Đồ án tốt nghiệp: Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN MÃ HÓA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ THỐNG NẤM MEN Pichia pastoris

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Thạc sĩ Nguyễn Xuân Đồng

Sinh viên thực hiện

: Phan Vũ Hải Yến

MSSV: 1051110247 Lớp: 10DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên

cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

kì công trình nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về

lời cam đoan này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Phan Vũ Hải Yến

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công

nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố

Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho

tôi trong suốt 4 năm đại học.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Hai người cô

kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho

tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Th.S Nguyễn

Xuân Đồng và K.S Lê Thị Huỳnh Trâm đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi về kiến

thức chuyên môn và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm đề tài tốt

nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Công nghệ Vi sinh - Trung tâm

Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện và

hỗ trợ tôi về kinh phí cũng như thiết bị để tôi có thể thực hiện đề tài.

Tôi cũng cảm ơn các bạn trong nhóm ESS đã luôn cổ vũ và động viên tôi

những lúc khó khăn để có thể vượt qua và hoàn thành tốt luận văn này.

Và cuối cùng, hơn ai hết, từ đáy lòng con cảm ơn ba mẹ đã sinh ra con, nuôi

dạy con khôn lớn, luôn bên con và là nguồn động viên to lớn của con, tạo mọi điều

kiện tốt nhất cả về tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và

hoàn thành luận văn này.

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 7 năm 2014

Phan Vũ Hải Yến

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................ vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................. vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG .............................................................................................. ix

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề: ...................................................................................................... 1

1.2. Mục đích nghiên cứu đề tài ............................................................................ 2

1.3. Nội dung nghiên cứuc ..................................................................................... 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN.............................................................................................. 3

2.1. Cấu tạo lignocellulose .................................................................................... 3

2.1.1. Cellulose ......................................................................................................... 4

2.1.2. Hemicellulose ................................................................................................ 6

2.1.3. Lignin .............................................................................................................. 7

2.2. Enzyme cellulase ............................................................................................ 8

2.2.1. Phân loại enzyme .............................................................................................. 8

2.2.2. Cơ chế tác dụng của cellulase ...................................................................... 9

2.2.3. Vi sinh vật sản xuất cellulase ..................................................................... 10

2.3. Phức hợp cellulosome trong vi khuẩn Clostridium thermocellum .............. 11

2.3.1. Tổng quan về vi khuẩn Clostridium thermocellum ..................................... 11

2.3.2. Đặc điểm của phức hệ cellulosome ........................................................... 12

2.4. Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris .............................................................. 14

2.4.1. Đặc điểm hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris ...................................... 14

2.4.2. Tích hợp gen ngoại lai vào P. pastoris ......................................................... 14

2.4.3. Ưu điểm của hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris ............................. 15

Đồ án tốt nghiệp

2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tạo dòng các gen từ Clostridium

thermocellum ........................................................................................................... 16

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 19

3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: .................................................................. 19

3.1.1. Địa điểm nghiên cứu: ...................................................................................... 19

3.1.2. Thời gian nghiên cứu: ..................................................................................... 19

3.2. Nguyên liệu ...................................................................................................... 19

3.2.1. Chủng vi sinh vật ............................................................................................. 19

3.2.2. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 19

3.2.3. Hóa chất ............................................................................................................ 20

3.2.4. Môi trường ....................................................................................................... 22

3.2.4.1. Môi trường LB (Luria-Bertani): ......................................................... 22

3.2.4.2. Môi trường MD (Minimal Dextrose): ................................................ 22

3.2.4.3. Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) .......................... 22

3.2.4.4. Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex): ........................... 22

3.2.4.5. Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC ... 23

3.2.5. Plasmid ............................................................................................................. 23

3.2.5.1. Plasmid pJET1.2/blunt ........................................................................ 23

3.2.5.2. Plasmid pPIC9K .................................................................................. 24

3.2.6. Các cặp mồi sử dụng ....................................................................................... 25

3.3. Phương pháp nghiên cứu: ................................................................................ 26

3.3.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của

Clostridium thermocellum......................................................................................... 26

3.3.1.1. Thiết kế mồi .................................................................................... 26

Đồ án tốt nghiệp

3.3.1.2. Thu nhận gen CelD của vi khuẩn C. thermocellum bằng phản ứng

PCR dựa vào cặp mồi đã thiết kế ..................................................................... 27

3.3.1.3. Quy trình tinh sạch gen theo MEGAquick – spin Total Fragment

DNA Purification Kit – INTRON Biotechnololy ............................................ 28

3.3.1.4. Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt ... 28

3.3.1.5. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5α khả nạp ............................................... 29

3.3.1.6. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa

biến nạp ............................................................................................................ 30

3.3.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc .................................... 31

3.3.1.8. Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào E. coli .............................. 32

3.3.1.9. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn ............................ 33

3.3.1.10. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự

tương ứng trên GenBank .................................................................................. 34

...................................................................................................................................... 34

3.3.2.Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD

3.3.2.1 Chuẩn bị dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn .......................... 34

3.3.2.2. Quy trình tinh sạch gen và plasmid theo MEGAquick-spin PCR &

Agarose Gel DNA Extraction System – INTRON .......................................... 35

3.3.2.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD ........................... 36

3.3.2.4. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5α khả nạp ............................................... 36

3.3.2.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E. coli DH5α .......... 36

3.3.2.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc .................... 37

3.3.2.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn ............................ 37

3.3.2.8. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự

tương ứng trên GenBank .................................................................................. 38

iii

Đồ án tốt nghiệp

3.3.3. Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa

enzyme endoglucanase D .......................................................................................... 38

3.3.3.1. Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp ............................ 39

3.3.3.2. Phương pháp điện biến nạp............................................................. 39

3.3.3.3. Chọn lọc các dòng Pichia pastoris mang nhiều bản sao của gen

CelD và có khả năng năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D ............. 40

3.3.3.4. Phương pháp ly trích DNA tổng số ............................................... 40

3.3.3.5. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng

phương pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R .......................................... 41

3.3.5. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái

tổ hợp ........................................................................................................................... 42

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 43

4.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD của

Clostridium thermocellum ...................................................................................... 43

4.1.1. Khuếch đại gen CelD bằng kĩ thuật PCR ................................................. 43

4.1.2. Tạo dòng E. coli mang plasmid nhân dòng chứa gen CelD ................... 44

4.1.3. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc ............................................. 45

4.1.4. Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu

CelDF/ CelDR và enzyme cắt giới hạn ................................................................... 46

4.1.5. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2-CelD bằng

giải trình tự .................................................................................................................. 48

4.2.1. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc ............................................. 52

4.2.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu

CelDF/ CelDR và bằng enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI ............................ 53

4.2.3. Kiểm tra dòng E. coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K – CelD

bằng giải trình tự ........................................................................................................ 55

Đồ án tốt nghiệp

4.3. Tạo dòng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen CelD ...................... 57

...................................................................................................................................... 58

4.3.1. Biến nạp plasmid pPIC9K – CelD vào chủng Pichia pastoris GS115

4.3.2. Sàng lọc tế bào nấm men mang gen mã hóa cho endoglucanase D ...... 59

4.3.3. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương

pháp PCR với mồi AOX1F/ AOX1R ..................................................................... 60

4.3.4. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ

hợp................................................................................................................................ 62

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 63

5.1. Kết luận ......................................................................................................... 65

5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................66

PHỤ LỤC

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

Alcohol oxydase AOX

Buffered Glycerol-complex BMGY

Buffered Methanol-complex BMMY

Base pair bp

Cellulose binding domain CBD

Carboxymethyl-cellulose CMC

Deoxyribonucleotide triphosphate dNTP

DNA Deoxyribonucleic acid

Kb kilo base

LB Luria-Bertani

MD Minimal Dextrose

Mut Methanol Utilisation

NCBI National Center for Biotechnology Information

OD Optical Density

PCR Polymerase Chain Reaction

Taq Thermus aquaticus

TAE Tris – acetate – EDTA

TE buffer Tris EDTA buffer

YNB Yeast Nitrogen Base

YPD Yeast Extract Peptone Dextrose

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1. Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose. .................................................. 3

Hình 2.2. Lignocellulose ............................................................................................. 4

Hình 2.3. Cấu trúc phân tử Cellulose .......................................................................... 5

Hình 2.4. Cấu trúc cellulose ........................................................................................ 6

Hình 2.5. Hemicellulose. ............................................................................................. 7

Hình 2.6. Lignin ........................................................................................................... 7

Hình 2.7. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase. .................................. 9

Hình 2.8. Clostridium thermocellum ........................................................................ 11

Hình 2.9. Cơ chế hoạt động của Cellulosome ........................................................... 12

Hình 3.1. Thang DNA 1 Kb ...................................................................................... 21

Hình 3.2. Plasmid pJET 1.2 ....................................................................................... 24

Hình 3.3. Plasmid pPIC9K ........................................................................................ 25

Hình 3.4. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR ............... 27

Hình 3.5. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/

pJET1.2R ................................................................................................................... 32

Hình 3.6. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/

AOX1R ....................................................................................................................... 37

Hình 3.7. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R ........... 41

Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD ..................... 43

Hình 4.2. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2-

CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50 µg/ml) ...................................................444

Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli

DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R ........................................... 45

Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2-CelD bằng enzyme

SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi đặc

hiệu CelDF/ CelDR .................................................................................................... 46

Hình 4.5. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa pPIC9K-CelD bằng môi trường

LB/ ampicillin (50 µg/ml). ......................................................................................... 51

vii

Đồ án tốt nghiệp

Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli

DH5α/pPIC9K-CelD với cặp mồi AOX1F/AOX1R. ................................................ 52

Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi

CelDF/ CelDR và sản phẩm cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI. .................... 53

Hình 4.8. Kết quả blast trình tự protein của trình tự trong plasmid

pPIC9K-CelD trên NCBI .......................................................................................... 56

Hình 4.9. Sàng lọc thể biến nạp P. pastoris GS115 chứa pPIC9K-CelD ................. 58

Hình 4.10. Sàng lọc tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ G418

..................................................................................................................................... 60

Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của plasmid

pPIC9K-CelD vào bộ gen P. pastoris GS115 .......................................................... 61

Hình 4.12. Vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm

với thuốc đỏ Congo ................................................................................................... 63

viii

Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Các cặp mồi được sử dụng có trình tự như sau: ....................................... 26

Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR .......................... 27

Bảng 3.3. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào plasmid pJET1.2 ...................... 29

Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R ............... 31

Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI ................ 33

Bảng 3.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid pPIC9K và pJET1.2-CelD với SnaBI

và EcoRI ..................................................................................................................... 35

Bảng 3.7. Thành phần phản ứng nối CelD vào vector biểu hiện pPIC9K ................ 36

Bảng 3.8. Thành phần phản ứng cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI.............. 38

Bảng 4.1. Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng P. pastoris tái tổ hợp

.................................................................................................................................... 64

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề:

Ethanol là một trong những dung môi quan trọng trong công nghiệp hóa học

và công nghệ sản xuất thực phẩm. Gần đây, ethanol được coi là một nhiên liệu sạch

có khả năng tái tạo, có thể thay thế một phần cho các nguồn nhiên liệu hoá thạch

đang ngày càng cạn kiệt như than đá, dầu mỏ trong tương lai. Hiện nay 98% ethanol

được sản xuất từ ngũ cốc hoặc nguyên liệu thực phẩm. Điều này sẽ gây ảnh hưởng

nghiêm trọng đến tình hình an ninh lương thực trên thế giới. Trong khi đó, sản xuất

nông nghiệp hàng năm sinh ra một lượng lớn phụ phế phẩm như rơm rạ, cám mì,

trấu, bã mía,…Việc tận dụng được nguồn chất thải này để sản xuất ethanol sinh học

không những giảm khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên đang dần cạn kiệt mà còn

giảm ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu tái

sinh này vẫn còn gặp nhiều khó khăn khi sản xuất ở quy mô công nghiệp.

Trong công nghệ sản xuất cồn sinh học, hai hướng chính để thủy phân

cellulose là phương pháp hóa học và sinh học. Trong thủy phân hóa học, cellulose

bị phân hủy thành đường đơn dưới tác dụng của H2SO4 ở nhiệt độ cao. Công nghệ

này mặc dù có hiệu suất cao nhưng rất độc hại và phức tạp, ảnh hưởng xấu đến môi

trường và con người. Chính vì vậy, hướng ứng dụng enzyme để thủy phân cellulose

là một hướng nghiên cứu mới, hứa hẹn đem đến những đột phá về mặt công nghệ.

Enzyme cellulase là enzyme ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thủy phân cellulose

thành glucose – nguyên liệu chính trong sản xuất cồn sinh học. Tuy nhiên, việc sử

dụng chúng vẫn còn hạn chế vì chi phí sản xuất enzyme cellulase cao và hiệu suất

chuyển hóa cơ chất thấp. Nguyên nhân là do quá trình thu nhận enzyme trực tiếp từ

vi sinh vật tốn nhiều thời gian và công sức, khó thực hiện ở quy mô công nghiệp,

enzyme đôi khi không có đủ các đặc tính mong muốn. Chính vì thế, ứng dụng

những tiến bộ của kỹ thuật di truyền vào việc sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp

là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng để thu nhận enzyme với sản lượng

lớn.

Đồ án tốt nghiệp

Hiện nay trên thế giới đã có những nghiên cứu về hệ enzyme phân hủy

cellulose của cellulosome ở vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt Clostridium thermocellum.

Hướng biểu hiện hệ cellulosome tái tổ hợp để thu nhận được số lượng lớn

cellulosome có chức năng phân giải cellulose được coi là hướng có tiềm năng nhất

trong công nghệ sản xuất cồn từ cellulose. Trên cơ sở đó đề tài: “Tạo dòng plasmid

tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn

Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris” được tiến hành.

Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme cellulase phân

hủy cellulose từ các nguồn phụ phế phẩm nông – lâm nghiệp và ứng dụng để sản

xuất cồn sinh học với giá thành hợp lý.

1.2. Mục đích nghiên cứu đề tài

Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme

endoglucanase D từ vi khuẩn Clostridium thermocellum.

1.3. Nội dung nghiên cứu:

- Thu nhận gen mã hóa endoglucanase D (CelD) từ Clostridium

thermocellum bằng phản ứng PCR.

- Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝛼 mang plasmid nhân dòng tái tổ hợp chứa

gen CelD

- Tạo dòng E. coli DH5𝛼 mang vector biểu hiện pPIC9K chứa gen mã hóa

enzyme endoglucanase D.

- Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme

endoglucanase D.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1. Cấu tạo lignocellulose

Lignocellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến trong tự nhiên. Hàng năm sản

lượng sinh khối thực vật trên Trái Đất khoảng 200 tỉ tấn, trong đó 90% là

lignocellulose (Himmel và cộng sự, 2007). Việc chuyển hóa lignocellulose không

chỉ quan trọng đối với vòng tuần hoàn vật chất mà còn ảnh hưởng đến việc tái hồi

dinh dưỡng cho cây.

Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và một số

thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, lignocellulose chủ yếu có trong

phụ phế phẩm nông nghiệp, sản phẩm phụ của công nghiệp sản xuất giấy và các

chất thải rắn,…Về thành phần cấu tạo, lignocellulose gồm cellulose, hemicellulose

và lignin. Số lượng mỗi loại polymer thay đổi tùy loài, tuổi và từng bộ phận khác

nhau của cây.

Hình 2.1. Tỉ lệ các thành phần trong lignocellulose

Nguồn: Pérez và cộng sự (2002)

Với thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu

tiềm năng cho sản xuất cồn sinh học. Tuy nhiên đây là một hợp chất khó phân hủy

trong điều kiện tự nhiên vì nó có cấu trúc đa dạng và phức tạp, bao gồm các thành

phần có độ polymer hóa cao và liên kết với nhau một cách chặt chẽ. Do đó muốn

phân hủy được chúng, cần phải có một hệ enzyme chuyên biệt, đòi hỏi một hệ vi

sinh vật có khả năng tổng hợp hệ enzyme để phân hủy chúng. (Himmel và cộng sự,

2007).

Đồ án tốt nghiệp

Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản, các sợi này gắn lại với nhau

nhờ hemicellulose, tạo thành cấu trúc vi sợi. Hemicellulose và lignin bao bọc xung

quanh các vi sợi, tạo nên một cấu trúc vững chắc, bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công

của enzyme cũng như các hóa chất khác trong quá trình thủy phân (Charles E.

Wyman, 1996).

Hình 2.2. Lignocellulose

Nguồn: Joseleau và cộng sự (1992)

2.1.1. Cellulose

Cellulose là thành phần polymer phổ biến nhất trong tự nhiên, chiếm 50%

lượng sinh khối thực vật, giúp mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Thành

phần cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật. Người ta

thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây. Cellulose chiếm đến

90% trong sợi bông, 50% trong gỗ, 40 – 50% trong bã mía, 35 – 40% trong rơm lúa

mỳ và lúa gạo (Sloneker, J. H., 1971; Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012).

Cellulose là chất rắn màu trắng, không mùi vị, có độ bền nhiệt cao, không tan

trong nước và các dung môi thông thường (rượu, ete, benzen,…) nhưng tan trong

dung dịch Schweitzer (dung dịch Cu(OH)2 trong NH3). Cellulose bị phân hủy mạnh

dưới tác dụng của một số dung dịch axit vô cơ mạnh như: HCl, H2SO4,… và tương

đối yếu với các axit hữu cơ (axit acetic, axit formic,…) nhưng bền vững dưới tác

dụng của kiềm (Nguyễn Văn Lân, 2004).

Đồ án tốt nghiệp

Cellulose là polysaccharide có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, trọng lượng

phân tử khoảng từ 50.103 đến 2,5.106 Da, gồm từ 5000 đến 14000 gốc β - D glucose

nối lại với nhau bằng liên kết 𝛽 – 1,4 glucoside tạo thành dạng chuỗi. Các phân tử

cellulose liên kết với nhau nhờ lực hút Van der Waals và liên kết hidro tạo thành

cấu trúc dạng sợi bền vững.

Hình 2.3. Cấu trúc phân tử Cellulose

Nguồn: Gardner và cộng sự (1974)

Cellulose có cấu trúc sợi dài, đường kính khoảng 3 nm. Nhiều sợi liên kết

song song với nhau thành chùm nhờ liên kết hidro giữa các nhóm OH, tạo thành vi

sợi. Trong tự nhiên, các vi sợi không đồng nhất, chúng thường tồn tại ở 2 vùng:

- Vùng kết tinh: có cấu trúc trật tự rất cao, chặt chẽ như tinh thể, chiếm khoảng

¾ cấu trúc cellulose (Taiz và cộng sự, 2006). Các mạch cellulose liên kết với nhau

nhờ liên kết hidro giữa nhóm hydroxyl của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch

khác, tạo thành một mạng lưới liên kết hydro dày đặc, ngăn cản sự tác động của

enzyme ở điều kiện bình thường.

- Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Van der Waals do đó

vùng này có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài (Charles

E. Wyman, 1996). Khi gặp nước, chúng dễ bị trương lên, tạo điều kiện thuận lợi

cho enzyme cellulase tấn công dễ dàng, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng.

Tuy vậy việc thủy phân cellulose chỉ có thể đạt hiệu quả cao khi tách cellulose khỏi

các thành phần khác cùng cấu tạo nên màng tế bào thực vật (Tô Kim Anh và cộng

sự, 2010).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.4. Cấu trúc cellulose

Nguồn: Hsu và cộng sự (1980)

2.1.2. Hemicellulose

Hemicellulose là hợp chất polysaccharide chiếm tỷ lệ lớn trên thế giới sau

cellulose. Đây là polysaccharide phức tạp, có phân tử khối nhỏ hơn nhiều so với

cellulose. Chúng được cấu tạo từ các gốc đường khác nhau như arabinose,

galactose, glucose, mannose và xylose. Các gốc đường này liên kết với nhau thông

qua các liên kết 𝛽 – 1,4 glucoside, 𝛽 – 1,3 glucoside và 𝛽 – 1,6 glucoside tạo thành

cấu trúc dạng mạch nhánh. Sự phân nhánh trong cấu trúc của hemicellulose cũng

tạo điều kiện thuận lợi cho dung môi và các chất hóa học tấn công. Cấu trúc của

hemicellulose không bền, dễ bị phân hủy bởi acid loãng hoặc kiềm. Khi bị phân

hủy, hemicellulose tạo thành các monosaccharide (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự,

2012).

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.5. Hemicellulose

Nguồn: Fengel và Wegener (1989)

2.1.3. Lignin

Lignin là hợp chất cao phân tử có nhiều ở thực vật bậc cao (cả thực vật hạt

trần và thực vật hạt kín). Hàm lượng và thành phần lignin thay đổi theo tế bào, mô

và theo nhóm thực vật, ở cây gỗ, lignin chiếm từ 20 – 30%... Lignin có nhiệm vụ

kết dính và tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn

chặn các độc tố và sự xâm nhiễm của các vi sinh vật đồng thời cản trở sự tiếp xúc

của enzyme cellulase với cellulose (Odier và cộng sự, 1992; Nguyễn Đức Lượng và

cộng sự, 2012). Do vậy phân hủy lignin sẽ tạo điều kiện cho thủy phân hiệu quả

cellulose. Các nghiên cứu đã cho thấy có sự tỉ lệ thuận giữa mức độ lignin bị phân

hủy và mức độ thủy phân cellulose ( Kim và cộng sự, 2006).

Hình 2.6. Lignin

Nguồn: J. Pérez và cộng sự (2002)

Đồ án tốt nghiệp

Lignin có cấu tạo vô định hình, kị nước và bền với các tác nhân phân giải

hóa học và sinh học. Dưới tác dụng của bisulfite natri và H2SO4, lignin bị phân giải

tạo ra các hợp chất thơm. Đây là hợp chất được tạo thành từ sự ngưng tụ của các

loại rượu khác nhau, trong đó có ba loại rượu cơ bản là conyferylic, synafilic và

courmarylic. Các loại rượu này liên kết với nhau bằng liên kết C – C và C – O.

2.2. Enzyme cellulase

2.2.1. Phân loại enzyme

Cellulase là enzyme được sinh ra từ nhiều sinh vật khác nhau như nấm mốc,

vi khuẩn, thực vật,…có khả năng thủy phân cellulose. Cellulase có thể tồn tại dưới

dạng enzyme đơn hoặc phức hệ enzyme còn gọi là cellulosome. Dựa vào cơ chế

thủy phân cellulose, enzyme cellulase được Wood và Mc. Cral (1979) chia làm 3

nhóm chủ yếu : endoglucanase, exoglucanase và 𝛽 – glucosidase.

- Endoglucanase hay 1,4 𝛽 – D – glucanohydrolase (EC 3.2.1.4): là enzyme

tham gia phân giải liên kết 𝛽-1.4 glucoside trong cellulose. Sản phẩm của quá trình

phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose. Chúng tham gia tác động mạnh đến

cấu trúc cellulose vô định hình và tác dụng yếu đến cấu trúc cellulose kết tinh.

- Exoglucanase hay 1,4 𝛽 – D – glucan – cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91): cắt

đầu không khử của chuỗi cellulose và giải phóng ra các cellobiose. Enzyme này

không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất

hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endoglucanase phân giải chúng.

- 𝛽 – D – glucoside glucohydrolase hay 𝛽 – glucosidase (EC 3.2.1.21):

enzyme này có tác dụng thủy phân cellobiose và cellodextrine tan tạo thành D –

glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy.

Ba enzym này xúc tác cho các giai đoạn nối tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn

nhau của quá trình thủy phân cellulose thành glucose (Cullen và cộng sự, 1992).

Đồ án tốt nghiệp

2.2.2. Cơ chế tác dụng của cellulase

Trong thiên nhiên, quá trình thủy phân cellulose có sự tham gia của cả ba

loại enzyme là endoglucanase, exoglucanase và 𝛽 – glucosidase. Mỗi loại enzyme

tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định, xúc tác cho các giai đoạn nối

tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn nhau trong quá trình thủy phân từ cellulose thành

glucose (Cullen và cộng sự, 1992). Nhờ vào sự phối hợp hoạt động của các enzyme

này mà cơ chất được thủy phân hoàn toàn.

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme endoglucanase có tác dụng phân cắt

tốt trên vùng vô định hình, đặc biệt trên các cellulose biến tính như carboxymethyl-

cellulose (CMC), hydroxyethyl cellulose (HEC). Ngược lại, enzyme exoglucanase

tác động trên vùng cellulose kết tinh, ít trên vùng cellulose vô định hình và hầu như

không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự,

2012)

Dưới tác dụng của exocellulase và endocellulase, mạch cellulose tách thành

các mạch nhỏ (oligosaccharide), sau đó tiếp tục bị phân cắt thành đường glucose

nhờ enzyme β-glucosidase.

Hình 2.7. Quá trình phân giải cellulose của enzyme cellulase

Đồ án tốt nghiệp

2.2.3. Vi sinh vật sản xuất cellulase

Trong tự nhiên, hệ vi sinh vật có khả năng cellulose vô cùng đa dạng và

phong phú. Nhiều loài nấm hoặc vi khuẩn có phân giải cellulose mạnh ở điều kiện

hiếu khí và kị khí và ở các nhiệt độ khác nhau.

Nấm sợi là nhóm có khả năng tiết một lượng lớn enzyme cellulase có cấu

trúc hoàn chỉnh ra ngoài môi trường nên phân hủy cellulose khá mạnh. Đại diện có

các loài như Trichoderma reesei, T. viridae, Aspergillus niger, Fusarium solani,

Penicillium pinophinum, Sporotrichum pulverulentum. Các loài nấm ưa nhiệt cũng

được chú ý vì chúng có thể sinh các enzyme bền nhiệt, sinh trưởng và phân giải

nhanh cellulose. Nhưng thông thường các chủng nấm sợi phân giải cellulose điển

hình thường thiếu enzyme 𝛽 − glucosidase, vì vậy để hệ này hoạt động hiệu quả

cần phải bổ sung 𝛽 − glucosidase (Lee và cộng sự, 1996).

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đặc biệt, đa số sống trong đất và phát triển

trong điều kiện hiếu khí, một số ít loài có thể sống trong điều kiện kị khí. Một số xạ

khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose là: Streptomyces, Streptosporagium,

Actinomyces nocardia, Micromonospora …(Schimz và cộng sự, 1983).

Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật phân giải cellulose mạnh nhưng cường độ

không bằng nấm do lượng enzyme tiết ra ít hơn. Vi khuẩn hiếu khí và kị khí đều có

thể phân giải cellulose. Các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng phân giải cellulose

khá mạnh như Cellulomonas, Vibrio,…Trong điều kiện yếm khí, các loài vi khuẩn

ưa ấm và ưa nhiệt cũng có khả năng phân giải cellulose. Đại diện điển hình cho các

vi khuẩn ưa ấm phân giải cellulose ở nhiệt độ 30 – 400C là loài Clostridium

omelanskii, vi khuẩn ưa nóng là loài Clostridium thermocellum, nhiệt độ tốt nhất

cho sự phát triển của chúng là 60 – 650C. Các vi khuẩn ưa ấm, ưa nóng phát triển

tốt trên môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải cellulose thành glucose và

cellubiose, chúng sử dụng đường này như nguồn năng lượng (Schwarz WH và cộng

sự, 1986; Schwarz, 2001).

Đồ án tốt nghiệp

Trong tự nhiên, đa số các loài không có khả năng cùng một lúc sinh tổng hợp

tất cả các loại enzyme có trong phức hệ cellulase. Có loài này có khả năng sinh tổng

hợp mạnh loại enzyme này, loài khác lại tổng hợp loại enzyme khác. Chính vì vậy,

sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và không triệt để

(Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2012). Tuy nhiên có một loại vi khuẩn có khả

năng phân hủy cellulose nhanh hơn nhờ vào hệ thống phức hợp đa enzyme. Đó

chính là vi khuẩn Clostridium thermocellum.

2.3. Phức hợp cellulosome trong vi khuẩn Clostridium thermocellum

2.3.1. Tổng quan về vi khuẩn Clostridium thermocellum

Hệ thống phân loại:

Giới: Vi khuẩn

Ngành: Firmicutes

Lớp: Clostridia

Bộ: Clostridiales

Họ: Clostridiaceae

Chi: Clostridium

Loài: Clostridium thermocellum Hình 2.8. Clostridium thermocellum

Clostridium thermocellum là trực khuẩn gram dương, kỵ khí bắt buộc, ưa

nhiệt, sinh bào tử, phát triển tốt ở nhiệt độ từ 600C – 650C và pH từ 6,1 – 7,5 (Freier

và cộng sự, 1988). Đây là một vi sinh vật tiềm năng trong công nghiệp sản xuất cồn

sinh học vì nó có khả năng phân hủy cellulose. Quá trình phân giải cellulose bởi

Clostridium thermocellum là các phản ứng được thực hiện bởi 1 phức hệ enzyme

gắn kết với nhau gọi là cellulosome (Bayer và cộng sự, 1998). Tuy nhiên đây là vi

sinh vật kị khí bắt buộc nên quá trình nuôi cấy đạt hiệu quả không cao, lượng

enzyme tạo ra thấp, khó áp dụng vào quy mô công nghiệp.

Đồ án tốt nghiệp

2.3.2. Đặc điểm của phức hệ cellulosome

Cellulosome là phức hệ đặc biệt gồm nhiều enzyme liên kết với nhau. Phức

hệ này có khả năng phân huỷ cơ chất phức tạp như cellulose vì có chứa đầy đủ các

thành phần enzyme để thuỷ phân triệt để cơ chất này. Vì vậy, cellulosome có thể

thủy phân cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose trong khi các enzyme

đơn lẻ không thể thực hiện được chức năng này.

Cấu trúc quan trọng của cellulosome bao gồm scaffoldin cùng dạng enzyme

hoạt động cho phép thủy phân cellulose một cách có hiệu quả.

Hình 2.9. Cơ chế hoạt động của Cellulosome

Nguồn: Shoham Y và cộng sự (1999)

Scaffoldin là thành phần quan trọng của hệ cellulosome có các vùng chức

năng :

- Kết nối các enzyme thủy phân thuộc phức hợp cellulsome thông qua tương

tác cohesin (scaffoldin) và dockerin (enzyme).

Đồ án tốt nghiệp

- Kết nối phức hợp và các nguồn cơ chất, cellulose nhờ vùng CBD (cellulose-

binding domain).

- Kết nối bề mặt tế bào và phức hợp enzyme nhờ các protein dính kết với bề

mặt tế bào, nhờ đó mà tế bào thuận tiện trong việc sử dụng sản phẩm phân giải cho

quá trình đồng hóa.

Trong cấu tạo của scaffoldin thì cohesin luôn có mặt và là thành phần dính

kết với các dockerin của enzyme. Số lượng các cohesin là khác nhau trong các

scaffoldin khác nhau và có tính đặc trưng cho tương tác của chúng với dockerin

trong các enzyme có nguồn gốc cùng loài. Ví dụ trong Clostridium thermocellum,

scaffoldin bao gồm 9 cohesin loại I nối với các enzyme phân giải qua các dockerin

loại I, các dockerin này không tương tác với các cohesin được tìm thấy trong

scaffoldin của Clostridium cellulolyticum. Bên cạnh đó, một dockerin loại II nối với

các protein bề mặt tế bào qua các cohensin loại II. Tương tác này sẽ gắn chặt cấu

trúc cellulosome lên bề mặt tế bào, giúp quá trình thủy phân cellulose hiệu quả hơn

(Doi và cộng sự, 2004).

CBD (Carbonhydrate binding domain) là một thành phần của scaffoldin, có

chức năng gắn hệ cellulosome vào cơ chất cellulose. Scaffoldin của Clostridium

thermocellum chứa CBD IIIa liên kết rất mạnh với cellulose kết tinh. Ngoài ra nó

còn làm yếu các liên kết giữa các sợi của cellulose kết tinh, thúc đẩy cho quá trình

phân giải tiếp theo (Bayer và cộng sự, 1998).

Ở C. thermocellum có một hệ thống enzyme endoglucanase rất đa dạng bao

gồm: CelA, CelB, CelC, CelD, CelE, CelF, CelG, CelH, CelJ, CelK, CelN, CelO,

CelP, CelQ (Roy H. Doi và Akihiko Kosugi, 2004). Trong đó, endoglucanase CelD

có hoạt tính rất cao được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu. Enzyme này

hoạt động tối ưu ở pH 6,3 và nhiệt độ 600C. Hoạt tính riêng của enzyme này đạt 428

IU/ mg cao hơn nhiều so với các enzyme endoglucanase khác của C. thermocellum

(Gwennael và cộng sự, 2000).

Đồ án tốt nghiệp

Do đó, khi tương tác với scaffoldin thì hoạt tính của enzyme tăng lên nhiều

so với enzyme tự do, giúp cho enzyme gắn chặt với cơ chất hơn và nâng cao hiệu

quả thủy phân.

2.4. Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris

2.4.1. Đặc điểm hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris

Pichia pastoris là sinh vật eukaryote thuộc họ Saccharomycetaceae. Chúng

sinh trưởng ở nhiệt độ từ 28 – 320C. Nếu nhiệt độ môi trường nuôi cấy cao hơn

320C sẽ ảnh hưởng đến quá trình tiết protein của nấm men này. Pichia pastoris là

một trong số không nhiều nấm men có khả năng sử dụng methanol như nguồn

cacbon duy nhất. P. pastoris có hai gen mã hóa enzyme alcohol oxydase (AOX) là

AOX1 và AOX2.

Ứng dụng của P. pastoris trong biểu hiện xuất phát từ việc khai thác

promoter AOX, promoter liên quan đến quá trình đồng hóa methanol. Thông

thường gen biểu hiện protein mong muốn đặt dưới sự kiểm soát của promoter

AOX1. Promoter AOX1 có vai trò quan trọng trong việc điều khiển sự phiên mã

của gen nhân dòng và việc sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp. Promoter AOX2

cũng mã hóa alcohol oxydase nhưng hoạt tính thấp hơn khoảng 10 – 20 lần so với

AOX1 (Daly R, Hearn MT, 2005). Gen ngoại lai chứa trong plasmid tái tổ hợp có

khả năng tích hợp vào hệ gen của P. pastoris nhờ quá trình tiếp hợp và trao đổi

chéo, qua đó làm tăng tính ổn định của gen này trong tế bào chủ (Thân Văn Minh,

2012).

Tất cả các chủng biểu hiện của hệ biểu hiện P. pastoris đều có nguồn gốc từ

chủng dại NRRL-Y 11430. P. pastoris GS115 và KM71 là các chủng đột biến gen

histidinol dehydrogenase (his4) mất khả năng tổng hợp histidine nên các thể biến

nạp có thể được chọn lọc bằng môi trường khuyết dưỡng histidine.

2.4.2. Tích hợp gen ngoại lai vào P. pastoris

Các vector biểu hiện trong P. pastoris được thiết kế tương đồng với locus

AOX1 hay locus his4. Giống như ở S. cerevisiae, DNA dạng thẳng giúp ổn định

Đồ án tốt nghiệp

quá trình biến nạp vào P. pastoris nhờ sát nhập hay tái tổ hợp với trình tự tương

đồng trong bộ gen nấm men. DNA tái tổ hợp có thể tồn tại ổn định với dạng đa bản

sao trong bộ gen tế bào chủ. Ở chủng Mut+ hoặc MutS, gen sát nhập tại locus his4

do sự trao đổi chéo giữa locus his4 của nhiễm sắc thể nấm men và vector biểu hiện.

Kết quả có thể cho một hoặc nhiều bản sao của vector tại vị trí his4 và có kiểu hình

His+. Làm thẳng vector bằng enzyme cắt giới hạn tại vị trí his4, kiểu hình Mut+ hay

MutS tùy thuộc vào chủng chủ sử dụng. Các dòng nấm men tái tổ hợp đa bản sao

của vector biểu hiện chiếm 1-10% các chủng His+ biến nạp (Thân Văn Minh, 2012).

2.4.3. Ưu điểm của hệ thống biểu hiện trên Pichia pastoris

Một số hệ thống biểu hiện phổ biến hiện nay bao gồm: E. coli, B. subtilis, S.

cerevisae, P. pastoris, A. niger và tế bào động vật. Mỗi hệ biểu hiện có những ưu

điểm có những ưu điểm và hạn chế riêng, tùy thuộc sản phẩm protein mà cần lựa

chọn hệ biểu hiện phù hợp.

Nấm men đang là hệ biểu hiện đang được sử dụng rộng rãi hiện nay do có

nhiều ưu điểm. Chúng là các sinh vật nhân chuẩn có khả năng tích hợp gen lạ của

các sinh vật khác vào genome của mình. Ngoài ra chúng là sinh vật nhân chuẩn duy

nhất có khả năng thực hiện các thao tác kĩ thuật di truyền phân tử dễ dàng như khi

thực hiện ở E. coli và có khả năng phát triển rất mạnh trong môi trường nuôi cấy.

Đặc biệt ở nấm men có quá trình sửa đổi sau dịch mã hoàn thiện để trở thành dạng

protein hoạt động và có khả năng tiết protein mạnh với cơ chế điều hòa nghiêm

ngặt, thao tác dễ dàng (R. Daly, M. T. Hearn, 2005).

Pichia pastoris có thể sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy liên tục và có khả

năng lên men với mật độ tế bào cao. Chúng có thể sinh trưởng trên môi trường pH

tương đối thấp từ 3 đến 7 do đó có thể điều chỉnh được pH để giảm thiểu tối đa hoạt

động của protease đối với protein được tiết ra.

Có khả năng sử dụng methanol là nguồn cacbon chính nên môi trường nuôi

cấy chứa nhiều methanol, hạn chế được sự nhiễm của các loài sinh vật khác. Do vậy

nuôi cấy P. pastoris ít bị tạp nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài. Đồng thời methanol là

chất rẻ tiền hơn so với IPTG, chất cảm ứng của hệ thống biểu hiện E. coli.

Đồ án tốt nghiệp

Nấm men P. pastoris tổng hợp protein ngoại lai trong peroxisome, thuận tiện

cho việc vận chuyển và tiết protein. Hệ thống P. pastoris có khả năng sản xuất

lượng lớn protein tái tổ hợp với hàm lượng lên đến gram trên lít.

Vector biểu hiện pPIC9K có trình tự nhân tố α giúp protein mục tiêu được

tiết ra ngoài môi trường nên dễ thu nhận hơn so với các hệ thống biểu hiện khác,

đồng thời protein của bản thân P. pastoris được tiết ra với hàm lượng rất thấp nên

quá trình tinh sạch và thu nhận protein mục tiêu về sau rất dễ dàng.

Quá trình lên men được thực hiện nhanh chóng, dễ dàng thu được sản phẩm

ở dạng gấp cuộn có hoạt tính, mỗi mẻ từ 5-6 ngày, đáp ứng được nhu cầu sản xuất

protein số lượng lớn, các thông số pH, độ thông khí, lượng CO2 có thể được kiểm

soát chặt chẽ.

Ngoài ra P. pastoris không là tác nhân gây bệnh, không chứa virus trong tế

bào và còn có một promoter mạnh có thể kiểm soát chặt chẽ bằng nguồn cacbon.

Với các thuận lợi trên, P. pastoris thu hút được nhiều sự quan tâm và là đối

tượng được lựa chọn để biểu hiện nhiều loại protein, nâng cao được hiệu quả và tiết

kiệm được chi phí sản xuất so với các hệ thống biểu hiện khác.

2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tạo dòng các gen từ Clostridium

thermocellum

Khởi đầu cho những nghiên cứu về hệ enzyme cellulase ở Clostridium

thermocellum là T.Kobayashi và cộng sự (1990). Nhóm nghiên cứu đã tạo hệ

minicellulosome và tiến hành khảo sát hoạt tính phân giải cellulose. Hoạt tính của

hệ cellulosome này cao hơn 8 lần trên Avicel (microcrystalline cellulose powder)

(pH 5,5 – 7; 700C) và hơn 15 lần trên CMC ( (pH 5,5 – 7; 650C) so với dịch

cellulase ngoại bào thô đã được phân tách từ hệ cellulase của C. thermocellum.

Năm 1993, Wang và cộng sự đã nhân dòng và phân tích trình tự gen CelS từ

Clostridium thermocellum ATCC 27405 vào DH1OB. E. coli XL-1 Blue bằng

plasmid pBluescript SK. Đến năm 1994, Wang và các cộng sự của mình tiếp tục tạo

dòng tế bào E. coli DH5𝛼 mang vector biểu hiện pRSET chứa gen mã hóa CelS.

Thông qua phân tích bằng phương pháp Western blot đã phát hiện được protein tái

Đồ án tốt nghiệp

tổ hợp với kích thước tương tự protein từ CelS. Tiến hành kiểm tra định tính khả

năng sinh enzyme cellulase của các dòng E. coli tái tổ hợp, kết quả cho thấy các

dòng này phân hủy rất ít trên môi trường cacboxymethyl cellulose nhưng có khả

năng phân hủy mạnh trên môi trường cellulose tinh thể.

Năm 1996, Mohammad Mainul Ahsan và cộng sự cũng nghiên cứu tạo dòng,

giải trình tự và biểu hiện gen mã hóa cellulase CelJ trong tế bào E. coli JM109. Kết

quả điện di SDS - PAGE cho thấy gen CelJ có khả năng biểu hiện cao trong tế bào

này.

Shen-Long Tsai và cộng sự (2009) đã thiết kế một hệ minicellulosme ba

chức năng từ các enzyme endoglucanase CelA, β-glucosidase BglA của Clostridium

thermocellum, exoglucanase CelE và endoglucanase CelG từ C. cellulolyticum với

hướng biểu hiện bề mặt scaffoldin trên hệ thống biểu hiện Saccharomyces

cerevisiae. Kết quả lên men ethanol với hiệu quả gấp 2,6 lần so với việc sử dụng

các enzyme tinh sạch trên phối hợp với nhau, mặc dù hàm lượng đo được là giống

nhau.

Vào năm 2011, Jian-Ming Liu và cộng sự đã tạo dòng và biểu hiện năm gen

mã hóa enzyme cellobiohydrolase và một gen mã hóa enzyme endoglucanase của

Clostridium thermocellum DSM 1237 là CbhA, CelK, CelO, Cel48Y, Cel48S và

CelA vào hai dòng tế bào Bacillus subtilis WB600 và WB800. Các enzyme

cellulase từ các dòng B. subtilis tái tổ hợp trên có khả năng tiết enzyme hiệu quả

trong môi trường nuôi cấy, có hoạt tính khá tốt trên chất nền photphoric acid

swollen cellulose (PASC). Kết quả cụ thể cho thấy khi khi nghiên cứu biểu hiện

cellobiohydrolase của CbhA, Cel48S, Cel48Y cho hàm lượng enzyme lần lượt là

304, 110 và 153 mg/l, nhưng khi có sự phối hợp CbhA – Cel48S và CbhA – Cel48Y

thì hàm lượng enzyme thu được của mỗi phức hợp lần lượt là 532 mg/l và 611 mg/l.

Bên cạnh đó sự phối hợp giữa CelA với các tỉ lệ CbhA khác nhau cũng cho hàm

lượng từ 761 – 905 mg/l trên chất nền phosphoric acid swollen cellulose (PASC).

Đồ án tốt nghiệp

Tuy nhiên hai gen mã hóa cho CelO và CelK thì chưa được biểu hiện thành công

trên Bacillus subtilis.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tạo dòng gen mã hóa enzyme cellulase từ

Clostridium thermocellum chưa nhiều và chủ yếu được thực hiện trên hệ thống

Bacillus subtilis. Phạm Lương Thắng và cộng sự (2012) đã nghiên cứu tạo dòng và

biểu hiện endoglucanase A (CelA) từ Clostridium thermocellum vào các chủng

Bacillus subtilis 1012 và WB800N. Nguyễn Hoàng Ngọc Phương cũng đã nghiên

cứu đề tài tạo mini – cellulosome từ các protein tái tổ hợp của Clostridium

thermocellum và biểu hiện trên hệ thống Bacillus subtilis.

Hiện nay các nghiên cứu chỉ mới tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa enzyme

cellulase từ Clostridium thermocellum trên các hệ thống E. coli, Bacillus subtilis,

Saccharomyces cerevisiae nhưng chưa có nghiên cứu nào sử dụng hệ thống biểu

hiện Pichia pastoris. Vì thế, nghiên cứu dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa cellulase

từ Clostridium thermocellum trên hệ thống Pichia pastoris là một hướng nghiên cứu

tiềm năng ở Việt Nam và trên thế giới.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu:

3.1.1. Địa điểm nghiên cứu:

Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM.

3.1.2. Thời gian nghiên cứu:

Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2014 đến tháng 7/2014.

3.2. Nguyên liệu

3.2.1. Chủng vi sinh vật

Chủng vi khuẩn Clostridium thermocellum JCM 9322 có nguồn gốc từ hãng

Riken, Nhật Bản.

Chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5𝛼 có nguồn gốc từ hãng Invitrogen,

Hoa Kỳ được sử dụng làm thể nhận trong thí nghiệm biến nạp, chọn dòng và nhân

dòng plasmid tái tổ hợp.

Chủng nấm men Pichia pastoris GS115 có nguồn gốc từ hãng Invitrogen,

Hoa Kỳ được dùng để biểu hiện gen mục tiêu.

3.2.2. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Máy Gel doc (BioRrad), máy li tâm lạnh Centrifuge 5810R

(Eppendorf), máy luân nhiệt (BioRad), bộ điện di DNA (BioRad), máy đo quang

phổ Biomate3 (Thermo EC), tủ ấm (Memmet), máy lắc ổn nhiệt, tủ lạnh -200C

(Sanyo), tủ lạnh sâu -800C (Sanyo), tủ mát 40C (Alaska), cân phân tích (Prescisa),

bộ điện biến nạp ECM399, tủ cấy cấp II.

Dụng cụ:

- Eppendorf 200 µl

- Eppendorf 1500 µl

- Pippetman với đầu típ tương ứng (1000 µl, 100 µl, 10 µl)

- Đĩa petri nhựa, que cấy trang, đèn cồn

- Falcon 50 ml

Đồ án tốt nghiệp

3.2.3. Hóa chất

Hóa chất nhân dòng trong vector pJET1.2: Kit nhân dòng CloneJET™ PCR

Cloning Kit.

Hóa chất tách chiết plasmid: Kit tách chiết plasmid (Plasmid Mini Kit -

Bioline).

Hóa chất tinh sạch DNA từ gel agarose và sản phẩm PCR: Kit tinh sạch

DNA từ gel agarose và sản phẩm PCR (MEGAquick – spin Total Fragment DNA

Purification Kit – INTRON Biotechnololy).

Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn:

Các loại enzyme cắt giới hạn (New England BioLabs) được sử dụng :

SnaBI với trình tự nhận biết:

EcoRI với trình tự nhận biết:

SacI với trình tự nhận biết:

Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Các thành phần cần thiết cho phản ứng

PCR được cung cấp bởi Thermo Scientific : Taq polymerase, dNTP, Taq buffer

10X.

Hóa chất điện di DNA:

- Agarose

- TAE 1X: Tris acetate 40 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0.

- Dung dịch nạp mẫu (loading dye): 0,25% bromophenol blue; 40% glycerol

trong TAE 1X.

- Ethium bromide 10 mg/ml.

- Thang DNA 1 Kb: được cung cấp bởi Invitrogen.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.1. Thang DNA 1 Kb (Nguồn: Invitrogen)

Hóa chất tách chiết bộ gen nấm men

- Nitơ lỏng

- Lysis buffer (50 mM Tris HCl, 50 mM EDTA, 1% 𝛽-mercaptoethanol, 3%

SDS, pH 8,0)

- Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1)

- Isopropanol 100%

- Ethanol 70%

- Dung dịch TE (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0)

Hóa chất kiểm tra định tính hoạt tính enzyme endoglucanase

- Tris – HCl 0,1M

- Congo Red 1%

- NaCl 1M

- Acid acetic 5%.

Đồ án tốt nghiệp

3.2.4. Môi trường

3.2.4.1. Môi trường LB (Luria-Bertani):

Tryptone 10 g

Yeast extract 5 g

NaCl 5 g

Nước cất vừa đủ 1000 ml.

Môi trường thạch có thành phần như môi trường lỏng, bổ sung thêm 2%

agar. Kháng sinh dùng để chọn lọc là ampicillin được bổ sung vào môi trường với

nồng độ cuối là 50 µg/ml.

3.2.4.2. Môi trường MD (Minimal Dextrose):

Sorbitol 182 g

Agar 20 g

Bổ sung 800 ml nước. Hấp khử trùng ở 1210C, 15 phút. Sau đó bổ sung thêm

các thành phần sau:

YNB 10X 100 ml

Biotin 500X 2 ml

D – Glucose 10X 100 ml

3.2.4.3. Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose)

Yeast extract 10 g

Pepton 20 g

Nước cất vừa đủ 900 ml. Hấp khử trùng 1210C, 15 phút. Bổ sung 100 ml

D – Glucose 10X rồi lọc lại với màng lọc 0,2 µm.

3.2.4.4. Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex):

Yeast extract 10 g

Peptone 20 g

Nước cất 700 ml

Hấp khử trùng ở 1210C. Bổ sung thêm các thành phần sau:

Đồ án tốt nghiệp

Potassium photphate buffer 1M 100 ml

YNB 10X 100 ml

Glycerol 10X 100 ml

Biotin 500X 2 ml

3.2.4.5. Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC

Yeast extract 10 g

Peptone 20 g

CMC 0,5% 5 g

Agar 20 g

Thêm 700 ml nước cất. Hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Bổ sung thêm

các thành phần sau:

100 ml Potassium photphate buffer 1M

YNB 10X 100 ml

Methanol 10X 100 ml

Biotin 500X 2 ml

3.2.5. Plasmid

3.2.5.1. Plasmid pJET1.2/blunt

- Kích thước 2974 bp.

- Mang gen kháng ampicillin dùng để chọn lọc tế bào tái tổ hợp

- Mang gen gây độc eco47IR giúp chọn lọc khuẩn lạc mang gen chèn

- Plasmid cho phép gắn chèn đoạn DNA ở dạng đầu bằng

- Plasmid pJET1.2/blunt được sử dụng để nhân dòng.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.2. Plasmid pJET 1.2

(Nguồn : CloneJET™ PCR Cloning Kit #K1231, Fermentas)

3.2.5.2. Plasmid pPIC9K

Plasmid pPIC9K (Invitrogen) dùng biểu hiện gen trong Pichia pastoris GS

115 có những đặc điểm sau:

- Có trình tự tiết nhân tố 𝛼 giúp hỗ trợ tiết protein mục tiêu ra ngoài môi

trường nên dễ thu nhận hơn so với các hệ thống biểu hiện khác protein của Pichia

pastoris được tiết ra với hàm lượng rất thấp nên quá trình tinh sạch và thu nhận

protein mục tiêu về sau rất dễ dàng.

- Có gen mã hóa cho histidinol dehydrogenase giúp Pichia pastoris GS115 có

khả năng tự tổng hợp histidine.

- Có trình tự promoter AOX1 tương đồng với trình tự của AOX1 trong bộ gen

của Pichia giúp chuyển trình tự gen mục tiêu vào bộ gen của tế bào.

- Có chứa trình tự gen HIS4 để chọn lọc thể biến nạp ở P. pastoris khi sử dụng

các chủng khuyết dưỡng histidine.

- Có trình tự gen kháng ampicillin dùng để sang lọc tế bào E. coli tái tổ hợp.

- Có gen kháng Kanamycin giúp Pichia pastoris kháng lại Geneticin dùng để

chọn lọc tế bào P.pastoris tái tổ hợp, đồng thời xác định tương đối số bản sao của

gen được chèn vào bộ gen tế bào dựa vào nồng độ Geneticin tế bào có khả năng

kháng được (4 mg/ml tương ứng 7 – 12 bản sao).

Đồ án tốt nghiệp

- Không có điểm khởi đầu sao chép của nấm men nên khi biến nạp vào trong

tế bào mà plasmid không chèn vào bộ gen sẽ không tồn tại độc lập được trong tế

bào. Đặc điểm này giúp bước sàng lọc tế bào mang gen mục tiêu đơn giản hơn.

Khuẩn lạc nào mọc được trên môi trường có kháng sinh tức là đã có mang trình tự

gen mục tiêu trong bộ gen tế bào.

- Trình tự cắt duy nhất của NotI, BgIII, SacI và SalI dùng để làm thẳng vector

trước khi chuyển vào tế bào Pichia và tạo dạng tái tổ hợp Mut+ (sử dụng methanol

mạnh nên tăng sinh tốt trên môi trường có methanol) hoặc MutS (sử dụng methanol

ít nên tăng sinh chậm trên môi trường có methanol).

Hình 3.3. Plasmid pPIC9K (Nguồn: Invitrogen)

3.2.6. Các cặp mồi sử dụng

Cặp mồi pJET1.2F và pJET1.2R được dùng để khuếch đại vùng trình tự có

mang gen đã được nối vào plasmid pJET1.2.

Cặp mồi CelDF và CelDR được sử dụng để khuếch đại đoạn DNA mã hóa

cho đoạn gen CelD dựa trên trình tự gốc từ Genbank. Hai đoạn mồi này được thiết

kế thêm vị trí cắt của hai enzyme cắt giới hạn là EcoRIvà SnaBI phù hợp với vị trí

cắt của plasmid pPIC9K.

Cặp mồi AOX1F và AOX1R được dùng để khuếch đại vùng trình tự có

mang gen đã được nối vào của plasmid pPIC9K.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi được sử dụng

TÊN MỒI TRÌNH TỰ MỒI (5’ – 3’)

pJET1.2F pJET1.2R ĐỘ DÀI (NU) 23 24

CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG ATACGTAGCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTG CelDF 35 SnaBI

AGAATTCTATTGGTAATTTCTCGATTACC CelDR 29 EcoRI

GACTGGTTCCAATTGACAAGC AOX1F 21

GCAAATGGCATTCTGACATCC AOX1R 21

3.3. Phương pháp nghiên cứu:

3.3.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝜶 chứa plasmid mang gen CelD của

Clostridium thermocellum

3.3.1.1. Thiết kế mồi

Dựa vào trình tự gen CelD của Clostridium thermocellum từ ngân hàng gen

NCBI, thiết kế cặp mồi CelDF/ CelDR để khuếch đại gen CelD kích thước 1824 bp.

Hai đoạn mồi này được thiết kế thêm vị trí cắt của hai enzyme cắt giới hạn là EcoRI

và SnaBI phù hợp với vị trí cắt của plasmid pPIC9K. Cặp mồi CelDF/ CelDR có

trình tự như sau:

CelDF: 5’- ATACGTAGCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTG-3’

SnaBI

CelDR : 5’- AGAATTCTATTGGTAATTTCTCGATTACC-3’

EcoRI

Sau khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR để khuếch đại đoạn gen

CelD, tiến hành phản ứng PCR để thu nhận đoạn gen.

Đồ án tốt nghiệp

3.3.1.2. Thu nhận gen CelD của vi khuẩn C. thermocellum bằng phản ứng PCR

dựa vào cặp mồi đã thiết kế

Sử dụng DNA tổng số của C. thermocellum làm mạch khuôn cho phản ứng

PCR khuếch đại gen CelD với cặp mồi đặc hiệu CelDF và CelDR.

Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR

Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl)

Taq Buffer 10X 1X 2,5

dNTP 10 mM 0,2 mM 0,5

Mồi xuôi 10 µM 0,2 µM 0,5

Mồi ngược 10 µM 0,2 µM 0,5

DNA mạch khuôn - 0,5

Taq polymerase 5 U/µl 1 U 0,25

- 20,25 H2O

Tổng thể tích 25 µl

Thiết lập chu trình nhiệt độ:

950C 950C

720C 720C 30’’ 5’ 520C 2’ 10’

40C 30’’

∞ 30 chu kỳ

Hình 3.4. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR

Đồ án tốt nghiệp

Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2% sẽ được

tinh sạch qua cột bằng bộ kit của INTRON để thu nhận đoạn gen CelD.

3.3.1.3. Quy trình tinh sạch gen theo MEGAquick – spin Total Fragment DNA

Purification Kit – INTRON Biotechnololy

- Cho mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Thêm BNL Buffer theo tỉ lệ Buffer : mẫu là

5 : 1, vortex để hòa tan toàn bộ mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

- Chuyển mẫu vào màng lọc được đặt trong eppendorf mới, ly tâm 13000

vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng.

- Thêm 700 μl dung dịch rửa vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ

dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong 1

phút để làm khô màng. Thực hiện bước này hai lần nếu sau đó sản phẩm được dùng

cho phản ứng nối.

- Chuyển màng lọc vào eppendorf mới. Thêm 40 μl Elution Buffer vào giữa

màng, để yên 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút thu sản phẩm tinh sạch.

Sau khi được tinh sạch, gen CelD được nối vào vector nhân dòng pJET1.2 để

tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD.

3.3.1.4. Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt

Đoạn gen CelD thu nhận từ phản ứng PCR được nối với plasmid nhân dòng

đầu bằng pJET1.2 để tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD. Thực hiện phản ứng nối

với thành phần trong bảng 3.3 và ủ ở nhiệt độ 220C trong 30 phút.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.3. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào plasmid pJET1.2

Thành phần Thể tích (µl)

2X Reaction Buffer 10

DNA 1 (75 – 100 ng)

DNA Blunting Enzyme 1

6 H2O

Vortex nhẹ rồi ủ ở 700C trong vòng 5 – 10 phút

1 pJET1.2/blunt Cloning Vector (50 ng/µl)

1 T4 DNA Ligase (20000 U/ml)

Tổng thể tích 20 µl

Sản phẩm nối CelD và plasmid pJET1.2 được biến nạp vào tế bào E. coli

DH5𝛼 bằng phương pháp hóa biến nạp.

3.3.1.5. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5𝛼 khả nạp

Thu tế bào E. coli phát triển ở pha log, ly tâm và huyền phù tế bào trong

CaCl2. Màng tế bào vi khuẩn dưới tác động của hoá chất sẽ bị thay đổi trở nên xốp,

mỏng hơn và tạo các lỗ giúp cho các phân tử DNA có thể chui vào. Sau đó, các tế

bào được phục hồi lại trên môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp sẽ được phát

hiện trên môi trường chọn lọc.

Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp được tiến hành như sau:

- Cấy một khuẩn lạc E. coli DH5α vào 3 ml môi trường LB, lắc 250

vòng/phút ở 370C qua đêm.

Đồ án tốt nghiệp

- Chuyển 1 ml dịch nuôi cấy qua đêm vào 100 ml LB trong erlen 500 ml, ủ ở

370C, lắc với tốc độ 250 vòng/phút cho tới khi OD600 của dịch nuôi cấy đạt khoảng

0,375 (không được để OD600 quá 0,4).

- Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh. Ngâm trong đá 5 – 10

phút.

- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 1600xg trong 7 phút ở 40C. Bỏ dịch nổi.

- Hoà tan nhẹ nhàng tế bào thu được trong 10 ml CaCl2 100 mM lạnh.

- Ly tâm 1100xg, 5 phút, 40C. Bỏ dịch nổi. Hòa tan tủa nhẹ nhàng trong 10

ml CaCl2 lạnh. Giữ phần tế bào đã hòa tan trong đá 30 phút.

- Ly tâm 1100xg, 5 phút, 40C. Bỏ dịch nổi, hoà tan tủa trong 1,5 ml dung

dịch CaCl2 100 mM lạnh, bổ sung thêm 0,75 ml glycerol 50%.

- Chia 100 µl tế bào vào các tube 1,5 ml đã trữ lạnh trước. Bảo quản tế bào

khả nạp trong tủ -800C, khi sử dụng rã đông các eppendorf chứa tế bào khả nạp

trong bể đá.

3.3.1.6. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp hóa biến nạp

Sản phẩm nối pJET1.2-CelD được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng

phương pháp hóa biến nạp.

Quy trình hóa biến nạp:

- 5 µl plasmid pJET1.2-CelD được trộn đều với 100 µl tế bào E. coli DH5α

khả nạp. Ủ trong đá 30 phút, sau đó sốc nhiệt ở 420C trong 2 phút, tiếp tục ủ đá 10

phút.

- Thêm vào 1 ml môi trường LB lỏng và tiến hành lắc 250 vòng/phút ở 370C

trong 30 phút để phục hồi các tế bào E. coli DH5α.

- Hút 100 µl dịch biến nạp trải trên đĩa petri chứa môi trường thạch LB có bổ

sung kháng sinh ampicillin nồng độ 50 µg/ml.

- Ly tâm 900 µl dịch còn lại ở 4000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi,

thêm vào 100 µl nước vào hòa tan phần sinh khối kết tủa.

Đồ án tốt nghiệp

- Hút toàn bộ dịch hòa tan trải trên đĩa petri chứa môi trường LB có bổ sung

kháng sinh ampicillin nồng độ 50 µg/ml. Ủ đĩa ở 370C trong 14 – 16 giờ. Kiểm tra

các khuẩn lạc phát triển trên đĩa. Thí nghiệm được thực hiện song song với đối

chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp các gen mục tiêu.

3.3.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc

Chọn ngẫu nhiên các dòng E. coli DH5α từ các khuẩn lạc mọc được trên môi

trường kháng sinh, sau đó kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi

pJET1.2F/ pJET1.2R để xác định các khuẩn lạc đó có chứa plasmid tái tổ hợp quan

tâm. Nguyên tắc của kĩ thuật này dựa trên kĩ thuật PCR, trong đó plasmid tái tổ hợp

từ khuẩn lạc sẽ dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. Thực hiện phản ứng PCR theo

chu trình nhiệt độ đã tối ưu trong hình 3.5 với các thành phần trong bảng 3.4.

Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R

Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl)

2,5 Buffer 10X 1X

0,5 dNTP 10 mM 0,2 mM

0,5 Mồi xuôi 10 µM 0,2 µM

0,5 Mồi ngược 10 µM 0,2 µM

0,5 Dịch huyền phù khuẩn lạc -

0,25 Taq polymerase 5 U/µl 1 U

20,25 - H2O

Tổng thể tích 25 µl

Đồ án tốt nghiệp

950C 950C

720C 720C 950C 30’’ 5’ 600C 2’ 720C 10’

40C

40C ∞ 30’’ 30’’ 30 chu kỳ

Hình 3.5. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi

pJET1.2F/pJET1.2

Kiểm tra sản phẩm PCR khuẩn lạc bằng điện di trên gel agarose 1,2%. Từ

kết quả PCR, chọn những dòng có khả năng mang plasmid tái tổ hợp để tách

plasmid và cắt kiểm tra với hai enzyme EcoRI và SnaBI. Sau khi kiểm tra các dòng

E. coli DH5α tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn, chọn một số dòng cho sản

phẩm cắt phù hợp để giải trình tự với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R.

3.3.1.8. Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào E. coli

Sử dụng bộ kit Plasmid Mini Kit của Bioline để tách plasmid. Quy trình tách

chiết như sau:

- Nuôi cấy khuẩn lạc trong trong 5 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút

ở 370C cho đến khi OD600 đạt 1 – 1,5.

- Dịch huyền phù được ly tâm 13000 vòng/phút ở 160C trong 30 giây, thu sinh

khối, loại bỏ dịch nổi.

- Thêm vào 420 μl Resuspension Buffer, vortex mạnh để hòa tan sinh khối.

Chuyển toàn bộ dịch vào eppendorf 1,5 ml.

- Thêm 420 μl Lysis Buffer để ly giải tế bào. Đóng nắp và đảo eppendorf

nhiều lần. Chú ý không được vortex, thời gian thực hiện bước này không được quá

5 phút.

- Thêm 500 μl Neutralization buffer và đảo eppendorf nhiều lần. Dung dịch sẽ

trở nên đục và kết tủa. Sau đó ủ trong đá lạnh 5 phút.

Đồ án tốt nghiệp

- Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút, thu dịch nổi chuyển vào màng

lọc được đặt trong eppendorf mới.

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây, bỏ dịch, thu phần phía trên màng lọc.

Thêm 700 μl Washing buffer và ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây. Đổ bỏ dịch

bên dưới, thu phần trên màng.

- Làm khô màng bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây. Chuyển

màng lọc vào eppendorf mới và ủ ở 500C, thêm 30 – 50 μl Elution buffer vào giữa

màng, để yên 1 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 60 giây để thu plasmid.

3.3.1.9. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn

Để xác định chính xác DNA ngoại lai đã được chèn vào vector mong muốn,

plasmid mang gen tái tổ hợp được cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra..

Các vị trí cắt giới hạn của hai enzyme cắt SnaBI và EcoRI được thiết kế ở hai

đầu các cặp mồi khuếch đại gen CelD nên phản ứng cắt plasmid tổng số với hai

enzyme cắt vừa được sử dụng trong quá trình sàng lọc dòng E. coli DH5α tái tổ hợp

vừa được sử dụng trong quá trình tạo vector biểu hiện mang gen mục tiêu.

Phản ứng cắt DNA bằng enzyme SnaBI và EcoRI để kiểm tra sự hiện diện

của đoạn gen CelD gồm các thành phần trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Thành phần phản ứng cắt pJET1.2-CelD với SnaBI và EcoRI

Thành phần Thể tích (µl)

Buffer CutSmart 10X 2

pJET1.2-CelD 1 µg

SnaBI (5000 U/ml) 0,4

EcoRI (20000 U/ml) 0,5

vừa đủ 20 µl H2O

Đồ án tốt nghiệp

Phản ứng cắt được thực hiện ở 370C trong 3 giờ. Bất hoạt enzyme ở 800C

trong 20 phút. Sau đó tiến hành kiểm tra sản phẩm cắt bằng điện di trên gel agarose.

Chọn lọc dòng E. coli DH5α mang plasmid pJET1.2-CelD tiến hành giải trình tự

kiểm tra trình tự gen mục tiêu.

3.3.1.10. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương

ứng trên ngân hàng Gen

Plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD sau khi được kiểm tra bằng phản ứng PCR

và phản ứng cắt sẽ được giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) với cặp mồi

pJET1.2F/ pJET1.2R. Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên máy tính bằng

phần mềm Genetyx, blast trên NCBI để so sánh và phân tích sự tương đồng của

trình tự này với trình tự gen CelD đã được công bố trên ngân hàng Gen.

3.3.2. Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝜶 chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD

Gen mã hóa CelD thu nhận từ vector nhân dòng pJET1.2-CelD bằng phản

ứng cắt giới hạn với hai enzyme EcoRI và SnaBI. Sản phẩm cắt được điện di và tinh

sạch từ gel agarose 0,8% để tiến hành thu nhận gen, chuẩn bị cho giai đoạn gắn

chèn vào vector biểu hiện pPIC9K. Plasmid pPIC9K cũng được cắt bởi enzyme

EcoRI và SnaBI, sau đó được nối với gen CelD bằng T4 DNA ligase để thu được

plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào E. coli

DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp tương tự như đối với vector pJET1.2.

3.3.2.1 Chuẩn bị dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn

Plasmid pJET1.2-CelD được cắt với hai enzyme EcoRI và SnaBI để thu

nhận đoạn gen CelD, vector biểu hiện pPIC9K được cắt mở vòng cũng với hai

enzyme trên.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid pPIC9K và pJET1.2-CelD với

SnaBI và EcoRI

Thành phần pPIC9K CelD

Buffer CutSmart 10X 20 µl 20 µl

pPIC9K 10 µg -

Plasmid pJET1.2-CelD - 10 µg

SnaBI (5000 U/ml) 4 µl 4 µl

EcoRI (20000 U/ml) 5 µl 5 µl

vừa đủ 200 µl vừa đủ 200 µl H2O

Phản ứng cắt được thực hiện ở 370C trong 3 giờ. Bất hoạt enzyme ở 800C

trong 20 phút. Sản phẩm cắt được tinh sạch qua cột. Sau đó, nối gen CelD vào

plasmid biểu hiện pPIC9K đã cắt mở vòng để tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD.

3.3.2.2. Quy trình tinh sạch gen và plasmid theo MEGAquick-spin PCR & Agarose

Gel DNA Extraction System – INTRON

- Cho mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Thêm BNL Buffer theo tỉ lệ Buffer : mẫu là

5:1, vortex để hòa tan toàn bộ mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

- Chuyển mẫu vào màng lọc được đặt trong eppendorf mới, ly tâm 13000

vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng.

- Thêm 700 μl Washing Buffer vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ

bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong

1 phút để làm khô màng. Thực hiện bước này hai lần nếu sau đó sản phẩm được

dùng cho phản ứng nối.

Đồ án tốt nghiệp

- Chuyển màng lọc vào eppendorf mới. Thêm 40 μl Elution Buffer vào giữa

màng, để yên 1 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút thu sản phẩm tinh sạch

3.3.2.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD

Sau khi tinh sạch, đoạn gen CelD được nối vào vector biểu hiện pPIC9K đã

mở vòng bằng T4 DNA ligase. Nồng độ của đoạn DNA cần nối và vector đã cắt mở

vòng tương ứng theo tỷ lệ 3:1 để tạo thành plasmid tái tổ hợp.

Hỗn hợp phản ứng nối được ủ ở 220C trong 2 giờ. Sau khi nối, tiến hành biến

nạp plasmid mang gen mục tiêu vào tế bào E. coli DH5α khả nạp bằng phương pháp

hóa biến nạp.

Bảng 3.7. Thành phần phản ứng nối gen CelD vào vector biểu hiện pPIC9K

Thành phần phản ứng Nồng độ phản ứng Thể tích (µl)

T4 DNA ligase buffer 10X 1X 2

T4 DNA ligase (20000 U/ml) 20 U 1

pPIC9K 200 ng -

CelD 118 ng -

- vừa đủ 20 µl H2O

3.3.2.4. Chuẩn bị tế bào E. coli DH5𝛼 khả nạp

Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 3.3.1.5.

3.3.2.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E. coli DH5𝛼

Biến nạp được thực hiện như mục 3.3.1.6. Thí nghiệm được thực hiện song

song với đối chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp các

gen mục tiêu. Mẫu đối chứng dương là tế bào E. coli DH5α chứa vector pPIC9K và

không có đoạn chèn CelD. Tế bào sau khi biến nạp được trải trên môi trường đĩa

thạch LB chứa 50 µg/ml ampicillin và ủ ở 370C trong 16 giờ.

Đồ án tốt nghiệp

3.3.2.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc

Chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc sinh trưởng được trên môi trường kháng

sinh và kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/AOX1R.

Cặp mồi AOX1F/AOX1R cho phép xác định vector biểu hiện pPIC9K có mang

đoạn gen chèn CelD. Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc tương tự mục 3.3.1.7 với

chu trình nhiệt độ như hình 3.6.

950C 950C

720C 720C 950C 30’’ 5’ 540C 2’30’’ 720C 10’

40C

40C ∞ 30’’ 30’’ 30 chu kỳ

Hình 3.6. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi

AOX1F/ AOX1R

3.3.2.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng enzyme cắt giới hạn

Các khuẩn lạc cho kết quả dương tính khi thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc

với cặp mồi AOX1F/ AOX1R được nuôi cấy để tách plasmid như mục 3.3.1.8. và

kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn với SnaBI và EcoRI. Sau đó chọn ra một dòng

E. coli DH5α mang plasmid pPIC9K-CelD để giải trình tự kiểm tra trình tự gen mục

tiêu.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.8. Thành phần phản ứng cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI

Thành phần Thể tích (µl)

Buffer CutSmart 10X 2

pPIC9K-CelD 1 µg

SnaBI (5000 U/ml) 0,4

EcoRI (20000 U/ml) 0,5

vừa đủ 20 µl H2O

3.3.2.8. Xác định trình tự gen và so sánh trình tự gen thu được với trình tự tương

ứng trên ngân hàng Gen

Plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD sau khi được kiểm tra bằng phản ứng PCR

khuẩn lạc và phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn sẽ chọn ra một dòng E. coli

DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD gửi đi giải trình tự để kiểm tra trình tự

gen mục tiêu đồng thời chuẩn bị cho thí nghiệm biến nạp vector biểu hiện vào

Pichia pastoris.

3.3.3. Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa

enzyme endoglucanase D

Plasmid pPIC9K-CelD được thu nhận từ các dòng E. coli DH5α tái tổ hợp đã

qua kiểm tra được làm thẳng bằng enzyme cắt giới hạn SacI để tăng khả năng trao

đổi chéo giữa plasmid và bộ gen của tế bào nấm men, cũng như để tạo được chủng

P. pastoris tái tổ hợp dạng Mut+. Plasmid pPIC9K-CelD dạng thẳng được chuyển

vào tế bào P. pastoris GS115 bằng phương pháp điện biến nạp. Do có sự tương

đồng giữa trình tự gen mã hóa cho histidinol dehydrogenase trên bộ gen của tế bào

P. pastoris và trên plasmid nên xảy ra tái tổ hợp tương đồng, dẫn đến việc gen mục

tiêu từ plasmid được chuyển nạp vào trong bộ gen của tế bào Pichia pastoris.

Đồ án tốt nghiệp

3.3.3.1. Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp

- Tăng sinh một khuẩn lạc Pichia pastoris trong 5 ml môi trường YPD, lắc

250 vòng/phút ở 280C qua đêm.

- Lấy 0,1 – 0,5 ml dịch tế bào cho vào 50 ml môi trường YPD trong erlen 2 lít.

Nuôi cấy như trên với điều kiện qua đêm cho đến khi OD600 nm = 1,3 – 1,5.

- Ly tâm 1500xg trong 5 phút và ở 40C để thu tế bào. Sau đó huyền phù cặn tế

bào với 50 ml nước lạnh vô trùng.

- Ly tâm tương tự bước trên. Bỏ dịch nổi .Sau đó huyền phù cặn tế bào với 25

ml nước lạnh vô trùng.

- Ly tâm 1500xg trong 5 phút. Bỏ dịch nổi. Huyền phù tế bào trong 20 ml

sorbitol 1M lạnh.

- Ly tâm như trên, huyền phù cặn tế bào trong 1 ml sorbitol 1M lạnh cho 1,5

ml. Sau đó hút 80 µl dịch tế bào nấm men khả nạp ra các eppendorf. Nên dùng ngay

vì hiệu suất sẽ giảm đáng kể khi giữ ở -800C.

3.3.3.2. Phương pháp điện biến nạp

Quy trình điện biến nạp:

- Trộn 80 µl tế bào P. pastoris khả nạp với 10 – 15 µg plasmid đã được làm

thẳng bằng enzyme cắt giới hạn (trong 5 – 10 µl buffer TE). Chuyển vào cuvette 0,2

cm đã được giữ trong đá lạnh trước. Tiếp tục ủ trong đá lạnh 5 phút.

- Thực hiện điện biến nạp ở hiệu điện thế 1500V trong 5 giây bằng bộ điện

biến nạp ECM399.

- Thêm nhanh chóng 1 ml sorbitol 1M vào cuvette biến nạp. Chuyển dịch tế

bào sang một eppendorf mới vô trùng.

- Trải 200 µl dịch tế bào đã biến nạp trên môi trường MD. Ủ đĩa ở 280C cho

đến khi khuẩn lạc xuất hiện. (khoảng từ 3 – 5 ngày).

- Các plasmid dạng vòng (phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn chưa hoàn

toàn) sẽ không tồn tại được trong tế bào nấm men do plasmid pPIC9K được thiết kế

không có trình tự khởi đầu sao chép của nấm men. Ngoài ra chỉ có những tế bào

Đồ án tốt nghiệp

nấm men P. pastoris biến nạp thành công mới có khả năng tự tổng hợp histidine vả

phát triển trên môi trường MD. Vì vậy chỉ có những tế bào có sự sáp nhập thành

công giữa plasmid và bộ gen của nấm men thì gen mục tiêu mới tồn tại ổn định

trong tế bào, đồng thời có khả năng kháng lại kháng sinh geneticin (G418).

3.3.3.3. Chọn lọc các dòng Pichia pastoris mang nhiều bản sao của gen CelD

Do vector pPIC9K có chứa gen kháng G418 nên các dòng tế bào P. patoris

và có khả năng năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D

có mang gen CelD sẽ phát triển được trên môi trường YPD có kháng sinh G418.

Các khuẩn lạc thu nhận được trên môi trường YPD có nồng độ kháng sinh G418 là

4 mg/ml tương ứng có khoảng 7 – 12 bản sao của gen mục tiêu. Tiến hành sàng

lọc các dòng P. pastoris tái tổ hợp trên các nồng độ kháng sinh 0,25 – 4 mg/ml.

Chọn một số dòng P. pastoris có thể mọc trên môi trường chứa nồng độ kháng

sinh cao nhất, tách chiết DNA và kiểm tra sự sát nhập gen CelD vào bộ gen của

nấm men bằng PCR với cặp mồi AOX1F/AOX1R, đồng thời phân tích định tính

khả năng phân hủy cellulose của các P. pastoris tái tổ hợp trong thí nghiệm tiếp

theo.

3.3.3.4. Phương pháp ly trích DNA tổng số

Quy trình ly trích DNA dựa trên quy trình ly trích của Lee và Taylor

(1990).

- Chọn lọc 1 số dòng Pichia pastoris phát triển được trên môi trường YPD

chứa 4 mg/ ml G418 tăng sinh trong BMGY lỏng qua đêm ở 280C để ly trích DNA

tổng số.

- Sinh khối nấm men được nghiền trong eppendorf với nitơ lỏng đến khi mịn.

Đối với những ống chưa sử dụng ngay được giữ ở -800C.

- Cho 600 µl Lysis buffer 2X vào eppendorf có chứa sinh khối nấm, vortex

mạnh cho đến khi tạo huyền phù đồng nhất, giúp cho việc phá vỡ tế bào được tốt

hơn.

- Ủ ở 650C trong 1 giờ, cứ 20 phút đảo mẫu một lần.

Đồ án tốt nghiệp

- Cho 450 µl Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1) vào đảo đều, để 5

phút ở nhiệt độ phòng.

- Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 rpm ở 40C trong 5 phút.

- Thu dịch nổi (300 – 400 µl) cho vào eppedorf mới. Cho 180 – 240 µl

isopropanol lạnh vào (nồng độ 100%, đảm bảo thể tích isopropanol gấp 0,6 lần

dịch nổi), lắc mạnh rồi ủ ở tủ -200C trong 20 phút. Ly tâm 13000 rpm, 7 phút ở

40C. Tiến hành thu tủa, bỏ dịch nổi.

- Cho 300 – 400 µl ethanol 70% vào eppendorf rửa tủa. Vortex nhẹ và ly tâm

13000 rpm , 7 phút ở 40C. Tiến hành rửa tủa lặp lại 2 lần.

- Để khô tự nhiên, cho khoảng 30 – 50 µl TE buffer vào, trộn nhẹ và bảo

quản ở -200C.

- Sản phẩm DNA tổng số được kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel

0,8%.

3.3.3.5. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương

pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R

Nhằm kiểm tra khả năng sát nhập của vector tái tổ hợp chứa gen CelD vào bộ

gen của nấm men, các dòng nấm men tái tổ hợp mọc trên môi trường YPD có nồng

độ kháng sinh G418 là 4 mg/ml được tăng sinh trong môi trường BMGY ở 280C

qua đêm để tách chiết DNA bộ gen, sau đó thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi

AOX1F/AOX1 theo thành phần trong bảng 3.2 và chu trình nhiệt độ đã tối ưu trong

hình 3.7.

950C 950C

720C 720C 30’’ 5’ 540C 2’30’’ 10’

40C 30’’

∞ 30 chu kỳ

Hình 3.7. Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R

Đồ án tốt nghiệp

3.3.5. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ

hợp

Các dòng nấm men tái tổ hợp phát triển trên nồng độ kháng sinh cao nhất

được tăng sinh trong môi trường BMGY. Sau đó các dòng tế bào này được sàng lọc

biểu hiện trên đĩa thạch môi trường BMMY có bổ sung 0,5% cơ chất

Carboxymethyl Cellulose (CMC), ủ ở 280C trong 72 giờ. Các dòng có khả năng

sinh enzyme cellulase sẽ phân hủy được CMC và tạo vòng phân giải khi nhuộm với

thuốc nhuộm đỏ Congo. So sánh vòng phân giải của các chủng Pichia pastoris tái tổ

hợp.

Quy trình nhuộm thuốc đỏ Congo theo Nakazawa, H. và cộng sự (2008):

- Các đĩa nuôi cấy được rửa bằng 2 – 3 ml Tris – HCl 0,1M, pH 8,0.

- Nhỏ 2 ml thuốc nhuộm đỏ Congo 1% lên đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30

phút.

- Rửa thuốc nhuộm bằng 5 – 7 ml NaCl 1M.

- Rửa lần cuối bằng dung dịch acid acetic 5% và quan sát vòng phân giải. Những

đĩa có xuất hiện vòng phân giải chứng tỏ dòng đó có tiết endoglucanase có hoạt tính.

- Đối chứng âm là chủng Pichia pastoris không chứa plasmid tái tổ hợp

pPIC9K-CelD.

Từ kết quả so sánh đường kính vòng phân giải, chọn ra những chủng có khả

năng tiết enzyme cellulase ngoại bào mạnh để nghiên cứu biểu hiện và xác định

hoạt tính endoglucanase của các dòng này.

Xử lí số liệu: các dữ liệu được xử lý thống kê ANOVA với mức ý nghĩa 95%

bằng phầm mềm Statgraphic 7.0.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝜶 chứa plasmid mang gen CelD của

Clostridium thermocellum

4.1.1. Khuếch đại gen CelD bằng kĩ thuật PCR

Dựa vào trình tự gen CelD trên ngân hàng gen, thiết kế cặp mồi đặc hiệu

CelDF và CelDR để khuếch đại đoạn gen. Cặp mồi được thiết kế thêm vào trình tự

cắt đặc hiệu của hai enzyme giới hạn là SnaBI và EcoRI nên khi xử lý bằng hai

enzyme này sẽ cho ra đoạn DNA một đầu bằng và một đầu so le. Đây là cơ sở tạo

điều kiện thuận lợi cho quá trình ghép nối và tạo khung dịch mã đúng trong quá

trình biểu hiện protein tái tổ hợp sau này.

DNA tổng số được sử dụng làm mạch khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi

đặc hiệu CelDF/ CelDR dùng cho gen CelD.

Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD

Giếng 1 – 3: sản phẩm khuếch đại đoạn gen CelD bằng phản ứng PCR với cặp mồi

CelDF/ CelDR; N: đối chứng âm; M: thang DNA 1 Kb

Đồ án tốt nghiệp

Theo NCBI, gen mã hóa cho CelD của Clostridium thermocellum có kích

thước 2286 bp (mã số GenBank là X04584.1). Tuy nhiên, cặp mồi được thiết kế chỉ

để khuếch đại đoạn gen có kích thước 1824 bp (từ vị trí 324 đến 2147) mã hóa

peptide có hoạt tính. Kết quả điện di sản phẩm PCR ở hình 4.1 cho thấy giếng 1, 2,

3 hiện các vạch có kích thước khoảng 1800 bp, phù hợp với kích thước của gen mục

tiêu tại vị trí mồi bắt cặp, đồng thời đối chứng âm không hiện vạch. Như vậy đoạn

gen CelD đã được khuếch đại thành công bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc

hiệu, sản phẩm PCR này hoàn toàn đạt yêu cầu làm nguyên liệu cho thí nghiệm

nhân dòng gen tiếp theo.

4.1.2. Tạo dòng E. coli mang plasmid nhân dòng chứa gen CelD

Đoạn gen CelD sau khi tinh sạch qua cột sẽ được nối với vector nhân dòng

pJET1.2 nhờ enzyme nối T4 DNA ligase. Sản phẩm nối pJET1.2-CelD được biến

nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5𝛼 bằng phương pháp hóa biến nạp. Các chủng

biến nạp mang gen mục tiêu được sàng lọc trên môi trường thạch LB có bổ sung

ampicillin (50 µg/ml) ở 370C qua đêm. Thí nghiệm được thực hiện song song với

đối chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp. Kết quả thu

nhận được trên đĩa biến nạp các khuẩn lạc như hình 4.2.

A B

Hình 4.2. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp

pJET1.2-CelD trên môi trường LB/ Ampicillin (50µg/ml)

A: Đĩa đối chứng âm; B: Đĩa biến nạp

Đồ án tốt nghiệp

Do plasmid pJET1.2 có chứa gen kháng kháng sinh ampicillin nên chỉ tế bào

E. coli DH5𝛼 mang vector này mới có thể sinh trưởng trên môi trường LB có bổ

sung ampicillin. Bên cạnh đó, vector pJET1.2/blunt mang gen gây độc eco47IR nên

nếu tự đóng vòng sẽ biểu hiện enzyme giới hạn gây chết sau khi biến nạp và không

nhân lên được. Vì vậy chỉ có các dòng tế bào E. coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp

mới sinh trưởng trên đĩa môi trường LB có bổ sung ampicillin.

4.1.3. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc

Đoạn gen CelD sau khi chèn vào plasmid pJET1.2 được biến nạp vào E. coli

DH5𝛼. Để khẳng định các thể biến nạp thu được chứa plasmid tái tổ hợp, tiến hành

chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc sinh trưởng trên môi trường đĩa thạch LB/ampicillin

và thực hiện phản ứng PCR các khuẩn lạc bằng cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R.

Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng

E. coli DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R

Giếng 1 – 6: E. coli DH5α /pJET1.2-CelD (E1 – E6); M: thang DNA;N: Đối chứng âm

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R

cho thấy từ giếng 1 đến giếng 6 đều cho vạch có kích thước khoảng 2000 bp. Kích

thước này tương ứng với tổng kích thước lý thuyết của gen CelD khi chèn vào

plasmid pJET1.2. Để chắc chắn, chọn lọc ngẫu nhiên một số dòng E. coli DH5α

tách chiết plasmid, kiểm tra bằng phương pháp PCR, enzyme cắt giới hạn và giải

trình tự.

4.1.4. Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu

CelDF/ CelDR và enzyme cắt giới hạn

Ba dòng tế bào E. coli DH5α cho đúng kích thước mục tiêu ở trên được chọn

ngẫu nhiên và tăng sinh qua đêm trong môi trường LB lỏng để tách chiết plasmid

và thực hiện kiểm tra bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR, cắt với

hai enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI nhằm xác định các dòng E. coli DH5α

mang gen CelD. Vị trí cắt của hai enzyme này được thiết kế ở đầu 5’ của hai cặp

mồi khuếch đại các gen mục tiêu. Những dòng tế bào có plasmid pJET1.2-CelD sẽ

bị cắt thành hai đoạn có kích thước tương ứng với kích thước của plasmid pJET1.2

(2974 bp) và của gen CelD (1824 bp). Chọn một dòng gửi giải trình tự và tiến hành

chuyển gen mục tiêu sang vector biểu hiện.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm của cắt plasmid pJET1.2 – CelD

bằng enzyme SnaBI và EcoRI và sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp

pJET1.2-CelD với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR

Giếng 1 - 3: plasmid pJET1.2-CelD cắt bằng SnaBI vả EcoRI (E1 – E3); giếng 4 –

6: sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi CelDF/ CelDR; 7: sản

phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi pJET1.2F/ pJET1.2R; M:

thang chuẩn DNA 1 Kb; N: đối chứng âm.

Kết quả điện di sản phẩm cắt các plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD bằng

enzyme SnaBI và EcoRI ở giếng 1, 2, 3 tương ứng với các dòng E. coli DH5α E1,

E2, E3 đều cho hai vạch rõ nét. Một vạch có kích thước khoảng 3000 bp tương ứng

với kích thước lý thuyết của plasmid pJET1.2 khi mở vòng (2974 bp) và một vạch

có kích thước khoảng 1800 bp tương ứng với kích thước của gen CelD là 1824 bp.

Bên cạnh đó giếng 4, 5, 6 là sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với

cặp mồi đặc hiệu của đoạn gen, cho các cho vạch có kích thước khoảng 1800 bp so

với thang chuẩn tương ứng với kích thước của đoạn gen CelD là 1824 bp. Vạch này

thấp hơn vạch điện di sản phẩm PCR plasmid pJET1.2-CelD với cặp mồi

pJET1.2R/ pJET1.2R là 2000 bp ở giếng 7. Dựa vào kết quả điện di, nhận thấy phản

Đồ án tốt nghiệp

ứng cắt hoàn toàn bình thường, hiệu suất cắt của cả hai enzyme đều tốt, tất cả các

plasmid đã được cắt hoàn toàn và đưa về dạng mạch thẳng, di chuyển cùng với vị trí

của thang tương ứng với kích thước của nó. Như vậy, các dòng E. coli DH5α E1,

E2, E3 có khả năng chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD.

4.1.5. Kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5𝜶 chứa plasmid pJET1.2-CelD bằng giải

trình tự

Trong quá trình tiến hành kĩ thuật PCR, sai sót có thể xảy ra, đặc biệt là sự

thay đổi nucleotide trong gen CelD. Những sai sót này có thể nhỏ nhưng lại ảnh

hưởng lớn đến kết quả biểu hiện gen. Sự thay thế nucleotide không mong muốn có

thể tạo ra một trình tự mã kết thúc. Sự mất hay thêm nucleotide dẫn đến sai cấu trúc

dịch mã tạo ra protein không chính xác. Chính vì vậy, từ kết quả sàng lọc bằng PCR

khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R và kiểm tra bằng PCR với cặp mồi

CelDF/ CelDR cũng như phản ứng cắt giới hạn với hai enzyme SnaBI và EcoRI,

chọn ra dòng E. coli DH5α E2 gửi đi giải trình tự bằng cặp mồi pJET1.2F/

pJET1.2R tại công ty Macrogen (Hàn Quốc).

Kết quả giải trình tự được xử lý bằng phần mềm Genetyx, xác định được

khoảng 600 nucleotide của trình tự cần biết trong plasmid pJET1.2. Khi blast trình

tự DNA này lên NCBI, nhận thấy trình tự này có sự tương đồng 99% với trình tự có

mã số X04584.1 được công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI.

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen CelD trong plasmid tái tổ hợp

Query 4 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 63 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 324 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 383 Query 64 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 123 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 384 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 443 Query 124 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 183 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 444 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 503

pJET1.2-CelD với trình tự có mã số X04584.1 bằng công cụ BLAST của NCBI.

Query 184 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTT 209 |||||||||||||||||||||||||| Sbjct 504 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTT 529 ... Query 1 AGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACAATGATTATGTAAAT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1593 AGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACAATGATTATGTAAAT 1652 Query 61 GCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACAACAGGTCTTATGTA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1653 GCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACAACAGGTCTTATGTA 1712 Query 121 ACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTTCAGGGGCTGACGGA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1713 ACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTTCAGGGGCTGACGGA 1772 Query 181 ATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCGGACCGAAGGATTGG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1773 ATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCGGACCGAAGGATTGG 1832 Query 241 GTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACTGGAATGCGGCATTG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1833 GTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACTGGAATGCGGCATTG 1892 Query 301 ATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTGCTCAAAATGAAGTACTGTACGGA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| Sbjct 1893 ATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTCCTCAAAATGAAGTACTGTACGGA 1952 Query 361 GATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGTTAAAAAGATATGTT 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1953 GATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGTTAAAAAGATATGTT 2012 Query 421 CTTAAAGCCGTCTCA 435 ||||||||||||||| Sbjct 2013 CTTAAAGCCGTCTCA 2027

Đồ án tốt nghiệp

Trình tự thu nhận được của gen CelD trong plasmid pJET1.2 được xử lý

bằng phần mềm DNAClub để chuyển từ trình tự nucleotide sang trình tự amino

acid. Khi blast trình tự amio acid này lên NCBI, nhận thấy trình tự protein này

Query 2 AKITENYQFDSRIRLNSIGFIPNHSKKATIAANCSTFYVVKEDGTIVYTGTATSMFDNDT 61 Sbjct 42 AKITENYQFDSRIRLNSIGFIPNHSKKATIAANCSTFYVVKEDGTIVYTGTATSMFDNDT 101 Query 62 KETVYIAD 69 Sbjct 102 KETVYIAD 109 … Query 1 RQTMILQVANKISPNNDYVNAALDAISHVFGRNYYNRSYVTGLGINPPMNPHDRRSGADG 60 Sbjct 465 RQTMILQVANKISPNNDYVNAALDAISHVFGRNYYNRSYVTGLGINPPMNPHDRRSGADG 524 Query 61 IWEPWPGYLVGGGWPGPKDWVDIQDSYQTNEIAINWNAALIYALAGFVNYNSAQNEVLYG 120 Sbjct 525 IWEPWPGYLVGGGWPGPKDWVDIQDSYQTNEIAINWNAALIYALAGFVNYNSAQNEVLYG 584 Query 121 DVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVS 145 Sbjct 585 DVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVS 609

tương đồng 100% với trình tự đã công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI.

Đồ án tốt nghiệp

Do đoạn gen có kích thước 1824 bp trong khi giải trình tự chỉ có thể giải

được khoảng 1200 bp nên không thể giải toàn bộ trình tự của đoạn gen CelD. Tuy

nhiên, dựa vào trình tự đã biết có thể kết luận rằng đã thu nhận thành công đoạn gen

mã hóa cho enzyme endoglucanase D từ Clostridium thermocellum và nhân dòng

thành công gen CelD trong vector pJET1.2. Từ đó, tiến hành tạo dòng vào E. coli

DH5α thông qua vector biểu hiện pPIC9K.

4.2. Tạo dòng tế bào E. coli DH5𝛂 chứa plasmid pPIC9K mang gen CelD

Sau khi kiểm tra bằng phương pháp giải trình tự, plasmid pJET1.2 tái tổ hợp

của dòng E2 và plasmid pPIC9K được cắt với enzyme cắt giới hạn là SnaBI và

EcoRI. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó tiến hành thu nhận

đoạn gen trực tiếp từ gel điện di để loại bỏ các sản phẩm phụ không mong muốn

đồng thời để hạn chế sự thất thoát, tăng hiệu suất thu nhận gen.

Tiến hành nối vector pPIC9K với gen mục tiêu bằng T4 DNA ligase ở 160C

qua đêm để tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Sản phẩm nối được biến nạp vào

tế bào E. coli DH5α khả nạp bằng phương pháp hóa biến nạp.

4.2.1. Sàng lọc các dòng E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-CelD

Các chủng biến nạp mang gen mục tiêu được sàng lọc trên môi trường LB

đĩa thạch có chứa ampicillin (50 μg/ml). Do plasmid pPIC9K có mang gen kháng

kháng sinh ampicillin nên chỉ những tế bào E. coli DH5α có mang plasmid này mới

sinh trưởng được trên môi trường này. Thí nghiệm được thực hiện song song với

mẫu đối chứng âm là tế bào E. coli DH5α không mang plasmid tái tổ hợp gen mục

tiêu và mẫu đối chứng dương là tế bào E. coli DH5α chứa vector pPIC9K đã cắt mở

vòng và không có đoạn gen chèn CelD.

Đồ án tốt nghiệp

A B

Hình 4.5. Sàng lọc thể biến nạp E. coli DH5𝛼 chứa pPIC9K – CelD bằng môi trường đĩa thạch LB/ ampicillin (50 µg/ml) A. Đĩa đối chứng âm; B. Đĩa đối chứng dương; C. Đĩa biến nạp

Kết quả cho thấy, sau khoảng 16 giờ nuôi cấy trên đĩa thạch, đĩa đối chứng

âm không xuất hiện khuẩn lạc vì đây là đĩa chứa các tế bào E. coli DH5𝛼 không

được biến nạp vector pPIC9K nên không có khả năng sinh trưởng trên môi trường

chứa ampicillin. Đĩa đối chứng dương xuất hiện một vài khuẩn lạc trên đĩa. Nguyên

nhân là do phản ứng cắt vector pPIC9K bằng enzyme cắt giới hạn chưa hoàn toàn

nên những tế bào E. coli DH5α chứa vector pPIC9K dạng vòng sẽ có khả năng

kháng kháng sinh và phát triển được trên môi trường có ampicillin. Đĩa biến nạp

chứa các tế bào E. coli DH5𝛼 đã được biến nạp sản phẩm nối pPIC9K-CelD nên có

thể sinh trưởng trên môi trường chứa ampicillin.

Chọn ngẫu nhiên 6 khuẩn lạc E. coli DH5𝛼 trên đĩa biến nạp và thực hiện

phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/AOX1R để chọn lọc những dòng

mang plasmid tái tổ hợp gen mục tiêu.

Đồ án tốt nghiệp

4.2.2. Kiểm tra thể biến nạp bằng PCR khuẩn lạc

Để khẳng định các thể biến nạp chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD, tiến

hành PCR khuẩn lạc các thể biến nạp với cặp mồi AOX1F/ AOX1R.

Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli

DH5α/pPIC9K-CelD với cặp mồi AOX1F/AOX1R.

Giếng 1 – 6: sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α/pPIC9K-

CelD (EP1 – EP6); M: Thang DNA 1Kb; N: đối chứng âm.

Plasmid pPIC9K có hai vùng promoter AOX1F và AOX1R nằm ở hai đầu

của MCS nên sản phẩm khuếch đại với cặp mồi AOX1F và AOX1R sẽ có kích

thước 493 bp. Khi có gen mục tiêu chèn vào pPIC9K trong vùng này thì sản phẩm

khuếch đại với cặp mồi trên sẽ cho ra kích thước 2330 bp. Kết quả điện di sản phẩm

PCR khuẩn lạc cho thấy đối chứng âm không xuất hiện vạch, các giếng số 1, 3, 4, 5

tương ứng với các dòng E. coli DH5α EP1, EP3, EP4, EP5 chỉ xuất hiện vạch

khoảng 500 bp so với thang chuẩn trùng với kích thước lý thuyết của vector pPIC9K

là 493 bp. Điều này cho thấy rằng, các chủng này không chứa đoạn gen chèn CelD.

Đồ án tốt nghiệp

Giếng số 2 và giếng số 6 tương ứng với dòng EP2 và EP6 xuất hiện vạch

khoảng 2300 bp trùng với tổng kích thước lý thuyết của vector pPIC9K (493 bp) và

đoạn gen CelD (1824 bp). Như vậy, chỉ có 2 dòng E. coli DH5α EP2 và EP 6 có khả

năng chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD.

4.2.3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với mồi đặc hiệu

CelDF/ CelDR và bằng enzyme cắt giới hạn SnaBI và EcoRI

Hai dòng tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-CelD là EP2

và EP6 được tăng sinh trong môi trường LB lỏng để tách chiết plasmid, kiểm tra

bằng phản ứng cắt giới hạn bằng hai enzyme SnaBI và EcoRI đồng thời thực hiện

phản ứng PCR với mồi CelDF và CelDR.

Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD

với mồi CelDF/ CelDR và cắt pPIC9K-CelD bằng SnaBI và EcoRI.

Giếng 1: plasmid pPIC9K chưa cắt; giếng 2: plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD

chưa cắt; giếng 3: sản phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP2 với SnaBI; giếng 4: sản

Đồ án tốt nghiệp

phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP6 với SnaBI; giếng 5: sản phẩm cắt pPIC9K với

SnaBI và EcoRI; giếng 6: sản phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP2 với SnaBI và

EcoRI; giếng 7: sản phẩm cắt pPIC9K-CelD dòng EP6 với SnaBI và EcoRI; giếng

8: Sản phẩm PCR dòng EP2 với mồi CelDF/ CelDR; giếng 9: Sản phẩm PCR dòng

EP6 với mồi CelDF/ CelDR; M: Thang chuẩn DNA 1 Kb; N: đối chứng âm.

Kết quả điện di ở hình 4.7 cho thấy khi so sánh sản phẩm cắt plasmid

pPIC9K với SnaBI và EcoRI ở giếng 5 với pPIC9K chưa cắt ở giếng 1, nhận thấy

có sự khác nhau rõ rệt. Hình điện di sản phẩm cắt của pPIC9K cho thấy một vạch

duy nhất tại vị trí thấp hơn 10 kb của thang chuẩn, phù hợp với kích thước của

pPIC9K là 9300 bp. Như vậy, tất cả plasmid pPIC9K đã được cắt hoàn toàn và đưa

về dạng mạch thẳng. Dựa vào kết quả điện di, nhận thấy phản ứng cắt hoàn toàn

bình thường, hiệu suất cắt của cả hai enzyme đều tốt.

Giếng số 6 và giếng số 7 tương ứng với plasmid tái tổ hợp của hai dòng EP2

và EP6 sau khi cắt với hai enzyme SnaBI và EcoRI đều cho cho hai vạch rõ nét.

Một vạch có kích thước lớn hơn 1636 bp, tương ứng với kích thước của lý thuyết

của gen CelD là 1824 bp. Một vạch kích thước khoảng 9300 bp, tương ứng với kích

thước lý thuyết của plasmid pPIC9K là 9276 bp. Vector tái tổ hợp pPIC9K-CelD

của hai dòng EP2 và EP6 sau khi cắt bằng enzyme SnaBI (giếng số 3 và 4) cho vạch

có kích thước hơn 10 kb, tương ứng với kích thước lý thuyết của plasmid pPIC9K

sau khi chèn gen CelD là 11100 bp. Sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-

CelD với cặp mồi CelDF/ CelDR đặc trưng cho gen CelD của dòng EP2 và EP6 ở

giếng 8 và 9 cũng cho vạch có kích thước bằng với kích thước gen đã được cắt ở

giếng 6 và giếng 7. Plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD chưa cắt ở giếng 2 cũng cho

kích thước lớn hơn plasmid pPIC9K chưa cắt ở giếng 1. Như vậy cả hai dòng EP2

và EP6 có khả năng mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Tuy nhiên, dựa vào sản

phẩm cắt vẫn chưa thể khẳng định đã tạo dòng thành công tế bào E.coli DH5α mang

plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD mà cần phải có thêm kết quả giải trình tự.

Đồ án tốt nghiệp

4.2.4. Kiểm tra dòng E. coli DH5𝜶 chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD bằng

giải trình tự

Plasmid tái tổ hợp của dòng EP2 được tiến hành giải trình tự tại công ty

Macrogen (Hàn Quốc) để kiểm tra lại trình tự của gen mục tiêu. Kết quả được xử lý

bằng phần mềm Genetyx. Khi blast trình tự này lên NCBI, nhận thấy sự tương đồng

là 99%.

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen CelD trong plasmid pPIC9K-

Query 239 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 298 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 324 GCAAAAATAACGGAGAATTATCAATTTGATTCACGAATCCGTTTAAACTCAATAGGTTTT 383 Query 299 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 358 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 384 ATACCGAACCACAGCAAAAAGGCGACTATAGCTGCAAATTGTTCAACCTTTTATGTTGTT 443 Query 359 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 418 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 444 AAAGAAGACGGAACAATAGTGTATACCGGAACGGCAACTTCAATGTTTGACAATGATACA 503 Query 419 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTTTTCATCCGTTAATGAAGAAGGAACGTACTATCTT 478 |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 504 AAAGAAACTGTTTATATTGCTGATTTTTCATCTGTTAATGAAGAAGGAACGTACTATCTT 563 Query 479 GCCGTGCCGGGAGTAGGAAAAAGCGTAAACTTTAAAATTGCAATGAATGTATATGAGGAT 538 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 564 GCCGTGCCGGGAGTAGGAAAAAGCGTAAACTTTAAAATTGCAATGAATGTATATGAGGAT 623 Query 539 GCTTTTAAAACAGCAATGCTGGGAATGTATTTGCTGCGCTGCGGCACCAGTGTGTCGGCC 598 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 624 GCTTTTAAAACAGCAATGCTGGGAATGTATTTGCTGCGCTGCGGCACCAGTGTGTCGGCC 683 Query 599 ACATACAACGGAATACACTATTCCCATGGACCGTGCCATACTAATGATGCATATCTTGAT 658 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 684 ACATACAACGGAATACACTATTCCCATGGACCGTGCCATACTAATGATGCATATCTTGAT 743 Query 659 TATATAAACGGACAGCATACTAAAAAAGACAGTACAAAAGGCTGGCATGATGCGGGCGAC 718 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 744 TATATAAACGGACAGCATACTAAAAAAGACAGTACAAAAGGCTGGCATGATGCGGGCGAC 803

…

Query 1 GGACCAGCCAAAACCATGGCTATGGCAGAACCCTTGGTACAACATATTACTGGGGATGCA 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1519 GGACCAGCCAAAACCATGGCTATGGCAGAACCCTTGGTACAACATATTACTGGGGATGCA 1578 Query 61 ACGGCACGGTTGTAAGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1579 ACGGCACGGTTGTAAGACAGACTATGATACTTCAGGTTGCGAACAAGATTTCACCCAACA 1638

CelD với trình tự có mã số X04584.1 bằng công cụ BLAST của NCBI

Query 121 ATGATTATGTAAATGCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1639 ATGATTATGTAAATGCTGCTCTCGATGCGATTTCACATGTATTTGGAAGAAACTATTACA 1698 Query 181 ACAGGTCTTATGTAACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1699 ACAGGTCTTATGTAACAGGCCTTGGTATAAATCCTCCTATGAATCCTCATGACAGACGTT 1758 Query 241 CAGGGGCTGACGGAATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1759 CAGGGGCTGACGGAATATGGGAGCCGTGGCCCGGTTACCTTGTAGGAGGAGGATGGCCCG 1818 Query 301 GACCGAAGGATTGGGTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACT 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1819 GACCGAAGGATTGGGTGGATATTCAGGACAGTTATCAGACCAATGAAATTGCTATAAACT 1878 Query 361 GGAATGCGGCATTGATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTGCTCAAAATG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| Sbjct 1879 GGAATGCGGCATTGATTTATGCCCTTGCCGGATTTGTCAACTATAATTCTCCTCAAAATG 1938 Query 421 AAGTACTGTACGGAGATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1939 AAGTACTGTACGGAGATGTGAATGATGACGGAAAAGTAAACTCCACTGACTTGACTTTGT 1998 Query 481 TAAAAAGATATGTTCTTAAAGCCGTCTCAACTCTGCCTTCTTCCAAAGCTGAAAAGAACG 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1999 TAAAAAGATATGTTCTTAAAGCCGTCTCAACTCTCCCTTCTTCCAAAGCTGAAAAGAACG 2058 Query 541 CAGATGTAAATCGTGACGGAAGAGTTAATTCCAGTGATGTCACAATACTTTCAAGATATT 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2059 CAGATGTAAATCGTGACGGAAGAGTTAATTCCAGTGATGTCACAATACTTTCAAGATATT 2118 Query 601 TGATAAGGGTAATCGAGAAATTACCAATA 629 ||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2119 TGATAAGGGTAATCGAGAAATTACCAATA 2147

Đồ án tốt nghiệp

Trình tự thu nhận được của gen CelD trong plasmid pPIC9K được xử lý bằng

phần mềm DNAClub để chuyển từ trình tự nucleotide sang trình tự amino acid.

Hình 4.8. Kết quả blast trình tự protein của trình tự

trong plasmid pPIC9K-CelD trên NCBI

Kết quả blast trình tự protein cho thấy hai chuỗi acid amin khác nhau. Chuỗi

đầu tiên chính là trình tự tiết nhân tố α có trong plasmid biểu hiện pPIC9K. Chuỗi

tiếp theo là trình tự protein mã hóa cho enzyme cellulase.

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả so sánh trình tự protein của gen CelD ban đầu với gen CelD trong

Query 80 AKITENYQFDSRIRLNSIGFIPNHSKKATIAANCSTFYVVKEDGTIVYTGTATS 133

Sbjct 42 AKITENYQFDSRIRLNSIGFIPNHSKKATIAANCSTFYVVKEDGTIVYTGTATS 95

Query 134 MFDNDTKETVYIADFSSVNEEGTYYLAVPGVGKSVNFKIAMNVYEDAFKTAMLGMYLLRC 193

Sbjct 96 MFDNDTKETVYIADFSSVNEEGTYYLAVPGVGKSVNFKIAMNVYEDAFKTAMLGMYLLRC 155

Query 194 GTSVSATYNGIHYSHGPCHTNDAYLDYINGQHTKKDSTKGWHDAGD 239

Sbjct 156 GTSVSATYNGIHYSHGPCHTNDAYLDYINGQHTKKDSTKGWHDAGD 201

…

Query 1 TSQNHGYGRTLGTTYYWGCNGTVVRQTMILQVANKISPNNDYVNAALDAISHVFGRNYYN 60

Sbjct 441 TSQNHGYGRTLGTTYYWGCNGTVVRQTMILQVANKISPNNDYVNAALDAISHVFGRNYYN 500

Query 61 RSYVTGLGINPPMNPHDRRSGADGIWEPWPGYLVGGGWPGPKDWVDIQDSYQTNEIAINW 120

Sbjct 501 RSYVTGLGINPPMNPHDRRSGADGIWEPWPGYLVGGGWPGPKDWVDIQDSYQTNEIAINW 560

Query 121 NAALIYALAGFVNYNSAQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNA 180

Sbjct 561 NAALIYALAGFVNYNSAQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNA 620

Query 181 DVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI 209

Sbjct 621 DVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI 649

plasmid pPIC9K bằng công cụ BLAST của NCBI

Tuy không giải được toàn bộ trình tự gen nhưng dựa vào trình tự đã biết, kết

luận rằng gen được chèn vào plasmid biểu hiện pPIC9K chính là gen CelD và cũng

đã được chèn vào đúng vị trí mục tiêu trên vector pPIC9K. Như vậy, đã tạo dòng

thành công tế bào E. coli DH5𝛼 mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD. Từ đó tiến

hành biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào hệ thống Pichia pastoris nhằm

nghiên cứu khả năng biểu hiện của enzyme endoglucanase.

4.3. Tạo dòng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen CelD

Các kết quả phân tích bằng giải trình tự cho phép khẳng định rằng gen CelD

đã ghép nối thành công vào vector biểu hiện pPIC9K. Plasmid tái tổ hợp pPIC9K-

CelD được cắt bằng enzyme cắt giới hạn SacI và biến nạp vào tế bào Pichia

pastoris để nghiên cứu biểu hiện gen.

Đồ án tốt nghiệp

4.3.1. Biến nạp plasmid pPIC9K – CelD vào chủng Pichia pastoris GS115

Vector biểu hiện pPIC9K thuộc dạng plasmid sáp nhập, khi được biến nạp

vào tế bào nấm men, một phần DNA trên plasmid sẽ sáp nhập vào bộ gen của tế bào

chủ thông qua tái tổ hợp tương đồng. Sự tái tổ hợp tương đồng này thường có hiệu

suất cao hơn khi plasmid ở dạng thẳng. Do vậy, plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD đã

qua kiểm tra được cắt bằng enzyme cắt giới hạn SacI tại vị trí 5’ AOX1 để tăng khả

năng trao đổi chéo giữa plasmid và bộ gen của tế bào nấm men, cũng như để tạo

được chủng P. pastoris tái tổ hợp dạng Mut+. Plasmid pPIC9K-CelD dạng thẳng

được biến nạp vào tế bào nấm men bằng phương pháp điện biến nạp. Trong tế bào,

do có sự tương đồng giữa trình tự gen mã hóa cho histidinol dehydrogenase trên bộ

gen của tế bào và trên plasmid nên xảy ra sự trao đổi chéo, dẫn đến việc gen mục

tiêu từ plasmid được chuyển vào bộ gen của tế bào. Nhờ vậy gen mục tiêu có thể

tồn tại ổn định trong tế bào. Thí nghiệm được thực hiện đồng thời với mẫu đối

chứng âm là tế bào nấm men Pichia pastoris không được không được biến nạp

vector pPIC9K.

A B

Hình 4.9. Sàng lọc thể biến nạp P. pastoris GS115 chứa pPIC9K-CelD

A. Đĩa đối chứng âm; B. Đĩa biến nạp

Đồ án tốt nghiệp

Tế bào sau khi biến nạp được trải trên môi trường MD và ủ ở 280C từ 3 – 5

ngày cho các khuẩn lạc phát triển. Môi trường MD là môi trường không chứa

histidine nên chủng P. pastoris GS115 (chủng khuyết dưỡng histidine) không thể

phát triển được, chỉ có những chủng Pichia pastoris GS115 nào có chứa plasmid

pPIC9K được sáp nhập vào bộ gen nấm men mới phát triển được trên môi trường

này. Vì vậy, đĩa đối chứng âm không xuất hiện các khuẩn lạc của nấm men. Trong

khi đó các đĩa biến nạp pPIC9K-CelD xuất hiện nhiều khuẩn lạc do plasmid

pPIC9K-CelD có chứa gen HIS4 nên có khả năng tổng hợp histine. Như vậy, bước

đầu đã thu nhận được các thể biến nạp Pichia pastoris GS115 mang plasmid tái tổ

hợp pPIC9K-CelD sáp nhập vào bộ gen. Các khuẩn lạc này được tăng sinh, kiểm tra

khả năng kháng G418 và cuối cùng thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự gắn chèn.

4.3.2. Sàng lọc tế bào nấm men mang gen mã hóa cho endoglucanase D

Chỉ có những tế bào có sự sáp nhập thành công giữa plasmid và bộ gen của

nấm men thì gen mục tiêu mới tồn tại ổn định trong tế bào đồng thời có khả năng

kháng lại kháng sinh Geneticin (G418). Để sàng lọc các dòng nấm men mang nhiều

bản sao gen CelD, chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển trên môi trường MD và

cấy chuyền vào môi trường đĩa thạch YPD có bổ sung kháng sinh Geneticin (G418)

với nồng độ là 2mg/ml và 4 mg/ml. Tế bào có mang gen mã hóa cho endoglucanase

D sẽ phát triển được trên môi trường này. Bên cạnh đó, các tế bào có càng nhiều

bản sao sẽ phát triển được trên môi trường có nồng độ G418 càng cao.

Đồ án tốt nghiệp

A B

Hình 4.10. Sàng lọc tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ G418

A. Các dòng tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ 2mg G418

B. Các dòng tế bào P. pastoris mang gen CelD trên môi trường YPD/ 4mg G418

Chọn một số dòng P. pastoris có thể mọc trên nồng độ kháng sinh cao nhất,

tách chiết DNA và kiểm tra sự sát nhập gen CelD vào bộ gen của nấm men bằng

PCR với cặp mồi AOX1F/AOX1R, đồng thời phân tích định tính khả năng phân

hủy cellulose của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp này.

4.3.3. Kiểm tra các dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu bằng phương pháp

PCR với mồi AOX1F/ AOX1R

Nhằm kiểm tra khả năng sát nhập của vector tái tổ hợp chứa gen CelD vào bộ

gen của nấm men, các dòng nấm men tái tổ hợp phát triển trên môi trường YPD có

chứa kháng sinh Geneticin G418 (4 mg/ml) được tăng sinh trong môi trường

BMGY ở 280C qua đêm để tách chiết DNA tổng số, sau đó thực hiện phản ứng PCR

với cặp mồi AOX1F/AOX1R.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của plasmid

pPIC9K-CelD vào bộ gen P. pastoris GS115

Giếng 1: sản phẩm PCR plasmid pPIC9K với mồi AOX1F/ AOX1R; giếng 2: sản

phẩm PCR đoạn gen CelD với mồi CelDF/ CelDR; giếng 3:sản phẩm PCR plasmid

tái tổ hợp pPIC9K-CelD với mồi AOX1F/ AOX1R; giếng 4:sản phẩm PCR nấm men

Pichia pastoris chưa chèn plasmid với mồi AOX1F/ AOX1R; giếng 5 – 9: sản phẩm

PCR Pichia pastoris/ pPIC9K-CelD với mồi AOX1F/ AOX1R; N: đối chứng âm;

M: thang chuẩn DNA 1Kb.

Kết quả điện di trên hình 4.11 cho thấy ở giếng 1, khi thực hiện phản ứng

PCR plasmid pPIC9K với cặp mồi AOX1F/ AOX1R sẽ xuất hiện một vạch có kích

thước khoảng 500 bp, trùng với kích thước của vector này khi đóng vòng. Đoạn gen

CelD được PCR với cặp mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR cho một vạch có kích thước

khoảng 1800 bp (giếng 2) trùng với kích thước lý thuyết của đoạn gen CelD là 1824

bp. Giếng 3 là sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD bằng cặp mồi

AOX1F/ AOX1R cho một vạch có kích thước khoảng 2300 bp, kích thước này

Đồ án tốt nghiệp

tương ứng với tổng kích thước của vector pPIC9K (493 bp) và đoạn gen chèn CelD

(1824 bp). Giếng 4 là sản phẩm PCR với khuôn là DNA bộ gen của chủng Pichia

pastoris GS115 chưa biến nạp vector pPIC9K, vì vậy xuất hiện một vạch có kích

thước trên 2 Kb tương đương với kích thước của gen AOX1 của Pichia pastoris.

Giếng 5 đến giếng 9 là sản phẩm PCR của các dòng Pichia pastoris tái tổ

hợp chứa gen CelD bằng cặp mồi AOX1F/AOX1R. Kết quả điện di cho thấy tất cả

các dòng đều cho hai vạch đúng kích thước mục tiêu: một vạch có kích thước

khoảng 2200 bp, tương ứng với kích thước của gen AOX1 có trong genome của

Pichia pastoris; một vạch có kích thước khoảng 2300 bp, tương ứng với kích thước

của gen CelD là 1824 bp cộng với trình tự trong plasmid pPIC9K là 493 bp.

Như vậy, có thể kết luận đoạn gen CelD đã được biến nạp thành công vào bộ

gen của nấm men P. pastoris với kiểu hình Mut+ (dòng P. pastoris có thể sử dụng

methanol ở nồng độ cao). Các dòng Pichia pastoris này sẽ được kiểm tra khả năng

sinh enzyme endoglucanase trên môi trường BMMY có bổ sung cơ chất CMC

(Carboxymethyl-cellulose).

4.3.4. Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng P. pastoris tái tổ

hợp

Dựa vào kết quả PCR, các dòng nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp có sự

sáp nhập của plasmid pPIC9K-CelD vào bộ gen được tăng sinh trong môi trường

BMGY ở 280C trong 24 giờ và sàng lọc biểu hiện trên đĩa thạch chứa môi trường

BMMY có bổ sung cơ chất CMC (Carboxymethyl-cellulose) 0,5%. Đánh giá khả

năng tiết enzyme endoglucanase của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp, đồng thời

lựa chọn các chủng nấm men có hoạt tính enzyme cao nhất dựa vào đường kính

vòng phân giải trên môi trường chứa CMC (Carboxymethyl-cellulose) sau khi

nhuộm bằng thuốc nhuộm đỏ Congo sau 3 ngày nuôi cấy ở 280C. Thí nghiệm được

thực hiện cùng với đối chứng âm là nấm men Pichia pastoris. Các nghiệm thức

được lặp lại 6 lần.

Đồ án tốt nghiệp

A B

Hình 4.12. Vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp khi nhuộm

với thuốc đỏ Congo

Đĩa A: vòng phân giải CMC của dòng Pichia pastoris tái tổ hợp P8

Đĩa B: vòng phân giải CMC của dòng Pichia pastoris tái tổ hợp P9

Kết quả trên hình 4.12 cho thấy trên cả hai đĩa A và B, phần đối chứng âm

không xuất hiện vòng sáng vì chủng P. pastoris không sử dụng được CMC

(Carboxymethyl-cellulose) có trong môi trường BMMY nên không tạo được vòng

phân giải, chỉ có những chủng Pichia pastoris GS115 có chứa plasmid pPIC9K-

CelD được sáp nhập vào bộ gen nấm men mới tạo vòng phân giải trên môi trường

này. Vì vậy, các dòng P. pastoris tái tổ hợp P8 và P9 tương ứng trên hai đĩa A, B

đều có vòng phân giải cơ chất CMC. Đường kính vòng phân giải của các chủng

Pichia pastoris tái tổ hợp trên môi trường BMMY có CMC 0,5% được thể hiện

trong bảng 4.1.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 4.1. Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng Pichia pastoris

tái tổ hợp

ĐƯỜNG KÍNH STT CHỦNG (mm)

1 13,58± 3,32 P2

2 13,08 ± 3,80 P3

3 15,17± 0,61 P4

4 16,75 ± 1,72 P5

5 15,50± 2,37 P6

6 15,75 ± 2,27 P7

7 16,58 ± 1,02 P8

8 18,42 ± 2,38 P9

Từ kết quả đo vòng phân giải cơ chất CMC của các dòng Pichia pastoris tái

tổ hợp khi nhuộm với thuốc đỏ Congo, chứng tỏ đã biến nạp thành công các gen

CelD vào tế bào P. pastoris và các dòng tái tổ hợp thu nhận được có khả năng tiết

enzyme phân giải cellulose ra ngoại bào. Dựa trên đó, chọn ra một số dòng tế bào

tạo đường kính vòng phân giải cao nhất: P9, P5, P8 để tiếp tục kiểm tra hoạt tính

endoglucanase.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1.

Kết luận

Từ các kết quả đạt được của đề tài: “Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa

enzyme endoglucanase D (CelD) của Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm

men Pichia pastoris” rút ra được một số kết luận sau:

- Tạo dòng thành công tế bào E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pJET1.2 –

CelD. Kết quả giải trình tự đã khẳng định điều này.

- Tạo dòng thành công tế bào E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pPIC9K

chứa gen CelD mã hóa cho enzyme endoglucanase D. Kết quả giải trình tự đã khẳng

định được điều này.

- Biến nạp thành công plasmid pPIC9K mang gen mã hóa cho enzyme

endoglucanase D vào Pichia pastoris và các dòng tái tổ hợp thu nhận được có khả

năng tiết enzyme phân giải cellulose ra ngoại bào, đã chọn ra một số dòng tế bào tạo

đường kính vòng phân giải cao nhất.

5.2. Đề nghị

- Kiểm tra khả năng biểu hiện enzyme endoglucanase D từ các dòng Pichia

pastoris tái tổ hợp thu nhận được trên môi trường nuôi cấy Pichia pastoris với chất

cảm ứng là methanol.

- Phân tích thành phần protein biểu hiện trong dịch nuôi cấy Pichia pastoris tái

tổ hợp bằng điện di SDS-PAGE.

- Định lượng hoạt tính enzyme endoglucanase của các dòng Pichia pastoris tái

tổ hợp.

- Tạo dòng và biểu hiện các thành phần còn lại của hệ minicellulosome trên hệ

thống nấm men Pichia pastoris.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Tô Kim Anh (2010). Nghiên cứu tạo enzyme tái tổ hợp thủy phân lignocellulose

phục vụ sản xuất cồn nhiên liệu, Báo cáo tổng kết đề tài, Viện Công nghệ

Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Hà Nội.

Nguyễn Văn Lân (2004). Vật liệu dệt, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp.Hồ Chí

Minh, Tp. Hồ Chí Minh.

Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Ánh Tuyết, Cao Cường, Lê Thị Thủy Tiên (2012).

Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh, Tp.

Hồ Chí Minh. 288 – 397.

Thân Văn Minh (2012). Đánh giá sự biểu biểu hiện gen mã hóa Pheromone lai

alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase

và Interleukin-2 bằng kỹ thuật Real-time PCR, Luận văn Thạc sĩ ngành Sinh

học thực nghiệm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội), Hà

Nội.

Phạm Lương Thắng, Phan Thị Phượng Trang, Trần Linh Thước, Nguyễn Đức

Hoàng (2012). Biểu hiện endoglucanase A của Clostridium thermocellum

trong các chủng Bacillus subtilis 1012 và WB800N, Báo cáo Hội nghị Khoa

học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên (ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh), Tp. Hồ

Chí Minh.

Tài liệu tiếng Anh

Bayer, E.A., R. Kenig and R. Lamed. (1983). Adherence of Clostridium

thermocellum to cellulose, Journal of Bacteriology, 156, 818 – 817.

Charles E. Wyman (1996). Handbook on Bioethanol: Production and Utilization,

Taylor & Francis, 119 – 285.

Đồ án tốt nghiệp

Cullen, D., Kersten, P. (1992). Fungal enzyme for lignocelluloses degradation,

Applied molecular genetics of filamentous fungi, Chapman & Hall, New

York, 111 – 131.

Daly R, Hearn M.T. (2005). Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris:

a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol.

Recognit, 18, 119 – 138.

Doi R. H., A. Kosugi, K. Murashima, Y. Tamaru, S. O. Han (2003). Cellulosome

from Mesophilic Bacteria. Journal of Bacteriology.

Doi Roy H. and Akihiko Kosugi (2004). Cellulosomes: plant cell walldegrading

enzyme complexs, Nature Reviews Microbiology, Volume 2, 541 – 551.

Edward A. Bayer, Jean-Pierre Belaich, Yuval Shoham, and Raphael Lamed (1998).

Cellulosomes – Structure and Ultrastructure, Journal of structure biology,

124, 221 – 234.

Fei Wen, Jie Sun and Huimin Zhao (2010). Yeast Surface Display of Trifunctional

Minicellulosomes for Simultaneousn Saccharification and Fermentation of

Cellulose to Ethanol, Applied Environmental Microbiology, 76, 1251 –

1260.

Fengel, D., Wegener, G. (1989). Wood. Chemistry, Ultrastructure, Reactions,

Walter de Gruyter, Berlin, Germany, 613.

Freier. D, C. P. Mothershed, and J. Wiegel (1988). Characterization of C.

thermocellum, AppL Environ. Microbiol, 54 (1), 204 – 210.

Gardner, K. H. and Blackwel, J. (1974). Structure of Native Cellulose, Biopolymers,

13 (10), 1975 – 2001.

Gwennael, Joliff, Pierre Beguin, Michel Juy, Jacqueline Millet, Antoinette Ryter,

Roberto Poljak, Jean-Paul Aubert (2000). Isolation, crystalization and

Properties of a new cellulase of Clostridium thermocellum overproduced in

Escheria coli, Naturebiotechnology.

Đồ án tốt nghiệp

Himmel, M. E., Ding, S. Y., Johnson, D. K., DNAey, W. S., Nimlos, MR., Brady, J.

W., Foust, T. D. (2007). Biomass recalcitrance: engineering plants and

enzyms for biofuels production, Science, 315, 804 – 807.

Hsu, T.A., Ladisch, M.R., Tsao, G.T. (1980). Alcohol from cellulose, Chemical

Technology, 10 (5), 315 – 319.

Jian – Ming Liu, Xiu Juan Xin, Chun – Xiu Li, Jian – He Xu, Jie Bao (2011).

Cloning of Thermostable Cellulase Genes of Clostridium thermocellum and

Their Secretive Expression in Bacillus subtilis, Applied Biochemistry and

Biotechnology, 166 (3), DOI 10.1007/s12010 – 011 – 9456 – z.

Joseleau, J. P., Comtat, J., Ruel, K. (1992). Chemical structure of xylans and their

interaction in the plant cell walls. In Xylan and xylanases, eds. J. Visser, G.

Beldman, M. A. Kusters-van Someren and A. G. J. Voragen, Elsevier,

Science Publishers, Amsterdam, 1 – 15.

Kim, S., Holtzapple, M. T. (2006). Effect of structural feature and enzym

digestibility of cellulose, Bioresource Technol, 95, 583 – 591.

Kobayashi T., M. P. Romanie, U.Fauth and A L Demain (1990). Subcellulosome

Preparation with High Cellulase Activity from Clostridium thermocellum,

Applied and Environmental Microbiology, 56 (10), 3040 – 3046.

Lamed R., Setter E., Bayer E. A. (1983). Characterization of Cellulose – Binding

Celllulase – Containing Complex in Clostridium thermocellum, Journal of

Bacteriology.

Lee, M.S., Henry, M., and Silver, P.A. (1996). A protein that shuttles between the

nucleus and the cytoplasm is an important mediator of RNA, Genes Dev, 10,

1233 – 1246.

Lee, S. B., and Taylor J. W. (1990). Isolation of DNA from fungal mycelia and

single spore, In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M.

Đồ án tốt nghiệp

Innis, D. Gelfand, J. Sninsky and T. White , eds.), Academic Press, Orlando,

Florida, chapter 34, 282 – 287.

Mohammad Mainul Ahsan, Tetsuya Kimura, Shuichi Karita, Kazuo Sakka and

Kunio Ohmiya (1996). Cloning, DNA Sequencing and Expression of the

Gene Encoding Clostridium thermocellum Cellulase CelJ, the Largest

Catalytic Component of the Cellulosome, Journal of Bacteriology, 178 (19),

5732 – 5740.

Nakazawa, H., Okada, K., Kobayashi, R., Kubota, T., Onodera, T., Ochiai, N.,

Omata, N., Ogasawara, W., Okada, H. and Morikawa, Y. (2008).

Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei

endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli, Applied

Microbiology Biotechnology, 81 (4), 681 – 689.

Odier, E. and Artaud, I. (1992). Degradation of Lignin. In Microbial Degradation

of Natural Products, ed G. Winkelmann, VCH Publishers, Inc., New York,

161 – 191.

Pérez J., J. Munõz-Dorado, T. de la Rubia, J Martínez (2002). Biodegradation and

biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview, Int

Microbiol, 5, 53 – 63.

Sambrook J, Fritsch E.F., Maniatis T. (2001). Molecular Cloning: A laboratory

manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

Schimz KL, Broll B, John B. (1983). Cellobiose photphorylase (EC2.4.1.20) of

Cellulomonas: occurrence induction and its role in cellobiose metabolism,

Arch Microbiol, 135, 241 – 249.

Schwarz WH, Grabnitz F, Staudenbauer WL (1986). Properties of Clostridium

thermocellum endoglucanase produced in Escherichia coli, Appl Environ

Microbiol, 51, 1293 – 1299.

Đồ án tốt nghiệp

Schwarz WH. (2001). The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic

bacteria. Appl Microbiol Biotechnol, 56, 634 – 649.

Shen – Long Tsai, Jeongseok Oh, Shailendra Singh, Ruizhen Chen and Wilfred

Chen (2009). Functional Assembly of Minicellulosomes on the

Saccharomyces cerevisae Cell Surface on Cellulose Hydrolysis and Ethanol

Production. Applied and Environmental Microbiology, 75 (19), 6087 – 6093.

Shoham Y, Lamed R, Bayer E.A (1999). The cellulosome concept as an efficient

microbial strategy for the degradation of insoluble polysaccharides, Trends

Microbiol, 7 (7), 275 – 281.

Sloneker, J. H. (1971). Determination of cellulose and apparent hemicellulose in

plant tissue by gas-liquid chromatography, Anal. Biochern, 43, 539.

Taiz, L., Zeiger, E. (2006). Plant physiology, Sinauer Associates, Inc.

William K. Wang, Kristiina Kruus and David Wu J. H. (1993). Cloning and DNA

Sequence of the Gene Coding for Clostridium thermocellum Cellulase SS

(CelS) a Major Cellulosome Component. Journal of Bacteriology, 175 (5),

1293 – 1302.

William K. Wang, Kristiina Kruus and David Wu J. H. (1994). Cloning and

expression of the Clostridium thermocellum CelS gene in Escherichia coli,

Applied Microbiol Biotechnol, 42, 346 – 352.

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

Phụ lục A: Kết quả giải trình tự gen CelD trong plasmid pJET1.2

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục B: Kết quả giải trình tự gen CelD trong plasmid pPIC9K

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục C: Kết quả xử lí số liệu đo vòng phân giải CMC của các dòng Pichia pastoris tái tổ hợp

Summary Statistics for duong kinh

Mau Count Average Minimum Maximum Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis Standard deviation Coeff. of variation

1 6 13.5833 3.3229 24.4631% 10.0 -0.0750651 -1.33917 7.0 17.0

2 6 13.0833 3.80022 29.0463% 8.0 -0.376797 -1.08766 9.0 17.0

3 6 15.1667 0.60553 3.99251% 14.0 -1.95171 1.82851 1.5 15.5

4 6 16.75 1.72482 10.2974% 14.0 -0.460406 0.259516 5.0 19.0

5 6 15.5 2.36643 15.2673% 12.0 -0.458421 -0.30971 6.5 18.5

6 6 15.75 2.27486 14.4436% 12.0 -1.07985 -0.0150529 6.0 18.0

7 6 16.5833 1.02062 6.1545% 15.0 -0.333131 0.25824 3.0 18.0

8 6 18.4167 2.37522 12.8971% 16.0 0.138369 -1.19845 5.5 21.5

21.5 Total 48 15.6042 2.75403 17.6493% 8.0 13.5 -2.16211 1.24718

Đồ án tốt nghiệp

ANOVA Table for duong kinh by Mau

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 125.063 17.8661 3.09 0.0107 7

Within groups 231.417 5.78542 40

Total (Corr.) 356.479 47

Multiple Range Tests for duong kinh by Mau

Method: 95.0 percent LSD

Mau Count Mean Homogeneous Groups

2 6 13.0833 X

1 6 13.5833 X

3 6 15.1667 XX

5 6 15.5 XX

6 6 15.75 XXX

7 6 16.5833 XX

4 6 16.75 XX

8 6 18.4167 X

Đồ án tốt nghiệp: Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum trên hệ thống nấm men Pichia pastoris

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN MÃ HÓA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ THỐNG NẤM MEN Pichia pastoris

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Thạc sĩ Nguyễn Xuân Đồng

Sinh viên thực hiện

: Phan Vũ Hải Yến

MSSV: 1051110247 Lớp: 10DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2014

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC HÌNH

DANH SÁCH CÁC BẢNG

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Kết luận

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục A: Kết quả giải trình tự gen CelD trong plasmid pJET1.2

Có thể bạn quan tâm

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thu nhận và đặc tính một số enzyme chuyển hóa lignocellulose từ nấm Việt Nam

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thu nhận và đặc tính một số enzyme chuyển hóa lignocellulose từ nấm Việt Nam

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận án Tiến Sĩ: : Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)

Báo cáo thực tập: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (QUATEST 2)

Câu hỏi ôn tập môn Công nghệ sinh học nấm ăn và nấm dược liệu

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Công nghệ nông nghiệp năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Câu hỏi ôn tập kiểm tra học kì 2 môn Công nghệ chăn nuôi lớp 11 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Đề cương ôn tập học kì 2 môn Công nghệ nông nghiệp lớp 12 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Virus Real-time PCR

Bài giảng Công nghệ sản xuất enzym - Lê Ngọc Khánh

Đề khảo sát giữa học kì 2 môn Khoa học tự nhiên lớp 9 năm 2024-2025 có đáp án - Trường THCS Xuân Tiến (Đề số 02)

Định danh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis R1 phân lập từ rơm có hoạt tính phân huỷ huyết khối

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Công nghệ sinh học nano năm 2021-2022

Bài giảng Công nghệ sinh học phân tử vi sinh vật - Trần Linh Thước

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Xuân Lộc, Đồng Nai

Tài liêu mới

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống sấy khí thổi dùng để sấy tinh bột gạo nếp, năng suất 2000 kg/h theo sản phẩm

Đồ án môn học: Nghiên cứu phát triển sản phẩm kem trứng muối đóng hộp mix hạt điều

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống xử lý nước ngầm công suất 15000M3 /NG/Đ

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu về ứng dụng công nghệ số trong sản xuất in và tác động của nó đến chiến lược kinh doanh của công ty in

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống chùm để ngưng tụ hơi cồn nồng độ 96% khối lượng, lưu lượng 10000kg/ngày

Báo cáo đồ án: Thiết kế hệ thống chưng cất mâm chóp hệ etanol – nước năng suất nhập liệu 2000 L/h

Đồ án công nghệ: Thiết kế hệ thống chuyển hóa cacbon monoxit Water gas shift

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng hệ thống chia sẻ tài liệu theo kiến trúc hướng dịch vụ

Luận văn tốt nghiệp: Thiết kế nhà máy sản xuất màng ghép phức hợp ứng dụng cho bao bì thuốc trừ sâu năng suất 90 triệu m²/năm

Đồ án tốt nghiệp: Thành lập bản đồ lớp phủ thực vật tỉ lệ 1:50000 tại huyện Sóc Sơn, thành phố Hà Nội từ tư liệu ảnh viễn thám

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng chương trình quản lý chất lượng theo HACCP cho sản phẩm thịt ba rọi xông khói tại Cty TNHH MTV Việt Nam kỹ nghệ súc sản (VISSAN)

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng mô hình dự báo nguồn nhân lực thuyền viên xuất khẩu Việt Nam

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu giải pháp điều khiển bám quỹ đạo tàu thủy có ràng buộc tín hiệu và bất định hàm ở đầu vào

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Đánh giá sự hiện diện một số kim loại nặng trong nghêu trắng Meretrix lyrate và môi trường sống của chúng

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tính toán hệ dây neo công trình biển nổi đặt tại vùng biển Việt Nam

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng