Câu 1: Nêu khái ni m v nuôi c y , t bào th c v t? Các k thu t nuôi c y ế
chính và ng d ng?
Khái ni m: nuôi c y t bào th c v t ph m t khái ni m chung cho t t c ế
các lo i nuôi c y nguyên li u th c v t hoàn toàn s ch các vi sinh v t, trên môi
tr ng dinh d ng nhân t o, trong đi u ki n vô trùng.ườ ưỡ
Nuôi c y mô, t bào th c v t còn g i là nuôi c y th c v t in vitro ế
Nuôi c y mô, t bào th c v t bao g m hoang lo t các k thu t khác nhaukh ế
năng ng d ng r ng rãi trong r t nhi u lĩnh v c.
Các k thu t nuôi c y chính và ng d ng c a:
-- Nuôi c y h t gi ng: tăng kh năng n y m m c a các h t khó n y m m trong đi u
ki n bình th ng. Thúc đ y quá trình y m m b ngch b sung c ch t đi u tiêt ườ
sinh tr ng. T o ra cây con dùng cho nuôi c y merisrem ho c các b ph n khácưở
-- Hoa cái: th ph n trong ng nghi m ph c v lai xa. T o đ n b i và t o đa phôi ơ
-- Hoa đ c: t o mô s o và cây đ n b i. T o đ t bi n m c đ n b i. T o dòng đ ng ơ ế ơ
h p t
-- Phôi h p t : nuôi c y c u phôi khi lai xa. Nhân các dòng lai xa. Phá ng ngh c a
h t.
-- Mô s o: t o phôi vô tính. Nuôi c y t bào đ n và tách t bào tr n. T o cây có bi n ế ơ ế ế
d soma
-- T bào: t o đ t bi n m c đ t bào. T o t bào tr n đ lai tính. Bi n n pế ế ế ế ế
gen. Nuôi c y t bào đ n ế ơ
-- Đ nh ch i: t o nhân nhanh dòng đ ng nh t v di truy n. Làm s ch virus. Nguyên
c u -sinh lý phát tri n
-- Phân hóa phôi tính: đ ng h ng i sinh ch y u. ng d ng: nhân nhanh,ườ ướ ế
s n xu t h t nhân t o. Cung c p v t li u đ t o các protoplast kh năng sinh
phôi. Cho phép c khí hóa quá trình nuôi c y và s d ng bioreactorơ
-- Đ t bi n soma: phân l p các bi n d ích ki u hình t ng song còn thi u ế ế ưở ế
m t s tính tr ng mong mu n. Phân l p các bi n d có tích đ s n xu t các h p ch t ế
ch ng ch u stress t t h n. T o các bi n d di truy n không qua l i h u tính nh ng ơ ế
dòng u túư
Câu 2: u nh ng u đi m c a ph ng pháp nuôi c y t bào th c v t ư ươ ế
so v ic ph ng pháp truy n th ng khác? ươ
Th nh t: vi nhân gi ng (micropropagation)
- Th c hi n trong phòng thí nghi m, không ch u nh h ng c a th i ti t, a ưở ế
v . Ch đ ng s n xu t cây gi ng.
- Sinh s n vô tính t o ra m t l ng l n cây gi ng gi nguyên b n ch t di truy n ượ
nh cây m .ư
- H s nhân cao, t c đ tăng tr ng nhanh rút ng n th i gian ra hoa qu ưở
v i nh ng cây lâu năm.
- S n xu t h t nhân t o.
Th hai, ch n và t o gi ng in vitro
- Ch nc dòng kháng vi rút, ch u l nh, ch u h n, ...
1
- T o dòng thu n nhanh b ng cách nuôi c y bao ph n r i đa b i hoá nh hoá
ch t.
- T o cây tr ng bi n đ i gen mang nhi u tính tr ng quý. ế
- Dung h p t bào tr nơ ế
Th ba, s n xu tc hoá ch t có ho t tính sinh h c
- S n xu t ch đ ng và liên t c trong phòng thí nghi m không ph thu c vào t
nhiên và mua v .
