Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)

CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP.

Ngành:

ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP. CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt

TS. Lương Tấn Trung

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thị Phượng Hằng

MSSV: 1151110009

Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)

CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP.

Ngành:

ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP. CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt

TS. Lương Tấn Trung

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thị Phượng Hằng

MSSV: 1151110009

Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên

cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm

Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được

công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về

lời cam đoan này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày ....... tháng ....... nãm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Phượng Hằng

LỜI CÁM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Ðại

học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh

học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến

thức quý báu cho em trong suốt những nãm học vừa qua.

Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt,

người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong

suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở

Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các

anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn

thành tốt đề tài của mình.

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên

con những lúc khó khãn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng

như trong cuộc sống.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày ...... tháng ...... nãm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Phượng Hằng

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục ...................................................................................................................... i

Danh sách chữ viết tắt ............................................................................................. vi

Danh sách các hình ................................................................................................. vii

Danh sách các bảng ............................................................................................... viii

MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1

1. Đặc vấn đề ............................................................................................................. 1

2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................. 2

3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 2

4. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................... 2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3

1.1. Giới thiệu chung về chi Medinilla sp. ............................................................ 3

1.1.1 .Phân loại, nguồn gốc và phân bố .................................................................. 3

1.1.1.1. Phân loại khoa học....................................................................................... 3

1.1.1.2 Phân bố và sinh thái ...................................................................................... 3

1.1.2. Đặc điểm thực vật học .................................................................................... 3

1.2.3 Một số loài đặc trưng thuộc chi Medinilla sp. ............................................... 3

1.2.3.1 Medinilla septentrionalis .............................................................................. 3

1.2.3.2 Medinilla assamica ....................................................................................... 4

1.2.3.3 Medinilla lanceata ........................................................................................ 4

1.2.3.4 Medinilla nana .............................................................................................. 5

1.2.3.5 Medinilla fengi .............................................................................................. 6

1.2.3.6 Medinilla formosana ..................................................................................... 6

1.2. Một số thành phần hóa học trong thực vật .................................................... 6

1.2.1 Carbohydrate ................................................................................................... 6

1.2.1.1. Khái niệm ..................................................................................................... 6

1.2.1.2 Vai trò ........................................................................................................... 6

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2 Amino acid .................................................................................................... 7

1.2.2.1 Khái niệm ................................................................................................... 7

1.2.2.2 Vai trò ......................................................................................................... 7

1.2.3 Alkaloid ......................................................................................................... 8

1.2.3.1 Khái niệm .................................................................................................. 8

1.2.3.2 Vai trò ......................................................................................................... 8

1.2.4 Glycoside ....................................................................................................... 9

1.2.4.2 Saponin ....................................................................................................... 9

1.2.4.3Glycoside tim ............................................................................................... 9

1.2.4.4Anthraquinone glycoside ........................................................................... 10

1.2.4.5 Flavonoid và anthoxyanosid ................................................................... 10

1.2.4.6 Tannin ...................................................................................................... 10

1.2.4 Steroid ......................................................................................................... 11

1.2.4.1 Khái niệm ................................................................................................ 11

1.2.4.2 Vai trò ....................................................................................................... 11

1.2.5 Các hợp chất phenolic ................................................................................ 11

1.2.5.1 Khái niệm ................................................................................................. 11

1.2.5.2 Vai trò ....................................................................................................... 12

1.3. Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ............................. 12

1.3.1. Khái niệm .................................................................................................. 12

1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung ...................................................................... 12

1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất

kháng khuẩn trong thực vật ............................................................................... 13

1.3.3.1 Alkaloid ................................................................................................... 13

1.3.3.2 Phenol đơn và acid phenolic .................................................................... 14

1.3.3.3 Flavonoid ................................................................................................. 15

1.3.3.4 Tannin ...................................................................................................... 16

1.3.3.5 Các hợp chất quinone .............................................................................. 16

1.3.3.6 Terpenoid và tinh dầu .............................................................................. 17

Đồ án tốt nghiệp

1.3.3.7 Saponin ..................................................................................................... 18

1.2.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt

Nam ...................................................................................................................... 19

1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thê giới ................ 19

1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn từ thực vật ở Việt Nam .................... 20

1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration _MIC) và

nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum bactericidal concentration_MBC)21

1.4.4. Khái niệm, ý nghĩa MIC và MBC ............................................................. 21

1.4.1.1. Khái niệm ................................................................................................ 21

1.4.1.2. Ý nghĩa .................................................................................................... 21

1.4.3. Sơ lược về một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

.............................................................................................................................. 22

1.4.3.1Phương pháp khuếch tán trên thạch (agar-diffusion methods) ................ 22

1.4.3.2.Phương pháp pha loãng (Dilution methods) ........................................... 22

1.4.4 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thực vật .. 23

1.4.4.1 Tình hình nghiên cứu MIC trên thế giới .................................................. 23

CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 25

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................................. 25

2.1.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................. 25

2.1.2 Địa điểm thu mẫu ....................................................................................... 25

2.1.3 Thời gian nghiên cứu................................................................................. 25

2.2.Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 25

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 25

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị .......................................................................................... 25

2.2.3 Môi trường ................................................................................................. 25

2.2.3.1 Môi trýờng nuôi cấy và phân lập ............................................................ 25

2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................. 26

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 26

iii

2.3.1. Phương pháp thu và tách chiết các hợp chất từ thực vật........................ 26

Đồ án tốt nghiệp

2.3.2. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị ............................................... 27

2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật ..................................... 27

2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật ........................................................ 27

2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu ............................................................ 27

2.3.4. Phương pháp pha loãng vi sinh vật .......................................................... 28

2.3.5 Phương pháp xác định mật độ tế bào ....................................................... 28

2.3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol bằng phương pháp

khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) ............................................ 29

2.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường

lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin (broth dilution resazurin method) ............ 30

2.3.8 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp đĩa giấy

khuếch tán (disc diffusion method) ................................................................... 31

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 32

2.4 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 32

2.4.1 Thí nghiệm 1: Tách chiết cao ethanol từ cây Medinilla sp. ..................... 33

2.4.1.1 Sơ đồ tách chiết ........................................................................................ 33

2.4.1.2 Thuyết minh quy trình .............................................................................. 33

2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol 70% từ

cây Medinilla sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch ................ 34

2.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu quy trình xác định chỉ số MIC của cao chiết

ethanol 70% từ cây Medinilla sp. ....................................................................... 35

2.4.3.1 Thí nghiệm 3.1 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch ..................... 36

2.4.3.2 Thí nghiệm 3.2 Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung

chất chỉ thị resazurin ........................................................................................... 37

2.4.3.3 Thí nghiệm 3.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán .................................. 38

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 40 3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol từ cây Medinilla sp. .. 40

3.1.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli .................................................. 41

3.1.2 Đối với nhóm Salmonella spp .................................................................... 42

Đồ án tốt nghiệp

3.1.3 Đối với nhóm Shigella spp ......................................................................... 43

3.1.4 Đối với nhóm Vibrio spp. ........................................................................... 44

3.1.5 Đối với nhóm chủng vi sinh vật gây bệnh khác ........................................ 45

3.2 Kết quả xác định chỉ số (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây

Medinilla sp. (MEE) ........................................................................................... 46

3.2.1 Xác định chỉ số MIC của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên

giếng thạch (WDA) .............................................................................................. 47

3.2.2 Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị

resazurin (MDR).................................................................................................. 48

3.2.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (DDA) ................................................ 50

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………56

4.1 Kết luận………………………………………………………………………56

4.2 Kiến nghị……………………………………………………………………..56

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MEE: Medinilla sp. ethanol extract: Cao chiết 70% từ cây Medinilla sp.

MIC: Minimum Inhibitory Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu

MBC: Minimum Bactericidal Concentration: Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

WDA: Agar well diffusion assay: Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

MDR: Broth dilution resazurin menthod: Phương pháp pha loãng trên môi trường

lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin

DDA: Disc diffision assay: Phương pháp đĩa giấy khuếch tán

TSA: Trypticase Soya Agar

TSB: Trypton Soya Broth

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1. Medinilla septentrionalis ............................................................................ 4

Hình 1.2. Medinilla assamica ..................................................................................... 4

Hình 1.3. Medinilla lanceata ...................................................................................... 5

Hình 1.4. Medinilla nana ............................................................................................ 5

Hình 1.5. Medinilla formosana .................................................................................. 6

Hình 1.6. Cấu tạo amino acid ..................................................................................... 7

Hình 1.7. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thiên nhiên .............................. 12

Hình 1.8. Berberine .................................................................................................. 14

Hình 1.9. Eugenol ..................................................................................................... 15

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học saponin ....................................................................... 18

Hình 2.1. Đường kính vùng ức chế của MEE đối với chủng Escherichia coli

O157:H7 .................................................................................................................... 29

Hình 2.2. Sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị resazurin ......................................... 31

Hình 2.3. Đường kính vùng ức chế của cao chiết Medinilla sp. nồng độ 100

mg/mlđối với chủng Shi. Sonnei ............................................................................... 32

Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................................. 33

Hình 2.5. Quy trình tách chiết cao ethanol 70% ...................................................... 33

Hình 2.6. Dịch lọc mẫu ethanol 70% ....................................................................... 34

Hình 2.7. Quy trình xác định hoạt tính kháng khuẩn ............................................... 35

Hình 2.8. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch36

Hình 2.9. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp pha loãng trên môi trường

lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin ............................................................................ 37

Hình 2.10. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán .......... 38

Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của MEE (100mg/ml) và ciprofloxacin (500µg/ml) đối

vii

với nhóm Escherichia coli ........................................................................................ 40

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.2. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với nhóm

Salmonella spp. ......................................................................................................... 41

Hình 3.3. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với nhóm

Shigella spp. ............................................................................................................. 42

Hình 3.4. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (8µg/ml) đối với nhóm

viii

Vibrio spp. ................................................................................................................ 43

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất

lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin ............................................................................ 44

Bảng 3.1. Kết quả đối kháng của MEE với 20 chủng vi sinh vật khảo sát .............. 44

Bảng 3.2. Chỉ số MIC của MEE đối với 20 chủng vi sinh vật khảo sát bằng phương

pháp WDA................................................................................................................. 47

Bảng 3.3. Chỉ số MIC trên 20 chủng vi sinh vật khảo sát bằng phương pháp MDR ...

................................................................................................................................... 49

Bảng 3.4. Chỉ số MIC trên 20 chủng vi sinh vật khảo sát được thực hiện bằng

phương pháp DDA .................................................................................................... 50

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, việc kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh cho con

người được báo cáo từ khắp nơi trên thế giới (Piddock và ctv, 1989). Tình hình

đáng báo động là việc sử dụng kháng sinh bừa bãi ở các nước đang phát triển

(Ahmad và ctv, 2001), mặc dù ngành công nghiệp dược đã sản xuất một số loại

kháng sinh mới trong ba thập kỷ qua, nhưng đề kháng của vi khuẩn đối với các loại

thuốc đã tăng lên, vì vi khuẩn có khả năng di truyền nên có khả năng kháng thuốc

qua các thế hệ (Cohen, 1992).

Thuốc kháng sinh là cơ sở chính để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn.

Từ khi phát hiện ra các loại thuốc kháng sinh và sử dụng chúng như hóa học trị liệu

với hy vọng cho ngành y tế rằng kháng sinh sẽ tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật gây

các bệnh truyền nhiễm. Tuy nhiên, lạm dụng kháng sinh đã trở thành nhân tố chính

cho sự xuất hiện và phát triển nên nhiều chủng kháng thuốc của một số nhóm vi

sinh vật (Harbottle và ctv, 2006).

Do đó, việc quan trọng là phải tìm ra các loại kháng sinh mới. Tuy nhiên theo hồ

sơ trước đây, ngay cả những loại kháng sinh thương mại mới được giới thiệu chỉ có

hiệu quả trong một thời gian ngắn (Coates, 2002). Hơn nữa, sự phát triển kháng

thuốc và sự xuất hiện của các tác dụng phụ không mong muốn của thuốc kháng sinh

thương mại đã dẫn đến việc tìm kiếm các tác nhân kháng khuẩn mới, chủ yếu là các

chất chiết xuất từ thực vật, để tìm ra cấu trúc hóa học mới để khắc phục những

nhược điểm nói trên (Ordóñez và ctv, 2003). Vì lý do này, các nhà nghiên cứu đang

ngày càng chuyển sự chú ý sang các sản phẩm thảo dược, tìm kiếm hy vọng mới

cho sự phát triển loại thuốc tốt hơn so với các chủng vi khuẩn đã kháng (Braga và

ctv, 2005)

Hàng nghìn năm trước, con người đã biết về lợi ích của việc sử dụng thực vật để

làm giảm hoặc chữa bệnh. Các loài thực vật tạo thành một nguồn các hợp chất hóa

học mới quan trọng có tiềm năng sử dụng trong y học và các ứng dụng khác. Chiết

xuất từ thực vật đã được ghi nhận bởi các nền văn minh cổ đại là có ý nghĩa cho

Đồ án tốt nghiệp

việc điều trị các bệnh khác nhau, và khoảng 30% doanh số dược phẩm bán ra trên

toàn thế giới được dựa trên các sản phẩm tự nhiên (Grabley, 1999)

Hiện nay vẫn chưa có nhiều tài liệu khoa học đề cập đến hoạt tính kháng khuẩn

củng như quy trình xác định nồng độ kháng khuẩn của chiết xuất từ thực vật được

sử dụng trong y học dân gian. Vì vậy, để làm phong phú cho danh sách các thực vật

có tiềm năng sử dụng thay thế thuốc kháng sinh, và xây dựng quy trình xác định

nồng độ ức chế tối thiểu áp dụng đối tượng thực vật _ cây thuốc (có màu) là lý do

chính để đề tài “Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp” được thực hiện

2. Mục đích nghiên cứu

Bước đầu xác định được quy trình phù hợp để khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu

(MIC) cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp.

3. Nội dung nghiên cứu

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cho cao chiết ethanol của chi Medinilla sp.

Nghiên cứu một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ đó đưa

ra quy trình chung cho đối tượng cây thuốc

4. Phạm vi nghiên cứu

Sử dụng dung môi ethanol 70% cho quá trình tách chiết cao

Thử nghiệm trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về chi Medinilla sp.

1.1.1 .Phân loại, nguồn gốc và phân bố

1.1.1.1. Phân loại khoa học

Giới (regnum) : Plantae

Ngành (division) : Magnoliophyta

Lớp (class): Magnoliopsida

Bộ (ordo): Myrtales

Họ (familia): Melastomataceae

Chi (genus): Medinilla

1.1.1.2 Phân bố và sinh thái

Medinilla sp. là một chi có khoảng 193 loài thực vật có hoa thuộc họ

Melastomataceae, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới cổ xưa bắt nguồn từ Châu Phi

(hai loài) về phía đông qua Madagascar (khoảng 70 loài) và miền Nam châu Á đến

phía tây các đảo Thái Bình Dương. Chi này được đặt tên theo J. de Medinilla, thống

đốc của quần đảo Mariana vào năm 1820. (Renner và ctv, 2004)

1.1.2. Đặc điểm thực vật học

Medinilla thuộc loại cây bụi hoặc dây leo. Lá mọc đối diện hay vòng, có

cuống lá hoặc không cuống, phiến lá thường nhẵn, rìa lá có hoặc không có răng cưa.

