Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên sâu xanh da láng Spodoptera exigua và xác định tác nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HIỆU LỰC DIỆT SÂU VÀ KHẢ NĂNG SINH SẢN CỦA HAI CHỦNG TUYẾN TRÙNG S – XT VÀ H – CP16 TRÊN SÂU XANH DA LÁNG Spodoptera exigua VÀ XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH CÔN TRÙNG CỦA TUYẾN TRÙNG

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Sinh viên thực hiện

: LÊ QUỐC VŨ

MSSV: 1151110545 Lớp: 11DSH05

TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Là sinh viên năm năm cuối của Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh, nay

được vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn tất chương trình học của mình. Tôi cam

đoan đây là nghiên cứu do tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học

– Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh.

Những số liệu, hình ảnh trong bài hoàn toàn trung thực chưa từng có ai công bố.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Lê Quốc Vũ

LỜI CẢM ƠN

Tận đáy lòng con xin ghi khắc công lao cha mẹ đã gian khó nuôi dạy con thành

người. Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất, là người nâng con dậy sau mỗi lần vấp

ngã, là động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống.

Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Trường

Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức

quý giá ngay từ những ngày đầu tiên bước vào giảng đường đại học.

Đặc biệt, con xin chân thành biết ơn cô Nguyễn Hoài Hương, người thầy đáng

kính, luôn hết mình chỉ dạy để con có thể hoàn thành đồ án. Và hơn thế nữa là những

lời khuyên, bài học cuộc sống cô dạy bảo, sẽ là hành trang quý báu cho con sau này.

Con cũng xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn con về

phương pháp nuôi sâu, tuyến trùng và cũng là người cho con nguồn nấm bệnh trong

những thí nghiệm. Con cũng chân thành cô Đỗ Thị Tuyến đã cho con vi khuẩn chỉ thị

và hoá chất để con có thể hoàn thành đồ án.

Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng, cô

Nguyễn Trần Thái Khanh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng

thí nghiệm.

Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH đã luôn khích lệ và giúp đỡ mình trong suốt quá

trình học tập tại trường. Cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Anh Kha, anh Nguyễn Ngọc

Phong, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, bạn Phan Nguyễn Hương Thảo, Phạm Hải Hậu, Đinh

Thị Minh Châu, Hồ Thị Bích Phương cùng em Lê Thị Ngọc Dung 12DSH01 đã cùng

đồng hành, sát cánh trong những ngày làm đồ án tốt nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn!

TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015

SVTH: Lê Quốc Vũ

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC ................................................................................................................... i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... vii

DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... x

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 4

1.1 Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) .............................................. 4

1.1.1. Khái niệm EPN ................................................................................................. 4

1.1.2. Vai trò và ƣu thế của EPN ................................................................................. 4

1.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng ......................................................... 5

1.2.1. Phân loại ............................................................................................................ 5

1.2.2. Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis ..................... 6

1.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus ....................... 7

1.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae ..................................................... 8

1.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus ......................................................... 9

1.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản .................................................................. 11

1.4. Tổng quan về Serratia marcescens .................................................................... 16

1.4.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens ........................................................... 16

1.4.2. Phân loại Serratia marcescens ........................................................................ 17

1.4.3. Đặc điểm của Serratia marcescens ................................................................. 17

1.4.3.1. Đặc điểm sinh lý ........................................................................................... 17

1.4.3.2. Đặc điểm sinh hóa ........................................................................................ 18

1.4.3.3. Đặc điểm phân bố ......................................................................................... 20

Đồ án tốt nghiệp

1.4.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens .............................. 20

1.4.4.1. Sắc tố ............................................................................................................ 20

1.4.4.2. Biosurfactants ............................................................................................... 21

1.4.4.3. Acid béo ....................................................................................................... 22

1.4.4.4. Enzyme ......................................................................................................... 22

1.4.5. Yếu tố độc lực của Serratia marcescens ......................................................... 22

1.5. Mối quan hệ cộng sinh ....................................................................................... 23

1.5.1. Vai trò của tuyến trùng .................................................................................... 23

1.5.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh ........................................................................ 24

1.5.3. Tổng quát mối quan hệ trong tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn .......................... 24

1.5.4. Mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng EPN và Serratia sp.. ...................... 28

1.6. Khái quát về các loài côn trùng bị EPN và vi khuẩn tiêu diệt ........................... 29

1.6.1. Đặc trƣng côn trùng bị EPN tiêu diệt .............................................................. 29