- Nhi u h p ch t sinh h c ph c t p nhân đ c t t bào nuôi c y. ượ ế
- Ch n c dòng t bào s n xu t các ch t v i năng su t cao h n cây ngoài t ế ơ
nhiên
- Thu nhân nhi u ch t quý hi m t ng h p hoá h c r t đ t. B n thân cây đó ế
tăng tr ng ch m, sinh s n khó khăn thì nuôi c y kh ng ch t o ưở ế
(mô r ) s n sinh ra nhi u ch t đó
-
Câu 3: Trình bày c s khoa h c c a ph ng pháp nuôi c y mô – t o?ơ ươ ế
*C u trúc chung c a t bào th c v t ế
-H c thuy t t bào: ế ế Schleiden và Schwann (1839) đã đ c l p đ a ra k t lu n: ư ế
- C th th c v t v đ ng v t đ u do các t o h p thành t bào đ n v c uơ ế ế ơ
trúc và ch c năng c a t t c m i c th s ng ơ
- T bào đ n v c u trúcch c năng c a c th th c v t b i t bào r t đa d ngế ơ ơ ế
nh ng t ch c theo nguyên tác c u trúc th ng nh t và có t t c các đ c tính c a thư
th ng s ng:
-Trao đ i ch t và năng l ng ượ
-Sinh tr ng, phát tri n và sinh s nưở
-Di truy n cho th h sau đ c tính c a mình ế
- kh năng t n t i đ c l p phân chia trên i tr ng dinh d ng. Trong ườ ưỡ
đi u ki n nuôi c y thích h p t bào th tái sinh phát tri n thành c th ế ơ
nguyên v n.
* Tính toàn năng c a t bào (totipotency): ế Haberlandt (1902), l n đ u tiên quan ni m
răng: M i m t t bào b t kỳ c a m t c th sinh v t đa bào đ u kh năng ti m ế ơ
tàng đ phát tri n thành m t cá th hoàn ch nh.
-Theo quan ni m c a sinh h c hi n đ i: M i t bào riêng r đã phân hóa đ u ế
mang toàn b l ng thông tin di truy n c n thi t đ c a c c th sinh v t ượ ế ơ
đó. Khi g p đi u ki n thích h p, m i t bào đ u có th phát tri n thành m t ế
th hoàn ch nh.
-Tính toàn năng c a t bào Haberlandt nêu ra chính c s lu n c a ế ơ ơ
ph ng pháp nuôi c y mô - t bào.ươ ế
*S bi u hi n tính toàn năng c a t bào trong nuôi c y in vitro: ế
Quá trình t ngu n v t li u ban đ u là t o ho cth c v t nuôi c y phân ế
hóa thành cây hoàn ch nh đ c g i s bi u hi n v tính toàn năng c a t ượ ế
bào th c v t.
2
Kh năng bi u hi n tính toàn năng c a các t bào, c a c th khác ế ơ
nhau.
Tính toàn năng c a t bào nuôi c y in vitro bi u hi n tr i qua 3 giai đo n: ế
+ T bào ph n bi t hóa v i s phát sinh t bào kh bi nế ế ế
+ Đ nh h ng phân hóa t bào ướ ế
+ Phát sinh hình thái, phát sinh c quanơ
*S phân hóa, ph n phân hóa t bào và s hình thành t bào kh bi n: ế ế ế S phân hóa
t bào : ế
T bào phôi sinh ế t bào chuyên hóa, đ m b o ch c năng chuyênế
bi t.
Vd: mô d u, mô bì, mô m m, mô d n
S ph n phân hóa:
- S ph n phân hóa quá trình t bào đã phân hóa (chuyên hóa) trong m t đi u ế
ki n nh t đ nh, khôi ph c kh năng phân chia chuy n thành t bào phân sinh ế
hình thành mô s o.
Trong đó m t b ph n t bào hình thành t bào c m ng phát sinh hình thái, t c ế ế
t bào th c m th tín hi u kích thích phân t , t đó xác đ nh đ ng h ngế ườ ướ
m i c a s sinh tr ng và phát tri n t bào ưở ế
Đi u khi n s phân hóa ph n phân hóa t o th c v t d n đ n s phát ế ế
sinh hình thái trong nuôi c y mô t bào th c v t. ế
Nuôi c y t bào th c v t chính đi u khi n s phát sinh hình thái c a t ế ế
bào, mô nuôi c y
Câu 4. Nêuc thành ph n chính c a môi tr ng dinh d ng nuôi c y mô – t ườ ưỡ ế
bào th c v t in vitro
i trưêng nu«i cÊy ®iÒu kiÖn tèi cÇn thiÕt, u quyÕt ®Þnh cho ph©n
hãa tÕ bµoquan trong nu«i cÊy.nhiÒu lo¹i m«i trưêng nu«i cÊy cho c¸c lo¹i
thùc vËt kh¸c nhau vµ môc ®Ých nu«i y kh¸c nhau.i trưêng thưêng bao gåm c¸c
thµnh phÇn chÝnh sau ®©y:
• Nguyªn tè ®a lưîng
Nguyªn tè vi lưîng
Nguånc bon h÷u c¬
C¸c vitamin
ChÊt ®iÒu tiÕt sinh trưëng thùc vËt
C¸c hçn hîp chÊt tù nhiªn
ChÊt lµm ®«ng m«i trưêng
C¸c nguyªn tè ®a lưîng:
C¸c nguyªn tè kho¸ng chÊtthùc t cÇn thiÕt khi nång ®é lín h¬n 0,5 mM/l gäi
lµ nguyªn tè ®¹i lưîng
C¸c nguyªn : N, P, K, S, Mg, Ca, cÇn thiÕt thay ®æi tïy theo ®èi tưîng nu«i
cÊy. i chung, nång ®é mçi nguyªn nãi trªn trong m«i trưêng > 30ppm. Chóng
lµ nguyªn liÖu ®Ó tÕ bµo x©y dùng nªn thµnh phÇn cÊu tróc cña m×nh.
