Đồ án tốt nghiệp: Định danh vùng gene 16D DNA chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ Dầu Tiếng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH VÙNG GENE 16S DNA CHỦNG VI KHUẨN

LAM CÓ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TỐ Ở HỒ DẦU TIẾNG

Ngành:

Công Nghệ Sinh Học

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hướng dẫn : TS. Hoàng Quốc Khánh

HVCH. Ngô Đức Duy

Sinh viên thực hiện

: Khưu Văn Quang

MSSV: 1311101028 Lớp: 13DSH06

TP. Hồ Chí Minh, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Người thực hiện đề tài xin cam đoan những nội dung trong đồ án tốt nghiệp

này là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, dưới sự

hướng dẫn của TS.Hoàng Quốc Khánh và HVCH.Ngô Đức Duy. Các số liệu và kết

quả nghiên cứu trong đồ án này là trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo

nào đã được công bố trước đây. Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài

liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí khoa học và các trang web

theo danh mục tài liệu của đồ án. Nếu sai người thực hiện đề tài xin chịu hoàn toàn

trách nhiệm và mọi kỷ luật của khoa và nhà trường đề ra.

Sinh viên thực hiện

Khưu Văn Quang

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM,

được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn

thành tốt bài báo cáo này. Em xin chân thành cảm ơn đến:

Thầy Ngô Đức Duy phòng vi sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới

TPHCM. đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực

hiện đồ án tốt nghiệp này.

Thầy Hoàng Quốc Khánh và thầy Nguyễn Hoàng Dũng phòng vi sinh ứng

dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TPHCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em làm đồ

án tốt nghiệp tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ để em thực hiện tốt đồ án tốt

nghiệp.

Chị Lê Quỳnh Loan đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẽ kiến thức, kinh nghiệm

và tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học

Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho em nhiều điều trong suốt

quá trình nghiên cứu.

Toàn thể các Thầy Cô khoa CNSH-TP-MT trường Đại Học Công Nghệ Thành

Phố Hồ Chí Minh là những người đã tận tâm dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em

được ngày hôm nay.

Các bạn trong lớp 13SH06 đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẽ mọi thứ với tôi

trong suốt quãng đường thời sinh viên.

Cuối cùng, con xin cảm ơn Ba Mẹ đã nuôi nấng, chăm sóc, dạy dỗ và cho con

ăn học thành người có ích cho xã hội.

Sinh Viên Thực Hiện

Khưu Văn Quang

1 MỤC LỤC

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

MỞ ĐẦU……………………………………………………...…………………1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................ 5

1.1. Tổng quan về tin sinh học ................................................................................ 5

1.1.1. Sự ra đời của tin sinh học ............................................................................. 5

1.1.2. Khái niệm Tin sinh học ................................................................................. 5

1.1.3. Vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học ............................................ 6

1.1.4. Cây phát sinh loài ......................................................................................... 6

1.1.5. Công cụ và cách tiến hành ............................................................................ 7

1.1.6. Đánh giá kết quả ........................................................................................... 8

1.2. Tổng quan về định danh sinh học phân tử ....................................................... 8

1.2.1. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số ................................... 9

1.2.2. Phương pháp PCR và ứng dụng.................................................................. 11

1.3. Tổng quan về vi khuẩn lam ............................................................................ 13

1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn lam ......................................................................... 13

1.3.2. Hình thái và cấu trúc tế bào ........................................................................ 14

1.3.3. Phân loại vi khuẩn lam ............................................................................... 15

1.3.4. Hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam .......................................................... 16

1.3.5. Độc tố microcystins .................................................................................... 17

1.3.6. Hai hợp chất gây mùi hôi geosmin và 2-methylisoborneol ........................ 20

1.3.7. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn lam và độc tố của vi khuẩn lam ........... 21

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 25

Thời gian và địa điểm ..................................................................................... 25 2.1.

i

2.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất........................................................................... 25

2.2.1. Dụng cụ và thiết bị ...................................................................................... 25

2.2.2. Nguồn mẫu .................................................................................................. 25

2.2.3. Hóa chất ...................................................................................................... 25

2.3. Phương pháp thu mẫu .................................................................................... 27

2.3.1. Phương pháp phân lập ................................................................................ 27

2.3.2. Phương pháp nuôi tăng sinh khối và thu sinh khối vi khuẩn lam ............... 27

2.3.3. Định danh chủng vi khuẩn lam bằng sinh học phân tử............................... 28

Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR: .............................................. 32

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...................................................... 35

3.1. Kết quả ly trích và thu nhận DNA bộ gene của hình thái vi khuẩn lam ........ 35

3.2. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau khi ly trích và thu nhận .................... 36

3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gen 16S DNA bằng kỹ thuật PCR ......................... 37

3.3.1. PCR với cặp mồi CYA371F, 373R ............................................................ 37

3.3.2. PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R ............................................................. 38

3.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn lam ..................... 39

3.5. Kết quả giải trình tự vùng gen 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam ......... 39

3.5.1. Mẫu 2 (chủng Microsystis) ......................................................................... 39

3.5.2. Mẫu 10 (chủng Anabaena) .......................................................................... 40

3.5.3. Mẫu 29 (chủng Cylindropermopsis) ........................................................... 40

3.5.4. Mẫu 31(chủng plantothrix) ......................................................................... 41

3.6. Kết quả so sánh trình tự gen trên ngân hàng NCBI và xây dựng cây phát sinh loài ......................................................................................................................... 41

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... 44

4.1. Kết luận .......................................................................................................... 44

4.2. Đề nghị ........................................................................................................... 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 46

PHỤ LỤC

ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribo Nucleic Axit

RNA Ribonucleic Acid

Ethylene diamine tetraacetic acid EDTA

National Center for Biotechnology Information NCBI

Polymerase chain reaction PCR

Ultraviolet UV

Tris acetate ethylenediaminetetraacetic acid TAE

Microcystins MCs

MIB Methylisoborneol

ITB Institute of Tropical Biology

CTAB Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide

Cs Cộng sự

SDS Sodium dodecyl sulfate

Bp Base pairs

UV Ultra violet

iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Vi khuẩn lam nở hoa ở Hồ Dầu Tiếng ........................................... ..........17

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 3 loại độc tố microcystins thường gặp ................... 18

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Geosmin và 2-methylisoborneol MIB .................... 21

Hình 2.1. Sinh khối vi khuẩn lam ............................................................................. 28

Hình 2.2. Quy trình phản ứng PCR ........................................................................... 31

Hình 3.1. Kết quả thu nhận DNA bộ gene của vi khuẩn lam gồm 4 chủng trên gel

agarose 1,5 ................................................................................................................. 35

Hình 3.2. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi

CYA371F, 373R ....................................................................................................... 37

Hình 3.3. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi

CYA-F, CYA-R ........................................................................................................ 38

Hình 3.4. Kết quả điện di trên gel agarose của các chủng vi khuẩn lam sau khi tinh

sạch ............................................................................................................................ 39

Hình 3.5. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene 16S DNA của các

chủng Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis với vi khuẩn lam

trên ngân hàng NCBI……………...………………………………………….……42

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA371F và 373R ................................... 32

Bảng 2.2.Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA-F và CYA-R ..................................... 33

Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau thu nhận .................................... 36

v

Đồ Án Tốt Nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Việc gia tăng dân số, phát triển các ngành công nghiệp, nông nghiệp đã và đang

làm gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu là ni tơ và phốt pho) đáng kể vào các thủy

vực. Ô nhiễm dinh dưỡng diễn ra ngày càng quan trọng tại các thủy vực như sông,

hồ, đầm nuôi trồng thủy sản...luôn đi kèm với hiện tượng nở hoa nước mà thực chất

là sự phát triển mạnh mẽ của quần xã thực vật nổi trong đó chủ yếu do vi khuẩn lam

(VKL).

Vi khuẩn lam là một trong những sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đất cách

đây hàng tỷ năm và tồn tại cho đến ngày nay. Cùng với vi tảo, vi khuẩn lam đóng

một vai trò quan trọng trong sinh thái thủy vực như cung cấp nguồn năng lượng sơ

cấp cho các chuỗi thức ăn trong thủy vực, đồng thời giải phóng một lượng oxy vào

không khí thông qua quá trình quang hợp. Tuy nhiên, bên cạnh những đóng góp tích

cực thì hiện tượng tăng trưởng bùng phát hay còn gọi là nở hoa của vi khuẩn lam

gây nhiều ảnh hưởng xấu lên chất lượng môi trường nước, tài nguyên thủy sản và

cân bằng hệ sinh thái. Trong đó một số loài nhóm vi sinh này có khả năng sản sinh

độc tố. Ở nước ta, vi khuẩn lam sinh độc và độc tố của chúng thường xuất hiện

trong các thủy vực nước ngọt. Chúng có khả năng sản sinh ra các loại độc tố như

neurotoxin (độc tố thần kinh) và hepatotoxin (độc tố gan). Độc tố nhóm vi sinh này

tác động nguy hiểm tới sinh vật thủy sinh và sức khỏe con người. Do đó Tổ chức Y

tế thế giới (WHO) quy định nồng độ giới hạn trong nước uống không được vượt

quá là 1 µg/L. Ngoài ra một số chủng này còn sinh ra các hợp chất gây mùi hôi

trong nước.

Ở Việt Nam ô nhiễm môi trường nước mà chủ yếu là ô nhiễm chất hữu cơ, chất

dinh dưỡng, kéo theo bùng nổ thực vật nổi, trong đó có tảo độc đang diễn ra rất phổ

biến do tác động của các hoạt động con người trong các lưu vực sông, hồ....Tại các

hồ như hồ Ba Bể, hồ Tây, hồ hoàn Kiếm, hồ Dầu Tiếng, hồ Trị An, hồ Núi Cốc...

1

Đồ Án Tốt Nghiệp

đều quan sát thấy sự hiện diện của vi khuẩn lam độc chủ yếu là các loài thuộc

Microcystis, Anabaena, Plantothrix, Cylindropermopsis...

Hồ Dầu Tiếng là hồ chứa nước nhân tạo có chức năng như ngăn lũ, cấp nước sinh

hoạt, tưới tiêu, rửa mặn, cải thiện chất lượng nước và nuôi trồng thủy sản. Là nguồn

cung cấp trực tiếp hoặc gián tiếp nước sinh hoạt và tưới tiêu cho hàng triệu dân ở

Tây Ninh, Bình Dương và TP.Hồ Chí Minh.

Hiện nay, các nghiên cứu đã cho thấy thành phần vi khuẩn lam tại hồ Dầu Tiếng

rất đa dạng và hiện tượng nở hoa tại đây đang là một vấn đề quan trọng và mang

tính cấp bách. Vi khuẩn lam nở hoa và độc tố của chúng sinh ra sẽ gây ảnh hưởng

rất lớn tới sinh vật thủy sinh, động vật sống xung quanh hồ và sức khỏe con người.

Phần lớn các nghiên cứu ở nước ta hiện nay chỉ tập trung vào đánh giá sự đa dạng

của nhóm vi sinh này tại các thủy vực, đặc điểm hình thái cũng như chỉ nghiên cứu

độc tính trên thực vật hoặc động vật thủy sinh. Chưa có nhiều nghiên cứu tập trung

về định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam. Và đây là đề tài khảo sát về

sự hiện diện của các chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ Dầu Tiếng

hiện nay.

2. Mục đích nghiên cứu

Mục đích của đề tài là định danh vùng gene 16S DNA chủng vi khuẩn lam có

khả năng gây độc tố ở Hồ Dầu Tiếng.

3. Nhiệm vụ nghiên cứu

Phân lập một số loài vi khuẩn lam tại hồ Dầu Tiếng.

Định danh vi khuẩn lam tới chi dựa theo hình thái học và sinh học phân tử.

Khảo sát sự hiện diện có mặt chủ yếu của loài vi khuẩn lam ở hồ Dầu Tiếng.

4. Phƣơng pháp nghiên cứu

Phương pháp thu mẫu, phân lập mẫu và nuôi tăng sinh khối, thu sinh khối vi

khuẩn lam.

2

Đồ Án Tốt Nghiệp

Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gene DNA (theo phương pháp CTAB).

Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi 16S DNA.

Sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gene 16S DNA loài vi

khuẩn lam.

Đề tài có sử dụng các phần mềm như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120,

seaview 4.32.0.0.

Ngân hàng gene https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

Các tài liệu phục vụ nghiên cứu được tham khảo từ các nghiên cứu, các bài báo

khoa học, các luận văn khoa học được sưu tầm trên internet.

5. Các kết quả đạt đƣợc

Sau quá trình nghiên cứu đề tài đã tách chiết được 4 chủng vi khuẩn lam dựa vào

các bước định danh sinh học phân tử, dựa trên các nghiên cứu trong và ngoài nước

thì cả 4 loài vi khuẩn lam này đều có khả năng gây bệnh nguy hiểm trên thực vật,

động vật nguyên sinh và cả con người. Và đã chọn lọc được đoạn mồi thích hợp để

định danh 4 chủng vi khuẩn lam là Microcystis, Anabaena, Plantothrix,

Cylindropermopsis.

