Hội thảo khoa học khoa Công nghệ thực phẩm 2018
KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN CAO CHIẾT ETHANOL TỪ LÁ
ĐINH LĂNG POLYSCIAS FRUTICOSA (L.) HARM
Nguyễn Hồng Anh 1*, Nguyễn Thị Phụng, Trần Chí Hải
1 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP. Hồ Chí Minh, Vietnam
*Email: honganhnguyen201296@gmail.com
Ngày nhận bài: 07/7/2018; Ngày chấp nhận đăng: 12/7/2018
TÓM TẮT
Lá đinh lăng là dược liệu quý có chứa nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt
là polyphenol và saponin triterpenoid. Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản (5 oC,
30 oC, 60 oC) đến hàm lượng saponin triterpenoid tổng, polyphenol tổng và hoạt tính kháng oxy hóa
của cao chiết ethanol - lá đinh lăng trong 30 ngày bảo quản đã được tiến hành. Nghiên cứu cho thấy 3
yếu tố này có mối tương quan thuận, chặt chẽ với nhau. Sau 30 ngày bảo quản, nhiệt độ 5 oC có sự hao
hụt về hàm lượng các chỉ tiêu thấp nhất trong tất cả các điều kiện bảo quản với sự tổn thất về hàm
lượng saponin triterpenoid tổng, polyphenol tổng và khả năng kháng oxy hóa (bao gồm khả năng bắt
gốc tự do DPPH và khả năng khử Fe3+) lần lượt là 9,55%, 19,81%, 4,18% và 34,6%. Kết quả nghiên
cứu cho thấy, việc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp (khuyến cáo 5oC) giúp hạn chế tối đa sự hao tổn
các hợp chất có hoạt tính sinh học.
Từ khóa: Polyscias fruticosa(L.) Harms, Saponin triterpenoid, polyphenol tổng, kháng oxy hóa, bảo
quản, đinh lăng
1. GIỚI THIỆU
Lá đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms là dược liệu quý được sử dụng phổ biến ở vùng
Đông Nam Á, có tác dụng đáng kể trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh như viêm nhiễm, xơ vữa động
mạch, tiểu đường,.. [1] Tuy nhiên, những nhiên cứu về hoạt tính sinh học của chúng chưa được công
bố đầy đủ, đặc biệt là hoạt tính kháng oxy hóa. Sự mất cân bằng oxy hóa trong cơ thể gây ra nhiều loại
bệnh tật nguy hiểm như ung thư, xơ vữa động mạch, suy tim [2]. Để giảm nguy cơ mắc các bệnh do sự
mất cân bằng oxy hóa gây ra, các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều đến việc tạo ra các sản phẩm dược
chứa các hợp chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ tự nhiên. Trong lá đinh lăng tồn tại hai hợp chất
sinh học quan trọng là polyphenol và saponin triterpenoid, có vai trò lớn trong việc nâng cao giá trị
sinh học của cao chiết lá đinh lăng, đặc biệt là hoạt tính kháng oxy hóa. Việc sản xuất ra một sản phẩm
dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng không chỉ yêu cầu sản phẩm phải có những tính chất và công
dụng đặc trưng, mà phải đảm bảo rằng trong thời gian sử dụng, hoạt tính sinh học của sản phẩm vẫn
còn giá trị sử dụng với người tiêu dùng. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu cụ thể về ảnh hưởng của điều
kiện bảo quản đến sự thay đổi hoạt tính kháng oxy hóa trên lá đinh lăng.
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá mối tương quan giữa hàm lượng saponin
triterpenoid, hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa của cao chiết lá đinh lăng. Nghiên cứu
cũng khảo sát về tác động của nhiệt độ bảo quản (5oC, 30oC, 60oC) lên hàm lượng saponin triterpenoid
130
Nguyễn Hồng Anh, Nguyễn Thị Phụng, Trần Chí Hải
tổng, polyphenol tổng, và hoạt tính kháng oxy hóa. Từ đó đánh giá và lựa chọn nhiệt độ bảo quản phù
hợp để hạn chế sự mất mát về hoạt tính sinh học của cao chiết.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Đinh lăng lá dài, răng cưa nhỏ tại huyện Thạnh Hóa, tỉnh Long An đã được thu hái. Sau đó, lá
đinh lăng được phơi khô tự nhiên, xay, nghiền và sàng qua rây 0,3mm. Phần qua rây được bảo quản
trong các túi zip và tránh ánh sáng trực tiếp.
Bột lá đinh lăng thu được có các thông số như sau: Độ ẩm (4,21%), Protein (15,6%), Lipid
(7,25%), Cacbohydrate (49,1%) - phân tích bởi Công ty TNHH DV KHCN Khuê Nam (2/17 Phạm
Văn Bạch, phường 12, quận Tân Bình, Tp HCM).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị cao chiết ethanol
Bột đinh lăng được trích ly với ethanol 95o theo tỉ lệ 1:20 (w/v) trong 60 phút tại nhiệt độ thường.
Sau đó hỗn hợp được ly tâm (5500 vòng, 15 phút) và thu lấy dịch. Dịch thu được đem cô đặc chân
không ở 40 oC cho đến khi giá trị hệ số cô đặc là 20. Lúc này, dịch trích được gọi là cao lỏng với 1mL
cao lỏng tương đương với 1 gam bột đinh lăng [3].
2.2.2. Bảo quản cao chiết ethanol
Cao chiết sau khi chuẩn bị xong được bảo quản trong các chai vio tối màu ở các nhiệt độ 5oC,
30oC, 60oC trong vòng 30 ngày. Sau mỗi ngày bảo quản, các mẫu được tiến hành phân tích các chỉ
tiêu: hàm lượng saponin triterpeniod tổng, polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa (bao gồm khả năng
khử gốc tự do DPPH và khả năng khử Fe3+).
2.3. Phương pháp phân tích
2.3.1. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng.
Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singleton với một vài hiệu
chỉnh như sau: 0.5mL dịch chiết đã pha loãng ở nồng độ phù hợp được cho vào ống nghiệm cùng với
2,5mL thuốc thử Folin- Ciocalteu [4]. Hỗn hợp được trộn đều và ủ trong tối 5 phút trước khi thêm
2mL Na2CO3 7,5%. Sau đó, hỗn hợp được giữ trong tối 1 giờ và đo quang ở bước sóng 765nm. Hàm
lượng polyphenol tổng được quy về tương đương với hàm lượng acid gallic chuẩn có trong cao chiết
(µgGAE/mL).
2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng saponin triterpenoid tổng.
Hàm lượng saponin triterpenoid tổng được thực hiện như mô tả của Gao: 0,2mL cao đã pha loãng
ở nồng độ phù hợp được cho vào ống nghiệm cùng 0,2mL Vanillin-Acid Acetic 5%., thêm 1,2mL
Acid Perchloric, lắc đều và đem ủ ở 70oC/15 phút. Làm lạnh nhanh 2 phút, định mức tới vạch 5mL và
đo quang ở bước sóng 548nm. Hàm lượng saponin triterpenoid tổng được tính theo đơn vị mg/mL dựa
trên đường chuẩn được xây dựng với chất chuẩn là acid oleanolic [5].
131
Khảo sát điều kiện bảo quản cao chiết ethanol từ lá đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms
2.3.3. Phương pháp xác định khả năng khử Fe3+
Năng lực khử Fe3+ được xác định theo phương pháp của Oyaizu với một vài hiệu chỉnh nhỏ [6].
Lấy 1 mL dịch chiết trộn với 2,5 mL đệm phosphate pH = 6,6 trước khi thêm 0,5 mL dung dịch
K3(Fe[CN]6) 1%. Hỗn hợp được ủ ở 50ºC trong 20 phút, sau đó thêm 2,5 mL dung dịch Tricloric acid
10%. Hút ra từ các ống nghiệm trên 2,5mL dịch, thêm 2 mL nước cất và 0,5 mL dung dịch FeCl3
0,1%. Đo quang tại bước sóng 700 nm. Khả năng khử Fe3+ được tính dựa vào đường chuẩn với chất
chuẩn trolox và đơn vị là số mg Fe3+ được khử bởi 1 mL cao chiết. (mgFe3+/mL).
2.3.4. Phương pháp khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH của cao chiết được xác định theo phương pháp của Fu và Shieh
với một vài hiệu chỉnh nhỏ [7]. 1 mL cao chiết đã pha loãng ở nồng độ phù hợp trộn với 5mL DPPH
30mM. Lắc đều và ủ tối 30 phút. Đo quang tại bước sóng. 517nm. Khả năng khử gốc tự do DPPH
được tính tương đương với số miligam Trolox trên 1mL (mgTrolox/mL) có khả năng ức chế tương
đương phần trăm ức chế của cao chiết.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình và ± độ lệch
chuẩn. Phần mềm Microsoft Excel và Statgraphics XV.I được sử dụng để tính toán và vẽ biểu đồ.
3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Sự thay đổi hàm lượng và mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng
oxy hóa
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến hàm lượng polyphenol
tổng được thể hiện trên hình 3.1.
Nhìn chung, hàm lượng polyphenol tổng số trong cao chiết bảo quản ở cả ba nhiệt độ 5oC, 30 oC,
và 60 oC đều có xu hướng giảm dần theo thời gian bảo quản. Tuy nhiên, mức độ giảm của ba mẫu này
khác nhau. Cụ thể, hàm lượng polyphenol tổng ngày cuối cùng ở mẫu bảo quản ở 60oC giảm nhiều
hơn mẫu bảo quản 5oC và 30oC lần lượt là 2,78% và 8,18%. Điều đặc biệt là, trong khoảng thời gian từ
ngày đầu tiên đến ngày thứ 14 ở tất cả các mẫu, hàm lượng polyphenol hao hụt đáng kể hơn nhiều so
với khoảng thời gian còn lại của quá trình bảo quản. Điển hình như ở mẫu bảo quản 30oC, từ hàm
lượng ban đầu là 43,23 µgGAE/mL, vào ngày thứ 14 chỉ còn 35,63 µgGAE/mL, giảm hơn 17,58%
trên tổng hao hụt 25,21% của hàm lượng polyphenol tổng. Tuy nhiên từ ngày 14 trở đi, hàm lượng
polyphenol không có sự thay đổi nhiều ở cả ba điều kiện nhiệt độ, hơn nữa còn có xu hướng ổn định
vào những ngày cuối cùng của quá trình bảo quản.
Kết quả này tương tự như công bố của Zam khi nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng polyphenol
trong dịch chiết vỏ quả lựu ở các nhiệt độ bảo quản khác nhau trong 14 ngày [8]. Tác giả nhận định
rằng, nhiệt độ và thời gian bảo quản đều ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng số. Hàm lượng
polyphenol của mẫu bảo quản ở nhiệt độ thấp giảm chậm hơn nhiều so với mẫu bảo quản ở nhiệt độ
60oC và nhiệt độ phòng. Sự giảm hàm lượng này được giải thích như sau: Polyphenol là những hợp
chất có khả năng chống oxy hóa mạnh, do đó trong thời gian bảo quản, có thể một số hợp chất
polyphenol tham gia phản ứng oxy hóa để bảo vệ dịch trích khỏi sự tấn công của tác nhân oxy hóa có
sẵn trong môi trường chứa mẫu.
132
Nguyễn Hồng Anh, Nguyễn Thị Phụng, Trần Chí Hải
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng
polyphenol tổng trong thời gian bảo quản ở các
nhiệt độ khác nhau.
Hình 3.2. Mối tương quan giữa hàm lượng Polyphenol
tổng và khả năng kháng oxy hóa tại nhiệt độ bảo quản
5o C
Ở những ngày đầu tiên, khi hàm lượng oxy cao, các hợp chất polyphenol tham gia phản ứng dẫn
đến sự sụt giảm đáng kể về hàm lượng polyphenol tổng trong 14 ngày đầu. Mặt khác, nghiên cứu của
James F.Gillooly và cộng sự đã báo cáo tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nhiệt độ [9]. Vì vậy, nhiệt độ
60oC sẽ thôi thúc phản ứng diễn ra nhanh và mãnh liệt hơn so với nhiệt độ còn lại. Mặt khác, môi
trường nhiệt độ thấp (5oC) sẽ ức chế sự phân giải các hợp chất và làm chậm các quá trình oxy hóa do
vi sinh vật cũng như do các thành phần hóa lý trong môi trường tác động đến các hợp chất polyphenol.
Hình 3.3 thể hiện khả năng kháng oxy hóa của cao chiết tại các nhiệt độ bảo quản khác nhau
Hình 3.3a-b. Đồ thị sự thay đổi khả năng bắt gốc tự do DPPH(a) và khả năng khử Fe3+ (b) trong 30 ngày
bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau
Đồ thị trên cho thấy, khả năng khử Fe3+ và bắt gốc tự do DPPH cũng đi theo quy luật thay đổi của
hàm lượng polyphenol, tuy nhiên ở mẫu bảo quản 60oC, khả năng kháng oxy hóa vẫn có xu hướng tiếp
tục giảm nhẹ vào những ngày cuối cùng. Đồng thời, đồ thị cho thấy khả năng khử Fe3+ giảm dần theo
chiều tăng của nhiệt độ và thời gian bảo quản. Khả năng khử Fe3+ của cao chiết bảo quản ở 5oC giảm
hơn 31,45% từ 3,71mgTrolox/mL xuống còn 2,31mgTrolox/mL vào ngày cuối cùng. Trong khi đó, ở
các mẫu bảo quản tại 30 oC và 60 oC, sự hao hụt này lần lượt là 34,46% và 49,07%, nhiều hơn đáng kể
so với mẫu bảo quản ở nhiệt độ 5oC. Một cách tương tự, khả năng khử gốc tự do DPPH cũng cho thấy
xu hướng giảm dần khi tăng nhiệt độ và thời gian bảo quản. Theo Lu và Fu, nhóm phenolic gồm
những hợp chất có khả năng chống oxy hóa nổi trội nhất ở thực vật [10] , và được chứng minh là mạnh
hơn cả vitamin C,E và carotenoid [11].
0
10
20
30
40
50
0 5 10 15 20 25 30
Hàm lượng Poplyphenol tổng
(µgGAE/mL)
Thời gian bảo quản (ngày)
Bảo quản 5 độ C
Bảo quản 30 độ C
Bảo quản 60 độ C
y = 0.0897x - 2.8943
R² = 0.9625
y = 0.0035x + 0.7731
R² = 0.9761 0.96
0.99
1.02
1.05
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
020 40 60 80
Khả năng khử gốc ưự do
(mgTrolox/mL)
Khả năng khử Sắt
(mgFe3+/mL)
Hàm lượng PP tổng (µgGAE/mL)
Mối tương quan hàm lượng PP tổng và khả năng khử
Sắt
0.93
0.96
0.99
1.02
1.05
0 5 10 15 20 25 30
Khả năng khử gốc tự do
DPPH
(Tương đương
mgTrolox/mL)
Thời gian bảo quản (ngày)
Bảo quản 5 độ C Bảo quản 30 độ C
Bảo quản 60 độ C
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Khả năng khử Sắt (III)
(mgFe/mL)
Thời gian bảo quản (ngày)
Bảo quản 5 độ C Bảo quản 30 độ C
Bảo quản 60 độ C
133
Khảo sát điều kiện bảo quản cao chiết ethanol từ lá đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms
Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính kháng
oxy hóa tại nhiệt độ bảo quản 5oC được thể hiện ở Hình 3.2. Đồ thị cho thấy, hàm lượng polyphenol
tổng và khả năng khử Fe3+ biến thiên theo phương trình bậc nhất y= 0,0897x – 2,8943 với hệ số R2=
0,9625. Tương tự, hàm lượng polyphenol tổng cũng liên quan mật thiết với khả năng khử gốc tự do
DPPH với R2= 0.9761. Kết quả phân tích hồi quy tại các nhiệt độ khác cũng cho thấy mối tương quan
thuận cùng hệ số R2 cao giữa hai yếu tố này. Hơn nữa, mối tương quan giữa polyphenol tổng và hoạt
tính chống oxy hóa được phân tích trong nhiều nghiên cứu như: báo cáo của Bambang về rong nâu
[12], nghiên cứu của Kettawan và cộng sự về rong biển [13], đều công nhận rằng khi hàm lượng
polyphenol cao thì xu hướng hoạt động chống oxy hóa cũng tăng theo. Các nghiên cứu đi trước cũng
chỉ ra mối tương quan cao (R2 >0.92) giữa hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa.
Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, để giữ lại hàm lượng polyphenol tổng nhiều nhất, và đồng
thời cũng là giữ lại hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất thì cao chiết nên được bảo quản ở nhiệt độ càng
thấp càng tốt.
3.2. Sự thay đổi hàm lượng và tương quan giữa hàm lượng saponin triterpenoid và hoạt tính
kháng oxy hóa
Hình 3.4a thể hiện sự thay đổi hàm lượng saponin triterpenoid trong quá trình bảo quản mẫu ở
các nhiệt độ khác nhau.
Hình 3.4a-b. Sự thay đổi hàm lượng saponin triterpenoid trong thời gian bảo quản (a) và mối
tương quan với khả năng kháng oxy hóa tại 5oC (b)
Nhìn chung, hàm lượng saponin triterpenoid cho thấy một xu hướng tương tự như polyphenol
tổng và hoạt tính oxy hóa, tuy nhiên quá trình giảm hàm lượng saponin triterpenoid diễn ra xuyên suốt
trong thời gian bảo quản ở tất cả các nhiệt độ. Cụ thể, mẫu bảo quản ở 5oC cho thấy mức độ giảm
không nhiều từ hàm lượng ban đầu là 1050,12mg/mL, giảm 9,55% còn 949,79mg/mL sau 30 ngày
,trong khi mẫu bảo quản ở 30 oC và 60 oC giảm mạnh lần lượt là 29,65% và 57,82% xuống còn
738,73mg/mL và 57,82mg/mL. Mặt khác, biểu đồ cũng thể hiện xu hướng giảm mạnh hơn về hàm
lượng saponin triterpenoid theo chiều tăng của nhiệt độ bảo quản. Kết quả này cũng tương tự như
nghiên cứu X.W.Du về nhân sâm Mỹ trong 12 tuần bảo quản tại 5 oC, 20 oC, và 30oC cho thấy, hàm
lượng saponin triterpenoid ở cả ba nhiệt độ đều có xu hướng giảm và mức độ giảm ở mẫu bảo quản tại
nhiệt độ cao nhiều hơn so với mẫu bảo quản nhiệt độ thấp. Vì vậy, nhiệt độ bảo quản được X.W.Du
khuyến nghị là càng thấp càng tốt [14].
Hơn nữa, trong khoảng thời gian từ ngày 19 đến ngày 30, hàm lượng polyphenol ở cả 3 nhiệt độ
bảo quản, và hàm lượng saponin triterpenoid ở nhiệt độ 5 oC và 30 oC không thay đổi nhiều, trong khi
kết quả kiểm tra hàm lượng saponin triterpenoid và hoạt tính kháng oxy hóa ở 60 oC lại có xu hướng
tiếp tục giảm. Điều này tạm được giải thích rằng: Trong cao chiết, ngoài hợp chất polyphenol thì
saponin triterpenoid cũng đóng vai trò không nhỏ trong khả năng kháng oxy hóa của cao chiết.
134