C¸c nguyªnvi lưîng: C¸c nguyªn tè kho¸ng mà thùct cÇn thiÕt cã nång ®é nhá
h¬n 0,5 mM/l gäi nguyªn vi lưîng.Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, I, Co c¸c nguyªn
3
vi lưîng thưêng ®ưîc dïng trong m«i trưêng nu«i cÊy in vitro. C¸c nguyªnnμy ®ãng
vai t quan träng trong c¸c ho¹t ®éng cña enzym. Chóng ®ưîc dïng i nång ®é mçi
nguyªn <30ppmtuú thuéc vào lo¹i m«i trưêng mà hàm lưîngtû lÖ cña chóng
sÏ thay®æi
Trong m«i trưêng nu«i cÊy, Fe thưêng ®ưîc dïng dưíi d¹ng muèi phøc (chelat): Fe-
EDTA, Fe-citrate
Nguån c¸c bon h÷u c¬:
Khi nu«i y in vitro bào, m« thùc vËt sèng chñ yÕu theo phư¬ng thøc dưìng.
vËy, cÇn nguån cac bon h÷u thưêng dïng là ®ưêng saccaroza víi liÒu
lưîng 20 -30g/lÝt. Trong mét trưêng hîp ®Æc biÖt, thÓ dông nguån ®ưêng
kh¸c như glucoza, maltoza , galactoza và lactoza
C¸c vitamin.
M«, bào nu«i cÊy in vitro thÓ tæng hîp vitamin nhưng kh«ng ®ñ cho ho¹t
®éng sèng cña chóng nªn cÇn sung thªm vitamin vào m«i trưêng nu«i cÊy §¸ng
chó ý c¸c vitamin: thiamin, axit nicotinic, pyridoxin riboflavin. Nång ®é thưêng
dïng kho¶ng 1mg/lÝt. C¸c vitamin này ®ãng vai trß quan träng trong tÕ ochóng
c¸c co-enzym. Myo-inositol cÇn ®ưîc xung vμo mét lưîng kh¸ lín 50 -
100mg/lÝt, chÊt này tá ra cã t¸c dông kh¸ râ ®Õn sù ph©n chia cña tÕ bμo.
C¸c chÊt ®iÒu tiÕt sinh truëng.
C¸c chÊt ®iÒu tiÕt sinh trưëng yÕu quan träng nhÊt trong m«i trưêng quyÕt
®Þnh kÕt qu¶ nu«i y auxin và xytokinin ®ưîc sö dông nhiÒu h¬n c¶ trong nu«i y
invitro.
*Auxin kÝch thÝch h×nh thành o t¹o t ®Þnh, kÝch thÝch d_n
cña bào. C¸c auxin thưêng dông là: 2,4 - Dicloro phenoxy axetic axit (2,4D), α-
naphtylaxetic axit - NAA), Indolaxetic axit (IAA). Nång ®é dông:10-5-10-7 M/l
*Xytokinin kÝch thÝch ph©n chia bào quyÕt ®Þnh ph©n hãa chåi. C¸c
xytokinin thưêng ®ưîc ng Benzyladenin (BA), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2
iP) và Zeatin (mét chÊt tù nhiªn). Nång ®é sö dông: 10-5 - 10-7 M
*Tû Auxin/Xytokinin quyÕt ®Þnh ph©n hãa cña u cÊy theo hưíng t¹o rÔ,
chåi hay m«
sÑo.
C¸c hçn hîp chÊt tù nhiªn
thành phÇn thưêng ®ùoc dông nhưng kh«ng ph¶i thành phÇn t buéc.