6. Kết cấu đề tài

Đề tài gồm 4 chương

Chương 1: Tổng quan

Trình bày về sự ra đời, khái niệm, vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học

để dựng cây phát sinh loài. Giới thiệu về kỹ thuật PCR và các ứng dụng chủ yếu của

PCR để sử dụng trong định danh vi khuẩn lam. Giới thiệu tổng quan về vi khuẩn

lam, hình thái, cấu trúc tế bào, phân loại và hiện tượng nở hoa của loài vi khuẩn

lam, tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam trong và ngoài nước.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3

Đồ Án Tốt Nghiệp

Trình bày thời gian và địa điểm thu mẫu, những hóa chất, máy móc thiết bị phục

vụ nghiên cứu và toàn bộ các quy trình, thao tác thực hiện các phương pháp

nghiên cứu như thu mẫu, phân lập, nuôi tăng sinh khối, thu sinh khối, định danh,

phương pháp ly trích DNA, đo OD, điện di, tinh sạch DNA và giải trình tự gene.

Chương 3: Kết quả và biện luận

Trình bày và biện luận những kết quả chi tiết của toàn bộ quá trình thực hiện

nghiên cứu.

Chương 4: Kết luận và đề nghị

Tổng kết lại những kết quả nghiên cứu đã đạt được và đưa ra những đề nghị liên

quan nhằm hoàn thiện đề tài.

4

Đồ Án Tốt Nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về tin sinh học

1.1.1. Sự ra đời của tin sinh học

Do sự xuất hiện của các thông tin về cấu trúc, chức năng và trình tự protein,

DNA từ đó dẫn tới nhu cầu quản lý, so sánh và dự đoán cấu trúc và chức năng của

chúng.

Ngoài ra, sự phát triển của các ngành khoa học khác như là công nghệ thông tin,

máy tính đã hình thành môn khoa học mới đó là Tin sinh học (bioinformatics).

1.1.2. Khái niệm Tin sinh học

Tin sinh học (bioinformatics) là môn học về cách sử dụng máy tính để giải

quyết những vấn đề của khoa học sự sống, chủ yếu là vấn đề cơ sở dữ liệu phong

phú của bộ gen, trình tự protein…

Tin sinh học (bioinformatics) là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ

của các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính, trí tuệ nhân

tạo, hóa học và hóa sinh (biochemistry) để giải quyết các vấn đề sinh học. Một thuật

ngữ thường được dùng thay thế cho tin sinh học là sinh học tính

toán (computational biology). Tuy nhiên, tin sinh học thiên về việc phát triển các

giải thuật, lý thuyết và các kĩ thuật thống kê và tính toán để giải quyết các bài toán

bắt nguồn từ nhu cầu quản lý và phân tích dữ liệu sinh học. Trong khi đó, sinh học

tính toán thiên về kiểm định các giả thuyết (hypothesis) được đặt ra của một vấn đề

trong sinh học nhờ máy tính thực nghiệm trên dữ liệu mô phỏng, với mục đích

chính là phát hiện và nâng cao tri thức về sinh học (ví dụ: dự đoán mối quan hệ

tương tác giữa các protein, dự đoán cấu trúc bậc 2 phân tử của protein, v.v.).

Ngoài ra nó còn giải quyết những vấn đề về kỹ thuật như mô hình cấu trúc ba

chiều của phân tử và các hệ thống sinh học.

5

Đồ Án Tốt Nghiệp

Các ngành của Tin sinh học bao gồm: tin sinh học genome, tin sinh học protein,

tin sinh học tiến hóa, tin sinh học nông nghiệp, tin sinh học y học, phát triển các

công cụ và cơ sở nền.

Thuật ngữ bioinformatics có thể định nghĩa một cách ngắn gọn là sự kết hợp giữa

công nghệ sinh học và công nghệ thông tin với mục tiêu giúp hiểu biết và khám phá

những nguyên lý trong sinh học (National Center for Biotechnology Information).

1.1.3. Vai trò và xu hướng phát triển của tin sinh học

1.1.3.1. Vai trò của Tin sinh học

- Tập hợp, lưu trữ, sắp xếp, truy xuất cơ sở dữ liệu.

- Hỗ trợ cho việc tìm kiếm, phân tích, xử lý và dự đoán các kết quả nghiên cứu.

- Hỗ trợ trong các nghiêm cứu về cấu trúc không gian phân tử.

- Hỗ trợ trong nghiên cứu đa dạng và tiến hóa của sinh vật

1.1.3.2. Xu hướng phát triển của Tin sinh học

Những lĩnh vực của Tin sinh học đang được tập trung nghiên cứu:

+ Quản lí cơ sở dữ liệu.

+ Phân tích, biên dịch dữ liệu.

+ Phát triển các thuật toán.

+ Các cấu trúc cơ sở dữ liệu.

+ Thiết kế các giao diện và hiển thị.

1.1.4. Cây phát sinh loài

Cây phát sinh loài là (tiếng Anh: phylogenic tree) miêu tả lịch sử tiến hóa của

một nhóm các loài (species) với những đặc tính khác nhau nhưng cùng có mối quan

hệ họ hàng với nhau và cùng hình thành từ một tổ tiên chung trong quá khứ. Có

nhiều hướng nghiên cứu khác nhau để chứng minh đặc điểm phát sinh chủng loại

này. Trước hết, người ta có thể so sánh trình tự các đoạn DNA (thuộc sinh học phân

6

Đồ Án Tốt Nghiệp

tử hay hệ gene học (genomics); hoặc so sánh các hóa thạch (fossil) hoặc các di chỉ

(record) của cổ sinh vật học (thuộc khảo cổ học - paleontology).

Các nhà sinh học tổ chức và phân tích các mối quan hệ tiến hóa thông qua các

phương pháp khác nhau, bao gồm phát sinh chủng loài học (phylogenetics), ngoại

hình học (phenetics) và miêu tả theo nhánh học (cladistics). Các sự kiện chính xảy

ra trong quá trình tiến hóa của sự sống được xây dựng thành biểu đồ thời gian của

tiến hóa (evolutionary timeline) dựa trên các hiểu biết hiện nay của khoa học.

Chúng ta có thể tạo cây phát sinh loài từ các trình tự đoạn gene có được so sánh

với những trình tự trong ngân hàng dữ liệu gene bằng cách sử dụng chương trình

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số

trình tự tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần

mềm tin sinh học như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0 để

xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp những thông tin có liên quan đến tiến hóa.

Một cây phát sinh loài gồm các thành phần sau:

- Một nhánh (một đơn vị huyết thống) là một nhóm vi sinh vật hay nhóm gene

bắt nguồn từ tổ tiên chung. Trong phân tích cây phát sinh loài, chiều dài

nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa giữa các loài.

- Nút giao điểm của các nhánh.

- Hệ thống phát sinh loài dựa trên các phân tử mà đặc biệt là trình tự gene được

sử dụng phổ biến trong định danh phân loại.

1.1.5. Công cụ và cách tiến hành

Seaview 4 là một phần mềm (giao diện Windows) dùng để so sánh tương đồng

nhiều trình tự DNA và protein. Nó mô tả kết quả bằng hệ thống các màu sắc và làm

nổi bậc những nét đặc trưng trong những đoạn tương đồng.

MEGA5 5.0.1.120 là một phần mềm dùng để vẽ cây phát sinh loài. Phần mềm

này thực hiện đọc kết quả so sánh từ những tập tin dạng PHYLIP hoặc MEGA của

chương trình seaview 4.32.0.0.

7

Đồ Án Tốt Nghiệp

Mở chương trình seaview 4 trên desktop.

 Lựa chọn chức năng Multiple Alignment Mode.

 Từ menu File, chọn Load Sequences. Trong hộp Open, chọn các tập tin chứa

các trình tự cần so sánh. Nhấn nút Open.

 Chọn Do Complete Alignment trong Menu Alignment. Xác định vị trí cho

tập tin xuất rồi nhấn nút Align.

1.1.6. Đánh giá kết quả

Kết quả xuất hiện các trình tự so sánh tương đồng. Các vị trí trình tự giống nhau

sẽ được thể hiện cùng một màu sắc (mỗi loại nucleotide một màu) và được đánh dấu

*. Vị trí giống nhau.

Ta có thể nhận xét mức độ tương đồng của các trình tự thông qua sự tương

đồng về màu sắc và dạng đồ thị bên dưới.

Để tạo cây phát sinh loài dạng PHYLIP chúng ta cần thực hiện các bước:

+ Trong menu Trees, chọn chức năng Draw N-J Trees.

+ Trong hộp DRAW TREE ta chọn nút OK để lưu tập tin dạng *.ph

+ Mở chương trình Tree View trên desktop. Từ menu File, chọn Open.

+ Trong hộp Open chọn tập tin *.ph và File of type là All tree files.

Một trang kết quả cây phát sinh loài bằng cách nhấn vào các nút Phylogram,

Rectanglar Cladogram, Cladogram, Radial tree.

1.2. Tổng quan về định danh sinh học phân tử

Có nhiều cách để định danh sinh học phân tử như: PCR, southern blotting,

northern blotting, western blotting, immunohistochemistry, microarray… nhưng

phương pháp chủ yếu định danh đối với loài vi khuẩn lam là PCR.

8

Đồ Án Tốt Nghiệp

1.2.1. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số

1.2.1.1. Nguyên tắc và yêu cầu

Ly trích và thu nhận DNA tổng số là nhu cầu cần thiết bởi các thực nghiệm

của công nghệ gene đều tiến hành với DNA (hay RNA).

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận

một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật

tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối

đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh)

hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường

khi tế bào bị phá vỡ).

Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế

hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease - DNase và ribonuclease -

RNase).

1.2.1.2. Một số phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi

theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc

là những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật

được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của

những bộ gene hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá.

Sự ra đời của kỹ thuật dựa trên phân tử acid nucleic đã dẫn tới sự thay đổi lớn

trong việc phát hiện vi sinh vật trong môi trường tự nhiên. Với những kỹ thuật này

đã phát hiện một số thay đổi lớn về việc tìm hiểu cấu trúc và sự vận động của các vi

sinh vật cộng đồng trong môi trường tự nhiên. Ly trích DNA thường bị ảnh hưởng

bởi các yếu tố như không ly trích hoàn toàn tế bào vi khuẩn hoặc DNA bị hư hỏng.

Rõ ràng việc áp dụng một quy trình ly trích DNA phù hợp với các mẫu cụ thể là rất

cần thiết cho việc đánh giá đúng đa dạng vi sinh vật. Phương pháp ly trích DNA cần

9

Đồ Án Tốt Nghiệp

phải đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả. Chất lượng DNA là rất quan trọng ảnh

hưởng đến hiệu quả khuếch đại DNA về sau. Do đó ly trích DNA được coi như một

bước phân tích độc lập trong phân tích đa dạng vi sinh vật. Việc ly trích thường kết

hợp với các chất tẩy, các tác nhân vật lý, các dung môi và enzyme để thu được

nucleic acid (Haruta và cộng sự (2002); Tomoyukihori và cộng sự (2006).

Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng

dụng là rất cần thiết. Quá trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và

độ nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo.

Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích

nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp.

Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên

thường được sử dụng:

- Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): Được xem là phương pháp

thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật

với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. J Zhou và cộng sự

(1996) đã sử dụng phương pháp ly trích với nồng độ muối cao (1,5 M

NaCl) và ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyl

trimethyl ammonium bromide, và proteinase K.

- Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là

phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB

là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB

được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích

DNA của vi khuẩn sử dụng phương pháp CTAB được mô tả bởi Ausubel

và cộng sự (1992). Ly trích DNA cần phải có cả hai yếu tố là hiệu suất và

độ tinh khiết. Trong nghiên cứu của Jara C. (2008), phương pháp ly trích

tốt nhất là phương pháp CTAB.

- Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương

đối hiệu quả. Nó có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia

10

Đồ Án Tốt Nghiệp

nhiệt đến 650C. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng

và mang lại kết quả khá cao. Phương pháp này được Zhu và cộng sự

(1993) sử dụng để ly trích DNA của cả thực vật, nấm và vi khuẩn.

- Phương pháp đóng băng và tan băng: Là phương pháp do Ellingsue và

cộng sự (2002). Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở - 65oC trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải

phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly

trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên.

1.2.2. Phương pháp PCR và ứng dụng 1.2.2.1. Kỹ thuật PCR

Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh (1985) tạo nên bước

tiến nhảy vọt trong sinh học phân tử và kỹ thuật gene. Đây là một kĩ thuật sinh hóa

và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con

đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành

một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học

và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gene, chuẩn đoán

bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gene.

PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên

mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao

của khuôn này thành hàng triệu bản sao mà không qua tạo dòng, nhờ hoạt động của

enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật

PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm

giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy

được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho

các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một

trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA,

đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên

biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược.

11

Đồ Án Tốt Nghiệp

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch

của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này

được kéo dài để hình thành mạch mới.

Mồi xuôi (forward primer): Bắt cặp với mạch khuôn DNA và kéo dài theo

chiều phiên mã.

Mồi ngược (reverse primer): Bắt cặp mạch mã của DNA và kéo dài ngược

chiều phiên mã.

Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm có: DNA mẫu, mồi xuôi, mồi

ngược, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR buffer, MgCl2, Taq polymerase.

1.2.2.2. Các ứng dụng chủ yếu của PCR

Có thể nói sinh học hiện đại nói chung, sinh học phân tử nói riêng không thể

thiếu ứng dụng của kỹ thuật PCR.

Trong kỹ thuật gene, PCR sử dụng thường xuyên trong tách dòng gene, xây

dựng ngân hàng gene, lập bản đồ gene và giải trình tự bộ gene.

PCR được dùng trong chẩn đoán bệnh do virus, vi khuẩn và các đột biến di

truyền.

PCR được dùng để tạo đột biến invitro, trong công nghệ protein tái tổ hợp, tạo

ra nhiều protein có tính năng vượt trội mà trong tự nhiên chưa hề có.

Nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài và phân loại phân tử.

1.2.2.3. Đoạn gene 16S rDNA

Gene rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gene mã hóa RNA của ribosome, đóng

vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát. rDNA được quan tâm nghiên

cứu vì nó là một gene có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho bất kì protein

nào. Các bản sao của gene nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới

quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng

nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ

12

Đồ Án Tốt Nghiệp

sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các

primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng

cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh.

Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự

không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh sinh vật.

Gene rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gene,

khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt

phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho

các nghiên cứu liên quan đến rDNA.

Để phát hiện sự hiện diện DNA của vi khuẩn lam, cặp mồi CYA (Urbach và

cộng sự, 1992; Hotto và cộng sự, 2005; Pham và cộng sự, 2015) đã được sử dụng để

khuếch đại một đoạn 1200 bp của đoạn gene 16S rDNA phổ biến cho hầu hết các

chủng vi khuẩn lam. Ngoài ra một số loài vi khuẩn lam thuộc chi Planktothricoides

và Microcystis được phát hiện dựa trên cặp mồi CYA371F và 373R (Savichtcheva

và cộng sự, 2011) khuếch đại một đoạn gen khoảng 1500 bp.

1.3. Tổng quan về vi khuẩn lam

1.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn lam

Vi khuẩn lam (danh pháp khoa học: Cyanobacteria) hay Tảo Lam (blue – green

algae) là một trong những nhóm sinh vật có sức sống mãnh liệt, có khả năng thích

ứng với hầu hết các điều kiện môi trường nên chúng có mặt ở mọi nơi: trên mặt đất,

ao hồ, sông suối và ven biển (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2007). Vi khuẩn lam

đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái thủy vực, là sinh vật sơ cấp trong môi

trường nước. Cùng với vi tảo, vi khuẩn lam cung cấp năng lượng sơ cấp cho những

sinh vật ở bậc cao hơn trong tháp năng lượng (Đào Thanh Sơn và cộng sự, 2013).

Khi chết chúng tạo ra nhiều bùn bã hữu cơ, là nguồn thức ăn quan trọng cho nhiều

loài sinh sinh vật. Nhiều loài vi khuẩn lam làm tăng độ phì nhiêu của đất bằng khả

năng cố định đạm (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2007). Ngoài ra, một số loài vi

khuẩn lam còn dùng để làm sạch các nguồn nước thải (Dương Thị Hoàng Oanh và

13

Đồ Án Tốt Nghiệp

cộng sự, 2011). Trong điều kiện môi trường thuận lợi ở các thủy vực giàu dinh

dưỡng, vi khuẩn lam dễ dàng phát triển mạnh và gây hiện tượng “nước nở hoa” gây

độc cho môi trường và ảnh hưởng bất lợi đến các sinh vật khác (Đặng Ngọc Thanh

và cộng sự, 2002; Dương Thị Hoàng Oanh và cộng sự, 2011).

Bằng việc tạo ra oxy ở dạng khí như là một phụ phẩm của quá trình quang hợp,

các vi khuẩn lam được người ta cho là đã chuyển đổi khí quyển mang tính khử ở

thời kỳ đầu thành khí quyển mang tính ôxi hóa, một công việc đã thay đổi mãnh

liệt thành phần sự sống trên Trái Đất bằng sự kích thích đa dạng sinh học và dẫn tới

sự gần như tuyệt chủng của các sinh vật không chịu được ôxy. Theo thuyết nội cộng

sinh, các lục lạp được tìm thấy trong thực vật và tảo nhân chuẩn đã tiến hóa từ các

tổ tiên là vi khuẩn lam thông qua cơ chế nội cộng sinh.

1.3.2. Hình thái và cấu trúc tế bào

Hình thái của vi khuẩn lam có thể được chia thành nhiều dạng bao gồm đơn

bào, đa bào, dạng tập đoàn hay dạng sợi. Tế bào nhóm vi sinh này không mang roi.

Sinh sản bằng cách chia đôi. Các tế bào có thể được bao bọc trong một khối nhầy có

màu vàng nhạt hoặc không màu trong suốt quá trình sinh trưởng để tạo thành tập

đoàn. Một số chủng dạng sợi, dạng chuỗi. Cấu trúc đa bào bao gồm một chuỗi các

tế bào gọi là trichome. Trichome có thể thẳng hoặc cuộn xoắn.

Cấu trúc tế bào khá đơn giản, chưa có nhân điển hình, chưa có màng phân cách

giữa nhân và tế bào chất, cấu trúc thành tế bào là lớp peptidoglycan tương tự như

cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn gram âm; bao gồm 2 lớp: Lớp peptidoglican cứng,

dính liền với màng tế bào. Lớp lipopolisacharide ở phía ngoài.

Một đặc điểm đặc trưng của vi khuẩn lam là sự hiện diện của không bào khí

(khí thể) trong tế bào, chúng có thể làm cho tế bào nổi. Một số chủng thuộc các chi

như Anabaena thường sẽ hình thành những tế bào đặc biệt khác với tế bào dinh

dưỡng gọi là dị bào, đây là nơi xảy ra quá trình cố định nitơ. Ngoài ra nhóm vi sinh

vật này còn có tế bào nghỉ.

14

Đồ Án Tốt Nghiệp

1.3.3. Phân loại vi khuẩn lam

Trước đây thường nhầm lẫn là Tảo lam (Cyanophyta). Thực ra đây là những

cơ thể nhân nguyên thuỷ, không liên quan gì đến tảo , ngoài khả năng quang hợp

hiếu khí (quang tự dưỡng vô cơ) và dùng H2O làm chất cho điện tử trong quá trình

quang hợp. Vi khuẩn lam chứa chlorophyll a và phycocyanin - phycobiliprotein.

Một số loài có sắc tố đỏ phycoerythrin. Chúng phối hợp với sắc tố lục tạo nên màu

nâu. Màng liên kết với phycobilisom. Đơn bào hoặc đa bào dạng sơi. Không di

động hoặc di động bằng cách trườn (gliding), một số loài có túi khí (gas vesicles).

Nhiều loại có dị tế bào (heterocysts) và có khả năng cố định nitơ. Vi khuẩn lam có

mặt ở khắp mọi nơi, trong đất, trên đá, trong suối nước nóng, trong nước ngọt và

nước mặn. Chúng có năng lực chống chịu cao hơn so với thực vật đối với các điều

kiện bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp. Một số loài có khả năng sống cộng sinh với

các cơ thể khác như Rêu, Dương xỉ, Tuế...Nhiều loài cộng sinh với nấm để tạo ra

Địa y (Lichen). Vi khuẩn lam có thể là sinh vật xuất hiện sớm nhất trên Trái Đất.

Vi khuẩn lam được chia thành 5 bộ theo đặc điểm hình thái: Chroococcales,

Oscillatorriales, Nostocales, Stigonematales và Pleurocapsales (theo NCBI; 2005):

1.3.3.1. Bộ Chroococcales

Hình que hoặc hình cầu đơn bào, không có dạng sợi hay dạng kết khối

(aggregate), phân đôi hoặc nẩy chồi, không có dị tế bào (heterocytes). Hầu hết

không di động. Tỷ lệ G+C là 31-71%. Các chi tiêu biểu là: Chamaesiphon,

Chroococcus, Gloeothece, Gleocapsa, Prochloron.

1.3.3.2. Bộ Oscillatorriales

Dạng sợi (filamentous), dạng lông (trichome) không phân nhánh chỉ có ở các

tế bào dinh dưỡng, phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn (fragmentation),

không có dị tế bào, thường di động. Tỷ lệ G+C là 34-67%. Các chi tiêu biểu là:

Lyngbya, Osscillatoria, Prochlorothrix, Spirulina, Pseudanabaena.

15

Đồ Án Tốt Nghiệp

1.3.3.3. Bộ Nostocales

Dạng sợi, dạng lông (trichome) không phân nhánh có thể chứa các tế bào biệt

hoá (specialized cell), phân đôi trên mặt phẳng, có kiểu đứt đoạn tạo thành đoạn

sinh sản (hormogonia), có tế bào dị hình, thường di động có thể sản sinh bào tử

màng dày (akinetes). Tỷ lệ G+C là 38-47%. Các chi tiêu biểu là : Anabaena,

Cylindrospermum, Aphanizomenon, Nostoc, Scytonema, Calothrix.

1.3.3.4. Bộ Stigonematales

Lông (trichome) dạng sợi, phân nhánh hoặc do các tế bào nhiều hơn một chuỗi

tạo thành, phân đôi theo nhiều mặt phẳng, hình thành đoạn sinh sản (hormogonia),

có tế bào dị hình, có thể sản sinh bào tử màng dày ( alkinetes), có hình thái phức tạp

và biệt hóa (differentiation). Tỷ lệ G+C là 42-44%. Các chi tiêu biểu là: Fischerella,

Stigonema, Geitlerinema.

1.3.3.5. Bộ Pleurocapsales

Hình que hoặc hình cầu đơn bào, có thể tạo dạng kết khối (aggregate), phân

cắt nhiều lần tạo ra các baeocytes, không có dị tế bào. Chỉ có các baeocytes là có di

động. Tỷ lệ G+C là 40-46%. Các chi tiêu biểu là: Pleurocapsa, Dermocapsa,

Chroococcidiopsis.

1.3.4. Hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam

Hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam xảy ra rất nhiều các thủy vực bị phú

dưỡng. Nguyên nhân là do sự gia tăng đột biến số lượng tế bào trôi nổi như

Microcystis, Anabaena, Oscillatoria... trên mặt nước. Hiện tượng nở hoa thường

xảy ra vào mùa hè ở vùng ôn đới khi nhiệt độ môi trường cao. Tuy nhiên ở vùng

nhiệt đới, sự nở hoa của nhóm vi sinh này có thể xảy ra quanh năm. Nguyên nhân

của hiện tượng nở hoa là sự gia tăng hàm lượng nitơ và photpho trong nước tạo điều

kiện thuận lợi cho chúng phát triển mạnh. Tuy nhiên do có khả năng nổi trên mặt

nước nên có lợi thế trong việc hấp thu lượng ánh sáng mạnh hơn, bên cạnh đó khả

năng cố định nitơ của một số loài khi hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường giảm

giúp cho chúng cạnh tranh tốt hơn so với các loài tảo khác. Hiện tưởng nở hoa gây

16

Đồ Án Tốt Nghiệp

ra rất nhiều vấn đề cho hệ sinh thái thủy vực như biến đổi màu của nước, gây mất

mỹ quan ao/hồ, làm ô nhiễm nguồn nước, gây mùi hôi, đặc biệt là gây độc các sinh

vật sống khác trong hệ thống thủy sinh.

Ở Việt Nam hiện tượng nở hoa của vi khuẩn lam cùng với sản sinh ra nhiều loại

độc tố trong đó có MCs thường có hàm lượng cao nhất đã được ghi nhận ở nhiều

thuỷ vực khác nhau như hồ Thành Công, hồ Núi Cốc, hồ Hoàn Kiếm, hồ Dầu

Tiếng, hồ Trị An.

Hình 1.1. Vi khuẩn lam nở hoa ở hồ Dầu Tiếng

(Nguồn: Phạm Thanh Lưu)

1.3.5. Độc tố microcystins

Microcystins (MCs) là độc tố vi khuẩn lam phát hiện ở hầu hết các thủy vực

nước ngọt và nước lợ khắp nơi trên thế giới. Đây là độc tố được nghiên cứu nhiều

nhất.

MCs là loại độc tố dạng vòng hepatotoxic peptides thuộc nhóm độc tố cylic

peptides (Hình 1.2). Có cấu tạo gồm 7 amino acid khác nhau, với 2 amino acid cuối

cùng của dãy peptide nối liền lại hình thành nên phức hợp vòng. Có trọng lượng

17

Đồ Án Tốt Nghiệp

phân tử dao động từ 500 – 4000 Da (Marian và ctv, 2007). Cấu trúc chung của MCs là Cyclo-(D-Alanine1-X2-D-MeAsp3-Z4-Adda5-D-glutamate6-Mdha 7 trong đó:

- X và Z là các L – axit amin khác nhau như Leucine (L), Ariginine (R),

Tyrosine (T), Alanine (A) hoặc Methionine (M).

- D-MeAsp3 là axit D-erythro-b-methylaspartic

- Mdha là N-methyldehydroalanine và Adda là axit (2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino-

9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic.

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 3 loại độc tố microcystins thường gặp.

(nguồn: Duy và cộng sự, 2000).

Có 3 dạng MCs phổ biến nhất, hiện diện hầu hết ở các chủng gây độc là MC-

LR, MC-YR và MC-RR, có trọng lượng phân tử từ 900 – 1100 Da.

Hợp chất này được phân lập lần đầu tiên từ loài tảo lam Microcystis aeruginosa,

sau đó được đặt tên là Microcystins. Còn nhiều loài tảo lam thuộc chi Microcystis

có khả năng sinh ra MCs như Microcystis viridis, Microcystis flos aquae,).

Tùy thuộc vào loại độc tố và nồng độ xâm nhiễm, các tác động đến sức khỏe

con người cũng như các triệu chứng lâm sàng biểu hiện khác nhau. Hậu quả tác

động tức thời từ ngứa, sưng tấy ngoài da, đến các triệu chứng chóng mặt, buồn nôn,

đau bụng, tiêu chảy, đau đầu, tê liệt, suy hô hấp, và nặng có thể tử vong. Những tác

động lâu dài đến sức khỏe con người như viêm nhiễm dạ dày, viêm gan, ung thư...

18

Đồ Án Tốt Nghiệp

Nhiều ca ngộ độc do độc tố lam đã được ghi nhận ở các quốc gia, trên thế giới cho

thấy sự nguy hiểm của loại độc tố này (Chorus và cộng sự, 1999).

Điển hình vào năm 1959 ở Cannada, 13 người ở vùng Saskatchewan bị ngộ độc

với các triệu chứng như co rút dạ dày, nôn mửa, tiêu chảy, sốt, đau đầu; ở Mỹ năm

1975, xấp xĩ 62% số người sử dụng nguồn nước cấp nhiễm độc tố tảo lam từ sông

Ohio có triệu chứng đau bụng và tiêu chảy, năm 1998 ở Brazil, 2000 trường hợp ở

bang Bahia bị viêm nhiễm dạ dày, 88 trường hợp tử vong do sử dụng nguồn nước

từ đập Itaparita, mặc dù đã qua đun sôi. Kết quả điều tra cho thấy nguyên nhân là do

sử dụng nguồn nước có chứa tảo Microcystis và Anabaena ở mật độ cao tương

đương tế bào . Năm 1996 cũng tại nước này ở khu vực Caruaru, hơn 100

trường hợp bị viêm gan cấp, 52 trường hợp tử vong sau khi sử dụng nguồn nước cấp

tính, các triệu chứng lâm sàng như hoa mắt, chóng mặt, đau đầu, đau bụng, nôn

mửa, tê liệt... Microcystins và Cylindropermopsis được tìm thấy trong nguồn nước

cấp, trong máu và trong các tế bào gan của các bệnh nhân (Chorus và cộng sự,

1999).

Hậu quả tác động lâu dài của MCs cũng đã được ghi nhận trong các công trình

nghiên cứu dịch tễ tại Trung Quốc, nơi người ta phát hiện tỷ lệ ung thư gan sơ cấp ở

những người sử dụng nước uống từ nguồn nước bề mặt bị nhiễm Microcystins cao

hơn nhiều so với những người sử dụng nguồn nước từ giếng khoan (Chorus và cộng

sự, 1999).

Cơ chế gây độc của độc tố MCs là làm ức chế enzyme protein phosphatase 1A

và 2A trong tế bào động thực vật, đặc biệt là tế bào gan. Độc tố MCs thường phá vỡ

cấu trúc tế bào gan, mất cấu trúc thể xoang, tăng trọng lượng gan do xuất huyết và

gây sốc sự vận chuyển máu, rối loạn nhịp tim dẫn đến chết ở động vật (Dương Đức

Tiến, Trịnh Tam Kiệt (Trung Tâm CNSH Việt Nam, Đại Học Quốc Gia Hà Nội)).

Theo số liệu thống kê ở Tp Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận như Bình Dương

và Tây Ninh có đến 70% dân số xấp xĩ 6-7 triệu người sử dụng nước cấp sinh hoạt

từ hồ Dầu Tiếng và sông Sài Gòn. Một số nghiên cứu gần đây đã ghi nhận tảo lam

19

Đồ Án Tốt Nghiệp

nở hoa với tần suất ngày càng cao trong nguồn nước ở một số thủy vực quanh

Thành Phố Hồ Chí Minh (Dao và cộng sự, 2010; Dương Đức Tiến, 1996). Tuy

nhiên, trong tiêu chuẩn an toàn cấp nước ở nước ta chưa có tiêu chuẩn quy định về

nồng độ của độc tố tảo, việc quan trắc độc tố tảo lam cũng chưa được quan tâm.

Trong khi đó tình hình về bệnh có nghi can nhiều đến độc tố tảo như các bệnh về

gan, thần kinh, tiêu hóa, ung thư, và nhiều dấu hiệu bệnh khác nhưng nguyên nhân

từ độc tố tảo thường không được nhắc đến.

1.3.6. Hai hợp chất gây mùi hôi geosmin và 2-methylisoborneol

Geosmin còn gọi là 1,2,7,7-tetramethyl-2-norborneol là một alcohols bậc ba. Công thức phân tử C12H22O. Khối lượng phân tử là 182,3 g.mol-1. Hợp chất 2-

methylisoborneol là dẫn xuất của hợp chất hóa học isoborneol. Công thức phân tử C11H20O. Khối lượng phân tử là 168,28 g.mol-1 là hợp chất hữu cơ phổ biến dễ bay hơi gây mùi hôi, mùi bùn trong thủy vực. Cả geosmin và 2-MIB đều là hợp chất

terpenoid và tổng hợp bởi enzyme terpene. Có thể được phát hiện bởi những người nhạy cảm ở nồng độ rất thấp (<10 ng.L-1). Geosminvà 2-MIB phát tán vào môi

trường thông qua sự phân hủy sinh học của một số loại vi khuẩn lam nở hoa chủ

yếu là dạng sợi và một số loài xạ khuẩn. Tuy nhiên có một số loài khi tế bào khỏe

mạnh vẫn phát tán được geosmin và 2-MIB vào môi trường nước. Geosmin và 2-

MIB không gây nguy hại nhiều tới sức khỏe công cộng nhưng sự hiện diện của

chúng trong nước có thể gây ra mối lo ngại nghiêm trọng đối với chất lượng và cảm

quan của nguồn nước do chúng rất khó bị loại bỏ trong quá trình xử lý nước.

2-methylisoborneol Geosmin

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Geosmin và 2-methylisoborneol MIB.

(Nguồn: Friedrich và susan, 2007).

20

Đồ Án Tốt Nghiệp

1.3.7. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn lam và độc tố của vi khuẩn lam

1.3.7.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam và độc tố vi khuẩn lam trên thế giới

Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam và độc tố của chúng đang được quan tâm

hàng đầu. Sivonen và cộng sự (1988) đã đưa ra nghiên cứu về độc tố của chủng vi

sinh vật này trong nước ngọt và ven biển ở Phần Lan. Độc tính của các mẫu nở hoa

được kiểm tra cấp tính trên chuột và cho thấy 83/188 mẫu (44%) có những dấu hiệu

đặc trưng của độc thần kinh hoặc độc gan. Tiến hành phân lập các chủng này cho

thấy Anabaena là chi được tìm thấy thường xuyên nhất trong cả mẫu nở hoa có độc

hoặc không có độc. Đặc biệt là Anabaena có mặt hầu hết các mẫu gây độc thần

kinh và độc gan. Ngoài ra các chi Microcystis và Oscillation cũng xuất hiện ở các

mẫu gây độc cho gan. Nghiên cứu này khẳng định nhóm vi sinh này gây độc là rất

phổ biến ở các hồ nước ngọt và ven biển ở Phần Lan gây ảnh hưởng tới sinh vật và

cả con người.

Các nghiên cứu độc tính của vi khuẩn lam ở giai đoạn đầu thường chỉ sử dụng

các phương pháp thử nghiệm sinh học. Tuy nhiên không phải tất cả các chủng đều

gây độc, trong cùng một loài cũng có những chủng sinh độc tố và có những chủng

không sinh độc tố mà không thể phân biệt được bằng phương pháp hình thái học vì

thế những nghiên cứu sau này thường tập trung phân tích theo hướng sinh học phân

tử do khả năng dự đoán nhanh và chính xác hơn.

Davis và cộng sự (2009) đã đưa ra báo cáo kiểm tra sự ảnh hưởng của nhiệt

độ và dinh dưỡng đối với tốc độ tăng trưởng và xác định khả năng gây độc của các

chủng Microcystis bằng định lượng đoạn gene mcyD và 16S rDNA từ 4 hồ thuộc

vùng Đông Bắc Mỹ trong 2 năm. Nghiên cứu cho thấy Microcystis độc hại chiếm

trong khoảng từ 12% đến 100% so với tổng số loài tại hồ RonkonKoma, New York

và từ 0,01% đến 6% ở ba hồ còn lại. Và khi nhiệt độ, nồng độ nitơ và photpho tăng

thì các chủng gây độc cũng tăng trưởng cao chiếm 83%. Điều này cho thấy hiện

tượng ấm lên và phú dưỡng trong tương lai cũng góp phần tăng các chủng

Microcystis gây độc.

21

Đồ Án Tốt Nghiệp

Ngoài nghiên cứu về độc tố của vi khuẩn lam còn có các nghiên cứu về các

hợp chất gây mùi hôi là geosmin và 2-MIB. Chúng là nguyên nhân chính gây ra mùi

hôi trong nước. Tuy nhiên, các nghiên cứu về hai hợp chất này của chưa có nhiều.

Năm 2014, Suvi Suurnakki và cộng sự đã nghiên cứu xác định sự hiện diện của 2

hợp chất gây mùi hôi geosmin và 2-MIB trong 100 chủng vi khuẩn lam bằng

phương pháp sắc ký khối phổ vi chiết pha rắn (SPME-GCMS). Kết quả cho thấy có

21/100 chủng nghiên cứu thuộc 6 chi có khả năng sản xuất geosmin và 2 trong số

đó cũng sản xuất 2-MIB. Tiếp theo, nghiên cứu sử dụng các phản ứng PCR để phát

hiện đoạn gen geoA và mib tham gia quá trình tổng hợp geosmin và 2-MIB. Nghiên

cứu cho thấy 2 đoạn gen geoA và mib đã được phát hiện trong tất cả các chủng

tương ứng với kết quả của phương pháp sắc ký khối phổ vi chiết pha rắn.

1.3.7.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam và độc tố vi khuẩn lam ở Việt Nam

Những nghiên cứu về vi khuẩn lam trước đây ở Việt Nam chỉ dừng lại ở việc

xác định loài bằng hình thái học và chưa có nhiều các nghiên cứu về khả năng sinh

độc tố đặc biệt là bằng phương pháp sinh học phân tử.

Từ 1998 – 2003 các nghiên cứu chỉ tập trung khảo sát, phân loại thành phần và

kiểm tra số lượng loài vi khuẩn lam tại các ao, hồ (Đặng Đình Kim và Dương Thị

Thủy, 2014). Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về độc tính của nhóm vi

sinh này lên động thực vật thuỷ sinh bắt đầu được quan tâm nghiên cứu. Điển hình

như nghiên cứu của Đào Thanh Sơn và cộng sự (2013) tiến hành nghiên cứu ảnh

hưởng của độc tố vi khuẩn lam MCs từ mẫu nước mặt và mẫu vi khuẩn lam tạo

váng tại hồ Dầu Tiếng lên sự phát triển của cải bông xanh ở giai đoạn nảy mầm đây

là một trong những nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về độc tố của nhóm vi sinh này

trên thực vật. Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cho thấy nồng độ

độc tố MCs trong mẫu nước mặt tại hai lần lấy mẫu lần lượt là 20 và 1000 µg/L và

mẫu tạo váng là 250 µg/g trọng lượng khô sinh khối vi khuẩn lam. Kết quả cho thấy

độc tố MCs ức chế sự phát triển của rễ, chiều dài thân và trọng lượng của cải bông

xanh.

22

Đồ Án Tốt Nghiệp

Bên cạnh nghiên cứu độc tố của vi khuẩn lam lên thực vật. Độc tính lên động

vật đặc biệt là vi giáp xác và cá sọc ngựa cũng đã được báo cáo (Đào Thanh Sơn và

cộng sự, 2013). Kết quả phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đã

cho thấy mẫu tạo váng và chủng M. aeruginosa chứa độc tố MCs lần lượt là 250 và

3700 µg/g trọng lượng khô sinh khối. Đây là một hàm lượng vượt rất cao so với tiêu

chuẩn thế giới (1µg/L) và chứa đựng mối nguy hại tiềm ẩn. Vi khuẩn lam từ mẫu

tạo váng và loài Microcystis aeruginosa phân lập từ hồ Dầu Tiếng gây độc mạnh

lên cá sọc ngựa. Điển hình là với hàm lượng độc tố 200 µg/L làm suy giảm tỉ lệ nở

của phôi cá sọc ngựa.

Bên cạnh các nghiên cứu thành phần khảo sát độc tính của vi khuẩn lam tại

một số thủy vực dựa vào phương pháp thử nghiệm sinh học. Các nghiên cứu theo

hướng đánh giá đa dạng di truyền của các chủng gây độc cũng như khả năng phát

hiện sớm các chủng gây độc dựa bằng sinh học phân tử đã bước đầu tiến hành.

Trong đó sử dụng phương pháp PCR đã cho thấy khả năng phát hiện các chủng gây

độc nhanh chóng và chính xác hơn hẳn các phương pháp khác thông qua việc phát

hiện các gene mã hóa cho sinh tổng hợp độc tố.

Điển hình là nghiên cứu Phạm Thanh Lưu và cộng sự (2015) đã phân lập và

đưa ra đặc điểm của vi khuẩn lam sản xuất độc tố gan MCs tại hồ Dầu Tiếng.

Nghiên cứu đã phân lập được 68 loài thuộc 5 chi: Microcystis, Dolichospermum,

Arthrospira, Pseudarabaena, Cylindrospermopsis trong đó đây là lần đầu tiên mô tả

hình thái loài Dolichospermum nygaardii trong nước ở Việt Nam. Đồng thời nghiên

cứu cũng xác định khả năng sinh độc tố MCs ở các chủng này bằng phương pháp

PCR sử dụng 3 gene quy định khả năng sinh độc tố MCs là mcyA, mcyB, mcyD.

Hàm lượng độc tố được đo đạt bằng phương pháp HPLC. Kết quả phân tích PCR

cho thấy trong 59 chủng thuộc Microcystis có 25 chủng dương tính với cả 3 gene

mcyA, mcyB và mcyD; 12 chủng dương tính với mcyA, mcyB nhưng âm tính với

mcyD và 22 chủng âm tính với cả 3 gene. Các chủng thuộc 4 chi còn lại được báo

cáo âm tính với cả 3 gene. Và hàm lượng MCs trong 25 chủng nuôi cấy chứa hàm

lượng MCs từ 39-2129 μg/g sinh khối khô.

23

Đồ Án Tốt Nghiệp

Năm 2016, Đào Thanh Sơn và cộng sự đã đưa ra những ghi nhận đầu tiên về

về độc tố của vi khuẩn lam Planktothrix rubescens ở Việt Nam. Nghiên cứu cung

cấp những mô tả hình thái đầu tiên cho loài P. rubescens ở Việt Nam. Bằng phương

pháp ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay) đã cho thấy rằng cả 5

chủng (S1-S5) thuộc loài P. rubescens phân lập được đều có khả năng sản sinh MCs

với nồng độ từ 0,06-0,42 μg/g sinh khối khô. Đồng thời dịch chiết của chủng S1

cũng bước đầu thử nghiệm phơi nhiễm mãn tính trên vi giáp xác D. aphnia magna

cho thấy có sự suy giảm số lượng sinh vật ở nồng độ 0,028 μg/L.

24

Đồ Án Tốt Nghiệp

2 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ 13/03/2017 – 14/07/2017 tại phòng thí nghiệm vi sinh

thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh.

2.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất

2.2.1. Dụng cụ và thiết bị

Các dụng cụ được sử dụng: micropipette, đầu tuýp, cân phân tích, ống đong,

eppendorf, cột QIA…

Các thiết bị được sử dụng: Tủ lạnh, nồi hấp khử trùng, máy PCR sprint thermo

Cycler , hộp đèn soi UV Uvitec, máy vortex, lò vi sóng, máy li tâm lạnh MIKRO

220R, nguồn EC105 và Bể điện di QS-710…

2.2.2. Nguồn mẫu

Mẫu vi khuẩn lam được thu tại hồ Dầu Tiếng nằm chủ yếu trên địa phận huyện

Dương Minh Châu và một phần nhỏ trên địa phận huyện Tân Châu thuộc tỉnh Tây

Ninh. Hồ Dầu Tiếng nằm ở vị trí 11°27'31" vĩ độ Bắc, 106°19'48" kinh độ Đông.

2.2.3. Hóa chất

2.2.3.1. Hóa chất dùng trong nuôi tăng sinh khối (môi trường WC)

NaNO3 1 mM Vitamin B1 1 mL/L

CaCl2.2H2O 0,25 mM Vitamin B6 1 mL/L

MgSO4.7H2O 0,15 mM Vitamin B12 1 mL/L

NaHCO3 0,15 mM Dung dịch khoáng 1 mL/L

Na2SiO3.9H2O 0,1 mM

K2HPO4 0,05 mM

H3BO3 0,39 mM

25

Đồ Án Tốt Nghiệp

2.2.3.2. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA

Đệm CTAB (0,2 M Tris-Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,05M EDTA, 2 % CTAB).

Phenol:chloroform:isoamylalcohol tỷ lệ (25:24:1) hoặc Chloroform isoamyl

alchol tỷ lệ (24:1).

Isopropanol.

Etanol 70 %, etanol 100 %.

Nước khử ion.

2.2.3.3. Hóa chất dùng trong điện di

6X LB Loading dye.

TAE 1X.

Agarose.

Ethidium bromide.

Thang DNA 1kb.

2.2.3.4. Hóa chất dùng trong PCR

Nước khử ion.

Master Mix (2x My taq Mix).

Mồi xuôi CYA371F: CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCC

Mồi ngược 373R: CTAACCACCTGAGCTAAT

Mồi xuôi CYA-F: ACGGGTGAGTAACGCGTRA

Mồi ngược CYA-R: CTTCAYGYAGGCGAGTTGCAGC

2.2.3.5. Hóa chất dùng trong tinh sạch mẫu DNA

Nước khử ion.

Buffer PB.

Buffer PE.

26

Đồ Án Tốt Nghiệp

2.3. Phƣơng pháp thu mẫu

Mẫu vi khuẩn lam được thu bằng lưới vớt thực vật phiêu sinh hình nón với

kích thước mắt lưới 25 µm, đường kính miệng lưới 40 cm. Thu mẫu bằng cách

quăng và kéo lưới trong vòng bán kính 5-7 m. Mẫu được cố định ngay tại hiện

trường bằng dung dịch formaline, nồng độ formaline cuối cùng trong mẫu vào

khoảng 4% (Pham và cộng sự, 2015).

Mẫu tảo lam nở hoa được lọc qua giấy lọc sợi thủy tinh GF/C, sấy khô qua

đêm ở 45°C và lưu trữ ở điều kiện phòng thí nghiệm cho đến khi phân tích (Pham

và cộng sự, 2015).

Các mẫu thu được ghi các kí hiệu gồm ngày, giờ thu mẫu, kí hiệu mẫu.

2.3.1. Phương pháp phân lập

Vi khuẩn lam được phân lập bằng phương pháp hút rửa trực tiếp (pipetting and

washing). Theo đó một tập đoàn vi khuẩn lam được hút/bắt bằng micropipette.

Từng sợi riêng lẻ hoặc tập đoàn được hút/bắt, rửa một vài lần qua môi trường đã

khử trùng và chuyển vào nuôi trong môi trường WC. Mẫu được nuôi trong điều

kiện sáng : tối là 12:12h, nhiệt độ khoảng 25°C. Lắc nhẹ ống nghiệm mỗi ngày một

lần. Sau thời gian từ 2 tới 4 tuần thì kiểm tra xem ống nghiệm nào có dấu hiệu tăng

sinh của nhóm vi sinh này thì tiến hành kiểm tra quan sát và phân loại trên kính hiển

vi. Sau đó tiến hành nuôi tăng sinh.

2.3.2. Phương pháp nuôi tăng sinh khối và thu sinh khối vi khuẩn lam

Nuôi tăng sinh khối

Mẫu vi khuẩn lam sau khi phân lập trong ống nghiệm được cấy chuyền và

nuôi tăng sinh khối trong các bình tam giác thể tích 0,5 – 1 L có chứa môi trường

nuôi WC. Mẫu được nuôi trong cùng điều kiện phòng thí nghiệm đã mô tả ở trên.

Thu sinh khối

Sinh khối được thu bằng giấy lọc sợi thủy tinh GF/C từ 100 mL dịch nuôi cấy

(hình 2.1) và lưu trữ eppendorf ở nhiệt độ -20°C (Kurmayer và cộng sự, 2003).

27

Đồ Án Tốt Nghiệp

Hình 2.1. Sinh khối vi khuẩn lam

2.3.3. Định danh chủng vi khuẩn lam bằng sinh học phân tử

Các chủng vi khuẩn lam phân lập được quan sát trên kính hiển vi quang học

Olympus CK40-F200 ở độ phóng đại ×100-400. Định loại vi sinh vật này dựa trên

cơ sở hình thái học theo hệ thống phân loại của các tác giả trong và ngoài nước như

Dương Đức Tiến (1996), Komárek và Anagnostidis (1999; 2005), Cronberg (2006).

Quá trình định danh bao gồm các bước tách chiết DNA, khuếch đại đoạn DNA

bằng phản ứng PCR, điện di kiểm tra sản phẩm PCR, giải trình tự gene và so sánh

đoạn trình tự này với trình tự gene trên ngân hàng NCBI.

2.3.3.1. Phương pháp ly trích DNA bằng CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)

Phương pháp ly trích DNA của vi khuẩn lam được thực hiện theo các bước

như sau:

Cắt nhỏ mẫu giấy lọc cho vào eppendorf.

Hút thêm vào 800 - 900 đệm CTAB

Vortex 30 giây, sau đó shot sprins.

28

Đồ Án Tốt Nghiệp

Ủ -800C trong 30-60 phút.

Sau khi ủ đem đi đun sôi 15 phút.

Votex, ly tâm 14.000 rpm/5 phút/4oC.

Sau khi ly tâm thu dịch nổi. Hút 500 μL dịch nổi cho vào eppendorf mới.

Thêm phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) tương đương với thể tích

phần dịch lấy ra (500µl).

Tiếp tục đem vortex, ly tâm 14.000 rpm/5 phút/4oC.

Thu dịch nổi và cho vào eppendorf mới.

Thêm 500 μL isopropanol lạnh (tỷ lệ thể tích 1:1) để kết tủa DNA.

Vortex nhẹ, ly tâm 14.000 rpm/5 phút/4oC.

Thu tủa.

Rửa tủa DNA bằng ethanol 70% rồi ly tâm 14.000 rpm/4°C/1 phút.

Loại bỏ dịch nổi.

Tiếp tục rửa tủa với ethanol 100% rồi ly tâm 14.000 rpm/4°C/1 phút.

Hút bỏ ethanol thật sạch.

Để khô tự nhiên, thu tủa.

Thêm vào 30 μL và bảo quản -20°C.

Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1.5%.

2.3.3.2. Phương pháp điện di kiểm tra DNA trên gel agarose

Điện di ở bước này nhằm mục đích xem sản phẩm ly trích DNA có bị gãy hay

không và tiến hành điện di sản phẩm ly trích trên gel agarose 1,5%.

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5%, cân 1,5g agarose vào 100ml TAE1X, lắc

nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong microwave ở 650W trong 2 phút. Để chai nguội khoảng 50 - 600C, đổ nhẹ dung dịch vào khay điện di, khoảng 45 phút

thì gel đông lại, gel có màu trắng đục.

29

CM CDN

1

CSG

Đồ Án Tốt Nghiệp

Bước 2: Tiến hành điện di. Trộn dung dịch gồm 5µl DNA sau ly trích và 3µl

loading dye 6X. Bơm dung dịch này vào giếng trên gel. Khởi động nguồn điện,

chỉnh 90 voltage, chạy điện di khoảng 30 - 40 phút.

Bước 3: Nhuộm gel. Bảng gel được chuyển vào khay chứa thuốc nhuộm

ethidium bromide trong khoảng 10 - 15 phút, sau đó rửa lại bằng nước.

Bước 4: Quan sát kết quả chạy điện di dưới hộp đèn UV 312nm.

Nếu sản phẩm ly trích có DNA thì trên gel điện di sẽ có band DNA phát sáng

dưới dạng vạch. Mức độ tập trung và độ đậm nhạt của bảng điện di phản ánh độ tinh

sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA.

2.3.3.3. Phản ứng PCR

Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một

mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gene

(gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm. Mồi là những đoạn DNA ngắn

có khả năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của

DNA polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới.

Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase.

Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một

trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA

polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn

các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và

điện di trên gel agarose.

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp đi lặp lại nhiều lần, thông thường kéo dài

20 - 35 chu kì. Một chu kỳ gồm có 3 giai đoạn được mô tả ở hình 2.2 bao gồm:

Giai đoạn 1 (biến tính DNA): Đầu tiên, phản ứng PCR thường được gia nhiệt đến nhiệt độ 94 - 96oC, nhiệt độ này được giữ 1 - 9 phút nhằm đảm bảo tất cả DNA

mục tiêu và mồi bị biến tính , DNA được làm tách mạch bởi sự phá vỡ liên kết

hydrogen giữa các base bổ sung của chuỗi DNA, tạo thành các chuỗi DNA mạch

30

Đồ Án Tốt Nghiệp

đơn. Sau đó, chu trình bắt đầu với một bước có nhiệt độ 94 - 980C khoảng 20 - 30

giây.

Giai đoạn 2 (bắt cặp): Nhiệt độ phản ứng được làm thấp để mồi có thể bắt cặp

với mạch khuôn DNA đơn. Liên kết hydrogen giữa mạch khuôn và mồi bắt đầu

được hình thành. Liên kết này chỉ được bền vững khi mồi bắt cặp chính xác với

mạch khuôn và đoạn ngắn DNA mạch đôi này là nơi DNA polymerase gắn vào và

bắt đầu tổng hợp DNA. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi và thông thường khoảng 50-65oC trong thời gian 30 - 60 giây.

Giai đoạn 3 (kéo dài): DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung đối

với DNA mạch khuôn. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ hoạt động tối

ưu của DNA polymerase. Taq DNA polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu 70 - 74oC, trong hầu hết trường hợp nhiệt độ thường được dùng là 72oC. Nối hydrogen

giữa đoạn mồi và DNA khuôn phải đủ bền để chịu đựng được nhiệt độ cao. Mồi đã

lai với vùng DNA có nhiều base sai sẽ bị tách ra từ khuôn mẫu và không được kéo

dài. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase được sử dụng và chiều dài

đoạn DNA mục tiêu cần được khuếch đại. Bước kéo dài cuối cùng kéo dài khoảng 5

- 15 phút (phụ thuộc vào chiều dài mỗi đoạn DNA mẫu), chu kì cuối cùng này được

dùng để chắc chắn phần còn lại của chuỗi DNA có thể được kéo dài hoàn toàn.

Hình 2.2. Quy trình phản ứng PCR.

31

Đồ Án Tốt Nghiệp

Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

 Cặp mồi CYA371F và 373R

Thành phần: Tổng 25 μL gồm: 12.5 μL Master mix, 1 μL primer F, 1 μL

primer R, 1-2 μL DNA mẫu, 8,5 - 9,5 μL H2O.

Chu trình nhiệt được thiết lập theo phương pháp của Savichtcheva (2011) như

mô tả ở bảng 2.1

Bảng 2.1. Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA371F và 373R

Chu kỳ lặp lại Nhiệt độ Thời gian

1 5 phút 94°C

1 phút 94°C

1 phút 60°C 30

1 phút 72°C

1 7 phút 72°C

 Cặp mồi CYA-F và CYA-R

Thành phần: Tổng 25 μL gồm: 12.5 μL Master mix, 1 μL primer F, 1 μL

primer R, 1-2 μL DNA mẫu, 8.5-9.5 μL H2O.

Chu trình nhiệt được thiết lập theo phương pháp của Pham và cộng sự (2015) như

mô tả ở bảng 2.2

32

Đồ Án Tốt Nghiệp

Bảng 2.2. Chu trình nhiệt của cặp mồi CYA-F và CYA-R

Chu kỳ lặp lại Nhiệt độ Thời gian

1 95°C 10 phút

94°C 30 giây

30 60°C 1 phút

72°C 1 phút

1 72°C 7 phút

2.3.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR

Trước khi giải trình tự đoạn gen đã được khuếch đại, ta phải tinh sạch mẫu nhằm

loại bỏ các tạp chất còn lại trong lúc thực hiện phản ứng PCR và các bước thực hiện

như sau:

Bước 1: Lấy eppendorf có chứa DNA mẫu (mẫu đã PCR và điện di) cho buffer PB

vào (tỷ lệ 1:5).

Bước 2: Sau đó vortex, short spring. Nếu có màu cam hoặc tím ta cho vào 10 μL

3M sodium acetate pH 5.0 để chuyển sang màu vàng nhạt, còn nếu có màu vàng

nhạt thì không cần thêm.

Bước 3: Cho dung dịch ở bước 1 vào cột QIA, sau đó ly tâm lạnh 13000 vòng/1

phút, hút bỏ dịch dưới đáy giữ lại cột.

Bước 4: Thêm 700-750 μL buffer PE vào cột QIA.

Bước 5: Ly tâm lạnh 13000 vòng/1 phút, bỏ dịch thu cột.

Bước 6: Tiếp tục ly tâm lạnh 13000 vòng/1 phút, sau đó bỏ dịch giữ lại cột.

Bước 7: Lấy cột cho vào eppendorf mới, cho vào 30 μL O vào cột QIA.

33

Đồ Án Tốt Nghiệp

Bước 8: Để khoảng 10 phút.

Bước 9: Đem đi ly tâm lạnh 13000 vòng/1 phút, thu được DNA tinh sạch.

2.3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự vùng gene 16S DNA

Mẫu sau khi tinh sạch, điện di trên gel agarose xem kết quả thì được gửi mẫu qua

công ty Nam Khoa, địa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, Quận 7 –

Thành Phố Hồ Chí Minh để giải trình tự.

Sau khi giải trình tự thì kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm

chuyên dụng như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0 và

Ngân hàng gene https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ để định danh loài và xây dựng cây

phát sinh loài.

34

Đồ Án Tốt Nghiệp

3 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả ly trích và thu nhận DNA bộ gene của hình thái vi khuẩn lam

Chủng vi khuẩn lam sau khi phân lập được quan sát trên kính hiển vi quang

học. Phân loại vi sinh vật này dựa trên cơ sở hình thái học theo hệ thống phân loại

của Dương Đức Tiến (1996), Komárek và Anagnostidis (1999; 2005), Cronberg

(2006) và từ khoảng 30 mẫu đã qua sơ bộ xác định hình thái học, trong nghiên cứu

này chọn ra 4 loài đại diện cho loài sau: 2: Microsystis, 10: Anabaena, 29:

Cylindropermopsis, 31: Plantothrix.

Sau khi phân loại, tiến hành tách chiết và thu nhận DNA của 4 chủng. Kết quả

thu nhận được thể hiện trong hình 3.1.

2 10 29 31

Hình 3.1. Kết quả thu nhận DNA bộ gene của vi khuẩn lam gồm 4 chủng trên gel

agarose 1,5%. (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và 31:

Plantothrix).

Dựa vào hình 3.1, cho thấy kết quả tách chiết và thu nhận DNA của 4 chủng

Cylindropermopsis, Plantothrix, Microsystis và Anabaena khá tốt. Kết quả ly trích

trên có thể dùng cho phản ứng nhân bản vùng gene định loại loài.

35

Đồ Án Tốt Nghiệp

3.2. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau khi ly trích và thu nhận

Mẫu số 2, 10, 29 và 31 được pha loãng và đo nồng độ DNA, kết quả được thể

hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ DNA bộ gene sau thu nhận

Mẫu

2 1,429 0,724 1,974

10 1,358 0,729 1,863

29 1,017 0,508 2,002

31 2,003 1,188 1,686

Tỷ lệ đo nằm trong khoảng 1,7-2,0 là có độ tinh khiết tốt nhất.

Kết quả đo nồng độ DNA:

= 1,429 x 50 x 10 = 714,5 ng/ml

= 1,358 x 50 x 10 = 679,0 ng/ml

= 1,017 x 50 x 10 = 508,5 ng/ml

= 2,003 x 50 x 10 = 1001,5 ng/ml

Qua kết quả từ bảng 3.1 cho thấy nồng độ DNA trong mẫu 2, 10, 29, 31 thu

được là cao. Tỷ lệ 260nm/280nm của mẫu 2 và 10 lần lượt là 1,974 và 1,863 nằm

trong khoảng 1,7-2,0 chứng tỏ lượng DNA thu được có độ tinh sạch tốt. Mẫu 29 và

31 có tỷ lệ là 2,002 và 1,686 chênh lệch không quá cao so với khoảng 1,7-2,0 chứng

tỏ lượng DNA thu được khá sạch.

36

Đồ Án Tốt Nghiệp

3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gene 16S DNA bằng kỹ thuật PCR

3.3.1. PCR với cặp mồi CYA371F, 373R

10 29 T 2 31

Hình 3.2. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi

CYA371F, 373R (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và

31: Plantothrix ).

Dựa vào hình 3.2 sau khi khuếch đại đoạn gene 16S DNA của 4 mẫu (2, 10, 29

và 31) bằng phương pháp PCR với cặp mồi CYA371F, 373R. Kết quả điện di sản

phẩm PCR cho thấy 2 mẫu số 2 và 31 cho kết quả dương tính, mẫu số 10 và 29 cho

kết quả âm tính, điều này cho thấy cặp mồi CYA371F, 373R là cặp mồi có độ nhạy

cao hơn khi sử dụng nhân bản đoạn gene cho 2 chủng Microsystis và Plantothrix,

kết quả này phù hợp với công bố kết quả nghiên cứu của Savichtcheva và cộng sự

với kích thước khoảng 1500 bp (Savichtcheva và công sự, 2011). Từ kết quả khuếch

đại đoạn gene 16S DNA chứng tỏ rằng đoạn mồi CYA371F, 373R thích hợp để

khuếch đại đoạn gene đối với chủng Microsystis và Plantothrix.

37

Đồ Án Tốt Nghiệp

3.3.2. PCR với cặp mồi CYA-F, CYA-R

T 10 29 2 31

Hình 3.3. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR với cặp mồi

CYA-F, CYA-R (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và

31: Plantothrix ).

Theo hình 3.3 trong nghiên cứu này cho thấy rằng sau khi khếch đại đoạn gene

16S DNA của 4 mẫu (2, 10, 29, 31) bằng phương pháp PCR với cặp mồi CYA-F,

CYA-R. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy cả 4 mẫu đều dương tính, điều này

cho thấy cặp mồi CYA-F, CYA-R là cặp mồi được sử dụng để khuếch đại một đoạn

1200 bp của đoạn gene 16S DNA phổ biến cho hầu hết các chủng vi khuẩn lam theo

công bố kết quả nghiên cứu (Urbach và cộng sự, 1992; Hotto và cộng sự, 2005;

Pham và cộng sự, 2015). Từ kết quả khuếch đại đoạn gene 16S DNA chứng tỏ rằng

đoạn mồi CYA-F, CYA-R thích hợp để khuếch đại đoạn gene đối với hầu hết các

chủng vi khuẩn lam, nhưng so về độ nhạy thì chủng Microsystis, Anabaena,

Cylindropermopsis nhạy hơn so với chủng Plantothrix.

38

Đồ Án Tốt Nghiệp

2

3.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn lam

10 29 31

1500

1000

Hình 3.4. Kết quả điện di trên gel agarose của các chủng vi khuẩn lam sau khi tinh

sạch (2: Microsystis, 10: Anabaena, 29: Cylindropermopsis và 31: Plantothrix ).

Theo hình 3.4 cho thấy kết quả tinh sạch DNA của các chủng vi khuẩn lam khá

tốt. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với công bố kết quả nghiên cứu của (Urbach và

ctv, 1992; Hotto và ctv, 2005; Pham và ctv, 2015) và (Savichtcheva và ctv, 2011).

3.5. Kết quả giải trình tự vùng gene 16S DNA của các chủng vi khuẩn lam

TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCA

GGTTGCTTAACGACCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAG

CAGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGA

AAGCGTGCTACTGGGCTGTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGG

ATTAGATACCCCTGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGA

CCCGAGCCGTGCCGAAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAG

TGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAAT

TCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGC

TAGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC

3.5.1. Mẫu 2 (chủng Microsystis)

39

Đồ Án Tốt Nghiệp

GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATT

AAGTTGGGGACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG

TCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAA

GGGCAGCGAACTCGCGAG

GGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCG

CGTGAGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAAAAAAATG

ACGGTACCTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGG

AGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCCGCAGGTGGCATTGAA

AGTCTGCTGTTAAAGAGTTTGGCTCAACCAAATAAAAGCAGTGGAAACTACAAAGCT

AGAGTTTGGTCGGGGCAGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCA

GGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGCTCTGCTAGGCCGAGACTGACACTGAGGGACG

AAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATG

GATACTAGGCGTAGCTCGTATCGACCCGAGCTGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGTAT

CCCGCCTGGGGAGTACGCAGGCAACTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG

CACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGC

TTGACATGTCACGAATTCTGTGGAAACATAGGAGTGCCTTAGGGAGCGTGAACACAG

GTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG

AGCGCAACCCTCGTTTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGCACTCTAGAGAGACTGC

CGGGTGACAAACCGGAGGAAGGGTGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCCTTT

ACGTCTTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGACAAAGGGCAGCTACACAGCTG

AAG

3.5.2. Mẫu 10 (chủng Anabaena)

AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGC

TCTTGGGTCGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGAAAGTGACGGTACTTGAGGAAT

AAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTAT

CCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCTGCAGGTGGAACTGAAAGTCTGCTGTTAAAGA

GTTTGGCTTAACCAAATAAAAGCGGTGGAAACTACAGAACTAGAGTGTGGTAGGGGC

AAAAGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCGGTG

GCGAAAGCGTTTTGCTAGACCATAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCG

AATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCT

TGTATCGACCCGAGCCGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTAC

GCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTA

TGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATCCTGCGAAT

CCTGGTGAAAGCTGGGAGTGCCTTAGGGAGCGCAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTC

GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTTT

3.5.3. Mẫu 29 (chủng Cylindropermopsis)

40

Đồ Án Tốt Nghiệp

TTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG

AACGGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCCTTACGTCTTGGGCTACCACACGT

ACTACAATGCTACGGACAGAGGGCAGCGAGCCAGGGTATG

CCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAAAGATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCG

CTCTACTGGACTGCAACTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAACGAATGGGATTA

AATACCCCAGTAATCCTAACCGTAAACGATGGATACTAAGTGTTGTCTGTATCGACCC

AGACAGTGCCCCAGCTAACGCGATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTG

TGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAATATGTGGTTTAATT

CCATGCAACGCGAAAAACCTTACCAGGGCTTGACATGTCCCGAACCTCGCTGAAAGG

TGAGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT

CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCATCA

TTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATG

ACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTACTACAATGGGTGGG

ACAAAGGGCAGCGAACTCGCAAGAGCCAGCTAATCCCATAAACCCATCCTCAGTTCA

GATTGCTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAG

CATACTGCGGTGAATACGTTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGA

AGTTGGCCATGCCCGAAGTCATTACTCTAACCCCTCGGGGAGGAGGATGCCGAAGGC

AGGGCTGATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGTGGC

3.5.4. Mẫu 31(chủng plantothrix)

3.6. Kết quả so sánh trình tự gene trên ngân hàng NCBI và xây dựng cây phát

sinh loài

Sau đó sản phẩm PCR được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa Biotek

Company. Sử dụng phần mềm ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview

4.32.0.0. và ngân hàng gene NCBI để phân tích dữ liệu đoạn gene và thiết lập cây

phát sinh loài. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene 16S DNA

của các chủng vi khuẩn lam (2, 10, 29, 31) được phân lập ở hồ Dầu Tiếng và các

loài vi khuẩn lam trong ngân hàng gene NCBI. Kết quả giải trình tự của các chủng

đều có sự tương đồng cao khi so sánh với ngân hàng gene, sự tương đồng được thể

hiện rõ qua cây phát sinh loài (Hình 3.5). Đồng thời kết quả giải trình tự hoàn toàn

phù hợp với kết quả định danh hình thái.

41

Đồ Án Tốt Nghiệp

Cylindrospermopsis raciborskii CHAB1351

Raphidiopsis mediterranea 07-04

73

53

Cylindrospermopsis catemaco CHAB148 29 Raphidiopsis curvata CHAB3413

2 Microcystis panniformis

51

98

Microcystis smithii CHAB1459 14591CHAB1459

99

18

Oscillatoriales cyanobacterium

94

Lyngbya hieronymusii N-929

Planktothricoides raciborskii T1-6-2 Phormidium cf. aerugineo-coeru

Microcystis aeruginosa LMECYA 147

100

Microcystis ichthyoblabe VN461

Sphaerocavum brasiliense CCIBt3094

66

87 25 27

31

10 Dolichospermum circinale Anabaena ucrainica CHAB1431 Sphaerospermopsis kisseleviana CHAB332

10

Hình 3.5. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene 16S DNA của

các chủng Microcystis, Anabaena, Cylindrospermopsis, Plantothrix với các chủng

vi khuẩn lam trên ngân hàng gene NCBI.

Tiến hành so sánh vùng gene của các mẫu phân lập được với vùng gene 16S DNA

của các chủng vi khuẩn lam trên ngân hàng NCBI, các đặc điểm hình thái học của

các chủng tương đồng và có được kết quả như sau:

42

Đồ Án Tốt Nghiệp

 Mẫu 2 có mối quan hệ gần nhất với chủng Sphaerocavum brasiliense CCIBt3094,

Microcystis aeruginosa LMECYA 147, Microcystis ichthyoblabe VN461,

Microcystis panniformis và Microcystis smithii CHAB1459 với mức độ gene tương

đồng là 99%.

 Mẫu 10 có mối quan hệ gần nhất với loài Dolichospermum circinale và Anabaena

ucrainica CHAB1431 với mức độ gene tương đồng là 99%, còn với loài

Sphaerospermopsis kisseleviana CHAB332 với mức độ gene tương đồng là 98%.

 Mẫu 29 có mối quan hệ gần nhất với loài Cylindrospermopsis catemaco

CHAB148, Cylindrospermopsis raciborskii CHAB1351, Raphidiopsis

mediterranea 07-04 và Raphidiopsis curvata CHAB3413 với mức độ gene tương

đồng là 99%.

 Mẫu 31 có mối quan hệ gần nhất với loài Planktothricoides raciborskii T1-6-2 với

mức độ gene tương đồng là 99%, với Phormidium cf. aerugineo-coeruleum,

Oscillatoriales cyanobacterium Alignment_Isolate4 và Lyngbya hieronymusii N-

929 với mức độ gene tương đồng là 93%.

43

Đồ Án Tốt Nghiệp

4 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Sau khi so sánh các mẫu phân lập được và định danh vùng gene 16S DNA của

các chủng vi khuẩn lam: Microcystis, Anabaena, Cylindrospermopsis, Plantothrix ở

hồ Dầu Tiếng với các chủng vi khuẩn lam trên ngân hàng NCBI đã cho kết luận

sau:

- Mẫu 2 có mối quan hệ gần nhất với chủng Sphaerocavum brasiliense

CCIBt3094, Microcystis aeruginosa LMECYA 147, Microcystis ichthyoblabe

VN461, Microcystis panniformis và Microcystis smithii CHAB1459 với mức độ

gene tương đồng là 99%.

- Mẫu 10 có mối quan hệ gần nhất với loài Dolichospermum circinale và

Anabaena ucrainica CHAB1431 với mức độ gene tương đồng là 99%, còn với loài

Sphaerospermopsis kisseleviana CHAB332 với mức độ gene tương đồng là 98%.

- Mẫu 29 có mối quan hệ gần nhất với loài Cylindrospermopsis catemaco

CHAB148, Cylindrospermopsis raciborskii CHAB1351, Raphidiopsis

mediterranea 07-04 và Raphidiopsis curvata CHAB3413 với mức độ gene tương

đồng là 99%.

- Mẫu 31 có mối quan hệ gần nhất với loài Planktothricoides raciborskii T1-6-2

với mức độ gene tương đồng là 99%, với Phormidium cf. aerugineo-coeruleum,

Oscillatoriales cyanobacterium Alignment_Isolate4 và Lyngbya hieronymusii

N-929 với mức độ gene tương đồng là 93%.

Dựa trên các nghiên cứu trước nay và đề tài nghiên cứu này thì cho thấy rằng sự

hiện diện của các chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố vẫn còn hiện diện

trong hồ Dầu Tiếng.

Định danh được 4 nhóm vi khuẩn lam.

So sánh giữa hai cặp mồi CYA371F, 373R và CYA-F, CYA-R dùng trog khuếch

đại đoạn gene của 4 chủng trên.

44

Đồ Án Tốt Nghiệp

4.2. Đề nghị

Qua quá trình nghiên cứu và tìm hiểu các thông tin từ các nghiên cứu trong

nước và trên thế giới về các loài vi khuẩn lam đã được định danh thì ngoài các

chủng vi khuẩn lam trên còn có các chủng khác như: Gloeotrichia, Desmonostoc

và Arthronema...

Vì thời gian còn hạn chế nên có nhiều phương pháp và quy trình mà đồ án vẫn

chưa tiến hành thử nghiệm hết được, cần có những nghiên cứu sau:

 Cần xác định mức độ hiện diện của các nhóm vi khuẩn lam gây bệnh,

nhằm có biện phát hạn chế sự phát triển của chúng trong nguồn nước

cấp sinh hoạt cho người dân.

 Khảo sát khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn lam phân lập được.

 Khảo sát khả năng gây độc tố của các chủng trên.

45

Đồ Án Tốt Nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 Tiếng việt

[1] Dương Đức Tiến, 1996. Phân loại vi khuẩn lam ở Việt Nam. NXB Nông

nghiệp. Hà Nội.

[2] Dương Thị Hoàng Oanh, Vũ Ngọc Út và Nguyễn Thị Kim Liên, 2011.

Nghiên cứu khả năng xử lý nước thải của tảo Spirulina platensis. Kỷ yếu Hội

nghị Khoa học Thủy sản lần IV. Trường Đại học Cần Thơ, trang 15-27.

[3] Đào Thanh Sơn, Bùi Bá Trung và Đỗ Hồng Lan Chi, 2013. Đa dạng sinh

học vi khuẩn lam ở hồ Dầu Tiếng. Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và

tài nguyên sinh vật lần V. Nxb Nông nghiệp, trang 660-665.

[4] Đặng Ngọc Thanh, Hồ Thanh Hải, Dương Đức Tiến, và Mai Đình Yên,

2002. Thủy sinh học ở các thủy vực nước ngọt nội địa Việt Nam. Nxb Khoa

học và Kỹ thuật, 399 trang.

[5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty, 2007. Vi sinh

vật học. Nxb Giáo dục, 519 trang.

[6] Đặng Đình Kim, Dương Thị Thủy. 2014. Vi khuẩn lam độc nước ngọt.

Khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà Nội.

[7] Đào Thanh Sơn, Trần Trúc Ly, Phạm Thanh Lưu. 2013. Nguy cơ ngộ độc

bởi độc tố vi khuẩn lam ở hồ Dầu Tiếng. Tạp chí STINFO số 1&2: 52-53.

[8] Đào Thanh Sơn, Lê Thái Hằng, Phạm Thanh Lưu. 2013. Ảnh hưởng của

độc tố vi khuẩn lam từ hồ Dầu Tiếng. Tạp chí STINFO số 7: 28-36.

[9] Trần Cẩm Xô (chủ biên), Nguyễn Thị Lan (2005), Cơ sở di truyền và công

nghệ gen, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội.

 Tiếng nƣớc ngoài

[10] Baxevanis, A.D. and Ouellette, B.F.F., eds., Bioinformatics: A Practical

Guide to the Analysis of Genes and Proteins, third edition. Wiley, 2005. ISBN

0-471-47878-4.

46

Đồ Án Tốt Nghiệp

[11] Claverie, J.M. and C. Notredame, Bioinformatics for Dummies. Wiley,

2003. ISBN 0-7645-1696-5.

[12] World Health Organization (WHO), 1996. Guidelines for drinking water

quality. Volume 2. World Health Organization, Geneva.

[13] Komárek J., Anagnostidis K., 2005. Cyanoprokaryota 1. Teil:

Oscillatoriales. In Büdel, B., Gärtner, G., Krienitz, L., Schagerl, M. (Eds):

Süβwasserflora von Mitteleuropa. 19/2: 1-759. Gustav Fischer Verlag Jena.

[14] Komárek J. & Anagnostidis K. 1999. Susswasserflora von

Mitteleuropa,Cyanoprokaryota. 1. Teil: Chroococcales. Gustav Fischer

Verlag Jena. 548p.

[15] Chorus I., J. Bartram, 1999. Toxic cyanobacteria in water: A guide to

their public health consequences, monitoring and management. Published on

behalf of WHO, Spon Press, London, 416 pp.

[16] Dao, T. S., G. Cronberg, J. Nimptsch, L. C. Do-Hong, C. Wiegand, 2010.

Toxic cyanobacteria from Tri An Reservoir, Vietnam. Nova Hedwigia, 90:

433–448.

[17] Sivonen K., Niemela S. I., Niemi R. M., Lepisto L., Luoma T. H. &

Rasanenl L. A.. 1988. Toxic cyanobacteria (blue-green algae) in Finnish fresh

and coastal waters. Hydrobiologi 190: 267-275.

[18] Suvi Suurnakki, Gonzalo V. Gomez-Saez, Anne Rantala-Ylinen, Jouni

Jokela, David P. Fewer, Kaarina Sivonen. 2014. Identification of geosmin and

2-methylisoborneol in cyanobacteria and molecular detection methods for the

producers of these compounds. Water research 68: 56-66.

[19] Thanh-Luu Pham, Thanh-Son Dao, Kazuya Shimizu, Do-Hong Lan-Chi

and Motoo Utsumi. 2015. Isolation and characterization of microcystin-

producing cyanobacteria from Dau Tieng Reservoir, Vietnam. Nova Hedwigia

101: 1–2, 3–20.

47

Đồ Án Tốt Nghiệp

[20] Thanh-Luu Pham, Thanh-Son Dao, Ngoc-Dang Tran, Jorge Nimptsch,

Claudia Wiegand and Utsumi Motoo. 2016. Influence of environmental factors

on cyanobacterial biomass and microcystin concentration in the Dau Tieng

Reservoir, a tropical eutrophic water body in Vietnam. Ann. Limnol. - Int. J.

Lim. 0 (2016) 1–12.

[21] Thanh-Son Dao, Jorge Nimptsch and Claudia Wiegand. 2016. Dynamics

of cyanobacteria and cyanobacterial toxins and their correlation with

environmental parameters in Tri An Reservoir, Vietnam. Journal of Water and

Health 14.4: 699-712.

[22] Duy T. N., Paul K. S. Lam, Glen R. Shaw, Des W. Connell. 2000.

Toxicology and risk assessment of freshwater cyanobacterial (bluegreen

algal) toxins in water, Rev. Environ. Contam. Toxicol 163: 113 –186.

[23] Ena Urbach, Deborah L. Robertson, Sallie W. Chisholm. 1992. Multiple

evolutionary origins of prochlorophytes within the cyanobacteria radiation.

Nature Publishing Group 355: 1-4.

[24] Kitching IJ, Forey PL., Humphries CJ., Williams DM. 1998. Clasdistics,

the theory and practice of parsimony analysis. Oxford University Press.

228pp. Occurrence of the toxic cyanobacterium (blue-green alga) Microcystis

aeruginosa in Central China. Arch. Hydrobiol 114: 21-30.

[25] Page, R.D.M., Holmes, E.C. 1998. Molecular Evolution. Blackwell

Publishing. 346pp.

[26] Salemi M., Vandamme A-M. 2006. The phylogenetic handbook, a

practical approach to DNA and protein phylogeny. Cambridge University

Press. 398pp.

[27] Ye SQ. 2008. Bioinformatics: A Practical Approach. CRC Press, Taylor

& Francis Group. Amber Hotto, Mike Satchwell, Gregory Boyer. 2005.

Seasonal Production and Molecular Characterization of Microcystins in

Oneida Lake, New York, USA. Environ. Toxicol 20: 243–248.Carmichael,

W.W., Yu, M. J., He, Z.R, He, J.W. and Yu, J-L.. 1988.

48

Đồ Án Tốt Nghiệp

[28] Friedrich Jüttner, Susan B. Watson. 2007. Biochemical and Ecological

Control of Geosmin and 2-Methylisoborneol in Source Waters. Appl. Environ.

Microbiol 73: 4395-4406.

[29] Olga Savichtcheva, Didier Debroas, Rainer Kurmayer, Clement Villar,

Jean Philippe Jenny, Fabien Arnaud, Marie Elodie Perga, and Isabelle

Domaizon. 2011. Quantitative PCR Enumeration of Total/Toxic Planktothrix

rubescens and Total Cyanobacteria in Preserved DNA Isolated from Lake

Sediments. Appl. Environ. Microbiol Vol. 77, No. 24: 8744–8753.6.

[30] Amber Hotto, Mike Satchwell, Gregory Boyer. 2005. Seasonal

Production and Molecular Characterization of Microcystins in Oneida Lake,

New York, USA. Environ. Toxicol 20: 243–24.

[31] Kurmayer, R., G. Christiansen, and I. Chorus. 2003. The abundance of

microcystin-producing genotypes correlates positively with colony size in

Microcystis and determines its microcystin net production in Lake Wannsee.

Appl. Environ. Microbiol. 69:787–795.

[32] Cronberg G., H. Annadotter, 2006. Manual on aquatic cyanobacteria: A

photo guide and a synopsis of their toxicology. Kerteminde Tryk A/S, 106 pp.

[33] Zhou J. et al (1996). DNA recovery from soils of diverse composition,

Applied and Environmental Microbiology, 62 (2), 316 – 322.

[34] Jara C. et al (2008). Analysis of several methods for the extration of high

quality DNA from acetic acid bacteria in wine and vinegar for

characterization by PCR-based methods, International Journal of Food

Microbiology, 128 (2), 336 - 341.

[35] Zhu H, Qu F, Zhu LH. Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and

bacteria using benzyl chloride. Nucleic Acids Res 1993; 21(22), 5279-80.

[36] Haruta S. (2002). Construction of a stable microbial community with high

cellulose – degradation ability, Appl Microbiol Biotechnol, 59 (4), 529 – 534.

[37] Tomoyukihori, Shin Haura, Yohiyuki Ueno, Masaharuishii, Yasuo

Igarashi (2006). Direct comparinson of singlesstand conformation

49

Đồ Án Tốt Nghiệp

polymorphism (SSCP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to

characterize a microbial community on the basis of 16S RNA gene fragment,

Journal of Microbiological Methods, 66, 165 – 169.

[38] Friedrich Jüttner, Susan B. Watson. 2007. Biochemical and Ecological

Control of Geosmin and 2-Methylisoborneol in Source Waters. Appl. Environ.

Microbiol 73: 4395-4406.

 Tài liệu từ Internet

[1] https://voer.edu.vn/c/vi-khuan-lam/9b2ffb8d/6b311bf8

[2] https://vi.wikipedia.org/wiki/Tin_sinh_h%E1%BB%8Dc

[3]http://tailieu.vn/doc/bai-giang-tin-sinh-hoc-chuong-1-ths-nguyen-thanh-

luan-1672608.html

50

Đồ Án Tốt Nghiệp

PHỤ LỤC

A. Hình ảnh các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu

Máy li tâm lạnh MIKRO 220R Nguồn EC105 và Bể điện di QS-710

Hộp đèn soi UV Uvintec Máy PCR sprint thermo Cycler

1

Đồ Án Tốt Nghiệp

B. Kết quả so sánh trình tự 16S DNA của loài vi khuẩn lam với ngân hàng gene NCBI.

1. Kết quả so sánh mẫu 2 với chủng Microcystis aeruginosa LMECYA 147 trên trình tự đoạn gene 16S DNA

Score Expect Identities Gaps Strand

Query 1 AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTT 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 277 AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTT 336

Query 61 GGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCG 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 337 GGATTGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGTTCTGACGGTACTTGAGGAATCAGCCTCG 396

Query 121 GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATT 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 397 GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGAGGCAAGCGTTATCCGGAATTATT 456

Query 181 GGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGA 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 457 GGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGTCAGCCAAGTCTGCCGTCAAATCAGGTTGCTTAACGA 516

Query 241 CCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTG 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 517 CCTAAAGGCGGTGGAAACTGGCAGACTAGAGATCAGTAGGGGTAGCAGGAATTCCCAGTG 576

Query 301 TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCT 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 577 TAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGGAAGAACATCGGTGGCGAAAGCGTGCTACTGGGCT 636

Query 361 GTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTC 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 637 GTATCTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAAAGGGATTAGATACCCCTGTAGTC 696

Query 421 CTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTA 480

1602 bits (867) 0.0 884/891(99%) 6/891(0%) Plus/Plus

2

Đồ Án Tốt Nghiệp

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 697 CTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGAAGCTA 756

Query 481 ACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGAC 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 757 ACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGAC 816

Query 541 GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTAC 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 817 GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTAC 876

Query 601 CAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTAGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACA 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 877 CAAGACTTGACATGTCGCGAACCCTGGTGAAAGCTAGGGGTGCCTTCGGGAGCGCGAACA 936

Query 661 CAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGGTTAAGTCCCGCAAC 720

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||

Sbjct 937 CAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT-GGGTTAAGTCCCGCAAC 995

Query 721 GAGCGCAACCCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGGGACTCTAAGGAGACTGC 780

|||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||

Sbjct 996 GAGCGCAA-CCCTCGTTCTTAGTTGCCAGCATTAAGTT--GGGGACTCTAAGGAGACTGC 1052

Query 781 CGGTGACAAACCCGGAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTT 840

|||||||||| |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1053 CGGTGACAAA-CCGGAGGAAGGT-GGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTT 1110

Query 841 GGGCGACACACGTACTACAATAGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCGAG 891

||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1111 GGGCGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCGAG 1161

2. Kết quả so sánh mẫu 10 với chủng Anabaena ucrainica CHAB1431 trên trình tự đoạn gene 16S DNA.

Score Expect Identities Gaps Strand

1624 bits (879) 0.0 899/907(99%) 8/907(0%) Plus/Plus

3

Đồ Án Tốt Nghiệp

Query 1 GGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTG 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 222 GGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTG 281

Query 61 AGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGaaaaaaaTGACGGTAC 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 282 AGGGAGGAAGGCTCTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAAGAAAAAAATGACGGTAC 341

Query 121 CTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAG 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 342 CTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAG 401

Query 181 CGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCCGCAGGTGGCATTGAAAGTCTGCTGTTAA 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 402 CGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGGGTCCGCAGGTGGCATTGAAAGTCTGCTGTTAA 461

Query 241 AGAGTTTGGCTCAACCAAATAAAAGCAGTGGAAACTACAAAGCTAGAGTTTGGTCGGGGC 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 462 AGAGTTTGGCTCAACCAAATAAAAGCAGTGGAAACTACAAAGCTAGAGTTTGGTCGGGGC 521

Query 301 AGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCAGTGGCGA 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 522 AGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCAGTGGCGA 581

Query 361 AGGCGCTCTGCTAGGCCGAGACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGAT 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 582 AGGCGCTCTGCTAGGCCGAGACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGAT 641

Query 421 TAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTAGCTCGTATCGACCC 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 642 TAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTAGCTCGTATCGACCC 701

Query 481 GAGCTGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCAGGCAACTGTGA 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 702 GAGCTGTGCCGGAGCTAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCAGGCAACTGTGA 761

Query 541 AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGC 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 762 AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGC 821

4

Đồ Án Tốt Nghiệp

Query 601 AACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGTCACGAATTCTGTGGAAACATAGGAGTGC 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 822 AACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGTCACGAATTCTGTGGAAACATAGGAGTGC 881

Query 661 CTTAGGGAGCGTGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG 720

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 882 CTTAGGGAGCGTGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG 941

Query 721 GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGGCA 780

|||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| |||||

Sbjct 942 GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG-TTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTT-GGGCA 999

Query 781 CTCTAGAGAGACTGCCGGGTGACAAACCGGAGGAAGGGTGTGGGGATGACGTCAAGTCAG 840

|||||||||||||||| ||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||

Sbjct 1000 CTCTAGAGAGACTGCC-GGTGACAAACCGGAGGAAG---GTGGGGATGACGTCAAGTCAG 1055

Query 841 CATGCCCCCTTTACGTCTTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGACAAAGGGCAGCT 900

|||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1056 CATGCCCC--TTACGTCTTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGACAAAGGGCAGCT 1113

Query 901 ACACAGC 907

|||||||

Sbjct 1114 ACACAGC 1120

3. Kết quả so sánh mẫu 29 với chủng Cylindrospermopsis catemaco CHAB148

trên trình tự đoạn gene 16S DNA.

Score Expect Identities Gaps Strand

Query 1 AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTT 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 321 AATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTCTT 380

Query 61 GGGTCGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGAAAGTGACGGTACTTGAGGAATAAGCATC 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 381 GGGTCGTAAACCTCTTTTCTCAAGGAAGAAGAAAGTGACGGTACTTGAGGAATAAGCATC 440

1615 bits (874) 0.0 887/892(99%) 5/892(0%) Plus/Plus

5

Đồ Án Tốt Nghiệp

Query 121 GGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGAT 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 441 GGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGAT 500

Query 181 TGGGCGTAAAGGGTCTGCAGGTGGAACTGAAAGTCTGCTGTTAAAGAGTTTGGCTTAACC 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 501 TGGGCGTAAAGGGTCTGCAGGTGGAACTGAAAGTCTGCTGTTAAAGAGTTTGGCTTAACC 560

Query 241 AAATAAAAGCGGTGGAAACTACAGAACTAGAGTGTGGTAGGGGCAAAAGGAATTCCTGGT 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 561 AAATAAAAGCGGTGGAAACTACAGAACTAGAGTGTGGTAGGGGCAAAAGGAATTCCTGGT 620

Query 301 GTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCGGTGGCGAAAGCGTTTTGCTAGAC 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 621 GTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACACCGGTGGCGAAAGCGTTTTGCTAGAC 680

Query 361 CATAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGT 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 681 CATAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGT 740

Query 421 CCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGGAGCT 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 741 CCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGGAGCT 800

Query 481 AACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGA 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 801 AACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGA 860

Query 541 CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTA 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 861 CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTA 920

Query 601 CCAAGACTTGACATCCTGCGAATCCTGGTGAAAGCTGGGAGTGCCTTAGGGAGCGCAGAG 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 921 CCAAGACTTGACATCCTGCGAATCCTGGTGAAAGCTGGGAGTGCCTTAGGGAGCGCAGAG 980

Query 661 ACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC 720

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 981 ACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC 1040

6

Đồ Án Tốt Nghiệp

Query 721 GAGCGCAACCCTCGTTTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCG 780

|||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1041 GAGCGCAACCCTCG-TTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCG 1099

Query 781 GTGACAAACCGGAGGAACGGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCCTTACGTCTTGG 840

||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||

Sbjct 1100 GTGACAAACCGGAGGAA-GGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATG-CCCCTTACGTCTTGG 1157

Query 841 GCTACCACACGTACTACAATGCTACGGACAGAGGGCAGCGAGCCAGGGTATG 892

|||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||

Sbjct 1158 GCTA-CACACGTACTACAATGCTACGGACAGAGGGCAGCGAGCCAGGG-ATG 1207

4. Kết quả so sánh mẫu 31 với chủng Planktothricoides raciborskii T1-6-2 trên

trình tự đoạn gene 16S DNA.

Score Expect Identities Gaps Strand

Query 2 CCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAAAGATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGCTCTA 61

|||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 549 CCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGCTCTA 608

Query 62 CTGGACTGCAACTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAACGAATGGGATTAAATACCCC 121

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| |||||||

Sbjct 609 CTGGACTGCAACTGACACTCAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCC 668

Query 122 AGTAATCCTAACCGTAAACGATGGATACTAAGTGTTGTCTGTATCGACCCAGACAGTGCC 181

|||| ||||| ||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 669 AGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTTGTCTGTATCGACCCAGACAGTGCC 728

Query 182 CCAGCTAACGCGATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGG 241

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 729 GCAGCTAACGCGATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGG 788

Query 242 AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAATATGTGGTTTAATTCCATGCAACGCGAAAA 301

||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| ||||||||||||||

Sbjct 789 AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAA 848

1443 bits (781) 0.0 804/815(99%) 1/815(0%) Plus/Plus

7

Đồ Án Tốt Nghiệp

Query 302 ACCTTACCAGGGCTTGACATGTCCCGAACCTCGCTGAAAGGTGAGGGTGCCTTCGGGAGC 361

||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 849 ACCTTACCAGGGCTTGACATGTCGCGAACCTCGCTGAAAGGTGAGGGTGCCTTCGGGAGC 908

Query 362 GCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC 421

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 909 GCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC 968

Query 422 CGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGAC 481

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 969 CGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGAC 1028

Query 482 TGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACGTCC 541

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1029 TGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTACGTCC 1088

Query 542 TGGGCTACACACGTACTACAATGGGTGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCAAGAGCCAGCT 601

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1089 TGGGCTACACACGTACTACAATGGGTGGGACAAAGGGCAGCGAACTCGCAAGAGCCAGCT 1148

Query 602 AATCCCATAAACCCATCCTCAGTTCAGATTGCTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGAGG 661

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1149 AATCCCATAAACCCATCCTCAGTTCAGATTGCTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGAGG 1208

Query 662 AATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTTCCCGGGCCTTGTACAC 721

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||

Sbjct 1209 AATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACG-TTCCCGGGCCTTGTACAC 1267

Query 722 ACCGCCCGTCACACCATGGAAGTTGGCCATGCCCGAAGTCATTACTCTAACCCCTCGGGG 781

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1268 ACCGCCCGTCACACCATGGAAGTTGGCCATGCCCGAAGTCATTACTCTAACCCCTCGGGG 1327

Query 782 AGGAGGATGCCGAAGGCAGGGCTGATGACTGGGGT 816

|||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1328 AGGAGGATGCCGAAGGCAGGGCTGATGACTGGGGT 1362

8