1.6.2. Các loài côn trùng bị EPN tiêu diệt ................................................................. 29

1.7. Khái quát về SXDL Spodoptera exigua ............................................................ 30

1.7.1. Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 30

1.7.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái ....................................................................... 30

1.6.2.1. Vòng đời (30 – 40 ngày) .............................................................................. 30

1.7.2.2. Thiên địch ..................................................................................................... 31

1.7.3. Một số biện pháp phòng trừ ............................................................................ 32

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 33

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 33

2.1.1. Thời gian ......................................................................................................... 33

2.1.2. Địa điểm .......................................................................................................... 33

Đồ án tốt nghiệp

2.2. Vật liệu – thiết bị - hoá chất ............................................................................... 33

2.2.1. Nguồn vi sinh vật ............................................................................................ 33

2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất sử dụng ....................................................... 33

2.3. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 36

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm ..................................................... 38

2.4.1. Phƣơng pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm .............................................. 38

2.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu tuyến trùng in vivo .................................................. 38

2.4.2.1 Phƣơng pháp thử nghiệm trong đĩa petri (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) ......... 38

2.4.2.2 Phƣơng pháp bẫy nƣớc thu tuyến trùng Whitetrap (White, 1927)................ 39

2.4.2.3. Phƣơng pháp lọc rửa tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2009) ................... 39

2.4.2.4. Phƣơng pháp đếm tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) ........................ 40

2.4.2.5. Phƣơng pháp bảo quản tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Phong, 2013) .............. 40

2.4.2.6. Phƣơng pháp xác định hoạt động của tuyến trùng (Albrecht M.

Koppenhofer, 2007) .................................................................................................. 41

2.4.2.7. Thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16

trên đối tƣợng SXDL tuổi ......................................................................................... 41

2.4.2.8. Thí nghiệm khảo sát sự tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm - sản lƣợng IJ

và chu kì kí sinh – phát tán của các chủng tuyến trùng trên vật chủ SXDL ............. 43

2.4.2.9. Thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S – XT, H

– CP16 bằng phƣơng pháp tiêm và bƣớc đầu xác định tác nhân gây chết................ 44

2.4.3. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn ..................................................................... 46

2.4.3.1. Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp của Akhurst (1980) và

Sun Ho Park và Yeon Su Yu (1999) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2009) ................... 46

2.4.3.2. Phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp của Lawrwnce A.

Lacey (2011) ............................................................................................................. 48

iii

Đồ án tốt nghiệp

2.4.3.3. Phƣơng pháp chứng minh nội sinh .............................................................. 48

2.4.3.4. Phƣơng pháp định lƣợng vi khuẩn nội sinh ................................................ 49

2.4.4. Phƣơng pháp định danh vi khuẩn phân lập ..................................................... 49

2.4.4.1. Phƣơng pháp kiểm tra độ thuần khiết .......................................................... 49

2.4.4.2. Phƣơng pháp quan sát hình thái, sinh lý ...................................................... 50

2.4.4.3. Thử nghiệm sinh hoá .................................................................................... 50

2.4.4.4. Phƣơng pháp định danh bằng APIKIT 20E .................................................. 50

2.4.4.5. Giải trình tự 16S rRNA ................................................................................ 50

2.4.5. Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính sinh học ........................................................ 50

2.4.5.1. Phƣơng pháp định tính enzyme .................................................................... 50

2.4.5.2. Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng kháng sinh ..................................... 51

2.4.5.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn- phƣơng pháp cấy chéo ............................ 51

2.4.5.4. Khảo sát hoạt tính kháng nấm ...................................................................... 53

2.4.5.5. Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phƣơng pháp tiêm ..................................... 53

2.4.5.6. Khảo sát sự tính tƣơng tác tổ hợp vi khuẩn và tuyến trùng EPN ................. 54

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................... 56

3.1. Kết quả đánh giá LD50 của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 ......... 56

3.1.1. Chủng S – XT .................................................................................................. 57

3.1.2. Chủng H – CP16 ............................................................................................. 58

3.2. Khả năng sinh sản của tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên SXDL ............... 60

3.2.1. Khả năng nhân của 2 chủng tuyến trùng trên SXDL tuổi 4 ............................ 62

3.2.1.1. Chủng S – XT ............................................................................................... 62

3.2.1.2. Chủng H – CP16 .......................................................................................... 63

3.2.2. Mối tƣơng quan giữa số lƣợng IJ gây nhiễm và sản lƣợng IJ sinh ra ............. 63

Đồ án tốt nghiệp

3.2.2.1. Chủng S – XT ............................................................................................... 64

3.2.2.2. Chủng H – CP16 .......................................................................................... 66

3.2.3. Chu kỳ kí sinh và phát tán của hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H –

CP16 trên SXDL ....................................................................................................... 68

3.2.3.1. Chu kỳ kí sinh hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H – CP16 trên SXDL

................................................................................................................................... 68

3.2.3.2. Chu kỳ phát tán của hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H – CP16 trên

SXDL ........................................................................................................................ 69

3.3. Xác định tác nhân gây chết sâu .......................................................................... 72

3.4. Phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng .............................................................. 75

3.5. Kết quả định lƣợng tổng số vi khuẩn trong tuyến trùng (cfu/IJ) ....................... 79

3.6. Quan sát hình thái, sinh lý .................................................................................. 80

3.7. Thử nghiệm sinh hóa .......................................................................................... 83

3.8. Kết quả định danh bằng KIT API 20E (Biomerieux) ......................................... 85

3.9. Kết quả giải trình tự rRNA 16S ......................................................................... 86

3.10. Khả năng tiết enzymme ngoại bào ................................................................... 88

3.11. Khả năng kháng kháng sinh ............................................................................. 91

3.12. Hoạt tính kháng khuẩn ..................................................................................... 94

3.14.1. Đối kháng không tiếp xúc ............................................................................. 95

3.14.2. Đối kháng tiếp xúc ........................................................................................ 96

3.13. Hoạt tính kháng nấm ........................................................................................ 98

3.14. Hiệu lực diêt sâu ............................................................................................. 101

3.17. Khảo sát sự tƣơng tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn ...................................... 104

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................ 107

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 109

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PTSH : P òng trừ sinh học

IJ : Ấu trùng xâm nhiễm (viết tắt tên tiếng Anh: Infective juveniles).

EPN : tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh:

entomopathogenic nematodes).

S-XT : Steinernema guangdongense XT

H-CP16: Heterorhabditis indica CP16

VKCS : Vi khuẩn cộng sinh.

BSL : Bƣớm sáp lớn.

SB : Serratia marcescens SB

HB : Serratia marcescens HB

VSV : Vi sinh vật.

SXDL : Sâu xanh da láng

vii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng............................................... 6

Bảng 1.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus ...................................... 9

Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus ....... 11

Bảng 1.4.Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của

Xenorhabdus / Photorhabdus .............................................................................. 12

Bảng 1.5. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Photorhabdus .................................... 14

Bảng 1.6. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus....................................... 15

Bảng 1.7. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens .......................... 19

Bảng 1.8. Vòng đời của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh ................................ 27

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H –

CP16 trên đối tƣợng SXDL tuổi 4 ...................................................................... 42

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm và sản lƣợng IJ

sinh ra đối với 2 chủng tuyến trùng .................................................................... 43

Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S

– XT, H – CP16 bằng phƣơng pháp tiêm ............................................................ 45

Bảng 3.1. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng S – XT ........................... 57

Bảng 3.2. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng H – CP16 ....................... 59

Bảng 3.3. Khả năng sinh sản của chủng S – XT trên SXDL ............................... 61

Bảng 3.4. Khả năng sinh sản của chủng H – CP16 trên SXDL .......................... 61

Bảng 3.5. Chu kỳ kí sinh của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên

SXDL ................................................................................................................... 68

Bảng 3.6. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng S – XT ...................... 70

Bảng 3.7. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng H – CP16 ................. 71

Bảng 3.8 Kết quả diệt sâu ở một số nồng độ gây nhiễm của hai chủng S – XT và H

– CP16 bằng phƣơng pháp tiêm .......................................................................... 73

Bảng 3.9. Kết quả khử trùng bề mặt tuyến trùng ................................................ 76

viii

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.10. Bảng tóm tắt đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng phân lập

............................................................................................................................ 84

