Đồ án tốt nghiệp: Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHITOSANASE TỪ ASPERGILLUS SPP.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGÔ ĐẠI NGHIỆP

Sinh viên thực hiện

: PHẠM MINH SANG

MSSV: 0851110196 Lớp: 08DSH6

TP. Hồ Chí Minh, 2012

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... viii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ................................................................................. ix

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ ................................... Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ..................................................................................... ix

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đại cương về chitin và chitosan ..................................................................... 6

1.1.1. Lịch sử phát hiện ....................................................................................... 6

1.1.2. Phân bố và đặc điểm sinh hóa .................................................................. 7

1.1.2.1. Phân bố ................................................................................................ 7

1.1.2.2. Đặc điểm sinh hóa ............................................................................... 7

1.1.3. Phương pháp thu nhận Chitosan và oligomer từ Chitin ...................... 10

1.1.4. Ứng dụng của Chitosan và các dẫn xuất thủy phân từ Chitosan ......... 13

1.2. Đại cương về hệ enzyme Chitosanase .......................................................... 16

1.2.1. Định nghĩa ............................................................................................... 16

1.2.2. Nguồn gốc và phân loại .......................................................................... 16

1.2.3. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitosanase ................................... 19

1.2.3.1. Trọng lượng phân tử.......................................................................... 19

1.2.3.2. Tính đặc hiệu cơ chất ........................................................................ 19

1.2.3.3. Đặc tính thủy phân ............................................................................ 20

1.2.3.4. Đặc tính động học ............................................................................. 21

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.2.3.5. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của chitosanase ........ 22

1.2.3.6. Chất hoạt hóa và chất ức chế ............................................................ 24

1.2.4. Cảm ứng tổng hợp, tinh chế và xác định hoạt tính chitosanase ........... 24

1.2.4.1. Cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase ................................................. 24

1.2.4.2. Tinh chế chitosanase ......................................................................... 25

1.2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính chitosanase ................................... 26

1.2.5. Ứng dụng của chitosanase ...................................................................... 26

1.2.6. Tình hình nghiên cứu chitosanase trên Thế giới và ở Việt Nam ......... 27

1.2.6.1. Tình hình nghiên cứu chitosanase trên thế giới ................................ 27

1.2.6.2. Tình hình nghiên cứu chitosanase ở Việt Nam .................................. 28

1.3. Khái quát về lên men bán rắn ...................................................................... 29

1.3.1. Định nghĩa lên men ................................................................................. 29

1.3.2. Lên men bán rắn ..................................................................................... 29

1.3.3. So sánh lên men bán rắn với lên men chìm ........................................... 30

1.4. Khái quát về Aspergillus spp. ....................................................................... 32

1.4.1. Giới thiệu về Aspergillus spp. ................................................................. 32

1.4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Aspergillus spp. ................................... 33

1.4.3. Một số ứng dụng của Aspergillus spp. ................................................... 34

1.5. Khái quát về nguồn nguyên liệu cám gạo và vỏ trấu trong nước ............. 35

1.5.1. Nguồn cám gạo trong nước .................................................................... 35

1.5.2. Nguồn vỏ trấu trong nước ...................................................................... 36

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu ........................................................................................................... 38

2.1.1. Chủng giống ............................................................................................ 38

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

2.1.2. Cơ chất cảm ứng ..................................................................................... 38

2.1.3. Cơ chất nuôi cấy ...................................................................................... 38

2.1.4. Hóa chất và thiết bị ................................................................................. 38

2.1.4.1. Hóa chất ............................................................................................ 38

2.1.4.2. Thiết bị ............................................................................................... 39

2.1.5. Môi trường ............................................................................................... 39

2.1.5.1. Môi trường giữ giống ........................................................................ 39

2.1.5.2. Môi trường nhân giống ..................................................................... 39

2.1.5.3. Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme .............................................. 40

2.1.5.4. Môi trường lên men bán rắn ............................................................. 41

2.2. Phương pháp ................................................................................................. 41

2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu ............................................ 41

2.2.2. Phương pháp xác định trực tiếp số lượng bào tử .................................. 42

2.2.2.1. Cấy nhân sinh khối ............................................................................ 42

2.2.2.2. Xác định số lượng bào tử bằng phương pháp đếm bằng buồng đếm

hồng cầu ……………………………………………………………………...42

2.2.3. Phương pháp cấy điểm trên môi trường thạch đĩa chọn chủng nấm

mốc có hoạt tính chitosanase cao......................................................................... 43

2.2.3.1. Nguyên tắc ......................................................................................... 43

2.2.3.2. Tiến hành ........................................................................................... 43

2.2.4. Phương pháp khuếch tán thạch đĩa ....................................................... 44

2.2.5. Phương pháp mô tả hình thái vi sinh vật ............................................... 44

2.2.5.1. Quan sát đại thể ................................................................................ 44

iii

2.2.5.2. Quan sát vi thể ................................................................................... 44

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

2.2.6. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn ................................... 44

2.2.7. Phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5 – dinitrosalicylic)

xác định hoạt tính chitosanase ............................................................................. 45

2.2.7.1. Nguyên tắc ......................................................................................... 45

2.2.7.2. Tiến hành ........................................................................................... 45

2.2.8. Phương pháp Bradford – xác định hàm lượng protein ......................... 47

2.2.8.1. Nguyên tắc ......................................................................................... 47

2.2.8.2. Tiến hành ........................................................................................... 47

2.2.9. Phương pháp trích ly enzyme chitosanase ............................................. 48

2.2.10. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý thống kê ................................. 49

2.2.10.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................ 49

2.2.10.2. Xử lý thống kê .................................................................................... 49

2.2.11. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 49

2.2.11.1. Thí nghiệm khảo sát chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp chitosanase

cao……………………………………………………………………………..49

2.2.11.2. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất cảm ứng .............. 49

2.2.11.3. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ thoáng khí .......................... 50

2.2.11.4. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ................... 50

2.2.11.5. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống ......................... 50

2.2.11.6. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ................... 51

2.2.11.7. Nuôi cấy thu enzyme chitosanase ...................................................... 51

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

3.1. Khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ năm chủng nấm mốc khảo sát .. 52

3.1.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp chitosanase ..................................... 52

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

3.1.2. Định lượng khả năng sinh tổng hợp chitosanase.................................. 53

3.2. Hình thái đại thể và vi thể của chủng O2 ................................................... 54

3.2.1. Hình thái đại thể ..................................................................................... 54

3.2.2. Hình thái vi thể ........................................................................................ 55

3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase ............................................................................................................... 55

3.4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 58

3.5. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase ............................................................................................................... 61

3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 64

3.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase ............................................................................................................... 67

3.8. Kết quả lên men bán rắn thu nhận enzyme ................................................ 70

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận ............................................................................................................. 71

4.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 72

PHỤ LỤC .................................................................................................................. 1

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CMC Carboxy Methyl Cellulose

GlcN Glucosamine

GlcNAc N – acetyl glucosamine

kDa Kilo Dalton

O1 Aspergillus oryzae – 1

O2 Aspergillus oryzae – 2

N1 Aspergillus niger – 1

N3 Aspergillus niger – 3

N7 Aspergillus niger – 7

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide

PGA Potato Glucose Agar

LSF Liquid state fermentation

SSF Solid state fermentation

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

DANH MỤC CÁC BẢNG

TT Bảng Trang

1 1.1 10

2 1.2 17

3 1.3 18 Nội dung Các phương pháp hóa học được sử dụng để tạo các oligomer của chitosan Các chitosanase trong Họ 46 thuộc enzyme thủy phân liên kết glycoside Trọng lượng phân tử chitosanase thu nhận từ các loài khác nhau

4 1.4 Đặc điểm thủy phân của một số chitosanase vi sinh vật 20

5 1.5 20

Hằng số Michaelis và Vmax của chitosanase ở một số loài tiêu biểu Giá trị pH tối ưu của một số chitosanase

So sánh giữa các quá trình lên men lỏng và rắn Thành phần xơ và giá trị dinh dưỡng của các nguyên liệu

bước tiến hành xác định hoạt tính đối với mẫu thí nghiệm

6 7 8 9 10 11 12 1.6 1.7 Nhiệt độ tối ưu của một số chitosanase 1.8 1.9 2.1 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucosamine 2.2 2.3 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn albumine 22 23 30 35 36 37 38

13 2.4 39

14 3.1 42

15 3.2 43

16 3.3 46

17 3.4 47

18 3.5 49 Các nghiệm thức khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp Chitosanase) Đường kính vành khuyên phân giải chitosan theo phương pháp cấy điểm của các chủng O1, O2, N1, N3, N7 Bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của các chủng nấm mốc sau 24 giờ nuôi cấy Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng protein Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase

19 3.6 Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hàm lượng protein. 50

20 3.7 51 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase

21 3.8 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein. 53

22 3.9 54 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase.

23 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein. 56

24 3.11 57 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase.

25 3.12 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein 58

vii

26 3.13 60 Điều kiện tối ưu lên men bán rắn thu nhận chitosanase với chủng O2.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

DANH MỤC CÁC HÌNH

Nội dung

TT Hình 1 2 3 1.1 Công thức cấu tạo của chitin 1.2 Công thức cấu tạo của chitosan 1.3 Công thức biểu diễn công thức chính xác của chitosan Trang 7 8 9

4 1.4 9

5 1.5 30

6 3.1 54

7 3.2 55

8 3.3 55

Cơ chế xúc tác của chitosanase trong phản ứng phân cắt chitosan Đặc điểm của quá trình lên men bán rắn (SSF) (Moo – Young và cộng sự, 1983) – sự sắp xếp các hạt chất rắn ẩm và pha khí liên tục trong hệ thống SSF với hệ nấm sợi (bên trái) và sinh vật đơn bào (bên phải). Hình thái đại thể chủng O2, mặt trên khuẩn lạc (bên trái) và mặt dưới khuẩn lạc. Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi chưa nhuộm - ảnh được quan sát và ghi nhận ở vật kính 40. Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi nhuộm Methylene Blue - ảnh được quan sát và ghi nhận ở vật kính 40.

viii

9 10 11 12 PL1 Khuẩn lạc và đường kính vành khuyên phân giải PL2 Bình nhân giống chủng O2 trên môi trường lúa PL3 Đường chuẩn D - glucosamine PL4 Đường chuẩn Albumine 1 2 3 3

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

TT Biểu đồ Trang

1 3.1 53

2 3.2 56

3 3.3 58

4 3.4 59

5 3.5 60

6 3.6 61

7 3.7 63

8 3.8 65

9 3.9 66

68 10 3.10

Nội dung Bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của các chủng nấm mốc sau 24 giờ nuôi cấy Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng protein Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hàm lượng protein Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein 69 11 3.11

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

TT Sơ đồ Trang

1 1.1 12 Nội dung Quy trình thủy phân chitosan để thu nhận oligomer (Tokutake và cộng sự, 1986).

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Chitin, chitosan là polymer hữu cơ phổ biến trong thiên nhiên; trong động

vật thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chiêm tỷ lệ khá

cao, từ 14-35% so với trọng lượng chất khô. Hiện nay chitin, chitosan và các dẫn

xuất của chúng đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiêu lĩnh vực như trong nông

nghiệp, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y

dược,... Do dó, việc nghiên cứu sản xuât chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng

đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu.

Các sản phẩm từ các loài giáp xác trên toàn thế giới ước tính tới 1,9 triệu tấn

mỗi năm, phần lớn các sản phẩm từ tôm được sản xuất từ các nước châu Á trong đó

có Việt Nam. Mỗi năm ngành công nghiệp này thải ra 1,4 triệu tấn chất thải với chủ

yếu là vỏ và đầu tôm. Phương thức xử lý phần thừa thông dụng hiện nay chủ yếu là

đốt bỏ, thải ra biển hoặc tập kết đến nơi xử lý rác. Cách làm này làm ô nhiễm vượt

mức cho phép tại các khu vực có kinh doanh khai thác chế biến các loại giáp xác. Ở

nước ta, sản lượng phế phụ phẩm từ các nhà máy chế biến thủy hải sản là rất lớn.

Theo ước tính mỗi năm riêng các nhà máy chế biến thủy, hải sản thải ra môi trường

hơn 70 nghìn tấn phế liệu là vỏ tôm, cua các loại.

Nếu các phế phẩm này được chế biến thành các sản phẩm có giá trị, ngoài

việc mang lại nguồn lợi cao, nó còn góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm và các chi

phí phát sinh trong quá trình xử lý chất thải.

Chitin, chitosan có thể được thủy phân để tạo thành những chất có hoạt tính

sinh học cao bằng phương pháp hóa học (acid HCl đậm đặc) hoặc bằng phương

pháp sinh học (dùng các enzyme như papain, hemicellulase,…). Việc thủy phân

chitin, chitosan bằng phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm như chi phí cao,

hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường, gây hao mòn máy móc thiết bị cao và quan

trọng là sản phẩm thu được có hoạt tính không cao. Vì vậy, việc nghiên cứu sản

xuất các dẫn suất thủy phân từ chitin và chitosan bằng phương pháp sinh học là một

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

hướng đi có nhiều triển vọng vì điều kiện phản ứng nhẹ, ít gây ô nhiễm môi trường

và nhất là sản phẩm thu được có chất lượng tốt.

Bên cạnh đó, nấm mốc là nguồn cung cấp hệ enzyme ngoại bào vô cùng

phong phú, khả năng sinh trưởng mạnh trên các nguồn cơ chất khác nhau. Vì vậy,

việc nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase trên nấm mốc là việc

làm cần thiết nhằm giảm thiểu chi phí cho nguyên liệu, hóa chất và quan trọng là sẽ

dễ dàng đưa vào ứng dụng sản xuất với điều kiện trong nước.

Vì những lý do trên, tôi quyết định chọn đề tài “Bước đầu nghiên cứu thu

nhận chitosanase từ Aspergillus spp.” trong khóa luận tốt nghiệp này.

2. Tình hình nghiên cứu

Trong nước:

+ Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ

Streptomyces griceus, Phạm Hồng Ngọc Thùy – Khoa chế biến trường đại

học Nha Trang (03/2008).

+ Thu nhận và mô tả đặc tính của enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus

licheniformis NN1, Nguyễn Thị Phương Nhung – Trường Đại học Nông

Nghiệp Hà Nội (2012).

+ Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme

chitosanase từ mẫu đất ở Phước Long – Nha Trang; Nguyễn Trọng Thăng và

Ngô Xuân Mạnh; Khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nông

nghiệp Hà Nội (2011).

+ Lâm Ngọc Tuyết, Đỗ Anh Tuấn, Nguyễn Đức Hoàng, Trần Linh Thước

(2003), Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa chitosanase trong E. Coli, Những

vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Hội nghị toàn quốc lần

thứ 2, Nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp và Y học, Bộ Khoa

học và Công nghệ, Hội đồng Khoa học tự nhiên, Ngành Khoa học sự sống,

Huế.

+ Cao Thị Ngọc Phượng, Ngô Phước Hậu, Đỗ Anh Tuấn, Trần Linh Thước,

Jügen Pleiss (2003), Xây dựng cơ sở dữ liệu protein phục vụ nghiên cứu sinh

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

học: trường hợp chitinase và chitosanase, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn

quốc 2003, Bộ Khoa học và Công nghệ, Hội các ngành Sinh học Việt Nam,

Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Hà Nội.

Nước ngoài:

+ J. S. PRICE and R. STOCK; Production, Purification, and

Characterization of an Extracellulase Chitosanase from Streptomyces;

Journal of Bacteriology (12/ 1975).

+ Tamo Fukamizo, Yuji Honda, Sachio Goto, Isabelle Boucher and Ryszard

Brzezinski; Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp. N174;

Biochem. J. (1995). Great Britain.

+ Xiao-E Chen, Xu-Bo Fang và Wen-Sui Xia; Strain imvironment and

optimization of the media composition of chitosanase-producing fungus

Aspergillus sp. CJ 22-326; African Journal of Biotechnology Vol. 7 (14), 18

July, 2008.

+ Chih-Yu Cheng, Chu-Han Chang, Yue-Jin Wu, và Yaw-Kuen Li;

Exploration of Glycosyl Hydrolase Family 75, a chitosanase from

Aspergillus fumigatus; The Journal of Biological Chemistry Vol. 281, NO. 6,

February 10, 2006. U.S.A.

3. Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp.

- Làm phong phú thêm nguồn thu nhận chitosanase từ vi sinh vật.

- Tận dụng nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ 5 chủng Aspergillus ban đầu,

chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp chitosanase cao nhất để tiến hành

nghiên cứu.

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men.

- Tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính chitosanase của chủng được chọn

trên môi trường tối ưu hóa.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

5. Phương pháp nghiên cứu

Trong nuôi cấy vi sinh vật, khả năng thuần cũng như khả năng sinh ra các

hoạt chất cao của giống là yếu tố quyết định đến hiệu suất của quá trình. Vì vậy,

trước khi thực hiện, cần tiến hành khảo sát từ 5 chủng mốc giống được cung cấp để

chọn ra được chủng cho kết quả khảo sát tối ưu nhất trên môi trường thực hiện khảo

sát.

Sau khi đã chọn được chủng tiến hành nghiên cứu, thực hiện việc nghiên cứu

đối với chủng được chọn trên các yếu tố môi trường ảnh hưởng lên khả năng sinh

tổng hợp enzyme như: tỷ lệ cơ chất, độ ẩm, độ thoáng khí, tỷ lệ tiếp giống, thời gian

nuôi cấy… Trong các thí nghiệm này, thông số thay đổi là mức của các yếu tố và

chỉ tiêu theo dõi chính là hoạt tính enzyme và hàm lượng protein thu được ở từng

mức của yếu tố khảo sát.

6. Các kết quả đạt được của đề tài

- Đã chọn ra được một chủng từ 5 chủng giống được cung cấp.

- Đã tối ưu hóa được một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh

tổng hợp chitosanase.

- Đã tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính của enzyme trên môi trường đã

tối ưu hóa.

7. Kết cấu của đồ án

- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU – nội dung chương đề cập đến các

nội dung có liên quan đến đề tài nghiên cứu.

- CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP – nội dung chương đề cập

đến các dụng cụ thiết bị và đặc biệt là các phương pháp thực nghiệm dùng

trong đồ án.

- CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN – nội dung chương đưa ra những

kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện chứng cho những kết

quả thu được.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

- CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ – nội dung chương tóm tắt lại

những kết quả mà đề tài đạt được và đệ trình những phần cần thực hiện thêm

của đề tài.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.1. Đại cương về chitin và chitosan

1.1.1. Lịch sử phát hiện

Chitin được Braconnot phát hiện lần đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch

chiết của một loại nấm và ông đã đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm ra

nó. Năm 1823, Odier đã phân lập được một chất từ bọ cánh cứng và ông gọi là

“chitin” hay “chitine” có nghĩa là lớp vỏ. Nhưng không phát hiện ra sự có mặt của

Nitơ, cuối cùng cả Braconnot và Odier đều cho rằng cấu trúc của chitin giống cấu

trúc của cellulose [3].

Năm 1929, Karrer đun sôi chitin với dung dịch KOH 5% trong 24 giờ và đun

tiếp ở 160oC với kiềm bảo hòa trong 50 phút, ông thu được sản phẩm có phản ứng

màu đặc trưng với thuốc thử, sản phẩm đó chính là chitosan [3].

Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa và ứng dụng của

chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ X. Nhật, Mỹ, Ấn Độ, Trung

Quốc và Pháp là những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất

chitosan. Năm 1973, Nhật Bản là nước đầu tiên sản xuất chitosan thương phẩm với

sản lượng 20 tấn/năm, hiện nay đã lên tới hơn 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất trên 300

tấn/năm. Theo Know (1991), thị trường có nhiều triển vọng của chitin, chitosan là

Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức. Nhật Bản được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản

xuất và buôn bán chitin, chitosan. Theo như ước tính của các nhà phân tích, trong

những năm tới sản lượng chitosan sẽ đạt tới 118000 tấn/năm, trong đó, Nhật và Mỹ

là những nước sản xuất chính [1].

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất chitin, chitosan và ứng dụng trong

sản xuất phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới mẻ. Vào những năm 1978 –

1980, trường đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitosan

của tác giả Đỗ Minh Phụng. Điều này đã mở đầu bước ngoặc quan trọng trong việc

nghiên cứu, tuy nhiên vẫn chưa có ứng dụng nào thực tế trong sản xuất [1].

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.1.2. Phân bố và đặc điểm sinh hóa

1.1.2.1. Phân bố

Chitin là một polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose, được

tổng hợp với năng suất trung bình là 20 g/năm/m2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên,

chitin hiện diện ở động vật và thực vật. Ở động vật, chitin được tìm thấy trong lớp

vỏ ngoài của tôm, cua và các loài giáp xác; là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ

một số loài động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể và giun tròn. Ở

thực vật, chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae [11].

