Đồ án tốt nghiệp: Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢ NĂNG SỬ DỤNG MỘT SỐ VI KHUẨN LAB PHÂN

LẬP TRONG KHOANG MIỆNG ỨC CHẾ SỰ TẠO

THÀNH MÀNG SINH HỌC CỦA Lactobacillus fermentum

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoài Hương

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đặng Vân Anh

MSSV: 1311100138 Lớp: 13DSH02

TP.Hồ Chí Minh, 2017

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS.

Nguyễn Hoài Hương Giảng viên Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi

trường của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác

dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này đều hoàn toàn trung

thực. Tôi xin chịu trách nhiệm toàn bộ về đồ án của mình.

Tp.HCM, ngày tháng năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đặng Vân Anh

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành được đồ án “Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân

lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus

fermentum” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp

phải không ít lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình

của TS. Nguyễn Hoài Hương, Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm -

Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, cùng những kiến thức và kỹ năng cần

thiết Cô truyền dạy mà em có thể đạt được thành quả của ngày hôm nay. Em xin chân

thành cảm ơn cô.

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến các Thầy Cô giảng viên và

Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học

Công nghệ TPHCM đã tạo điều kiện giúp em tiếp cận được nhiều nguồn tài liệu để

hoàn thành đồ án tốt nghiệp đúng thời gian quy định.

Dù đồ án đã hoàn thành nhưng không tránh khỏi những sai sót nhất định do khả

năng hiểu biết hạn hẹp và thông tin tài liệu không mấy khả quan để phục vụ quá trình

thực hiện đồ án. Kính mong nhận được sự góp ý và chỉ dạy của các Thầy Cô để em học

hỏi thêm những kinh nghiệm, tích lũy cho quá trình học tập rèn luyện và chuẩn bị hành

trang bước sang một môi trường làm việc mới sau này.

Ngoài ra, con xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, những người đã

bên con và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình thực hiện đồ án tốt

nghiệp.

Em xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, ngày tháng năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đặng Vân Anh

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i

LỜI CÁM ƠN ..................................................................................................................ii

MỤC LỤC ...................................................................................................................... iii

PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG ................................................................... v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...........................................................................................ii

DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................................. iv

MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................................... 1

2. Tình hình nghiên cứu ........................................................................................... 2

3. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 3

4. Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................................... 4

5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 4

6. Các kết quả đạt được ............................................................................................ 5

7. Kết cấu đồ án ........................................................................................................ 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 6

1.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB) .............................................................. 6

1.2. Tổng quan về Probiotic .................................................................................. 19

1.3. Màng sinh học ................................................................................................ 31

1.4. Sâu răng .......................................................................................................... 37

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 44

2.1. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 44

2.2. Thời gian thực hiện ........................................................................................ 44

2.3. Vật liệu và thiết bị .......................................................................................... 44

2.4. Phương pháp luận ........................................................................................... 45

2.5. Phương pháp thí nghiệm ................................................................................ 47

iii

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................. 64

3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý ............................................................................ 64

3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa ......................................................................... 67

3.3. Kết quả khả năng sinh enzyme ...................................................................... 71

3.4. Kết quả khả năng kháng khuẩn ...................................................................... 75

3.5. Kết quả khả năng kháng kháng sinh .............................................................. 77

3.6. Kết quả khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau

khi qua xử lý nhiệt ................................................................................................... 81

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 84

1. Kết luận .............................................................................................................. 84

2. Kiến nghị ............................................................................................................ 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 85

PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................................... 94

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG

 Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe agar (MRS agar):

 Tween 80 1ml 0.2g  MgSO4.7H2O

 Cao thịt 10g 0.2g  MgSO4.4H2O

 Pepton 5g 2g  K2PO4

 Yest Extract 5g  Nước cất 1000ml

 D-glucose 10g  Agar 2%

 Diamonium Citrate 2g

 Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC.

 Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe broth (MRS broth):

 Tween 80 1ml  Diamonium Citrate 2g

 Cao thịt 10g 0.2g  MgSO4.7H2O

 Pepton 5g 0.2g  MgSO4.4H2O

 Yest Extract 5g 2g  K2PO4

 D-glucose 10g  Nước cất 1000ml

 Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC.

 Thành phần nước muối sinh lí:

 NaCl 9g

 Nước cất 1000ml

 Thành phần môi trường Glucose Phosphate broth (MR – VP broth):

 Peptone 7g

 Dextrose 5g

5g  K2HPO4

 Nước cất 1000ml

Đồ án tốt nghiệp

 Thành phần môi trường Simmon citrate agar (SCA)

0,2g  MgSO4.7H2O

1g  NH4H2PO4

1g  K2HPO4

2g  Na3C6H5O7

 NaCl 5g

 Bromothymol blue 0,08g

 Agar 15g

 Nước cất 1000ml

 Điều chỉnh pH = 6.8 ± 0.2 tại 25oC.

 Thành phần môi trường canh tryptone:

 Tryptone 10g

 NaCl 5g

 Nước cất 1000ml

 Điều chỉnh pH = 7.5 ± 0.2 tại 25oC

 Thành phần môi trường Triple sugar iron agar (TSI):

 Cao thịt 3g  NaCl 5g

 Peptone 20g 0,3g  Na2S2O3

 Yeast extract 3g  Phenol red 0,024g

 Lactose 10g  Agar 15g

 Sucrose 10g  Nước cất 1000ml

 Dextrose 1g  Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại

25oC. 0,2g  FeSO4

Đồ án tốt nghiệp

 Thành phần môi trường Blood agar:

 Beef heart infusion 500g

 Tryptose 10g

 NaCl 5g

 Agar 15g

 Máu cừu 50ml

 Nước cất 950ml

 Điều chỉnh pH = 7.3 ± 0.2 tại 25oC.

 Thành phần môi trường Skim milk agar:

 Bột sữa gầy 28g

 Casein enzymic hydrolysate 5g

2,5g  Cao nấm men

1g  Dextrose

15g  Agar

 Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25oC.

 Thành phần môi trường Lactobacillus biofilm medium (LBM):

 Peptone 5g 2,5g  CH3COONa.H2O

 Cao nấm men 2,5g 0,05g  MgSO4

3g 0,025g  K2HPO4  MnSO4

1g 0,1g  (NH4)3C6H5O7  CaCl2

 Dextrose 10g  Nước cất 1000ml

 Cao thịt 5g

 Tween 80 0,5g

 Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25oC.

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

LAB Lactic acid bacteria /Lactobacillales

MRS de Man, Rogosa and Sharpe

SCA Simmon citrate agar

SAS Statistical Analysis Systems

TSI Triple sugar iron

TN Thí nghiệm

VK Vi khuẩn

VSV Vi sinh vật

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ

răng miệng ....................................................................................................................... 3

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic ..................................... 11

Bảng 1.2. Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB ....... 19

Bảng 2.1. Phân loại khả năng kháng kháng sinh dựa vào đường kính vòng kháng ..... 62

Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý .......................................................................... 64

Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa ........................................................................ 67

Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm lên men carbohydrate .................................................. 69

Bảng 3.4. Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng lactic ................................... 71

Bảng 3.5. Tỉ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic (%) ................................................ 76

Bảng 3.6. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic ........................................... 77

Bảng 3.7. Kết quả ức chế khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn lactic sau khi xử lý

nhiệt ............................................................................................................................... 82

iii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Mô ̣t số vi khuẩn lactic điển hình .................................................................... 8 Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic ........................... 13

Hình 1.3. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang

miệng ............................................................................................................................. 28

Hình 1.4. Các dạng sản phẩm từ sữa có chứa probiotic ............................................... 29

Hình 1.5. Các giai đoạn hình thành màng sinh học ...................................................... 32

Hình 1.6. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới

đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử ........................................ 32

Hình 1.7. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng

sinh học ......................................................................................................................... 35

Hình 1.8. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ

nước nóng Mickey, Oregon .......................................................................................... 36

Hình 1.9. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng .................... 39

Hình 1.10. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng ....................... 39

Hình 1.11. Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng .................................... 40

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................... 46

Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế màng sinh học sau khi vi khuẩn

lactic bị xử lý nhiệt ........................................................................................................ 63

Hình 3.1. Kết quả nhuộm bào tử bằng Malachite green của các chủng lactic ............. 66

Hình 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh dưỡng kỵ khí. Dưới đáy ống nghiệm có xuất hiện

sinh khối, chứng tỏ các chủng đều tăng trưởng bình thường khi không có khí O2 ....... 67

Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm Citrate (+: Salmonella typhimurium) ........................... 68

Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm H2S ............................................................................... 68

Hình 3.5. Kết quả thử nghiệm Indole (+:Escherichia coli) .......................................... 69

Hình 3.6. Kết quả lên men carbohydrate của các chủng lactic .................................... 70

Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm tan huyết của các chủng lactic ..................................... 72

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Casein ........................................ 73

Hình 3.9. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Gelatin ....................................... 73

Hình 3.10. Tất cả các chủng đều chuyển sang màu vàng cho kết quả dương tính với

thử nghiệm β- galactosidase ........................................................................................... 74

Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic ........................... 75

Hình 3.12. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic ......................................... 80

Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ ức chế khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn

lactic sau khi xử lý nhiệt ............................................................................................... 81

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Song song với sự phát triển về kinh tế, chính trị và xã hội thì các nghiên cứu khoa

học thuộc lĩnh vực Công nghệ sinh học cũng ngày càng phát triển. Ngày nay con người

đã ứng dụng các thành tựu khoa học công nghệ vào trong cuộc sống, từ công nghiệp,

nông nghiệp, an ninh quốc phòng cho đến giải trí, v.v...

Các nhà khoa học cùng với các nhà nghiên cứu đã ứng dụng các kiến thức từ

các tài liệu trên toàn thế giới và áp dụng các biện pháp kỹ thuật mới để cho ra đời các

giống cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật có tính năng ưu việt hơn các giống hiện có. Bên

cạnh đó người ta còn tạo ra những loại thức ăn mới, nghiên cứu ra các loại thuốc, các

bộ kit xác định bệnh, những nhân tố mới có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế

- xã hội và bảo vệ môi trường.

Ngoài ra, đã có nhiều kết quả nghiên cứu khoa học áp dụng cho lĩnh vực công

nghệ thực phẩm. Từ những nghiên cứu đó chúng ta cho ra đời các loại vi sinh vật dùng

trong chế biến nhằm làm tăng giá trị dinh dưỡng, cảm quan và bảo quản thực phẩm,

làm cho thực phẩm không đơn giản chỉ là bổ sung năng lượng mà còn có thể giúp con

người phòng chống một số bệnh, tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể.

Đi đôi với sự phát triển không ngừng của xã hội, nhu cầu sử dụng các chế phẩm,

thực phẩm cũng như việc sinh hoạt lành mạnh để có được sức khỏe tốt luôn là mục tiêu

của rất nhiều người đang hướng tới. Thời gian gần đây, chúng ta thường nghe nhiều về

khái niệm “Probiotics” mà không phải ai cũng hiểu Probiotics là gì. Probiotics trên

thực tế chính là các vi khuẩn sống có lợi đường ruột, khi ăn vào đem lại các lợi ích sức

khoẻ con người nhờ cải thiện hệ vi sinh đường ruột và chức năng của ruột. Hai loài vi

khuẩn probiotics thông dụng hiện này Bifidobacteria và Lactobacillus. Vi khuẩn

probiotic giúp tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa ung thư... Ngoài ra, việc có thể phát

hiện được một loài vi khuẩn có khả năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của các vi

khuẩn có hại trong khoang miệng để hạn chế khả năng gây sâu răng đồng thời mang

Đồ án tốt nghiệp

tính an toàn như một chủng vi khuẩn Probiotic cũng được khá nhiều nhà khoa học quan

tâm và đó là lý em em chọn thực hiện đề tài này. Em muốn mình có thể tìm hiểu cụ thể

hơn về loại vi khuẩn này cũng như hy vọng rằng có thể vận dụng những điều mình biết

được vào thực tế, cụ thể là khi làm việc sau này.

2. Tình hình nghiên cứu

Trong nhiều năm qua, đã có nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác

động của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi

vi khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ có khả năng tồn tại một thời gian

nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng

probiotic có khả năng này [43], khiến cho việc sử dụng vi khuẩn lactic nói chung và

probiotic nói riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn.

Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei có trong sữa

chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans trong

nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần sử dụng

[48]. Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên men pho mát,

LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 có trong pho mát có thể làm giảm tỷ lệ sâu

răng ở trẻ nhỏ [49].

Hallstrom và cộng sự cũng đã chứng minh được việc sử dụng chủng probiotic

L. reuteri ATCC 55730 và ATCC PTA 5289 không góp phần hình thành mảng bám

trong khoang miệng [44].

Hầu hết các nghiên cứu lâm sàng của probiotic trong việc bảo vệ răng miệng đều

thông qua việc định lượng tổng vi khuẩn mutans streptococci (MS) trong khoang

miệng. Các thành quả nghiên cứu trong những năm gần đây được tổng hợp ở bảng 1.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 0. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ

răng miệng [50].

Tác giả

Chủng probiotic

Tổng MS trong khoang miệng

Tình trạng sâu răng

Thời gian nghiên cứu

7 m 3 w 2 w 45 d

Độ tuổi – số đối tượng nghiên cứu 1–6, 594 18–35, 74 20, 40 23–37, 35

 - - -

   

Nase và cs, 2001 Ahola và cs, 2002 Nikawa và cs, 2004 Montalto và cs, 2004 Caglar và cs, 2005

2 w

21–24, 21



2 w 3 w 10 d

21–25, 120 21–24, 80 20–24, 40

- - -

  

Caglar và cs, 2006 Caglar và cs, 2007 Caglar và cs, 2008 Caglar và cs, 2009

10 d

20, 20



Cildir và cs, 2009

2 w

12–16, 24



L. rhamnosus GG Lactobacillus spp. L. reuteri ATCC 55730 Lactobacillus spp. Bifidobacterium animalis ssp. lactis DN-173010 L. reuteri ATCC 55730 L. reuteri ATCC 55730 Bifidobacterium lactis BB-12 L. reuteri ATCC 55730, L. reuteri ATCC PTA 5289 Bifidobacterium animalis ssp. lactis DN-173010 L. rhamnosus LB21

21 m

1–5, 174





2 w

12–15, 20



Stecksen-Blicks và cs, 2009 Lexner và cs, 2010 Singh và cs, 2011

10 d

12–14, 40



Jindal và cs, 2011

14 d

7–14, 150



Marttinen và cs, 2012

2 w

20–30, 13



2 w

20–26, 70



Chuang và cs, 2011 Cildir và cs, 2012

25 d

4–12, 19



15 m





L. rhamnosus LB21 L. acidophilus La5 Bifidobacterium lactis Bb-12 L. rhamnosus, Bifidobacterium longum, Saccharomyces cerevisae L. rhamnosus GG, L. reuteri SD2112, L. reuteri PTA 5289 L. paracasei GMNL- 33 L. reuteri ATCC PTA 5289, L. reuteri DSM 17938 L. rhamnosus LB21 Bifidobacterium animalis BB-12

Petersson và cs, 2011 Taipale và cs, 2012

15 m



L. rhamnosus hct 70 L. acidophilus

9 w 3 w

- -

 

58–84, 160 2 tháng tuổi đến 2 tuổi, 106 12-15, 40 Juneja và Kakade, 2012 Sudhir và cs, 2012 10-12, 40 (d, ngày; w, tuần; m, tháng;, giảm;  , không thay đổi; -, âm tính)

3. Mục tiêu nghiên cứu

Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ khoang miệng. Mục tiêu

cuối cùng sau khi thực hiện các thử nghiệm khảo sát là xác định xem chúng có khả

Đồ án tốt nghiệp

năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum không và có đủ

an toàn để bổ sung vào các sản phẩm sử dụng cho con người và động vật không.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

_ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa.

_ Khảo sát khả năng kháng khuẩn.

_ Khảo sát khả năng kháng kháng sinh.

_ Xác định độ an toàn và khả năng ức chế màng sinh học của Lactobacillus fermentum.

5. Phương pháp nghiên cứu

a) Phương pháp luận

_ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý: khả năng chịu nhiệt ở 10oC, 45oC, 60oC; khả năng

chịu mặn: 3,5% NaCl và 6,5% NaCl; khả năng sinh bào tử; khả năng sinh dưỡng trong

điều kiện kỵ khí.

_ Tiến hành các thử nghiệm sinh hóa: khả năng lên men carbohydrate; thử nghiệm MR

– VP; thử nghiệm Citrate; Thử nghiệm Indole; khả năng sinh H2S.

_ Khảo sát khả năng sinh enzyme: enzyme thủy phân Gelatin; enzyme thủy phân

Casein; thử nghiệm tan huyết; thử nghiệm 𝛽 – Galactosesidase.

_ Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục.

_ Khả năng kháng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar Diffusion

Test).

_ Khả năng ức chế tạo màng sinh học của Lactobacillus fermentum sử dụng các vi

khuẩn lactic sau xử lý nhiệt.

b) Phương pháp xử lý số liệu

- Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị.

- Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để xử lý số liệu.

Đồ án tốt nghiệp

6. Các kết quả đạt được

_ Chọn được chủng vi khuẩn lactic an toàn và có thể ứng dụng để ức chế sự hình thành

màng sinh học của Lactocbacillus fermentum.

7. Kết cấu đồ án

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên

quan đến tài liệu nghiên cứu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến

các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề

tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được. Chương 4: Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề

tài đạt được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB)

1.1.1. Giới thiệu chung

Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta.

Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ đầu

thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục đích

chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotic đã ra đời và phát triển. Đến nay,

những nghiên cứu về probiotic đã không ngừng cung cấp những bằng chứng có tính

khoa học về hiệu quả thực sự của probiotic đối với sức khỏe con người.

Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại

thực phẩm lên men (sữa chua, muối dưa, muối cà,...), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc

để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà

hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua.

Năm 1875, L. Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động

của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó (1878), Lister

đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là

Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic

đã được hình thành.

Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, hiện nay chúng được công nhận là

an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên

trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người.

Một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra

bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin,

plantacin,... có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển

của các nguồn bệnh trong thực phẩm [2] [3].

Đồ án tốt nghiệp

Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất ra

các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất có khối

lượng phân tử thấp và bacteriocin là chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram (+) và

vi khuẩn gram (-). Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh acid hữu cơ, đặc

biệt là acid lactic trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Đối với hydroxy peroxide

thì khả năng kháng khuẩn là do việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên

tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl. Đối với bacteriocin, cơ chế

kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứu đầu tiên ở nisin,

bacteriocin gram (+) [4].

1.1.2. Đă ̣c điểm hình thá i củ a vi khuẩn lactic.

Các tế bào có hình dáng đa dạng: từ hình que dài, mảnh đến hình que ngắn uốn

cong, thường tạo thành chuỗi. Không có khả năng di động (ngoại trừ một số chủng có

tiên mao hoặc lông roi trên bề mặt cơ thể), không sinh bào tử, gram dương. Một số

chủng thể hiện tính lưỡng cực, xuất hiện các chấm nhỏ hoặc các đường kẻ dọc (quan

sát qua kính hiển vi) khi nhuộm vi khuẩn với thuốc nhuộm gram hoặc methylene blue.

[51]

Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong bề mă ̣t bóng, màu trắng đục hoặc

màu vàng kem, hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn

lạc tỏa ra mùi chua của acid.

Về kích thước tế bào thì đối với các dạng cầu khuẩn là từ 0.5 – 1.5μm. Các tế

bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Còn với trực

khuẩn thì từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi.

 Đặc điểm hình thái giống vi khuẩ n lactic điển hình: Trong số các vi khuẩn lactic, giố ng Lactobacillus đươ ̣c xem là đa ̣i diê ̣n cho chủ ng

vi khuẩn này.

Đồ án tốt nghiệp

Tùy thuộc vào hình thái tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 dạng :

hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy theo từng loài.