Chóng làm gia t¨ng thành phÇn dinh dưìng chÊt ho¹t tÝnh sinh cho m«i
trưêng nªn kÝch thÝch sù sinh trưëng và ph©n ho¸ cña mÉuy.Thưêng bao gåm:
* Nưíc dõa: thưêng chøa c¸c axit amin, axit h÷u c¬, ®ưêng, ARN, AND. §Æc biÖt
trong nưíc dõa chøa nh÷ng hîp chÊt quan träng cho nu«i cÊy invitro ®ã là:
myoinositol, c¸c hîp chÊt cã ho¹t tÝnh auxin, c¸c glucosit cña xytokinin.
* ch nghiÒn cña 1 rau, qu¶ tư¬i (khoai t©y, rèt, chuèi, t¸o…): Thành phÇn
hãa häc cã: ®ưêng, axit nucleic, axit amin, vitamin, kho¸ng…
* DÞch thñy ph©n casein (casein hydrolysat) hay pepton : chñ yÕu ®ưîc sö dông làm
nguån bæ xung axit amin.
ChÊt làm ®«ng cøng m«i trưêng - Agar.
4
Agar làt lo¹i polysaccarit cña t¶o. ë 80 0C th¹ch ngËm nưíc chuyÓn sang tr¹ng th¸i
sol cßn ë 40 0C th× trë tr¹ng th¸i gel. Kh¶ n¨ng ngËm nưíc cña th¹ch kh¸ cao: 6 -
12 gam/lÝt nưíc. Th¹ch ë d¹ng gel nhưng vÉn ®Ó cho c¸c ion vËn chuyÓn dung
và cã ®é tho¸ng khÝ cao. Nång ®é trung b×nh 6 - 8g/lÝt
Câu 5 Có m y nhóm ch t đi u hòa sinh tr ng? Nêu vai trò c a chúng trong ưở
đi u khi n s phát sinh hình thái c a mô, t bào th c v t nuôi c y in vitro? ế
Bên c nh các ch t cung c p dinh d ng cho nuôi c y, vi c b sung m t ho c ưỡ
nhi u ch t đi u hòa sinh tr ng nh auxin, cytokinin giberellin r t c n thi t đ ưở ư ế
kích thích s sinh tr ng, phát tri n và phân hoá c quan, cung c p s c s ng t t cho ưở ơ
các t ch c. Tuy v y, yêu c u đ i v i nh ng ch t y thay đ i tuỳ theo loài
th c v t, lo i mô, hàm l ng ch t đi u hòa sinh tr ng n i sinh c a chúng. Các ch t ượ ưở
đi u hoà sinh tr ng th c v t đ c chia thành các nhóm chính sau đây: ưở ượ
A. Nhóm auxin
i tr ng nuôi cây đ c bô sung cac auxin khac nhau nh : 1H- indole-3-acetic acidươ) * ươ+ , * * ư
(IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-
dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) va naphthoxyacetic acid (NOA))
Vai trò:
- Kích thích phân chia và kéo dài t bào ế
- Ch i đ nh cung c p auxin y ra c ch sinh tr ng c a ch i bên. u th ch i ế ưở Ư ế
đ nh làm c ch sinh tr ng c a ch i nách. N u ng t b ch i đ nh s d n đ n s ế ưở ế ế
phát ch i nách. N u thay th vai trò c a ch i đ nh (đã b ng t b ) b ng m t l p ch t ế ế
keo ch a IAA thì ch i nách v n b c ch sinh tr ng. C ch c ch c a ch i ế ưở ơ ế ế
đ nh liên quan đ n m t ch t đi u hoà sinh tr ng khác ethylene. Auxin (IAA) ch ế ưở
thích ch i bên s n sinh ra ethylen làm c ch sinh tr ng c a ch i đ nh. ế ưở
- IAA đóng vai trò kích thích s phân hoá c a các mô d n (xylem and phloem).
- Auxin kích thích s m c r cành giâm kích thích s phát sinh ch i ph trong
nuôi c y mô.
- Auxin các nh h ng khác nhau đ i v i s r ng lá, qu , s đ u qu , s phát ưở
tri n và chín c a qu , s
ra hoa trong m i quan h v i đi u ki n môi tr ng. ườ
- T o và nhân nhanh mô s o (callus)
- Kích thích t o ch i b t đ nh ( n ng đ th p)
- T o phôi soma (2,4-D)
B. Nhóm các cytokinin
Cac cytokinin la dân xuât cua adenine, đây la nh ng hormone liên quan chu yêu đên* ) / * , ) ư/ , * *
s phân chia bao, s thay đôi u thê ngon va phân hoa chôi trong nuôi cây .ư+ * ) ư+ , ư * + ) * ) *
Cac cytokinin đ c s dung th ng xuyên nhât la 6-benzylaminopurine (BAP) hoăc* ươ+ ư, + ươ) * ) +
6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-
5