Lá bắc nhỏ, sớm rụng. Hoa có 4 hay 6 cánh. Có chùy hoa lớn màu trắng hoặc hồng,

có cuống nhỏ và đôi khi có lá bắc con. Đế hoa có hình chén, hình phễu, hình

chuông, hoặc hình ống. Cánh hoa dạng trứng ngược (đầu nhỏ ở phía cuống lá), hình

trứng đôi khi xiên. Nhị hoa = 2 x cánh hoa. Hạt nhiều. Bầu nhụy thấp, hình trứng,

chóp cụt hoặc với màng bao quanh đỉnh, đôi khi có vách ngăn.(Jie và ctv, 2007)

1.2.3 Một số loài đặc trưng thuộc chi Medinilla sp.

1.2.3.1 Medinilla septentrionalis

Đồ án tốt nghiệp

Là cây bụi, cao khoảng 1 – 7m,

nhiều nhánh, nhánh thẳng đứng đôi khi

xen kẽ. Cành dày, hình trụ, nhẵn với vỏ

mỏng có màu nâu. Cuống lá dày

khoảng 0,4 – 0,9 mm. Phiến lá hình

lưỡi mác, có kích thước 7–8,5 × 2–2,5

cm, mỏng như giấy, rìa lá có răng cưa

nhỏ, thưa thớt. Cụm hoa nách, có kích

thước 3,5-5,5 cm, có 1 – 5 hoa, nhẵn, Hình 1.1. Medinilla septentrionalis

cuống hoa 1-2,5 cm, đế hoa có hình chuông 4-4,5 mm

Phân bố: Các rừng rậm, bìa rừng, khu vực râm ẩm ướt; độ cao khoảng 200-

1800 m. Được tìm thấy ở Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam),

Myanmar, Thái Lan, Việt Nam.

1.2.3.2 Medinilla assamica

Là cây bụi, hoặc dây leo, cao 1

– 4m. Cành có 4 góc khi còn nhỏ, khi

trưởng thành cành dày, nhẵn có hình

trụ. Lá có cuống hoặc không cuống.

Phiến lá hình trứng, lanceolateovate

hoặc hình elip có kích thước 10 – 21 ×

3,8 – 11 cm, rìa lá có đường răng cưa

nhỏ, nhọn đỉnh. Đế hoa có hình chuông

Hình 1.2. Medinilla assamica (15 – 30 cm). Cuống hoa nhỏ (0.,5 - 2

mm), đế hoa có hình chén (3 - 4 mm). Cánh hoa màu hồng, có 4 cánh hình trứng

- Phân bố: tập trung thưa thớt ở rừng rậm, thung lũng, sườn đồi, nơi ẩm ướt,

độ cao khoảng 200 – 1300m. Được tìm thấy ở Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Thái Lan,

Myanmar, Việt Nam

1.2.3.3 Medinilla lanceata

Đồ án tốt nghiệp

Là cây riêng lẽ hoặc bụi, cao

khoảng 2 – 5 m. Cuống lá dài khoảng

8 - 10 mm, hơi có lông; lá hình lưỡi

mác đến hình ovate - lanceolate, có

kích thước khoảng 15 - 24 × 3-5,5 cm,

mỏng như giấy, 2 bề mặt lá nhẵn, đỉnh

và đuôi lá nhọn, rìa lá có đường răng

cưa nhỏ nông. Cụm hoa chèn vào lá

cành hoặc các đốt của rễ. Hoa mọc

theo cụm, hình chùy (15 – 25 cm), đế Hình 1.3. Medinilla lanceata

hoa có hình chuông (5 - 6 mm), cánh hoa hình trứng rộng, cùn ở đỉnh và tròn dần về

cuối

Phân bố rải rác ở rừng rậm, nơi ẩm ướt, dưới bóng cây, thung lũng, sườn đồi,

độ cao khoảng 400 - 1000m. Được tìm thấy ở Trung Quốc (Hải Nam, Vân Nam)

1.2.3.4 Medinilla nana

Là cây bụi, cao khoảng 15 -

100cm. Chúng là thực vật biểu sinh,

thân bò. Cuống lá (1 – 4 mm), nhẵn lá

có hình lưỡi trứng đến elip, có kích

thước 2 - 3,5 × 1,1 - 1,5 cm, lá mọng

nước để trữ nước, 2 bề mặt lá nhẵn.

Cum hoa có khoảng 1 - 3 hoa, hoa có

4 cánh, màu hồng, hình trứng Hình 1.4. Medinilla nana

Phân bố: ở các rừng rậm, độ cao khoảng 1100 – 2000 m. Được tìm thấy ở

Trung Quốc (Vân Nam) và Việt Nam

1.2.3.5 Medinilla fengi

Là cây bụi, cao 50 – 120 cm, nhiều nhánh. Cuống lá (5 - 12 mm), phiến lá

hình trứng đến elip, có kích thước 4 – 10 × 2 - 3,5 cm, lá có răng cưa nhỏ thưa thớt

hoặc không có răng cưa, đầu và đuôi lá đều nhọn. Hoa mọc theo chùm, có kích

Đồ án tốt nghiệp

thước 2 – 3 × 3 – 5 cm, chùm khoảng 3 - 6 hoặc 16 hoa, cuống hoa (5 - 10 mm), đế

hoa hình phễu (4 – 5 mm), hoa có 4 cánh, màu hồng, hình trứng rộng (6 - 7,5 mm),

đỉnh cắt xén hoặc nhọn

Phân bố: rừng thường xanh cây lá rộng, những nơi ẩm ướt có bóng, vết nứt

của đá, độ cao khoảng 600 - 1800 m. Được tìm thấy ở Đài Loan và Trung Quốc

(Vân Nam).

1.2.3.6 Medinilla formosana

Là cây bụi, hoặc dây leo. Lá mọc đối

diện hoặc mọc vòng quanh thân, cuống lá (5

– 10 mm), nhẵn; phiến lá hình thuôn - trứng

đến trứng - mũi mác, kích thước 10 - 20 × 7

- 14 cm, mỏng như giấy. Cụm hoa đầu cuối

hoặc gần cuối, hoa mọc theo chùy, cuống

hoa (6 mm), nhẵn. Đế hoa gần hình cầu,

kích thước 3 × 2,5 mm, 4 cạnh, nhẵn. Hoa 4 Hình 1.5. Medinilla formosana cánh, hình trứng.

Phân bố: rừng, sườn núi, độ cao dưới 100 - 1000 m. Được tìm thấy ở Đài

Loan

1.2. Một số thành phần hóa học trong thực vật

1.2.1 Carbohydrate

1.2.1.1. Khái niệm

Carbohydrate là hợp chất hữu cơ được tạo nên từ các nguyên tố: C, H, O.

Công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n và là nhóm phổ biến nhất trong

bốn nhóm phân tử sinh học chính. Ở thực vật carbohydrate tập trung chủ yếu ở

thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ

Nguồn gốc các carbohydrate trong tự nhiên: được hình thành từ trong lá cây

của thực vật nhờ quá trình quang hợp của ánh sáng mặt trời và sắc tố xanh

chlorophyll (diệp lục) (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013)

1.2.1.2 Vai trò

Đồ án tốt nghiệp

- Cung cấp năng lượng

- Cấu trúc, tạo hình (cellulose,…)

- Bảo vệ (mucopolysaccharide)

- Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể)

- Điểm tựa: bộ khung thực vật

- Dự trữ: tinh bột ở thực vật (hạt, thân, củ) (Nguyễn Huy Công và ctv, 2005)

1.2.2 Amino acid

1.2.2.1. Khái niệm

Amino acid là loại hợp chất hữu cơ tạp chức

mà phân tử chứa đồng thời nhóm amino (-NH2-) và

nhóm cacboxyl (-COOH-)

Công thức cấu tạo: Gồm nguyên tử carbon

trung tâm, nhóm amin (amino), nhóm carboxylate,

mạch nhánh. Có công thức : (H2N)x – R – (COOH)y.

Các acid amin khác nhau là do cấu tạo mạch nhánh

Hình 1.6. Cấu tạo amino acid khác nhau

Trong phân tử amino acid, nhóm NH2 và nhóm COOH tương tác với nhau tạo ion

lưỡng cực. Vì vậy amino acid kết tinh tồn tại ở dạng ion lưỡng cực (Hồ Chí Tuấn,

2009)

1.2.2.2 Vai trò

Vai trò và một số amino acid được thể hiện ở bảng 1.1

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất

Các amino acid Hoạt động sinh hóa

Glycine - Là tiền chất của chlorophyll

Proline và - Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước

hydroxyproline - Cấu tạo nên thành tế bào (nematostatic action)

- Thiết yếu để tạo phấn hoa

Glutamic và Đạm hữu cơ dự trữ để tạo thành các amino acid khác và

glutamine protein thông qua phản ứng trao đổi

Serine - Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước, rất quan trọng

cho quá trình tổng hợp chlorophyll

Arginine - Là tiền chất của polyamine, rất quan trọng để để phân

chia tế bào

Phenylalanine - Là tiền chất cấu tạo nên lignine, tạo các chồi gỗ khỏe

hơn

Alanine - Vai trò rất quan trọng trong việc tạo hoocmon trao đổi

chất và kháng virus

Tryptophan - Tiền tố của indole-acetic acid, các chất kích thích sinh

trưởng tự nhiên

1.2.3 Alkaloid

1.2.3.1 Khái niệm

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường

gặp trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài động vật. Chúng

có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất là đối với hệ thần

kinh. Alkaloid là chất độc gây chết người nhưng rất quan trong trong lĩnh vực y học

Đồ án tốt nghiệp

và cung cấp những loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao (Nguyễn Huy Công và ctv,

2005)

1.2.3.2 Vai trò

- Diệt khuẩn

- Tác động lên hệ thần kinh

- Hạ huyết áp

- Chống ung thư

- Là những chất chuyển hóa thứ cấp, đóng vai trò trong quá trình sinh sản và

giúp bảo vệ thực vật chống lại các sinh vật ăn thực vật. (Nguyễn Huy Công và ctv,

2005)

1.2.4 Glycoside

Là những hợp chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp. Glycoside thường được hòa

tan trong dịch tế bào của cây, khi gặp điều kiện thuận lợi thì nó có thể bị các

enzyme phân hủy.

Khi thủy phân glycoside sẽ cho hai phần: một phần không đường và một

phần gồm một hay nhiều đường, phần đường có thể là đường đơn hay đường đa, có

tác dụng làm tăng sự hòa tan glycoside trong nước, còn phần không đường (gọi là

aglycon hay genin) có cấu trúc hóa học rất khác nhau. Tùy theo phần không đường

này và tác dụng của các cây thuốc, glycoside lại chia làm nhiều chất khác nhau. Có

thể kể đến một số glycoside chính sau đây: (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.2.4.2 Saponin

a. Khái niệm: Là những glycoside có tính chất gây bọt, phá huyết. Những vị thuốc

có chất saponin khi tán nhỏ, lắc với một ít nước thì sẽ gây rất nhiều bọt như bọt xà

phòng trong ống thí nghiệm. Bọt này rất lâu mới tan

b. Vai trò

- Tác dụng bổ, tăng cường sinh lực (saponin có trong họ nhân sâm)

- Tác dụng long đờm, dịu ho (có trong cam thảo, viễn chí)

- Giảm đau nhức khớp xương (có trong ngưu tất, cỏ xước)

- Hạ cholesterol trong máu (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Đồ án tốt nghiệp

1.2.4.3 Glycoside tim

a. Khái niệm: Là các glycoside thực vật, có ảnh hưởng kích thích tim và thường có

độc tính cao. Có đặc điểm là những kết tinh, không màu, có vị đắng. Tan trong các

dung môi phân cực. Dễ bị thủy phân trong môi trường acid

1.2.4.4Anthraquinone glycoside

a. Khái niệm: thường có màu từ vàng, cam tới đỏ. Gắn vào nhân thường có các

nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH...Tuỳ theo vị trí các nhóm chức gắn vào

nhân mà có các dẫn xuất khác nhau

b. Vai trò: một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất anthraquinone có tác dụng kích

thích miễn dịch chống ung thư

1.2.4.5 Flavonoid và anthoxyanosid

a. Khái niệm: là những chất glycoside có màu sắc. Flavonoid là những sắc tố màu

vàng có trong thực vật, còn anthoxyanosid là những sắc tố cùng loại, có thể là màu

xanh, tím, đỏ hoặc không màu củng được xếp vào nhóm flavonoid. Có đặc điểm là

trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng

liên kết với glucide (glycoside). Trong đó, dạng aglycol thưòng tan trong các dung

môi hữu cơ như este, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng

glycoside thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực

như aceton, benzen, chloroform. Những chất này có liên quan chặt chẽ với chất

tannin (Nguyễn Huy Công và ctv, 2005)

b. Vai trò: một chất flavon rất quý là rutin hay rutoside có trong hoa hòe có tác

dụng giảm huyết áp, giúp cho cơ thể chống lại những trường hợp đứt mạch máu nhỏ

khi huyết áp tăng cao. Vai trò của anthoxyanosid hiện nay chưa được xác định rõ rệt

về mặt điều trị. (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.2.4.6 Tannin

a. Khái niệm: tanin được định nghĩa là những hợp chất polyphenol có trong thực vật

có vị chát được phát hiện dương tính với "thí nghiệm thuộc da" và được định lượng

dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn. Tannin có đặc điểm:

Đồ án tốt nghiệp

- Tannin thường là bột vô định hình từ màu ngả vàng cho đến màu nâu sáng, không

mùi hoặc mùi rất nhẹ, vị rất chát, gây săn se niêm mạc.

- Khối lượng phân tử từ 500 – 20000, điểm chảy không cố định mà thay đổi tùy

cách chiết xuất, phân lập

- Tannin thường là những chất rất phân cực, dễ tan trong các dung môi phân cực

như cồn, glycerin, aceton…

- Đa số không tan trong các dung môi hữu cơ

- Tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt)

- Tạo phức tủa bền với các dun dịch của protein (albumin, gelatin…) nên có tính

thuộc da, làm cho da bền, ít thấm nước, không bị trương phồng hay thối rửa

b. Vai trò

Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu. Tác

dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng. Công dụng chữa viêm ruột,

tiêu chảy. Chữa ngộ độc kim loại nặng và các alkaloid vì làm kết tủa các chất đó

(Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.2.4 Steroid

1.2.4.1 Khái niệm

Là những hợp chất thiên nhiên có bộ khung cacbon stenan gồm bốn vòng

ngưng tụ với nhau, chứa các mạch bên và các nhóm chức khác nhau như: CO, -

CHO, -COOH, -OH. Steroid tồn tại trong động, thực vật dưới dạng glycosid hoặc

liên kết với các cacbon acid amin. Steroids có đặc điểm là hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan. Có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp. Khi đun nóng với Se ở 36000C sẽ

tạo hợp chất Hidrocacbon Diel

1.2.4.2 Vai trò

Tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. Thường dùng làm các

thuốc kích thích

1.2.5 Các hợp chất phenolic

1.2.5.1 Khái niệm

Đồ án tốt nghiệp

Là những hợp chất hóa học được tìm thấy ở khắp các chất màu của hoa quả

được cấu tạo từ các tiểu đơn phân phenol. Có đặc điểm là đa số được tổng hợp từ

phenylalanine. Ở thực vật nhóm phenolics chủ yếu được tìm thấy là caffeic acid

1.2.5.3 Vai trò

- Bảo vệ thực vật chống lại mầm bệnh và các động vật ăn cỏ

- Chất chống oxi hóa tự nhiên và tìm thấy trong táo, trà xanh

- Chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm

- Một hợp chất phenolic khác là chlorogenic acid được biết như là chất gây ra viêm

da dị ứng ở người

1.3. Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật

1.3.1. Khái niệm

- Là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế

sự phát triển của vi khuẩn, ngăn vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức phân

tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết cho sự phát

triển của vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa của chúng. Thường có tác

dụng đặc hiệu với một nồng độ rất nhỏ .

- Các chất kháng khuẩn thực vật thường là các hợp chất như alkaloid,

flavonoid, tannin và một số loại tinh dầu…

1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn chung

Đồ án tốt nghiệp

Đông tụ Proton động lực

Tế bào chất

Vách tế bào

Màng tế bào chất

Màng protein

Hình 1.7. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thiên nhiên

Cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng khuẩn từ thiên nhiên là phá hủy màng

tế bào chất, làm mất ổn định của proton động lực (PMF), dòng điện tử, hoạt động

vận chuyển và đông tụ của các tế bào

Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất chủ yếu thông qua : phá vách tế bào, làm

rối loạn màng sinh chất và bất hoạt enzyme, protein … của tế bào vi khuẩn .

Có nhiều hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật tiêu diệt vi sinh vật

thông qua phá vỡ vách tế bào

Có rất nhiều hợp chất tấn công vào màng trao đổi chất tiêu diệt vi khuẩn .

+ Thành phần kỵ nước trong tinh dầu hòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn làm

ảnh hưởng đến cấu trúc và thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn (Sikkema J

và ctv, 1994)

+ Một số loại tinh dầu có khả năng kích thích sự tăng trưởng của sợi nấm giả, điều

đó chứng minh rằng nó có thể hoạt động trên các enzyme tham gia vào quá trình

tổng hợp thành phần cấu trúc vi khuẩn (Lambert và ctv, 2001)

+ Thymol có khả năng phân hủy màng tế bào của vi khuẩn Gram (-)

Đồ án tốt nghiệp

Tiêu diệt vi khuẩn thông qua ngăn chặn sự bám dính của vi khuẩn và virus

như: mannose specificaglutinin, chrysin…

1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất

kháng khuẩn trong thực vật

1.3.3.1 Alkaloid

a. Cơ chế kháng khuẩn chung của alkaloid

Cơ chế kháng khuẩn alkaloid: là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn..

Berberine có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế được Shigella, S.aureus, Vibrio

choleare,..

Có tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn gram (-) , gram (+ ) và các vi khuẩn

acid

b. Một số alkaloid có tính kháng khuẩn điển hình

Morphine là một alkaloid được sử dụng trong y tế trong những năm đầu của thế

kỷ XIX. Morphine được lấy từ cây thuốc phiện Papaver somniferum. Codein và

heroin là hai dẫn xuất của morphine. Diterpenoid alkaloids là một loại alkaloid

thường được lấy từ các họ cây mao lương (Ranunculaceae), chúng có đặc tính

kháng kháng khuẩn.

- Solamargine

Solamargine, một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum

khasianum), và các alkaloid khác trong loài cây này có tác dung chống lại sự lây

nhiễm khi đã mắc phải HIV.

Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan

trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy.

- Berberine

Một đại diện quan trọng của alkaloid có trong

các cây: hoàng đằng, hoàng bá, hoàng liên…

Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối

với shigella, tụ cầu khuẩn. Những năm gần đây,

một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine Hình 1.8. Berberine

Đồ án tốt nghiệp

có tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn gram dương, gram âm và các vi khuẩn axit.

Ngoài ra có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên

sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét.

Cơ chế kháng khuẩn berberine là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn

gây bệnh sốt rét, chính vì điều này mà tác dụng kháng khuẩn của Berberine khá

mạnh đối với loại trùng gây bệnh này.

Đặc biệt khi dùng berberine điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh

hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột. Các nghiên cứu

gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với

berberine sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ

vi sinh vật đường ruột.

1.3.3.2 Phenol đơn và acid phenolic

a. Một số hợp chất phenolic có khả năng kháng khuẩn

Catechol và pyrogallol là hai hợp chất hydroxyl hóa của phenol cho thấy là có

độc tính đối với vi sinh vật. Cơ chế được cho là nguyên nhân dẫn đến độc tính của

các hợp chất phenolic này đối với vi sinh vật bao gồm sự ức chế enzyme bởi các

hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua

sự tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein

Hợp chất phenolic có chứa một nhánh thế mà

có carbon ở trạng thái oxy hóa thấp không chứa

oxy được xếp vào nhóm tinh dầu và thường được

xem như là chất kháng khuẩn. Eugenol là đại diện

đặc trưng được tìm thấy trong dầu đinh hương.

Eugenol được xem là chất kìm hãm đồng thời Hình 1.9. Eugenol chống lại cả nấm sợi và vi khuẩn.

1.3.3.3 Flavonoid

a. Cơ chế kháng khuẩn

Đồ án tốt nghiệp

Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với

các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ưa béo càng có khả

năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật

Flavonoid có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có

mặt glucose.

Flavonoid ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho

thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được

Flavonoid gắn lên màng sinh chất của vi khuẩn, làm thay đổi tính thẩm thấu

chọn lọc của màng nguyên sinh chất

Ức chế tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn

Có tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của vi khuẩn

b. Một số hợp chất flavonoid kháng khuẩn điển hình

Trong trà xanh có catechine, catechine vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio

cholerae, ức chế enzyme glucosyltransferase của Streptococcus mutans, ức chế hoạt

động của Shigella và một số vi khuẩn, vi nấm khác

Một số flavonoid như quercetin, hesperetin và catechine có thể chống lại

virus type 1 (HSV – 1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh

khó thở ở trẻ

Galangin (3,5,7 – trihydroxylflavone) được chiết xuất từ cây thảo mộc sống

lâu năm Helichrysum aureonitens có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram (+) củng

như nấm sợi và virus, đặc biệt là HSV – 1 và coxsackie B type - 1

1.3.3.4 Tannin

a. Cơ chế kháng khuẩn

Là những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị chát được phát hiện

dương tính với “thí nghiệm thuộc da” và được định lượng dựa trên mức độ hấp phụ

của bột da sống chuẩn.

Nhiều hoạt động sinh lý của con người, chẳng hạn như sự kích thích của thực

bào các tế bào và chống nhiễm khuẩn tại nhiều cơ quan trong cơ thể được thực hiện

bởi các hợp chất của tannin.

Đồ án tốt nghiệp

Một trong những tính chất rất đặc trưng của tannin là tạo phức với các

protein thông qua các liên kết không đặc hiệu như liên kết hydro và các liên kết

cộng hóa trị.. Khi liên kết với protein chúng có thể làm mất hoạt tính của các

protein chức năng. Các protein này có thể là enzyme, các protein vận chuyển hay

thành tế bào polypeptide…

Tannin có thể gây độc cho nấm sợi, nấm men và vi khuẩn

1.3.3.5 Các hợp chất quinone

a. Cơ chế kháng khuẩn

Quinone là những vòng thơm với hai nhóm thế ketone

Chúng tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có phản ứng đặc trưng cao. Những

hợp chất này là những hợp chất màu, là nguyên nhân của những phản ứng hóa nâu ở

bề mặt cắt hoặc vết thương của rau trái và là hợp chất trung gian trong con đường

tổng hợp melanine ở da người.

Quinone gây sự bất hoạt và làm mất chức năng của protein do hình thành

phức không phục hồi với các acid amin của vi khuẩn

Hoạt tính chống chảy máu của chúng là do sự dễ dàng bị oxy hóa của chúng

ở các mô trong cơ thể. Các amino acid cũng có thể tạo thành quione khi có enzyme

xúc tác, chẳng hạn như polyphenoloxydase.

Ngoài ra nó còn là nguồn cung cấp các gốc tự do ổn định, quinones được biết

là có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân trong protein,

thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Vì lí do đó khả năng

kháng khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt

tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Quinone cũng tạo ra

chất nền không thể sử dụng được cho các vi sinh vật

b. Một số hợp chất quinone kháng khuẩn điển hình

Cây óc chó có tác dụng kháng khuẩn: Candida mycoderma, B. Subtills,

Hansenula anomala, Botrys cinerea… và nhiều loài nấm mốc, chữa herpes sinh

dục, trị ho, viêm phế quản.

Đồ án tốt nghiệp

Cây bạch hoa xà: S.aureus, Streptococus pyogenes, Pneumococus, E. coli…

Có tác dụng chữa các bệnh ngoài da, những vết loét, vết thương.

Một số loài thuộc họ Gọng vó có thể kháng Mycobacterium tuberculosis. Tác

dụng chữa ho, chống co thắt.

Cây lá móng kháng nhóm vi khuẩn: Staphylococus, Streptococus, Brucella

và Salmonella…có tác dụng chữa lở loét, hắc lào, ho, viêm khí quản.

1.3.3.6 Terpenoid và tinh dầu

a. Cơ chế kháng khuẩn

Terpen: chất chuyển hóa thứ cấp dựa trên đơn vị isopren

Khi các hợp chất có chứa các thành phần bố sung, thường oxi, nó được gọi là

terpenoid

Tinh dầu thuộc nhóm chất izoprenoid, là sản phẩm trao đổi chất bậc hai

Về bản chất hóa học tinh dầu thường là hỗn hợp các chức khác nhau:

hydrocarbon, rượu, phenol, aldehyde, acid, este,... Tuy nhiên quan trọng và thường

gặp hơn cả trong hợp phần của tinh dầu là terpen và các dẫn xuất chứa oxy của

terpen.

Cơ chế tác động của terpen chưa được khẳng định rõ ràng, nhưng được suy

đoán là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic.

b. Một số terpenoid và tinh dầu có tính kháng khuẩn điển hình

Cây thanh hao hoa vàng: Artemisin là một secquiterpen chiết xuất từ cây

thanh hao hoa vàng (Artemisia annua) có hoạt tính kháng sốt rét mạnh, hoạt chất

này đã được nghiên cứu và phân lập từ những năm 70.

Tinh dầu từ các loài sả - Andropogon spp. có tác dụng kháng khuẩn chủ yếu

lên vi khuẩn Gram âm. Tác dụng của tinh dầu sả tỉ lệ với hàm lượng citral

Tinh dầu từ cây bạch đàn – Eucalyptus globulus có tác dụng lên Bacillus

subtilis và Staphylococcus aureus nhưng kém tác dụng với E.coli. Cineol trong tinh

dầu là thành phần có tác dụng

Menthol có trong tinh dầu bạc hà có tác dụng chọn lọc trên một số chủng

Brucella

Đồ án tốt nghiệp

1.3.3.7 Saponin

Là nguyên liệu đầu tổng hợp các hormone steroid. Chủ yếu là kháng dầu và

kháng nấm.

a. Cơ chế kháng khuẩn của saponin:

Saponin, chủ yếu là asiaticoside có tác dụng lên Mycobacterium leprae, do

asiaticoside làm tan màng sáp của vi khuẩn.

Nhiều saponin thuộc nhóm spirostan, nhóm spirosolan, solanidan và olean đã

được nghiên cứu, có tác dụng chủ yếu là kháng nấm.

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học saponin

b. Một số saponin có khả năng kháng khuẩn điển hình

Tomatin có trong cây cà chua nhiều nhất ở lá: hạt không có. Tomatin ức chế

nhiều loại nấm gây bệnh ở người. Tomatin còn ức chế nấm gây bệnh cà chua –

Fusarium oxysporum f. lycopersici, một số nấm mốc khác như Aspergillus niger,

Penicillium notatum và một số vi khuẩn: Staph. aureus, Bacillus cerus, B.

mycoides, B. subtilis, E. coli.

Parillin có tác dụng kháng Candida albicans, Trichoderma mentagrophytes,

Aspergillus niger

Cyclamin, Primulasaponin (nhóm olean) ngoài tác dụng kháng nấm còn có

tác dụng lên vi khuẩn Staph. aureus, E. coli.

Một số saponin còn có tác dụng ức chế virus cúm type A trên thực nghiệm.

Saponin của cam thảo có tác dụng mạnh nhất

1.2.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt

Nam

1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới

- Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt

khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hóa học Chester J. Cavallito đã phân tích được hợp

chất Alicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh. Một nghiên cứu khác tại

Đồ án tốt nghiệp

Brazil năm 1982 đã chứng minh nước tinh chất từ tỏi có thể chữa được nhiều bệnh

nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn, nhất là loại Salmonella (Nguyễn Thị

Vân Thái, 2003)

- Vào năm 1967, Binz đã chứng minh được quinin rất độc với Paramecium. Quinin

ở nồng độ 1/20000 làm suy yếu hoạt lực của Paramecium để điều trị các bệnh do

Paramecium gây ra (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003)

- Năm 1928, B. P. Tokin đã chứng minh nhiều chất bay hơi từ cây xanh có tác dụng

đối với vi khuẩn được gọi là Phytocid. Gries (1943), Largralge (1956) chiết xuất từ

cây Hồ Đào (Juglals ligra – Juglandaceae) được chất Juglon, đây là một dẫn xuất

Natoquinon, chất này có tác dụng với nhiều loại nấm và vi khuẩn nha bào. Năm

1959 Horak, Santavi chiết xuất từ cây Cannabit sativa thuộc họ Cannabinnaceae

được chất Cannabiriolic có tác dụng với vi khuẩn lao ở người và một số vi khuẩn

Gram (+), đặc biệt là vi khuẩn kháng lại Penicilin (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003)

- Năm 1997 tại Thái Lan, Satapon Direkbusarakom và cộng sự đã thử nghiệm thành

công khả năng kháng khuẩn của các loài cây thảo dược như: O.sanctum, C.alata,

Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava,

Clinacanhus nutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus

reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus, và P.urinaria đối với Vibrio

spp. Tuy nhiên, chỉ có hai cây Momordica charatina và Psidium guajava có hiệu

quả ức chế đối với Vibrio spp. (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003)

- Năm 2007, J.R. Soberón và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt chất kháng khuẩn của

chiết xuất từ 12 cây vùng Argentina và chiết xuất Tripodanthus acutifolius có khả

năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn. (Soberón J.R. và ctv, 2007)

- Năm 2011, Firdaus Jahan và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động kháng khuẩn của

chiết xuất từ lá của cây Syzygium cumini (Jamun), Lawsonia inermis (Mehndi),

Zizyphus mauritiana (Ber), Ocimum sanctum (Tulsi) and Ficus religiosa (Peepal)

chống lại chủng Staphylococcus aureus (Firdaus Jahan và ctv, 2011)

Đồ án tốt nghiệp

- Năm 2011, Naveed Ahmad và cộng sự đã nghiên cứu về sự chống oxi hóa và

kháng khuẩn của chiết xuất từ lá và hoa của cây Calotropis procera bằng nhiều loại

dung môi khác nhau (Võ Văn Chi, 2000)

1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn từ thực vật ở Việt Nam

- Năm 1959, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc có tác

dụng kháng khuẩn mạnh. Năm 1959, Nguyễn Văn Hưởng cùng cộng sự đưa ra chế

phẩm Tô Mộc trị tiêu chảy sau khi nghiên cứu trên 1000 cây thuốc về tính kháng

khuẩn (Võ Văn Chi, 1997, 2000)

- Năm 2012, Trần Ngọc Hùng và Trương Thị Thành Vinh đã nghiên cứu bước đầu

trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy dịch ép nguyên chất từ cây cỏ mực

(Eclipta prostrata L) có tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Streptococus spp (Đỗ

Tấn Lợi, 1968)

- Qua 20 năm nghiên cứu theo dõi trên động vật và người (1987 - 2007) tập thể của

các cán bộ khoa học của Học Viện Quân Y, Viện Lão Khoa, Viện Quân Y 103,

Bệnh Viện Lao Và Bệnh Phổi TW, Bệnh Viện Xanh Pôn, Bệnh Viện U Bướu Hà

Nội,.. đã chiết xuất thành công Cao toàn phần của loài Azolla microphylla có tên là

Phylamin được thương mại hóa dưới tên “Mediphylamin”

- Năm 2011, Nguyễn Thị Thu Hương đã nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của

cao chiết từ tỏi (Allium Sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở người (Nguyễn

Thị Thu Hương, 2011)

1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration _MIC)

1.4.1 Khái niệm, ý nghĩa MIC

1.4.1.1 Khái niệm

Nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration - MIC) là nồng độ

thấp nhất của chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật

sau khoảng 24 giờ nuôi cấy. (Andrews, 2011)

1.4.1.2 Ý nghĩa

Nồng độ ức chế tối thiểu rất quan trọng trong việc xác nhận sự đề kháng của vi

khuẩn đối với một tác nhân kháng khuẩn và cũng để theo dõi hoạt động của các tác

Đồ án tốt nghiệp

nhân kháng khuẩn mới. MIC thường được coi là các đo lường trong phòng thí

nghiệm cơ bản nhất của các hoạt động của một tác nhân kháng khuẩn chống lại một

chủng vi sinh vật

Nồng độ ức chế tối thiểu về mặt lâm sàng được sử dụng không chỉ để xác định

lượng thuốc mà bệnh nhân sẽ nhận được, do đó hạn chế khả năng kháng thuốc của

vi khuẩn

Chỉ số MIC có tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn chất diệt khuẩn phù

hợp với từng loại vi sinh vật...Việc loại trừ sạch vi khuẩn có thể dự đoán dựa vào dữ

liệu MIC. Chọn được nồng độ tối ưu để làm chậm sự phát triển của vi khuẩn kháng

thuốc.

Ngoài ra còn có ý nghĩa về:

+ Dược động học (pharmacokinetics = PK): là sự thay đổi nồng độ của chất diệt

khuẩn thay đổi theo thời gian.

+ Dược lực học (pharmacodynamics = PD) : là mối quan hệ giữa nồng độ với

hiệu quả của một chất diệt khuẩn trên vi sinh vật gây bệnh

1.4.3 Sơ lược về một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Các phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu được phân loại thành 3 nhóm

chính: khuếch tán, pha loãng và phương pháp bioautographic.

1.4.3.1 Phương pháp khuếch tán trên thạch (agar-diffusion methods)

Trong kỹ thuật khuếch tán, một giếng chứa các hợp chất thử nghiệm ở một

nồng độ nhất định được đưa vào tiếp xúc với một môi trường đã cấy vi sinh vật và

đường kính ức chế xuất hiện xung quanh các giếng chứa được đo tại đầu và cuối

trong thời gian ủ vi sinh vật. Ở phương pháp này, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

được định nghĩa là nồng độ thấp nhất có thể ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật

có thể nhìn thấy. Các phương pháp được sử dụng phổ biến như phương pháp đĩa

giấy khuếch tán hoặc khuếch tán qua giếng thạch.

Phương pháp khuếch tán không thích hợp để thực hiện trên mẫu không phân

cực hoặc các mẫu không thể khuếch tán vào môi trường thạch (Paul Cos và ctv,

2006)

Đồ án tốt nghiệp

1.4.3.2 Phương pháp pha loãng (dilution methods)

Trong phương pháp pha loãng, các hợp chất thử nghiệm được thêm vào môi

trường thích hợp đã được bổ sung vi sinh vật. Phương pháp thường được sử dụng

phổ biến là pha loãng trong môi trường lỏng, so độ đục và dựa vào chất oxi hóa

khử. Độ đục có thể được ước tính một cách trực quan hoặc xác định chính xác hơn

bằng cách đo mật độ quang ở 405 nm. Tuy nhiên, không phải mẫu thử nghiệm nào

củng hòa tan hoàn toàn vào môi trường, nên sẽ gây ảnh hưởng đến độ đục, vì vậy

cần phải thực hiện đối chứng âm và dương để so sánh với kết quả thí nghiệm.

Hiện nay các chất oxi hóa khử MTT và resazurin thường được sử dụng để

xác định số lượng vi khuẩn (Eloff, 1998; Gabrielson và ctv, 2002) và phát triển của

nấm (Jahn và ctv, 1995; Pelloux-Prayeret và ctv, 1998). Resazurin có lợi thế không

kết tủa khi cho vào môi trường, cho phép đọc trực tiếp, dễ thực hiện.

Phương pháp pha loãng phương pháp pha loãng thích hợp cho khảo nghiệm

chiết xuất hoặc hợp chất phân cực và không phân cực để xác định giá trị MIC và

MBC/MFC. (Paul Cos và ctv, 2006)

1.4.4 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thực vật

1.4.4.1 Tình hình nghiên cứu MIC trên thế giới

Năm 2005, Mullika đã tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối

thiểu của 19 loại thảo dược lên hai loài vi khuẩn Probionibacterium acnes và

Staphylococcus epidermidis bằng phương pháp thạch. Kết quả cho thấy 13 loại

thuốc thảo dược có ảnh hưởng đến sự phát triển của hai loài vi khuẩn trên môi

trường thạch. Trong đó, Garcinia mangostana là thuốc có tác dụng mạnh nhất, với

giá trị MIC nhỏ nhất (39 ppm). Điều đặc biệt là giá trị MIC của thảo dược này trên

cả hai loài vi khuẩn thì bằng nhau. (Mullika và ctv, 2005).

Năm 2007, Kumar cũng tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối

thiểu của thảo dược lên hai loài vi khuẩn Probionibacterium acnes và

Staphylococcus epidermidis, với 12 loại thuốc thảo dược hemidesmus indicus,

eclipta alba, coscinium fenestratum, curcubito pepo, tephrosia purpurea, mentha

piperita, pongamia pinnata, symplocos racemosa, euphorbia hirta, tinospora

Đồ án tốt nghiệp

cordyfolia, thespesia populnea, jasminum officinale. Qua phương pháp thạch có 7

loại thuốc cho kết quả ức chế sự phát triển của hai loài vi khuẩn này trên môi trường

thạch. Và qua phương pháp pha loãng xác định được nồng độ ức chế của Coscinium

fenestratum trên hai loài vi khuẩn này bằng nhau và nhỏ nhất. Giá trị MIC trên hai

loài vi khuẩn là 49ppm. (Kumar và ctv, 2007)

Chiết suất methanol và acetone từ nhiều cây nấm có tác dụng trên vi khuẩn

baccilus cereus, Staphylococcus aureus, listeria monocitogenes, Escherichia coli,

salmonella infantis. Qua phương pháp pha loãng xác định được khoảng giá trị MIC

của các chiết suất này từ165 – 2640 mg/ml. B.cereus nhạy với hầu hết các chiết suất

từ cinnamomumcassia, azadirachta indica, ruta graveolén, rumex nervosus với

khoảng MIC từ 165 – 660 mg/ml. Chiết suất từ Cinnamomum cassia chỉ có hiệu

quả trên vi khuẩn E.coli, S. infantis ở giá trị MIC cao nhất (2640 mg/ml) (Mohan

& ctv, 2004)

Năm 2005, thí nghiệm kiểm tra tác dụng của ethyl acetate và n-butanol chiết

suất từ vỏ quả Punica granatum lên E. coli O157:H7, E. coli O26:H11, E. coli

O111:NM và E.coli O22 bằng phương pháp thạch. Xác định được giá trị MIC của

cả hai chiết suất này lên E. coli O157:H7 là nhỏ nhất (50 ppm). Giá trị MIC của

ethyl acetate chiết suất từ Centaurealên vi khuẩn Staphylococcus aureus là 62,5

ppm, thấp hơn so với giá trị MIC của chloramphenicol (125 ppm), nghĩa là ethyl

acetate có tác dụng mạnh hơn chloramphenicol lên vi khuẩn Staphylococcus aureus

(Kiymet & ctv, 2005)

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học –

Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM.

2.1.2 Địa điểm thu mẫu

Nguồn mẫu được thu tại Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

2.1.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 5/2015 đến tháng 8/2015

2.2.Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu

Toàn bộ mẫu cây Medinilla sp. gồm lá, thân, cành

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị

Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 16 chủng vi khuẩn được

cung cấp bởi Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh – Khoa sinh học

- Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium,

bao gồm:

- Nhóm vi khuẩn Escherichia coli gồm E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. coli

S. dublin.

- Nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm Shi. sonnei, Shi. boydii, Shi. flexneri.

- Các vi khuẩn gây bệnh khác: L. monocytogenes, L. innocua, Enterococcus

O157:H7

feacalis, Staphylococcus aureus.

Và nhóm vi khuẩn Vibiro: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. Harveyi.

V. cholerae được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II

2.2.3 Môi trường

2.2.3.1 Hóa chất

Resazurin

NaCl

Đồ án tốt nghiệp

Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Ðộ).

Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Ðộ).

DMSO – Dimethyl Sulfoxide

Glycerol.

2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị

a. Dụng cụ

Ống nghiệm Dụng cụ đục lỗ

Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml Thước đo

Ống đong 100 ml Bông thấm và bông không thấm

Pipet 1ml, 10 ml nước

Ống ly tâm ependoff 2 ml Ðũa thuỷ tinh

Bình môi trường 250 ml, 500 Các loại đầu típ

ml, 1000 ml Micropipette 100 µl, 1000 µl

Dây cấy ria, que cấy trang Các loại dụng cụ khác như: bao chịu

Đèn cồn nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp,

Đĩa petri muỗng, dao, thun,...

b. Thiết bị

Máy đo UV – VIS (Hach)

Autoclave (Huxky Ðài Loan) Tủ ấm 300C, 370C (Memmert Đức) Cân phân tích (Orbital Đức)

Máy ly tâm (Tuttligen Đức) Bếp từ (Billy – Anh)

Máy đo pH (Hach – Đức) Máy nước cất (Branstead USA)

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp thu và tách chiết các hợp chất từ thực vật

Mục đích: Tách chiết các hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật

nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về sau.

Nguyên tắc: Sử dụng các loại dụng môi để tách chiết các hợp chất có trong

cây thuốc nhờ lực liên kết hóa học nhờ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi

mẫu cây thuốc.

Đồ án tốt nghiệp

Phương pháp: Mẫu cây thuốc tươi được rửa sạch để lại bỏ bụi bẩn rồi đem đi

phơi khô rồi nghiền thành dạng bột. Bột cây thuốc sẽ được ngâm với dung môi

trong 24 giờ để trích ly hợp chất, sau đó lọc lấy dịch lọc. Bã đem ngâm lại với dung

môi, lặp lại từ 3 đến 5 lần cho đến khi dịch lọc trong. Dịch lọc sẽ được loại bỏ dung

môi để giữ lại phần cao chiết bằng cách cô quay chân không ở nhiệt độ nhỏ hơn 500C hoặc cô cách thủy ở nhiệt độ 700C. Cao chiết thu được sẽ được bảo quản ở nhiệt độ -40C (Atta và Mouneir, 2004)

2.3.2. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị

Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường

vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đây cũng là bước đầu giúp thu

sinh khối vi khuẩn nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh

dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh

dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh

vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi

chất giữa vi sinh vật và môi trường.

Phương pháp: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi

khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh

bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB. Sau đó

tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi

khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013).

2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật

được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 50C) để bảo quản.

Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật

luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhóm vi sinh

Đồ án tốt nghiệp

vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa

là 3 tháng cấy chuyển một lần.

Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy

chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).

2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng,

có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ

trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là

việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước

trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn

chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol.

Phương pháp: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích

hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và

thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).

2.3.4. Phương pháp pha loãng vi sinh vật

Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có

vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở

các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân

tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử

dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh

vật trong mẫu.

Phương pháp: Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào

ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho

đến khi được nồng độ cần thiết.

Đồ án tốt nghiệp

Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10 gram mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu

lỏng. (Phạm Minh Nhựt, 2013).

2.3.5 Phương pháp xác định mật độ tế bào

Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland):

Mật độ = OD600 x 1,02 x 109 (cfu/ml)

2.3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol bằng phương pháp

khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) (Sen và Batra, 2012)

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng trực tiếp của chất

kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị trên môi trường nuôi cấy. Chất kháng khuẩn có

khả năng khuếch tán trong môi trường agar và tác động lên vi khuẩn chỉ thị. Nếu

chất kháng khuẩn kháng được vi khuẩn chỉ thị thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn

xung quanh giếng thạch.

Phương pháp: Vi khuẩn được tăng sinh và pha loãng để đạt nồng độ 106

cfu/ml. Sau đó cấy trang vi khuẩn trên môi trường TSA. Dùng ống thép không gỉ

(đường kính 6 mm) tiến hành đục lỗ thạch. Nhỏ cao đã pha loãng với nồng độ cần khảo sát vào các giếng trên đĩa. Sau đó đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ 370C trong 24

giờ cho vi khuẩn chỉ thị phát triển. Sau 24 giờ, tiến hành đo đường kính vòng kháng

khuẩn quanh miệng giếng trên đĩa -> Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch cao

đối với các vi khuẩn chỉ thị.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) đối với chủng Escherichia

coli O157 :H7

2.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường lỏng

bổ sung chất chỉ thị resazurin (broth dilution resazurin method) (Banfi và ctv,

2003)

Nguyên tắc: Dựa trên sự thay đổi màu của resazurin theo thời gian phụ thuộc

vào sự hoạt động của vi sinh vật, điều đó có nghĩa là phản ứng với resazurin cho ta

biết mức độ hoạt động của vi sinh vật hơn là số lượng của chúng.

Phương pháp: Chuẩn bị dung dịch resazurin bằng cách hòa tan một viên

resazurin vào 50 ml nước cất vô trùng.

Chuẩn bị ống nghiệm vô trùng. Thêm cao pha loãng với nồng độ khảo sát và vi khuẩn đã được tăng sinh và pha loãng (106 cfu/ml) vào ống nghiệm đã được bổ sung môi trường TSB. Sau đó đem các ống nghiệm ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ

cho vi khuẩn chỉ thị phát triển. Sau 24 giờ, thêm vào các ống nghiệm chất chỉ thị

resazurin. Sự thay đổi màu sắc được đánh giá trực quan, bất kỳ thay đổi màu sắc từ

tím sang màu hồng hoặc mất màu được ghi nhận là dương tính với sự hoạt động của

vi sinh vật trong ống nghiệm. Nồng độ thấp nhất mà tại đó sự thay đổi màu xảy ra

được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.2. Sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị resazurin

2.3.8 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp đĩa giấy

khuếch tán (disc diffusion method) (Ahmad, 2011)

Nguyên tắc: Đĩa giấy sẽ hấp thu nước từ môi trường thạch, dịch cao hòa tan

và bắt đầu khuếch tán vào thạch có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ

nhạy cảm của vi khuẩn với dịch cao được biểu hiện bằng đường kính các vùng ức

chế xung quanh khoanh giấy.

Phương pháp: Vi khuẩn được tăng sinh và pha loãng để đạt nồng độ 106

cfu/ml. Sau đó cấy trang vi khuẩn trên môi trường TSA. Đặt các khoanh giấy (d =

6mm) lên mặt thạch, sau đó nhỏ dịch cao đã pha loãng với nồng độ (100mg/ml;

50mg/ml; 25mg/ml; 12,5mg/ml) vào các đĩa. Sau đó đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ cho vi khuẩn chỉ thị phát triển. Sau 24 giờ, tiến hành đo đường

kính vùng ức chế -> Nồng độ thấp nhất xuất hiện vùng ức chế được xác định là giá

trị MIC (Anja Klancnik, 2010)

Đồ án tốt nghiệp

100mg/ml 50mg/ml

Hình 2.3. Đường kính vùng ức chế của cao chiết Medinilla sp. đối với chủng Shi.

sonnei

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm

Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. So sánh thống

kê bằng phương pháp One way – ANOVA ở mức tin cậy 95%

2.4 Bố trí thí nghiệm

Tiến trình thí nghiệm tổng quát được trình bày ở hình 2.4

Đồ án tốt nghiệp

Mẫu cây Medinilla sp.

Xử lý mẫu

Cao thuốc

Xác định hoạt tính kháng khuẩn

Xác định giá trị MIC của cao ethanol trên các chủng vi sinh vật

Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (disc diffusion assay)

Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion assay ) [3.1] Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung resazurin (broth dilution resazurin method) [3.2] Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

2.4.1 Thí nghiệm 1: Tách chiết cao ethanol từ cây Medinilla sp.

2.4.1.1 Sơ đồ tách chiết

Mẫu cây Medinilla sp.

Phơi khô, xay nhuyễn

Tỷ lệ 1:20 (w/v)

Ngâm ethanol 70%

Bã Lọc tinh

Cô cách thủy 70 C

Cao Medinilla sp.

Hình 2.5. Quy trình tách chiết cao ethanol 70%

Đồ án tốt nghiệp

2.4.1.2 Thuyết minh quy trình

Mẫu cây Medinilla sp. tươi được rửa sạch để loại bỏ bụi bẩn và đem đi phơi

khô. Cây khi đã khô được đem xay thành dạng bột. Sau đó tiến hành cân 5g bột cây

và ngâm trong 100ml ethanol 70% theo tỷ lệ 1 : 20 (w/v) ở nhiệt độ phòng trong 24

giờ. Sau 24 giờ, tiến hành lọc tinh thu lấy dịch lọc. Bã được ngâm tiếp với dung môi

từ 3-5 lần cho đến khi màu sắc dịch lọc không thay đổi.

Tất cả các dịch lọc thu được qua các lần ngâm được hòa trộn và đem đi cô cách thủy ở 700C cho đến khi đuổi hết dung môi, ta thu được cao chiết ethanol 70%. Cao chiết được bảo quản lạnh ở nhiệt độ 40C để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp

theo.

Hình 2.6. Dịch lọc mẫu ethanol 70%

2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol 70% từ cây

Medinilla sp. bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion

assay)

Đồ án tốt nghiệp

DMSO 1%

Vi sinh vật chỉ thị Môi trường TSA Cao ethanol 70%

Tăng sinh Đổ đĩa

Dịch cao nồng độ 100mg/ml

Đục lỗ thạch (d=6mm) Đo OD600nm

Pha loãng để đạt nồng 6 Nhỏ 100 μl cao pha loãng vào các giếng độ 10 cfu/ml

Hút 100 µl cấy trang

Ủ 370C trong 24 giờ

Hình 2.7. Quy trình xác định hoạt tính kháng khuẩn

Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml môi trường TSB

(hoặc TSB + 1.5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đó nuôi cấy ở 150

vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 giờ. Tiến hành đo dịch tăng sinh ở bước sóng 600nm đê xác định mật độ. Sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng để đạt mật độ 106

CFU/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn đã pha loãng nhỏ lên mặt đĩa môi trường thạch

TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô hoàn toàn. Các đĩa thạch

sau đó được đục 3 lỗ đường kính với mỗi lỗ là 6mm.

Cao chiết Medinilla sp. được pha trong DMSO 1% ở nồng độ 100 mg/ml. Hút

100μl dịch cao chiết và nhỏ vào các giếng trong đĩa môi trường TSA đã được đục lỗ trước đó. Đem ủ ở 370C trong vòng 24 giờ. Đối chứng âm sử dụng DMSO 1%, đối

chứng dương sử dụng Ciprofoxacin ở nồng độ 500 µg/ml. Mỗi nghiệm thức lặp lại

3 lần.

Quan sát: Sau 24 giờ, nếu lỗ nào có vòng kháng khuẩn xung quanh, chứng tỏ

cao ethanol 70% có kháng chủng vi khuẩn đó. Từ kết quả kháng khuẩn đó, sử dụng

cao ethanol 70% tiếp tục làm thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

2.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu quy trình xác định chỉ sô MIC của cao chiết

ethanol 70% từ cây Medinilla sp.

Đồ án tốt nghiệp

Kết thúc thí nghiệm 2, xác định được cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn với

chủng nào và cao chiết này được sử dụng để xác định chỉ số MIC đối với các chủng

đối kháng. Tiến trình khảo sát chỉ số MIC được trình bày ở hình 2.8, hình 2.9 và

hình 2.10

2.4.3.1 Thí nghiệm 3.1 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

Vi sinh vật chỉ thị Môi trường TSA Cao ethanol 70%

100 µl

Cấy trang

Tăng sinh Đổ đĩa

Đục lỗ thạch (d=6mm) Đo OD600nm Pha loãng bằng DMSO 1% thành dãy nhiều nồng độ theo cấp số 2

0 Ủ 37

Pha loãng để đạt nồng 6 Nhỏ 100μl cao pha loãng vào các giếng độ 10 cfu/ml

C trong 24 giờ

Đọc kết quả

Hình 2.8. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml môi trường TSB

(hoặc TSB + 1,5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đó nuôi cấy ở 150

CFU/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn đã pha loãng nhỏ lên mặt đĩa môi trường thạch

TSA, tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô hoàn toàn. Các đĩa thạch

sau đó được đục 3 lỗ đường kính với mỗi lỗ là 6mm.

Đồ án tốt nghiệp

Cao Medinilla sp. được pha loãng liên tiếp trong DMSO 1% thành dãy nhiều

nồng độ theo cấp số 2: 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml. Mỗi nghiệm

thức lặp lại 3 lần

Quan sát: Sau 24 giờ, kiểm tra sự tạo vòng kháng. MIC được xác định là

nồng độ thấp nhất của dịch cao ethanol có sự xuất hiện vùng ức chế xung quang

miệng giếng.

2.4.3.2 Thí nghiệm 3.2 Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung chất

chỉ thị resazurin

Cao ethanol 70% VSV chỉ thị Ống nghiệm vô trùng

Môi trường TSB Tăng sinh

Tỷ lệ 1:3 (v/v)

Pha loãng bằng DMSO 1% thành dãy nhiều nồng độ theo cấp số 2 Đo OD600nm Ủ 370C trong 24 giờ

6 10

Pha loãng để đạt nồng độ

cfu/ml Thêm resazurin (tỷ lệ 1:10 (v/v))

Quan sát sự thay đổi màu sắc

Xác định MIC

Hình 2.9. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp pha loãng trên môi trường

lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin

Cao Medinilla sp. được pha loãng liên tiếp trong DMSO 1% thành dãy nhiều

nồng độ theo cấp số 2: 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml. Mỗi nghiệm

thức lặp lại 3 lần

Đồ án tốt nghiệp

Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml môi trường TSB (hoặc

TSB + 1,5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đó nuôi cấy ở 150 vòng/phút ở

nhiệt độ phòng trong 18 giờ. Tiến hành đo dịch tăng sinh ở bước sóng 600nm đê xác định mật độ. Sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng để đạt mật độ 106 CFU/ml.

Từ dịch tăng sinh, hút 1ml vi khuẩn vào ống nước muối sinh lý 9 ml, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1.Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp một thể tích vi

khuẩn được tính theo công thức Mc Farland vào các ống nghiệm (chứa 3ml môi

trường TSB và 1ml dịch cao chiết ở các nồng độ). Ủ tất cả các ống nghiệm trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Đối chứng âm sử dụng ống nghiệm chứa 3ml môi trường

TSB bổ sung dịch vi khuẩn. Đối chứng dương sử dụng ống nghiệm chứa 3ml môi

trường TSB bổ sung dịch cao chiết ở các nồng độ. Sau 24 giờ, bổ sung chất chỉ thị

resazurin theo tỷ lệ 1:10 (v/v)

Quan sát: Sự thay đổi màu sắc trong ống nghiệm so với đối chứng âm. Nồng độ

thấp nhất mà tại đó sự thay đổi màu sắc từ tím sang màu hồng hoặc mất màu xảy ra

được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) (Banfi và ctv, 2003)

2.4.3.3 Thí nghiệm 3.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán

Đĩa giấy lọc (d=6mm) Môi trường TSA Vi sinh vật

Tăng sinh Hấp tiệt trùng Đổ đĩa

Đặt đĩa giấy Đo OD600nm

Cấy trang 100µl

Pha loãng để đạt Cao ethanol 70% pha loãng bằng DMSO 1% thành dãy nhiều nồng độ theo cấp số 2 nồng độ 106 cfu/ml Nhỏ 10µl lên các đĩa giấy

Ủ 370C trong 24 giờ

Đọc kết quả

Hình 2.10. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán

Đồ án tốt nghiệp

Cao Medinilla sp. được pha loãng liên tiếp trong DMSO 1% thành dãy nhiều

nồng độ theo cấp số 2: 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12,5 mg/ml. Mỗi nghiệm

thức lặp lại 3 lần

Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai chứa 10 ml môi trường TSB

(hoặc TSB + 1,5% NaCl đối với các chủng Vibrio spp. Sau đó nuôi cấy ở 150

cfu/ml. Hút 0.1 ml dịch khuẩn đã pha loãng nhỏ lên mặt đĩa môi trường thạch TSA,

tiến hành trang dịch vi khuẩn trên đĩa cho tới khi khô hoàn toàn.

Đặt đĩa giấy đã hấp tiệt trùng (d = 6mm) lên mặt thạch. Sau đó nhỏ 10 µl dịch

cao chiết theo nồng độ lên đĩa giấy. Ủ ở 370C trong 24 giờ

Quan sát: Sau 24h, tiến hành đo đường kính vùng ức chế -> Nồng độ thấp nhất

xuất hiện vùng ức chế được xác định là giá trị MIC.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol từ cây Medinilla sp.

Cao ethanol từ cây Medinilla sp. được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng

phương pháp khuếch tán qua giếng thạch với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị với nồng

độ 100 mg/ml

3.1.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli

Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của cao ethanol 70% (MEE) ở nồng độ

100 mg/ml (MEE) và ciprofloxacin (500 µg/ml) đối với nhóm vi khuẩn E. coli được

)

m m ( ế h c c ứ g n ò v h n í k

g n ờ ư Đ

*Những giá trị trên cùng một chủng có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

trình bày ở Hình 3.1

Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của MEE (100mg/ml) và ciprofloxacin (500µg/ml) đối

với nhóm Escherichia coli

Dựa vào hình 3.1, chúng tôi nhận thấy rằng MEE ở nồng độ 100 mg/ml có

hoạt tính đối kháng với tất cả các chủng E. coli khảo sát với đường kính vùng ức

chế chế từ 12,5 mm đến 15 mm. Điều này chứng tỏ rằng, nhóm Escherchia coli

khảo sát nhạy cảm đối với MEE. Trong đó, MEE có khả năng ức chế mạnh đối với

chủng ETEC (đường kính vòng ức chế là 14,7 mm). So với kết quả kháng khuẩn

của ciprofloxacin (500 µg/ml) thì hoạt tính kháng khuẩn của MEE cũng khá tương

đồng. Đối với chủng E. coli O157 :H7, E. coli, hoạt tính kháng khuẩn của MEE

Đồ án tốt nghiệp

tương đồng với ciprofloxacin (500 µg/ml) và không có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê (P > 0,05). Đối với chủng E. coli 0208, hoạt tính kháng khuẩn của MEE

cao hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05) khi so với ciprofloxacin (500 µg/ml).

Nhưng đối với chủng ETEC, hoạt tính kháng của MEE lại thấp hơn một cách ý

nghĩa thống kê (P < 0,05) so với ciprofloxacin (500 µg/ml).

3.1.2 Đối với nhóm Salmonella

Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của MEE và ciprofloxacin (500 µg/ml)

*Những giá trị trên cùng một chủng có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. được trình bày ở Hình 3.2

Hình 3.2. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500 µg/ml) đối với nhóm

Salmonella spp.

Dựa vào hình 3.2, chúng tôi nhận thấy rằng đối với nhóm Salmonella spp.

MEE thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với 4/4 chủng khảo sát và vòng ức chế có

đường kính từ 13 mm đến 14 mm. Điều này chứng tỏ MEE có khả năng ức chế

tương đối mạnh đối với nhóm Salmonella spp.; Khi so sánh với khả năng ức chế các

chủng Salmonella spp. với ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml thì hoạt tính kháng

khuẩn của MEE có sự khác biệt về mặt thống kê. Đối với chủng S. enteritidis, hoạt

tính kháng khuẩn của MEE tương đương với ciprofloxacin (500 µg/ml) và không có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Tuy nhiên, đối với chủng S. dublin, S.

typhi và S. typhimurium, hoạt tính kháng khuẩn của MEE cao hơn một cách ý nghĩa

Đồ án tốt nghiệp

thống kê (P < 0,05) so với ciprofloxacin (500 µg/ml). Điều này chứng tỏ, MEE thể

hiện đặc tính kháng khuẩn mạnh và có hoạt tính tốt hơn kháng sinh đối với nhóm

Salmonella spp. ở một nồng độ khảo sát nhất định

3.1.3 Đối với nhóm Shigella spp.

Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của MEE và ciprofloxacin (500 µg/ml)

trên nhóm vi khuẩn Shigella spp. được trình bày ở hình 3.3

*Những giá trị trên cùng một chủng có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

Hình 3.3. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500 µg/ml) đối với nhóm

Shigella spp.

Dựa vào hình 3.3, chúng tôi nhận thấy MEE có khả năng đối kháng với tất cả

3 chủng trong nhóm Shigella spp. và đường kính vòng ức chế từ 13,7 mm đến 14,7

mm. khi so sánh với khả năng ức chế các chủng Shigella spp. với ciprofloxacin ở

nồng độ 500 µg/ml thì hoạt tính kháng khuẩn của MEE có sự khác biệt về mặt

thống kê. Đối với chủng Shi. flexneri và Shi. boydii, hoạt tính kháng khuẩn của

MEE cao hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với ciprofloxacin (500

µg/ml). Một điểm đặc biệt khi tiến hành khảo sát khả năng hoạt tính kháng khuẩn

của MEE ở nồng độ 100 mg/ml và ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml đối với

Shi.boydii là chủng này có khả năng kháng lại kháng sinh nhưng lại nhạy cảm với

Đồ án tốt nghiệp

MEE. Điều đó chứng tỏ MEE là loại cao chiết có hoạt tính sinh học rất tốt và có

tiềm năng trong việc ứng dụng để xử lý các nhóm vi khuẩn kháng kháng sinh.

3.1.4 Đối với nhóm Vibrio spp.

Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của MEE và ciprofloxacin (8 µg/ml)

*Những giá trị trên cùng một chủng có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

trên nhóm vi khuẩn Vibrio spp. được trình bày ở hình 3.4

Hình 3.4. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (8 µg/ml) đối với nhóm

Vibrio spp.

Dựa vào hình 3.4, chúng tôi nhận thấy rằng MEE ở nồng độ 100mg/ml có

hoạt tính đối kháng với tất cả các chủng Vibrio spp. khảo sát với đường kính vùng

ức chế từ 12,2 mm đến 14 mm. Khi so với khả năng ức chế các chủng Vibrio spp.

của ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml thì hoạt tính kháng khuẩn của MEE có sự

khác biệt về mặt thống kê. Đối với chủng V. cholerae, hoạt tính kháng khuẩn của

MEE tương đồng với ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml và không có sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Trên chủng V. parahaemolyticus, hoạt tính kháng

khuẩn của MEE cao hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với ciprofloxacin

(500 µg/ml) nhưng đối với chủng V. alginolyticus và V. harveryi thì ngược lại, hoạt

tính kháng của MEE lại thấp hơn một cách ý nghĩa thống kê (P < 0,05) khi so với

ciprofloxacin ở nồng độ 500µg/ml.

Đồ án tốt nghiệp

3.1.5 Đối với nhóm chủng vi sinh vật gây bệnh khác

Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của MEE và ciprofloxacin (8 µg/ml)

*Những giá trị trên cùng một chủng có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

trên các chủng vi sinh vật gây bệnh khác được trình bày ở hình 3.5

Hình 3.5. Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với các chủng

vi sinh vật gây bệnh khác

Dựa vào hình 3.5, chúng tôi nhận thấy MEE có khả năng đối kháng với tất cả

5 chủng vi sinh vật gây bệnh và đường kính vòng ức chế từ 13,8 mm đến 14,2 mm.

Khi so sánh với khả năng ức chế các chủng vi sinh vật gây bệnh khác của

ciprofloxacin (500 µg/ml) thì hoạt tính kháng khuẩn của MEE cao hơn một cách ý

nghĩa thống kê (P < 0,05). Điều này chứng tỏ rằng, MEE thể hiện đặc tính kháng

khuẩn mạnh và có hoạt tính tốt hơn kháng sinh đối với nhóm vi sinh vật gây bệnh

khác

Như vậy, kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol 70% từ cây

Medinilla sp. (MEE) ở nồng độ 100mg/ml đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị thuộc

5 nhóm được trình bày trong bảng 3.1.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.1. Kết quả đối kháng của MEE với 20 chủng vi sinh vật khảo sát

Chủng vi sinh vật Ethanol 70% Đối chứng

Escherichia coli O157:H7 13,3 ± 0,764 13,2 ± 0,289

Escherichia coli 0208 13,8 ± 0,289 12,3 ± 0,289

Escherichia coli 13,3 ± 0,764 13,2 ± 0,289

E.coli-ETEC 14,7 ± 0,577 31,0 ± 0,500

Listeria innocua 14,2 ± 0,289 12,0 ± 0,500

Listeria monocytogenes 13,8 ± 0,764 12,2 ± 0,289

Salmonella dublin 14,3 ± 0,764 12,2 ± 0,764

Salmonella enteritidis 13,3 ± 1,041 13,0 ± 0,500

Salmonella typhi 14,5 ± 0,000 12,5 ± 0,500

Salmonella typhimurium 13,8 ± 1,041 11,0 ± 0,000

Shigella boydii 14,7 ± 0,577 0,0 ± 0,000

Shigella flexneri 14,5 ± 0,500 13,2 ± 0,289

Shigella sonnei 13,7 ± 0,289 33,0 ± 0,500

Vibrio alginolyticus 14,0 ± 1,000 16,2 ± 0,289

Vibrio cholerae 12,5 ± 0,866 13,3 ± 0,577

Vibrio harveyi 13,8 ± 1,041 18,0 ± 0,500

Vibrio parahaemolyticus 12,2 ± 0,289 11,3 ± 0,289

Pseudomonas aeruginosa 13,8 ± 0,289 12,2 ± 0,577

Staphylococcus aureus 14,8 ± 0,289 12,2 ± 0,289

Vùng ức chế (mm) bao gồm đường kính của giếng (d = 6 mm) Cao ethanol 70% (100 mg/ml); Đối chứng : Ciprofloxacin (500µg/ml) đối với 16 chủng, ciprofloxacin (8µg/ml) đối với nhóm Vibrio spp.; Số liệu là trung bình của 3 lần lặp lại (trung bình ± SD).

Enterococcus feacalis 13,8 ± 0,764 12,0 ± 0,500

Dựa vào bảng 3.1, kết quả cho thấy MEE có phổ kháng khuẩn rất rộng. Ở

nồng độ 100 mg/ml, MEE có hoạt tính đối kháng với 20/20 chủng vi khuẩn khảo

sát. Song song với phổ kháng khuẩn rộng, MEE còn thể hiện hoạt tính kháng tương

đối cao với đường kính vòng ức chế từ 12,2 mm đến 14,8 mm. Trong đó, MEE thể

Đồ án tốt nghiệp

hiện hoạt tính mạnh nhất đối với chủng S. aureus (14,8mm) và thấp nhất là chủng

V. parahaemolyticus (12,2mm). Điều này chứng tỏ rằng bản thân cây Medinilla sp.

có rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học cao nói chung và có hoạt tính kháng

khuẩn nói riêng, đồng thời các hợp chất này hòa tan trong ethanol 70%. Do đó, khi

sử dụng ethanol 70% để tách chiết, đã thu được cao chiết có hoạt tính sinh học rất

tốt.

Theo nghiên cứu của Sen và Batra (2012), cao chiết từ cây Melia azedarach

L (1 mg/ml) thể hiện hoạt tính mạnh đối với chủng S.aureus và E.coli với đường

kính vòng ức chế lần lượt là 19,5mm và 19,6mm (đường kính giếng d = 6mm). Còn

trong nghiên cứu của Oskay (2009) đã tiến hành thử nghiệm khả năng đối kháng

của cao chiết từ 19 loài thực vật (4 mg/ml) trên chủng E. coli và được kết quả có

8/19 loài thực vật có khả năng kháng mạnh đối với E. coli với đường kính vòng ức

chế từ 8 mm đến 14 mm (đường kính giếng d = 6mm), 11/19 loài thực vật có đường

kính vòng ức chế là 6 mm. Từ kết quả của hai nghiên cứu trên, chúng tôi nhận thấy

được rằng cao chiết 70% từ cây Medinilla sp. (100mg/ml) có phổ kháng rộng,

kháng được nhiều chủng khảo sát, nhưng hoạt tính kháng khuẩn không cao, cần

phải sử dụng nồng độ lớn (100 mg/ml) để thể hiện tính đối kháng với các chủng vi

sinh vật.

Tuy nhiên, với mục tiêu khảo sát và chọn lựa quy trình phù hợp trong việc

xác định chỉ số MIC của cao chiết thì cao ethanol 70% của cây Medinilla sp. với

phổ kháng khuẩn rộng và hoạt tính kháng khuẩn tương đối tốt là đối tượng phù hợp

để tiến hành xây dựng. Do đó, chúng tôi sử dụng cao chiết ethanol 70% của cây

Medinilla sp. để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

3.2 Kết quả xác định chỉ số (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla

sp. (MEE)

Sau khi xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol, chúng tôi tiến

hành xác định quy trình phù hợp để xác định chỉ số MIC của cao chiết trên các

chủng đối kháng. Nồng độ khảo sát lần lượt là 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml,

12,5 mg/ml.

Đồ án tốt nghiệp

3.2.1 Xác định chỉ số MIC của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên

giếng thạch (WDA)

Kết quả xác định chỉ số MIC của cao chiết MEE thực hiện bằng phương

pháp khuếch tán trên giếng thạch được trình bày trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Chỉ số MIC của MEE đối với 20 chủng vi sinh vật khảo sát

STT Chủng Giá trị MIC (mg/ml)

1 50 Escherichia coli O157:H7

2 50 Escherichia coli 0208

3 12,5 Escherichia coli

4 12,5 E.coli-ETEC

5 25 Listeria innocua

6 25 Listeria monocytogenes

7 25 Salmonella dublin

8 25 Salmonella enteritidis

9 12,5 Salmonella typhi

10 25 Salmonella typhimurium

11 12,5 Shigella boydii

12 25 Shigella flexneri

13 25 Shigella sonnei

14 25 Vibrio alginolyticus

15 50 Vibrio cholerae

16 50 Vibrio harveyi

17 25 Vibrio parahaemolyticus

18 50 Pseudomonas aeruginosa

19 25 Staphylococcus aureus

20 Enterococcus feacalis 12,5

Qua bảng 3.2 chúng tôi nhận thấy rằng giá trị MIC của MEE đối với 20

chủng khảo sát biến động từ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml khi khảo sát bằng phương

pháp khuếch tán trên giếng thạch. Giá trị MIC của cao chiết ethanol của cây

Đồ án tốt nghiệp

Medinilla sp. khác nhau tùy theo từng chủng vi khuẩn khảo sát khi tiến hành bằng

phương pháp này.

Đối với nhóm E. coli, giá trị MIC của MEE biến thiên từ nồng độ 12,5

mg/ml đến 50 mg/ml, trong đó giá trị MIC thấp nhất đối với chủng E. coli và ETEC

là 12,5 mg/ml. Đối với nhóm Salmonella spp. và Shigella spp., giá trị MIC được

xác định từ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml trong đó giá trị MIC thấp nhất đối với hai

chủng S. typhii và Shi. boydii. Riêng đối với nhóm Vibrio spp., giá trị MIC của

MEE cao hơn 3 nhóm vi khuẩn trên, giá trị biến thiên từ 25 mg/ml đến 50 mg/ml.

Đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh khác, giá trị MIC của MEE có sự thay đổi khá lớn

giữa các chủng, trong đó nhạy cảm nhất là chủng Enterococcus feacalis ở nồng độ

12,5 mg/ml, còn chủng Pseudomonas aeruginosa thì phải đến nồng độ 50mg/ml

MEE mới thể hiện được hoạt tính ức chế.

Như vậy, kết quả khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của MEE bằng phương

pháp khuếch tán trên giếng thạch đối với 20 chủng vi sinh vật cho thấy rằng có 5/20

chủng vi khuẩn khảo sát bị ức chế bởi MEE ở nồng độ 50 mg/ml; 10/20 chủng khảo

sát bị ức chế ở nồng độ 25 mg/ml; 5/20 chủng bị ức chế ở nồng độ 12,5 mg/ml.

Điều này chứng tỏ rằng, giá trị MIC thấp nhất ức chế được vi sinh vật của cao

ethanol 70% là 12,5 mg/ml và cao nhất là 50 mg/ml khi đánh giá bằng phương pháp

khuếch tán trên giếng thạch.

Theo kết quả nghiên cứu của Klancnik và ctv (2010) khảo sát trên nhiều loại

chiết xuất từ cây hương thảo thương mại đã xác định được chỉ số MIC bằng phương

pháp khuếch tán trên giếng thạch đối với chủng Staphylococcus aureus từ 0,635

mg/ml đến >40 mg/ml. Còn trong nghiên cứu của Akinsulire (2007) giá trị MIC trên

chủng S. aures của chiết xuất lá từ cây Kalanchoe crenata là 256 mg/ml. Từ kết quả

của hai nghiên cứu trên, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

của cao ethanol 70% thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch cho

kết quả tương đối tốt.

3.2.2 Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin

(MDR)

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả chỉ số MIC thực hiện bằng phương pháp pha loãng trên môi trường

lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3. Chỉ số MIC trên 20 chủng vi sinh vật khảo sát bằng phương pháp MDR

STT Chủng MIC (mg/ml)

1 Escherichia coli O157:H7 25

2 Escherichia coli 0208 25

3 Escherichia coli 25

4 E.coli-ETEC 12,5

5 Listeria innocua 12,5

6 Listeria monocytogenes 25

7 Salmonella dublin 12,5

8 Salmonella enteritidis 25

9 Salmonella typhii 12,5

10 Salmonella typhimurium 25

11 Shigella boydii 12,5

12 Shigella flexneri 25

13 Shigella sonnei 25

14 Vibrio alginolyticus 25

15 Vibrio cholerae 25

16 Vibrio harveyi 25

17 Vibrio parahaemolyticus 25

18 Pseudomonas aeruginosa 25

19 Staphylococcus aureus 25

20 Enterococcus feacalis 25

Qua bảng 3.3 chúng tôi nhận thấy rằng giá trị MIC của MEE đối với 20

chủng khảo sát biến động từ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml khi khảo sát bằng phương

pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin.

Đối với nhóm E. coli, giá trị MIC của MEE được xác định từ 12,5 mg/ml đến

25 mg/ml, trong đó nhạy cảm nhất là chủng ETEC. Đối với nhóm Salmonella spp.,

Đồ án tốt nghiệp

giá trị MIC của MEE biến thiên từ nồng độ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml, trong đó giá

trị MIC thấp nhất đối với chủng S.dublin và S. typhi là 12,5 mg/ml. Riêng đối với

nhóm Vibrio spp., giá trị MIC của MEE cao hơn 2 nhóm vi khuẩn trên, giá trị MIC

của MEE là 25 mg/ml. Đối với nhóm Shigella spp. và nhóm vi sinh vật gây bệnh

khác, giá trị MIC của MEE biến động từ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml, trong đó giá trị

MIC thấp nhất đối với chủng Shi. boydii và Lis. innocua.

Như vậy, kết quả khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của MEE bằng phương

pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin đối với 20 chủng

vi sinh vật cho thấy rằng có 15/20 chủng khảo sát bị ức chế ở nồng độ 25 mg/ml;

5/20 chủng bị ức chế ở nồng độ 12,5 mg/ml. Điều này chứng tỏ rằng, giá trị MIC

thấp nhất ức chế được vi sinh vật của cao ethanol 70% là 12,5 mg/ml và cao nhất là

25 mg/ml khi đánh giá bằng phương pháp MDR

Theo kết quả của Hoàng Văn Tuấn (2013), dịch chiết diếp cá giàu flavonoid

ức chế vi khuẩn E. coli ở nồng độ thấp nhất là 100 mg/ml còn trên chủng S. aureus

là 50mg/ml bằng phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng. Giá trị MIC trên vi

khuẩn E. coli của chiết xuất ethanol 80% từ lá cây Akk (Calotropis procera) là 21

mg/ml, còn chiết xuất ethanol 80% từ hoa Akk (Calotropis procera) là 26 mg/ml.

Điều này cho thấy cao ethanol 70% từ cây Medinilla sp. có hoạt tính cao, nồng độ

ức chế tối thiểu (MIC) của cao ethanol 70% thực hiện bằng phương pháp pha loãng

trên môi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin cho kết quả tương tốt chỉ với 25

mg/ml có thể ức chế được 15/20 chủng vi sinh vật khảo sát.

3.2.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (DDA)

Kết quả chỉ số MIC thực hiện bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán được

trình bày trong bảng 3.4

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.4. Chỉ số MIC trên 20 chủng vi sinh vật khảo sát được thực hiện bằng

phương pháp DDA

STT Chủng MIC (mg/ml)

1 Escherichia coli O157:H7 50

2 Escherichia coli 0208 25

3 Escherichia coli 50

4 Enterotoxigenic E.coli-ETEC 50

5 Listeria innocua 100

6 Listeria monocytogenes 100

7 Salmonella dublin 50

8 Salmonella enteritidis 25

9 Salmonella typhii 12,5

10 Salmonella typhimurium 12,5

11 Shigella boydii 100

12 Shigella flexneri 50

13 Shigella sonnei 50

14 Vibrio alginolyticus 12,5

15 Vibrio cholerae 12,5

16 Vibrio harveyi 100

17 Vibrio parahaemolyticus 25

18 Pseudomonas aeruginosa 100

19 Staphylococcus aureus 50

20 Enterococcus feacalis 100

Qua bảng 3.4, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối

với 20 chủng khảo sát bằng phương pháp đĩa giấy có giá trị MIC từ 12,5 mg/ml đến

100 mg/ml.

Đối với nhóm E.coli, giá trị MIC của MEE biến động từ 25 mg/ml đến 50

mg/ml, trong đó giá trị MIC thấp nhất đối với chủng E. coli 0208. Đối với nhóm

Salmonella spp. giá trị MIC thay đổi từ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml, trong đó nhạy

Đồ án tốt nghiệp

cảm nhất là hai chủng S. typhi và S. typhimurium ở nồng độ 12,5 mg/ml. Đối với

nhóm Vibrio spp. giá trị MIC từ 12,5 mg/ml đến 100 mg/ml, trong đó MEE ở nồng

độ 100 mg/ml mới có thể ức chế được chủng V. harveyi. Riêng đối với 2 nhóm

Shigella spp., và nhóm vi sinh vật gây bệnh khác, giá trị MIC của MEE cao hơn 3

nhóm vi khuẩn trên, giá trị MIC biến thiên từ 50 mg/ml đến 100 mg/ml.

Như vậy, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao ethanol 70% từ

cây Medinilla sp. bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán thu được kết quả không

khả quan, 4/20 chủng nhạy ở nồng độ 12,5 mg/ml, trong khi đó có đến 13/20 chủng

vi sinh vật khảo sát có giá trị MIC từ 50 mg/ml đến 100 mg/ml.

Dựa vào kết quả đánh giá chỉ số MIC của cao ethanol 70% từ cây Medinilla

sp. đối với 20 chủng vi sinh vật khảo sát thông qua ba phương pháp bao gồm WDA,

MDR và DDA, chúng tôi nhận thấy rằng kết quả xác định chỉ số MIC của MEE có

sự khác biệt khá lớn giữa ba phương pháp khảo sát. Xét về độ nhạy của ba phương

pháp trong việc xác định chỉ số MIC, chúng tôi nhận thấy rằng phương pháp MDR

có độ nhạy cao hơn hai phương pháp còn lại vì có khoảng phát hiện giá trị MIC từ

12,5 mg/ml đến 25 mg/ml đối với tất cả các chủng vi khuẩn khảo sát trong khi đó

phương pháp WDA có độ nhạy trung bình từ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml, còn

phương pháp DDA thì khoảng phát hiện cao từ 12,5 mg/ml đến 100 mg/ml, điều

này chứng tỏ phương pháp đĩa giấy khuếch tán có độ nhạy thấp.

Xét trên phương diện độ chính xác của giá trị MIC thì ba phương pháp cũng

có sự khác biệt nhau. Khi so sánh giá trị MIC được xác định qua ba phương pháp

với kết quả hoạt tính kháng khuẩn của MEE trong thí nghiệm 2, chúng tôi nhận thấy

rằng phương pháp MDR cho kết quả chính xác nhất vì 5 chủng (ETEC, Lis.

innocua, S. dublin, S. typhi và Shi. boydii) bị ức chế bởi MEE ở nồng độ 12,5 mg/ml

cũng là 5 chủng mà MEE thể hiện hoạt tính đối kháng mạnh nhất, đối với 15 chủng

còn lại thì hoạt tính của MEE là như nhau (13,7mm ± 0,68) nên có nồng độ ức chế

tối thiểu đều là 25 mg/ml. Còn phương pháp WDA cho kết quả MIC tương đối vì

phát hiện được 3 chủng (ETEC, S. typhi, Shi. boydii) có khả năng chống lại tác dụng

ức chế của MEE ở nồng độ 12,5 mg/ml đồng thời 3 chủng này thể hiện khả năng

Đồ án tốt nghiệp

nhạy thấp đối với MEE. Phương pháp DDA thì cho kết quả kém chính xác khi so

sánh giá trị MIC với hoạt tính kháng khuẩn của MEE. Qua kết quả trên, chúng tôi

nhận thấy rằng phương pháp MDR là phương pháp tốt nhất và phù hợp nhất để xác

định chỉ số MIC.

Phương pháp MDR được dựa trên nguyên tắc phát hiện sự thay đổi màu

trong môi trường của chất chỉ thị resazurin thông qua quá trình trao đổi chất của vi

sinh vật có trong môi trường (Banfi và ctv, 2003). Vi sinh vật và chất kháng khuẩn

được hòa trộn vào trong ống nghiệm chứa môi trường dinh dưỡng, chất kháng

khuẩn sẽ khuếch tán vào môi trường lỏng ức chế sự phát triển của vi sinh vật, sau

đó nhờ vào chất chỉ thị resazurin sẽ xác định được nhanh chóng giá trị MIC, vì vậy

phương pháp này rất dễ thực hiện, ít tốn kém, đọc kết quả qua sự thay đổi màu của

resazurin, không bị ảnh hưởng bởi cảm quan của người đọc khi dựa vào mắt

thường. Phương pháp này có thể được sử dụng để xác định các giá trị MIC ở các

khoảng nồng độ nhỏ hơn với độ chính xác cao hơn. Hơn nữa, với phương pháp

MDR còn có thể kết hợp để xác định được nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)

bằng cách cấy trải dịch nuôi cấy từ các ống thí nghiệm MIC trong thí nghiệm mà

không có sự phát triển của vi sinh vật lên môi trường thạch, nuôi ở điều kiện thích

hợp, đọc kết quả thông qua sự hình thành khuẩn lạc trên bề mặt thạch. Chỉ số MBC

rất cần thiết khi thực hiện khảo sát kháng khuẩn, thông qua chỉ số MBC và MIC có

thể xác định được nồng độ ức chế và tiêu diệt đối với từng loại vi khuẩn để lựa chọn

được nồng độ tối ưu để làm giảm cơ hội phát triển của vi sinh vật.

Đối với phương pháp WDA, trong phương pháp khuếch tán qua giếng thạch,

vi sinh vật chỉ thị được trang một lớp mỏng trên bề mặt môi trường, cho cao ethanol

70% ở nồng độ cần khảo sát vào giếng. Ngay tại giếng, dịch cao sẽ khuếch tán các

hoạt chất đối kháng để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn chỉ thị xung quanh

giếng. Giếng thạch có khả năng chứa một thể tích dịch cao nhất định, nên các chất

kháng khuẩn có khả năng khuếch tán cao vào môi trường thạch. Mặc dù phương

pháp này rất dễ thực hiện, đơn giản, ít tốn kém, chỉ sử dụng một lượng chất kháng

khuẩn nhỏ, tuy nhiên, khi tiến hành đo vòng ức chế, chỉ dựa trên mắt thường đồng

Đồ án tốt nghiệp

thời do cao chiết từ thực vật thường có màu sắc khá sậm nên việc xác định đường

vùng ức chế tương đối khó khăn. Quan trọng là phương pháp WDA chỉ giúp xác

định MIC mà không thể xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC), nếu muốn

thực hiện thử nghiệm MBC thông qua phương pháp này thì cần phải chuẩn bị một

môi trường lỏng, có chất diệt khuẩn cùng vi sinh vật sau đó trải hỗn hợp đó qua môi

trường thạch mới có thể xác định được MBC, vì vậy sẽ rất tốn thời gian, kết quả

không tin cậy, sử dụng một lượng lớn chất kháng khuẩn vì phải thực hiện 2 phương

pháp mới xác định được khoảng MBC. Đối với phương pháp DDA, dịch chiết của

cao ethanol 70% không đối kháng trực tiếp với vi sinh vật chỉ thị mà chỉ có hoạt

chất của dịch chiết khuếch tán qua môi trường thạch, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng

của vi sinh vật chỉ thị. Vòng giấy thấm được đặt lên bề mặt đĩa petri đã cấy vi sinh

vật rồi nhỏ dịch chiết của cao lên. Tuy nhiên, phương pháp này không đạt được kết

quả khả quan. Do độ hấp thụ các chất kháng khuẩn từ dịch cao chiết bị hạn chế ở

10µl, cho thấy lượng cao dùng để thử hoạt tính là rất ít, đĩa giấy không giữ được

lượng dịch ở nồng độ như mong muốn. Đồng thời các chất kháng khuẩn được thấm

vào giấy có sự khuếch tán lên môi trường thạch là không cao. Củng như phương

pháp WDA, phương pháp này khi thực hiện xác định giá trị MIC củng cho kết quả

không ổn định, gặp khó khăn khi muốn chia nhỏ khoảng nồng độ khảo sát và không

thể xác định được chỉ số MBC

Qua việc so sánh kết quả và ưu nhược điểm của ba phương pháp xác định chỉ

số MIC, chúng tôi nhận thấy rằng, phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng bổ

sung chất chỉ thị resazurin là phương pháp cho kết quả chính xác, nhanh chóng, ổn

định, độ nhạy cao đối với các chủng vi sinh vật khảo sát đồng thời phương pháp có

những ưu điểm vượt trội so với những phương pháp được khảo sát trong nghiên cứu

này.

Do đó chúng tôi đề xuất phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng bổ

sung chất chỉ thị resazurin nên được sử dụng trong việc xác định chỉ sô MIC của

các loại hợp chất tách chiết từ thực vật củng như các chất có hoạt tính kháng khuẩn

đối với vi sinh vật chỉ thị vì đây là phương pháp có độ nhạy cao, dễ thực hiện, có

Đồ án tốt nghiệp

khả năng phát hiện được các khoảng nồng độ nhỏ, đồng thời phương pháp này có

thể liên kết việc xác định chỉ số MBC. Chính vì thế phương pháp MDR là phương

pháp tối ưu để xác định chỉ số MIC từ cao chiết thực vật

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

Tách chiết thu hồi được cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp.

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao MEE đối với 20 chủng vi

sinh vật khảo nghiệm cho thấy cao ethanol 70% ở nồng độ 100 mg/ml có hoạt tính

mạnh, phổ kháng rộng, ức chế được 20/20 chủng vi sinh vật

Kết quả xác định MIC bằng 3 phương pháp cho thấy, cho thấy rằng phương

pháp MDR có độ nhạy cao hơn hai phương pháp còn lại vì có khoảng phát hiện giá

trị MIC từ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml đối với tất cả các chủng vi khuẩn khảo sát

trong khi đó phương pháp WDA có độ nhạy trung bình từ 12,5 mg/ml đến 50

mg/ml, còn phương pháp DDA thì khoảng phát hiện cao từ 12,5 mg/ml đến 100

mg/ml. Vì vậy, phương pháp MDR là phương pháp tối ưu để xác đinh MIC từ cao

chiết thực vật

4.2 Kiến nghị

Xác định chỉ số MIC của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp. đối với

20 chủng vi sinh vật khảo nghiệm ở các nồng độ thấp hơn

Xác định chỉ số MBC của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp. đối với

20 chủng vi sinh vật khảo nghiệm

Thử nghiệm độc lực của MEE trên mô hình chuột

Định tính thành phần hóa học chưa trong cây Medinilla sp.

Định danh, xác định loài Medinilla sp.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Nguyễn Thị Vân Thái, Nguyễn Minh Phúc, Ngô Thị Kim, Nguyễn Kim Độ và Lưu

Thị Dung, (2006). Bàn về tiềm năng phòng và chữa bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng

sinh thảo mộc trong nuôi trồng thủy sản. Báo cáo các công trình khoa học. Nhà xuất

bản Nông nghiệp, Hà Nội, 2003.

Trần Ngọc Hùng và Trương Thị Thành Vinh, (2012). Kết quả thử nghiệm một số

loài thảo dược trong phòng trị bệnh do vi khuẩn Streptococus spp trên cá trê lai

(Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male). Khoa học công nghệ,

kỳ 2:48-52.

Võ Văn Chi, (2000). Cây thuốc trị bệnh thông dụng. NXB Thanh Hóa

Võ Văn Chi, (1997). Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội

Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, (1997). Phân loại học thực vật bậc cao. NXB Đại

học và Trung học chuyên nghiệp

Đỗ Tấn Lợi, (1968). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Khoa học và kỹ

thuật, Hà Nội

Nguyễn Thị Thu Hương, (2011). Bước đầu nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của

cao chiết từ Tỏi (Allium sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở người. Kỷ yếu

hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011:168-175

Phùng Trung Hùng, Phan Nguyễn Hữu Trọng, Nguyễn Phước Long, (2013). Đại

cương Carbohydrate. Đọc sách Y sinh

Hồ Chí Tuấn, (2009). Amin - Amino acid – Protein. Đại học Y Hà Nội

DS. Nguyễn Huy Công, DS. Bùi Đức Dũng, DS. Đào Đình Hoan, ThS. Nguyễn Thị

Thanh Hoài, (2005). Giáo trình dược liệu. NXB Y học Hà Nội

Đỗ Tất Lợi, (2004), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”. Nhà xuất bản Y học

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, (2012). Ngiên cứu phân lập các hợp chất phenolic từ một

số thực vật Việt Nam. Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại học khoa học tự nhiên

– Đại học Quốc gia Hà Nội.

Đồ án tốt nghiệp

Lê Ngọc Thuỳ Trang, (2013). Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả năng

sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum. Khoá luận tốt

nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM.

Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp. Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh

vật, link :

Phạm Minh Nhựt, (2013). Thực hành vi sinh đại cương. Trường Đại học Công

Nghệ Tp. HCM.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

KJV Piddock, R Wise, (1989). J. Antimicrob. Chemother., 23, 475-483.

I Ahmad, AZ Beg. J. Ethnopharmacol. 2001, 74, 113-123.

ML Cohen. Science, (1992), 257, 1050-1055

H Harbottle, S Thakur, S Zhao, DG White. Anim. Biotechnol. 2006, 17, 111-124.

Ordóñez, A.A.L., Gómez, J.D., Cudmani, N.M., Vattuone, M.A. and Isla, M.I.

(2003). Antimicrobial activity of nine extracts of Sechium edule (Jacq.) Swartz.

Microbiol Ecol Health Dis 15, 33–39.

Grabley, S. and Thiericke, R. (1999) Bioactive agents from natural sources: trends

in discovery and application. Adv Biochem Eng/Biotechnol 64, 101–154

Soberón J.R., Sgariglia M.A., Sampietro D.A., Quiroga E.N. and Vattuone M.A.,

(2007). Antibacterial activity of plant extracts from northwestern Argentina. Journal

of Applied Microbiology (102): 1450–1461

Mullika traidej Chomnawang, Suvimol Surassmo, Veena S. Nukoolkarn,Wandee

Gritsanapan, (2005). Antimicrobial effects Thai medicinal plants against acne-

inducing bacteria. Journal of Ethnopharmocology (101) (2005): 330-333

Kumar G.S., Jayaveera K.N., Ashok Kumar C.K., Umachigi P.S., Vrushabendra

B.M., Kishore Kumar D.V., (2007). Antimicrobial effects of Indian medicinal plants

against acne-inducing bacteria. Tropical journal of Pharmaceutical Research, June

2007: 717-723

Mohan Thakare, Denbow D.M., McElrroy A.R., Novak C.L., Link L.R., (2004).

Thesis submitted to the faculty of the Virginia Polytechnic institute and State

University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of

Sciences in animal and poultry sciences. Pharmacology.42p.

Supayang Piyawan Voravuthikunchai, Treechada Sririrak, Surasak Limsuwan,

Thanomjit Sup awita, (2005). Inhibilitory Effects of Active Compounds from Punica

granatum on Verocytotoxin production by Enterohemorrhagic Escherichia coli

O157:H7. Journal of health science: 590-596

Đồ án tốt nghiệp

Kiymet Guven, Sezgin Celik, Ismet Uysal, (2005). Antimicrobial activity of CentaureaSpecies. Pharmaceatical Biology, pp: 67-71

Sikkema J, de Bont JA, Poolman B. Interactions of cyclic hydrocarbons with

biological membranes. J Biol Chem. 1994;269(11):8022–8

Lambert RJW, Skandamis PN, Coote P, Nychas GJE (2001);. A study of the

minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil,

thymol and carvacrol. J Appl Microbiol, 91(3):453-62.

Valgas, C., de Souza, S.M., Smânia, E.F.A., Smânia Jr., A., (2007). Screening

methods todetermine antibacterial activity of natural products. Braz. J. Microbiol.

38, 369–380

Mourey, A., Canillac, N., (2002). Anti-Listeria monocytogenes activity of essential

oils components of conifers. Food Control 13, 289–292.

Ellof, J.N., (1998). A sensitive and quick microplate method to determine the

minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Med. 64,

711–713

Jie, C. and Renner., S. S., (2007). Melastomataceae. Flora of China 13, 392 – 395

Renner, S. S., (2004). Multiple Miocene Melastomataceae dispersal between

Madagascar, Africa and India. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci, 359(1450):

1485-1494

Jennifer M. Andrews, (2011). Determination of minimum inhibitory concentrations.

Journal of Antimicrobial Chemotherapy Volume 48: 5-16.

Attia H. Atta, Samar M. Mouneir, (2004). Antidiarrhoeal activity of some Egyptian

medicinal plant extracts. Journal of Ethnopharmacology 92: 303–309

Antara Sen và Amla Batra, (2012). Evaluation of antimicrobial activity of different

solvent extracts of medicinal plant: melia azedarach l. International Journal of

Current Pharmaceutical Research, Vol 4, Issue 2: 67-73

Đồ án tốt nghiệp

Elena Banfi, Giuditta Scialino and Carlo Monti-Bragadin, (2003). Development of a

microdilution method to evaluate Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility.

Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 796–800

Naveed Ahmad, Farooq Anwar, Sohail Hameed and Mary C. Boyce, (2011).

Antioxidant and antimicrobial attributes of different solvent extracts from leaves

and flowers of akk [Calotropis procera (Ait.) Ait. F.)]. Journal of Medicinal Plants

Research Vol. 5(19), pp. 4879-4887

Anja Klancnik, Barbara Jeršek, Sonja Smole Možina, (2010). Evaluation of

diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant

extracts. Journal of microbiological methods, 81 (2010) 121–126

Sawai, J., Doi, R., Maekawa, Y., Yoshikawa, T., Kojima, H., (2002). Indirect

conductimetric assay of antibacterial activities. Journal of Industrial Microbiology

& Technology 29, 296–298

Eloff, J.N., (1998). A sensitive and quick microplate method to determine the

minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica 64,

711–713.

Gabrielson, J., Hart, M., Jarel¨ ov, A., K¨ uhn, I., McKenzie, D., M¨ ollby, R.,

(2002). Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and

spectrophotometer for quantification of microbial growth in microplates. Journal of

Microbiological Methods 50, 63–73.

Jahn, B., Martin, E., Stueben, A., Bhakdi, S., (1995). Susceptibility testing of

Candida albicans and Aspergillus species by a simple microtitre menadione-

augmented 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide

assay. Journal of Clinical Microbiology 33, 661–667.

Pelloux-Prayer, A.L., Priem, B., Joseleau, J.P., (1998). Kinetic evaluation of

conidial germination of Botrytis cinereaby a spectrofluorometric method.

Mycology Research 102, 320–322

Đồ án tốt nghiệp

Paul Cos, Arnold J. Vlietinck, Dirk Vanden Berghe, Louis Maes, (2006). Review

Anti-infective potential of natural products: How to develop a stronger in vitro

‘proof-of-concept’. Journal of Ethnopharmacology 106 (2006) 290–302

Mustafa Oskay, Dilek Oskay and Fatih Kalyoncu, (2009). Activity of Some Plant

Extracts of Some Plant Extracts Some Plant Extracts Plant Extracts Extracts

Against Multi-Drug Resistant Human Pathogens. Iranian Journal of Pharmaceutical

Research (2009), 8 (4): 293-300.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ CÂY MEDINILLA SP.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng A.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp. nồng độ 100 mg/ml

Đƣờng kính vòng ức chế (mm) STT Chủng Lần 1 Lần 2 Lần 3

13,5 14 12,5 Escherichia coli O157:H7 1

14 14 13,5 Escherichia coli 0208 2

12,5 14 13,5 Escherichia coli 3

15 15 14 E.coli-ETEC 4

14,5 14 14 Listeria innocua 5

14,5 14 13 Listeria monocytogenes 6

13,5 15 14,5 Salmonella dublin 7

14,5 12.5 13 Salmonella enteritidis 8

14,5 14.5 14,5 Salmonella typhi 9

13,5 13 15 Salmonella typhimurium 10

15 14 15 Shigella boydii 11

14,5 15 14 Shigella flexneri 12

14 13.5 13,5 Shigella sonnei 13

13 15 14 Vibrio alginolyticus 14

12 12 13,5 Vibrio cholerae 15

13 15 13,5 Vibrio harveyi 16

12 12 12,5 17 Vibrio parahaemolyticus

14 14 18 Pseudomonas aeruginosa 13,5

15 15 14,5 19 Staphylococcus aureus

14 13 14,5 20 Enterococcus feacalis

Đường kính giếng thạch d = 6 mm

Đồ án tốt nghiệp

Bảng A.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của Ciprofloxacin ở nồng độ

500 µg/ml đối với 16 chủng vi sinh vật và 8 µg/ml đối với nhóm Vibrio spp.

Đƣờng kính vòng ức chế (mm) STT Chủng Lần 1 Lần 2 Lần 3

1 Escherichia coli O157:H7 13 13 13,5

2 Escherichia coli 0208 12,5 12 12,5

3 Escherichia coli 13 13 13,5

4 E.coli-ETEC 30,5 31 31,5

5 Listeria innocua 11,5 12 12,5

6 Listeria monocytogenes 12 12 12,5

7 Salmonella dublin 12 11,5 13

Salmonella enteritidis 13,5 8 13 12,5

9 Salmonella typhi 13 12 12,5

10 Salmonella typhimurium 11 11 11

11 Shigella boydii 0 0 0

12 Shigella flexneri 13 13 13,5

13 Shigella sonnei 33,5 33 32,5

14 Vibrio alginolyticus 16,5 16 16

15 Vibrio cholerae 13 13 14

16 Vibrio harveyi 17,5 18 18,5

17 Vibrio parahaemolyticus 11,5 11,5 11

18 Pseudomonas aeruginosa 12,5 11,5 12,5

19 Staphylococcus aureus 12 12 12,5

20 Enterococcus feacalis 12 11,5 12,5

Đường kính giếng thạch d = 6 mm

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ

Bảng B.1. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100

mg/ml) trên chủng E. coli O157:H7

Bảng B.2. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100

mg/ml) trên chủng E. coli 0208

Bảng B.3. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100

mg/ml) trên chủng E. coli

Đồ án tốt nghiệp

Bảng B.4. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100

mg/ml) trên chủng ETEC

Bảng B.5. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100

mg/ml) trên chủng Listeria innocua

Đồ án tốt nghiệp

Bảng B.6. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100

mg/ml) trên chủng Listeria monocytogenes

Bảng B.7. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100

mg/ml) trên chủng Salmonella dublin

Bảng B.8. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100

mg/ml) trên chủng Salmonella enteritidis

Đồ án tốt nghiệp

Bảng B.9. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Salmonella typhi

Bảng B.10. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Salmonella typhimurium

Đồ án tốt nghiệp

Bảng B.11. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Shigella boydii

Bảng B.12. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Shigella flexneri

Đồ án tốt nghiệp

Bảng B.13. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Shigella sonnei

Bảng B.14. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Vibrio alginolyticus

Đồ án tốt nghiệp

Bảng B.15. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Vibrio cholerae

Bảng B.16. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Vibrio harveyi

Đồ án tốt nghiệp

Bảng B.17. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Vibrio parahaemolyticus

Bảng B.18. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Pseudomonas aeruginosa

Đồ án tốt nghiệp

Bảng B.19. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Staphylococcus aureus

Bảng B.20. Kết quả xử lý thống kê đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100 mg/ml) trên chủng Enterococcus feacalis

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ HÌNH ẢNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

VÀ CHỈ SỐ MIC BẰNG 3 PHƢƠNG PHÁP CỦA MEE ĐỐI VỚI

ĐẠI DIỆN CỦA 5 NHÓM VI KHUẨN KHẢO SÁT

Hình C.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của MEE (100mg/ml)

Staphylococcus aureus Shigella boydii

Vibrio cholerae Escherichia coli

Salmonella dublin

Đồ án tốt nghiệp

Hình C.2 Kết quả chỉ số MIC của MEE bằng phương pháp WDA

Escherichia coli O157:H7

Vibrio cholerae

Đồ án tốt nghiệp

Salmonella enteritidis

Hình C.3 Kết quả chỉ số MIC của MEE bằng phương pháp MDR

Vibrio alginolyticus Pseudomonas aeruginosa

Đồ án tốt nghiệp

Hình C.4 Kết quả chỉ số MIC của MEE bằng phương pháp DDA

100mg/ml 50mg/ml

Shigella sonnei

100mg/ml 50mg/ml

25mg/ml 12,5mg/ml

Vibrio alginolyticus

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ (MIC) CỦA CAO CHIẾT

ETHANOL 70% TỪ CÂY MEDINILLA SP.

Bảng D.1. Xác định chỉ số MIC của cao chiết bằng phương pháp WDA

Đồ án tốt nghiệp

Đƣờng kính vừng ức chế (mm)

STT Chủng

L3 12 11 L1 0 0 50 L2 13 11

L3 0 0 11,5

12,5 L2 L3 0 0 0 0 0 0 11 9,5 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 11,5 11,5

0 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli (K) Enterotoxigenic E.coli-ETEC Listeria innocua Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhi Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis 25 100 L1 L2 L1 L3 L2 0 0 13 15 16 0 0 11 13 13 9,5 11 13,5 12,5 13,5 10,5 15 15 11,5 11,5 10,5 10,5 10,5 11 11 14,5 14 10.5 11 11 12 12 15,5 16 10 11,5 12,5 12,5 12,5 11 15 13 11 11,5 10,5 11 11,5 12 14 13,5 11 10,5 12 12 16 12 15 11 11,5 11 11 15,5 15,5 11,5 0 11,5 10,5 10,5 13 12 11 16,5 16 9,5 11,5 11,5 12 11 16 17 12 12 12 12,5 17 16,5 11 14,5 11,5 11,5 12 11 11 16 15 11 11,5 11 13 12 12 16,5 17 0 0 0 12 11,5 15 17 11 0 0 0 12 11,5 11,5 16 14 0 0 11,5 11 10,5 12 14 12 12 11,5 12 16 14,5 0 0 0 11,5 11,5 11,5 10,5 14 15 12 12 11 12 11,5 10,5 10,5 12 0 0 0 0 11 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 10 12.5 11 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 L1 16,5 13 16 15 16,5 15 13 15 15 15 16 16 16 16 15 15 13,5 15 15 14

Đường kính vòng ức chế bao gồm đường kính giếng thạch Bảng D.2. Xác định chỉ số MIC của cao chiết bằng phương pháp MDR

Đồ án tốt nghiệp

STT Chủng MIC- Ống nghiệm

50 25

100 2 (+) 3 (+) 1 (+) 1 (+) 2 (+) 3 (+) 1 (+) 2 (+) 3 (+) 12,5 2 (-) 3 (-) 1 (-) 1

Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli ETEC Listeria innocua Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhi Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Bảng C.3. Xác định chỉ số MIC của MEE bằng phương pháp DDA

Đồ án tốt nghiệp

STT Chủng Đƣờng kính vùng ức chế (mm)

1 3

Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli 0208 Escherichia coli Enterotoxigenic E.coli-ETEC Listeria innocua Listeria monocytogenes Salmonella dublin Salmonella enteritidis Salmonella typhi Salmonella typhimurium Shigella boydii Shigella flexneri Shigella sonnei Vibrio harveyi Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus feacalis 3 10 - 12 10 - - 9 9 8,5 8 - 10 9,5 - 9 9 8 - 10,5 - 1 9,5 9 11 10 - - 9 9 9 9.5 9 9 11,5 - 8 9 10 - 9 9 100 2 9,5 9 10 9 - - 10,5 9 8,5 10 8 9 9 - 8,5 8,5 8,5 - 10 10 1 9 8 9 8 - - 10 9 8 9,5 - 8,5 9 - 8 8 9 - 8 - 50 2 9 9 8 8 - - 9 9 8,5 10 - 8 10 - 8 7,5 9 - 9 - 3 - - 9 9 - - 10 8 9 8,5 - 8,5 8 - 8 - 9 - 9,5 - 2 3 1 - - - 8,5 8,5 9 - - - - - - - - - - - - - - - 9 8,5 8 8 8,5 9 - - - - - - - - 8 9 8,5 8,5 8 8 - - - - - - - 8 9 - - - - - - - - - - 12,5 2 - - - - - - - - - - - - - - - - 9,5 9,5 8 7,5 - - - - - - - - 9 8 8 8 - - - - - - - - - - - - - - - - - 8 - - - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Đường kính vòng ức chế bao gồm đường kính giếng thạch (d = 6mm)

Đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp.

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu bước đầu xác định được quy trình phù hợp để khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp. Mời các bạn cùng tham khảo.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)

CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP.

ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP. CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt

TS. Lương Tấn Trung

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thị Phượng Hằng

MSSV: 1151110009

Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)

CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP.

ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP. CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Th S. Phạm Minh Nhựt

TS. Lương Tấn Trung

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thị Phượng Hằng

MSSV: 1151110009

Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CÁM ƠN

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH HÌNH

DANH SÁCH BẢNG

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ

PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ HÌNH ẢNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

VÀ CHỈ SỐ MIC BẰNG 3 PHƢƠNG PHÁP CỦA MEE ĐỐI VỚI

ĐẠI DIỆN CỦA 5 NHÓM VI KHUẨN KHẢO SÁT

Salmonella dublin

PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ (MIC) CỦA CAO CHIẾT

ETHANOL 70% TỪ CÂY MEDINILLA SP.

Có thể bạn quan tâm

Hàm lượng polyphenol, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết từ cây Nọc Xoài (Struchium sparganophorum (L.) Kuntze), họ Cúc (Asteraceae)

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thu nhận và đặc tính một số enzyme chuyển hóa lignocellulose từ nấm Việt Nam

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thu nhận và đặc tính một số enzyme chuyển hóa lignocellulose từ nấm Việt Nam

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận án Tiến Sĩ: : Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)

Báo cáo thực tập: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (QUATEST 2)

Câu hỏi ôn tập môn Công nghệ sinh học nấm ăn và nấm dược liệu

Khóa luận tốt nghiệp: Khảo sát thành phần hoá học phân đoạn Me40 từ cao chiết ethanol của thân cây Trà hoà (Camellia hoaana H. T. Khuong & S. X. Yang, Theaceae)

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Công nghệ nông nghiệp năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Câu hỏi ôn tập kiểm tra học kì 2 môn Công nghệ chăn nuôi lớp 11 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Đề cương ôn tập học kì 2 môn Công nghệ nông nghiệp lớp 12 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của cao ethanol từ cây gai toàn tơ (Boehmeria holosericea Blume)

Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật và hoạt tính sinh học cao chiết ethanol của cây Đọt choại (Stenochlaena palustris (Burm. f.) Bedd)

Virus Real-time PCR

Bài giảng Công nghệ sản xuất enzym - Lê Ngọc Khánh

Đề khảo sát giữa học kì 2 môn Khoa học tự nhiên lớp 9 năm 2024-2025 có đáp án - Trường THCS Xuân Tiến (Đề số 02)

Định danh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis R1 phân lập từ rơm có hoạt tính phân huỷ huyết khối

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Công nghệ sinh học nano năm 2021-2022

Tài liêu mới

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống sấy khí thổi dùng để sấy tinh bột gạo nếp, năng suất 2000 kg/h theo sản phẩm

Đồ án môn học: Nghiên cứu phát triển sản phẩm kem trứng muối đóng hộp mix hạt điều

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống xử lý nước ngầm công suất 15000M3 /NG/Đ

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu về ứng dụng công nghệ số trong sản xuất in và tác động của nó đến chiến lược kinh doanh của công ty in

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống chùm để ngưng tụ hơi cồn nồng độ 96% khối lượng, lưu lượng 10000kg/ngày

Báo cáo đồ án: Thiết kế hệ thống chưng cất mâm chóp hệ etanol – nước năng suất nhập liệu 2000 L/h

Đồ án công nghệ: Thiết kế hệ thống chuyển hóa cacbon monoxit Water gas shift

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng hệ thống chia sẻ tài liệu theo kiến trúc hướng dịch vụ

Luận văn tốt nghiệp: Thiết kế nhà máy sản xuất màng ghép phức hợp ứng dụng cho bao bì thuốc trừ sâu năng suất 90 triệu m²/năm

Đồ án tốt nghiệp: Thành lập bản đồ lớp phủ thực vật tỉ lệ 1:50000 tại huyện Sóc Sơn, thành phố Hà Nội từ tư liệu ảnh viễn thám

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng chương trình quản lý chất lượng theo HACCP cho sản phẩm thịt ba rọi xông khói tại Cty TNHH MTV Việt Nam kỹ nghệ súc sản (VISSAN)

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng mô hình dự báo nguồn nhân lực thuyền viên xuất khẩu Việt Nam