_ Giống Lactobacillus

 Giới : Vi khuẩn

 Ngành : Firmicutes

 Lớp: Bacilli

 Bộ: Lactobacillales

 Họ: Lactobacillacea

 Giống: Lactobacillus

c) a)

d) b)

Hình 1.1. Mô ̣t số vi khuẩn lactic điển hình b) Latobacillus brevis a) Lactobacillus casei

c) Lactobacillus bulgaricus d) Lactobacillus plantarum

Đồ án tốt nghiệp

Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như: L. acidophilus, L. brevis, L.

casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus …

Tế bào có dạng hình que nhưng hình dạng của chúng có thể thay đổi tùy vào điều

kiện của môi trường sống, có thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi hay đứng

riêng lẻ hoặc ở dạng que kép. Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, không di động,

không sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, có khả năng chịu được môi

trường có pH thấp. Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng,

và chịu được nhiệt độ cao. Ngoại trừ loài L. plantarum thì những loài khác không có

khả năng chuyển hóa nitrate khi ở điều kiện nhất định.

Các loài Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật

và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh

dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có

chứa các vi khuẩn này như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis,

Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus

plantarum.

Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của quá trình trao đổi

chất của chúng. Vì vậy có thể chia các loài Lactobacillus thành 3 nhóm như sau:

- Nhóm I (Lên men đồng hình bắt buộc): Chúng được gọi là Thermobacterium,

có fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có

phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không

lên men được pentose, thường phát triển ở 45oC.

- Nhóm II (Lên men dị hình tùy nghi): Chúng được gọi là Streptobacterium (có

FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men

đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid

acetic.

Đồ án tốt nghiệp

- Nhóm III (Lên men dị hình bắt buộc): Chúng được gọi là Betabacterium (có

phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả

hexose và pentose lên men dị hình.

Trên thực tế, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích

trong việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng

ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn

Clostridium difficile, cơ thể không phân giải được lactose, bệnh về da như: ban đỏ

do sốt, chàm, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp.

1.1.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

1.1.3.1. Đặc điểm sinh lý , sinh trưở ng

Sinh dưỡng ở điểu kiện kỵ khí tùy nghi, thường tăng trưởng trên bề mặt môi

trường rắn kèm theo các điều kiện: kỵ khí, giảm áp suất oxy, 5-10% CO2. Có thể bị ức

chế tăng trưởng trong điều kiện hiếu khí, một số loài thuộc nhóm sinh vật kỵ khí bắt

buộc.

Có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, dẫn xuất acid

nucleic, vitamin, khoáng, acid béo, ester acid béo và carbohydrate. Các yêu cầu dinh

dưỡng đặc trưng cho từng loài, thường là các chủng đặc biệt. Nhiệt độ tăng trưởng từ

2 – 53oC, nhiệt độ tối ưu khoảng 30 – 40oC.

Tăng trưởng tốt trong điều kiện môi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2,

thường tăng trưởng ở mức pH 5.0 hoặc thấp hơn, tốc độ tăng trưởng giảm trong điều

kiện pH môi trường trung tính hoặc kiềm.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic

Nhiệt Khả năng độ tăng pH tăng Hình Lên chịu Lactic aicd trưởng, trưởng Chi thái tế men muối,% isomer

oC

bào lactic

10 45 6,5 18 4,4 9,6

Lactobacillus que đh/dh ± D,L,DL ± ± - ± -

- + - - ± - L Lactococcus Cầu đh

- + ± - ± - D Leuconostoc Cầu dh

+ + ± - ± - D Oenococcus Cầu dh

± ± ± - + - D,L,DL Pediococcus Tứ cầu đh

+ - - - - - L Streptococcus Cầu đh

- + + + - + L Tetragenococcu Tứ cầu đh

- + + - - + L Aerococcus Tứ cầu đh

- + - - - - L Carnobacterium Que dh

+ + + - + + L Enterococcus Cầu đh

- + - - ± - L Vagococcus Cầu đh

- + ± - ± - D,L,DL Weissella Cầu dh

(đh: đồng hình ; dh: dị hình)

1.1.3.2. Đặc điểm sinh hoá

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram (+), oxidase âm tính, không có khả năng di đô ̣ng

đồ ng thờ i không sinh bào tử , có khả năng lên men carbonhydrate.

Hiếm khi khử nitrate, chỉ khi pH cuối cùng từ 6.0 trở lên hoặc có bổ sung vào môi

trường tăng trưởng. Không thủy phân gelatine (làm gelatine hóa lỏng), không phân giải

Đồ án tốt nghiệp

casein nhưng một lượng nhỏ nitơ hòa tan được sản xuất ra bởi hầu hết các chủng. Thử

nghiệm Indole âm tính và không sản xuất H2S.

Catalase và cytochrome âm tính (không có prophyrin), tuy nhiên, một vài chủng

của một số loài phân hủy H2O2 bằng pseudocatalase hoặc bằng chính catalase của

heme có mặt trong môi trường. Phản ứng Benzidine âm tính. Hiếm có trường hợp hình

thành sắc tố, nếu có sẽ xuất hiện màu cam, vàng, đỏ gạch. [51]

1.1.3.3. Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua

việc lên men lactic. LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose,

mannose, galactose, fructose…), disaccharide (lactose, saccharose…); pentose

(arabinose, xylose, ribose…) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các

loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện

khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo

ra cũng khác nhau.

Quá trình lên men lactic có thể đồng hình hoặc dị hình. Lên men đồng hình gồm

con đường EMP chuyển hóa đường thành pyruvate, sau đó pyruvate bị khử thành

lactic acid 90% đường được chuyển hóa thành acid lactic. Trong khi đó ở lên men

lactic dị hình chỉ 50% đường được chuyển hóa thành acid lactic, còn lại là CO2,

acetaldehyde, ethanol.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic A) Lên men đồng hình . B) Lên men dị hình

Đồ án tốt nghiệp

 Lên men lactic đồng hình

Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic

tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol,

diacetyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:

C6H12O6  2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J

Con đường Glycolysis hay con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas pathway)

được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli,

Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase

để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3-

phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo

thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử

thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được

oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra

chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình. (Hình

1.2A)

 Lên men lactic dị hình

Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo

6-phosphogluconate. Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục

chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate. GAP được

tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic.

Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị

khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này ngoài sản

phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol,

acid acetic, acid succinic... thì nó được gọi là lên men lactic dị hình.

Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:

C6H12O6  CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2

Đồ án tốt nghiệp

Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic

và acid acetic 10% các loại khí 20%.... đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự

tích luỹ một lượng ít acid foocmic.

1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn lactic

Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần

đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là

lớn nhất và giá thành rẻ [79]. Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng

đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ

đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.

 Thành phần môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho

hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi

trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa

nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi

khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế

bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn

carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối

khoáng và các yếu tố vi lượng.

 Yếu tố môi trường

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh hưởng đến enzyme của tế

bào vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các

enzyme, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt

độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở

Đồ án tốt nghiệp

nhiệt độ 30 – 40oC. Một số có thể sinh trưởng dưới 15oC và thậm chí một số dòng có

thể sinh trưởng dưới 5oC [5].

 Ảnh hưởng của pH

Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm và khi

nó giảm tới mức nào đó nó sẽ ảnh hưởng lên sự phát triển của vi khuẩn lactic. Do đó,

cần phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuôi,

pH tối ưu phải giữa 5.5 và 6.0.

 Ảnh hưởng của nồng độ acid

Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi

khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích

lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát

triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người ta

cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid

sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3.

 Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men

Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những

mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao

đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men.

1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính

kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều

trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong

nhiều lĩnh vực khác nhau như:

_ Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như

cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực

phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính cảm quan và

Đồ án tốt nghiệp

dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi

ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có

tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối đồ ng thờ i kéo dài đươ ̣c thờ i gian bảo quản củ a các sản phẩm thực phẩm như bánh mì.

_ Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic,

đem lại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều lĩnh

vực khác nhau.

_ Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá…

_ Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của nấm

Fusarium, Aspergillus, chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô nhiễm,

ứ c chế mô ̣t số vk gây bê ̣nh trên các loài thuỷ hải sản. Ngoài ra cò n đươ ̣c ứ ng du ̣ng trong bảo quản ha ̣t giố ng do sự phát triển củ a nấm mố c như: bắp, đâ ̣u phô ̣ng,….

1.1.6. Hoa ̣t tính sinh học

Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như acid lactic

và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và

các loại peptide kháng nấm. LAB đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai trò

quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men. Lợi ích sức khỏe

của LAB được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hóa của con

người [6] [7].

1.1.6.1. Khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic

LAB cũng ứ c chế sự phát triển củ a vi sinh vâ ̣t có ha ̣i gây thố i rữa thông qua các sản phẩm chuyển hoá như hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và đă ̣c biê ̣t là

bacteriocin.

Bacteriocin: Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học do vi khuẩn tiết ra, có thể

tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác có quan hệ họ hàng với

Đồ án tốt nghiệp

chúng [8]. Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhóm vi

khuẩn đa dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng,

đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc [9].

Ưu điểm của bacteriocin là có hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở nồng độ

rất thấp. Tuy nhiên, bacteriocin thường có phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh. Khác

với chất kháng sinh, bacteriocin thường được dùng trong thực phẩm và không có ảnh

hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn còn chất kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và có

ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn. Trên thế giới bacteriocin được sản xuất bằng

công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic.

Bacteriocin cò n có mô ̣t số ha ̣n chế như: ít đươ ̣c biết đến hơn chất bảo quản hoá

ho ̣c. Bi ̣ thoái biến nhanh chó ng bở i các enzyme phân giải protein.

Bacteriocin đươ ̣c ứ ng du ̣ng: Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là

các chất bảo quản thực phẩm, dùng màng polyethylen hoạt tính bacteriocin cho đóng

gói thực phẩm.

Sản phẩm chuyển hoá củ a LAB sử du ̣ng để chố ng la ̣i các vi sinh vâ ̣t gây thố i rữa

và chứ c năng hoá có thể ứ c chế vi sinh vâ ̣t củ a chú ng đươ ̣c tó m tắt như sau:

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.2. Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB [5].

Sản phẩm Các sinh vật ảnh hưởng

Vi khuẩn gram âm, một vài loài nấm Acid lactic

Nấm, nấm men, vi khuẩn gây thối rửa Acid acetic

Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức ăn giàu protein H2O2

Hệ thống lactoperoxidase với Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản phẩm làm từ sữa) H2O2

Lysozyme Vi khuẩn gram dương

Reuterin (3-OH- Nấm mốc, nấm men propoonaldehyde)

Diacetyl Vi khuẩn gram âm

Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau

1.2. Tổng quan về Probiotic

1.2.1. Lược sử nghiên cứu

Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khi các nhà

vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ VSV trong ống tiêu hóa của người

bệnh và người khỏe mạnh. Hệ vi sinh vật có ích trong hệ thống ống tiêu hóa được gọi

là probiotic.

Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những người nông dân Bungary có sức khỏe

tốt, nhà sinh lý học người Nga Eli Metchnikoff đã đưa ra thuật ngữ “probiotic” có

nguồn gốc từ Hy Lạp, theo nghĩa đen là “vì cuộc sống” để chỉ những vi sinh vật đã

được chứng minh có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe của người và động vật. [83]

Khái niệm này sau đó được làm rõ hơn bởi định nghĩa của Tổ chức Y tế thế giới

và Tổ chức Lương nông thế giới (WHO/FAO, 2001): “Probiotic là những vi sinh vật

còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của người sử

dụng.” [90]

Đồ án tốt nghiệp

Đây là những nhóm vi khuẩn (VK) sống trong đường tiêu hóa của người, chúng

tạo thành một khu hệ VSV, cản trở sự phát triển của một số VSV gây bệnh, cung cấp

cho con người một số chất có lợi cho cơ thể, ảnh hưởng tốt đến hệ miễn dịch. Con

người sử dụng các chế phẩm probiotic như một loại thực phẩm, thuốc, sử dụng chúng

như một phương tiện để vận chuyển vi khuẩn probiotic vào trong cơ thể, từ đó giúp

phòng và chữa bệnh.

1.2.2. Các vi sinh vật probiotic thường gặp

Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như vi khuẩn,

xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của vi khuẩn lactic

(LAB) phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi nên thành

phần của hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB.

Một số nhóm vi sinh vật probiotic thường gặp:

 Nhóm vi khuẩn lactic: Theo Lee, Nomoto, Salminen và Gorbach (1999), một

số loại chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng LAB, trong đó chủ

yếu là những loài thuộc chi Lactobacillus và Streptococcus như L. acidophilus, L.

casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes,

Bifidobacterium breve, Bifidus bacteria, Streptococcus faecalis,…

Những chủng này đều có thể chịu đựng nhiệt độ cũng như các tác động trong quá

trình sản xuất thuốc, không tương tác với các thành phần bổ sung thêm trong chế phẩm

như vitamin, acid amin, acid béo, đường và đặc biệt là fructoligosaccharide, là một tá

dược được dùng phổ biến trong hầu hết các chế phẩm propiotic.

Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng chỉ một chủng LAB (như L. acidophilus

hay L. sprorogenes,…) hoặc kết hợp nhiều chủng LAB (L. acidophilus, L.

sprorogenes, L. kefir, Streptococcus faecalis,…). Sử dụng chế phẩm probiotic - lactic

là liệu pháp rất tốt cho các trường hợp rối loạn đường tiêu hóa, giúp duy trì hệ VSV có

Đồ án tốt nghiệp

lợi cho hệ tiêu hóa, ngăn ngừa tiêu chảy hữu hiệu và nhiều trường hợp bệnh khác nhờ

những tác dụng trong cơ thể người. [71] [75]

 Bacillus subtilis

B. subtilis là VK ứng dụng làm probiotic từ rất sớm. Chúng được sử dụng qua

đường uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy sau khi dùng kháng

sinh. B. subtilis có tác dụng hồi phục hệ VSV tự nhiên trong đường tiêu hóa của người

sau khi dùng kháng sinh kéo dài. Các chế phẩm B. subtilis được bán ở hầu hết các nước

Châu Âu, mặc dù người ta còn chưa biết nhiều về cơ chế tác dụng của chúng. Bào tử

của B. subtilis có thể vượt qua rào chắn đường tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm

trong ruột non và sinh sôi trong đường ruột. Một số tác dụng lâm sàng của B. subtilis

đã được biết như làm tác nhân kích thích miễn dịch trong một số bệnh [83].

 Bacillus clausii

Thuộc giống Bacillus, GP+P, không di động, nuôi cấy dễ dàng với các môi

trường dinh dưỡng thông dụng, có khả năng sinh bào tử giúp VK tồn tại trong điều

kiện khắc nghiệt. Bào tử của B. clausii có thể qua dạ dày với tỉ lệ sống sót cao, có thể

sống được trong môi trường dịch vị với pH = 2 ít nhất l2 giờ. Chúng đề kháng rất tốt

với nhiều loại kháng sinh. Vì thế, có thể dùng chung trong thời gian điều trị kháng

sinh.

Khi vào ruột non, bào tử B. clausii sẽ nảy mầm thành dạng sinh trưởng và tiếp tục

sinh sôi nảy nở trong ruột. Nhờ đó lấp đầy lại được khoảng trống rối loạn hệ VK trong

đường ruột. Đồng thời sự sinh trưởng của B. claussi sẽ tái lập được điều kiện kỵ khí,

tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trở lại của các VK có lợi ở đường ruột (như

Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides) đã bị rối loạn vì các nguyên nhân khác

nhau.

B. clausii thường được dùng tạo chế phẩm probiotic cho người như chế phẩm

Enterogermina ở dạng lỏng. Bào tử được bào chế dưới dạng hỗn dịch không màu,

Đồ án tốt nghiệp

không mùi, không vị trong từng ống nhựa nhỏ nên tiện lợi khi sử dụng, đặc biệt là cho

trẻ em.

 Nấm men

Được sử dụng làm probiotic như Saccharomyces cerevisiae, S. boulardii. Trong

các chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa acid amin, các vitamin nhóm B, hấp thu

độc tố và bài thải ra ngoài. Chúng chuyển hóa glucose thành acid pyruvic là cơ chất

cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản. Ngoài ra, chúng còn tiết enzyme tiêu hóa

như amylase, protease,…. [78]

S. boulardii: được dùng như probiotic từ năm 1950. Là thành phần chính của một

số chế phẩm probiotic như ultralevure (Pháp), florastor, bioflora (Pháp). Tác động hiệu

quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp. Ngừa tiêu chảy do KS và trị liệu phối hợp

trong nhiễm trùng H. pylori. S. boulardii tác động thông qua cơ chế:

 Tiết enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile, sản sinh

phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E. coli tiết ra.

 Tăng lượng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và N-

aminopeptidase, tăng hấp thu ở người tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi ngắn

cần thiết cho cho việc hấp thu nước và chất điện giải.

 Ngoài ra, chúng còn tác dụng giảm viêm ở đường ruột do kích thích tế bào

1.2.3. Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic

Vi sinh vật được sử dụng trong hầu hết các sản phẩm probiotic hiện nay chủ yếu

là LAB, do chúng mang những đặc điểm ưu việt vốn có thích hợp cho việc tạo chế

phẩm probiotic. Tuy nhiên, không phải bất kì LAB nào cũng được ứng dụng làm

probiotic. Những chủng LAB được chọn phải đảm bảo các tiêu chuẩn sau:

 Là VK hiện diện bình thường ở ruột của người, sinh trưởng và phát triển nhanh.

 Là VK chịu được pH thấp nên có thể sống được khi qua dạ dày.

Đồ án tốt nghiệp

 Lên men lactic làm giảm pH môi trường sống, ức chế sự phát triển của VSV

gây bệnh khác.

 Có khả năng làm mất sự liên kết của các acid mật nên chịu acid mật tốt.

 Đề kháng được kháng sinh.

 Tạo enzyme lactase giúp đồng hóa được đường lactose trong sữa.

 Làm tăng quá trình tiêu hoá thức ăn, tăng hấp thu chất dinh dưỡng.

 Sản sinh một số chất kháng khuẩn ức chế sự phát triển các VSV gây bệnh.

 Điều hoà khả năng miễn dịch.

 Làm giảm lượng cholestrol trong huyết thanh.

 Hoạt tính chống đột biến và chống ung thư.

1.2.4. Đặc điểm chung của vi sinh vật probiotic

Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể qua đường tiêu hóa, chúng tác

động thông qua một số cơ chế khác nhau. Tuy nhiên, để có thể tác động lên hệ tiêu hóa

vật chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong

đường tiêu hóa. Điển hình là các điều kiện như pH thấp, acid mật, kháng sinh,…

 Chịu pH thấp

Đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu. Các nhà khoa học đã chứng

minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước

khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian

xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chống lại được các điều kiện áp lực của dạ dày

với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được chọn lọc để sử dụng như trong chế

phẩm probiotic cần phải chịu được môi trường pH thấp ít nhất 90 phút. Sống sót ở pH

3.0 trong 2 giờ và nồng độ acid 1000 mg/l được xem như là khả năng chống đỡ đối với

acid tối ưu đối với các chủng probiotic [70].

Đồ án tốt nghiệp

Ngoài ra, VSV probiotic phải chống lại được các enzyme trong đường miệng như

lysozyme. Vì vậy, khả năng chịu acid là một trong những tính chất đầu tiên để sàng lọc

khi muốn tuyển chọn các dòng probiotic [69].

 Chịu acid mật

Acid mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi

sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Ở hầu hết các sinh vật (bao gồm người), quá trình

tổng hợp acid mật chủ yếu thông qua sự tiêu thụ cholesterol. Cơ thể tổng hợp khoảng

8mg cholesterol một ngày và dùng 4mg cholesterol để tổng hợp acid mật. Tổng cộng

có khoảng 20 – 30 g acid mật tiết vào ruột mỗi ngày [85].

Do vậy, khi thức ăn cùng VSV từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột. Tại đây,

chúng chịu sự tác động của acid mật. Khi acid mật đi vào khu vực tá tràng thì số lượng

VSV sẽ giảm. Khả năng chịu đựng acid mật là một trong những đặc tính cần thiết của

VSV có hoạt tính probiotic [1].

 Chịu kháng sinh

Kháng sinh được ứng dụng phổ biến trong điều trị một số bệnh cho người cũng

như vật nuôi. Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích do kháng sinh mang lại thì phương

pháp trị liệu kháng sinh có một số hạn chế nhất định như là tác động loại bỏ không

phân biệt được mầm bệnh thật sự và hệ VSV có lợi trong ruột. Vì vậy, phương pháp trị

liệu này đã dẫn đến thay đổi sự cân bằng hệ VSV của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng

xấu có thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngưng sử dụng cách điều trị này.

Chính vì vậy, việc sử dụng probiotic thường được chỉ định uống trong thời gian

điều trị bệnh bằng kháng sinh, để phòng mất cân bằng hệ VSV trong đường ruột. Do

đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải có khả năng chịu đựng được kháng sinh

[77].

 Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột

Các chủng VSV probiotic khác nhau có những ảnh hưởng khác nhau lên đường

tiêu hóa. Chúng chỉ có thể tác động được khi chúng có thể sinh trưởng và phát triển tốt

Đồ án tốt nghiệp

trong đường tiêu hóa. Do vậy, bên cạnh khả năng sống sót thì chúng phải có khả năng

bám vào thành biểu mô ruột, nhờ đó chúng mới không bị rửa trôi ra ngoài cùng với

phân [67].

Sự kết bám với tế bào biểu mô ruột là một yêu cầu quan trọng cho việc định cư

lâu dài của VK probiotic trong đường ruột, chống lại sự loại bỏ do nhu động ruột và tạo

được một ưu thế cạnh tranh trong hệ VSV đường ruột (Pedersen và Tannock 1989;

Freter 1992; Alander và cộng sự 1997) [66] [68].

Bên cạnh đó vi sinh vật probiotic còn có khả năng sản sinh những chất có hoạt

tính kháng khuẩn như các acid hữu cơ, ethanol, bacteriocin, H2O2,… Những chất này

được sản sinh cùng với quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng trong đường tiêu

hóa, tác động ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ sinh thái

đường ruột.

Ngoài ra, chúng còn có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng

hóa cholesterol, lactose, tạo ra các vitamin và giải phóng nhiều enzyme có lợi giúp cho

việc tiêu hóa thức ăn diễn ra dễ dàng. Bên cạnh đó, chúng còn giúp hấp thu các chất

dinh dưỡng cần thiết, khử các chất có khả năng gây ung thư, các hợp chất độc hại, kích

thích điều hòa hệ miễn dịch cơ thể chủ, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể vật chủ,…

[71] [75].

1.2.5. Cơ chế tác động chung của probiotic

Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể vật chủ, chúng tác động lên

đường tiêu hóa của vật chủ theo những cơ chế như cạnh tranh và đối kháng với các VK

gây bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của

cơ thể vật chủ,…

 Cạnh tranh và đối kháng với các VK gây bệnh

Hệ vi sinh vật ở đường tiêu hóa mất cân bằng do nhiều nguyên nhân khác nhau,

một trong những nguyên nhân chính là do việc sử dụng kháng sinh dài ngày dẫn đến

Đồ án tốt nghiệp

việc tiêu diệt các VSV có lợi trong ruột. Để khắc phục điều này, người ta thường bổ

sung các VSV có lợi thông qua sử dụng probiotic. Các VSV probiotic sẽ phát triển,

chiếm ưu thế trong đường ruột bằng cách cạnh tranh về mặt vị trí bám, về hấp thu chất

dinh dưỡng và khối lượng các chất được sản sinh. Từ đó, ức chế và tiêu diệt được VSV

gây hại, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột.

Trong một nghiên cứu cho thấy, khi cung cấp thường xuyên các VSV có lợi dưới

dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho người và động vật nuôi với liều lượng thích

hợp (1,2 tỷ CFU/ kg thức ăn/ ngày), sự cân bằng của hệ VSV đường ruột được duy trì

[57] [64] [74] [76] .

 Tác động kháng khuẩn do sản sinh một số chất kháng khuẩn

Probiotic tác động không chỉ thông qua sự phát triển, gia tăng về số lượng cạnh

tranh vị trí bám với VK gây bệnh, chúng còn tác động nhờ vào khả năng sản sinh các

chất có hoạt tính kháng khuẩn như kháng sinh, một số acid hữu cơ (acid lactic, acid

acetic, acid formic, acid béo, …), diacetyl, hydrogen peroxide, ethanol,… Đặc biệt,

nhiều chủng VSV còn sản xuất bacteriocin và các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn

[58]. Những chất này có tác dụng ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh ở đường ruột.

 Tăng cường hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn đường ruột.

Một số chủng VSV probiotic khi được bổ sung vào đường tiêu hóa có vai trò

tăng cường hoạt động chuyển hóa của một số chủng VK đường ruột khác. Chẳng hạn

như khi sử dụng L. rhamnosus dưới dạng sữa lên men, chúng kích thích hoạt động

enzyme và khả năng biến dưỡng của VK đường ruột [57].

 Điều hòa phản ứng miễn dịch

Vi sinh vật probiotic có thể có khả năng điều hòa phản ứng miễn dịch thông qua

ảnh hưởng lên lympho bào B. Như khi cho chuột sử dụng L. plantarum ATCC 14917

và L. fermentum YIT 0159, chúng sẽ kích thích sự đồng hóa P3PH - thymidine trong tế

bào lách ở chuột. Ngoài ra, L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159 cũng

Đồ án tốt nghiệp

có thể tăng cường bổ thể và kháng huyết thanh ở thỏ. Điều này chứng tỏ chúng kích

thích hoạt động trên lympho bào B của tế bào lách [57].

Ngoài ra, VSV probiotic còn tác động lên hệ tiêu hóa của người cũng như vật

nuôi bằng những cơ chế khác, như đồng hóa lactose trong sữa,... Sự không dung hòa

lactose là tình trạng sinh lí xảy ra ở những người thiếu khả năng sản xuất enzyme

lactase hay β-galactosidase. Lactase cần thiết để đồng hóa lactose trong sữa, phân giải

chúng thành các phân tử đường glucose và galactose đơn giản. Các cá thể thiếu lactase

sẽ không tiêu hóa được sữa và thường gây ra những khó khăn trong quá trình tiêu hóa,

đặc biệt ở trẻ sơ sinh. Triệu chứng thường thấy là khó chịu ở bụng, tiêu chảy, bị vọp

bẻ, đầy hơi, nôn và buồn nôn,… khi dùng sữa. Một vấn đề khác có liên quan đến việc

không dung hòa lactose là tình trạng thiếu canxi do không dùng sữa. Ngoài ra, VK khu

trú trong ruột kết không lên men tiêu hóa được lactose sẽ sản xuất acid và khí, gây ra

các triệu chứng như đau bụng, sưng phù và tiêu chảy.

Các dòng probiotic đã được chứng minh là có thể giải quyết vấn đề không dung

hòa được lactose nhờ khả năng sản xuất lactase và tăng nồng độ β-galactosidase ở ruột

non. Do vậy, người ta cho các bệnh nhân không dung hòa được lactose sử dụng

probiotic. Các dòng probiotic sẽ thủy phân lactose trong sữa uống và lactose sẽ được

đồng hóa, đồng thời canxi cũng được hấp thu [58].

 Cơ chế bảo vệ răng miệng của vi khuẩn Probiotic nói chung và

Lactobacillus spp. nói riêng

Vi khuẩn probiotic có tác động trực tiếp lên các tế bào khác và môi trường xung

quanh chúng. Các cơ chế kháng này được chia như sau:

 Tác động trực tiếp lên tế bào vi khuẩn khác

 Tăng khả năng miễn dịch của vật chủ

 Ức chế vi khuẩn khác thông qua khả năng sinh hydrogen peroxide,

bacteriocins, và một số acid hữu cơ.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang miệng [44].

Đồ án tốt nghiệp

1.2.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc probiotic

 Các sản phẩm thực phẩm chứa probiotic từ sữa

Hình 1.4. Các dạng sản phẩm từ sữa có chứa probiotic [91]

Ở Việt Nam hiện nay, các sản phẩm thực phẩm có chứa probiotic thường được

sản xuất ở dạng sữa chua (Vinamilk, Dutch Lady…) hoặc sữa chua uống (Yakult,

Probi). Ngoài ra, gần đây còn có các sản phẩm sữa bột cho trẻ nhỏ (Nestle Nan 1, 2)

hoặc sản phẩm kẹo có chứa vi khuẩn probiotic (Kẹo Huro).

Đồ án tốt nghiệp

 Chế phẩm probiotic

Theo tổ chức lương thực và thực phẩm Quốc Tế (FAO) [82]. Một chủng VSV

được sử dụng tạo chế phẩm probiotic cần phải đảm bảo tiêu chuẩn sau đây:

 Giống dùng cho probiotic phải mang tính đại diện và được công nhận

chung về tính an toàn cho người và vật nuôi (GRAS microorganism) [65] [72].

 Có nguồn gốc từ người được chứng minh an toàn cho người.

 Có khả năng sống sót trong điều kiện acid ở dạ dày, nồng độ acid mật và

kháng sinh trong ruột.

 Có khả năng kết bám vào biểu mô ruột, định cư và tăng trưởng nhanh về

số lượng trong ruột người.

 Góp phần điều chỉnh tích cực chức năng của ruột.

 Khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng hóa cholesterol

và lactose, tạo ra các vitamin và giải phóng các enzyme có lợi giúp cho việc tiêu

hóa thức ăn được diễn ra dễ dàng, hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết và khử

các chất có khả năng gây ung thư và các hợp chất độc hại [73] [75].

 Tạo ra chất có hoạt tính kháng khuẩn và kháng mầm bệnh ở người như sản

sinh acid L - lactic và những chất ức chế VK gây hại.

 Có khả năng tiết ra các chất có hoạt tính sinh học có thể kích thích đáp

ứng miễn dịch, làm gia tăng chức năng phòng thủ của mạng lưới tế bào chủ.

 Có khả năng tồn tại trong suốt quá trình sản xuất và bảo quản bằng đông

khô.

Chế phẩm probiotic hiện nay rất đa dạng với nhiều hình thức khác nhau. Một

trong những chế phẩm probiotic được biết đến phổ biến với tên thường gọi là “men vi

sinh”. Chúng tồn tại ở các dạng như cốm, bột, lỏng, viên nén,… chứa VSV có thể ở

dạng sống, chết đông khô, xác VK. Các sản phẩm probiotic có thể phối hợp nhiều

chủng VK (như L. acidophilus, L. sprorogenes, L. kefir, Streptococcus faecalis,…)

hoặc chỉ sử dụng một chủng VK ( như L. acidophilus hay L. sprorogenes,…). [71] [75]

Đồ án tốt nghiệp

Một số chế phẩm thông dụng ở dạng men tiêu hóa trên thị trường hiện nay như

Antibio (Hàn Quốc), Probio (Việt Nam), Acidophilus (Mỹ), Biolactyl (Việt Nam),

Lactéol (Pháp), Bio - acimin (Việt Nam), Biolactyl (liên doanh Pháp), L – bio - 3D

(Việt Nam), Bioflora (Pháp),… Các chế phẩm này được sử dụng nhằm khắc phục: các

chứng bệnh về đường tiêu hóa, một số hạn chế do điều trị bằng KS dài ngày mang lại,

điều trị tiêu chảy cấp, tăng cường khả năng miễn dịch,…

1.3. Màng sinh học

1.3.1. Sự hình thành

Các tế bào vi khuẩn sinh sống trôi nổi trong môi trường lỏng (dạng phù du) vô

tình bám vào một bề mặt nào đó, và nếu sau một thời gian chúng không chịu tác động

di chuyển đi nơi khác, quá trình sinh trưởng vẫn cứ tiếp tục, dần sẽ hình thành một kiểu

khuẩn lạc trên bề mặt đó, đây là giai đoạn đầu của sự hình thành màng sinh học. Kế

đến vi khuẩn sẽ bắt đầu thay đổi thay đổi kiểu hình, khả năng sinh hóa mới để thuận lợi

hơn trong việc tổng hợp nên cơ chất ngoại bào - extracellular polymeric substance

(EPS). Phân tích về mặt hình thái học kết hợp với di truyền học, người ta xác định rằng

các tế bào xuất hiện cấu trúc tua, nhung mao hoặc tiên mao sẽ tăng thêm độ vững chắc

của màng sinh học. Giai đoạn cuối của sự hình thành màng sinh học, các tế bào sẽ một

lần nữa biến đổi quay lại dạng phù du, tách ra khỏi màng sinh học để tìm địa điểm định

cư khác, giai đoạn này gọi là giai đoạn phát tán [11].

Đồ án tốt nghiệp

Hình 0.5. Các giai đoạn hình thành màng sinh học

Hình 0.6. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử [12].

Đồ án tốt nghiệp

1.3.2. Mạng lưới polymer ngoại bào (EPS)

EPS là các polymer sinh học cao phân tử được vi sinh vật tiết ra ngoài môi trường

sống xung quanh chúng. EPS là thành phần chính, đồng thời quyết định tính hóa lý của

màng sinh học [13]. EPS chiếm từ 50 – 90% tổng lượng chất hữu cơ của một màng

sinh học [14].

EPS chủ yếu là polysaccharide và một số protein. Ngoài ra còn có một lượng nhỏ

các thành phần khác như: DNA, lipid, mùn đất. EPS là vật liệu giúp cho tế bào vi

khuẩn bám dính lên một bề mặt nào đó và đồng thời liên kết với các tế bào khác.

Đa số các loài trong chi Lactobacillus đều có khả năng tổng hợp EPS, nhưng chia

thành hai dạng. Homopolysaccharides là dạng EPS được tổng hợp từ carbohydrate chủ

yếu là dextran, glucan và levan. Trong khi dạng Heteropolysaccharides được tổng hợp

từ nucleotide. Homopolysaccharides chủ yếu được tổng hợp từ loài lên men dị hình

như L. pontis, L. frumenti, L. sanfranciscensis, và L. reuteri. Heteropolysaccharides

được tổng hợp với số lượng ít, khoảng 0.1 – 1.5 g/l bởi những loài lên men đồng hình

như L. kefiranofaciens, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. paracasei, L. rhamnosus,

L. helveticus, và L. sakei [47].

1.3.3. Tính chất

Màng sinh học có thể là cả một quần thể vi khuẩn cùng nhau sinh trưởng và phát

triển, quan hệ hợp tác hay cạnh tranh đều có thể diễn ra trong màng, phụ thuộc vào

những loài có mặt trong đó [15].

Tính kỵ nước có một phần ảnh hưởng đến khả năng tạo màng sinh học của vi

khuẩn. Vì nếu tế bào có tính kỵ nước thì lực tác động của các phân tử ngoại bào hoặc

các tế bào khác lên chúng sẽ giảm đáng kể [16]. Một số vi khuẩn không có khả năng

bám trực tiếp lên một bề mặt nào đó, nhưng lại có khả năng liên kết với mạng lưới cơ

chất ngoại bào hoặc với tế bào vi khuẩn khác. Những vi khuẩn không có khả năng di

động sẽ kéo theo hạn chế về khả năng bám dính [16].

Đồ án tốt nghiệp

Trong màng sinh học, các tế bào liên kết với nhau bằng mạng lưới do chúng tự

tổng hợp nên EPS. EPS không chỉ bao gồm polysaccharides do tế bào tổng hợp ra, mà

còn các thành phần từ môi trường xung quanh như các ion khoáng, bụi bẩn, hồng cầu,

fibrin, protein và các acid nucleic [16]. Xen kẽ với mạng lưới EPS còn có các kênh

nước, giúp vận chuyển chất dinh dưỡng và tín hiệu giữa các tế bào [17].

EPS sẽ bao phủ tế bào vi khuẩn, nhưng vẫn tạo điều kiện cho các tế bào trao đổi

tín hiệu sinh hóa cũng như trao đổi gen với nhau. EPS chính là chìa khóa quan trọng

cho việc sự hình thành, phát triển của màng sinh học. EPS còn có chức năng giữ cho

các enzyme ngoại bào gần với tế bào, giúp hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn ổn

định hơn [18].

Dù cùng loài nhưng nếu sinh trưởng trong màng sinh học thì vi khuẩn sẽ có một

số đặc tính khác biệt rõ ràng hơn so với dạng phù du. Một nghiên cứu đã cho thấy

trong một số trường hợp khả năng kháng các chất diệt khuẩn, chất kháng sinh của vi

khuẩn trong màng sinh học cao hơn gấp 1000 lần so với dạng phù du [19].

Mức độ hình thành màng sinh học phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: mật độ vi

khuẩn, hàm lượng chất dinh dưỡng, độ bão hòa, pH, thành phần dinh dưỡng trong môi

trường, độ tĩnh và hệ gen của vi khuẩn [22].

1.3.4. Phân bố

1.3.4.1. Trong tự nhiên

Màng sinh học có ở khắp nơi trong mọi cơ thể sống. Ngoài ra màng sinh học còn

có thể hình thành trong cả những môi trường cực kỳ khắc nghiệt: dưới dòng chảy

mạnh, nhiệt độ cao trong suối nước nóng, môi trường độ kiềm/acid cao, các hồ đông

lạnh.

Ta có thể dễ dàng tìm thấy màng sinh học có thể trên các tảng đá, sỏi ở những con

sông. Màng sinh học cũng nằm trong chuỗi thức ăn của động vật dưới nước. Màng sinh

học hình thành trên hoặc trong thân cây thì lại góp phần gây bệnh cho cây, ngoại trừ

Đồ án tốt nghiệp

trường hợp màng sinh học của vi khuẩn Rhizobium (vi khuẩn nốt sần) ở rễ cây họ đậu.

Một số bệnh ở cây trồng do sự hình thành màng sinh học: Citrus Canker (bệnh thối quả

ở chi cam chanh); Pierce (nho héo lá); bệnh đốm trắng cà chua, ớt [20].

Màng sinh học còn được tìm thấy bên trong các đường ống nước, đặc biệt là ống

nước thải, gây tắc nghẽn và ăn mòn. Trường hợp xuất hiện trong đường ống dẫn nước

lạnh/nóng thì sẽ giảm khả năng truyền nhiệt đáng kể [21].

Màng sinh học xuất hiện trên vỏ của các con tàu sẽ hỗ trợ cho sự neo bám của các

sinh vật khác và bùn đất. Điều này kiến cho vận tốc di chuyển của tàu giảm đi một

phần đáng kể, bên cạnh đó còn phát sinh khoảng chi phí vệ sinh đáy tàu (cạo bỏ sinh

vật biển).

Hình 0.7. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng sinh học

Đồ án tốt nghiệp

Hình 0.8. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ nước nóng Mickey, Oregon [47].

1.3.4.2. Trong cơ thể sống

a) Đường ruột

Trong cơ thể người, màng sinh học được tìm thấy nhiều nhất trong đường ruột,

một trong những môi trường ẩm ướt nhưng ấm áp, cực kỳ thuận lợi cho sự phát triển

của vi khuẩn. Một nghiên cứu gần đây đã cho rằng hệ miễn dịch trong cơ thể chúng ta

đang hỗ trợ cho vi khuẩn trong ruột già tạo mảng bám. Từ phát hiện này người ta đã

đưa ra một số giả thuyết về chức năng của ruột thừa. Trong ruột thừa chứa một lượng

lớn mảng bám vi khuẩn, vì thế khi ruột già bị tổn thương, hệ vi sinh vật trong ruột đang

mất cân bằng thì vi khuẩn trong ruột thừa có thể giúp hồi phục lại hệ vi khuẩn trong

đường ruột [23].

b) Khoang miệng

Khi xuất hiện trong khoang miệng, màng sinh học được gọi là mảng bám răng.

Chúng hình thành ở mọi nơi trong khoang miệng kể cả trên răng giả. Phần nước chiếm

Đồ án tốt nghiệp

khoảng 80 – 90% trong mảng bám, trong khi 70% phần khô là vi khuẩn, còn lại là các

hợp chất polysaccharides và glycoproteins [24].

Các yếu tố sinh thái trong khoang miệng góp phần thúc đẩy sự hình thành của

mảng bám răng. Phổ pH bình thường trong miệng là 6 – 7, trong khi màng sinh học

được hình thành trong phổ pH 6.7 – 8.3 [25]. Và ngoài vai trò như là một chất đệm,

nước bọt còn chứa một số yếu tố dinh dưỡng như acid amin, protein và glycoprotein.

Chế độ ăn uống chỉ đóng một vai trò nhỏ trong việc cung cấp nơi cư trú cho vi khuẩn

[31]. Sự oxy hóa-khử của vi khuẩn hiếu khí đã góp phần cho lượng oxy trong khoang

miệng ở trạng thái bán ổn định, tạo điều kiện cho toàn quần thể vi khuẩn tồn tại.

1.4. Sâu răng

1.4.1. Bệnh học

1.4.1.1. Định nghĩa

Sâu răng là hiện tượng các tổ chức cứng của răng (men, ngà và cement) bị tổn thương,

đặc trưng bởi sự khử khoáng ở men răng, ngà răng tạo thành các lỗ sâu và không hoàn

nguyên được. Có nhiều định nghĩa về bệnh sâu răng, dựa trên những nghiên cứu và

nhận xét khác nhau về nguyên nhân cũng như tiến trình của bệnh, sâu răng có thể được

định nghĩa như sau:

- Bệnh sâu răng là một quá trình động, diễn ra trong mảng bám vi khuẩn dính trên

mặt răng, đưa đến mất cân bằng giữa mô răng với chất dịch xung quanh và theo

thời gian, hậu quả là sự mất khoáng của mô răng [27].

- Là bệnh nhiễm trùng của mô răng biểu hiện đặc trưng bởi các giai đoạn mất và tái

khoáng xen kẽ nhau [28].

1.4.1.2. Lịch sử

Sâu răng là một bệnh phổ biến trên toàn thế giới, xảy ra ở mọi lứa tuổi, giới tính,

dân tộc. Bệnh đã có từ rất lâu đời, nhưng chỉ thực sự nghiêm trọng khi đồ ngọt trở

Đồ án tốt nghiệp

thành thứ không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người. Trong các bệnh thường

gặp ở trẻ em, sâu răng đứng thứ hai sau bệnh hen suyễn [29]. Suốt một thể kỷ qua

người ta tin rằng mọi quần xã vi sinh vật có trong miệng đều có thể gây sâu răng và

việc chữa trị duy nhất đó là đánh răng – loại bỏ các mảng bám vi khuẩn.

Trong thế chiến thức I, II và chiến tranh Triều Tiên, lý do bị từ chối đi nghĩa vụ

quân sự nhiều nhất đó là sâu răng. Cuối thế kỷ 19, với dự đoán: nếu một người sống đủ

lâu thì sau này chắc chắn sẽ không còn răng, người ta đã phân ra nhánh mới riêng biệt

trong nền y học lúc bấy giờ - nha khoa, với mức đầu tư 34 tỷ đô la (năm 1990). Tới

những năm cuối thế kỷ 20 thì bệnh sâu răng có thể kiểm soát và phòng ngừa. Gần 50%

trẻ nhỏ không bị sâu răng và tỷ lệ sún răng ở người cao tuổi giảm từ 50% xuống còn

20% [30].

Dù không nguy hiểm đến tính mạng nhưng sự khó chịu khi sâu răng và chi phí

cho việc chữa trị/phòng ngừa là không hề nhỏ (đứng thứ 3 sau tim mạch và ung thư).

1.4.1.3. Dấu hiệu và triệu chứng

Dấu hiệu sớm nhất của bệnh là sự xuất hiện các đốm phấn trắng trên bề mặt răng,

đây là vùng men răng đang bị khử khoáng [31]. Khi các thương tổn tiếp tục diễn ra thì

lúc này vùng men sẽ chuyển sang màu nâu và bắt đầu lõm xuống, gọi là lỗ sâu. Ở giai

đoạn đốm trắng, men răng vẫn có thể tái khoáng hóa bởi các ion Ca2+ có trong nước

bọt. Ở giai đoạn hình thành lỗ sâu thì men răng hoàn toàn không có khả năng tái

khoáng hóa nhưng quá trình khử khoáng vẫn có thể bị dừng lại [32].

Đồ án tốt nghiệp

Hình 0.9. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng.

Khi cả men răng và ngà răng đồng thời bị khử khoáng thì lỗ sâu càng dễ nhìn thấy

bằng mắt thường, và không cứng chắc như trước. Lúc này tủy răng và mạch máu có thể

bị hở ra, chịu tác động bởi lực bên ngoài nhiều hơn, dẫn đến các cảm giác đau nhói khi

nhai hoặc tiếp xúc với đồ ăn nóng/lạnh và kể cả ngọt.

Hình 0.10. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng.

Răng sâu còn là một trong những nguyên nhân gây hôi miệng. Trường hợp xấu

hơn là nhiễm trùng lan sang vùng mô mềm (nướu). Biến chứng có thể xảy ra là nghẽn

mạch hang xoang, viêm họng Ludwig, … đe dọa đến tính mạng của người bệnh.

Đồ án tốt nghiệp

1.4.1.4. Nguyên nhân

Cần có bốn yếu tố chính đồng thời xuất hiện để gây nên triệu chứng sâu răng:

men răng hoặc ngà răng, vi khuẩn gây sâu răng, nguồn carbohydrates (thường là

sucrose) và thời gian [33]. Mức độ sâu răng thì lại phụ thuộc vào hình dáng của răng,

thói quen vệ sinh răng miệng, thành phần nước bọt, … Sự sâu răng có thể xảy ra ở bất

kỳ nơi nào trên răng. Sâu răng là do sự xuất hiện và phát triển của mảng bám (màng

sinh học) trên răng. Các vi khuẩn trong mảng bám sinh acid khi có sự hiện diện của các

nguồn carbohydrates khác nhau như sucrose, fructose và glucose.

Hình 0.11. Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng.

a) Vi khuẩn

Khoang miệng của người chứa vô số vi khuẩn, nhưng chỉ một số ít trong đó có

khả năng gây sâu răng, đáng nói đến nhất là Streptococcus mutans, Streptococcus

sobrinus và một số loài trong chi Lactobacillus.

Đặc tính để quyết định vi khuẩn có khả năng gây sâu răng hay không bao gồm:

khả năng tạo nên màng sinh học trên bề mặt răng, sinh ra một lượng acid lactic cao khi

lên men đường, khả năng sinh trưởng trong môi trường pH thấp [34].

Đồ án tốt nghiệp

Những vi khuẩn này đa số đều có mặt trong mảng bám răng miệng, nhưng chỉ với

mật độ rất thấp, chưa đủ để gây nên sự khử khoáng men răng. Nhưng nếu không trực

tiếp vệ sinh mảng bám thường xuyên hoặc lượng đường trong miệng liên tục cao, thì sẽ

diễn ra sự mất cân bằng mật độ vi khuẩn trong mảng bám. Lúc này mật độ của những

vi khuẩn gây sâu răng sẽ tăng cao, dẫn đến sự mất cân bằng pH trong khoang miệng và

gây sâu răng. Mảng bám thường hình thành ở những nơi chịu ít tác động của quá trình

nhai nghiền thức ăn và vệ sinh răng miệng.

Những vi khuẩn gây sâu răng, thường lây từ người lớn sang trẻ nhỏ thông qua

việc bú sữa mẹ, hành động mớm ăn và hôn của người chăm sóc trẻ [35].

b) Nguồn carbohydrates

Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose, fructose và nhất là sucrose (đường

ăn) thành acid (thường là acid lactic). Khi acid tiếp xúc với răng sẽ diễn ra quá trình

khử khoáng, gây sâu răng. Dù vậy nhưng acid sinh ra bởi quá trình lên men đường của

vi khuẩn có thể bị trung hòa bởi nước bọt hoặc nước súc miệng.

Đối với môi trường có 2 nguồn đường glucose và fructose thì khả năng gây sâu

răng không cao so với môi trường chỉ có một nguồn đường sucrose. Dù rằng sucrose là

đường đôi được cấu thành từ 1 đơn vị đường đơn glucose và fructose. Lý do là vì vi

khuẩn gây sâu răng cần sử dụng năng lượng của liên kết saccharide giữ glucose và

fructose trong phân tử sucrose để tạo ra một hợp chất kết dính dextran polysaccharide

bởi enzyme dextransucranase.

n sucrose  (glucose)n + n fructose

c) Thời gian

Thời gian răng bị phơi nhiễm trong môi trường acid sẽ quyết định sự sâu răng.

Sau những bữa ăn, vi khuẩn sẽ bắt đầu lên men đường và sinh acid làm giảm pH.

Trong khoảng thời gian nước bọt có thể trung hòa lại pH môi trường trong khoang

Đồ án tốt nghiệp

miệng, thì một lượng khoáng trên men răng đã bị trung hòa. Vì thế sự khử khoáng gây

sâu răng phụ thuộc khá nhiều vào tần suất phơi nhiễm trong môi trường pH thấp.

d) Răng

Hàm lượng khoáng chiếm đến 96% trong men răng. Sự khử khoáng bắt đầu xảy

ra khi pH môi trường đạt 5.5 [36]. Ngà và lớp cementum dễ bị tổn thương hơn vì

chúng có hàm lượng khoáng thấp hơn men răng [37].

Có một số bệnh rối loạn ở răng nhất định ảnh hưởng đến mức độ gây sâu răng của

cá thể. Bệnh hụt khoáng răng ngày càng phổ biến [38]. Nguyên nhân có thể là do yếu

tố di truyền hoặc chế độ dinh dưỡng. Ngoài ra các trường hợp khác như nồng độ

dioxins, polychlorinated biphenyl (PCB) cao trong sữa mẹ; trẻ sinh non, thiếu oxy

trong lúc sinh; các rối loạn nhất định trong 3 năm đầu đời của trẻ như bệnh quai bị,

bạch hầu, sốt xuất huyết, sởi, suy giáp, suy dinh dưỡng,… cũng ảnh hưởng đáng kể đến

mật độ khoáng của răng [39] [40]. Nhưng dù sao rối loạn do bệnh tật cũng không phải

là nguyên chính gây sâu răng.

Trường hợp thức ăn bị mắc lại trong các lỗ sâu, chân răng, kẽ răng cũng là

nguyên nhân dẫn đến gây sâu răng.

e) Yếu tố khác

Khả năng tiết nước bọt thấp sẽ tăng mức độ sâu răng, do tốc độ trung hòa pH

trong môi trường khoang miệng diễn ra chậm.

Một số hiệu thuốc lá không khói chứa hàm lượng đường cao, làm tăng khả năng

gây sâu răng [41]. Việc hút thuốc có thể dẫn đến bệnh nha chu, khiến nướu co lại, để

hở chân răng và tạo khoảng trống thuận lợi cho sự hình thành mảng bám.

Đồ án tốt nghiệp

1.4.2. Điều trị

Nên kết hợp giữa đánh răng và dùng chỉ nha khoa thường xuyên để loại bỏ triệt

để mảng bám vi khuẩn. Khám răng định kỳ mỗi 6 tháng để chuẩn đoán trạng thái của

răng vì các dấu hiệu ban đầu của bệnh sâu răng rất khó nhận thấy. Hơn nữa chỉ có nha

sĩ mới có đầy đủ phương tiện và khả năng chuyên môn để chẩn đoán, điều trị và đưa ra

những lời khuyên cần thiết cho hàm răng của bạn. Nếu đợi đến khi răng đau rồi mới đi

gặp nha sĩ thì việc điều trị sẽ trở nên phức tạp hơn, có khi phải chữa tủy răng, mổ nướu

răng hay phải nhổ răng vì đã quá muộn.

Phương pháp phủ Sealant cũng nên được cân nhắc đến. Phương pháp này thường

dành cho trẻ em và thanh thiếu niên, những chất liệu nha khoa phủ trên bề mặt nhai của

răng che phủ đi tâm tinh thể HA, hạn chế được quá trình khử khoáng.

Những nghiên cứu khoa học cho thấy ngoài việc Florua đóng vai trò ức chế sự

khử khoáng của acid lên men răng, với một nồng độ cao nhất định Florua còn có khả

năng diệt khuẩn [42]. Do vậy, Florua trong các sản phẩm răng miệng là một vũ khí vô

cùng lợi hại trong việc phòng ngừa sâu răng.

Chỉ nên đáp ứng nhu cầu năng lượng của cơ thể bằng những nguồn carbohydrates

có trong trái cây, rau đậu, ngũ cốc, tinh bột. Hạn chế tối đa dùng những thực phẩm

được chế biến từ sucrose (bánh kẹo, syrups, nước ngọt). Ngoài ra trái cây, rau quả còn

có nhiều chất xơ (fiber) tác động làm sạch răng. Bên cạnh đó có thể dùng đường xylitol

thay thế các loại đường ăn thông thường để tăng khẩu vị trong thực phẩm, vì vi khuẩn

không thể lên men được xylitol. Tránh những thức ăn dẻo, loại thức ăn này rất dễ bám

quanh răng, tạo điều kiện cực kỳ thuận lợi cho mảng bám vi khuẩn phát triển.

Từ bỏ thói quen ăn ngọt giữa các bữa ăn. Ăn vặt sẽ làm tăng các khoảng thời gian

men răng phơi nhiễm trong môi trường có pH thấp.

Nếu phải uống soda, cam, chanh thì nên dùng ống hút, tránh để chúng tiếp xúc

với răng (cam chanh có tính acid sẽ khử khoáng men răng). Nên súc miệng ngay sau

khi ăn ngọt hoặc dùng xong các loại nước uống có tính acid.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường

Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

2.2. Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện trong 15 tuần, từ ngày 03/04/2017 đến ngày 16/07/2017.

2.3. Vật liệu và thiết bị

2.3.1. Thiết bị - Dụng cụ

- Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)

- Máy đo pH Horiba (Nhật Bản)

- Autoclave (Memmmert – Đức)

- Kính hiển vi quang học Olympus – Nhật Bản

- Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmmert – Đức), tủ sấy (Memmmert – Đức)

- Lò vi sóng (Microwave)

- Pipetteman 100 – 1000 µl

- Bếp điện

- Bông thấm nước, bông không thấm nước

- Giấy lọc, lame, lamell

- Các dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, que cấy, đèn cồn, bình định mức, ống

đong, pipette, …..

2.3.2. Hóa chất

Các hóa chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm, thuốc thử, chất chỉ thị màu:

Đồ án tốt nghiệp

_ Safranine

_ Ethanol 95%

_ Chất chỉ thị màu Bromoresol green, Bromocresol purple

_ Chất chỉ thị màu Methyl red, Phenol red

_ Malachite green

_ Phenolphthalein

_ NaOH, KOH

_ NaCl

_ H2O2

2.3.3. Giống vi khuẩn lactic

Sử dụng giống đã phân lập được từ đồ án “Phân lập vi khuẩn Lactic trong

khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus

spp.” của bạn Nguyễn Tuấn Anh – 1311100138 – 13DSH02.

Năm chủng vi khuẩn gây bệnh: Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium do bạn Nguyễn

Tuấn Anh – 1311100138 – 13DSH02 cung cấp.

2.4. Phương pháp luận

 Mục tiêu: Khảo sát các vi khuẩn lactic phân lập từ khoang miệng có khả năng

ức chế sự tạo thành màng sinh học Lactobacillus fermentum hay không.

 Nội dung:

_ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa.

_ Khảo sát khả năng kháng khuẩn.

_ Khảo sát khả năng kháng kháng sinh.

_ Xác định độ an toàn và khả năng ức chế màng sinh học của Lactobacillus fermentum.

LAB có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của L. fermentum

Citrate

VP - MR

Sinh H2S

Sinh dưỡng kị khí

Chịu mặn 3.5 - 6.5% NaCl

Thử nghiệm sinh hóa

Khả năng lên men carbohydrates

Thử nghiệm sinh lý

Sinh dưỡng 10oC, 45oC, 60oC

Vòng indole

Đồ án tốt nghiệp

Lactobacillus spp.

Gelatinase

β-galactosidase

Staphylococcus aureus

Khảo sát

Hệ enzyme

Bacillus subtilis

Khả năng kháng khuẩn

Caseinase

Salmonella typhimurium

Pseudomonas aeruginosa

Thủy phân hồng cầu

0oC

Chloramphenicol

Ampicilli n

Khả năng ức chế sự tạo màng

Khả năng kháng kháng sinh

sinh học của L. fermentum sau

80oC

Penicillin

Streptomycin

E.coli

100oC

khi bị xử lý nhiệt

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Đồ án tốt nghiệp

2.5. Phương pháp thí nghiệm

2.5.1. Thử nghiệm sinh lý

2.5.1.1. Khả năng sinh dưỡng ở 10oC, 45oC, 60oC trong 48 giờ

_ Bước 1: Chuẩn bị 200ml môi trường MRS broth, phối môi trường vào các ống

nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng.

_ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường đã tiệt

trùng, sau đó ủ ở nhiệt độ 10oC, 45oC, 60oC trong 24 giờ và 48 giờ

_ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận

2.5.1.2. Khả năng chịu mặn: NaCl 3,5% và 6,5% trong 48 giờ

_ Bước 1: Chuẩn bị 100ml môi trường MRS broth, NaCl 3,5% và 100ml môi

trường MRS broth, NaCl 6,5%, phối môi trường vào các ống nghiệm mỗi ống

10ml, hấp tiệt trùng.

_ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường đã tiệt

trùng, sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ.

_ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận.

Đồ án tốt nghiệp

2.5.1.3. Khả năng sinh bào tử

Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều

lipid). Đầu tiên xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và acid. Nhuộm màu

cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế

bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất

của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh

và tế bào có màu hồng.

Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già (khoảng 7 ngày) để nhuộm bào tử. Từ kết

quả thu được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương không

sinh bào tử. Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton

Nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 – 7 ngày. -

Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram. -

Nhuộm bằng dung dịch Malachite green trong 10 phút, đặt trên 1 cốc nước đun -

sôi, rửa nước, thấm khô.

Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 – 90 giây, rửa nước, thấm khô. -

Soi kính: dùng vật kính dầu 100x -

Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào sinh dưỡng có màu đỏ.

2.5.1.4. Khả năng sinh dưỡng kỵ khí

_ Bước 1: Chuẩn bị 100ml môi trường MRS broth, phối môi trường vào các ống

nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng.

_ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường đã tiệt

trùng, bơm 1 lớp parafin có độ dày 1cm, sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.

_ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận.

Đồ án tốt nghiệp

2.5.2. Thử nghiệm sinh hóa

Các phương pháp sinh hóa sau đây được thực hiện như trong mô tả của cuốn:

Microbiological Methods” C.H. Collins, P.M. Lyne, J.M. Grange & J.O. Falkinham III

(2004).

2.5.2.1. Thử nghiệm lên men carbohydrate

Thử nghiệm này nhằm kiểm tra xem vi sinh vật có khả năng lên men các loại

đường nào. Các loại đường được sử dụng là: Arabinose, Cellobiose, Galactose,

Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Mannose, Ribose, Salicin, Sorbitol, Sorbose,

Sucrose, Glycerol. Kết quả từ thí nghiệm này giúp ta định danh đến cấp giống các

chủng vi khuẩn lactic phân lập được dựa theo khóa phân loại của Bergey.

Môi trường và thuốc thử:

_ Peptone 10g

_ NaCl 5g

_ Cao thịt 1g

_ Bromocresol purple 0,17g

_ Carbohydrate 1%

(Arabinose, Cellobiose, Galactose, Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol,

Mannose, Ribose, Salicin, Sorbitol, Sorbose, Sucrose, Glycerol)

_ Nước cất 1000ml

_ Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25oC.

Tiến hành:

- Chuẩn bị môi trường test đường: Phối môi trường cơ bản (không chứa đường)

vào trong các lọ thủy tinh, sau đó đem hấp khử trùng. Đường được cân riêng lẻ trong

các eppendorf vô trùng và được phơi dưới tia UV trong 20 phút (khoảng cách với đèn

là 10cm). Sau khi hấp khử trùng môi trường cơ bản, tiến hành hòa đường vào từng lọ

Đồ án tốt nghiệp

chứa môi trường. Dùng micropipette phối 500𝜇l các loại môi trường vào các giếng

trong đĩa giếng 48.

- Dùng micropipette cấy 20𝜇l giống vào trong các giếng, ủ 37oC trong 24 giờ.

Kết quả:

Dương tính: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) thì môi

trường chuyển sang màu vàng. Việc môi trường chuyển màu không hoàn toàn cũng

được đánh giá là dương tính yếu.

Âm tính: Nếu môi trường vẫn giữ nguyên màu tím, nghĩa là vi khuẩn không có

khả năng lên men đường.

2.5.2.2. Thử nghiệm VP (Voges proskauer)

Acid pyruvic là một hợp chất quan trọng trong quá trình lên men glucose, được

tạo thành thông qua các quá trình trao đổi chất khác nhau, phụ thuộc vào các hệ thống

enzyme của các vi khuẩn khác nhau. Trong số đó sẽ có một con đường trao đổi chất

sản xuất ra acetion (acetyl methyl carbinol), một sản phẩm tạo thành của con đường

butylene glycol (sản phẩm cuối cùng của phản ứng trung hòa).

Các chủng sinh vật thuộc các nhóm Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia sẽ

sản xuất acetoin như là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất glucose và tạo

thành một lượng nhỏ acid hỗn hợp. Trong điều kiện tiếp xúc với oxy trong khí quyển

và 40% kali hydroxyde, acetoin chuyển hóa thành diacetyl, alpha-naphthol đóng vai trò

là chất xúc tác để tạo ra một phức hợp màu đỏ.

Môi trường và thuốc thử:

_ Môi trường: MR – VP broth

_ Thuốc thử:

 𝛼 – naphthol: 5g 𝛼 – naphthol + 100ml cồn tuyệt đối

 KOH 40%: 40g KOH + 100ml nước cất

Đồ án tốt nghiệp

Tiến hành:

Chuẩn bị 100ml môi trường MR – VP, phối môi trường vào các ống nghiệm -

mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng

Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường đã được tiệt -

trùng, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

- Hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào ống nghiệm sạch. Bổ sung 0,6ml 𝛼 – naphthol

5% và 0,2ml KOH 40% (Lưu ý: Bổ sung thuốc thử theo trình tự này sẽ cho kết quả tốt

nhất).

- Lắc nhẹ và giữ cố định các ống nghiệm trong 10 – 15 phút. Quan sát kết quả và

kết luận.

Kết quả:

Dương tính: ống nghiệm xuất hiện màu đỏ sau 15 phút cho thuốc thử vào. Điều

này cho thấy sự của mặt của diacetyl, do quá trình oxy hóa acetoin tạo thành.

Âm tính: màu không đổi sau khi cho thuốc thử 15 phút.

 Lưu ý: Không nên đọc kết quả sau khi cho thuốc thử hơn 1 giờ, vì khi đó môi trường

MR – VP sẽ có màu đỏ đồng do các chủng vi khuẩn âm tính VP hình thành, gây sai

lệch kết quả.

2.5.2.3. Thử nghiệm MR (Methyl red)

Xét nghiệm Methyl Red (MR) xác định xem vi khuẩn có lên men glucose tạo hỗn

hợp acid hay không. Các loại và tỉ lệ của các sản phẩm lên men là một trong những đặc

tính phân loại chính giúp phân biệt các loại vi khuẩn đường ruột khác nhau.

Trong quá trình lên men tạo hỗn hợp acid, ba acid (acetic, lactic và succinic) được

tạo thành với số lượng đáng kể. Mỗi mol glucose được lên men sẽ cho ra 4 mol các sản

phẩm có tính acid (acid lactic và chủ yếu là acetic), 1 mol các sản phẩm lên men trung

tính (ethanol), 1 mol CO2 và 1 mol H2.

Đồ án tốt nghiệp

Lượng lớn acid tạo thành làm giảm đáng kể độ pH của môi trường đến dưới

4,4. Điều này được phát hiện bằng cách sử dụng chỉ thị pH, methyl red (p-

dimethylaminoaeobenzene-O-carboxylic acid), nếu pH trên 5.1 sẽ cho màu vàng hoặc

cam và màu đỏ khi pH 4.4.

Methyl red có phổ pH phát hiện axit thấp hơn đáng kể so với các loại thuốc thử

khác được sử dụng trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Do đó, để tạo ra sự thay đổi

màu sắc, vi khuẩn thử nghiệm phải sản xuất một lượng lớn acid khi lên men

carbohydrate đang được sử dụng.

Tiến hành:

- Sử dụng các ống nghiệm nuôi cấy chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MR –

VP của thử nghiệm Voges proskauer ủ tiếp ở 37oC trong 4 ngày. Sau đó, hút 1ml dịch

nuôi cấy cho vào ống nghiệm sạch. Thêm vào mỗi ống 5 giọt Methyl red.

Kết quả:

Dương tính: xuất hiện màu đỏ sau khi thêm thuốc thử. Màu đỏ là do vi khuẩn

lên men glucose, sản xuất acid làm pH môi trường giảm xuống còn 4.4 hoặc thấp hơn.

Âm tính: không có màu đỏ xuất hiện hoặc có màu cam sau khi thêm thuốc thử.

Màu cam xuất hiện là do vi khuẩn sản xuất ít acid nên pH môi trường cao hơn 4.4.

2.5.2.4. Thử nghiệm Citrate

Thử nghiệm Citrate được sử dụng để xác định khả năng của vi khuẩn sử dụng

Natri citrate như nguồn carbon duy nhất và là nguồn nitơ cố định duy nhất (NH4H2PO4)

Khi một acid hữu cơ như citrate (trong chu trình Krebs) được sử dụng như một nguồn

cacbon và năng lượng, carbonate có tính kiềm và bicarbonate được tạo ra. Ngoài ra,

NH4OH được sản xuất khi muối amoni trong môi trường được sử dụng làm nguồn nitơ.

Việc sử dụng citrate ngoại sinh đòi hỏi sự hiện diện của các protein vận chuyển

citrate (permeases: protein mang). Khi tế bào hấp thu, citrate được tách bằng cytrate

Đồ án tốt nghiệp

lyase thành oxaloacetate và acetate. Oxaloacetate sau đó được chuyển hóa thành

pyruvate và CO2 .

Quá trình chuyển hóa phụ thuộc vào độ pH của môi trường.

 Trong môi trường kiềm: pyruvate được chuyển hóa thành acetate và

formate.

 Ở pH 7.0 và thấp hơn: lactate và acetoin cũng được sản xuất. CO2 được

giải phóng sẽ phản ứng với nước và ion natri trong môi trường để tạo ra natri

cacbonate, hợp chất kiềm sẽ làm tăng pH. Ngoài ra, NH4OH được sản xuất khi muối

amoni trong môi trường được sử dụng làm nguồn nitơ.

Quá trình tăng trưởng của vi khuẩn thường dẫn đến phản ứng làm bromothymol

blue chuyển màu từ xanh lá sang xanh dương. Chỉ thị pH bromothymol blue có màu

xanh lá đậm ở pH trung tính. Khi tăng pH đến trên 7.6, bromothymol blue chuyển sang

màu xanh dương.

Tiến hành:

- Cấy vi sinh vật lên môi trường thạch nghiêng SCA, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

- Quan sát kết quả và kết luận

Kết quả:

Dương tính: vi khuẩn mọc trên mặt nghiêng của môi trường và môi trường sẽ có

màu xanh dương. Do các cacbonate có tính kiềm và bicarbonate được tạo ra như là các

sản phẩm phụ của quá trình dị hóa citrate làm tăng pH môi trường lên trên 7.6, làm cho

bromothymol blue thay chuyển từ màu xanh lá ban đầu sang màu xanh dương.

Âm tính: không nhìn thấy vi khuẩn mọc trên mặt nghiêng của môi trường, môi

trường không đổi màu.

Đồ án tốt nghiệp

2.5.2.5. Thử nghiệm Indole

Thử nghiệm Indole được sử dụng để xác định khả năng phân tách amino acid

tryptophan để hình thành hợp chất indole. Tryptophan được thủy phân

bằng tryptophanase để sản xuất ba sản phẩm cuối - một trong số đó là indole. Indole

được phát hiện bởi chất thử Kovac’s hoặc Ehrlich có chứa 4(p) - dimethylamino

benzaldehyde , thuốc thử phản ứng với indole tạo ra một hợp chất màu đỏ.

Tiến hành:

- Cấy chủng vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường canh tryptone,

ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ.

- Thêm 0,5ml thuốc thử Kovac’s vào dịch nuôi cấy.

- Quan sát kết quả và kết luận.

Kết quả:

Dương tính: Có màu hồng sau khi thêm thuốc thử.

Âm tính: Không đổi màu sau khi thêm thuốc thử.

2.5.2.6. Thử nghiệm khả năng sinh H2S trên môi trường TSI:

Thử nghiệm nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn

carbohydrate có mặt trong môi trường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh gas trong môi

trường.

Môi trường TSI chứa các nguồn carbohydrate: lactose 1%, sucrose 1%, glucose

0,1% là môi trường rắn sử dụng trong thử nghiệm sinh hóa.

Trên môi trường này, vi sinh vật sử dụng cả 3 nguồn carbohydrate trên hay chỉ

sử dụng glucose. Quá trình lên men này có thể sinh H2S và sinh gas hay không tùy vào

từng loại vi sinh vật. Sự sử dụng các nguồn carbohydrate khác nhau ở hai điều kiện:

hiếu khí phần nghiêng và kỵ khí phần sâu.

Tiến hành:

- Sử dụng que cấy thẳng lấy một ít sinh khối vi khuẩn lactic.

Đồ án tốt nghiệp

Đâm que cấy xuyên qua môi trường thạch (giữa ống nghiệm) cho đến khi gần -

chạm đáy ống nghiệm thì ngừng lại, tiếp tục dùng que cấy đó cấy ria trên mặt nghiêng

của môi trường thạch.

Đậy nắp lỏng, ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 18 – 24 giờ. -

Quan sát kết quả và kết luận. -

Kết quả:

Nếu vi sinh vật lên men được đường lactose hoặc sucrose, tạo ra một lượng lớn

acid, làm cho chỉ thị phenol red chuyển thành màu vàng ở cả phần nghiêng và phần sâu

của môi trường. Một số chủng còn kèm theo hiện tượng tạo khí, xuất hiện các bong

bóng khí hoặc vết nứt trong môi trường.

Nếu vi sinh vật không lên men đường lactose hoặc sucrose nhưng có lên men

glucose, phần sâu của môi trường không tiếp xúc với oxy sẽ có màu vàng, nhưng ở

phần trên acid sẽ bị oxy hóa thành CO2 và nước bởi các chủng vi sinh vật vì thế phần

trên sẽ có màu đỏ (pH kiềm hoặc trung tính).

Nếu không có bất kì loại đường nào bị được lên men, cả phần sâu và phần

nghiêng của môi trường thạch sẽ có màu đỏ. Phần trên có thể có màu đỏ tím (có nhiều

kiềm) là do quá trình oxy hóa các acid amine tạo ra NH3 (peptone là một thành phần

chính của môi trường).

Nếu có H2S sinh ra, màu đen của FeSO4 sẽ xuất hiện.

2.5.3. Khả năng sinh enzyme

2.5.3.1. Khả năng sinh enzyme thủy phân gelatin

Gelatin là một protein có nguồn gốc từ collagen (protein) động vật, là một thành

phần của mô liên kết và gân trên người cũng như các động vật khác. Nó đã được sử

dụng như là một tác nhân làm đông đặc trong thực phẩm trong một thời gian

Đồ án tốt nghiệp

dài. Robert Koch sử dụng gelatin có bổ sung chất dinh dưỡng như là một loại môi

trường thạch tăng trưởng đầu tiên.

Gelatin tan trong nước ở nhiệt độ 50oC và tồn tại ở dạng lỏng khi nhiệt độ trên

25oC, đông rắn hoặc tạo gel khi nhiệt độ dưới 25oC.

Thử nghiệm này được sử dụng để xác định khả năng sinh ra các enzyme

proteolytic ngoại bào, gelatinase thủy phân gelatin. Phản ứng xảy ra gồm hai bước lần

lượt: phản ứng đầu tiên, gelatinase thủy phân gelatin thành polypeptide và sau đó

polypeptide được chuyển đổi thành các acid amin.

Acid amin bị lấy bởi các tế bào và được sử dụng cho mục đích trao đổi chất.

Sự hiện diện của gelatinase được phát hiện bằng cách sử dụng môi trường gelatin

có bổ sung dưỡng chất. Môi trường này là một môi trường đơn giản bao gồm gelatin,

peptone và cao thịt bò. Khi cấy chủng vi sinh vật có khả năng sinh gelatinase vào ống

nghiệm chứa môi trường gelatin, gelatinase tiết ra làm cho gelatin hóa lỏng, làm môi

trường hóa lỏng theo. Trong khi các sinh vật không sinh gelatinase không tiết ra

enzyme và không làm mềm môi trường.

Môi trường và thuốc thử:

_ Gelatin 120g

_ Peptone 5g

_ Cao thịt bò 3g

_ Nước cất 1000ml

_ Điều chỉnh pH = 6.8 ± 0,2 ở 25 ° C.

Chuẩn bị:

Hoà tan tất cả các thành phần trong 1000ml nước cất hoặc nước khử khoáng. -

Cho 2-3 ml môi trường vào ống nghiệm. -

Hấp khử trùng các ống nghiệm ở 121°C trong 15 phút. -

Để ống nguội ở tư thế thẳng đứng trước khi sử dụng. -

Lưu trữ môi trường đã được chuẩn bị ở 2 – 8 oC -

Đồ án tốt nghiệp

Tiến hành:

- Cấy giống vào ống nghiệm với tỷ lệ 1%. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 14

ngày.

- Sau quá trình ủ cho các ống thử nghiệm vào tủ lạnh ít nhất 30 phút để gelatin

đông tụ (Gelatin có trạng thái lỏng ở 28oC trở lên).

- Nghiêng ống nghiệm để xác định khả năng đông tụ. Kết luận kết quả.

Lưu ý: Không lắc hoặc đảo ngược ống trước khi làm lạnh. Nhẹ nhàng đảo ngược để

kiểm tra độ đặc/lỏng của các thử nghiệm sau 30 phút làm lạnh.

Kết quả:

Dương tính: Môi trường thử nghiệm hoàn toàn không còn khả năng đông tụ khi

ở nhiệt độ thấp.

Âm tính: Môi trường thử nghiệm vẫn còn khả năng đông tụ ở nhiệt độ thấp.

1. Lưu ý: Gelatinase thường hoạt động ở bề mặt môi trường. Lắc ống nghiệm khi ấm có

thể kết luận âm tính sai.

2.5.3.2. Khả năng sinh enzyme thủy phân casein

Tế bào tiết enzyme caseinase (enzyme ngoại bào) vào môi trường xung quanh,

xúc tác sự phân hủy protein sữa (casein), thành các peptide kích thước nhỏ hơn và các

amino acid riêng biệt được các vi sinh vật hấp thụ để sinh năng lượng và làm nguyên

liệu tạo nên tế bào. Phản ứng thủy phân thạch sữa, làm sữa từ màu đục trở nên trong

suốt tại khu vực vi sinh vật phát triển, vì casein sẽ chuyển hóa thành dạng hòa tan tạo

thành các sản phẩm: các chuỗi amino acid nhỏ, dipeptide, polypeptide.

Môi trường: Skim milk agar

Tiến hành:

- Cấy ria vi sinh vật cần thử nghiệm lên đĩa môi trường, sau đó ủ ở 37oC trong 24

giờ. Quan sát kết quả và kết luận.

Kết quả: Giữ đĩa ở trước ánh sáng để quan sát kết quả

Đồ án tốt nghiệp

Dương tính: có vùng trong suốt xuất hiện xung quanh vị trí khuẩn lạc phát triển.

Âm tính: không có sự thay đổi màu sắc xung quanh vị trí khuẩn lạc phát triển

2.5.3.3. Thử nghiệm tan huyết

Tan huyết là quá trình phá vỡ tế bào hồng cầu. Khả năng làm tan hồng cầu của

các vi sinh vật khi nuôi trên thạch máu được sử dụng để phân loại các vi sinh vật nhất

định. Điều này đặc biệt hữu ích khi phân loại các loài thuộc Streptococcus. Các

hemolysin là các tác nhân làm tan hồng cầu động vật.

Một số loài vi khuẩn sản xuất ra các enzyme ngoại bào có thể làm tan các tế bào

hồng cầu trong thạch máu. Các hemolysin lan ra môi trường xung quanh vùng phát

triển của vi khuẩn gây ra sự phá vỡ một phần hoặc hoàn toàn các tế bào hồng cầu.

Chúng có thể làm hồng cầu bị biến tính dẫn đến việc các tế bào hồng cầu mất màu.

Có ba dạng tan huyết: tan huyết hoàn toàn (𝛽), tan huyết không hoàn toàn (𝛼) và

không tan huyết (𝛾).

Sự tan huyết được quan sát tốt nhất bằng cách kiểm tra khuẩn lạc được nuôi cấy

trong điều kiện môi trường kỵ khí hoặc kiểm tra các khuẩn lạc dưới bề mặt.

Lưu ý: Để phân biệt các dạng tan huyết, đĩa thạch thử nghiệm phải được giữ trước

nguồn sáng.

Nếu có sự tan huyết xảy ra, sẽ có một vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc vi

khuẩn.

Môi trường: Thạch máu (Blood agar)

Tiến hành:

- Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối cấy ria chủng vi sinh vật cần thử

nghiệm lên đĩa môi trường. Sau đỏ ủ ở 37oC trong 24 giờ. Quan sát kết quả và kết luận.

Kết quả:

- Tan huyết hoàn toàn (𝛽): vòng tan huyết trong, rõ.

Đồ án tốt nghiệp

- Tan huyết không hoàn toàn (𝛼): xung quanh và dưới khuẩn lạc chuyển đục, có

màu khác.

- Không tan huyết (𝛾): không có hiện tượng tan huyết xảy ra.

2.5.3.4. Thử nghiệm 𝛽 – Galactosesidase

O-Nitrophenyl-𝛽-D-galactopyranoside (ONPG) có cấu trúc tương tự như lactose

(tức là ONPG là một chất tương tự lactose), ngoại trừ orthonitrophenyl đã thay thế cho

glucose.

Trong quá trình thủy phân, thông qua hoạt động của enzyme β-galactosidase,

ONPG đã bị thủy phân thành 2 hợp chất, galactose và o-nitrophenol. ONPG là hợp chất

không màu: O-nitrophenol có màu vàng, là nhân tố chứng tỏ quá trình thủy phân đã

xảy ra.

Vi khuẩn lên men lactose có cả hai chất ức chế lactose và β-galactosesidase, 2

enzyme cần thiết để sản xuất acid trong kiểm tra lên men lactose. Các permease

(protein mang) giúp các phân tử lactose xâm nhập vào các tế bào vi khuẩn nơi β-

galactosesidase có thể cắt đứt liên kết galactoside để sản xuất glucose và galactose.

Các vi khuẩn không lên men lactose không có enzyme và không có khả năng sản

xuất acid từ lactose.

Một số loài vi khuẩn không lên men lactose vì chúng không có protein vận

chuyển, nhưng có chứa β-galactosidase và cho kết quả dương tính với ONPG. Vì vậy

được gọi là lên men lactose muộn vì quá trình sản xuất acid từ lactose bị hoãn lại do

protein vận chuyển hoạt động chậm. Trong trường hợp này, có thể dùng một phương

pháp kiểm tra ONPG dương tính giúp nhận biết nhanh quá trình lên men lactose chậm.

Môi trường và thuốc thử:

_ Đệm phosphat natri 1M, pH 7.0

_ O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 0,75 M

_ Nước muối sinh lý

Đồ án tốt nghiệp

_ Toulene

Tiến hành:

- Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường có chứa lactose (TSI) (để tạo ra

enzym galactosidase), cho kết quả tối ưu trong thử nghiệm ONPG.

Lưu ý: enzym β-galactosidase (enzym cảm ứng) chỉ được sản xuất khi có sự hiện

diện của lactose.

Khuẩn lạc vi khuẩn được hòa trong dung dịch muối sinh lý với dung tích 0.5ml -

để tạo ra một dịch huyền phù.

Thêm một giọt toluene để giải phóng enzyme của các tế bào vi khuẩn. -

Thêm vào một lượng dung dịch ONPG đã được hòa tan trong dung dịch đệm -

tương đương với lượng huyền phù.

Ủ hỗn hợp ở 37oC. -

Kết quả

Dương tính: Tốc độ thủy phân của ONPG thành o-nitrophenol có thể rất nhanh

đối với một số vi khuẩn. Tạo phản ứng màu vàng có thể nhìn thấy trong vòng 5 đến 10

phút. Màu vàng xuất hiện nghĩa là vi khuẩn đã sinh o-nitrophenol từ ONPG thông qua

hoạt động của enzyme β-galactosidase.

Âm tính: không có màu vàng xuất hiện.

Lưu ý: Hầu hết các kết quả là dương tính nếu thử nghiệm trong vòng 1 giờ. Tuy

nhiên, nếu thử nghiệm kéo dài quá 24 giờ sẽ không còn kết quả chính xác.

Đồ án tốt nghiệp

2.5.4. Khả năng kháng khuẩn

Sử dụng phương pháp đo độ đục:

Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có trong môi

trường. Trong một thời gian nhất định, mối quan hệ giữa số lượng vi sinh vật trong

nước tỷ lệ tuyến tính với độ đục của môi trường.

Định lượng vi sinh vật trong môi trường bằng máy đo độ đục hay máy so màu ở

bước sóng 550 – 610nm.

Trong phương pháp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính giữa độ đục

và số lượng vi sinh vật trong môi trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp.

Tiến hành:

- Nuôi cấy các chủng Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium trong môi trường LB lỏng ở 37oC

trong 24 giờ.

Nuôi cấy các chủng lactic trong môi trường MRS ở 37oC trong 24 giờ. -

Cho 1,5ml dịch tăng sinh 24 giờ của các chủng đối kháng vào tủ đông -70oC -

trong 30 phút nhằm gây thương tổn tế bào. Sau đó ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng trong

10 phút để thu dịch.

- Lần lượt phối 100μl canh trường của các chủng đối kháng và 100μl dịch tăng

sinh của các chủng gây bệnh vào đĩa giếng 96.

- Đối chứng âm: 100μl dịch tăng sinh + 100μl môi trường MRS + 2mg

Cloramphenicol. Đối chứng dương: 100μl dịch tăng sinh + 100μl môi trường MRS.

Mỗi thí nghiệm lặp lại 2 lần. Ghi nhận số đo OD 2 lần ở bước sóng λ=600nm, -

một lần sau khi cấy và một lần sau khi ủ 24 giờ.

Đồ án tốt nghiệp

2.5.5. Khả năng kháng kháng sinh

Vì mức độ thuận tiện, hiệu quả tốt nhưng ít tốn kém chi phí nên phương pháp

khuếch tán đĩa có lẽ là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để xác định tính kháng

kháng sinh trong các phòng thí nghiệm.

Môi trường tăng trưởng thông thường sử dụng là MRS agar, đầu tiên vi khuẩn

cần thử nghiệm (đã làm thuần) được pha loãng đến nồng độ khoảng 10-8 bằng nước

muối sinh lý, sau đó cấy trang lên đĩa môi trường.

Các giấy tẩm kháng sinh thương mại, mỗi loại được ngâm tẩm trước với nồng độ

chuẩn của một loại kháng sinh cụ thể, sau đó dùng giấy kháng sinh đặt lên bề mặt

thạch. Kháng sinh xét nghiệm ngay lập tức bắt đầu khuếch tán ra khỏi đĩa, tạo ra một

gradient nồng độ kháng sinh trong thạch.

Ủ qua đêm ở 37oC, quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên mỗi đĩa. Nếu vi khuẩn

nhạy cảm với một kháng sinh đặc biệt, sẽ có 1 vùng vi khuẩn không phát triển có thể

nhìn thấy rõ ràng xung quanh giấy tẩm kháng sinh. Lúc này, có thể kết luận vi khuẩn

đã bị ức chế bởi kháng sinh đó (nồng độ kháng sinh tối thiểu đủ để ức chế vi khuẩn).

Vùng ức chế này sẽ được đo bằng đơn vị milimet (mm) và được so sánh với biểu đồ

chuẩn để phân loại xem vi khuẩn này dễ dàng bị ức chế, có thể kiểm soát được hay có

thể kháng lại kháng sinh.

Kết quả: Sau khi quan sát và đo đường kính vòng kháng, để có thể đưa ra kết luận ta

sẽ dựa vào bảng phân loại sau:

Bảng 2.1. Phân loại khả năng kháng kháng sinh dựa vào đường kính vòng kháng [1]

Khả năng kháng kháng sinh Đường kính vòng kháng (mm)

Kháng mạnh (R: Resistant) 13 trở xuống

Trung bình (I: Intermediate) 14 – 16

Kháng yếu (S: Sensitive) 17 trở lên

Đồ án tốt nghiệp

2.5.6. Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau khi qua

xử lý nhiệt

Dịch tăng sinh 24h của các vi khuẩn lactic chọn lọc không tạo màng sinh học

(non-biofilm group - NBG) sau khi điều chỉnh thông số OD600 về gần bằng 0.8 thì sẽ

được chia làm 3 phần để xử lý ở 3 mốc nhiệt độ 0oC, 80oC, 100oC trong 30 phút. Thí

nghiệm khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic sau khi

qua xử lý nhiệt được mô tả trong hình 2.2. Mỗi ô nghiệm thức chứa 100 µl dịch tăng

sinh vi khuẩn lactic đã xử lý nhiệt, 100 µl môi trường LBM, 1% giống các chủng tạo

màng sinh học (biofilm group – BG).

Đối chứng âm: 200 µl môi trường LBM, 1% giống chủng tạo màng sinh học. Đối

chứng dương: 100 µl dịch tăng sinh vi khuẩn lactic đã xử lý nhiệt, 100 µl môi trường

LBM. Mọi nghiệm thức đều được lặp lại 3 lần.

Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế màng sinh học sau khi vi khuẩn lactic bị xử lý nhiệt

Tiến hành định lượng màng sinh học và xác định khả năng kháng theo như

phương pháp đã được mô tả như trên.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý

Từ hai mươi bảy chủng vi khuẩn lactic của đề tài “Phân lập vi khuẩn lactic trong

khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus spp.”

mười chủng được tuyển chọn có khả năng ức chế màng sinh học của ba chủng chỉ thị

(Lactobacillus fermentum 1B, L. fermentum 12R2 và L. fermentum 30B2) lên đến 50%.

Trong thí nghiệm này vì mục tiêu hướng tới là vi khuẩn chi Lactobacillus ứng dụng

làm probiotic/prebiotic trong nên nhóm thực hiện đồ án sẽ loại bỏ chủng cầu khuẩn

16B.

Các chuỗi thí nghiệm sinh hóa, sinh lý sẽ được tiến hành trên các chủng trực

khuẩn được cấp bởi Nguyễn Tuấn Anh bao gồm chủng: 7B2, 8R2, 21R2, 21B2, 23B1,

23B2, 26R1.

Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý

Chịu mặn

Sinh dưỡng 45oC + + + + + + + 60oC + + + + + + + 10oC + + + + + + + 3,5% + + + + + + + 6,5% - + - + + + + Sinh bào tử - - - - - - - Sinh dưỡng kỵ khí + + + + + + + 7B2 8R2 21R2 21B2 23B1 23B2 26R1

(+, dương tính; -, âm tính)

Các thử nghiệm sinh lý nhằm chọn lọc đặc tính probiotic của LAB gồm khả năng

bền nhiệt, chịu acid, chịu mặn và chịu được môi trường muối mật [61]. Nhưng vì hệ

sinh vật mà nhóm thực hiện đồ án mong muốn các LAB sẽ có tác động trực tiếp lên đó

Đồ án tốt nghiệp

là hệ sinh vật trong khoang miệng. Vì thế thí nghiệm khảo sát các khả năng chịu acid

và chịu được môi trường muối mật sẽ không được tiến hành. Bên cạnh đó, ba thử

nghiệm sinh lý: Khả năng sinh dưỡng ở 10oC, 45oC, 60oC; Khả năng chịu mặn: NaCl

6,5%, 6,5%; Khả năng sinh dưỡng kỵ khí là những thử nghiệm định tính, kết quả dựa

trên sự xuất hiện của sinh khối dưới đáy ống nghiệm hoặc môi trường chuyển từ trong

suốt sang đục.

Nhìn chung tất cả các chủng sinh dưỡng ở 10oC và 45oC. Theo Ibourahema và

cộng sự (2008) [53], khả năng sinh dưỡng được ở nhiệt độ cao là một đặc điểm tốt vì

nó có thể gia tăng tốc độ tăng trưởng của LAB, hơn nữa nó sẽ mang tính tích cực khi

ứng dụng các LAB vào sản xuất sản phẩm lên men, thông qua việc hạn chế bớt sự tạp

nhiễm của các vi khuẩn khác.

Thử nghiệm khả năng sinh dưỡng ở môi trường có các nồng độ muối khác nhau

nhằm đánh giá mức độ thẩm thấu tế bào. Môi trường có nồng độ muối cao sẽ ảnh

hưởng đáng kể lên các hoạt động trao đổi chất các LAB. Bên cạnh đó theo Adnan và

Tan (2007) [59], khả năng chịu mặn của LAB đóng vai trò quan trọng trong việc ứng

dụng các LAB vào sản phẩm lên men. Các sản phẩm lên men sau quá trình ủ có thể đạt

ngưỡng pH rất thấp, có thể làm giảm mức độ ưa thích cho người tiêu dùng. Để khắc

phục việc này người ta thường trung hòa sản phẩm lên men bằng dung dịch kiềm, theo

sau đó các acid tự do sẽ chuyển thành dạng muối của nó. Vì thế nếu LAB không thể

chịu được nồng độ muối cao thì sau quá trình trung hòa acid, lượng tế bào giảm sút,

ảnh hưởng trực tiếp lên chất lượng sản phẩm.

Nhìn chung kết quả của các thử nghiệm sinh lý, chỉ có các chủng 8R2, 21B2,

23B1, 23B2 và 26R1 là khác biệt về khả năng sinh trưởng trong môi trường NaCl 6.5%

(Bảng 3.1). Vì thế nếu đánh giá về mặt ứng dụng vào sản phẩm lên men, các chủng

này sẽ có tiềm năng cao hơn hẳn.

Đồ án tốt nghiệp

 Kết quả: Cả 7

chủng vi khuẩn lactic

đều không sinh bào tử.

Hình 3.1. Kết quả nhuộm bào tử bằng Malachite green của các chủng lactic

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh dưỡng kỵ khí. Dưới đáy ống nghiệm có xuất hiện sinh khối, chứng tỏ các chủng đều tăng trưởng bình thường khi không có khí O2.

3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa

Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa

TSI MR VP Citrate Indole

- + - - - - - Màu đen - - - - - - - Khí - - - - - - - - - - - - - - 7B2 8R2 21R2 21B2 23B1 23B2 26R1

+ - + - + - + - + - + - - + (+: dương tính; -: âm tính)

Thông qua kết quả thử nghiệm sinh hóa (Bảng 3.2) tất cả các chủng đều có khả

năng sản xuất và duy trì các sản phẩm acid bên trong môi trường trong quá trình lên

men glucose, nhưng một số chủng lại có thêm khả năng tạo thành một số sản phẩm

trung tính (acetoin) là 8R2 qua thử nghiệm MR – VP. Theo Hammes và cs (2009), các

loài trong chi Lactobacillus cho thử nghiệm Indole, Citrate âm tính và không có khả

Đồ án tốt nghiệp

năng sinh khí H2S. Từ các kết quả thí nghiệm trên, có thể xác định được các chủng vi

khuẩn lactic này thuộc chi Lactobacillus.

Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm Citrate (+: Salmonella typhimurium)

Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm H2S

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.5. Kết quả thử nghiệm Indole (+:Escherichia coli)

Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm lên men carbohydrate

7B2 + 8R2 + 21R2 + 21B2 + 23B1 + 23B2 + 26R1 + Arabinose

+ + + + + - + Cellobiose

+ + + + + + + Galactose

+ + + + + + + Glucose

+ + + + + + + Lactose

+ - + + + + + Maltose

+ + + + - - + Mannitol

+ + + + + - + Mannose

+ + + + + + + Ribose

+ + + + + - + Salicin

+ - - - - - + Sorbitol

- - - - - - - Sorbose

+ + + + + + + Sucrose

- - - - - - - Glycerol

(+: dương tính; -: âm tính)

Đồ án tốt nghiệp

Thông qua bảng kết quả thử nghiệm lên men carbohydrate (Bảng 3.3) có thể kết

luận được khả năng lên men đường của ba chủng 8R2, 21R2 và 21B2 là tương đương

với nhau, duy chỉ có maltose 8R2 không có khả năng lên men. Ngoài ra, hai chủng 7B2

và 26R1 có khả năng lên men các loại đường giống nhau, ngoại trừ Sorbose và

Glycerol. Đối với chủng 23B1 và 23B2 khả năng lên men khá giống nhau nhưng 23B2

không thể lên men được Cellobiose, Mannose và Salicin. Tóm lại, hai chủng có khả

năng sử dụng đa dạng các nguồn carbohydrate là 7B2 và 26R1.

Hình 3.6. Kết quả lên men carbohydrate của các chủng lactic

Đồ án tốt nghiệp

3.3. Kết quả khả năng sinh enzyme

Bảng 3.4. Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng lactic

Casein Gelatin Tan huyết

- - - - - - - 𝜷 - galactosidase + + + + + + + - - - - - - - + (𝛼) - (𝛾) + (𝛼) + (𝛼) + (𝛼) + (𝛼) + (𝛼) 7B2 8R2 21R2 21B2 23B1 23B2 26R1 (+: dương tính; -: âm tính)

(𝛼): Tan huyết không hoàn toàn

(𝛾): Không tan huyết

Thông qua kết khảo sát về khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn được

thể hiện trong bảng 3.4 có thể thấy rằng, tất cả các chủng đều không thể sinh enzyme

để thủy phân Casein, Gelatin. Đối với thử nghiệm β – galactosidase, do có kết quả đều

là dương tính nên có thể rút ra kết luận, các chủng này đều có khả năng lên men lactose

có trong sữa từ đó tạo thành các sản phẩm lên men từ sữa.

Riêng với thử nghiệm tan huyết, quan sát kết quả ở hình 3.7, xung quanh khu vực

phát triển của hai chủng 8R2 và 21R2 không có sự đổi màu thành trong suốt nghĩa là

không có sự tan huyết, nên có thể kết luận chúng thuộc dạng 𝛾, các chủng còn lại có

thể quan sát thấy xung quanh và dưới khuẩn lạc trở nên trong hơn nhưng chưa phải

hoàn toàn trong suốt, vì vậy có thể kết luận chúng thuộc dạng 𝛼.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm tan huyết của các chủng lactic

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Casein

Hình 3.9. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Gelatin

Đồ án tốt nghiệp

Một số người không thể tiêu hóa được đường lactose là do cơ thể họ không thể

tổng hợp được enzyme β-galactosidase. Vì vậy khi tiêu thụ các sản phẩm có chứa

đường lactose, chủ yếu là các sản phẩm từ sữa, cơ thể họ sẽ mắc phải các triệu chứng

như đau bụng, chuột rút và có thể tiêu chảy (Lin và cộng sự, 1991), việc lên men các

sản phẩm từ sữa bởi vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase sẽ giúp cho những

người không tiêu hóa được lactose không mắc phải những triệu chứng khó chịu trên và

cảm giác an toàn hơn khi dùng sữa.

Hình 3.10. Tất cả các chủng đều chuyển sang màu vàng cho kết quả dương tính với thử nghiệm β- galactosidase.

Đồ án tốt nghiệp

3.4. Kết quả khả năng kháng khuẩn

Dựa vào hình 3.11, tất cả các LAB khảo sát đều có khả năng kháng khuẩn. Trong

đó, nổi bật nhất là bốn chủng 8R2, 7B2, 21B2 và 26R1 với khả năng kháng trên 70% ở

cả năm chủng vi gây bệnh. Khả năng kháng khuẩn của LAB chủ yếu là dựa vào khả

năng tổng hợp và phân tán các chất như acid lactic, ethanol, CO2 và một số bacteriocin

ra ngoài môi trường xung quanh chúng (Rattanachaikunsopon và cs, 2010). Mức độ

tổng hợp nên các chất này phụ thuộc vào khả năng sinh hóa của từng chủng và điều

kiện môi trường dinh dưỡng.

Tỷ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic

7B2

8R2

21R2

21B2

23B1

23B2

26R1

16B

Bacillus subtilis

100

Staphylococcus aureus

E.coli

Salmonella typhimurium

Pseudomonas pseudomonas

Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic

Với tất các chỉ tiêu Bacillus subtilis, E.coli, Pseudomonas, Salmonella

typhimurium, Staphylococcus aureus, từ số liệu bảng 3.5 có thể thấy được chủng 8R2

có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất còn chủng 23B2 lại kháng yếu nhất. Ở hai chỉ tiêu

E.coli, Pseudomonas, chủng 26R1 có khả năng kháng tương đương với 8R2. Ở chỉ tiêu

Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, chủng 26R1 và 7B2 có tính kháng tương

Đồ án tốt nghiệp

đương nhau nhưng ở E.coli, Pseudomonas, Salmonella typhimurium, 7B2 lại có tính

kháng thấp hơn 26R1. Đối với các chỉ tiêu Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium,

các chủng có xu hướng kháng yếu dần lần lượt từ chủng 21B2, 21R2, 23B1, riêng

Pseudomonas, chủng 8R2 có tính kháng cao hơn 23B1. Cuối cùng, với chỉ tiêu E.coli,

chủng 21R2 kháng yếu hơn 21B1 nhưng lại cao hơn 23B1, còn ở Staphylococcus

aureus, 21B2 và 21R2 lại tương đương nhau và cao hơn 23B1.

Bảng 3.5. Tỉ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic (%)

E.coli

Pseudomonas

Bacillus subtilis

7B2

0.00g ± 0.00

0.00f ± 0.00

Salmonella typhimurium 90.82b ± 0.48 88.93b ± 0.29 77.99b ± 0.35 82.95c ± 0.81 93.51a ± 0.61 93.64a ± 0.48 80.31a ± 0.18 91.89a ± 0.46 8R2 21R2 78.73d ± 0.66 64.41d ± 0.54 62.97d ± 0.76 70.92e ± 0.69 21B2 88.30c ± 0.47 82.92d ± 0.66 71.34c ± 0.45 79.77d ± 0.63 23B1 53.66e ± 0.79 49.76e ± 0.63 44.50e ± 0.92 37.99g ± 0.45 0.00h ± 0.00 23B2 0.00g ± 0.00 26R1 91.14b ± 0.40 92.52a ± 0.72 79.36a ± 0.32 86.77b ± 0.55

Staphylococcus aureus 83.36b ± 0.86 90.25a ± 0.56 75.04c ± 0.87 76.73c ± 0.94 51.90d ± 0.73 0.00f ± 0.00 82.16b ± 0.83 (Kết quả được so sánh theo cột trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy là 99%)

Đồ án tốt nghiệp

3.5. Kết quả khả năng kháng kháng sinh

Bảng 3.6. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic

Vòng kháng sinh (mm)

Ampicillin Cloramphenicol Streptomycin Penicillin

25 (S) 33 (S) 7 (R) 20 (S) 7B2

25 (S) 34 (S) 11 (R) 35 (S) 8R2

14 (I) 27 (S) 8 (R) 25 (S) 21R2

16 (I) 30 (S) 10 (R) 32 (S) 21B2

18 (S) 30 (S) 10 (R) 33 (S) 23B1

26 (S) 37 (S) 10 (R) 27 (S) 23B2

25 (S) 31 (S) 7 (R) 18 (S)

26R1 Chú thích: - Am: Đĩa giấy dùng trong kỹ thuật KSĐ - ĐKS Ampicillin 10µg (1)

- Cl: Đĩa giấy dùng trong kỹ thuật KSĐ - ĐKS Chloramphenicol 30µg (2)

- Sm: Đĩa giấy dùng trong kỹ thuật KSĐ - ĐKS Streptomycin 10µg (3)

- Pn: Đĩa giấy dùng trong kỹ thuật KSĐ - ĐKS Penicillin 1 Ul (4)

- Mức độ kháng kháng sinh: + (R) Resistant: Kháng mạnh

+ (I) Intermediate: Trung bình

+ (S) Sensitive: Kháng yếu

Dựa vào kết quả của bảng 3.6, ở kháng sinh Am, hai chủng 21B2 và 21R2 có khả

năng kháng mạnh nhất, tuy nhiên khi so với bảng phân loại, khả năng kháng của chúng

chỉ ở mức trung bình. Các chủng còn lại có khả năng kháng tương đương nhau, đều ở

mức kháng yếu, tuy nhiên yếu nhất là 4 chủng 23B2, 26R1, 7B2, 8R2, riêng chủng

23B1 kháng mạnh hơn cả.

Ở kháng sinh Pn, tất cả các chủng đều có mức kháng kháng sinh yếu. Trong đó,

chủng kháng yếu nhất là 8R2 và mạnh nhất là chủng 26R1.

Đồ án tốt nghiệp

Trong thử nghiệm kháng kháng sinh khác của đề tài “Detection of antibiotic

resistance in probiotics of dietary supplement” [88], kết quả nghiên cứu cho thấy, các

vùng ức chế có bán kính > 0,5 cm được đo từ vùng khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ các

lô probiotic thương mại đối với các loại kháng sinh ampicillin, erythromycin,

clindamycin, cephalexin và tetracycline, cho thấy chúng không có khả năng kháng đối

với những kháng sinh này. So sánh với kết quả của thử nghiệm khảo sát đang thực

hiện, có thể kết luận các giống vi khuẩn lactic có khả năng kháng yếu đối với các

kháng sinh thuộc nhóm 𝛽 – lactamin (Ampicillin và Penicillin).

Ở kháng sinh Cl, tất cả các chủng đều thể hiện khả năng kháng yếu, tuy nhiên,

kháng yếu nhất là chủng 23B2 và mạnh nhất là chủng 21R2.

Ở kháng sinh Sm, các chủng vi khuẩn đều có khả năng kháng mạnh, mạnh nhất là

hai chủng 26R1 và 7B2 và khả năng kháng của chúng cũng tương đương với chủng

21R2. Riêng chủng 8R2 và ba chủng còn lại kháng yếu hơn.

Theo các kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học, lactobacilli nhìn chung có thể

làm giảm nồng độ của các tác nhân ức chế tổng hợp protein, chẳng hạn như

chloramphenicol, macrolides, lincosamides và tetracycline, nhưng mức độ kháng

aminoglycosides thường cao. Khả năng kháng các kháng sinh khác nhau của các chủng

lactobacilli có sự khác biệt. [89] Bên cạnh đó, streptomycin và gentamycin thuộc nhóm

aminoglycoside và khả năng kháng nhóm kháng kháng sinh này có thể nhận biết bởi

gen kháng có sẵn: Lactobacilli aminoglycoside: aac (6 ') - aph (2 "), ant (6) và aph (3') -

IIIa tương ứng [88]. Vì vậy, có thể kết luận rằng việc các giống vi khuẩn lactic đang

khảo sát có khả năng kháng được Streptomycin.

Theo báo cáo của đề tài nghiên cứu “Detection of antibiotic resistance in

probiotics of dietary supplement”[88] dựa vào các lợi ích của Probiotic đối với sức

khỏe của con người và động vật nên việc bổ sung chúng từ các nguồn thực phẩm

cũng như các chế phẩm vi sinh ngày càng phổ biến. Tuy nhiên, khi chúng ta bệnh

và cần sử dụng đến thuốc kháng sinh, các thuốc này thường được sử dụng qua

Đồ án tốt nghiệp

đường uống, chúng sẽ vào hệ tiêu hóa và hệ vi khuẩn probiotic sẽ phải đối mặt với

chúng và vì mục đích của vi khuẩn probiotic là giúp cân bằng hệ vi khuẩn trong

đường ruột nên nếu muốn làm được việc đó chúng sẽ phải có khả năng kháng lại

tác động của kháng sinh để sống sót từ đó phục hồi hệ vi khuẩn trong đường ruột,

tuy nhiên nếu vô tình trong hệ tiêu hóa lẫn vào các một vài vi khuẩn gây bệnh thì

khả năng truyền gen kháng kháng sinh từ vi khuẩn probiotic sang chúng khá cao.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.12. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic Chú thích: Am: Đĩa giấy dùng trong kỹ thuật KSĐ - ĐKS Ampicillin 10µg (1)

Cl: Đĩa giấy dùng trong kỹ thuật KSĐ - ĐKS Chloramphenicol 30µg (2)

Sm: Đĩa giấy dùng trong kỹ thuật KSĐ - ĐKS Streptomycin 10µg (3)

Pn: Đĩa giấy dùng trong kỹ thuật KSĐ - ĐKS Penicillin 1 Ul (4)

Đồ án tốt nghiệp

3.6. Kết quả khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic

sau khi qua xử lý nhiệt

Tỷ lệ ức chế khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau xử lý nhiệt

100

1 R 6 2

2 B 3 2

100

1 B 3 2

12R2

2 B 1 2

30B2

100

2 R 1 2

2 R 8

100

2 B 7

100

120

140

(1B, 12R2, 30B2: Các chủng vi khuẩn tạo màng sinh học)

Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ ức chế khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau khi xử lý nhiệt

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.7. Kết quả ức chế khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn lactic sau khi xử lý

nhiệt

L. fermentum NBG Nhiệt độ xử lý 1B 12R2 30B2

80 7B2

100

80 8R2

100

80 21R2

100

21B2 80

100

23B1 80

100

23B2 80

100

26R1 80

14.15bc ± 0.61 2.32b ± 0.15 0.00a ± 0.07 0.00c ± 0.06 0.00b ± 0.10 0.69a ± 0.03 11.87c ± 0.07 3.83b ± 0.17 0.00a ± 0.06 32.90ab ± 0.80 26.28a ± 0.64 0.30a ± 0.05 35.66a ± 0.55 0.00b ± 0.05 0.00a ± 0.06 0.00c ± 0.05 0.00b ± 0.02 1.92a ± 0.12 0.00c ± 0.04 0.00b ± 0.04 4.98a ± 0.19 0.00a ± 0.68 0.00b ± 0.07 0.00b ± 0.10 0.00a ± 0.10 0.00b ± 0.18 0.00b ± 0.06 0.00a ± 0.20 0.00b ± 0.13 0.00b ± 0.04 1.41a ± 0.90 0.00b ± 0.75 0.00b ± 0.08 0.97a ± 0.86 0.00b ± 0.08 0.00b ± 0.02 0.00a ± 0.15 0.00b ± 0.11 6.41ab ± 0.42 0.00a ± 0.12 0.00b ± 0.14 16.12a ±0.14 100

66.31abc ± 0.08 63.36bc ± 0.09 0.76b ± 0.04 60.70bc ± 0.17 57.39bcd ± 0.18 0.00b ± 0.04 84.31ab ± 0.24 72.59ab ± 0.16 0.00b ± 0.14 85.20ab ± 1.04 79.42ab ± 0.82 0.00b ± 0.10 79.78abc ± 0.60 89.22a ± 0.07 0.00b ± 0.13 23.69d ± 0.10 24.72e ± 0.13 4.69b ± 0.44 52.73c ± 0.13 46.70cde ± 0.15 18.49a ± 0.55 (Kết quả được so sánh theo cột trên kết quả chạy SAS với mức độ tin cậy là 95%)

Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào kết quả so sánh của bảng 3.7 và đồ thị ở hình 3.13, có thể kết luận rằng,

trong tất cả chủng có bốn chủng có khả năng ức chế cả ba chủng vi khuẩn tạo màng

sinh học, trong đó hai chủng 21B2 và 23B1 chỉ có thể ức chế khi không xử lý nhiệt,

riêng hai chủng 23B2 và 26R1 có khả năng ức chế khi bị xử lý nhiệt đến 100oC.

Còn lại ba chủng 7B2, 8R2 và 21R2 chỉ có khả năng ức chế được hai chủng tạo

màng sinh học.

Quan sát tổng thể, chủng tạo màng sinh học dễ bị ức chế nhất là 30R2, tiếp theo

là 1B và cuối cùng là 12R2 khó bị ức chế nhất.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Qua các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa đồng thời dựa vào kết quả nghiên cứu của

Ellie J. C. Goldstein và cộng sự “Lactobacillus thường xuất hiện dạng tan huyết không

hoàn toàn (𝛼)”[52] cho thấy cả 7 chủng vi khuẩn lactic đều thuộc chi Lactobacillus

nên về cơ bản là an toàn cho người sử dụng.

Dựa vào kết quả thử khả năng lên men các loại carbohydrate, nhóm thực hiện đề

tài thấy rằng chỉ riêng 2 chủng 21R2 và 21B2 là có khả năng cùng loài vì khả năng lên

men đường giống nhau.

Kết quả thu được chủng 8R2, 7B2, 26R1 có khả năng kháng cả năm chủng vi

khuẩn khá tốt (tỷ lệ kháng trên 70%).

Khảo sát khả năng kháng kháng sinh, các chủng vi khuẩn lactic đều kháng mạnh

với Streptomycin, đối với 3 loại kháng sinh còn lại thì đều ở mức kháng trung bình tới

yếu.

Qua khảo sát khả năng ức chế tạo màng sinh học sau xử lý nhiệt, nhận thấy hai

chủng 21B2, 23B1 có phổ ức chế khá tốt với cả 3 chủng vi khuẩn tạo màng sinh học.

Kế đến là 7B2, tuy chỉ ức chế được 2 chủng nhưng ở mức độ khá cao.

2. Kiến nghị

Khảo sát về các thử nghiệm chịu acid, chịu pH thấp, chịu sự tác động của muối

mật để xác định xem vi khuẩn lactic có khả năng trở thành chủng probiotic không.

Tiến hành thử nghiệm đối kháng trực tiếp với Lactobacillus fermentum để xác

định cơ chế gây bệnh và nguyên nhân gây bệnh chính xác hơn.

Khảo sát khả năng ứng dụng tạo các sản phẩm cụ thể có chứa vi khuẩn probiotic

có thể ức chế sự tạo màng sinh học của các vi sinh vật gây bệnh giúp chống sâu răng và

phòng ngừa các mảng bám gây sâu răng.

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu nước ngoài

[1] Stackebrandt E.Frederiksen W.,Grarrity G.M., Grimont P.A.D.,Kampfer P.,Maiden

M.C.J.,Nesme X.,Rossello-Mora R.,Swings J, TruperH.,G.,Vauterin L.,Ward A.

C.,Whitman W.B. (2002), “Report of the adhoc committee the re-evalution of the

species definition in bacteriology”, International Journal of Systematic and

Evolutionnary Microbiology, vol 52, pp. 1043-1047.

[2] Batt CA. (1999). “Latobacillus. Introduction. Encyclopedia of Food

Microbiology”. Academic Press

[3] Dubernet S, Desmasures N, Gueuguen M. (2002). “A PCR-based method for

identification of lactobacilli at the genus level.” FEMS Microbiology Letters 214: 271-

275.

[4] Thomas LV, Yu S, Ingram RE, Refdahl C, Elsser D, Delves-Broughton J. (2002)

“Ascopyrone P, a novel antibacterial derived from fungi”. J Appl Microbiol.

93(4):697-705

[5] Holzapfel, W. H., R. Geisen, and U. Schillinger. 1995. “Biological preservation of

foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade enzymes.”

[6] Cogan, T.M., T.M. Cogan and J.P. Accolas, 1995. “Dairy Starter Cultures.” 1st

Edn., John Wiley and Sons, USA., ISBN-10: 0471185841, pp: 290.

[7] Hafidh, R.R., A.S. Abdulamir, L.S. Vern and F.A. Bakar, 2010. “The inhibition of

human pathogens: Trichophyton rubrum and Trichoderma harzianum by a natural

product.” Am. J. Biochem. Biotechnol., 6: 40-46. DOI: 10.3844/ajbbsp.2010.40.46

[8] Antonio Gálvez, Hikmate Abriouel, Rosario Lucas López, Nabil Ben Omar (2007),

“Bacteriocin-based strategies for food biopreservation, International Journal of Food

Microbiology”, 120, 51–70.

Đồ án tốt nghiệp

[9] Klaenhammer TR. (1993) “Genetics of bacteriocins produced by lactic acid

bacteria”. FEMS Microbiol Rev.Sep;12(1-3):39-85

[10] C.H. Collins, P.M. Lyne, J.M. Grange & J.O. Falkinham III (2004),

“Microbiological Methods” Eighth Edition.

[11] Biology libretexts, [Online]. Available: https://bio.libretexts.org/. [Accessed 30

Dec 2016].

[12] A. F. P. J. W. Mark Keen (2010), "The clinical significance of nasal irrigation

bottle contamination,".

[13] H. H. H. D. N. T. Staudt C (2004), "Volumetric measurements of bacterial cells

and extracellular polymeric substance glycoconjugates in biofilms," Biotechnol.

Bioeng, p. 88 (5): 585–92.

[14] C. J. Donlan RM (2002), " Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant

microorganisms," Clin. Microbiol. Rev., p. 15 (2): 167–93.

[15] C. D. Nadell, J. B. Xavier and K. R. Foster (2009), "The sociobiology of biofilms,"

in FEMS Microbiology Reviews, 1 January, p. 33 (1): 206–224

[16] D. RM (2002), "Biofilms: Microbial Life on Surfaces," Emerging Infectious

Diseases., p. 8 (9): 881–890

[17] P. Stoodley, D. deBeer and Z. Lewandowski (1994), "Liquid Flow in Biofilm

Systems," Appl Environ Microbiol, p. 60 (8): 2711–2716.

[18] W. a. Flemming, in Nat. Rev. Microbiol, pp. 8, 623-633.

[19] C. J. Stewart PS (2001), "Antibiotic resistance of bacteria in biofilms," Lancet, p.

358 (9276): 135–8.

[20] B. B. O. S. S. A. L. B. Andersen PC (2007), "Influence of xylem fluid chemistry on

planktonic growth, biofilm formation and aggregation of Xylella fastidiosa," FEMS

Microbiology Letters, p. 274 (2): 210–7.

[21] W. Characklis, M. Nevimons and B. Picologlou (1981), "Influence of Fouling

Biofilms on Heat Transfer," Heat Transfer Engineering, p. 3: 23– 37.

Đồ án tốt nghiệp

[22] E. J. R. K. E. P. a. R. P. Kristi L. Frank (2007), "In Vitro Effects of Antimicrobial

Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus lugdunensis Clinical

Isolates," ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, p. 888–895.

[23] R. Bollinger, A. Barbas, E. Bush, S. Lin and W. Parker (2007), "Biofilms in the

large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix," The

Journal of Theoretical Biology, p. 249 (4): 826–831.

[24] D. J. B. P D Marsh (1995), "Dental plaque as a biofilm," Journal of Industrial

Microbiology Volume 15, p. 169.

[25] S. P. &. W. R. T. Humphrey (2001), " A review of saliva: normal composition,

flow, and function," The Journal of prosthetic dentistry, pp. 85(2), 162–69.

[26] M. A. D. D. Marsh PD (2011), "Dental plaque biofilms: communities, conflict,

and control," Periodontology 2000, pp. 55(1), 16–35.

[27] F. O. Thylstrup A (1978), "Clinical appearance of dental fluorosis in permanent

teeth in relation to histologic changes.," Community Dent Oral Epidemiol .

[28] N. W. J. J. M. H. R. A. D. W. L. M. Silverstone (1981), in “Dental caries,

Aetiology, Pathology and Prevention. 1st ed.” , London, Macmillan Pres, p. 26–27.

[29] P. J. Rees J (1995), ABC of asthma. 3 rd ed, London: BMJ Publishing Group.

[30] History of Dentistry: Ancient Origins, American Dental Association website,

January 9, 2007.

[31] R. S. King (2011), "An incipient carious lesion is the initial stage of structural

damage to the enamel, usually caused by a bacterial infection that produces tooth-

dissolving acid.," A Closer Look at Teeth May Mean More Fillings.

[32] C. Johnson (2007), Biology of the Human Dentition.

[33] S. J. Southam JC (1993), "2. Dental Caries," in Oral pathology (2nd ed.), Oxford

Univ. Press.

[34] H. JM (1982), "The microbiology of dental caries," in Dent Update, pp. 199–200,

202–4, 206–8.

Đồ án tốt nghiệp

[35] J. Douglass, Y. Li and N. Tinanoff (2008), "Association of mutans streptococci

between caregivers and their children.," in Pediatric Dentistry, p. 375–87.

[36] D. C (2003), " What is the critical pH and why does a tooth dissolve in acid?," in J

Can Dent Assoc, p. 69 (11): 722–4.

[37] M. JR (1986), "Demineralization and remineralization of root surface caries," in

Gerodontology, p. 5 (1): 25–31.

[38] R. M. D. L. K. I. Mast P (2013), "Understanding MIH: definition, epidemiology,

differential diagnosis and new treatment guidelines," Eur J Paediatr Dent (Review), p.

14 (3): 204–8.

[39] Z. M. A. A. L. H. Rashid M (2010), "Oral manifestations of celiac disease: a

clinical guide for dentists," in J Can Dent Assoc, 2011, p. 77: b39. C. G. G. F. G. P.

Giuca MR, "Oral signs in the diagnosis of celiac disease: review of the literature," in

Minerva Stomatol (Review), p. 59 (1–2): 33–43.

[40] C. G. G. F. G. P. Giuca MR (2010), "Oral signs in the diagnosis of celiac disease:

review of the literature," in Minerva Stomatol (Review), p. 59 (1–2): 33–43.

[41] B. D. D. C. A. J. B. Neville (2002), in Oral & Maxillofacial Pathology 2nd

edition, p. 347.

[42] D. A, J. Jeevarathan, M. Muthu, R. Prabhu V and Chamundeswari (2008), "Effect

of Fluoride Varnish on Streptococcus mutans Count in Saliva of Caries Free Children

Using Dentocult SM Strip Mutans Test: A Randomized Controlled Triple Blind Study,"

in International Journal of Clinical Pediatric Dentistry, p. 1 (1): 1–9.

[43] A. L. V. &. T. J. HAUKIOJA (2008), " Probiotic bacteria affect the composition

of salivary pellicle and streptococcal adhesion in vitro," Oral Microbiol Immunol, pp.

23, 336-43.

[44] H. L. S. Y.-L. T. D. G. HALLSTROM (2013), "Effect of probiotic lozenges on

inflammatory reactions and oral biofilm during experimental gingivitis.," Acta Odontol

Scand.

Đồ án tốt nghiệp

[45] D. A. W. (1990), "Microbial exopolymer secretion in ocean environment:,"

Oceanography and Marine, pp. 73-153.

[46] P. G. G. J. D. K. N. L. W. R. F. S. K.-H. W. W. (. Hammes W.P. and Hertel C.

(2009) Editors: Vos, "Lactobacillus" in “Bergey's Manual of Systematic Bacteriology”.

Volume 3: The Firmicutes, pp. 465 - 511.

[47] "Wikipedia," 11 July 2017. [Online]. Available:

https://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm. [Accessed 04 08 2009].

[48] M. A. v. d. M. H. Busscher HJ, "In vitro adhesion to enamel and in vivo

colonization of tooth surfaces by lactobacilli from a bio-yoghurt.," in Caries Res.,

1999, p. 33(5):403–404.

[49] Y.-K. H. S. T. e. a. Ahola AJ, "Short-term con-sumption of probiotic-containing

cheese and its effect on dental caries risk factors Arch Oral," in Biol, 2002, p.

47(11):799–804.

[50] P. Hasslöf, "Use of probiotics in the oral cavity," Probiotic Lactobacilli in the

context of dental caries as a biofilm-mediated disease , pp. 13 - 17, 2013.

[51] Paul De Vos, George M. Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg, Wolfgang

Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-Heinz Schleifer and William B. Whitman (2009),

“Bergey’s manual of systematic bacteriology” Second Edition, vol 3.

[52] Ellie J. C. Goldstein, Kerin L. Tyrrell, Diane M. Citron (2015)

“Lactobacillus Species: Taxonomic Complexity and Controversial Susceptibilities” “

Clinical Infectious Diseases” vol 60.

[53] Ibourahema C, Dauphin RD, Jacqueline D, Thonart P. (2008) “Characterization

of lactic acid bacteria isolated from poultry farms in Senegal” Afr J Biotechnol 7:

2006–2012

[54] Karimi O. and Pena A.S. (2003), “Probiotic: isolated bacteria strain or mixture of

different strain?”. Drug of Today, vol 39, pp. 565-597.

Đồ án tốt nghiệp

[55] Kos B., Suskovic J., Vukovic S., Simpraga M., Frece J. and Matosic S., (2003),

“Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus M92”. Journal of

Applied Microbiology, vol 94, pp. 981-987.

[56] Lin, M., Savaiano, D. And Harlender (1991) “S. Influence of nonfermented dairy

products containing bacterial starter cultures on lactose maldigestion in humans”.

Journal of Dairy Science. 1991; 74: 87-95.

[57] Young Ju Kim, Ji Hee Kang, Ji Sunlee & Myung Suklee (2001), “Study on the

bacteriocin produced by Lactobacillus sản phẩm GM 7311”. Department of

Microbiology college of nature Science Pukyong National University.

[58] S. Oh, S. H. Kim, and R. W. Worobo (2000), “Characterization and purification

of a bacteriocin produced by a potential probiotic culture, Lactobacillus acidophilus

30SC”, J Dairy Sci, pp.2747-2752.

[59] Mohd Adnan AF, Tan IK. (2007). Isolation of lactic acid bacteria from Malaysian

foods and assessment of the isolates for industrial potential. Bioresour Technol 98:

1380–1385

[60] Ouwehand A.C., Salminen S.,Isolauri E.,(2002), “Probiotics: an overview of

beneficial effects”. Antonie van Leeuwenhoek, vol 82, pp 279 -289.

[61] Pairat Sornplang and Sudthidol Piyadeatsoontorn (2016). Probiotic isolates from

unconventional sources: a review. J Anim Sci Technol. 58: 26.

[62] Rattanachaikunsopon P, Phumkhachorn P. 2010. Lactic acid bacteria: their

antimicrobial compounds and their uses in food production. Ann Biol Res 1: 218–228

[63] Yeung P.S.M ., M. E. Sanders, C.L. Kitts, R. Cano and P.S.Tong. “Species-

Species-Specific indentification of Commercial Probiotic”. Strains. J. Dairy Sci. pp.

1039 – 1051.

[64] Carbonelle, F Denneis, A. Marmonier, G Pion, R Vargues (1987), “Bacteriologie

medicale techniques usuelles”, SIMEP SA Paris, France .

Đồ án tốt nghiệp

[65] Frank J. C and Nino M (2002), “The Lactic Acid Bacteria”. Microbiology, vol 28,

pp. 281-370.

[66] Klein G., (2003), “Taxonomy, ecology and antibiotic resistance of enterococci

from food and the gastro – intestinal tract”. International Journal of Food

Microbiology, vol 88, pp. 123-131.

[67] Kakinuma Y., (1998), “Inorganic cation transpost and energy transduction in

Enterococcus hirae and other streptococci”. Microbiology and Molecular Biology, vol

62, pp. 1021 -1045.

[68] Kos B., Suskovic J.,Vukovic S., Simpraga M., Frece J. and Matosic S., (2003),

“Adhesion and aggregation ability of probiotic strains Lactobacillus acidophilus

M92”. Journal of Applied Microbiology, vol 94, pp. 981-987.

[69] Liong Min Tze (2006), “In-vivo and in-vitro cholesterol removal by Lactobacilli

and Bifidobacteria”, A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy, School

of Molecu.

[70] M. T. Liong and N. P. Shah (2005), “Acid and bile tolerance and cholesterol

removal ability of Lactobacillus strains”, American Dairy Science Association, pp. 55-

56.

[71] Song J.,Lee S –C, Kang J. –W.,Beak H-J, Suh J –W. (2004), “Phylogenetic

analysis of Streptomyces spp. Isolated from potato scab lesions in Korea on basis of

16S rDNA gen and 16S-23S rDNA internally transceibed spacer seuqnces”,

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, vol.54, pp. 203-

209.

[72] Saarela M.,Mogensen G., Fonde R.,(2000), “Probiotic bacteria: safety functional

and technological properties”. Journal of Biotechnology, vol 84, pp 197-215.

[73] Song J., Lee S.-C, Kang J.-W., Beak H.-J, Suh J.-W. (2004), “Phylogenetic

analysis of Streptomyces spp. Isolated from potato scab lesion in Korea on basis of 16S

Đồ án tốt nghiệp

rDNA gen and 16S -23S rDNA internally transceibed spacer seuqnces”, International

Journal of Systermatic and Evolutionnary Microbiology, vol.54, pp. 203-209.

Tài liệu trong nước

[74] Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), “Bệnh đường tiêu hóa

ở lợn”, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.

[75] Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo, Đỗ Anh Tuấn (2004), “Giáo trình thực

tập Bioinformatic”, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp. Hồ Chí

Minh, Lưu hành nội bộ.

[76] Lê Ngọc Tú, La Văn Chú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), “Enzyme

vi sinh vật”. Nxb Khoa học và Kỹ thuật.

[77] Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Vũ Tường Vy, Trần Thu Hoa (2007), “Khảo sát khả

năng chịu đựng acid, muối mật và KS của một số vi sinh vật là nguyên liệu sản xuất

probiotic đường uống”, Tạp chí dược học (378).

[78] Trần Thị Mỹ Trang (2006), “Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất chế

phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo”, Luận văn Thạc sỹ.Sinh học

Đại học Sư phạm Tp. HCM.

[79] Lương Đức Phẩm (2004), “Nấm men công nghiệp”, Trung Tâm Khoa Học Tự

Nhiên Và Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội

[80] Lưu Đa ̣i Kim Phươ ̣ng (2016) “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men

truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.”. Trườ ng

Đa ̣i ho ̣c Công nghê ̣ TP.HCM.

Tài liệu online

[81] http:// www.enterococcus.ouhssc.edu0T

[82] http:// www.fao.org/es/ESN/Probio.htm

[83] http:// en.wikipedia.org/wiki/Probiotic.html0

Đồ án tốt nghiệp

[84] http:// www.baomoi.com

[85] http://diaglab.vet.cornell.edu/clinpath/modules/chem/bileacids.htm.

[86]http://amrls.cvm.msu.edu/microbiology/detecting-antimicrobial-resistance/test-

methods/examples-of-antibiotic-sensitivity-tesing-methods

[87] https://microbeonline.com

[88] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4568587/

[89] http://www.ifrj.upm.edu.my/18%20(03)%202011/1)IFRJ-2011-310.pdf

[90] https://vi.wikipedia.org/wiki/Probiotic

[91] http://luanvan.co/luan-van/thu-nhan-probiotics-va-ung-dung-trong-cac-san-pham-

tu-sua-2027/

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU

Kháng khuẩn

TY LE KK Bacillus subtilis

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CHUNG

8 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 24

Number of Observations Used 24

TY LE KK Bacillus subtilis

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: TYLEKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

24019.40133 3431.34305 9215.64 <.0001

Error

5.95743

0.37234

Corrected Total 23

24025.35876

R-Square Coeff Var Root MSE TYLEKK Mean

0.999752 0.915458 0.610196

66.65471

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CHUNG

7 24019.40133 3431.34305 9215.64 <.0001

TY LE KK Bacillus subtilis

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLEKK

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.372339

Bacillus subtilis

Number of Means

Critical Range 1.455 1.518 1.559 1.588 1.611 1.628 1.643

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N CHUNG

93.5131 3 8R2

91.1437 3 26R1

90.8218 3 7B2

88.3008 3 21B2

78.7288 3 21R2

53.6601 3 23B1

37.0694 3 8B

0.0000 3 23B2

Đồ án tốt nghiệp

TY LE KK E.Coli

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CHUNG

8 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 24

Number of Observations Used 24

E.Coli

TY LE KK E.Coli

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: TYLEKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

20702.25382 2957.46483 8578.05 <.0001

Error

5.51634

0.34477

Corrected Total 23

20707.77016

R-Square Coeff Var Root MSE TYLEKK Mean

0.999734 0.876959 0.587172

66.95552

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CHUNG

7 20702.25382 2957.46483 8578.05 <.0001

TY LE KK E.Coli

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLEKK

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.344771

Number of Means

Critical Range 1.400 1.461 1.500 1.528 1.550 1.567 1.581

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N CHUNG

93.6382 3 8R2

92.5211 3 26R1

88.9260 3 7B2

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N CHUNG

82.9240 3 21B2

64.4096 3 21R2

63.4689 3 8B

49.7563 3 23B1

0.0000 3 23B2

Đồ án tốt nghiệp

TY LE KK Pseudomonas pseudomonas

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CHUNG

8 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 24

Number of Observations Used 24

TY LE KK Pseudomonas pseudomonas

The ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLEKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

16361.10803 2337.30115 9358.04 <.0001

Model

3.99622

0.24976

Error

Corrected Total 23

16365.10425

R-Square Coeff Var Root MSE TYLEKK Mean

0.999756 0.877805 0.499764

56.93338

Pseudomonas pseudomonas

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CHUNG

7 16361.10803 2337.30115 9358.04 <.0001

TY LE KK Pseudomonas pseudomonas

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLEKK

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.249764

Number of Means

Critical Range 1.192 1.243 1.277 1.301 1.319 1.334 1.345

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N CHUNG

80.3109 3 8R2

79.3622 3 26R1

77.9828 3 7B2

71.3350 3 21B2

62.9657 3 21R2

44.5031 3 23B1

39.0073 3 8B

0.0000 3 23B2

Đồ án tốt nghiệp

TY LE KK Salmonella typhimurium

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CHUNG

8 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 24

Number of Observations Used 24

TY LE KK Salmonella typhimurium

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: TYLEKK

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

21471.56860 3067.36694 10541.4 <.0001

Error

4.65571

0.29098

Corrected Total 23

21476.22431

R-Square Coeff Var Root MSE TYLEKK Mean

0.999783 0.876488 0.539427

61.54419

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CHUNG

7 21471.56860 3067.36694 10541.4 <.0001

TY LE KK Salmonella typhimurium

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLEKK

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.290982

Number of Means

Critical Range 1.286 1.342 1.378 1.404 1.424 1.439 1.452

Salmonella typhimurium

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N CHUNG

91.8911 3 8R2

86.7677 3 26R1

82.9528 3 7B2

79.7682 3 21B2

70.9150 3 21R2

42.0682 3 8B

37.9906 3 23B1

0.0000 3 23B2

Đồ án tốt nghiệp

TY LE KK Staphylococcus aureus

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CHUNG

8 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 24

Number of Observations Used 24

TY LE KK Staphylococcus aureus

The ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLEKK

Staphylococcus aureus

100

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

25612.99748 3658.99964 6858.86 <.0001

Error

8.53552

0.53347

Corrected Total 23

25621.53301

R-Square Coeff Var Root MSE TYLEKK Mean

0.999667 1.242746 0.730390

58.77230

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CHUNG

7 25612.99748 3658.99964 6858.86 <.0001

TY LE KK Staphylococcus aureus

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for TYLEKK

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.53347

Number of Means

Critical Range 1.742 1.817 1.866 1.901 1.928 1.949 1.966

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N CHUNG

90.2502 3 8R2

83.3566 3 7B2

82.1591 3 26R1

76.7286 3 21B2

Đồ án tốt nghiệp

101

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N CHUNG

75.0431 3 21R2

51.8985 3 23B1

10.7423 3 8B

0.0000 3 23B2

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure Class Level Information

Class Levels Values

NBG

9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

UC CHE 1B O 0DO

The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

4746.776658

593.347082

5.17 0.0018

Error

2067.391963

114.855109

Corrected Total 26

6814.168621

R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean

0.696604 88.61963 10.71705

12.09331

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NBG

8 4746.776658 593.347082

5.17 0.0018

Khả năng ức chế màng sinh học sau xử lý nhiệt Ức chế 1B ở 00C UC CHE 1B O 0DO

102

UC CHE 1B O 0DO

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

114.8551

Đồ án tốt nghiệp

Error Mean Square

Number of Means

Critical Range

18.38 19.29 19.86 20.26 20.54 20.76 20.93 21.06

Duncan Grouping

Mean

N NBG

35.659

3 23B1

32.900

3 21B2

14.260

3 8B

14.149

3 7B2

11.871

3 21R2

0.000

3 16B

0.000

3 23B2

0.000

3 26R1

0.000

3 8R2

Means with the same letter are not significantly different.

103

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure Class Level Information

Class Levels Values

NBG

9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 27

Ức chế 1B ở 800C UC CHE 1B O 80DO

Number of Observations Used 27

UC CHE 1B O 80DO

The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

1851.200732 231.400092

4.79 0.0028

Error

869.677465

48.315415

Corrected Total 26

2720.878197

R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean

0.680369 138.3042 6.950929

5.025828

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NBG

8 1851.200732 231.400092

4.79 0.0028

UC CHE 1B O 80DO

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

48.31541

Number of Means

Critical Range

11.92 12.51 12.88 13.14 13.32 13.47 13.58 13.66

104

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean

N NBG

26.282

3 21B2

11.482

3 8B

3.834

3 21R2

2.317

3 7B2

1.318

3 23B1

0.000

3 16B

0.000

3 23B2

0.000

3 26R1

0.000

3 8R2

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NBG

9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

Ức chế 1B ở 1000C UC CHE 1B O 100DO

105

UC CHE 1B O 100DO

The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

93.5157741 11.6894718

1.08 0.4207

Error

195.2819830 10.8489991

Corrected Total 26

288.7977571

R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean

0.323811 238.1836 3.293782

1.382875

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NBG

8 93.51577407 11.68947176

1.08 0.4207

UC CHE 1B O 100DO

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

10.849

Number of Means

Critical Range

5.650 5.928 6.104 6.225 6.314 6.381 6.433 6.474

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N NBG

4.978 3 26R1

4.396 3 8B

1.918 3 23B2

0.695 3 8R2

0.300 3 21B2

Đồ án tốt nghiệp

106

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N NBG

0.158 3 16B

0.000 3 21R2

0.000 3 23B1

0.000 3 7B2

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NBG

9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

UC CHE 12R2 O 0DO

The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

7.66898483 0.95862310

0.96 0.4927

Error

17.89930657 0.99440592

Corrected Total 26

25.56829140

R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean

0.299941 272.5161 0.997199

0.365923

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NBG

8 7.66898483 0.95862310

0.96 0.4927

Ức chế 12R2 ở 00C UC CHE 12R2 O 0DO

107

UC CHE 12R2 O 0DO

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.994406

Number of Means

Critical Range

1.711 1.795 1.848 1.885 1.912 1.932 1.948 1.960

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N NBG

1.4085 3 21B2

0.9677 3 23B1

0.9171 3 8B

0.0000 3 16B

0.0000 3 21R2

0.0000 3 23B2

0.0000 3 7B2

0.0000 3 26R1

0.0000 3 8R2

Đồ án tốt nghiệp

108

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NBG

9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

UC CHE 12R2 O 80DO

The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

70.3853638

8.7981705

2.00 0.1051

Error

78.9899259

4.3883292

Corrected Total 26

149.3752897

R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean

0.471198 366.9740 2.094834

0.570840

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NBG

8 70.38536383

8.79817048

2.00 0.1051

UC CHE 12R2 O 80DO

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

4.388329

Number of Means

Critical Range

3.593 3.770 3.882 3.959 4.016 4.059 4.092 4.117

Ức chế 12R2 ở 800C UC CHE 12R2 O 80DO

109

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N NBG

5.138 3 8B

0.000 3 16B

0.000 3 21R2

0.000 3 21B2

0.000 3 23B2

0.000 3 26R1

0.000 3 7B2

0.000 3 23B1

0.000 3 8R2

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NBG

9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

Ức chế 12R2 ở 1000C UC CHE 12R2 O 100DO

110

UC CHE 12R2 O 100DO

The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

727.633897

90.954237

2.57 0.0459

Error

637.074597

35.393033

Corrected Total 26

1364.708495

R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean

0.533179 233.2837 5.949204

2.550202

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NBG

8 727.6338972 90.9542371

2.57 0.0459

UC CHE 12R2 O 100DO

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

35.39303

Number of Means

Critical Range

10.20 10.71 11.02 11.24 11.40 11.53 11.62 11.69

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N NBG

16.117 3 26R1

6.414 3 23B2

0.421 3 16B

0.000 3 23B1

Đồ án tốt nghiệp

111

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N NBG

0.000 3 21R2

0.000 3 21B2

0.000 3 7B2

0.000 3 8B

0.000 3 8R2

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NBG

9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

UC CHE 30B2 O 0DO

The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

16738.71301 2092.33913

8.45 <.0001

Error

4458.11878

247.67327

Corrected Total 26

21196.83179

R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean

0.789680 25.04463 15.73764

62.83838

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NBG

8 16738.71301

2092.33913

8.45 <.0001

Ức chế 30B2 ở 00C UC CHE 30B2 O 0DO

112

UC CHE 30B2 O 0DO

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

247.6733

Number of Means

Critical Range

27.00 28.32 29.16 29.74 30.17 30.49 30.74 30.93

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N NBG

92.45 3 8B

85.20 3 21B2

84.31 3 21R2

79.78 3 23B1

66.31 3 7B2

60.70 3 8R2

52.73 3 26R1

23.69 3 23B2

20.37 3 16B

Đồ án tốt nghiệp

113

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NBG

9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

UC CHE 30B2 O 80DO

The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

13200.58602

1650.07325

10.39 <.0001

Error

2858.41696

158.80094

Corrected Total 26

16059.00298

R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean

0.822005 20.20968 12.60162

62.35440

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NBG

8 13200.58602

1650.07325

10.39 <.0001

UC CHE 30B2 O 80DO

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

158.8009

Number of Means

Critical Range

21.62 22.68 23.35 23.82 24.16 24.41 24.61 24.77

Ức chế 30B2 ở 800C UC CHE 30B2 O 80DO

114

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N NBG

92.10 3 8B

89.22 3 23B1

79.42 3 21B2

72.59 3 21R2

63.36 3 7B2

57.39 3 8R2

46.70 3 26R1

35.69 3 16B

24.72 3 23B2

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NBG

9 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2

Number of Observations Read 27

Number of Observations Used 27

Ức chế 30B2 ở 1000C UC CHE 30B2 O 100DO

115

UC CHE 30B2 O 100DO

The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

10561.68298 1320.21037

24.13 <.0001

Error

985.01321

54.72296

Corrected Total 26

11546.69619

R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean

0.914693 66.35841 7.397497

11.14779

Source DF

Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NBG

8 10561.68298 1320.21037

24.13 <.0001

UC CHE 30B2 O 100DO

The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility

Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha

0.05

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

54.72296

Number of Means

Critical Range

12.69 13.31 13.71 13.98 14.18 14.33 14.45 14.54

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N NBG

64.243 3 16B

18.488 3 26R1

12.146 3 8B

4.690 3 23B2

0.764 3 7B2

Đồ án tốt nghiệp

116

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping

Mean N NBG

0.000 3 21B2

0.000 3 21R2

0.000 3 23B1

0.000 3 8R2

Đồ án tốt nghiệp

117

Đồ án tốt nghiệp: Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH