Tạp chí Khoa học và Công nghệ 51 (3A) (2013) 1-16
TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH LÊN MEN FED-BATCH TẾ BÀO
CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM
Trần Thị Minh Tâm1, Nguyễn Thúy Hương2
1Khoa Sinh, trường Đại học Sư phạm Tp. HCM
1,2Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM
Mail: tamttm@hcmup.edu.vn
Đến Tòa Soạn ngày: Nhận đăng ngày:
TÓM TẮT
Bài báo nghiên cứu tối ưu hóa quá trình lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ chủng vi
khuẩn Corynebacterium glutamicum và tế bào cố định trên chất mang alginate. Kết quả nghiên
cứu cho thấy bắt đầu bổ sung thêm cơ chất glucose và chất cảm ứng biotin sau 18 giờ lên men,
mỗi chu kỳ bổ sung là 6 giờ với lượng bổ sung như sau: glucose 4,7% (w/v); biotine 0,54µg/L.
Và hàm lượng lysine tăng 1,25 lần sao với lên men dạng mẻ ở cùng điều kiện lên men.
Từ khóa. lysine, lên men fed-batch, tối ưu hóa.
1. MỞ ĐẦU
Lysine là một acid amin thiết yếu hiện diện với một lượng rất ít trong các loại thức ăn (ngũ
cốc, các loại đậu). Lysine không được tổng hợp trực tiếp trong cơ thể người và động vật mà cần
phải bổ sung từ bên ngoài. Ở thực vật và vi sinh, lysine được tổng hợp từ chu trình acid aspartic.
Trong công nghiệp, L-lysine được nghiên cứu sản xuất bởi sự lên men của Corynebacterium
glutamicum . Trên thế giới lysine đã được đưa vào sản xuất công nghiệp và nhu cầu sử dụng
lysine càng ngày càng lớn. Tại Việt nam, nhu cầu sử dụng lysine lớn trong thức ăn chăn nuôi và
thực phẩm nhưng lượng lysine hoàn toàn được nhập khẩu từ nước ngoài, hơn nữa quy trình lên
men vẫn chưa được nghiên cứu hoàn chỉnh và cũng chưa có cơ sở nào triển khai sản xuất lysine
ở quy mô công nghiệp. Kỹ thuật lên men đa dạng và được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu vi
sinh thu nhận sản phẩm bậc một và bậc hai . Trong giới hạn bài báo này, nhằm nâng cao năng
suất thu nhận L-lysine và tiến gần với quy mô sản xuất công nghiệp, chúng tôi nghiên cứu quá
trình tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất thu nhận L-lysine từ tế bào tự
do bằng kỹ thuật lên men fed-batch.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Chủng vi khuẩn: Corynebacterium glutamicum VTCC B-656 có nguồn gốc từ trung tâm
lưu trữ giống Đại học Quốc gia Hà nội
Trần Thị Minh Tâm, Nguyễn Thúy Hương
2.1.2. Vật liệu và hóa chất: các hóa chất cần thiết sử dụng môi trường nuôi cấy vi sinh
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men sinh Lysine.
Phương pháp lên men fed-batch ở quy mô phòng thí nghiệm.
Định tính L-lysine bằng phương pháp sắc ký bản mỏng, định lượng L-lysine bằng sắc ký
lỏng cao áp (HPLC). Xử lý số liệu thống kê: phần mềm Minitab 16.
2.3. Bố trí thí nghiệm
2.3.1. Khảo sát sự biến thiên nồng độ glucose, pH, sinh khối khô và lượng L-lysine theo thời
gian
Tiến hành nuôi cấy tế bào Corynebacterium glutamicum 10% (v/v) trong môi trường lên
men tối ưu , lấy mẫu mỗi chu kỳ 4 giờ kiểm tra: lượng glucose; lysine; pH và xác định sinh khối
khô trong canh trường, số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16. Mục đích xác
định mối tương quan giữa độ hao hụt glucose và lượng lysine sinh ra trong canh trường sau mỗi
thời điểm khảo sát; đồng thời xác định khoảng thời gian sẽ bổ sung thêm lượng glucose đã hao
hụt.
2.3.2. Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa hồi quy tuyến tính các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến năng
suất thu nhận L-lysine
Thí nghiệm được thiết kế theo ma trận Plackett-Burman với các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp
đến khả năng sinh lysine của chủng khảo sát. Ngoài yếu tố nồng độ glucose là cơ chất chính cần
bổ sung, chúng tôi tiến hành nghiên cứu bổ sung nồng độ biotin (chất cảm ứng quá trình sinh
lysine của chủng khảo sát) .
Bảng 1. Các biến trong ma trận Plackett-Burman
Tên yếu tố Giá trị các yếu tố
Thấp (-1) Cao (+1)
Glucose (%w/v) (x1) 6 3
Biotine (µg/L) (x2) 0,4 1,2
Thời gian bổ sung (giờ) (x3) 2 6
2.3.3. Xây dựng mô hình tối ưu và đánh giá mô hình bằng thực nghiệm
Trên cơ sở hàm hồi quy xác định trên, xây dựng một số mô hình bằng phần mềm Minitab
16 và tiến hành đánh giá mô hình.
3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1. Sự biến thiên glucose, sinh khối khô, pH và lượng lysine theo thời gian
Tối ưu hóa quá trình lên men fed-batch tế bào tự do và tế bào cố định …
Chủng vi sinh vật nghiên cứu có quá trình phát triển sinh khối và sinh lysine diễn ra song
song. Sự biến thiên giữa sinh khối, sự tiêu thụ glucose, pH và sản lượng lysine được thể hiện qua
đồ thị.
12
9
6
3
0
88807264564840322418124
100
75
50
25
0
88807264564840322418124
30
20
10
0
8
6
4
2
0
Sinh khối khô (g/L)
thời gian (giờ)
Glucose(g/L)
Lysine (g/L) pH
Hình 1. Diễn biến về tăng trưởng, pH môi trường, lượng glucose trong canh trường và sản lượng
lysine của chủng khảo sát theo thời gian lên men
Sự biến thiên nồng độ glucose trong canh trường và lysine theo tỷ lệ nghịch, trong khi đó
pH và sinh khối khô có sự biến động ít hơn.
Thứ nhất, nồng độ glucose trong canh trường tỷ lệ nghịch với thời gian từ khi lysine bắt
đầu sinh ra cho đến khi kết thúc quá trình lên men. Cụ thể là, lúc 12 giờ lên men nồng độ
glucose giảm 21% so với ban đầu; sau 18 giờ, lượng glucose giảm nhanh (từ 114g/L còn 79
g/L); nồng độ glucose tiếp tục giảm cho đến kết thúc quá trình với hệ số góc đường thẳng là -
0,83 từ 79 g/L (lúc 18 giờ) giảm xuống 17 g/L (lúc 92 giờ). Giai đoạn sau 18 giờ lên men đến 72
giờ, nồng độ glucose trong canh trường giảm đáng kể với hệ số góc đường thẳng bằng -1; 79g/L
so sánh với 29g/L.
Thứ hai, lượng lysine tăng đáng kể gấp 90 lần (lúc 18 giờ) so với thời điểm lysine bắt đầu
sinh ra (4 giờ); 0,9 g/L so với 0,01 g/L. Sản lượng lysine đạt cao nhất (28,05 g/L) sau 72 giờ lên
men và năng suất thu nhận L-lysine giảm sau đó, khoảng 19 g/L tại thời điểm 92 giờ lên men.
Thứ ba, lượng sinh khối khô trong canh trường tăng nhanh sau 8 giờ lên men đầu tiên, đạt
cực đại sau 24 giờ (12 g/L); sau đó lượng này thay đổi không đáng kể theo thời gian. Cuối cùng,
chỉ số pH trong canh trường theo thời gian lên men biến động trong giới hạn 4,0 đến 7,6; thấp
nhất tại thời điểm 36 giờ và chỉ số này bắt đầu tăng đến khi kết thúc quá trình lên men.
Thật vậy, nồng độ cơ chất chính (glucose) giảm đáng kể là do chủng khảo sát tiêu thụ cơ
chất để tham gia vào con đường EMP trong chu trình pyruvat; chuyển hóa glucose thành sản
phẩm bậc hai (L-lysine). Lượng cơ chất này giảm càng lớn khi lượng lysine sinh ra càng nhiều .
Tuy chủng khảo sát không có sự phân hủy lysine trong quá trình lên men, nhưng do lysine dễ bị
Trần Thị Minh Tâm, Nguyễn Thúy Hương
phân hủy bởi các yếu tố khác trong canh trường nên lượng lysine đã giảm nếu kéo dài quá trình
lên men. Vì vậy, kết thúc quá trình lên men đúng lúc và bổ sung lượng cơ chất cần thiết đã hao
hụt để chủng khảo sát kịp thời sử dụng đủ lượng cơ chất xúc tiến quá trình sinh lysine tối đa.
Dựa vào số liệu thực nghiệm, chúng tôi tiến hành phân tích sự tương quan giữa các yếu tố
cho thấy sản lượng lysine, glucose và thời gian lên men có mối tương quan rất gần (|r| > 0,9). Do
đó, chúng tôi tiến hành khảo sát quá trình lên men fed-batch bổ sung glucose theo chu kỳ thời
gian với hàm mục tiêu là hiệu suất thu nhận lysine cao nhất.
3.2. Phân tích hồi quy tuyến tính tối ưu hóa 3 yếu tố trong quá trình khảo sát fed-batch
Tiến hành khảo sát fed-batch 3 yếu tố: lượng glucose bổ sung (3-6%) vào canh trường lên
men và thời gian bổ sung (2-6 giờ) đã được xác định qua đồ thị 1; nồng độ biotin (0,4-1,2µg/L)
là vi chất cảm ứng của chủng khảo sát trong quá trình nghiên cứu thu lysine . Kết quả thực
nghiệm theo ma trận Plackett-Burman có tâm phương án xác định lượng lysine trong canh
trường sau 72 giờ lên men.
Phân tích số liệu bằng phần mềm Minitab 16, ba yếu tố khảo sát ảnh hưởng chính đến hàm
lượng lysine trong canh trường (giá trị có ý nghĩa thống kê p < 0,001) và các yếu tố tương tác
không ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng lysine, nên hàm tuyến tính diễn tả mối liên quan giữa
lysine trong canh trường sau 72 giờ lên men và các yếu tố khảo sát được viết dưới dạng: y = a0 +
a1*x1 + a2*x2 + a3*x3; trong đó, y là hàm lượng lysine (g/L), x1 (glucose), x2 (biotin), x3 (thời gian).
Phân tích hồi qui xác định các chỉ số a0, a1, a2, a3 đều có ý nghĩa thống kê và hệ số hồi quy (R-sq)
tính được là 0,9. Điều này thể hiện rằng có 90% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu tiên
đoán theo mô hình và giải thích được sự tương quan chặt chẽ giữa các yếu tố thí nghiệm và hàm
lượng lysine. Đánh giá mô hình được chọn dựa vào tiêu chí Mallows, có giá trị Cp gần bằng p
nhất và R-sq lớn nhất.
Phân tích bằng Minitab 16 các tiêu chí ở trên, mô hình hồi quy ba biến số x1, x2, x3 có giá
trị Cp = 4 đúng bằng giá trị p = 4 của thí nghiệm và R-sq = 0,9 là lớn nhất. Phương trình hồi quy
xác định như sau: y = 18,438 + 2,95*x1 - 4,4*x2 + 3,775*x3.
Phương trình hồi quy xác định cho thấy, để thu lượng lysine cao nhất (y) thì phải tăng nồng
độ glucose trong canh trường (hệ số = + 2,95) và giảm chu kỳ fed-batch bằng cách kéo dài
khoảng cách giữa hai lần bổ sung (hệ số = + 3,775) đồng thời giảm lượng biotin thêm vào (hệ số
= - 4,4). Điều này không đi ngược lại những kết quả đã công bố như Ko (1984) và Kiefer (2004),
thí nghiệm đã lên men với điều kiện tối ưu đã nghiên cứu trước , sử dụng cơ chất thay thế như
một phần bổ sung lượng glucose và biotin có sẵn trong dịch chiết bắp khi bổ sung vào canh
trường lên men dạng mẻ. Góp phần nâng cao hiệu suất lên men và hiệu quả kinh tế khi tiến gần
đến quy mô sản xuất công nghiệp.
3.3. Thực nghiệm tối ưu đường dốc nhất
Tiến hành thiết kế thí nghiệm theo phương pháp đường dốc nhất từ tâm phương án và dựa
trên hàm hồi quy tuyến tính chúng tôi xác định được lượng lysine cao nhất đạt được 35,08 g/L,
tăng 1,25 lần so với khảo sát ban đầu trong điều kiện lên men tối ưu theo mẻ (đồ thị 1).
Theo nghiên cứu của Ko, Chipley (1984) khi nồng độ glucose và biotin trong canh trường
lên men thích hợp đối với chủng Corynebacterium sp. thì sản lượng L-lysine được cải thiện đáng
kể. Điều này giải thích là khi bổ sung một lượng thích hợp cơ chất glucose và chất cảm ứng
biotine thì sản lượng lysine tăng lên. Nồng độ biotin trong canh trường cao kích thích cho màng
tế bào Corynebacterium sp. dễ dàng tiết amino acid mang tính kiềm (lysine) đi từ bên trong nội
Tối ưu hóa quá trình lên men fed-batch tế bào tự do và tế bào cố định …
bào ra ngoài môi trường và kìm hãm sản sinh lượng acid glutamic sinh ra song song cùng L-
lysine .
4. KẾT LUẬN
Phương pháp lên men fed-batch có nhiều ưu điểm hơn phương pháp lên men dạng batch
trong nghiên cứu thu nhận L-lysine từ chủng khảo sát. Sản lượng L-lysine lên men dạng fed-
batch đạt được 35 g/L cao gấp 1,25 lần so với lên men trong điều kiện tối ưu dạng mẻ (28g/L).
Đây là ưu điểm nổi trội trong sản xuất công nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Kiefer, P., E. Heinzle, O. Zelder, and C. Wittmann, Comparative metabolic flux analysis
of lysine-producing Corynebacterium glutamicum cultured on glucose or fructose.
Applied and environmental microbiology, 2004. 70(1): p. 229-239.
2. Anastassiadis, S., L-lysine fermentation. Recent patents on Biotechnology, 2007. 1(1): p.
11-24.
3. Tâm, T.T.M. and N.T. Hương, Tối ưu quá trình lên men thu nhận amino acid L-lysine từ
vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC - B- 656. Đại học Quốc gia Hà nội, Khoa
học tự nhiên, 2009(25): p. 172-178.
4. Ko, Y. and J. Chipley, Role of biotin in the production of lysine by Brevibacterium
lactofermentum. Microbios, 1983. 40(161-162): p. 161-171.
ABSTRACT
OPTIMIZATION OF CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM BY FED-BATCH
FERMENTATION
Tran Thi Minh Tam1, Nguyen Thuy Huong2
1Biology Faculty, Pedagogical University of Ho Chi Minh City
1,2Department of Biotechnology, Technology University of Ho Chi Minh City
In this paper, we investigate optimization of fed-batch fermentating process on the
usability L-glucose and biotine (vitamin H) by Corynebacterium glutamicum VTCC-B-656 and
immobilized cell on aginate matrix to receive amino acid L-lysine. The results are given that
after each fermentating cycling, we added L-glucose 4.7% (v/v); biotine: 0.54µg/L and adding-
time cycle was 6 hours as well as started adding after 18 hour-batch fermentation. And
production of L-lysine gained 1.25 times higher than those of batch fermentation.
Keyword: lysine, fed-batch fermentation, optimization.