1.1.2.2. Đặc điểm sinh hóa

Chitin là chất rắn vô định hình, bền, không tan trong nước, acid, kiềm, cồn

và các dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin cũng có thể bị thủy giải bởi acid vô

cơ mạnh (HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc, HF khan) hoặc bởi enzyme vi sinh vật [7].

Ngoài ra, chitin ít hiện diện ở trạng thái tự do, thường ở dạng phức hợp với các

protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác [3].

Chitin là polysaccharide mạch thẳng được cấu tạo từ các đơn phân N – acetyl

glucosamine (GlcNAc), có thể xem như là dẫn xuất của cellulose, trong đó nhóm (–

OH) ở C2 được thay thế bằng nhóm acetyl amino (-NHCOCH3). Như vậy, chitin là

poly N – acetyl – 2 – amino – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose liên kết với nhau

bởi các liên kết 1,4 – β – glycoside. Trong đó, các mắc xích của chitin cũng được

đánh số như glucose [3].

Công thức phân tử: [C8H13NO5]n

Mchitin = (203,186)n

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Phụ thuộc vào nguồn gốc đặc điểm từng vùng, chitin có hai loại cấu trúc đặc

trưng, gọi là dạng α và β. Sự khác nhau giữa hai dạng này được nhận biết bằng các

phương pháp phổ nghiệm như phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân

(NMR) chụp trạng thái rắn kết hợp với phân tích nhiễu xạ tia X (XRD). Dạng thứ

ba ít phổ biến hơn là γ – chitin, nhưng xuất phát từ các số liệu phân tích, theo một

số nhà phân tích thì dạng thứ ba chỉ là một dạng khác trong cấu trúc của α – chitin.

α – chitin là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên, nó có mặt trong vỏ tôm, cua,

các loài nhuyễn thể là thức ăn của cá voi và trong biểu bì của các loại côn trùng…

hiếm hơn là dạng β – chitin, được tìm thấy trong protein của mực ống [7].

Chitin là một nguyên liệu bền, giúp các loài giáp xác chống lại các tác nhân

gây hại và áp suất của môi trường.

Để thủy phân hoàn toàn chitin, vi sinh vật có khả năng thủy phân chitin hầu

hết đều có một hệ gồm 2 loại enzyme thủy phân là chitinase và chitobiase (β – N –

acetylglucosaminidase hoặc β – N – acetylhexosaminidase) [13].

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế

nhóm (–NHCOCH3) ở vị trí C2. Chitosan có cấu trúc mạch thẳng được hình thành

từ các đơn phân D – glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 – β – glycoside,

do vậy chitosan có thể gọi là poly 1,4 – β – 2 – amino – 2 – deoxy – D – glucose

hay poly 1,4 – β – D – glucosamin.

Công thức phân tử: [C6H11NO4]n

Mchitosan = (161,151)n

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của chitosan.

Chitosan được tạo thành từ quá trình hóa học hay enzyme đều không bị khử

hoàn toàn nhóm acetyl. Tỷ lệ acetyl còn lại trong chitosan khác nhau tùy theo

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

phương pháp khử acetyl và tính nhạy cảm của enzyme. Sự phân bố N – acetyl

glucosamine (GlcNAc) và glucosamine (GlcN) trên mạch chitosan cũng ảnh hưởng

đến hoạt tính enzyme thủy phân chúng. Chitosan có hai dạng dị liên kết là GlcNAc-

GlcN, GlcN – GlcNAc và hai đồng liên kết là GlcNAc – GlcNAc, GlcN – GlcN. Do

vậy, sự thủy phân các liên kết này trong chitosan bằng enzyme cũng khác nhau [13].

Trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử

chitosan (khoảng 10%). Vì vậy, công thức chính xác của chitosan được thể hiện như

Hình 1.3, trong đó tỷ lệ m/n phụ thuộc vào độ deacetyl hóa chitin [8].

Hình 1.3. Công thức biểu diễn công thức chính xác của chitosan.

Độ deacetyl hóa – DD (Degree of deacetylation), là tỷ lệ thay thế nhóm –

NHCOCH3 bằng nhóm –NH2 trong phân tử chitin (Hình 1.4.). Nếu DD < 50% thì

là chitin, DD ≥ 50% thì là chitosan [7].

Hình 1.4. Cơ chế xúc tác của chitosanase trong phản ứng phân cắt chitosan

Độ deacetyl hóa có thể được xác định dựa vào:

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (H – NMR).

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

 Phổ hồng ngoại IR.

 Chưng cất chitin, chitosan với acid phosphoric

 Phản ứng tạo màu với ninhydrin.

 Xác định theo Nitơ [32].

Khi hòa tan trong dung dịch acid acetic loãng sẽ tạo thành dung dịch keo

dương, nhờ đó mà không bị tủa khi có mặt một số ion kim loại nặng như: Pb2+,

Hg+… chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một

heteropolymer của “polycation”, có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm

như protein, amino polysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có

mặt của nhóm amino (-NH2) [12]. Trong khi hầu hết các polysaccharide trong tự

nhiên như cellulose, dextran, pectin, agar, agarose… đều trung tính hay có tính acid

thì chitosan (chitin) lại có tính base cao [32].

Nhiệt độ nóng chảy của chitosan là 309 – 311oC.

Trọng lượng phân tử chitosan thay đổi từ vài kDa đến hơn hai ngàn kDa, tùy

thuộc vào nguồn gốc của chúng. Trong tự nhiên, chitosan được tìm thấy trong vách

tế bào một số loài nấm như Zygomycetes, trong tảo lục Chlorella sp., cũng như

trong lớp vỏ của côn trùng, tôm, cua [33].

1.1.3. Phương pháp thu nhận Chitosan và oligomer từ Chitin

Nguyên liệu giàu chitin có nguồn gốc từ các loài giáp xác như: tôm, cua,

mực, sam… được rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ và ngâm trong dung dịch acid loãng

(HCl 6 – 12%) để loại bỏ các khoáng canxi và tạp chất. Hỗn hợp này được nấu với

dung dịch NaOH loãng (8 – 15%) để loại các protein tạp; sau đó ngâm lần lượt

trong các hỗn hợp dung dịch KMnO4 0,5% và H2SO4 10% (1:1), oxalic acid 3% để

tẩy màu, thu nhận sản phẩm là chitin. Để thu nhận được chitosan thì phải qua quá

trình khử nhóm acetyl của chitin bằng cách đun với dung dịch NaOH (40 – 50%)

[9].

Việc thủy phân chitin thành oligomer có thể được thực hiện bằng phương

pháp dùng acid [29], enzyme [3]. Sự thủy phân mạch polysaccharide của chitosan

bằng acid sẽ cắt đứt các liên kết glycoside giữa các phân tử đường D – glucosamin

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

tạo ra một hỗn hợp các đoạn oligomer. Một số loại acid mạnh như acid

hydrochloric, acid nitric, acid phosphoric và hydrogen fluoride đã được sử dụng để

thủy phân chitosan tạo oligomer ở các nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau

(Bảng 1.1.).

Bảng 1.1. Các phương pháp hóa học được sử dụng để tạo các oligomer của

chitosan [9].

Acid

Nhiệt độ phản ứng (oC) 53 100 80 100 72 37 0 70 37 20 Nồng độ acid phản ứng 35% 11% 35% 1% 35% 0,4 mM 70 mM 60% 85% 100% Thời gian phản ứng 48 giờ 34 giờ 2 giờ 5 giờ 1 giờ 15 giờ 9 giờ 4 giờ 4 tuần 19 giờ

Hydrochloric Nitric Phosphoric Hydrogen fluoride Các oligomer có kích thước mong muốn sẽ được phân đoạn và thu nhận bằng

các phương pháp sắc ký trao đổi ion, HPLC và lọc gel. Tuy nhiên, những phương

pháp này khó có thể áp dụng ở quy mô lớn, cũng như rất khó để tách được các

oligomer có kích thước lớn. Ngoài sắc ký, phương pháp tủa các oligomer có trọng

lượng phân tử lớn ở nhiệt độ thấp cũng đã được nghiên cứu và sử dụng [20].

Quy trình thủy phân chitosan bằng HCl 35% trong 3 giờ ở 80oC được đề

nghị bởi Tokutake và cộng sự (1986) hiện được sử dụng khá phổ biến. Nguyên tắc

cơ bản của quy trình này là dùng acid mạnh để thủy phân chitosan trong một thời

gian nhất định để tạo ra hỗn hợp chitosan polymer và chitosan oligomer. Sau đó

dùng phương pháp tủa phân đoạn để thu nhận các sản phẩm chitosan oligomer tinh

sạch có các kích thước khác nhau (Sơ đồ 1.1.).

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Sơ đồ 1.1. Quy trình thủy phân chitosan để thu nhận oligomer (Tokutake và

cộng sự, 1986).

Các phương pháp hóa học kể trên thường làm thay đổi trọng lượng phân tử,

mức độ acetyl hóa sản phẩm và thoái biến những protein có giá trị dinh dưỡng cao

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

trong nguyên liệu, đồng thời tạo những sản phẩm phụ gây ô nhiễm môi trường. Vì

vậy, những quy trình khử khoáng và khử acetyl của chitin từ nguyên liệu giàu chitin

bằng enzyme cũng đã và đang được quan tâm nghiên cứu. Hiệu quả khử protein

bằng enzyme tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu vỏ giáp xác và điều kiện tiến

trình xử lý. Xử lý nhẹ nguyên liệu vỏ giáp xác bằng enzyme có thể loại bỏ 90%

protein và carotenoid, sản phẩm carotenoprotein tạo thành này thường dùng làm

chất bổ sung cho thức ăn gia súc [48].

Chitin và chitosan ở trạng thái rắn đều bị thủy phân bằng acid (như: HCl,

HF, H3PO4…) ở nồng độ cao. Thủy phân bằng enzyme đòi hỏi mức độ hòa tan cao

của cơ chất trong môi trường. Sự phân cắt ngẫu nhiên nội mạch sẽ tạo những sản

phẩm oligomer đa dạng. Phản ứng thủy phân chitosan bằng enzyme có tính đặc hiệu

cơ chất (theo nhóm acetyl) nên vị trí phân cắt do thủy phân có thể được điều khiển

tạo các chitooligosaccharide được quan tâm nhiều trong các ứng dụng thực tiễn. Vì

độ hòa tan trong dung dịch của chitosan thường thấp nên nồng độ

chitooligosaccharide tạo ra cũng thấp. Như vậy, việc nghiên cứu enzyme có khả

năng thủy phân chitosan hòa tan ở pH thấp vừa mang lại hiệu quả về kinh tế vừa an

toàn với môi trường hiện đang là một thách thức lớn cho các nhà nghiên cứu [8].

1.1.4. Ứng dụng của Chitosan và các dẫn xuất thủy phân từ Chitosan

Những nghiên cứu gần đây cho thấy chitin, chitosan và những dẫn xuất của

chúng được ứng dụng nhiều trong các ngành hóa học, công nghệ sinh học, y học,

thú y, nha khoa, nông nghiệp, chế biến thực phẩm và bảo vệ môi trường… Những

ứng dụng này chủ yếu dựa trên các đặc tính đặc biệt của sản phẩm dẫn xuất như: có

sự hiện diện của những nhóm chức phản ứng, có khả năng tạo thành dạng gel, khả

năng bám hút cao, kháng nấm và vi khuẩn, kháng ung thư và khả năng phân hủy

sinh học [41]…

Trong lĩnh vực y học, chitin và chitosan được xem là những vật liệu sinh học

được định nghĩa là “vật liệu tương tác” có khả năng tương thích với mô tế bào xung

quanh và không tạo ra đáp ứng đào thải của vật chủ [54]. Do đó, chitin và chitosan

có một số các ứng dụng sau:

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

- Nguyên liệu làm chỉ phẫu thuật tự hủy: Đại học Delaware Mỹ đã chế tạo

thành công chỉ phẫu thuật tự hủy từ chitosan.

- Chitin làm tăng mức kéo giãn của vị trí mổ ở chuột và thỏ. Chitin nguyên

chất xúc tiến khả năng lành vết thương và không gây phản ứng phụ bất lợi [54].

- Tạo da nhân tạo: da nhân tạo làm từ chitin được gọi là Beschitin W, giống

như một tấm vải và được bọc ốp lên vết thương chỉ một lần cho đến khi vết thương

lành. Tấm Beschitin W sẽ tự phân hủy sinh học cho đến khi lớp biểu bì mới ở vết

thương hình thành. Da nhân tạo từ chitin có tác dụng giảm đau, giúp cho các vết sẹo

bỏng phục hồi nhanh chóng.

- Chitosan có đặc tính tăng cường tính thấm, tính bám dính sinh học và một

số đặc tính lý – hóa khác nên có thể được dùng làm chất tải trong thuốc nhỏ mắt (hệ

thống dạng gel chitosan hay những phần tử có kích thước nano), trong sản xuất

thuốc trị viêm loét dạ dày, tá tràng [12].

- Một số thử nghiệm trên động vật nhỏ như chuột, chó cho thấy chitosan có

khả năng tăng cường hiệu quả trên các vết thương ở mạch máu, da, xương… điều

này cho thấy, khi sử dụng làm vật liệu sinh học, chitosan đều đạt các thử nghiệm an

toàn về khả năng không gây đột biến, gây độc cấp tính, mãn tính, gây sốt…

Tuy có nhiều tiềm năng, nhưng trong thực tế có rất ít các sản phẩm từ chitin và

chitosan đạt được đầy đủ các yêu cầu của một vật liệu sinh học thương mại. Một

nguyên nhân chính gây khó khăn cho việc sản xuất nguyên liệu sinh học từ chitin và

chitosan là khả năng hòa tan kém của chúng trong điều kiện ôn hòa [54].

- Chitosan còn có hiệu quả ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Ouchi và

cộng sự (1991) đã kết hợp chitosan hay chitosamino – oligosaccharide (COS) vào

5-fluorouracil (5FU) tạo thành hệ đại phân tử có hiệu quả kháng ung thư mạnh [50].

- Chitobiose và chitotriose có hoạt tính kháng oxy hóa in vivo ở đường tiêu

hóa trên chuột. Chúng ức chế sự thủy phân benzoate thành salicylate bởi H2O2 với

sự hiện diện của Cu2+, trong khi glucosamine và N – acetylchito – oligosaccharide

(di – N – acetylchitobiose và tri – N – acetylchitotriose) không có biểu hiện hoạt

tính ức chế này. Chitobiose và chitotriose có hiệu lực lọc sạch những gốc hydroxyl.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Chitobiose còn có khả năng lọc sạch các gốc superoxide sinh ra bởi hệ thống thử

nghiệm (không dùng enzyme) sử dụng phenazine methosulfate và NADH [15].

Trong lĩnh vực công nghiệp, chitosan và các dẫn xuất thủy phân có một số

ứng dụng như sau [30]:

- Xử lý nước thải, làm sạch môi trường: loại bỏ các cặn bã và các kim loại

độc hại như: Ag+, Pb2+, Cu2+, Ni2+, Cadmium, Chromium…

- Công nghiệp giấy: sản xuất giấy chịu nhiệt, giấy hoa dán tường. Do cấu

trúc tương tự như cellulose nên việc bổ sung chitosan vào nguyên liệu làm giấy có

tác dụng làm tăng độ bền dai của giấy và tăng độ nét khi in.

- Công nghiệp dệt: dùng chất phối trộn để giữ màu hoa vải, sản xuất vải, vải

chịu nhiệt, vải chống thấm.

- Công nghiệp hóa mỹ phẩm: chitosan được dùng làm thành phần sản xuất

kem chống khô da dựa vào tính chất dễ cố định trên biểu bì da nhờ các nhóm NH4+.

Sản xuất kem dưỡng da chống nắng dựa vào khả năng ngăn các chất lọc tia cực tím

của các nhóm NH4+.

- Công nghiệp thực phẩm: chitosan được dùng để tạo màng mỏng bao gói

bảo quản thực phẩm; tẩy lọc nguồn nước trong các nhà máy chế biến; khử màu các

sản phẩm thẫm màu như: dầu cá, nước mắm xuất khẩu…; được dùng làm các chất

giảm béo do có khả năng gắn với các chất béo trong dạ dày tạo thành phức hợp có

kích thước lớn khó hấp thu được.

- Công nghệ sinh học: chitosan được dùng làm giá thể để cố định enzyme và

cố định tế bào dùng trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích.

Trong lĩnh vực nông nghiệp, chitosan được dùng để bao bọc hạt giống ngăn

ngừa sự tấn công của nấm trong đất, dùng để cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng

cường khả năng nẩy mầm của hạt. Dẫn xuất thủy phân của các chitosan ở dạng hỗn

hợp các oligomer của đường D – glucosamin cũng có nhiều ứng dụng đặc biệt trong

ngành y dược. Các dẫn xuất này được sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với các chất có

hoạt tính sinh học khác như các vitamin, acid succinic, taurine [30]…

Một số tác dụng của các dẫn xuất thủy phân từ chitosan [30] là:

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

- Ngăn chặn sự tích lũy các tế bào mỡ trong các cơ quan nội tạng, sự tác

động tiêu cực của rượu lên gan.

- Hoạt hóa chức năng gan, loại bỏ mỡ trong gan.

- Giảm hàm lượng đường và cholesterol trong máu.

- Thúc đẩy sự tiêu hóa các nguyên tố vi lượng như Fe2+, Ca2+…

- Kích hoạt hệ thống miễn dịch, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

Các đặc tính tan tốt trong nước, có tác dụng chữa lành vết thương và giữ ẩm

tốt của các dẫn xuất này là cơ sở để ứng dụng trong lĩnh vực mỹ phẩm (kem dưỡng

da, keo xịt tóc, son môi, mascara, dầu gội…).

1.2. Đại cương về hệ enzyme Chitosanase

1.2.1. Định nghĩa

Chitosanase là hệ enzyme thuộc nhóm thủy phân (hydrolase), xúc tác cho

phản ứng phân cắt các liên kết β – 1,4 – glycoside giữa N – acetyl – D – glucosamin

và D – glucosamin (hay giữa các D – glucosamin) trong phân tử chitosan. Mã số

enzyme của chitosanase là EC 3.2.1.132 [47, 56].

Chitosanase thu nhận từ các nguồn khác nhau sẽ có hoạt động phân cắt cơ

chất khác nhau tùy thuộc vào mức độ acetyl hóa của cơ chất. Hầu hết các

chitosanase thuộc loại enzyme phân cắt nội mạch polymer, do đó các sản phẩm tạo

thành chủ yếu là các dimer, trimer, tetramer hoặc các đoạn oligomer của chitosan

[47].

1.2.2. Nguồn gốc và phân loại

Chitosanase hiện hiện rộng rãi ở nhiều loài sinh vật khác nhau như: xạ khuẩn

(Streptomyces N174), nấm (Penicillium islandicum, Fusarium solani), thực vật

(Hordeum vulgare) [26] và một số loài vi khuẩn (Myxobacter AL – 1,

Amycolaptosis sp., Enterobacter sp.) [39]. Hầu hết các loài vi khuẩn và nấm đều tiết

ra chitosanase ngoại bào [36]; chitosanase nội bào được tìm thấy ở thực vật và các

loài nấm Zygomycete [43].

Việc phân loại chitosanase hiện nay vẫn còn là vấn đề đang bàn luận và cũng

chưa biết chính xác là có bao nhiêu loại chitosanase hiện diện trong tự nhiên. Tuy

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

nhiên, các nhà enzyme học cũng đã tiến hành phân loại dựa trên cơ sở trình tự gen

và các đặc tính cơ bản của chitosanase. Dựa vào tính tương đồng của các trình tự

gen mã hóa cho chitosanase ở các loài khác nhau mà các nhà nghiên cứu đã xếp các

enzyme này vào 5 họ của enzyme thủy phân liên kết glycoside là 5, 8, 46, 75 và 80.

Trong số này, họ 46 chứa nhiều chitosanase nhất. Các chitosanase thuộc họ 46 và

80 đều là những enzyme thủy phân cơ chất đường, có hai vị trí amino acid ở trung

tâm xúc tác phản ứng là glutamic acid và aspartic aicd [30]. Các enzyme trong họ

này được sắp xếp như trong Bảng 1.2. [56].

Trong khi đó, Họ 5, 8 và 75 chứa một số enzyme chitosanase đặc trưng như:

- Họ 5: hai enzyme ChoI và ChoII có nguồn gốc từ Streptomyces griseus

HUT 6037, đều là những enzyme xúc tác phản ứng transglycosyl [49].

- Họ 8: tiêu biểu là các chitosanase từ Bacillus sp. No. 7M (chỉ phân cắt liên

kết GlcN – GlcN), Bacillus circulans WL – 12 và Paenibacillus fukuinensis. Ngoài

ra họ này còn gồm một số cellulase và endoxylanase.

- Họ 75: gồm các chitosanase có nguồn gốc từ Aspergillus oryzae,

Aspergillus fumigatus hay Metarhizium anisopliae [31].

Ngoài ra, chitosanase ở vi sinh vật còn được phân loại dựa trên vị trí cắt đặc

hiệu của chitosanase đối với cơ chất chitosan [31]:

- Nhóm I: gồm các chitosanase thủy phân các mối liên kết GlcN – GlcN và

GlcNAc – GlcN (Streptomyces sp. N174).

- Nhóm II: các chitosanase thủy phân liên kết GlcN – GlcN (Bacillus sp. No.

7 – M).

- Nhóm III: các chitosanase thủy phân các mối liên kết GlcN – GlcN và GlcN

– GlcNAc (Bacillus circulans MH – K1).

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Bảng 1.2. Các chitosanase trong Họ 46 thuộc enzyme thủy phân liên kết

glycoside [9].

Ký hiệu chitosanase Tên loài

STR_N174 Streptomyces sp. strain N174

NOC_N106 Norcadioides sp. strain N106

AMY_CS02 Amycolatopsis sp. strain CsO-2

STR_COEL1 Streptomyces coelicolor A3(2)

STR_COEL2 Streptomyces coelicolor A3(2)

BAC_SUBT Bacillus subtilis

BAC_AMYL Bacillus amyloliquefaciens

BAC_KFB Bacillus KFB-C04, Bacillus sp. strain CK4

PBCV-1 Chlorella virus PBCV-1

CVK2 Chlorella virus CVK2

BAC_EHIM Bacillus ehimensis

BAC_COA Bacillus coagulans

BUR_GLAD Burkholderia gladioli

BAC_CIRC Bacillus circulans MH-K1

Sự khác biệt giữa chitosanase, chitinase, lysozyme và N – acetyl – β – D –

glucominidase cũng không rõ nét. Cả chitosanase và chitinase đều có khả năng thủy

phân một số loại chitosan với các mức độ acetyl hóa khác nhau. Tuy nhiên,

chitinase thường hoạt động trên cơ chất có tỷ lệ nhóm N – acetyl cao hoặc trên

chitosan có tỷ lệ khử nhóm N – acetyl thấp (20 – 45%), trong khi chitosanase không

hoạt động trên cơ chất có tỷ lệ nhóm N – acetyl cao [10]. Ngoài ra, chitosanase còn

được phân biệt với chitinase ở đặc điểm có phân tử lượng thấp hơn (khi điện di trên

gel SDS – PAGE trong điều kiện không có chất khử) và có tính đặc hiệu cơ chất

[25].

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.2.3. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitosanase

1.2.3.1. Trọng lượng phân tử

Các chitosanase có nguồn gốc từ các loài khác nhau có trọng lượng phân tử

khác nhau. Đa số đều có trọng lượng phân tử thấp, dao động từ 10 – 50 kDa. Tuy

nhiên, chitosanase của Rhodotorula gracilis có trọng lượng phân tử đến 100 kDa và

của Mucor rouxii ChoA là 76 kDa. Trọng lượng phân tử của các chitosanase của vi

khuẩn thì dao động trong khoảng từ 23 – 50 kDa, chitosanase từ các loài thực vật có

trọng lượng phân tử dao động trong khoảng từ 10 – 23 kDa [47].

Bảng 1.3. Trọng lượng phân tử chitosanase thu nhận từ các loài khác nhau [8].

Loài Tài liệu tham khảo

Trọng lượng phân tử (kDa) 79 63 Phương pháp xác định Lọc gel Lọc gel Alfonso, C. (1992) Alfonso, C. (1992)

35 (40) Aruchami, M. (1982) -

Lọc gel Tominaga, Y. (1975) 31

- Aruchami, M. (1982) 31

Mucor rouxii (enzyme A) Mucor rouxii (enzyme B) Macrotermes estherae (mối thợ) Bacillus sp. R-4 Macrotermes estherae (mối đực và mối cái có cánh) Penicillium islandicum Bacillus sp. No. 7-M Fenton, D.M. (1981) Uchida, Y. (1988) 30 30

Ando, A. (1992) Bacillus circulans 29,5

(-): không có thông tin về phương pháp xác định trọng lượng phân tử.

Streptomyces sp. Bacillus circulans Amycolatopsis sp. Bacillus sp. PI-7S Streptomyces griceus Lọc gel Lọc gel Từ trình tự nucleotide Lọc gel Lọc gel Lọc gel Lọc gel Lọc gel Price, J.S. (1975) Yabuki, M. (1988) Okajima, S. (1994) Seino, H. (1991) Ohtakara, A. (1988) 29 27 27 25 10

1.2.3.2. Tính đặc hiệu cơ chất

Cơ chất của chitosanase chủ yếu là chitosan và các dẫn xuất như glycol

chitosan, carboxymethyl chitosan và chitosan dạng keo. Ngoài ra, một số loại

chitosanase có khả năng thủy phân cơ chất là chitin và carboxymethyl cellulose

(CMC).

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Có rất nhiều dạng chitosanase được tìm thấy từ các loài sinh vật khác nhau

như Bacillus, Streptomyces, Citrus… có tính đặc hiệu cơ chất khác nhau. Ví dụ:

chitosanase từ Myxobacter AL – 1 [27], S. griceus [40], Bacillus sp. No. 7 – M và

Bacterium K – 1 [45] thủy phân được cả chitosan và CMC. Chitosanase từ B.

megaterium, F. solani và M. rouxii có thể thủy phân chitosan, một phần CMC và

chitin. Enzyme của Enterobacter sp. G – 1 có hoạt tính trên cả chitosan và chitin

[46].

Giải thích về tính đặc hiệu cơ chất, Schindler (1977) đã đưa ra giả thuyết về

những thay đổi trong cấu trúc cơ chất theo thời gian tiến hóa có thể ảnh hưởng đến

sự hình thành những vị trí hoạt động khác nhau của enzyme (ví dụ lysozyme). Do

đó, ở mỗi loài, enzyme có thể có tính đặc hiệu đối với cơ chất tự nhiên khác nhau.

1.2.3.3. Đặc tính thủy phân

Chitosanase chỉ thủy phân cơ chất chitosan mà không thủy phân chitin do

không có khả năng phân cắt liên kết GlcNAc – GlcNAc. Enzyme này phần lớn chỉ

tác động lên những cơ chất có tỷ lệ nhóm acetyl dưới 60% [22].

Chitosanase từ các loài vi sinh vật đã thể hiện các đặc điểm thủy phân khác

nhau, tùy thuộc vào độ lớn của phân tử và độ deacetyl hóa cơ chất. Chitosanase từ

B. circulans MH – K1 và Streptomyces N – 174 có thể xúc tác sự thủy phân các cơ

chất chitosan có mức độ acetyl hóa khác nhau [36]. Ngược lại, chitosanase từ F.

solani và N. orientalis chỉ có thể hoạt động tối ưu trên chitosan có mức acetyl hóa là

30%. Đặc biệt, chitosanase của B. circulans MH – K1 thủy phân tốt chitosan có độ

deacetyl hóa 80%. Chitosanase ở loài Enterobacter sp. G – 1 có khả năng thủy phân

chitin và chitosan ở dạng keo có mức độ deacetyl hóa khoảng 80% nhưng không

thủy phân chitosan dạng keo 100% deacetyl hóa và oligomer (dimer – hexamer)

[36].

Đặc tính phân cắt của chitosanase tương tự như những enzyme thuộc nhóm

thủy phân cơ chất đường với một cặp amino acid đóng vai trò xúc tác và sự tham

gia của các cặp carboxylic acid mạch bên [22].

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.2.3.4. Đặc tính động học

Trong tất cả các phản ứng enzyme, khi các điều kiện khác được giữ cố định

thì tốc độ phản ứng tùy thuộc vào nồng độ enzyme và nồng độ cơ chất. Hằng số Km

(hằng số Michaelis) và Vmax của chitosanase thay đổi tùy thuộc vào nguồn gốc của

enzyme và cơ chất thủy phân. Hầu hết các chitosanase tinh sạch xúc tác cho một

loại phản ứng phân cắt nội mạch chuyên biệt. Vận tốc phản ứng tùy thuộc vào mức

độ khử acetyl của chitosan cũng như lượng acetyl hòa tan trong môi trường phản

ứng [51]. Hằng số Km và Vmax của một số chitosanase vi sinh vật tiêu biểu được

trình bày trong Bảng 1.3.

Bảng 1.4. Đặc điểm thủy phân của một số chitosanase vi sinh vật [9]

Vị trí cắt Nguồn gốc chitosanase

Mức acetyl hóa của cơ chất (%) 1 – 60 Mức acetyl hóa tối ưu (%) 1 – 21 - Streptomyces N-174

Nocardia orientalis 0 – 41 30

Cắt liên kết GlcN-GlcN hoặc GlcNAc - -

Bacillus circulans Bacillus sp. P1-7S Bacillus pumilus 0 – 60 0 – 70 25 – 35 20 1 -

Enterobacter sp. G-1 20 20

Penicillium islandicum 0 – 80 30 -60 Cắt liên kết GlcN-GlcN Cắt liên kết GlcNAc- GlcNAc Cắt liên kết GlcNAc-GlcN

(-): không có thông tin

Bảng 1.5. Hằng số Michaelis và Vmax của chitosanase ở một số loài tiêu biểu [9]

Vmax Nguồn gốc chitosanase Km (mg/ml) Cơ chất đặc hiệu Tài liệu tham khảo

Streptomyces griseus 96,5 U/mg Chitosan, CMC 2,1

0,3 Chitosan, CMC Myxobacter AL-1 0,75 μmol/phút

0,82 286,3 U/mg Chitosan, CMC Bacillus megaterium P1a

1,4 Chitosan 2,7 μmol/phút Penicillium islandicum Ohtakara và cộng sự (1984) Hedges, Wolfe (1974) Pelletier, Sygusch (1990) Fenton, Eveleigh (1981)

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.2.3.5. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của chitosanase

Sự thay đổi về pH trong môi trường hoạt động của chitosanase sẽ gây ra một

số tác động như sau:

- Có thể làm thay đổi sự ion hóa những nhóm chức có vai trò xúc tác trong

phản ứng thủy phân.

- Thay đổi sự ion hóa những nhóm chức có vai trò trong việc gắn cơ chất.

- Làm biến tính enzyme.

Mỗi loại chitosanase đều có pH và nhiệt độ tối ưu riêng cho phản ứng thủy

phân cơ chất.

Nói chung, pH tối ưu của các chitosanase dao động từ pH 4,0 – 8,0 và phụ

thuộc vào loại cơ chất được sử dụng. Trị số pH tối ưu của chitosanase từ các loài

Myxobacter AL – 1, Streptomyces griseus và Bacterium K – 1 lần lượt là 5,0; 6,5 và

5,0 khi sử dụng cơ chất là CMC.

Mặt khác, tính bền pH của chitosanase cũng khác nhau tùy loài. Chitosanase

từ Streptomyces spp. thường trong khoảng 4,5 – 8,0; của Bacillus spp. là 3,3 – 11;

Penicillium islandicum, Nocardia orientalis, Pseudomonas sp. H-14, Enterobacter

sp. G-1 và Rh. gracilis CFR-1 là 3,5 – 7,0 (Bảng 1.5). Chitosanase của Penicillium

islandicum có hai khoảng pH giới hạn là pH 4,5 – 6,8 và pH 7,1 – 8 đối với cơ chất

hòa tan glycol chitosan [24]. Điểm đẳng điện (pI) thay đổi từ 4 – 10,1 tùy thuộc

nguồn gốc của chitosanase. Hoạt tính của đa số chitosanase sẽ nhanh chóng bị ức

chế khi giá trị pH của dung dịch phản ứng dưới 4,0.

Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của chitosanase trong khoảng 40 – 65oC.

Nhiều enzyme có nhiệt độ tối ưu lên đến trên 50oC (Bảng 1.6). Đa số chitosanase

mất khoảng 40 – 50% hoạt tính ở nhiệt độ 50 – 60oC sau 30 – 60 phút. Tuy vậy, một

số chitosanase chịu nhiệt từ Bacillus có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ

từ 60 – 100oC [28].

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Bảng 1.6. Giá trị pH tối ưu của một số chitosanase [24].

pH tối ưu Tên loài Tài liệu tham khảo

8,0 Streptomyces griseus Ohtakara, A. (1988)

6,5 Streptomyces griseus Ohtakara, A. (1988)

6,5 Bacillus circulans Yabuki, M. (1988)

6,2 Macrotermes estherae Aruchami, M. (1982)

5,8 Macrotermes estherae Aruchami, M. (1982)

5,6 Bacillus sp. Tominaga, Y. (1975)

5,6 Fusarium solani Shimosaka, M. (1993)

5,5 Streptomyces sp. Boucher, I. (1992)

5,3 Macrotermes estherae Aruchami, M. (1982)

5,0 Mucor rouxii Alfonso, C. (1992)

5,0 Citrus sinensis Osswald, W. F. (1991)

5,0 Nocardia orientalis Sakai, K. (1991)

4,9 Macrotermes estherae Aruchami, M. (1982)

4,5 Penicillium islandicum Fenton, D. M. (1981)

4,5 Streptomyces sp. Price, J. S. (1975)

4,0 Pseudomonas sp. Yoshihara, K. (1992)

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Bảng 1.7. Nhiệt độ tối ưu của một số chitosanase [24]

Loài Ghi chú Tài liệu tham khảo

- -

Nhiệt độ tối ưu (oC) 65 60 55 55 50 50 50 50 50 50 - -

Sakai, K. (1991) Yamasaki, Y. (1993) Fenton, D. M. (1981) 45 -

40 -

(-): không có thông tin

Boucher, I. (1992) Streptomyces sp. Price, J. S. (1975) Streptomyces sp. Enzyme A Alfonso, C. (1992) Mucor rouxii Okajima, S. (1994) ở pH 5,3 Amycolatopsis sp. Uchida, Y. (1988) Bacillus sp. ở pH 6,5 Yabuki, M. (1988) Bacillus circulans Mucor rouxii Enzyme B Alfonso, C. (1992) Bacillus megaterium Enzyme A Pelletier, A. (1990) Nocardia orientalis Enterobacter sp. Penicillium islandicum Bacillus sp. Fusarium solani 40 - Tominaga, Y. (1975) Shimosaka, M. (1993)

1.2.3.6. Chất hoạt hóa và chất ức chế

Chất hoạt hóa là những chất có khả năng làm tăng hoạt tính xúc tác của

enzyme hoặc làm cho enzyme không hoạt động trở thành hoạt động [8]. Các

chitosanase khác nhau có thể được hoạt hóa bằng các chất khác nhau. Các ion kim

loại (Mn2+, K+, Ca2+…) và một số hợp chất (EDTA…) đều có khả năng hoạt hóa

chitosanase [2].

Ngược lại, một số ion kim loại có tác dụng ức chế hoạt động của chitosanase,

chủ yếu là các ion Hg2+, Cu2+, Pb2+, Zn2+, Sn2+, Ni2+, Ag+, Fe2+… Chitosanase cũng

có thể bị ức chế bởi một số hợp chất như para – chloromercuribenzoate, N –

bromosuccinimide [36].

1.2.4. Cảm ứng tổng hợp, tinh chế và xác định hoạt tính chitosanase

1.2.4.1. Cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase

Hầu hết các loài vi sinh vật có khả năng tạo ra enzyme chitosanase đều có sự

cảm ứng dể sinh tổng hợp nên enzyme này. Ở chủng Streptomyces N – 174,

chitosanase được cảm ứng sinh tổng hợp trong môi trường có chứa chitosan, hoặc

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

D-glucosamin như là nguồn cacbon duy nhất [14]. Chitosanase từ Bacillus circulans

[18] và Amycolatopsis CsO – 2 [41] được cảm ứng tổng hợp bởi chitosan. Ở

Streptomyces sp. N6, D – glucosamin cũng có vai trò là chất cảm ứng tổng hợp

chitosanase nếu được bổ sung vào môi trường cùng với glucose ở giai đoạn tăng

trưởng tế bào. Tuy nhiên, nồng độ D – glucosamin tối ưu cho sự cảm ứng sinh tổng

hợp chitosanase là 0,05 M; ở nồng độ lớn hơn 0,1 M, D – glucosamin sẽ có tác

dụng ức chế. Galactosamin cũng có hoạt tính cảm ứng nhẹ, nhưng các đường

mannosamin, N – acetylglucosamin và galactose không có hoạt tính cảm ứng.

Ngoài ra, chitosanase cũng được cảm ứng sinh tổng hợp bởi các pathogensis related

protein (PR – protein) và các nấm (vesicular arbuscular mycorrhial – VAM) ở một

số loài thực vật [21]. Chitosanase cũng được cảm ứng sinh tổng hợp ở đậu phộng

bởi chitosan [17].

1.2.4.2. Tinh chế chitosanase

Chitosanase có thể được tinh chế bằng kỹ thuật thông dụng như tủa phân

đoạn bằng amonium sulfate, lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực… Năm 1988,

Minoru Yabuki và cộng sự đã tiến hành tinh chế chitosanase ngoại bào từ vi khuẩn

Bacillus circulans MH-K1 bằng phương pháp sắc ký CMC và phương pháp HPLC.

Nguyên tắc chủ yếu như sau: sau khi loại các tế bào vi khuẩn trong dung dịch nuôi

cấy bằng cách ly tâm, dịch nổi có chứa enzyme chitosanase ở dạng thô sẽ được tủa

lại bằng amonium sulfate với nồng độ bão hòa 70 – 90% ở pH 7,0. Ly tâm thu tủa

và hòa tan trong dung dịch đệm Tris – maleate, pH 7,2; tiếp tục thẩm tích dung dịch

protein chitosanase trong 8 giờ, ở 0oC để loại muối. Sau đó dung dịch enzyme thô

này được cho qua cột CMC để loại bỏ tạp chất. Các phân đoạn có chứa chitosanase

được gộp lại và tiến hành tinh chế tiếp bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp

(HPLC) để thu được chitosanase có độ tinh sạch cao [36].

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính chitosanase

Hoạt tính thủy phân chitosanase có thể được xác định dựa trên mức độ giảm

cơ chất hoặc mức độ tăng của sản phẩm tạo thành. Tuy nhiên, do cơ chất chitosan

không tan trong nước nên việc xác định hoạt tính và đo động học xúc tác cũng gặp

một số khó khăn.

Phương pháp đầu tiên được đề nghị để theo dõi phản ứng thủy phân của

chitosanase là do sự thay đổi về độ nhớt của dung dịch chitosan trong acetic acid

hoặc dịch đệm sodium acetate, cũng như đối với cơ chất là các dẫn xuất tan như

glycol chitosan. Tuy nhiên, phương pháp này có độ nhạy thấp [24].

Phương pháp thứ hai là phương pháp đo độ đục được sử dụng để xác định sự

giảm hàm lượng chitosan dạng keo trong phản ứng thủy phân.

Phương pháp xác định hoạt tính dựa trên sản phẩm phổ biến là phương pháp

đo các nhóm khử được tạo thành [39]. Một số nhà nghiên cứu đã đề xuất phương

pháp đo hoạt tính dựa trên lượng glucosamin được tạo thành bằng phản ứng màu

đặc hiệu của glucosamin với p – dimethyl – aminobenzaldehyde [44].

1.2.5. Ứng dụng của chitosanase

Ứng dụng trong y dược: sự thủy phân chitosan bằng chitosanase cho sản

phẩm là các oligomer có trọng lượng thấp có những đặc tính sinh học đặc biệt như

tác dụng ức chế sự tăng trưởng của nấm và vi khuẩn, khả năng kích thích sự tạo

thành phytoalexin (chất kháng vi sinh vật được tổng hợp và tích lũy ở thực vật bậc

cao). Chitosanase còn được dùng để định vị chitosan ở một số loài nấm.

Ứng dụng trong nông nghiệp: nhiều dạng chitosanase được tìm thấy ở thực

vật mà người ta tin rằng chúng có vai trò kháng lại các loại nấm bệnh xâm nhập

bằng cách phá hủy tính nguyên vẹn của vách tế bào nấm [23]. Chitosanase còn tạo

ra các oligomer có tác dụng kháng nấm cũng như gia tăng tạo thành những protein

kháng nấm khác đi đến khu vực xâm nhập bằng cách hoạt hóa các gen kháng bệnh

ở thực vật.

Ứng dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm: chitosan là một chất gôm cation tự

nhiên có hoạt tính kháng nấm được dùng để bổ sung vào kem, nước hoa, hóa chất

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

sơn móng… Hoạt tính thủy phân chitosan được tìm thấy ở nhiều vi khuẩn và nấm.

Vì vậy, các quy trình sử dụng chitosanase từ vi sinh vật có thể thay thế các quy trình

thủy phân hóa học sử dụng lượng lớn chlorhydric acid.

1.2.6. Tình hình nghiên cứu chitosanase trên Thế giới và ở Việt Nam

1.2.6.1. Tình hình nghiên cứu chitosanase trên thế giới

Do có những ứng dụng rộng rãi nên từ lâu trên thế giới đã có rất nhiều các

nghiên cứu về chitosanase như:

- Price và Stock (1975) đã nghiên cứu sản xuất, tinh sạch và đặc tính của

chitosanase ngoại bào từ Streptomyces.

- Fenton và cộng sự (1981) thực hiện tinh sạch và nghiên cứu phương thức

hoạt động của chitosanase từ Penicillium islandicum.

- Daris và Eveleigh (1984) đã tiến hành các nghiên cứu trên chitosanase như:

sự tìm thấy, sản xuất và cố định trên chitin, chitosan và enzyme liên quan.

- Reyes và cộng sự (1985) tìm hiểu về sự tự phân hóa của Mucor rouxii dưới

tác dụng của chitosanase.

- Boucher và cộng sự (1993) đã tiến hành tinh sạch và nghiên cứu đặc trưng

của chitosanase từ Streptomyces N-147.

- Shimosaka và cộng sự (1993) đã thực hiện các nghiên cứu về quy trình tinh

sạch và một số thuộc tính của chitosanase từ nấm gây bệnh cây Fusarium solani f.

sp. phaceoli.

- Shimosaka và cộng sự (1996) tiếp tục những nghiên cứu về sự tách dòng và

đặc trưng của gen chitosanase từ nấm gây bệnh cây Fusarium solani

- Jun-ichi Saito và cộng sự (1999) nghiên cứu về cấu trúc tinh thể của

chitosanase từ Bacillus circulans MH-K1 ở độ phân giải 1,6 Å và cơ chế nhận dạng.

- Hugo Tremblay và cộng sự (2000) đã nghiên cứu về dấu hiệu phân tử phổ

biến thống nhất chitosanase thuộc họ 46 và 80 trong số enzyme thủy phân

glycoside.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

- Tanabe và cộng sự (2003) nghiên cứu một dạng Chitosanase mới từ

Streptomyces griceus HUT 6037 với hoạt động chuyển giao đường khử từ một

glycoside khác.

- Xiao-E Chen và cộng sự (2008) nghiên cứu trên các chủng cải tiến và tiến

hành tối ưu hóa các thành phần dinh dưỡng để sản xuất chitosanase từ nấm

Aspergillus sp. CJ 22-326.

1.2.6.2. Tình hình nghiên cứu chitosanase ở Việt Nam

Tại Việt Nam, quá trình nghiên cứu về chitosan để ứng dụng vào các lĩnh

vực công nghệ nhằm phục vụ cho khoa học và đời sống đã được bắt đầu vào cuối

những năm thập niên 70 của thế kỷ XX. Tuy nhiên, những nghiên cứu về

chitosanase thì chỉ mới được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây:

- Lâm Ngọc Tuyết và cộng sự (2003), nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen

mã hóa chitosanase trong E. coli đề tài nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông

nghiệp và Y học, báo cáo trong hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 2.

- Cao Thị Ngọc Phượng và cộng sự (2003) đã xây dựng cơ sở dữ liệu protein

phục vụ nghiên cứu sinh học: trường hợp chitinase và chitosanase, báo cáo tại hội

nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2003, Bộ Khoa học và Công Nghệ, Hội các

ngành Sinh học Việt Nam, Trung tam Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia Hà

Nội.

- Vũ Thị Ánh Tuyết (2008) nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định đặc

tính enzyme chitosanase từ chủng Penicillium Oxalicum and Thom và ứng dụng để

thu nhận chitosan oligosaccharide.

- Trần Đình Cảnh và cộng sự (2012) đã thực hiện nghiên cứu tuyển chọn

chủng giống vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitosanase để sản xuất

glucosamin.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.3. Khái quát về lên men bán rắn

1.3.1. Định nghĩa lên men

Lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học được tiến hành do hoạt động sống

của vi sinh vật nhờ sự tiếp xúc của các enzyme nhằm cung cấp năng lượng và các

hợp chất trung gian cần thiết cho chúng [35].

Quá trình lên men có thể chia làm hai pha:

- Pha sinh trưởng: trong pha này, chủ yếu là quá trình sinh tổng hợp protein

và xây dựng tế bào. Các tế bào trong giai đoạn này rất trẻ, sinh trưởng

nhanh và tăng sinh khối khối nhanh. Môi trường dinh dưỡng trong pha

này giàu nguồn cacbon, nitơ, và phosphor vô cơ. Sản phẩm trao đổi chất

của vi sinh vật trong giai đoạn này không có hoặc chỉ mới bắt đầu tích tụ

với một số lượng rất nhỏ, sau tăng dần lên đồng thời với sự phát triển của

vi sinh vật, cho đến khi ổn định thì chuyển sang pha thứ hai [35].

- Pha thứ hai là pha tích tụ các sản phẩm của sự trao đổi chất. Ở pha này,

môi trường dinh dưỡng cạn dần, sinh khối tế bào cũng giảm dần nhưng

lượng sản phẩm trao đổi chất tích lũy ngày càng tăng. Tuy nhiên, ở cuối

pha này, do tế bào bắt đầu tự phân, quá trình tích tụ sản phẩm bị chậm lại

và một sản phẩm sẽ trở thành nguồn dinh dưỡng của vi sinh vật. Do đó,

môi trường khi nuôi cấy phải thống nhất, trong đó vi sinh vật với môi

trường có quan hệ tương hỗ với nhau. Trong thực tế sản xuất, pha này

bao giờ cũng phải kết thúc trước điểm cuối để tránh sự tự phân của tế

bào, làm tăng độ nhớt gây khó khăn cho việc tách lọc [35].

1.3.2. Lên men bán rắn

Theo Susana Rodríguez Couto và M. Ángeles Sanromán (2005), lên men bán

rắn (Solid State Fermentation – SSF) được định nghĩa là phương thức lên men bề

mặt của vi sinh vật diễn ra trên cơ chất rắn không tan, trong cơ chất này vẫn còn có

chất dinh dưỡng và có thể có một lượng không đáng kể nước hoặc là không có mặt

nước, chúng là giá đỡ về mặt cơ học, vừa cung cấp dưỡng chất cho vi sinh trong

điều kiện thiếu dòng nước chảy tự do. Hầu như toàn bộ hệ thống lên men được lấp

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

đầy bởi pha khí, còn nước chỉ tồn tại với lượng rất ít ở khoảng không gian giữa các

hạt cơ chất và không liên tục. Phần lớn lượng nước bị thẩm thấu vào các hạt cơ chất

rắn. Hàm ẩm nhỏ dẫn đến sự lên men chỉ có thể tiến hành với một số ít vi khuẩn,

nhưng phù hợp với phần lớn các nấm men, nấm mốc và các loài nấm khác.

Hình 1.5. Đặc điểm của quá trình lên men bán rắn (SSF) (Moo – Young và

cộng sự, 1983) – sự sắp xếp các hạt chất rắn ẩm và pha khí liên tục trong hệ

thống SSF với hệ nấm sợi (bên trái) và sinh vật đơn bào (bên phải) (David A.

Mitchell, Nadia Krieger, Marin Berovic (Eds), 2006).

Tinh bột, cellulose, sợi thiên nhiên, polymer hóa học… là những nguyên liệu

phổ biến được dùng trong nuôi cấy nấm và các loài vi sinh vật khác để lên men thể

rắn [35].

Quy trình SSF thông thường dùng nguyên liệu thô tự nhiên là nguồn cacbon

và cũng là nguồn năng lượng. SSF cũng có thể sử dụng nguyên liệu trơ làm hỗn hợp

rắn, khi này cần phải bổ sung thêm chất dinh dưỡng cần thiết cũng như nguồn

cacbon.

1.3.3. So sánh lên men bán rắn với lên men chìm

Môi trường cho các vi sinh vật phát triển của SSF khác hẳn với lên men giá

thể lỏng LSF Bảng 1.8:

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Bảng 1.8. So sánh giữa các quá trình lên men lỏng và rắn (Maurice Raimbault

(1998), David A. Mitchell (2006)).

SSF Sợi nấm tiếp xúc với không khí, dễ dàng bị khô. Nhiệt độ khác nhau tại những khác nhau trong thiết bị lên men, dễ tăng cao nếu không thổi khí tới. O2 tự do có khắp trên bề mặt hạt cơ chất, tuy nhiên lại rất thấp bên trong.

LSF Sợi nấm nằm trong pha lỏng, không sợ bị khô. Dễ dàng kiểm soát nhiệt độ, nhiệt độ được duy trì không đổi trong suốt quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Lượng O2 cần thiết cho vi sinh vật được điều chỉnh hợp lý tùy vào mức độ bão hòa của môi trường. Các thành phần dinh dưỡng dễ dàng điều chỉnh.

Dễ dàng kiểm soát được lực xé do khuấy đảo cơ học.

Điều chỉnh pH dễ dàng. Nguy cơ nhiễm khuẩn cao.

Theo Maurice Raimbault (1998), Có khả năng nhiều sản phẩm giá trị cao,

Lượng chất dinh dưỡng có sẵn để vi sinh vật sử dụng rất ít do chất dinh dưỡng bên ngoài hạt thấp hơn so với bên trong rất nhiều. Sự dịch chuyển các hạt có thể gây va chạm và hư hại vì các sợi nấm chịu va chạm kém. Khó điều khiển được pH. Nguy cơ nhiễm khuẩn thấp nhờ vào khả năng sinh trưởng mạnh của nấm. Tiêu thụ năng lượng thấp. Sử dụng ít thiết bị, chi phí thấp, không đòi hỏi kỹ thuật cao. Không có nước thải, ít ô nhiễm. Tiêu thụ năng lượng cao. Số lượng thiết bị nhiều, đòi hỏi công nghệ cao. Lượng nước thải lớn, gây ô nhiễm môi trường.

như các enzyme, các chất chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp, có thể được sản xuất trong

SSF. Nhưng những tiến bộ trong kỹ thuật và các khía cạnh kinh tế - xã hội được yêu

cầu bởi vì quá trình này phải sử dụng chất nền giá rẻ sẵn có ở địa phương, áp dụng

công nghệ thấp ở khu vực nông thôn, và quy trình phải được đơn giản hóa. Tiềm

năng tồn tại ở các nước đang phát triển, nhưng hợp tác chặt chẽ và trao đổi giữa các

nước phát triển và các nước công nghiệp hóa được yêu cầu cho các ứng dụng nhiều

hơn nữa của SSF.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.4. Khái quát về Aspergillus spp.

1.4.1. Giới thiệu về Aspergillus spp.

Aspergillus spp. thuộc:

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Eurotiomycetes

Bộ: Eurotiales

Họ: Trychocomaceae

Chi: Aspergillus

Aspergillus là một chi bao gồm hàng trăm loài nấm mốc được tìm thấy ở

nhiều vùng khí hậu khác nhau trên toàn thế giới. Aspergillus lần đầu tiên được xếp

vào danh mục năm 1729 bởi các linh mục và nhà sinh vật học người Ý Micheli.

Aspergillus là loài hiếu khí cao và được tìm thấy trong hầu như ở tất cả các

môi trường giàu oxy. Thông thường, nấm phát triển trên các bề mặt cơ chất giàu

cacbon như monosaccharide và polysaccharide. Aspergillus là loài gây hư hỏng phổ

biến của các loại thực phẩm giàu tinh bột (như bánh mì và khoai tây), và phát triển

trong nhiều loài thực vật và cây.

Ngoài ra, nhiều loài Aspergillus còn có khả năng phát triển trong môi trường

có nguồn dinh dưỡng cạn kiệt. A. niger là một ví dụ điển hình, nó có thể được tìm

thấy trên các bức tường ẩm ướt.

Aspergillus có ý nghĩa quan trọng trong y tế và thương mại. Một số loài có

thể gây nhiễm trùng ở người và động vật. Hơn 60 loài Aspergillus có liên quan đến

tác nhân gây bệnh. Đối với con người, có một loạt các bệnh như nhiễm trùng tai

ngoài, tổn thương da, viêm loét… Các loài khác có ý nghĩa quan trọng trong quá

trình lên men vi sinh thương mại. Một số thành viên của chi cũng là nguồn của các

sản phẩm tự nhiên có thể được sử dụng trong y dược để điều trị bệnh của con người

[43].

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Aspergillus spp.

Aspergillus là giống nấm mốc có khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh

trên nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Chúng sống hoại sinh hoặc kí sinh,

không có khả năng quang hợp tạo chất hữu cơ. Được xếp vào nhóm hiếu khí cao, có

khả năng sử dụng và chuyển đổi đa dạng các nguồn cơ chất để phát triển. Nhiều

nghiên cứu cho thấy chúng là một trong các giống nấm mốc có khả năng sống trong

điều kiện độ ẩm thấp và nhiệt độ khắc nghiệt, chúng có thể mọc ở các môi trường

có nồng độ đường cao, có pH acid và các cơ chất tương đối khô, nơi mà các vi sinh

vật khác khó có khả năng phát triển. Trong tự nhiên chúng tồn tại và phát triển trên

các loại cây hoa màu, cây ngũ cốc, những nơi có độ ẩm cao trong nhà, trên các loại

lương thực được bảo quản không kĩ, gây ra các tình trạng thối rữa, hư hại lương

thực [43].

Aspergillus có cấu tạo hệ sợi phân nhánh, khả năng phân nhánh nhanh, sợi

nấm có vách ngăn chia sợi thành nhiều tế bào đường kính sợi nấm tương đối mảnh

từ 5-7µm, phân nhánh và phát triển nhanh tạo hệ sợi nấm (hay còn gọi là hệ khuẩn

ty). Có hai loại khuẩn ty:

 Khuẩn ty sinh dưỡng: Loại khuẩn ty này giúp nấm mốc bám chặt vào giá thể, có

khả năng đâm sâu vào môi trường, tiết enzyme thủy phân và hấp thụ dinh dưỡng

từ cơ chất.

 Khuẩn ty khí sinh: thường mọc trên bề mặt môi trường rắn, màu trắng, giúp nấm

lấy oxy từ không khí. Khi già khuẩn ty chuyển từ màu trắng sang màu đặc trưng

của bào tử đính và có chức năng sinh sản.

Sinh sản sinh dưỡng: là hình thức sinh sản bằng khuẩn ty, khuẩn ty được

hình thành từ bào tử hoặc các khuẩn ty ban đầu, bay theo gió lẫn vào môi trường và

phát triển thành nấm mốc mới khi gặp điều kiện thuận lợi [51].

Sinh sản bằng bào tử: Aspergillus sinh sản bằng bào tử trần, khuẩn ty khi gặp

điều kiện thích hợp sẽ hình thành các cuốn đính bào tử, cuốn này mang các nang

bào tử được gọi là túi đỉnh, bào tử được hình thành trên đầu các thể bình trong túi

đỉnh và nối dài nên được gọi là bào tử đính. Khi chín bào tử được phát tán vào trong

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

không khí, khi gặp điều kiện môi trường có độ ẩm thuận lợi bào tử sẽ nẩy mầm và

phát triển thành nấm mới. Bào tử của Aspergillus thường có dạng hình tròn hoặc

hình ovan [32].

1.4.3. Một số ứng dụng của Aspergillus spp.

Acid citric là một trong số nhiều sản phẩm được tổng hợp từ Aspergillus,

được tổng hợp chủ yếu bởi A. niger được sử dụng rộng rãi trong ngành phụ gia thực

phẩm, trong dược phẩm, hóa học. Acid citric được thêm vào các hỗn hợp tẩy rửa

thay tripolyphophate để tạo ra các sản phẩm thân thiện với môi trường hơn.

Có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme với hiệu suất cao, nên

Aspergillus còn đóng một vai trò quan trọng trong công nghiệp enzyme. Các

enzyme như α – amylase, glucoamylase, cellulase, pectinase, xylanase,

hemicellulase, và protease là những enzyme được sản xuất nhiều nhất từ giống nấm

này. α – amylase được sử dụng trong công nghiệp bánh, trong sản xuất các loại thức

uống có chứa maltose được thủy phân từ tinh bột. Glucoamylase hay

amyloglucosidase kết hợp với các loại amylase khác có khả năng thủy phân tinh bột

tạo glucose hoặc các hỗn hợp đường dùng trong công nghiệp lên men. Xylanase

được dùng để xử lý làm trong các loại nước ép trái cây trong công nghiệp thực

phẩm, hoặc xử lý làm mềm các loại rau quả trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, giúp

cho quá trình tiêu hóa của các loại vật nuôi xảy ra dễ dàng hơn. Protease được sử

dụng thủy phân một phần gluten có trong các loại bột, góp phần cùng các enzyme

khác như xylanase làm cho bánh mềm và dễ nở hơn. Pectinase được ứng dụng rộng

rãi để xử lý các loại nước ép từ quả, nó thủy phân một số thành phần làm cho nước

ép có độ đồng nhất và trong hơn. Các nghiên cứu cho thấy một sự kết hợp giữa

pectinase và cellulase sẽ làm tăng hiệu xuất thủy phân các polysacharide, làm tăng

lượng đường thu hồi [51].

Ở các nước châu Á như Việt Nam, Nhật Bản, Trung Quốc…. A. oryzae,

Aspergillus sojae, và Aspergillus tamarii được sử dụng lên men tạo các loại nước

chấm từ đậu tương, sử dụng để đường hóa gạo và các loại ngũ cốc khác tạo các thức

uống có cồn.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Bên cạnh thế mạnh khả năng sinh tổng hợp enzyme, Aspergillus còn có khả

năng sinh tổng hợp mạnh một số hợp chất thứ cấp như Penicillin, cyclosporin A,

lovastatin [51].

1.5. Khái quát về nguồn nguyên liệu cám gạo và vỏ trấu trong nước

1.5.1. Nguồn cám gạo trong nước

Cám gạo là phụ phẩm chính thu được từ lúa sau khi xay xát và thường chiếm

khoảng 10% trọng lượng lúa. Cám gạo được hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm

phôi của hạt, cũng như một phần từ tấm. Cám gạo có màu sáng và mùi thơm đặc

trưng. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của cám gạo biến động rất lớn, phụ

thuộc nhiều vào kỹ thuật xay xát gạo.

Tỷ lệ vỏ trấu sau khi xay xát ảnh hưởng nhiều tới hàm lượng protein, béo và

xơ của cám gạo thành phẩm. Tỷ lệ protein trong cám gạo mịn có thể đạt 12 - 14%.

Lượng protein thô ở cám gạo cao hơn so với ở bắp hạt (chỉ đạt 8,3%). Hàm lượng

chất béo, xơ trong khoảng 13 - 14% và 7 - 8%. Tuy nhiên, theo kết quả phân tích đã

công bố cho thấy các chỉ tiêu này biến động rất lớn. Cụ thể, hàm lượng béo thô

khoảng 110 - 180g/kg vật chất khô (VCK) và lượng xơ biến động trong khoảng 90 -

120g/kg VCK. Theo báo cáo của Gene và ctv (2002) và Creswell (1987) qua phân

tích nhiều mẫu cám gạo được thu thập từ các nước Đông Nam á cho thấy thành

phần dinh dưỡng của chúng rất biến động. Hàm lượng chất béo có trong các mẫu

cám gạo nói trên biến động từ 12 - 19% từ đó ảnh hưởng tới mức năng lượng của

cám gạo. Trong khi đó hàm lượng xơ thô biến động từ 7,5 - 13% và làm giảm năng

lượng của cám. Cám có hàm lượng béo cao nhưng mức năng lượng trao đổi (ME)

thấp khoảng 2.850 Kcal/kg (NRC 1994, 1999) là do hàm lượng xơ thô cao. Chất

lượng cám gạo biến đổi nhiều tùy thuộc vào tỷ lệ vỏ trấu còn lại sau khi xay xát. Vỏ

trấu chiếm khoảng 20% trọng lượng hạt lúa và có hàm lượng silíc rất cao khoảng

210g/kg VCK, rất sắc nhọn nên dễ gây tổn thương thành ruột. Khẩu phần thức ăn

hỗn hợp chứa đa phần là ngũ cốc và các phụ phẩm của chúng thường chứa rất nhiều

NSP (Non Starch Polysaccharide). Cám gạo có các thành phần xơ chủ yếu như

arabinoxylan, cellulose và lignin. Trong quá trình tiêu hóa của lợn, giá trị dinh

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

dưỡng của cám gạo phụ thuộc rất nhiều vào hàm lượng chất xơ và thành phần của

chúng [6].

Bảng 1.9. Thành phần xơ và giá trị dinh dưỡng của các nguyên liệu [6].

Chi tiêu Bắp Lúa mì Bột mì Cám lúa mì

Protein (%) DE (Kcal/kg) Xơ thô (%) Xơ tổng số (%) NSP tổng số (%) Cellulose (%) Lignin (%) Arabinoxylan (%) (% không hoà tan) 8 3.525 2,2 9,5 9 2,0 0,5 3,7 (94) Cám gạo nguyên dầu 13 3.100 8 19 15 5 4 9 (96) Cám gạo Trích dầu 15 2.250 11 27 21 7 6 11 (97) 12 3.350 2,5 10,5 9,5 2,5 1 5,5 (77) 16 2.520 11 44 38,2 11 5,8 21 (99) 16 2.965 9 27 23,5 8 3,5 15 (97)

Arabinoxylan là những thành phần chủ yếu có trong cấu thành của xơ ở cám

gạo. Chúng chiếm khoảng 60% tổng số NSP hiện diện. Đây là một loại đường đa do

những đường đơn arabinose và xylose tạo nên nhờ các liên kết 1- 3, 1 - 4 glucoside,

động vật có dạ dày đơn không thể tiêu hóa được chúng.

Cám gạo cũng như các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật khác thường chứa

hàm lượng phốt pho khá cao ở dạng phytate. Mặc khác, gốc phốt phát từ phytate

thường tạo liên kết với các chất như axít amin và chất khoáng làm giảm sự tiêu hóa

các dưỡng chất này khi bổ sung vào khẩu phần. Thông thường có khoảng 2/3 hàm

lượng phốt pho có trong những loại nguyên liệu thô được sử dụng làm thức ăn gia

súc, hiện diện dưới dạng phytate. Cám gạo có lượng phốt pho khá cao nhưng trên

50% là ở dạng phytate. Động vật có dạ dày đơn khó tiêu hóa chất này do không sản

xuất đủ lượng enzyme phytase nội sinh cần thiết [4].

1.5.2. Nguồn vỏ trấu trong nước

Việt nam là nước có nền văn minh lúa nước rất lâu đời, từ lâu cây lúa đã gắn

liền với đời sống của nhân dân. Không những hạt lúa được sử dụng làm thực phẩm

chính, mà các phần còn lại sau khi đã thu hoạch lúa cũng được người dân tận dụng

trở thành những vật liệu có ích trong đời sống hàng ngày. Ví dụ rơm được sử dụng

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

lợp nhà, cho gia súc ăn, làm chất đốt, hoặc ủ làm phân. Trấu được sử dụng làm chất

đốt hay trộn với đất sét làm vật liệu xây dựng… Không những trấu được sử dụng

làm chất đốt trong sinh hoạt hàng ngày mà còn được sử dụng như là một nguồn

nguyên liệu thay thế cung cấp nhiệt trong sản xuất với giá rất rẽ.

Trấu là lớp vỏ ngoài cùng của hạt lúa và được tách ra trong quá trình xay xát.

Trong vỏ trấu chứa khoảng 75% chất hữu cơ dễ bay hơi. Chất hữu cơ chứa chủ yếu

cellulose, lignin và Hemi – cellulose (90%), ngoài ra có thêm thành phần khác như

hợp chất nitơ và vô cơ. Lignin chiếm khoảng 25 – 30% và cellulose chiếm khoảng

35 – 40%.

Các chất hữu cơ của trấu là các mạch polycarbohydrat rất dài nên hầu hết các

loài sinh vật không thể sử dụng trực tiếp được, nhưng các thành phần này lại rất dễ

cháy nên có thể dùng làm chất đốt. Sau khi đốt, tro trấu có chứa trên 80% là silic

oxyt, đây là thành phần được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực [6].

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

2.1. Vật liệu

2.1.1. Chủng giống

Chủng nấm mốc A. oryzae – 1 (O1), A. oryzae – 2 (O2), A. niger – 1 (N1), A.

niger – 3 (N3) và A. niger – 7 (N7) do Phòng thí nghiệm các chất có hoạt tính sinh

học thuộc Bộ môn Sinh hóa – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc

Gia Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp. Các chủng được bảo quản trên môi trường

PGA – thạch nghiêng.

2.1.2. Cơ chất cảm ứng

Chitosan dạng bột do Phòng thí nghiệm các chất có hoạt tính sinh học thuộc

Bộ môn Sinh hóa – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh

cung cấp.

2.1.3. Cơ chất nuôi cấy

Cám gạo và trấu được mua từ nhà máy xay xát Giồng Trôm, Huyện Giồng

Trôm, Tỉnh Bến Tre.

2.1.4. Hóa chất và thiết bị

2.1.4.1. Hóa chất

- Hóa chất pha môi trường: K2HPO4, NaNO3, MgSO4. 7H2O, KCl,

(NH4)2SO4, KH2PO4, Glucose công nghiệp, Agar.

- Hóa chất pha thuốc nhuộm:

+ Lugol: KI, I2.

+ Methylene Blue: Methylene blue – trihydrate.

- Hóa chất pha thuốc thử Bradford: Comasie Brilliant blue, Ethanol 99o,

acid Phosphoric 85%.

- Hóa chất pha thuốc thử DNS (acid 3,5 – dinitrosalicylic): DNS dạng bột,

Sodium Potassium Tartrate, NaOH 2N.

- Hóa chất dựng đường chuẩn Albumine: thuốc thử Bradford, Albumine.

- Hóa chất dựng đường chuẩn glucosamine: thuốc thử DNS, D –

glucosamine.

- Hóa chất pha đệm acetate: CH3COOH, CH3COONa.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

2.1.4.2. Thiết bị

- Wiseclause ® Digital Fuzzy Control System,

- Máy vortex

- Buồng đếm Malassez, Đức.

- Máy đo pH, Mettler Toledo, Thụy Sỹ

- Cân phân tích, PioneerTM, Mỹ

- Kính hiển vi quang học,

- Máy ly tâm, Universal 32 – Hettich Zentrifugen, Đức

- Máy quang phổ, CECIL – CE 1011

- Que cấy móc, que cấy vòng và các dụng cụ thí nghiệm khác.

2.1.5. Môi trường

2.1.5.1. Môi trường giữ giống

Môi trường giữ giống là môi trường dùng để bảo quản giống. Giống trong

môi trường được bảo quản bình thường ở nhiệt độ phòng và được cấy lưu 1 tháng 1

lần.

Môi trường giữ giống dùng trong khóa luận này là môi trường PGA (Potato

Glucose Agar).

Thành phần:

Khoai tây 200g

Glucose 20g

Agar 20g

Khoai tây thái lát đun sôi vừa lửa trong 30 phút, thu lấy dịch chiết hòa tan

cùng với glucose, thêm agar vừa đủ, thêm nước cất định mức 1000 ml. Nếu làm

thạch nghiêng thì phải đun tan hết agar, sau đó phối vào khoảng 1/4 ống nghiệm,

đậy nút bông. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút [7].

2.1.5.2. Môi trường nhân giống

Môi trường nhân giống được sử dụng là môi trường lúa. Thành phần:

Lúa 10 g

Dịch khoáng Czapek (*) 10ml

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Lúa được xử lý sơ bộ bằng cách ngâm nước trong 3 giờ, sau đó vớt ra vò

sạch, rửa lại bằng nước cất và để ráo tự nhiên. Cho vào bình nuôi cấy và bổ sung

dịch khoáng Czapek. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.

(*): thành phần dịch khoáng Czapek: K2HPO4 0,1%; NaNO3 0,2%; MgSO4

0,05%; KCl 0,05% [7].

2.1.5.3. Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme

a. Môi trường cấy điểm

Môi trường cấy điểm dùng để kiểm tra hoạt tính chitosanase được sử dụng là

môi trường Czapek dox agar – chitosan.

Thành phần:

0,5% Yeast extract

0,2% NaNO3

0,1% KH2PO4

0,05% KCl

0,05% MgSO4. 7H2O

0,001% FeSO4. 7H2O

Chitosan 1%

Chitosan được hòa tan trong đệm acetate 0,5M, pH 5,5 [2].

b. Môi trường đục lỗ thạch

Môi trường đục lỗ thạch dùng để kiểm tra định tính chitosanase từ dịch canh

trường trích ly sau nuôi cấy. Môi trường được dùng trong thí nghiệm là môi trường

Chitosan – agar.

Thành phần:

Chitosan 1% trong đệm acetate 0,5M, pH 5,0: 50ml

Agar 20g

Thêm nước cất đến 1000ml, hấp khử trùng 121oC trong 15 phút [2].

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

2.1.5.4. Môi trường lên men bán rắn

Cám gạo: 70%

Trấu: 10%

Chitosan: 10%

Độ ẩm môi trường: 60%

Độ ẩm được điều chỉnh bằng dịch khoáng ((NH4)2SO4: 0,2%; KH2PO4:

0,2%; MgSO4. 7H2O: 0,05%) [2].

2.2. Phương pháp

2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu

Nguyên tắc: dựa trên nguyên lý làm khô mẫu đến trọng lượng khô không đổi.

Khối lượng mẫu mất đi khi sấy mẫu đến trọng lượng khô không đổi là lượng nước

có trong mẫu.

Tiến hành: sấy khô và cân đĩa Petri đến khối lượng không đổi, sử dụng cân

phân tích chính xác đến 0.5 mg. Cân 5g mẫu (độ chính xác đến 1 mg) cho vào đĩa

Petri và đậy nắp lại. Đặt chén đựng mẫu vào tủ sấy, mở nắp Petri và sấy ở 105oC

trong 4 giờ. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 15 – 20 phút, rồi cân đĩa Petri với độ

chính xác đến 1 mg. Đặt đĩa Petri sấy tiếp 30 phút nữa ở 105oC. Lấy ra, để nguội

trong bình hút ẩm 15 – 20 phút và cân lại. Chênh lệch giữa hai lần cân không quá 5

mg, nếu vẫn chưa đạt thì cần phải sấy và cân lại [5].

Tính toán: Độ ẩm của mẫu (X) được tính theo công thức:

100

𝑀

(Công thức 1) X = (m1 – m2) *

Trong đó:

M: khối lượng mẫu phân tích (g)

m1: trọng lượng chén và mẫu trước khi sấy (g)

m2: trọng lượng chén và mẫu sau khi sấy (g)

X: độ ẩm của mẫu (%)

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

2.2.2. Phương pháp xác định trực tiếp số lượng bào tử

2.2.2.1. Cấy nhân sinh khối

Cấy giống: mốc giống được lấy từ các ống cấy chuyền, dùng 10 ml dịch agar

0,1% đã vô trùng cho vào ống giống cấy chuyền, dùng que cấy vòng lướt nhẹ trên

mặt thạch và đánh đều bào tử vào dịch agar. Cấy vào mỗi bình môi trường lúa 2 ml

dịch huyền phù bào tử.

Ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 3 – 5 ngày, quan sát khi mà mốc ra bào tử

đều khắp bình môi trường là được [5].

2.2.2.2. Xác định số lượng bào tử bằng phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng

cầu

Dùng buồng đếm hồng cầu Malassez để đếm tế bào nấm mốc. Malassez là

một phiến kính hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng ngang. Khoảng giữa là phần lõm

phẳng, với chiều cao tính từ mặt phẳng lõm đến lamelle là 0,2 mm ± 1% (1/20 mm).

Thể tích chứa trong 1 mm2 là 2 μl. Khu vực đếm hình chữ nhật có diện tích là 5

mm2. Khu vực này được chia thành 25 ô chữ nhật, diện tích mỗi ô là 0,25 x 0,20

mm (= 0,05 mm2). Mỗi ô chữ nhật này lại được chia ra thành 20 ô vuông nhỏ, với

diện tích mỗi ô vuông là 0,0025 mm2 (1/400 mm2).

Các bước tiến hành:

- Mẫu được lấy từ các bình nhân giống.

- Pha loãng mẫu ra các nồng độ: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5.

- Dùng máy vortex để đánh đều bào tử, hút một lượng vừa đủ nhỏ vào rãnh

buồng đếm để huyền phù bào tử theo lực mao dẫn lan vào khoảng giữa bề mặt

buồng đếm và lamelle. Nếu xuất hiện bọt khí thì phải làm sạch buồng đếm và

lamelle rồi tiến hành lại.

- Để yên buồng đếm trong 2 phút để ổn định bào tử, sau đó đưa lên kính hiển

vi đếm ở vật kính 40. Trên buồng đếm Malassez: đếm bào tử ở 5 ô trung bình của

khu vực đếm (4 ô ở bốn góc và 1 ô ở giữa). Trong mỗi ô trung bình đếm cả 20 ô

nhỏ. Trong mỗi ô nhỏ, đếm tất cả bào tử nằm gọn trong ô và những bào tử nằm ở

cạnh trên và cạnh trái. Như vậy biết được số bào tử trong 100 ô nhỏ. Những bào tử

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

nằm ngay trên vạch ngoài thì đếm 2 tính 1, còn bào từ nào nằm giữa 2 vạch hoặc

trên vạch thì 1 tính 1. Ở mỗi nồng độ pha loãng, bào tử nân được đếm 2 lần để tự

kiểm chứng khả năng. Ghi nhận lại kết quả đếm được và tiến hành tính theo công

thức [6]:

N =

(Công thức 2)

𝑎 ∗ 8000 ∗ 103 ∗ 10𝑛 𝑏

Trong đó:

N: số lượng bào tử trong 1 ml dịch huyền phù

a: số lượng bào tử trong 5 ô chữ nhật (100 ô vuông nhỏ)

b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô chữ nhật (20 x 5 = 100 ô vuông nhỏ)

8000 = 400 x 20 (1/400 mm2: diện tích một ô vuông nhỏ; 1/20 mm: chiều

cao từ mặt buồng đếm đến tấm lamelle)

103: số chuyển mm3 thành ml (1000 mm3 = 1 ml)

10n: độ pha loãng mẫu

2.2.3. Phương pháp cấy điểm trên môi trường thạch đĩa chọn chủng nấm mốc có

hoạt tính chitosanase cao

2.2.3.1. Nguyên tắc

Xác định khả năng phân giải chitosan của các chủng nấm mốc Aspergillus.

Chủng có khả năng phân giải chitosan thì khi cho thuốc thử Lugol vào sẽ xuất hiện

một vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Vòng càng lớn thì biểu hiện khả năng

phân giải chitosan càng cao [6].

2.2.3.2. Tiến hành

Dùng que cấy móc, tiến hành cấy điểm các chủng nấm mốc lên môi trường

thạch đĩa Czapek dox agar – chitosan. Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 – 6 ngày.

Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc trước, sau đó cho vào đĩa thạch 5 ml Lugol, để

yên trong 15 phút. Đổ lượng thuốc thử còn thừa ra và rửa lại đĩa thạch dưới vòi

nước chảy nhẹ trong 3 phút, để ráo. Quan sát và đo đường kính vòng phân giải

đường kính vòng phân giải càng lớn thì khả năng sinh tổng hợp chitosanase của

chủng nấm mốc càng lớn [6].

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

2.2.4. Phương pháp khuếch tán thạch đĩa

Cấy các chủng nấm mốc lên môi trường lên men bán rắn, nuôi ủ ở nhiệt độ

phòng trong 96 giờ. Tiến hành trích ly enzyme với nước.

Môi trường chitosan – agar sau khi hấp khử trùng, để nguội khoảng 45oC, đổ

vào các đĩa petri (lượng môi trường phối vào các đĩa nên đều nhau và phải dày từ 2

– 3 mm).

Chờ cho môi trường thạch đĩa đông lại, dùng dụng cụ đục lỗ đường kính 5

mm khoan thành 5 lỗ phân đều trên đĩa thạch. Nhỏ vào mỗi lỗ 20 μl dịch chiết

enzyme (đánh dấu cho từng chủng). Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau

đó cho 5 ml thuốc thử Lugol vào, để yên trong 15 phút. Đổ lượng thuốc thử còn

thừa ra và rửa lại đĩa thạch dưới vòi nước chảy nhẹ trong 3 phút, để ráo. Quan sát và

đo đường kính vòng phân giải (mm), kích thước vòng phân giải tỷ lệ thuận với khả

năng sinh tổng hợp chitosanase của nấm mốc [7].

2.2.5. Phương pháp mô tả hình thái vi sinh vật

2.2.5.1. Quan sát đại thể

Dùng que cấy móc vô trùng lấy một ít bào tử từ ống mốc giống cấy một điểm

trên môi trường thạch đĩa PGA, ủ đĩa thạch trong 3 ngày ở nhiệt độ phòng. Quan sát

hình dạng và màu sắc mặt trên và mặt dưới của khuẩn lạc [7].

2.2.5.2. Quan sát vi thể

Lót giấy thấm ở đáy của đĩa petri, đặt vào một miếng lame, gói giấy và hấp

khử trùng. Thao tác vô trùng rót môi trường PGA lên 1/2 tấm lame, chờ cho thạch

đông, làm ẩm giấy thấm bằng nước cất vô trùng. Dùng que cấy móc cấy một điểm

lên phần thạch PGA trên lame, ủ đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Sau 2 ngày, lấy miếng

lame khỏi đĩa petri, nhộm phần đĩa không dính môi trường PGA với thuốc nhộm

xanh methylen, đè nhẹ lamen lên phần sợi nấm đã nhộm. Quan sát dưới kính hiển vi

(X40) cuốn sinh bào tử đính và vách ngăn tế bào [7].

2.2.6. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn

Việc giữ giống và hoạt hóa các chủng nấm mốc được tiến hành trên các môi

trường đã giới thiệu ở mục 2.1.5. Thêm vào mỗi ống giống sau khi hoạt hóa 10 ml

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

dịch agar 0,1% (vô trùng). Dùng que cấy vòng (vô trùng) đánh nhẹ bào tử ở dạng

huyền phù.

Việc nuôi cấy nấm mốc tạo canh trường giàu enzyme được tiến hành trên

môi trường lên men bán rắn đã giới thiệu ở mục 2.1.5.4. Cho vào mỗi bình nuôi cấy

lượng cơ chất và thành phần như đã nêu và đem hấp khử trùng, chờ cho môi trường

nguội thì cấy vào 2 ml dịch huyền phù bào tử [5].

2.2.7. Phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5 – dinitrosalicylic) xác

định hoạt tính chitosanase

2.2.7.1. Nguyên tắc

Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử

DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử

trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucosamin với

thuốc thử sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Cho enzyme tác

dụng với cơ chất là chitosan, sản phẩm tạo thành là glucosamin được bắt màu với

thuốc thử DNS và đem đo mật độ quang ở bước sóng 575 nm [16].

2.2.7.2. Tiến hành

a. Dựng đường chuẩn glucosamin

Từ dung dịch glucosamin chuẩn, pha các dung dịch glucosamin chuẩn có

nồng độ từ 100 – 500 μg/ml như Bảng 2.1.:

Bảng 2.1. Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucosamine.

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Hóa chất

Dung dịch glucosamin 1 mg/ml (ml) 0 1 2 3 4 5

Nước cất (ml) 5 4 3 2 1 0

Nồng độ glucosamin (μg/ml) 0 100 200 300 400 500

Hút 0,5 ml dung dịch protein vừa pha loãng cho vào các ống nghiệm sạch và khô

khác

1 1 1 1 1 1 Dung dịch glucosamin (ml)

4 4 4 4 4 4 Thuốc thử DNS (ml)

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Ống nghiệm 0 tương ứng với thời gian xuất phát ban đầu là 0 phút và được

dùng làm ống đối chứng.

Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại, các ống cách nhau 1 phút.

Đem đun cách thủy ở 100oC trong 3 phút, làm nguội và đo OD ở bước sóng

575 nm. Dựng đường tuyến tính giữa nồng độ glucosamin (μg/ml) với mật độ quang

∆OD.

Đối với mẫu thí nghiệm thì tiến hành thực hiện như Bảng 2.2.:

Bảng 2.2. Các bước tiến hành xác định hoạt tính đối với mẫu thí nghiệm.

Ống nghiệm 0 1 Hóa chất

Chitosan 0,1 % (ml) 1 1

Dịch chiết enzyme (ml) 0 1

Để phản ứng xảy ra trong 30 phút ở nhiệt độ phòng

Dừng phản ứng bằng cách đun cách thủy ở 100oC trong 3 phút.

Dịch chiết enzyme (ml) 1 0

Thuốc thử DNS (ml) 4 4

Đun cách thủy ở 100oC trong 15 phút, để nguội, lọc và đo OD

ở bước sóng 575 nm.

b. Tính toán

Dựa vào đồ thị đường chuẩn tính được nồng độ đường khử của mẫu, từ đó

suy ra hoạt tính của enzyme theo công thức sau [16]:

Hoạt tính = (Công thức 3)

(UI/ml hay UI/mg)

X ∗ 103 215,6 ∗ 30 ∗ 1

Trong đó:

X: là lượng đường khử tạo thành (mg)

103: hệ số chuyển đổi từ mol sang μmol

215,6: trọng lượng phân tử của 1 mol N – acetylglucosamin

30: thời gian phản ứng 30 phút

1: thể tích enzyme tham gia phản ứng (ml)

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

2.2.8. Phương pháp Bradford – xác định hàm lượng protein

2.2.8.1. Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc

nhuộm Coomassien Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang

tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực

đại 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng

595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới hàm

lượng protein.

Để xác định hàm lượng protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường

chuẩn với dung dịch protein đã biết nồng độ (thường là Bovine plasma γ-globulin

hoặc Bovine serum albumin). Sau khi cho dung dịch thuốc nhuộm vào, màu sẽ xuất

hiện sau 2 phút và bền đến 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ ta

được ODx, độ hấp thu này sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu. Thực hiện mẫu đối

chứng với nước cất ODo.

Tính giá trị ΔOD = ODx – ODo của mẫu. Lượng protein trong dung dịch

được xác định bằng cách dựa vào đồ thị đường chuẩn albumin [16].

2.2.8.2. Tiến hành

a. Dựng đường chuẩn albumin

Để dung dịch albumin chuẩn có các nồng độ từ 10 – 50 μg/ml, ta thực hiện

như Bảng 2.3:

Bảng 2.3. Các bước tiến hành dựng đường chuẩn albumine

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Hóa chất

Dung dịch albumin 0,01 mg/ml (ml) Nước cất (ml) Nồng độ protein (μg/ml) 3 7 30 2 8 20 4 6 40 1 9 10 0 10 0

5 5 50 Hút 0,5 ml dung dịch protein vừa pha loãng cho vào các ống nghiệm tương ứng

Dung dịch albumin (ml) Thuốc thử Bradford (ml)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Ống nghiệm 0 tương ứng với thời gian xuất phát ban đầu là 0 phút và được

dùng làm ống đối chứng.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại, các ống cách nhau 1 phút.

Để yên sau 10 phút (theo thời gian của ống 0), tiến hành đo độ hấp thu của

dung dịch ở bước sóng 595 nm.

Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (μg/ml) với mật độ quang ∆OD.

Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự như trên. Mẫu phải được pha

loãng sao cho trị số mật độ quang nằm trong khoảng của đường chuẩn [16].

b. Tính toán

Dựa vào đồ thị chuẩn, tính được nồng độ protein của mẫu, từ đó suy ra hoạt

tính riêng của chế phẩm enzyme.

Như vậy, hoạt tính của enzyme được tính theo đơn vị quốc tế UI, một UI là

hoạt tính của enzyme xúc tác cho sự chuyển hóa 1 μmol cơ chất sau 1 phút ở điều

kiện thí nghiệm.

Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động còn phải

đánh giá mức độ tinh sạch. Đại lượng đặc trưng cho hoạt độ tinh sạch của chế phẩm

Hoạt tính (UI/g hay UI/ml)

enzyme là hoạt tính riêng. Hoạt tính riêng được tính như sau:

Hoạt tính riêng (UI/mg protein) =

Hàm lượng protein (mg/g hay mg/ml)

(Công thức 4)

2.2.9. Phương pháp trích ly enzyme chitosanase

Canh trường sau nuôi cấy được trộn đều bằng đũa thủy tinh, cân xác định

trọng lượng. Tiến hành chiết với nước cho đến khi dịch chiết cuối cho kết quả âm

tính khi thử hoạt tính với DNS. Cộng tất cả các thể tích nước dùng để chiết enzyme

lại, từ đó suy ra thể tích nước cất cần dùng để chiết enzyme từ canh trường theo tỷ

lệ xác định (canh trường : nước cất = w : ml). Tiến hành lọc và thu dịch lọc. Bảo

quản dịch lọc trong tủ lạnh ở 4oC [5].

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

2.2.10. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý thống kê

2.2.10.1. Bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (CRD:

Completely Randomized Design) 3 lần lặp lại.

2.2.10.2. Xử lý thống kê

Số liệu thu được của các nghiệm thức được phân tích biến lượng đơn yếu tố

(One – way Anova) để đánh giá sự khác biệt giữa chúng và phân nhóm xếp hạng,

thao tác trên phần mềm Microsoft Excel.

2.2.11. Bố trí thí nghiệm

2.2.11.1. Thí nghiệm khảo sát chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp chitosanase cao

a. Thí nghiệm định tính khả năng sinh tổng hợp chitosanase

Tiến hành như các phương pháp đã nêu ở mục 2.2.3 và 2.2.4 để định tính khả

năng sinh tổng hợp chitosanase của các chủng nấm mốc.

b. Thí nghiệm định lượng

Tiến hành nuôi cấy các chủng nấm mốc trên môi trường lên men bán rắn

(mục 2.1.5.4) ở nhiệt độ phòng. Giống được cấy từ các ống thạch nghiêng, 2 ml

huyền phù bào tử cho mỗi bình nuôi cấy. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành trích ly

enzyme, xác định hoạt tính chế phẩm dịch chiết enzyme.

* Kết thúc thí nghiệm này, sẽ chọn được một chủng nấm mốc có khả năng

sinh tổng hợp chitosanase cao nhất. Chủng được chọn sẽ được tiến hành các thí

nghiệm tiếp theo nhằm tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy, để tạo ra điều kiện

nuôi cấy sinh tổng hợp nhiều chitosanase nhất.

2.2.11.2. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất cảm ứng

Tiến hành pha môi trường lên men bán rắn có tỷ lệ giữa các thành phần cơ

bản như Bảng 2.4.:

Bảng 2.4. Các nghiệm thức khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng lên khả năng sinh

tổng hợp Chitosanase (NT: nghiệm thức, 1 – 6: thứ tự nghiệm thức, Chi*: chitosan).

NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Thành phần môi trường

Cám:Trấu:Chi* 80:10:10 70:10:20 60:10:30 50:10:40 40:10:50 30:10:60

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Độ ẩm môi trường được điều chỉnh về 60% bằng dịch khoáng (mục 2.1.5.4.).

Tỷ lệ giống cấy là 2 ml huyền phù bào tử với mật độ bào tử là 4,6. 106 /ml. Sau 24

giờ nuôi cấy, thu chế phẩm, xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của

dịch chiết enzyme.

Từ chỉ số hoạt tính và hàm lượng protein – enzyme text được, chọn ra tỷ lệ

cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase tốt nhất.

2.2.11.3. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ thoáng khí

Độ thoáng khí của môi trường không những đóng vai trò là chất tạo xốp và

giá thể mà còn ảnh hưởng đến độ ẩm môi trường cũng như sự phát triển của nấm.

Trong thí nghiệm này, tiến hành thay đổi nồng độ trấu theo các dãy tuyến tính từ 5 –

20%, cùng với sự thay đổi này sẽ phải đồng thời giảm lượng cám gạo để đảm bảo

khối lượng bình nuôi cấy đạt 100%. Nồng độ chitosan được giữ cố định ở 40%, độ

ẩm môi trường 60%, cấy giống 2 ml dịch huyền phù bào tử mật độ 4,6. 106 bào

tử/ml, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ nuôi cấy thì tiến hành kiểm tra hoạt tính

và hàm lượng protein trong từng nghiệm thức từ đó chọn ra nghiệm thức tốt nhất.

2.2.11.4. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường

Độ ẩm vừa ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, vừa ảnh hưởng đến sự trao đổi

chất của vi sinh vật trong quá trình lên men bán rắn. Trong thí nghiệm này, độ ẩm

được bổ sung và điều chỉnh bằng dịch khoáng để môi trường đạt các độ ẩm: 30%,

40%, 50%, 60% và 70%. Tỷ lệ cơ chất chitosan vừa được tối ưu được giữ cố định

cùng các yếu tố khác. Tỷ lệ giống cấy là 2 ml huyền phù bào tử với mật độ bào tử là

4,6. 106/ml. Sau 24 giờ nuôi cấy, thu chế phẩm, xác định hoạt tính enzyme và hàm

lượng protein của dịch chiết enzyme.

Từ chỉ số hoạt tính và hàm lượng protein – enzyme tìm được, chọn ra độ ẩm

tốt nhất để cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase.

2.2.11.5. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống

Dựa trên kết quả khảo sát tỷ lệ cơ chất cảm ứng và độ ẩm môi trường tối ưu.

Chuẩn bị môi trường với các thông số đã xác định này, tiến hành cấy giống với mật

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

độ bào tử xác định là 4,6. 106 bào tử/ml theo các tỷ lệ khác nhau là: 0,5 ml; 1 ml;

1,5 ml; 2,0 ml; 2,5 ml và 3 ml.

Sau 24 giờ nuôi cấy, thu chế phẩm, xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng

protein của dịch chiết enzyme.

Từ chỉ số hoạt tính và hàm lượng protein – enzyme tìm được, chọn ra tỷ lệ

cấy giống tốt nhất để cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase.

2.2.11.6. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Sau khi đã xác định được các yếu tố môi trường tối ưu, trong thí nghiệm này,

tiến hành nuôi cấy trên hệ môi trường được tối ưu với các mốc thời gian nuôi cấy

khác nhau: 8 giờ, 16 giờ, 24 giờ, 32 giờ, 40 giờ, 48 giờ, 56 giờ, 64 giờ và 72 giờ.

Kết thúc quá trình nuôi cấy theo các mốc thời gian, tiến hành thu chế phẩm,

xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme.

Từ chỉ số hoạt tính và hàm lượng protein – enzyme tìm được, chọn ra thời

gian nuôi cấy tốt nhất để cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase.

2.2.11.7. Nuôi cấy thu enzyme chitosanase

Nuôi cấy chủng nấm mốc được chọn trên môi trường đã tối ưu hóa, tiến hành

thu enzyme, kiểm tra hoạt tính và hàm lượng protein của enzyme thu được.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

3.1. Khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ năm chủng nấm mốc khảo sát

3.1.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp chitosanase

Tiến hành khảo sát khả năng phân giải chitosan trên môi trường định tính

chitosanase theo mục 2.2.11.1 Kết quả thí nghiệm được ghi nhận và trình bày ở

Bảng 3.1.

Bảng 3.1: Đường kính vành khuyên phân giải chitosan theo phương pháp cấy điểm

của các chủng O1, O2, N1, N3, N7.

Chủng Nhận xét chung Đường kính vành khuyên phân giải (mm)

63 ± 0,7 O1

62 ± 0,6 O2

* Nhận xét:

35 ± 1,5 30 ± 0,9 28 ± 0,9 Vành khuyên phân giải to, màu hơi vàng Vành khuyên phân giải to, màu sáng Màu hơi vàng Màu sáng, rõ Màu sáng, rõ N1 N3 N7

- Cả 5 chủng khảo sát đều có khả năng phân giải chitosan, tuy nhiên khả năng

sinh tổng hợp chitosanase không tương đồng.

- Chủng N3 và N7 cho kết quả khảo sát thấp nhất trong cả năm chủng, điều

này chứng tỏ về mặt định tính thì khả năng sinh tổng hợp chitosanase của 2

chủng này là rất thấp.

- Chủng N1 tuy kết quả khảo sát có cao hơn chủng N3 và N7 nhưng sai số

giữa các lần khảo sát tương đối lớn, điều này phần nào cho thấy khả năng phân

giải chitosan của chủng này không ổn định.

- Chủng O1 và O2 là hai chủng có kết quả khảo sát cao nhất trong cả năm

chủng và khả năng sinh tổng hợp của hai chủng này cũng tương đồng nhau

trong các lần thí nghiệm.

- Tóm lại qua kết quả thí nghiệm định tính này có thể sơ bộ nhận thấy được

khả năng sinh tổng hợp của từng chủng, quan trọng nhất là có thể định tính

được chủng có khả năng sinh tổng hợp chitosanase cao trong các chủng khảo

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

sát (chủng O1 và O2). Ngoài ra, kết quả này cũng phần nào là sự đối chiếu cho

kết quả định lượng tiếp theo.

3.1.2. Định lượng khả năng sinh tổng hợp chitosanase

Tiến hành định tính khả năng sinh tổng hợp chitosanase như mục 2.2.11.1, kết quả

thí nghiệm được ghi nhận trong Bảng 3.2:

Bảng 3.2: Bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của các chủng nấm

mốc sau 24 giờ nuôi cấy.

0.18

0.1632

)

0.16

m m

19.17

0.14

( n â h p

0.12

0.1

) g n ờ ư r t h n a c

Hoạt tính (UI/g)

g / I

0.08

y ủ h t g n ò v

(

0.06

h n í k

Bán kính vòng thủy phân (mm)

0.04

h n í t t ạ o H

0.02

g n ờ ư Đ

N1 Chủng

Chủng O1 O2 N1 N3 N7 Đường kính (mm) 17,5 ± 0,5 19,17 ± 0,2887 16,17 ± 0,7637 12,17 ± 1,0408 11,17 ± 1,0408 Hoạt tính enzyme (UI/g) 0,089 ± 0,0277 0,1632 ± 0,0153 0,0545 ± 0,005 0,0317 ± 0,001 0,0199 ± 0,0049

Biểu đồ 3.1: Biểu diễn bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của các

chủng nấm mốc khảo sát sau 24 giờ nuôi cấy.

* Nhận xét: từ Biểu đồ 3.1 có thể dễ dàng nhận thấy chủng O2 là chủng có khả

năng sinh tổng hợp chitosanase cao nhất trong năm chủng khảo sát trên môi trường

lên men bán rắn. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả định tính mục 3.1.1.

Thực tế nuôi cấy trên môi trường bán rắn cũng cho thấy kết quả tương tự vì chủng

O2 phát triển nổi bật so với 4 chủng khác.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Chính vì vậy, chủng O2 sẽ được chọn là đại diện để tiến hành các khảo nghiệm tiếp

theo cho việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy.

3.2. Hình thái đại thể và vi thể của chủng O2

3.2.1. Hình thái đại thể

Kết quả quan sát đại thể chủng O2 được ghi nhận ở Hình 3.1:

Hình 3.1: Hình thái đại thể chủng O2, mặt trên khuẩn lạc trái) và mặt dưới khuẩn

lạc (phải).

* Nhận xét: tốc độ phát triển của chủng O2 trên môi trường PGA tương đối nhanh,

tơ có dạng bông, khi còn non khuẩn lạc có màu trắng, khi tiếp tục phát triển, khuẩn

lạc chuyển thành vàng hoa cau, đây là màu của bào tử đính. Màu khuẩn lạc sẽ tiếp

tục xanh lên và sẽ đậm hơn khi bào tử già đi. Mặt sau khuẩn lạc không chuyển màu,

điều này chứng tỏ chủng O2 không tiết sắc tố vào môi trường.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

3.2.2. Hình thái vi thể

Hình 3.2: Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi chưa nhuộm -

ảnh được quan sát và ghi nhận ở vật kính 40.

Hình 3.3: Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi nhuộm

Methylene Blue - ảnh được quan sát và ghi nhận ở vật kính 40.

* Nhận xét: khuẩn ty chủng O2 không màu, phân nhánh rất nhiều, có vách ngăn rõ

rệt chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào), cuống bào tử rẽ nhánh từ các sợi

khuẩn ty và mọc thẳng đứng. Đầu cuống bào tử phân thành nhiều sợi mọc tròn đều

khắp cả cuống, đầu các sợi này có nhiều bào tử hình tròn đính vào nhau như sợi

chuỗi (bào tử đính).

3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Trong thí nghiệm này, tiến hành như trình tự đã nêu trong mục 2.2.11.2, kết quả

được ghi nhận trong Bảng 3.3 và biểu diễn dưới dạng đồ thị (Đồ thị 3.2):

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase.

Hoạt tính enzyme (UI/g) STT

0.3

0.2458

0.25

0.1949

0.2

0.1636

) g n ờ ư r t h n a c

0.1436

0.1393

0.15

g / I

(

Hoạt tính (UI/g)

0.1

0.0594

h n í t t ạ o H

0.05

80:10:10

60:10:30

50:10:40

30:10:60

70:10:20 40:10:50 Tỷ lệ (cám : trấu : chitosan / w : w : w)

Tỷ lệ cơ chất (Cám : Trấu : Chitosan) 80 : 10 : 10 70 : 10 : 20 60 : 10 : 30 50 : 10 : 40 40 : 10 : 50 30 : 10 : 60 0,1436 ± 0,001 0,1636 ± 0,0088 0,1949 ± 0,0196 0,2458 ± 0,0132 0,1393 ± 0,0047 0,0594 ± 0,0170 1 2 3 4 5 6

Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase.

* Nhận xét: từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến khả năng sinh

tổng hợp chitosanase (Bảng 3.3) và Biểu đồ 3.2 dễ dàng nhận thấy tỷ lệ cám gạo :

trấu : chitosan tương đương 50 : 10 : 40 theo khối lượng là nghiệm thức cho kết quả

khảo sát hoạt tính chitosanase cao nhất. Điều này có nghĩa ở nồng độ tỷ lệ cám :

trấu : chitosan = 50 : 10 : 40 là tỷ lệ cơ chất thích hợp để sinh tổng hợp nhiều

chitosanase nhất trong các tỷ lệ thí nghiệm, hoạt tính đạt cao nhất trung bình là

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

0,3342 (UI/g canh trường). Nếu tiếp tục tăng nồng độ chitosan lên thì hoạt tính

enzyme theo kết quả thể hiện là giảm đi rất đáng kể. Trên thực tế khi quan sát khách

quan về khả năng mọc của nấm giữa các nghiệm thức thì ở các nồng độ 50% và

60% mật độ nấm mọc tương đối thưa, điều này chứng tỏ ở các nồng độ này nấm có

thể bị ức chế và làm chậm quá trình nẩy chồi của bào tử cũng như khả năng lan tơ.

Mặt khác, vì trong thí nghiệm này mục đích quan trọng là tìm ra mối tương quan

giữa nồng độ cám gạo và chitosan, cho nên khi tăng nồng độ chitosan lên thì cũng

đồng nghĩa với việc phải giảm nồng độ cám gạo. Cám gạo là nguồn dinh dưỡng ban

đầu rất quan trọng, nó có tác dụng làm cho nấm thích nghi tốt trong môi trường lên

men khi chuyển từ môi trường nhân giống vào môi trường lên men. Việc giảm nồng

độ cám gạo xuống cũng đồng nghĩa với việc làm cho pha thích nghi của nấm trở

nên dài hơn. Đây cũng là một nguyên nhân có thể làm chậm sự phát triển của nấm

trong môi trường có nồng độ chitosan cao và ít cám gạo. Tuy nhiên, nếu chỉ hoạt

tính enzyme cao thôi thì vẫn chưa đủ căn cứ để kết luận. Bản chất của enzyme chính

là protein, vì vậy hàm lượng protein trong dịch enzyme thu được cũng là một phần

của điều kiện cần xét để có thể đưa ra kết luận chính xác.

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng protein

STT Hàm lượng Protein (mg/g)

1 2 3 4 5 6 Tỷ lệ cơ chất (Cám : Trấu : Chitosan) 80 : 10 : 10 70 : 10 : 20 60 : 10 : 30 50 : 10 : 40 40 : 10 : 50 30 : 10 : 60 0,0194 ± 0,0187 0,0503 ± 0,0146 0,0909 ± 0,0470 0,1214 ± 0,0152 0,0690 ± 0,0152 0,021 ± 0,0119

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

0.14

0.1214

0.12

) g / g m

0.0909

(

0.1

0.08

0.069

0.0503

0.06

Hàm lượng Protein (mg/g)

n i e t o r P g n ợ ư l

0.04

0.021

0.0194

m à H

0.02

80:10:10 70:10:20 60:10:30 50:10:40 40:10:50 30:10:60 Tỷ lệ (cám : trấu : chitosan / w : w : w)

Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng protein.

Từ hàm lượng protein ghi nhận được trong thí nghiệm, tiến hành dựng đồ thị

(Đồ thị 3.1) biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng

protein. Đồ thị thể hiện sự tuyến tính tăng dần của hàm lượng protein theo nồng độ

cơ chất cảm ứng sử dụng trong môi trường. Hàm lượng protein tăng dần ở các

nghiệm thức 10 – 40% chitosan, nhưng nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất cảm ứng

trong môi trường thì hàm lượng protein giảm đi rất nhanh chóng và hàm lượng

protein đạt được cao nhất là ở nghiệm thức sử dụng 40% chitosan, với hàm lượng

trung bình khảo sát được là 0,1214 (mg/g). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết

quả kiểm tra hoạt tính. Như vậy, có thể chính thức khẳng định ở tỷ lệ cơ chất cám

gạo : trấu : chitosan = 50 : 10 : 40 (tính theo phần trăm khối lượng) là tỷ lệ cơ chất

thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp chitosanase đối với chủng O2.

Chính vì những nguyên nhân trên và sự đánh giá khách quan từ kết quả thu

được, tỷ lệ cám gạo : trấu : chitosan = 50 : 10 : 40 (tính theo phần trăm khối lượng)

sẽ được chọn làm điểm tối ưu về mặt cơ chất và sẽ được cố định để khảo sát các

điều kiện nuôi cấy tiếp theo.

3.4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase

Tiến hành thí nghiệm như đã nêu ở mục 2.2.11.3, các kết quả được ghi nhận trong

Bảng 3.5 và 3.6.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase.

STT Hoạt tính enzyme (UI/g)

0.3

0.2692

0.2555

0.25

0.2

0.154

) g n ờ ư r t h n a c

0.15

g / I

0.12

(

Hoạt tính (UI/g)

0.1

0.05

h n í t t ạ o H

55:05:40

50:10:40

45:15:40

40:20:40

Tỷ lệ (cám : trấu : chitosan ) (%)

1 2 3 4 Tỷ lệ cơ chất (Cám : Trấu : Chitosan) 55 : 5 : 40 50 : 10 : 40 45 : 15 : 40 40 : 20 : 40 0,154 ± 0,0133 0,2555 ± 0,001 0,2692 ± 0,0130 0,1200 ± 0,0172

Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase.

* Nhận xét: từ Biểu đồ 3.3 dễ dàng nhận thấy hoạt tính chitosanase tăng dần ở các

nghiệm thức sử dụng trấu 5%, 10% và 15% và cao nhất là ở 15% với hoạt tính là

0,2692 (UI/g). Nhưng nếu tiếp tục tăng nồng độ trấu sử dụng trong môi trường lên

thì kết quả cho thấy hoạt tính enzyme giảm đi rõ rệt. Nồng độ chitosan là thành

phần đã được cố định khi tiến hành tối ưu cơ chất cảm ứng, vì vậy khi tăng nồng độ

trấu thì cũng đồng nghĩa với việc giảm đi nồng độ cám gạo sử dụng trong môi

trường, điều này sẽ gây bất lợi cho pha thích nghi của nấm. Ngoài ra, trấu là cơ chất

có cấu trúc khó phân giải vì trong thành phần chứa nhiều lignin (20 – 30%), cùng

với đặc tính giữ nước kém và ít biến đổi khi tiệt trùng môi trường, trấu gần như là

cơ chất trơ trong môi trường và chỉ được sử dụng để tạo độ xốp cũng như là giá thể

cùng với cám gạo và chitosan để nấm cố định và phát triển. Vì vậy, khi sử dụng

lượng trấu lớn thì khả năng đồng nhất cơ chất trong môi trường sẽ giảm do khó tạo

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

thành hệ giá thể cám – trấu – chitosan để nấm phát triển và sinh tổng hợp tốt

chitosanase. Mặt khác, nếu lượng trấu quá nhiều sẽ tạo nên những khoảng không rất

lớn trong khối môi trường, điều này sẽ làm cho môi trường rất dễ bị mất đi độ ẩm

cần thiết cho sự phát triển của nấm. Như vậy, từ kết quả kiểm tra hoạt tính thu được

đã có thể cơ bản xác định được nồng độ trấu sử dụng trong môi trường thích hợp

cho sự sinh tổng hợp chitosanase đối với chủng O2 là 15%.

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hàm lượng protein.

STT Hàm lượng Protein (mg/g)

0.14

0.1274

0.1181

0.12

) g / g m

0.1

(

0.0842

0.0809

0.08

0.06

Hàm lượng Protein (mg/g)

n i e t o r P g n ợ ư l

0.04

m à H

0.02

55:05:40

50:10:40

45:15:40

40:20:40

Tỷ lệ (cám gạo : trấu : chitosan) (%)

1 2 3 4 Tỷ lệ cơ chất (Cám : Trấu : Chitosan) 55 : 5 : 40 50 : 10 : 40 45 : 15 : 40 40 : 20 : 40 0,0842 ± 0,0148 0,1181 ± 0,0089 0,1274 ± 0,0158 0,0809 ± 0,0174

Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hàm lượng protein.

Kết quả hàm lượng protein thu được cũng cho thấy mức độ ảnh hưởng của độ

thoáng khí môi trường đến hàm lượng protein. Từ Đồ thị 3.2 có thể thấy được ở các

nồng độ trấu sử dụng 10% và 15% là độ thoáng khí thích hợp nhất để tạo ra hàm

lượng protein – enzyme cao trong canh trường nuôi cấy. Điều này hoàn toàn phù

hợp với kết quả hoạt tính chitosanase khảo sát được từ các nghiệm thức tương ứng.

Tóm lại, trong thí nghiệm này, trấu được sử dụng ở cả nồng độ 10% và 15%

đều cho kết quả hoạt tính là tương đối như nhau. Tuy nhiên, nếu sử dụng trấu với

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

nồng độ 15% sẽ gia giảm được giá thành của nguyên liệu do trấu rẻ hơn cám gạo rất

nhiều, ngoài ra dựa trên kết quả khách quan từ thí nghiệm thì hoạt tính và hàm

lượng protein khi sử dụng trấu 15% cao hơn ở 10%, vì vậy nồng độ trấu 15% sẽ

được chọn làm điều kiện tối ưu để thực hiện các thí nghiệm tối ưu tiếp theo.

3.5. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase

Tiến hành thí nghiệm như đã nêu ở mục 2.2.11.4, các kết quả được ghi nhận

trong Bảng 3.7 và 3.8.

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase.

STT Độ ẩm (%) Hoạt tính enzyme (UI/g)

0.275

0.3

0.25

) g / I

0.2

(

0.1428

0.1408

0.15

Hoạt tính (UI/g)

0.1

0.0709

h n í t t ạ o H

0.0266

0.05

30%

40%

60%

70%

50% Độ ẩm (%)

30 40 50 60 70 0,0266 ± 0,0140 0,0709 ± 0,0156 0,1408 ± 0,0103 0,2750 ± 0,0229 0,1428 ± 0,0357 Hàm lượng Protein (mg/g) 0,0514 ± 0,0090 0,081 ± 0,0061 0,1011 ± 0,0091 0,1642 ± 0,0121 0,1348 ± 0,0355 1 2 3 4 5

Biểu đồ 3.6: Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase.

* Nhận xét: đối với lên men bán rắn, độ ẩm môi trường là một nhân tố quyết định

then chốt đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm. Từ Biểu đồ 3.4 có thể dễ

dàng nhận thấy được điều này. Ở các thang độ ẩm 30% và 40% về thực tế nuôi cấy

và quan sát mức độ mọc của nấm có thể nhận thấy rằng ở các độ ẩm này nấm mọc

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

rất chậm và thưa trên toàn khối môi trường, khối môi trường do có độ ẩm kém vì

vậy khó tạo được hệ giá thể để nấm mọc và phát triển, ngoài ra chính sự rời rạc

trong toàn khối môi trường làm cho môi trường rất dễ bị mất đi độ ẩm trong quá

trình lên men, vì vậy kết quả thử hoạt tính trên hai thang độ ẩm này cho kết quả

thấp do nấm phát triển kém ở các độ ẩm này. Ở các thang độ ẩm 50% và 60%, khả

năng mọc của nấm tăng dần và tốt nhất là ở độ ẩm 60%, với hoạt tính kiểm tra được

là 0,275 (UI/g). Điều này chứng tỏ độ ẩm 60% là ẩm độ thích hợp cho sự phát triển

và sinh tổng hợp chitosanase của chủng O2. Nếu tăng độ ẩm lên 70% thì khả năng

mọc của nấm chỉ có thể phát triển được trên bề mặt môi trường khoảng 1/3 bề sâu

môi trường và xung quanh thành bình nuôi cấy, điều này chứng tỏ ở độ ẩm 70%,

khối môi trường bị kết khối lại ở phần giữa và phần tiếp xúc với đáy bình do độ ẩm

quá lớn vì vậy sẽ làm cho những khu vực này rất ít hoặc thậm chí là không còn

không khí để nấm có thể phát triển (do nấm mốc là loài hiếu khí). Chính vì vậy khả

năng phát triển trên môi trường có độ ẩm 70% của chủng O2 sẽ bị hạn chế, cho nên

gây ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp chitosanase.

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein.

STT Độ ẩm (%) Hàm lượng Protein (mg/g)

1 30 0,0514 ± 0,0090

2 40 0,081 ± 0,0061

3 50 0,1011 ± 0,0091

4 60 0,1642 ± 0,0121

5 70 0,1348 ± 0,0355

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

0.1642

0.1348

) g / g m

(

0.1011

0.081

0.0514

Hàm lượng Protein (mg/g)

n i e t o r P g n ợ ư l

m à H

0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0

30%

40%

50%

60%

70%

Độ ẩm (%)

Biểu đồ 3.7: Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein.

Từ kết quả kiểm tra hàm lượng protein trên các nghiệm thức tương ứng, rất dễ nhận

thấy hàm lượng protein cũng phụ thuộc rất nhiều vào độ ẩm môi trường. Hàm lượng

protein thu được trên các nghiệm thức có độ ẩm 30% và 40% là rất thấp, thậm chí

cũng không có sự biến động rõ rệt giữa 2 nghiệm thức này (trung bình dao động

khoảng 0,03 đơn vị hàm lượng protein). Tuy nhiên, bắt đầu từ độ ẩm 50 – 60% thì

hàm lượng protein gia tăng rất đáng kể và đạt cao nhất là ở độ ẩm môi trường đạt

60%, với hàm lượng protein kiểm tra trung bình là 0,1642 (mg/g) và cũng có xu

hướng giảm đi nếu như tiếp tục tăng độ ẩm môi trường lên. Như vậy, cả hoạt tính

chitosanase và hàm lượng protein đều chịu sự tác động ảnh hưởng từ độ ẩm môi

trường, chúng đều có xu hướng giảm đi nếu độ ẩm trong môi trường quá cao hay

quá thấp. Mỗi vi sinh vật đều có một giới hạn hàm ẩm nhất định, nếu như hàm ẩm

này quá cao hay quá thấp thì cũng đều gây tác động trực tiếp lên sự phát triển của

chúng. Nấm mốc tuy là vi sinh vật có thể được xếp vào nhóm có sức sống mảnh liệt

dựa vào khả năng phân giải được nhiều nguồn cacbon khác nhau, có thể sinh trưởng

rất nhanh chóng và đặc biệt là khả năng sinh trưởng được trên những cơ chất có

hàm ẩm rất cao. Điều này cũng có thể dễ nhận thấy trong lúc thực nghiệm tiến hành

quan sát khả năng mọc của nấm trên khối môi trường. Ở ẩm độ 70%, nấm mốc có

thể được đánh giá là có khả năng mọc tốt và tốc độ lan tơ cũng tương đối nhanh, tuy

nhiên nấm chỉ có thể mọc trên bề mặt cơ chất môi trường chứ không thể mọc lan

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

khắp khối môi trường như ở nghiệm thức có độ ẩm 60%. Như vậy, tuy nấm có khả

năng mọc tốt trên môi trường có độ ẩm 70% nhưng lại không thể mọc trên khắp

khối môi trường, chính vì vậy nếu xét trên toàn thể thì khả năng sinh trưởng của

nấm ở độ ẩm 70% là tương đối tốt nhưng về mặt hiệu suất sử dụng cơ chất thì lại

thấp hơn rất nhiều nếu so với khi mọc trên môi trường có độ ẩm 60%. Diện tích tiếp

xúc của nấm mốc với môi trường càng nhiều bao nhiêu thì hiệu suất thủy phân cơ

chất càng nhiều bấy nhiêu, điều này có nghĩa là khả năng sinh tổng hợp chitosanase

cũng như hàm lượng protein sẽ tăng lên theo hiệu suất sử dụng cơ chất.

Vì những nguyên nhân đã nêu và kết quả khách quan thu được, độ ẩm môi

trường 60% là độ ẩm được chọn làm ẩm độ thích hợp cho sự phát triển và sinh tổng

hợp đối với chủng O2.

3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase

Tiến hành thí nghiệm như đã nêu ở mục 2.2.11.5, các kết quả được ghi nhận

trong Bảng 3.9 và 3.10.

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase.

Hàm lượng Protein STT Tỷ lệ cấy giống (ml) Hoạt tính enzyme (UI/g) (mg/g)

1 0,5 0,1158 ± 0,0133 0,0937 ± 0,0118

2 1 0,1521 ± 0,0133 0,1238 ± 0,0120

3 1,5 0,1949 ± 0,0196 0,1527 ± 0,0328

4 2 0,2772 ± 0,0129 0,1638 ± 0,0120

5 2,5 0,2673 ± 0,0173 0,1725 ± 0,0147

6 3 0,2124 ± 0,0211 0,1745 ± 0,0116

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

0.3

0.2772

0.2673

0.25

0.2124

0.1949

0.2

0.1521

) g n ờ ư r t h n a c

0.15

g / I

0.1158

(

Hoạt tính (UI/g)

0.1

0.05

h n í t t ạ o H

0.5

1.5

2.5

Thể tích giống (ml)

Biểu đồ 3.8: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase.

* Nhận xét: chất lượng giống là yếu tố không thể thiếu cho quá trình sinh tổng hợp

chitosanase, tuy nhiên tỷ lệ giống tiếp vào môi trường cũng có ảnh hưởng không

kém phần quan trọng vì nếu nhiều hay ít quá thì cũng đều gây ảnh hưởng đến quá

trình sinh tổng hợp chitosanase. Điều này dễ dàng nhận thấy khi nhìn vào kết quả

thực nghiệm được biểu diễn trong Biểu đồ 3.5. Có thể dễ dàng nhận thấy hoạt tính

enzyme cho thấy sự tăng dần khi tăng tỷ lệ tiếp giống từ 0,5 – 2 ml và cho kết quả

cao nhất ở tỷ lệ tiếp giống 2 ml với hoạt tính là 0,2772 (UI/g). Tuy nhiên, nếu tiếp

tục tăng tỷ lệ cấy giống vào môi trường thì hoạt tính enzyme có hiện tượng giảm

dần theo tỷ lệ cấy giống. Trong sinh giới luôn tồn tại các mối quan hệ tương hỗ và

cạnh tranh khác loài hay cùng loài, trường hợp này nấm mốc cũng không ngoại lệ.

Khi nguồn cơ chất trong môi trường đủ để cả quần thể sử dụng thì quá trình sinh

tổng hợp chitosanase sẽ diễn ra rất tốt, nhưng nếu nguồn dinh dưỡng trở nên cạn

kiệt thì sẽ xảy ra hiện tượng ức chế cạnh tranh để tranh giành nguồn dinh dưỡng. Do

tỷ lệ cấy giống quá nhiều làm cho mật độ bào tử trong môi trường trở nên quá tải vì

vậy để thuận lợi cho sự phát triển, từng cá thể sẽ phải cạnh tranh nguồn dinh dưỡng,

chính việc này làm cho quá trình sinh tổng hợp chitosanase bị giảm đi. Mặt khác, do

mật độ bào tử nhiều sẽ sinh ra nhiều nhiệt trong quá trình lên men, điều này cũng sẽ

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

làm giảm nhanh độ ẩm môi trường và gây ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp

chitosanase.

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein.

STT Tỷ lệ cấy giống (ml) Hoạt tính enzyme (UI/g)

0.1747

0.1725

0.1638

0.1527

) g / g m

(

0.1238

0.0937

Hàm lượng Protein (mg/g)

n i e t o r P g n ợ ư l

m à H

0.2 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0

0.5

1.5

2.5

Tỷ lệ cấy giống (ml)

0,5 1 1,5 2 2,5 3 0,1158 ± 0,0133 0,1521 ± 0,0133 0,1949 ± 0,0196 0,2772 ± 0,0129 0,2673 ± 0,0173 0,2124 ± 0,0211 Hàm lượng Protein (mg/g) 0,0937 ± 0,0118 0,1238 ± 0,0120 0,1527 ± 0,0328 0,1638 ± 0,0120 0,1725 ± 0,0147 0,1745 ± 0,0116 1 2 3 4 5 6

Biểu đồ 3.9: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein.

Từ Đồ thị 3.4 biểu diễn mức độ ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng

protein, có thể sơ bộ nhận thấy hàm lượng protein cũng tuyến tính tăng theo tỷ lệ

cấy giống từ 0,5 – 1,5 ml với tốc độ tăng trung bình là 0,03 đơn vị hàm lượng. Bắt

đầu từ tỷ lệ cấy giống 2 – 3 ml thì hàm lượng protein cũng cho thấy biểu hiện tăng

lên, tuy nhiên đơn vị tăng lên là không đáng kể. Phân tích độ chênh lệch đơn vị hàm

lượng protein giữa tỷ lệ cấy giống 2 ml và tỷ lệ cấy giống 2,5 ml thì hai đơn vị hàm

lượng này chỉ hơn kém nhau trung bình khoảng 0,0085 đơn vị hàm lượng protein,

còn so sánh giữa tỷ lệ cấy giống 2,5 ml với tỷ lệ cấy giống 3 ml thì gần như đơn vị

hàm lượng tăng là không đáng kể chỉ vào khoảng 0,0022 đơn vị hàm lượng protein.

Điều này có thể được lý giải do việc sử dụng tỷ lệ giống càng cao thì nội tại trong

quần thể nấm lúc này xuất hiện sự ức chế lẫn nhau, chính việc này làm chậm lại quá

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

trình phát triển của từng đơn vị khuẩn lạc, do vậy sẽ làm giảm đi diện tích tiếp xúc

của nấm với môi trường, hệ quả kéo theo là làm giảm hiệu suất thủy phân cơ chất

cảm ứng cho nên cũng sẽ làm giảm đi quá trình sinh tổng hợp chitosanase, tuy

nhiên đồ thị vẫn cho thấy mức độ tăng lên của hàm lượng protein. Điều này có thể

giải thích là vì trong hàm lượng protein kiểm tra được, ngoài protein – enzyme còn

có cả những thành phần protein phi enzyme.

Kết thúc thí nghiệm này, tỷ lệ cấy giống 2 ml là tỷ lệ được chọn làm điều kiện

tối ưu cho sự sinh tổng hợp chitosanase đối với chủng O2 và tỷ lệ này sẽ được cố

định cùng với các yếu tố đã tối ưu khác trong thí nghiệm kiểm tra ảnh hưởng của

thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase.

3.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase

Tiến hành thí nghiệm như đã nêu ở mục 2.2.11.6, các kết quả được ghi nhận

trong Bảng 3.11 và 3.12.

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase.

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Thời gian (giờ) 8 16 24 32 40 48 56 64 72 Hoạt tính enzyme (UI/g) 0,0492 ± 0,005 0,0861 ± 0,0087 0,2866 ± 0,0102 0,6001 ± 0,02239 1,1132 ± 0,0242 0,6172 ± 0,0167 0,2178 ± 0,0221 0,1688 ± 0,0172 0,1319 ± 0,0166

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

1.1132

1.2

0.8

0.6172

0.6001

) g n ờ ư r t h n a c

0.6

g / I

(

0.4

0.2866

0.2178

0.1688

0.1319

0.2

0.0861

0.0492

h n í t t ạ o H

40 Thời gian (giờ)

Biểu đồ 3.10: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase.

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein.

STT Thời gian (giờ) Hàm lượng Protein (mg/g)

8 16 24 32 40 48 56 64 72 0,0039 ± 0,0034 0,0213 ± 0,0034 0,1604 ± 0,0091 0,1599 ± 0,0120 0,1743 ± 0,0145 0,1843 ± 0,0088 0,1167 ± 0,0087 0,056 ± 0,0148 0,0463 ± 0,0064 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

0.2

0.1843

0.1743

0.18

0.1599

0.1604

0.16

) g / g m

0.14

(

0.1167

0.12

0.1

0.08

0.056

n i e t o r P g n ợ ư l

0.06

0.0463

0.04

m à H

0.0213

0.02

0.0039

40 Thời gian (giờ)

Đồ thị 3.11: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein.

* Nhận xét: quá trình sinh trưởng của nấm mốc có mối quan hệ mật thiết với quá

trình sinh tổng hợp sinh chất trong môi trường, vì vậy việc xác nhận thời điểm thu

nhận sinh chất là điều rất quan trọng. Trong thí nghiệm này, từ đường đồ thị biểu

diễn hàm lượng protein có thể nhận thấy mối tương quan giữa hàm lượng protein

sinh ra và động học tăng trưởng của chủng O2. Đồ thị này thể hiện rõ quá trình phát

triển của nấm trên môi trường theo các pha: thời gian từ 0 – 16 giờ là pha thích

nghi, 16 – 24 giờ là pha tăng trưởng, 32 – 48 giờ là pha ổn định và cuối cùng là pha

suy tàn sau 48 giờ. Kết quả cho thấy hoạt tính enzyme thu được cao nhất là 1,1132

(UI/g) khi lên men được 40 giờ, kết quả này hoàn toàn phù hợp với động học tăng

trưởng của chủng O2. Thực tế quan sát mật độ phủ của nấm trên cơ chất và màu sắc

của bào tử cũng cho thấy sự tương thích với kết quả thu được. Trong khoảng thời

gian từ 8 – 16 giờ, bào tử đã bắt đầu nẩy mầm, khối cơ chất xuất hiện những đốm tơ

trắng nhỏ đầy khắp môi trường. Từ 16 – 32 giờ là khoảng thời gian tơ trắng lan đầy

khắp khối cơ chất môi trường. Thời gian từ 32 giờ lên men là thời gian nấm mốc bắt

đầu sinh bào tử, một số điểm trên môi trường xuất hiện những đốm nhỏ hơi vàng do

cuống bào tử đính bắt đầu tạo bào tử. Đến 40 giờ lên men là thời điểm mốc ra bào

tử đều khắp khối môi trường, bào tử lúc này có màu vàng hoa cau, kể từ thời điểm

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

này trở đi, bào tử sẽ tiếp tục chuyển màu do quá trình già đi, bào tử chuyển thành

màu xanh lục khi tiếp tục lên men đến 48 giờ và sẽ rõ hơn khi tiếp tục lên men.

Đối với các quá trình lên men tổng hợp sinh chất từ nấm mốc Aspergillus oryzae

như protease, amylase, pectinase… thì thời điểm thu nhận tốt nhất là thời điểm mà

mốc chớm tạo bào tử vàng hoa cau đều khắp môi trường. Điều này càng cho thấy

thời gian lên men 40 giờ để thu nhận chitosanase đối với chủng O2 là hoàn toàn phù

hợp.

3.8. Kết quả lên men bán rắn thu nhận enzyme

Trên cơ sở của các kết quả thu được, các điều kiện tối ưu để lên men bán rắn

thu nhận chitosanase đối với chủng Asp. oryzae – 2 được tổng hợp ở Bảng 3.8.

Bảng 3.13: Điều kiện tối ưu lên men bán rắn thu nhận chitosanase với chủng O2.

Nồng độ cơ chất cảm ứng – chitosan (%) 40

Độ thoáng khí – trấu (%) 15

Độ ẩm (%) 60

Thời gian nuôi cấy (giờ) 40

Tỷ lệ cấy giống (ml) 2

Mật độ bào tử 4,6 . 106/ml dịch huyền phù bào tử.

Tiến hành nuôi cấy với các điều kiện đã tối ưu, sau thời gian nuôi cấy tiến

hành trích ly enzyme, ly tâm thu phần dịch trong chứa protein – enzyme và xác định

hoạt tính cùng với hàm lượng protein có trong dịch.

Dịch enzyme thu được có hoạt tính trung bình là 1,11 (UI/g) và hàm lượng

protein là 0,17 (mg/g), hoạt độ riêng là 6,5294 (UI/mg protein).

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

4.1. Kết luận

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, người thực hiện đề tài đi đến một số

kết luận:

1. Chủng giống nấm Aspergillus oryzae – 2 tơ có dạng bông, khi còn non khuẩn

lạc có màu trắng, khi tiếp tục phát triển, khuẩn lạc chuyển thành vàng hoa

cau. Khuẩn lạc mọc lan đều trên khắp mặt thạch theo hình tròn và không tiết

sắc tố vào môi trường.

2. Chủng giống nấm Aspergillus oryzae – 2 nghiên cứu có khả năng sinh tổng

hợp chitosanase có hoạt tính 0,1632 (UI/g).

3. Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho mẫu giống nấm Aspergillus oryzae – 2 là tỷ lệ

cám gạo : trấu : chitosan = 45 : 15 : 40 (tính theo % khối lượng), độ ẩm 60%,

tỷ lệ cấy giống là 2 ml dịch huyền phù bào tử có mật độ 4,6. 106 bào tử/ml,

thời gian lên men là 40 giờ tính từ thời điểm bắt đầu cấy giống. Với điều

kiện nuôi cấy này, thì enzyme thu được có hoạt tính trung bình là 1,11

(UI/g).

4.2. Kiến nghị

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn, người thực hiện đề tài chỉ mới có thể đạt được

một số kết quả như trên. Vì vậy, người thực hiện đề tài xin được đề nghị cần nghiên

cứu thêm một số vấn đề sau:

1. Thực hiện tủa phân đoạn enzyme thu được khi tiến hành nuôi cấy trên điều

kiện tối ưu như đã nêu bằng các loại dung môi tủa khác nhau nhằm chọn ra

được phân xuất tủa tối ưu với từng dung môi và chọn ra được dung môi ưu

việt.

2. Cần tiến hành nghiên cứu việc cải thiện giống nhằm tăng cao khả năng sinh

tổng hợp chitosanase.

3. Xác định các điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme chitosanase hoạt động

như: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng, pH thích hợp cho phản ứng, tỷ lệ

enzyme – cơ chất…

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Tài Liệu Tham Khảo

Tài Liệu Tiếng Việt

[1]. Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền và các cộng sự (1997), Vật liệu sinh

học từ chitin, Viện Hóa học – Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm Khoa học

và Công nghệ Quốc gia Hà Nội.

[2]. Trần Cảnh Đình, Nguyễn Lan Anh, Vũ Thị Quyên (2012), Nghiên cứu tuyển

chọn chủng giống vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitosanase để sản xuất

glucosamine, Bản tin Viện nghiên cứu hải sản – Bộ Nông nghiệp và phát triển

Nông thôn, số 23 (1/2012).

[3]. Đinh Minh Hiệp (2001), Nghiên cứu các đặc tính của enzyme chitinase thu

nhận từ nấm mật Coprinus fimentarius và một số ứng dụng, Luận văn thạc sĩ

sinh học, Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh – Trường Đại học Khoa

Học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh.

[4]. Châu Văn Minh (1996), Sử dụng chitosan làm chất bảo quản quả tươi, Tạp chí

Khoa học, 4, 34.

[5]. Trần Thạnh Phong (2004), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

từ Tricoderma reesei và Aspergilllus niger trên môi trường lên men bán rắn,

Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên –

Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.

[6]. Đỗ Hữu Phước (2004), Đặc san khoa học kỹ thuật chăn nuôi, số 4.

[7]. Bùi Thanh Trung (2011), Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm và ứng dụng làm

màng bảo quản cà chua, Đồ án tốt nghiệp, Trường đại học Kỹ Thuật Công

Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh.

[8]. Đỗ Anh Tuấn (2004), Nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên cấu trúc phân tử

enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus circulans MH – K1, Luận văn thạc sĩ

sinh học, Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh – Trường Đại học Khoa

Học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh.

[9]. Lâm Ngọc Tuyết (2004), Biểu hiện và xác định một số đặc tính của chitosanase

tái tổ hợp từ vi khuẩn Bacillus circulans MH – K1, Luận văn thạc sĩ sinh học,

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh – Đại học Khoa Học Tự Nhiên,

Thành phố Hồ Chí Minh.

Tài liệu tiếng Anh

[10]. Akikazu Ando, Kayo N., Miyoko Y., Hirofumi S., Yasuo K., Hajime H.,

Minuro Y., Takaaki F. (1992), Primary structure of chitosanase produced by

Bacillus circulans MH – K1, J. Gen. Appl. Microbiol, 38, 135 – 144.

[11]. Akira Ohtakara, Masato I., Masaru M. (1988), Action of microbiol chitinase

on chitosan with different degrees of deacetylation, Agric. Biol. Chem., 52

(12), 3181 – 3182.

[12]. Alonso M. J., Sanchez A. (2003), The potential of chitosan in ocular drug

delivery, J. Pharm Pharmacol., 55 (11), 145 – 163.

[13]. Aruchami M., Gowri N., Sundara – Rajuhu G. (1986), Chitin in nature and

technology, Edited by R. A. A. Muzzarelli, C. Jeuniaux, G. W. Gooday,

Plenum Press, Newyork, 263 – 265.

[14]. Boucher I., Dupuy A., Vidal P., Neugebauer W. A and Brzezinski R. (1992),

Purification and characterization of chitosanase from Streptomyces N. 174,

App. Microbiol. Biotechnol, 38, 188 – 193.

[15]. Chen A. S., Taguchi T., Sakai K., Kikuchi K., Wang M. W., Miwa I. (2003),

Antioxidant activities of chitobiose and chitotriose, Biol Pharm Bull., 26 (9),

13, 26 – 30.

[16]. Chitosanase assay (1986), Chiang Mai University, Thailand.

[17]. Cuero R. G., Osuji G. (1991), Chitosanase bioinduction by two strains of

Bacillus sp. and chitosan in peanut: an effective biocontrol of pathogenic and

toxigenic fungi, Meded. Fac. Landbouwwet, Rijksuniv Gent., 56, 1415 – 1425.

[18]. Daris B., Eveleigh D. E. (1984), Chitosanase: occurrence, production and

immobilization in chitin chitosan and related enzyme, ed. J. D. ZiKakis,

Academic Press, FL, 164 – 179.

[19]. Domard A., Rinaudo M (1984), Gel permeation chromatography of cationic

polymer on cationic porous silicagels, Polym. Commun., 25, 55 – 58.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

[20]. Domardd A., Cartier N. (1989), Glucosamin oligomers: Reparation and

characterization, Int. J. Biol. Macromol., 11, 297 – 302.

[21]. Dumas – Gaudot E., Grenier J., Furlan V., and Asselin A. (1992), Chitinase,

Chitosan and β – 1,3 glucanase activities in Allium and Pisum roots colonized

by Glomus species, Plant Sci, 84, 17 – 24.

[22]. Edward M. M., Arthur F. M., Stephen R. E., Ryszard N., Jon D. R. (1996), X –

ray structure of anti – fungal chitosanase from Streptomyces N. 174, Nature

Structure Biology, 3 (2), 155 – 162.

[23]. El Quaktaoui S., Asselin A. (1992), Diversity of chitosanase activity in

cucumber, Plant Science, 85, 33 – 41.

[24]. Fenton D. M., Everleigh D. E. (1981), Purification and mode of action of a

chitosanase from Penicillium islandicum, J. Gen. Microbiol., 126, 151 – 165.

[25]. Fukamizo T., Ohkawa T., Tkeda Y., Goto S. (1994), Specificity of chitosanase

from Bacillus pumilus, Biochem. Biophys: Acta, 1205, 183 – 188.

[26]. Grenier J., Benhamous N., Asselin A. (1991), Colloidal gold – complexed

chitosanase a new probe for ultra structure localization of chitosan in fungi, J.

Gen. Microbiol., 137, 2007 – 2010.

[27]. Hedges A. R., Wolfe S. (1974), Extracallular enzyme from Myxobacter AL – 1

that exhibits both β – 1, 4 – glucanase and chitosanase activities, J. Bacteriol,

120, 844 – 853.

[28]. Ho – Geun Yoon, Hee – Yun K., Young – Hee L., Hye – Kyung K., Dong –

Hoon S., Bum – Shik H., Hong – Yon Cho (2000), Thermostable chitosanase

from Bacillus sp. strain CK4: cloning and expression of the gene and

characterization of the enzyme, Applied and Environmental Microbiology, 66

(9),3727 – 3734.

[29]. Horowitz ST, Roseman S., Blumental HJ. (1975), The preparation of

glucosamine oligosaccharide, Separation. J. Am. Chem. Soc.,79, 5046 – 5049.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

[30]. Hugo Trembley, Josse B., Ryszard B. (2000), A common molecular signature

unifies the chitosanase belonging to families 46 and 80 of glycoside hydrolase,

Can. J. Mcribiol, 46, 952 – 955.

[31]. Jun – ichi Saito, Akiko Kita, Yoshiki Higuchi, Yoshiho Nagata, Akikazu

Ando, Kunio Miki (1999), Crystal structure of chitosanase from Bacillus

circulans MH – K1 at 1,6 Å Resolution and Its Subtrate Recognition

Mechanism, J. Biol. Chem., 30818 – 30825.

[32]. Machida M., Gomi K. (2010), Aspergillus Molecular Biology and Genomics

An Over view. ISBN: 978 – 1 – 904455 – 53 – 0.

[33]. Majeti N. V., Ravi Kumar (2000), A review of chitin and chitosan

applications, Reactive & Functional Polymers, 46, 1 – 27.

[34]. Maurice Raimbault (1988), General and microbiological aspects of solid

subtrate fermentation, EJB Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717 –

3458, Vol. 1, No. 3.

[35]. Mihara S. (1961), Change in glucosamines in content of Chlorella cells during

the course of their life cycle, Plant Cell Physiol, 2, 15 – 29.

[36]. Minoru Yabuki, Akika Uchiyama, Kukino Suzuki, Akikazu Ando, Takaaki

Fujii (1988), Purification and properties of chitosanase from Bacillus

circulans MH – K1, J. Gen. Appl. Microbiol., 34, 255 – 270.

[37]. Monaghan R. L. D. E., Tewari R. P. (1973), Chitosanase a novel enzyme,

Nature New Biol, 245, 78 – 80.

[38]. Nagai T., Sawayanagi Y., Nambu N. (1984), Application of chitin and

chitosan to pharmacential preparations, In chitin, chitosan and Related

enzymes (J. Zikakis Ed.), Academic Press, New York, 21 – 39.

[39]. Nelson P. E., Toussoun T. A. & Cook R. J. (1981), Fusarium: deseases,

biology and taxonomy, Penn. State. Univ. Press, University Part, PA, 142 –

146.

[40]. Ohtakara A., Ogata H., Takenomi Y. & Mitsutomi M. (1984), Purification and

characterisation of chitosanase from Streptomyces griceus. In chitin, chitosan

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

and Related Enzyme, ed. J. P. Zikakis. Academic Press, Orlando, FL, 147 –

159.

[41]. Okajima S., A. Ando, H. Shimoyama, T. Fujii (1994), Purification and

characterization of an extracellular chitosanase produced by Amycolatopsis

sp. CsO. J. Ferment, Bioeng., 77, 617 – 620.

[42]. Palapura S., Kohn J. (1992), Trends indevelopment of bioresorbable polymers

for medical applications, J. Biomaterial Applications, 6, 216 – 250.

[43]. Reyes F., Lahoz R., Martinez M. J., Alfonso C. (1985), Chitosanase in

autolysis of Mocor rouxii, Mycopathologia, 89, 181 – 187.

[44]. Rondle C. J. M. & Morgan W. T. J. (1995), The determination of glucosamin

and galactosamine, Biochem. J., 61, 586 – 589.

[45]. Seino H., Tsukuda K., and Shimasue V. (1991), Properties and action pattern

of a chitosanase from Bacilus sp. PI – 7S, Agric. Biol. Chem., 55, 2421 –

2432.

[46]. Shimosaka M., Kumehara M., Zhang X – Y, Nogawa M., Okazaki M. (1996),

Cloning and cheraterization of a chitosanase gene from the plant pathogenic

fungus Fusarium solani, Journal of Fermentation and Bioengineering, 82, 426

– 431.

[47]. Somashekar D., Richard Joseph (1995), Chitosanase properties and

applications: A review, Bioresourse Technology, 55, 35 – 45.

[48]. Synowiecki J., Al – Khateeb N. A. (2003), Production, Properties, and some

new applications of chitin and its derivatives, Crit. Rev. Food. Sci. Nutr., 43

(2), 71, 145.

[49]. Tanabe T., Morinaga K., Fukamizo T., Mitsutomi M. (2003), Novel

chitosanase from Streptomyces griceus HUT 6037 with transglucosylation

activity, Biosci. Biotechnol and Biochem., 67, 354 – 364.

[50]. Valérie Dodane, Vinod D. Vilivalam (1998), Pharmaceutical applications of

chitosan, PSTT, 1 (6), 246 – 253.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

[51]. Ward O. P. Qin, W. M. Dhanjoon, J. Ye J. (2005), Physiology and

biotechnology of Aspergillus, Biotechnol, 49, 39 – 44.

[52]. Wei Gu, Tingting W., Jiang Z., Yunyu S., Haiyan Liu (2003), Molecular

dynamics simulation of the unfolding of the human prion protein domain

under low pH and high temperature conditions, Biophysical Chemistry, 104,

79 – 94.

[53]. William J. Hennen, Ph. D (1996), Chitosan, Woodlan Publishing Inc.

[54]. Yoshihiro S., Saburo M. (1995), Application of chitin and chitosan for

biomaterials, Biotechnol and Gene Eng Rev., Vol. 13, 383 – 420.

[55]. Zhao Q., Agger M. P., Fitzpatrick M., Anderson J. M., Hilter A., Stockes K.,

Urbanski P. (1990), Cellular interactions with biomaterials: invivo cracking of

pre – stressed Pelletthane 2363 – 80 Å, J. Biomed and Material Res., 24, 621 –

637.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Khuẩn lạc và đường kính vành khuyên phân giải

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

Phụ lục 2: Bình nhân giống trên môi trường lúa chủng O2.

Phụ lục 3: vòng thủy phân chitosan – kết quả kiểm tra định tính bằng phương pháp

đục lỗ thạch.

Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.

0.14

y = 0.2609x R² = 0.9948

0.12

0.1

0.08

D O ∆

0.06

0.04

0.02

0.1

0.2

0.4

0.5

0.6

0.3 Nồng độ D - glucosamine (mg/ml)

Phụ lục 4: Đường chuẩn D – glucosamine

0.07

y = 1.2473x R² = 0.9987

0.06

0.05

0.04

D O ∆

0.03

0.02

0.01

0.05

0.06

0.02 0.04 0.03 Hàm lượng Protein (mg/ml)

Phụ lục 5: Đường chuẩn Albumine

Đồ án tốt nghiệp: Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHITOSANASE TỪ ASPERGILLUS SPP.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGÔ ĐẠI NGHIỆP

Sinh viên thực hiện

: PHẠM MINH SANG

MSSV: 0851110196 Lớp: 08DSH6

TP. Hồ Chí Minh, 2012

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 72

PHỤ LỤC .................................................................................................................. 1

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

MỞ ĐẦU

(Công thức 2)

(UI/ml hay UI/mg)

Hàm lượng protein (mg/g hay mg/ml)

Hình 3.3: Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi nhuộm

Tài Liệu Tham Khảo

PHỤ LỤC

Có thể bạn quan tâm

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thu nhận và đặc tính một số enzyme chuyển hóa lignocellulose từ nấm Việt Nam

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thu nhận và đặc tính một số enzyme chuyển hóa lignocellulose từ nấm Việt Nam

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận án Tiến Sĩ: : Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)

Báo cáo thực tập: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (QUATEST 2)

Câu hỏi ôn tập môn Công nghệ sinh học nấm ăn và nấm dược liệu

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Công nghệ nông nghiệp năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Câu hỏi ôn tập kiểm tra học kì 2 môn Công nghệ chăn nuôi lớp 11 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Đề cương ôn tập học kì 2 môn Công nghệ nông nghiệp lớp 12 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Virus Real-time PCR

Bài giảng Công nghệ sản xuất enzym - Lê Ngọc Khánh

Đề khảo sát giữa học kì 2 môn Khoa học tự nhiên lớp 9 năm 2024-2025 có đáp án - Trường THCS Xuân Tiến (Đề số 02)

Định danh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis R1 phân lập từ rơm có hoạt tính phân huỷ huyết khối

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Công nghệ sinh học nano năm 2021-2022

Bài giảng Công nghệ sinh học phân tử vi sinh vật - Trần Linh Thước

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Xuân Lộc, Đồng Nai

Tài liêu mới

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống sấy khí thổi dùng để sấy tinh bột gạo nếp, năng suất 2000 kg/h theo sản phẩm

Đồ án môn học: Nghiên cứu phát triển sản phẩm kem trứng muối đóng hộp mix hạt điều

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống xử lý nước ngầm công suất 15000M3 /NG/Đ

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu về ứng dụng công nghệ số trong sản xuất in và tác động của nó đến chiến lược kinh doanh của công ty in

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống chùm để ngưng tụ hơi cồn nồng độ 96% khối lượng, lưu lượng 10000kg/ngày

Báo cáo đồ án: Thiết kế hệ thống chưng cất mâm chóp hệ etanol – nước năng suất nhập liệu 2000 L/h

Đồ án công nghệ: Thiết kế hệ thống chuyển hóa cacbon monoxit Water gas shift

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng hệ thống chia sẻ tài liệu theo kiến trúc hướng dịch vụ

Luận văn tốt nghiệp: Thiết kế nhà máy sản xuất màng ghép phức hợp ứng dụng cho bao bì thuốc trừ sâu năng suất 90 triệu m²/năm

Đồ án tốt nghiệp: Thành lập bản đồ lớp phủ thực vật tỉ lệ 1:50000 tại huyện Sóc Sơn, thành phố Hà Nội từ tư liệu ảnh viễn thám

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng chương trình quản lý chất lượng theo HACCP cho sản phẩm thịt ba rọi xông khói tại Cty TNHH MTV Việt Nam kỹ nghệ súc sản (VISSAN)

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng mô hình dự báo nguồn nhân lực thuyền viên xuất khẩu Việt Nam

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu giải pháp điều khiển bám quỹ đạo tàu thủy có ràng buộc tín hiệu và bất định hàm ở đầu vào

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Đánh giá sự hiện diện một số kim loại nặng trong nghêu trắng Meretrix lyrate và môi trường sống của chúng

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tính toán hệ dây neo công trình biển nổi đặt tại vùng biển Việt Nam

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật