÇm ngñ, ®Ønh ngän... C¸c giai ®o¹n cña kü thuËt cña b¶o qu¶n ngõng sinh trưëng t¹m thêi Xö lý chèng ®«ng cho tÕ bào, m« cña mÉu: - Xö lý trùc tiÕp - Xö lý gi¸n tiÕt - ChÊt chèng ®«ng: DMSO, Glycerol, Proline,, Mannitol, and ethylene glycol . Xö lý l¹nh ®Õn nhiÖt ®é cÇn thiÕt (-300C, -400C) – Làm l¹nh chËm(1-0,1oC/phót) – Làm l¹nh nhanh( 720 oC/phót) B¶o qu¶n mÉu trong nit¬ lỏng(-196oC). Phôc håi mÉu b¶o qu¶n - Làm tan b¨ng nhanh (120 oC/phót) cho c¸c mÉu b¶o qu¶n ë nhiÖt ®é 37oC – 40oC (1-2 phót) - Ng©m röa trong dung dÞch saccarose hoÆc m«i trưêng nu«i cÊy trong 30 phót - Nu«i cÊy mÉu trªn m«i trưêng thÝch hîp và t¸i sinh c©y hoàn chØnh Câu 10: Khái niệm biến dị dòng soma? Các nguyên nhân chính gây nên bi ến di dòng soma trong nuôi cấy mô và ứng dụng? A. Kh¸i niÖm: BiÕn dÞ dßng soma (somaclone variation) là kh¸i niÖm dïng ®Ó chØ tÊt c¶ c¸c biÕn dÞ thÓ hiÖn ë c¸c tÕ bào, m« nu«i cÊy và c©y cã nguån gèc tõ nu«i 11
cÊy m« (Larkin và Scowcropt, 1981). BiÕn dÞ dßng soma cßn ® ưîc gäi là biÕn dÞ dßng v« tÝnh. B. C¸c nguyªn nh©n chÝnh g©y biÕn dÞ dßng soma 1.Sù ®a d¹ng di truyÒn tù nhiªn cña c¸c tÕ bào nu«i cÊy C¸c mÉu cÊy trªn thùc tÕ bao gåm nhiÒu lo¹i tÕ b ào kh¸c nhau như là phloem, xylem, nhu m«, m« vá… Nh÷ng tÕ bào này cã thÓ cã møc ®é béi thÓ kh¸c nhau. Nãi c¸ch kh¸c, cã sù ®a d¹ng tÕ bào gi÷a c¸c lo¹i tÕ bào trong cïng mét mÉu cÊy. Sù ®a d¹ng tÕ bào như vËy thưêng gäi là "polysomatic" (®a béi v« tÝnh). C¸c loài nh ư lóa mú, thuèc l¸ ®ã ®ưîc c«ng bè là cã c¸c m« ®a béi v« tÝnh nh ư thÕ. NhiÒu thùc vËt tån t¹i ë d¹ng thÓ kh¶m. Chóng chøa nh÷ng líp tÕ bào hoÆc m« cã cÊu tróc di truyÒn kh¸c nhau ®ưîc ph¸t triÓn tõ meristem cã chøa líp hay bé phËn m« bÞ ®ét biÕn.HiÖn tưîng này ®Æc biÖt phæ biÕn ë c¸c c©y th©n gç. 2.T¸c ®éng cña c¸c yÕu tè trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy Lo¹i và nång ®é chÊt ®iÒu tiÕt sinh trưëng sö dông C¸c m« nu«i cÊy dài ngày trong m«i trưêng chøa c¸c auxin m¹nh như 2, 4 - D hoÆc 2,4,5 - T thưêng g©y ra c¸c sai kh¸c trong c¸c c©y t¸i sinh. ThÝ dô c¸c c©y dõa dÇu t¸i sinh tõ callus nu«i cÊy dài ngày trªn m«i tr ưêng cã chøa 2,4 - D cã tû lÖ rÊt lín c¸c biÕn dÞ khi trång trªn ®ång. ë nho, c¸c tÕ bào ph«i nu«i cÊy kÐo dài trong vài n ăm ®ã mÊt dÇn khả năng ph©n ho¸ và t¸i sinh thành c©y.Khi nu«i cÊy tiÓu m¹ch trªn m«i trưêng chøa 2mg/l 2,4,5-T làm tăng tû lÖ trao ®æi chÐo nhiÔm s¾c thÓ soma, nhưng khi bæ sung thªm kinetin thì tû lÖ này giảm và nếu dïng 2,4 D thì kh«ng thÊy hiÖn tưîng này. ViÖc nu«i cÊy dài ngày trong ®iÒu kiÖn in vitro còng như tăng sè lÇn cÊy chuyÓn sÏ làm tăng khẳ năng xuÊt hiÖn c¸c biÕn dÞ soma. VÝ dô: trong nh©n gièng in vitro chuèi tiªu “Nainco” sau 5,7,9,11 lÇn cÊy chuyÓn liªn tiÕp tû lÖ biÕn dÞ soma l μ 1,3%, 1,3%, 2,9% vμ 3,8% (Rodrigues vμ céng sù, 1998) Lo¹i mÉu cÊy C¸c lo¹i mÉu cÊy kh¸c nhau thưêng thÓ hiÖn møc ®é biÕn dÞ kh¸c nhau. C¸c mÉu cÊy cã nguån gèc tõ c¸c thÓ tiÒn chåi như chåi n¸ch, chåi ®Ønh hay meristem thưêng cã møc ®é biÕn dÞ thÊp h¬n khi sö dông c¸c mÉu cÊy cã nguån gèc kh«ng phải tõ ®Ønh sinh trưëng như là l¸ , rÔ hay protoplast. Kh ả năng xảy ra c¸c biÕn dÞ soma cßn phô thuéc vào kiÓu gen còng nh ư tuæi c©y mÑ. C¸c dßng già h¬n th ưêng tiÒm Èn c¸c biÕn dÞ s½n cã ë møc cao h¬n c¸c dßng trÎ h¬n. -Phư¬ng thøc nh©n gièng in vitro C¸c phư¬ng thøc nh©n gièng kh¸c nhau sÏ cho tû lÖ xuÊt hiÖn c¸c biÕn dÞ v« tÝnh kh¸c nhau. VÝ dô: gièng chuèi tiªu “Grande Naine” t¸i sinh c©y qua con ® ưêng t¹o ph«i v« tÝnh cã tû lÖ biÕn dÞ soma 5,3%. cßn t¸i sinh qua con ® ưêng t¹o chåi tû lÖ này là 3,6%. Nhìn chung nÕu chåi bÊt ®Þnh ® ưîc t¸i sinh tõ mét tÕ bào thì c¬ héi ®Ó xuÊt hiÖn c¸c biÕn dÞ soma thưêng là lín h¬n rÊt nhiÒu so víi c¸c chåi ® ưîc t¸i sinh tõ nhiÒu tÕ bào. C¸c qu¸ trinh nu«i cÊy t¸i sinh c©y tõ callus, huyÒn phï hoÆc protoplast do ®ã thưêng cã nhiÒu biÕn dÞ soma. Câu 11: Nêu các phương pháp nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tạo đơn bội? C¸c phư¬ng ph¸p nu«i cÊybao phÊn và h¹t phÊn 12
Nu«i cÊy bao phÊn trªn m«i trưêng ®Æc: callus và c©y ®¬n béi xuÊt hiÖn trªn bÒ mÆt bao phÊn Nu«i cÊy bao phÊn trong m«i tr ừêng láng và l¾c: h¹t phÊn gi¶i phãng vào m«i trưêng, callus và c©y ®¬n béi xuÊt hiÖn tõ h¹t phÊn Nu«i cÊy h¹t phÊn t¸ch rêi trong m«i trưêng láng và l¾c hoÆc trong m«i trưêng b¸n láng: callus và c©y ®¬n béi xuÊt hiÖn tõ h¹t phÊn Nu«i cÊy bao phÊn Qui trinh chung t¹o c©y ®¬n béi tõ bao phÊn: Chän bao phÊn: tèt nhÊt là chän bao phÊn chøa h¹t phÊn ë giai ®o¹n s¾p ph©n bào nguyªn nhiÔm lÇn mét. Bao phÊn cña nh÷ng hoa ®Çu tiªn cña c©y cho kÕt qu¶ cao h¬n hoa muén. Xö lý nô hoa: Xö lý l¹nh sÏ kÝch thÝch nh©n dinh d ưìng ph©n chia.ChÕ ®é xö lý nhiÖt ®é phô thuéc vào lo¹i c©y. VÝ dô: lóa Japonica xö lý ë 10oC trong 2-3 tuÇn; lóa Indica xö lý ë 7oC trong 1 tuÇn; ng« xö lý ë 4 oC trong 1 tuÇn Chän m«i trưêng nu«i cÊy thÝch hîp: Tuú theo ®èi, tưîng nu«i cÊy kh¸c nhau mà sö dông m«i trừêng tư¬ng øng. Tuy nhiªn cã mét sè qui luËt chung: - C¸c c©y hoà thảo cÇn nhiÒn auxin, ®Æc biÖt là 2,4 D ë nång ®é cao ®Ó khëi ®éng sù ph©n chia ®Çu tiªn (®èi víi lóa mú: 10-5mol 2,4 D trong 12 ngày), c©y hä cà cÇn Ýt h¬n (10-6 mol). - Hàm lưîng ®ưêng cao: ®èi víi ng« 60 - 120 g saccaroza/ l, lóa 50 -60g saccaroza/ l, c©y hä cà 20 - 40 g saccaroza/l. Bæ sung c¸c hçn hîp chÊt tù nhiªn: n−íc dõa, pepton… Kü thuËt t¸ch rêi tiÓu bào tö: Caùc bao phaán voâ truøng ñöôïc nghieàn hoaëc eùp trong moâi tröôøng loûng ñeå giaûi phoùng haït phaán ra ngoaøi bao phaán. Taùch haït phaán ra khoûi baõ tuùi phaán baèng caùch roùt dung dòch treân qua löôùi loïc coù kích thöôùc phuø hôïp Dung dòch sau loïcñöôïc ly taâm 800-1000rpm trong 3-5 phuùt ñeå taùch vaø laøm saïch haït phaán. Thaønh phaàn nheï noåi treân ñöôïc gaïn ñi trong khi haït phaán laéng döôùi ñaùy ñöôïc röûa saïch baèng moâi tröôøng môùi vaø ñöôïc ly taâm theâm 2 laàn nöõa ñeå loaïi boû caùc chaát öùc cheá trong tuùi phaán. Taïo huyeàn phuø haït phaán vôùi maät ñoä 104 – 105 teá baøo/ml Mét sè chó ý khi nu«i cÊy h¹t phÊn Caùc haït phaán nuoâi caáy taùch rôøi thöôøng phaùt sinh phoâi tröïc tieáp Ñeå kích thích söï phaùt sinh phoâi thöôøng söû duïng phöông phaùp nuoâi “trôï döôõng”: nuoâi keøm vôùi bao phaán hay loaïi moâ khaùc cuûa caây meï Moâi tröôøng nuoâi caáy haït phaán caàn boå sung caùc axit amin (glutamin, serin…) vôùi noàng ñoä cao (100-1000ppm) vaø coù tröôøng hôïp khoâng cần dùng hết chất điều tiết sinh trưởng (thuốc lá, cải dầu ...) Câu 12. Trình bày khái niệm về nuôi cấy dịch huyền phù tế bào và ứng dụng của nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật? 1.1.Kh¸i niÖm chung Caplin và Steward (1949) là nh÷ng ngưêi ®Çu tiªn c«ng bè sù thành c«ng cña viÖc nu«i cÊy c¸c tÕ bào thùc vËt trong m«i trưêng láng l¾c. 13
C¸c nhà nghiªn cøu (Tulecke and Nickell, 1959) ®ã dù kiÕn tr ưíc sù s¶n xuÊt sinh khèi lín cña tÕ bào thùc vËt b»ng nu«i cÊy chóng trong m«i tr ưêng láng và kh¶ n¨ng sö dông phư¬ng ph¸p này ®Ó sinh tæng hîp c¸c hîp chÊt thø cÊp cña thùc vËt nh ư alkaloit, steroit.... Nu«i cÊy huyÒn phï tÕ bào ® ưîc khëi ®Çu b»ng viÖc chuyÓn nh÷ng mÈu m« sÑo (callus) xèp vào m«i trưêng láng trong nh÷ng b×nh nu«i cã dung tÝch phï hîp (c¸c b×nh Erlenmeyer dung tÝch 30S 60 ml) và l¾c nhÑ nhàng. C¸c tÕ bào ®ưîc t¸ch rêi ra khái m« sÑo và ph©n t¸n trong m«i tr ưêng láng. ë ®ã chóng sinh trưëng, ph©n chia và cã thÓ h×nh thành nh÷ng côm tÕ bào kÕt tËp. Dung dÞch nu«i cÊy tÕ bào chuyÓn thành huyÒn phï tÕ bào. øng dông cña nu«i cÊy huyÒn phï tÕ bào S¶n xuÊt c¸c hîp chÊt thø cÊp: C¸c s¶n phÈm cña tÕ bào thùc vËt cã thÓ ®¬n gi¶n như ®ưêng cho tíi c¸c hîp chÊt cao ph©n tö phøc t¹p như c¸c chÊt th¬m, chÊt nhuém màu, dưîc liÖu, chÊt trõ s©u. S¶n phÈm cña nu«i cÊy huyÒn phï tÕ bào thưêng ®Æc trưng là nh÷ng chÊt cã gi¸ trÞ cao và cÇn ë lưîng nhá. Sử dông trong c«ng t¸c gièng c©y trång : Sö dông ®Ó chän läc c¸c dßng tÕ bào mong muèn qua c¸c test thanh läc. Sau ®ã t¸i sinh c¸c tÕ bào ®· chän läc ®ưîc thành c©y hoàn chØnh ®Ó cã thÓ nhËn ® ưîc c¸c vËt liệu khëi ®Çu quan träng trong c«ng t¸c gièng. Dïng ®Ó t¸ch protoplast hoÆc là nguån ®Ó s¶n xuÊt c¸c ph«i v« tÝnh. Câu 13. Trình bày phương pháp tách, nuôi cấy tế bào trần và ứng dụng? Phư¬ng ph¸p t¸ch tÕ bào trÇn b»ng enzym 1. Nguyªn t¾c: - Sö dông hçn hîp enzym: xellulolaza, emixellulolaza vµ pectinaza ®Ó ph©n gi¶i thµnh tÕ bµo vµ gi¶i phãng c¸c tÕ bµo trÇn - Mét nguyªn t¾c c¬ b¶n lµ sau khi thµnh tÕ bµo ® ưîc t¸ch ra, tÕ bµo trÇn ph¶i ®ưîc phãng thÝch vµo m«i trưêng cã ¸p suÊt thÈm thÊu cao ®Ó tr¸nh nưíc x©m nhËp vµo kh«ng bµo, g©y vì tÕ bµo chÊt, b»ng viÖc bæ sung c¸c chÊt t¹o ¸p suÊt thÈm thÊu nh ư saccarose, mannitol, sorbitol, Ca2+, v.v… - Nång ®é chÊt t¹o ¸p suÊt thÈm thÊu vµ thêi gian l ưu gi÷ tèi ®a hay ®æi cho thÝch hîp víi tõng ®èi tưîng c©y trång §©y lµ phư¬ng ph¸p dïng phæ biÕn vµ cã hiÖu qu¶ cao: tõ 1g l¸ t ư¬i cã thÓ thu nhËn ®ưîc tõ 6-12 triÖu tÕ bµo trÇn 2. C¸c bưíc tiÕn hành: - Chän nguyªn liÖu: ex vitro: m« l¸ non (cÇn ph¶i khö trïng), in vitro: l¸, m« sÑo, tÕ bµo huyÒn phï - Xö lý g©y co nguyªn sinh chÊt (CaCl2 , ®ưêng, manitol...0,5 - 0,7M ) - Xö lý hçn hîp enzym ( xellulolaza, hemixellulolaza, pectinaza ) - T¸ch vµ lµm s¹ch protoplast: läc, ly t©m - KiÓm tra kh¶ n¨ng sèng ( fluorescein diacetate ) vµ t¹o huyÒn phï protoplast cã mËt ®é phï hîp (104 - 107/ml) Nu«i cÊy protoplast: 14
Thưêng chia 2 giai ®o¹n: Giai ®o¹n 1: Nu«i cÊy ®Ó protoplast t¸i sinh thµnh (vá ) tÕ bµo vµ ph©n chia t¹o côm nhá tÕ bµo ( 4 - 10 tÕ bµo): nu«i cÊy trong tèi hay trong ®iÒu kiÖn ¸nh s¸ng yÕu, trong m«i trưêng láng cã l¾c hay m«i tr ưêng b¸n láng. M«i trưêng cÇn giµu dinh dưìng vµ ¸p suÊt thÈm thÊu phï hîp. NhiÒu trưêng hîp cÇn dïng líp nu«i trî dưìng Giai ®o¹n 2: Nu«i cÊy t¹o m« sÑo æn ®Þnh vµ t¸i sinh c©y hoµn chØnh: nu«i cÊy trong ®iÒu kiÖn chiÕu s¸ng tèt víi quang chu kú phï hîp, trªn m«i tr ưêng ®Æc. CÇn chó ý ®Õn hµm lưîng vµ tû lÖ auxin vµ xytokinin ®Ó t¸i sinh ®ưîc c©y tõ callus Cã hai con ®ưêng ph¸t sinh h×nh th¸i trong qu¸ tr×nh h×nh thµnh c©y hoµn chØnh ®èi víi c¸c tÕ bµo cã nguån gèc protoplast. - Th«ng qua qu¸ tr×nh ph¸t sinh c¬ quan (organogenesis) vÝ dụ: tÕ bµo protoplast cã nguån gèc tõ m« thÞt l¸ cña c©y thuèc l¸. - Th«ng qua con ®ưêng ph¸t sinh ph«i soma (somatic embryogenesis) vÝ dô: c¸c tÕ bµo protoplast cã nguån gèc tõ c¸c tÕ bµo ph«i ® ưîc nu«i cÊy d¹ng huyÒn phï mét sè loµi c©y thuéc hä hoµ th¶o. - NÕu ®¶m b¶o ®ưîc c¸c m«i trưêng nu«i cÊy phï hîp, th× ph«i vµ c¸c m« ph©n sinh sÏ h×nh thµnh sau kho¶ng 3 - 5 tuÇn lÔ. Nh ưng nÕu ®iÒu kiÖn nu«i cÊy kh«ng tèi ưu, c¸c biÕn ®æi di truyÒn cã thÓ x¶y ra. VÝ dô: trong mét sè nghiªn cøu nu«i cÊy protoplast tõ c©y khoai t©y, tÇn sè c©y 2n ®ưîc t¸i sinh chØ kho¶ng 10%, cßn l¹i chñ yÕu lµ c©y 4n. Ứng dông cña tÕ bào trÇn protoplast ®ưîc øng dông vµo 3 môc ®Ých chÝnh. - Dung hîp protoplast (lai soma). - Chän dßng tÕ bµo. - BiÕn n¹p di truyÒn: ChuyÓn c¬ quan tö, AND ngo¹i lai vµo protoplast. Câu 14. Trình bày các phương pháp dung hợp tế bào trần? Phư¬ng ph¸p dung hîp protoplast 1. Phư¬ng ph¸p dïng ho¸ chÊt: N¨m 1972, Carlson t¸i sinh thμnh c«ng c©y thuèc l¸ tõ tÕ bμo protoplast dung hîp trong m«i trưêng bæ sung NaNO3. N¨m 1974, Melchers ph¸t triÓn ra m«i tr ưêng dung hîp tÕ bμo trÇn gåm 50 mM Ca2+, 0,4M mannitol, pH 10,5 tá ra thÝch hîp cho viÖc dung hîp tÕ bμo trÇn nhiÒu loμi c©y trång kh¸c nhau. N¨m 1974, Kao ph¸t hiÖn ra PEG (polyethylene glycol) cã t¸c dông l μm t¨ng hiÖu qu¶ dung hîp cña protoplast. Khi ®ưîc ng©m vμo dung dÞch PEG (20 - 40 % w/v), c¸c protoplast kÕt dÝnh l¹i víi nhau. Sau ®ã, khi PEG ®ưîc röa b»ng dung dÞch Ca2+ cã ®é pH cao, màng nguyªn sinh chÊt ë chç tiÕp xóc sÏ vì ra và c¸c protoplast sÏ dung hîp víi nhau. Do PEG ®éc ®èi víi tÕ bào, nång ®é PEG thưêng ®ưîc gi¶m ®i và bæ sung thªm vào ®ã là DMSO (dimethyl sulfuside) 2. Phư¬ng ph¸p dïng xung ®iÖn (Zimmermann,Scheurich,1982) Zimmerman (1982) lµ ngưêi ®Çu tiªn ®Ò xưíng phư¬ng ph¸p dung hîp tÕ bµo trÇn nhê xung ®iÖn (electrofusion). 15
- Nguyªn t¾c: c¸c protoplast tÝch ®iÖn nªn dÞch chuyÓn trong ®iÖn tr ưêng và t¹o chuçi gi÷a hai thanh ®iÖn cùc, dïng xung ®iÖn ®Ó l μm thñng mμng cña hai protoplast s¸t c¹nh nhau khiÕn chóng hoà trén vào nhau - ThiÕt bÞ: m¸y t¹o xung ®iÖn, kÝnh hiÓn vi ®¶o pha, buång dung hîp - T¹o ®iÖn trưêng: ®Æt trong buång dung hîp c¸c ®iÖn cùc platin cã kho¶ng c¸ch 0,2 - 1,0mm và nèi víi nguån ®iÖn cã hiÖu ®iÖn thÕ 200V/cm - T¹o xung : hiÖu ®iÖn thÕ: 500 - 1000V/cm, thêi gian cùc ng¾n: 1 -200 miligi©y HiÖu qu¶ dung hîp cao những ®Çu tư thiÕt bÞ lín Câu 15. Nêu khái niệm và các bước tiến hành của phương pháp thụ phấn in vitro? 1.Kh¸i niÖm §Ó kh¾c phôc hiÖn tưîng bÊt hîp trong lai xa (lai kh¸c loài và kh¸c chi) cã thÓ tiÕn hành thô phÊn in vitro hoÆc nu«i cÊy ph«i in vitro. HiÖn tưîng bÊt hîp trong lai xa thưêng thÓ hiÖn ë hai kh©u: - BÊt hîp cña giao tö trưíc khi thô tinh: NÕu mét h¹t phÊn l¹ r¬i trªn nóm nhôy, lËp tøc nhôy sÏ tiÕt ra chÊt øc chÕ sù ph¸t triÓn cña èng phÊn hoÆc làm biÕn d¹ng èng phÊn ng¨n c¶n sù thô tinh. - BÊt hîp cña giao tö sau khi thô tinh: Trong mét sè trưêng hîp, qu¸ tr×nh thô tinh vÉn x¶y ra b×nh thưêng khi h¹t phÊn r¬i trªn nhôy. Tuy nhiªn ph«i lai xa l¹i kh«ng ph¸t tri ển được. Nguyên nh©n là do gi÷a néi nhò và ph«i ®ã thành mét c¬ chÕ øc chÕ sù ph¸t triÓn cña ph«i. 2.C¸c bưíc tiÕn hành: LÊy nô hoa cña c©y mÑ ë thêi ®iÓm tr ưíc khi në hoa 2 ngày, khö trïng, t¸ch lÊy bÇu qu¶ hay l¸ noãn nu«i cÊy in vitro LÊy nô hoa cña c©y bè vào ngày në hoa, khö trïng, t¸ch lÊy bao phÊn và ®Ó trong ®iÒu kiÖn v« trïng ®Õn khi chóng tung phÊn LÊy h¹t phÊn r¾c trùc tiÕp lªn mÆt c¾t cña bÇu qu¶ hay l¸ noãn ®Ó thô phÊn in vitro, hoÆc dïng c¸ch c¾t ng¾n vßi nhÞ, ghÐp vßi nhuþ…khi thô phÊn Khi noãn thô tinh, chóng h×nh thành hîp tö và t¹o ph«i. C¸c ph«i lai in vitro th ưêng bá qua giai ®o¹n nghñ, nghØ và mäc thành c©y in vitro Câu 16. Khái niệm về chuyển gen ở thực vật? Trình bày các phương pháp chuyển gen trực tiếp vào tế bào thực vật? Kh¸i niÖm : Kü thuËt chuyÓn gen vµo thùc vËt lµ kü thuËt ® a mét hay nhiÒu gen l¹ ®· ®ưîc thiÕt kÕ ë d¹ng ADN t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo lµm cho gen l¹ g¾n vµo bé gen tÕ bµo chñ. Trong tÕ bµo chñ, c¸c gen nµy ho¹t ®éng tæng hîp nªn c¸c protein/enzyme ®Æc trng dÉn tíi viÖc xuÊt hiÖn c¸c ®Æc tÝnh míi cña c¬ thÓ chuyÓn gen . Trực tiếp: súng bắn gen Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen: là sử dụng những công cụ (súng bắn gen) có thể tạo được áp lực trong không khí đẩy được các viên đạn (bằng kim loại trơ, đường kính khoảng 1µm) có ph ủ các vector chuyển gen đi với tốc độ 1300 ms. Với tốc độ bắn này, viên đạn có thể xuyên quan các lớp tế bào bên ngoài của mô và xâm nhập vào các tế bào bên trong g ặp 16
nhân và gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào. Chọn lọc tế bào mang gen và tái sinh thành cây chuyển gen Ưu điểm: - Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào. - Quá trình chuyển gen nhanh, đơn giản về mặt kỹ thuật. - Có thể xử lý một lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn. - Các vector mang gen mục tiêu có cấu tạo đơn giản. - Chỉ cần một lượng nhỏ plasmid DNA. - Biểu hiện tạm thời gen biến nạp có thể quan sát thấy trong vài ngày sau khi bi ến nạp. + Nhược điểm: - Có thể chuyển nhiều bản sao được chuyển vào tế bào gây khó khăn cho vi ệc phân tích biểu hiện của gen. - Hiệu quả chuyển gen thấp. - Đòi hỏi thiết bị đắt tiền như súng bắn gen, đạn vàng, tungten, xung đi ện Phương pháp chuyển gen bằng xung điện: - Thường được sử dụng cho việc chuyển gen vào tế bào trần. Tế bào trần (protoplast) là tế bào được loại bỏ thành tế bào bằng việc xử lý tế bào v ới enzyme xenlulaza, pectinaza. - Sử dụng dòng điện có hiệu điện thế cao phát xung trong thời gian cực ngắn khoảng 5-6/1000 giây để tạo ra trên bề mặt tế bào trần tạm thời các lỗ có đ ường kính 30 ηm, mà qua đó các ADN biến nạp có thể xâm nhập vào tế bào. + Ưu điểm: Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định, đặc biệt đối với các gen đơn. + Nhược điểm: Hệ thống tái sinh tế bào trần của nhiều loài thực vật còn khó khăn vi tiêm Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm (micoinjection): Sử dụng các thiết bị hiển vi, vi thao tác. Sử dụng các kim tiêm rất mảnh đ ể đ ưa các đoạn ADN trực tiếp vào nhân của tế bào trần, tế bào ti ền phôi của h ợp t ử hay h ạt phấn. + Ưu điểm: - Lượng ADN được biến nạp tuỳ ý và xác định. - ADN được đưa đúng vị trí mong muốn, thậm chí nhân tế bào. - Có thể áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như tế bào hạt ph ấn, phôi non mà các kỹ thuật khác không thực hiện được. + Nhược điểm: - Mỗi lần biến nạp chỉ đưa vào một tế bào duy nhất. Do vậy, đây là phương pháp tốn nhiều thời gian và công sức. - Chỉ có thể thực hiện bởi các kỹ thuật viên có kỹ năng cao. - Đòi hỏi thiết bị tương đối đắt tiền. hóa chất. Phương pháp chuyểng gen nhờ PEG (polyethylen glycol): là phương pháp chuyển gen vào tế bào trần. Ở nồng độ cao PEG làm ADN cần biến nạp không còn ở trạng thái hoà tan mà kết dinh lại trên màng sinh chất. Bằng cách loại bỏ PEG và x ử lý nồng độ cao của Ca2+ hoặc pH cao ADN biến nạp sẽ được chuyển vào trong tế bào trần. 17
+ Ưu điềm: - Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công. - Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền. + Nhược điểm: - Quá trình biến nạp khó điều khiển. Số bản sao của gen trong t ế bào bi ến n ạp có thể lớn. - Tần số biến nạp thành công biên động giữa các thí nghiệm. - Dễ dẫn đến hiện tượng dung hợp tế bào trần, gây khó khăn việc phân tích bi ểu hiện gen. - Hệ thống tái sinh tế bào trần của nhiều loài thực vật Câu 17. Trình bày cơ chế chuyển gen gây khối U ở thực vật do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ? Cơ chế chuyển gen gây u: Khi cây bị thường sẽ tiết ra 1 chất độc vết thương có cấu trúc dạng hợp chất phenol. Acetosyringone hấp dẫn vi khuẩn đất tới các mô đó, là chất hoạt hoá nhóm gen vir (gồm 6-9 đơn vị sao mã) đi ều khi ển sinh t ổng h ợp các sản phẩm (protein/enzyme). Các protein/enyme có các chức năng sau: + Cắt vùng bờ trái, bờ phải (T-DNA) giải phóng sợi đơn T-DNA + Bảo vệ sợi đơn T-DNA vừa cắt. + Vận chuyển sợi đơn T-DNA xâm nhập TBTV và gắn vào NST (hệ gen). Do trên đoạn T-DNA chứa một số gen mã hoá sinh tổng h ợp phytohormone (auxin và cytokinin) kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ, không được ki ểm soát d ẫn đ ến hình thành khối u. Đây là cơ chế chuyển gen tự nhiên vào thực vật của vi khuẩn A. tumefaciens. Câu 18. Trình bày cấu trúc Ti-plasmid tự nhiên và nguyên lý chung của thi ết k ế vector chuyển gen thực vật? Vector Ti-plasmid tự nhiên của vi khuẩn A. tumefaciens có một số hạn chế trong khi chuyển gen vào thực vật vì: - Ti-plasmid có kích thước lớn (200-800 kb). - Ti-plasmid không tự tái bản trong E. coli. - Đoạn T-DNA của Ti-plasmid mang các gen điều khiển sinh tổng hợp auxin và cytokinin cản trở sự tái sinh của cây trong qúa trình nuôi cấy. Nó còn ch ứa các gen điều khiển tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây ảnh hưởng đến năng suất. - Ti-plasmid không mang gen chỉ thị (reporter, seletion genes) nên khó ch ọn l ọc cây chuyển gen. - Các điểm cắt của RE nằm rải rác nên khó thao tác. Do đó, cần thiết kế lại Ti-plasmid tự nhiên để đáp ứng tiêu chuẩn cần thi ết của một vector chuyển gen thực vật. Quá trình thiết kế vector này như sau: * Nguyên lý chung: - Giữ lại các gen Vir cần thiết cho quá trình vận chuyển T-DNA gắn vào NST t ế bào thực vật. 18
- Giữ lại vùng bờ trái (LB), bờ phải (RB) và thay thế các gen c ần thi ết vào vùng T- DNA Có 2 loại hệ thống vector chuyển gen vi khuẩn A. tumefaciens: Vector đồng liên hợp (co-integrated vector) Dựa trên sự tái tổ hợp của 2 loại plasmid. - Plasmid 1: Có nguồn gốc từ plasmid vi khuẩn E. coli nên tái bản được trong E. coli. Có chứa phần bờ trái hoặc bờ phải, có các gen mục tiêu và các gen chỉ thị, có đoạn ADN tương đồng Ti-plasmid. - Plasmid 2: là Ti-plasmid cải tiến. Cắt bỏ toàn bộ phần T-DNA, giữa lại vùng bở phải hoặc bờ trái, giữ lại vùng gen Vir, bỏ đi vùng tổng hợp enzyme di hóa opine. Vector này được nhân dòng trong vi khuẩn A. tumefaciens. Sau đó, cho tương tác 2 loại plasmid 1 và plasmid 2, kết qu ả t ạo ra vector liên h ợp được sử dụng chuyển gen vào Vetor nhị thể (Binary vector): là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt: - Plasmid 1: Có nguồn gốc từ E. coli nhưng được thiết kế lại: + Thêm gốc tái bản trong A. tumefaciens. + Gắn các gen mục tiêu, promoter, gen chỉ thị nằm giữa LB, RB. - Plasmid 2: là Ti-plasmid được cắt bỏ toàn bộ các phần LB, RB, T-DNA, gen mã hóa enzyme sử dụng opine nhưng vẫn giữ lại góc tái bản trong A. tumefaciens, vùng gen Vir. Chuyển cả plasmid 1 và plasmid 2 vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens. Câu 19. Trình bày các bước chính trong qui trình chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens? Tạo cây in vitro. - Cắt tạo các đĩa lá nhằm tạo vết thương cho mô thực vật. - Ngâm đĩa lá trong dung dịch có chứa vi khuẩn A.tumefaciens mang hệ thống vector chuyển gen trong vài phút đến vài chục phút. Trong dung dịch có bổ sung acetosyringone. - Nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy. Cho thêm thời gian đ ể vi khuẩn A. tumefaciens sống và chuyển gen vào tế bào lá trong thời gian 2-5 ngày. - Lấy mẫu ra và diệt khuẩn A. tumefaciens bằng dung dịch kháng sinh cefotaxim (không gây độc cho mô thực vật) trong thời gian 15-30 phút. Vớt mô, thấm khô và cấy nuôi cây trên môi trường chọn lọc (kháng sinh, mantose, PPT, v.v.) trong một thời gian nhất định tuỳ thuộc loài cây. - Chọn lọc các mô sống mang gen chuyển, cấy lên môi trường tái sinh. - Phân tích sự có mặt và biểu hiện của gen chuyển bằng các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, Southern blot, Norhern blot, Western blot). - Thu được các dòng cây chuyển gen. - Đánh giá các dòng cây chuyển gen (biotest) trong phòng cách ly. - Giới thiệu vật liệu chuyển gen Câu 20. Nêu một số thành tựu tiêu biểu của việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô – tế bào thực vật ở Việt Nam? 19
Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm để đưa ra sản xuất nhanh chóng hơn nhiều phương pháp cổ điển. Nhờ kết quả này mà một người có thể sản xuất ra 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc hồng. Ở miền Bắc, Nhân bản vô tính thực vật được ứng dụng ở hầu hết các nông, lâm sản, bảo tồn thành công nguồn gene của các loại gỗ quý như: Vù h ương - Lo ại g ỗ chiết tinh dầu dùng trong dược, mỹ phẩm, cây Đăng lấy gỗ, Chè vang - một loại chè rất khó trồng. Kĩ thuật này giúp lai tạo thành công giống lúa chịu hạn DR1, nhân bản nhiều loại khoai tây, mía - Chỉ với 3 người, Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm Giống và Kĩ thuật cây tr ồng Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu cầu của khách hàng. - Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học – Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch Đàn Europhylla. - Trung tâm Ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công ngh ệ t ỉnh Vĩnh Phúc vừa ứng dụng thành công CNNCMTB để nhân giống cây Lô hội - một loài dược liệu quý của địa phương. Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất phong lan lớn trong khu vực. - Hiện nay, 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô. Bước sang năm 2008 công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đ ột phá mới: Nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng đặc biệt là loài lan Hài hồng - loài lan hài duy nhất có hương thơm trên thế giới 20