Bảng 3.11. Kết quả định danh bằng KIT API 20E của hai chủng SB và HB ..... 85

Bảng 3.12. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của SB và HB .............................. 89

Bảng 3.13. Tỷ lệ đối kháng nấm của 2 chủng SB, HB ..................................... 100

Bảng 3.14. LD50, LD90 của chủng SB và HB sau 48 giờ đƣợc tiêm vào sâu . 103

Bảng 3.15. Tỷ lệ chết của S – XT sau 12 ngày .................................................. 104

Bảng 3.16. Tỷ lệ chết của H – CP16 sau 12 ngày ............................................. 104

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng ....................................... 7

Hình 1.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus ......................... 10

Hình 1.3. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) ...... 17 Hình 1.4. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở 25oC

sau 48 giờ (David, 2012) ..................................................................................... 18

Hình 1.5. Vòng đời SXDL da láng ..................................................................... 31

Hình 2.1. Quy trình khảo sát sản lƣợng, chu kì kí sinh- phát tuyến trùng trên kí chủ

SXDL và phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng ............................................... 36

Hình 2.2. Quy trình khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa và định danh vi

khuẩn .................................................................................................................... 37

Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn mới phân lập .. 37

Hình 2.4. Quy trình phân lập vi khuẩn từ tuyến trùng EPN ............................... 47

Hình 3.1. Dấu hiệu sâu chết bởi tuyến trùng ...................................................... 56

Hình 3.2. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng S – XT

trên SXDL tuổi 4 ................................................................................................. 58

Hình 3.3. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng H –

CP16 trên SXDL tuổi 4 ........................................................................................ 60

Hình 3.4. Tƣơng quan giữa số lƣơng gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra của chủng S

– XT ..................................................................................................................... 65

Hình 3.5. Tƣơng quan giữa số lƣơng gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra của chủng

H – CP16 ............................................................................................................. 67

Hình 3.6. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng S – XT ....................... 70

Hình 3.7. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng H – CP16 .................. 72

Hình 3.8. Sâu chết bởi tuyến trùng bằng phƣơng pháp tiêm ............................... 74

Hình 3.9. Khuẩn lạc vi khuẩn từ huyết tƣơng sâu trên môi trƣờng NBTA ......... 75

Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc hai chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ tuyến trùng

khử trùng bề mặt trên NBTA, MacConkey, NA và PGA .................................... 78

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng SB .................................................... 80

Hình 3.12. Hình thái khuẩn lạc của chủng HB .................................................... 81

Hình 3.13. Kết quả nhuộm Gram của hai chủng SS1 và SH1 ............................. 83

Hình 3.14. Cây phát sinh loài của SB và HB ...................................................... 88

Hình 3.15. Khả năng tiết enzyme ngoại bào ....................................................... 90

Hình 3.16. Kết quả kháng sinh đồ ....................................................................... 92

Hình 3.17. Kết quả đối kháng không tiếp xúc ..................................................... 95

Hình 3.18. Kết quả đối kháng tiếp xúc (mặt trên) ............................................... 96

Hình 3.19. Kết quả đối kháng tiếp xúc (mặt dƣới) .............................................. 97

Hình 3.20. Kết quả đối kháng với các chủng nấm ............................................ 100

Hình 3.21. Khả năng diệt sâu của SB, HB sau 48 giờ tiêm vào sâu ................. 102

Hình 3.22. Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 giờ tiêm SB vào SXDL .......... 102

Hình 3.23. Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 giờ tiêm HB vào SXDL ......... 103

Hình 3.24. Tỷ lệ chết của chủng tuyến trùng S – XT ....................................... 105

Hình 3.25. Tỷ lệ chết của chủng tuyến trùng H – CP16.................................... 105

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay ngành nông nghiệp Việt Nam đang trên đà phát triển hết sức mạnh mẽ

cả về số lƣợng và chất lƣợng, trong đó một số mặt hàng nông sản nhƣ cà phê, lúa

gạo có kim nghạch xuất khẩu cao và có vị thế trên thị trƣờng quốc tế. Nhu cầu tăng

sản lƣợng, rút ngắn thời gian sản xuất để nâng cao lợi nhuận đang đƣợc đặt ra, đi

đôi với nó luôn đòi hỏi những kiến thức để sản xuất sản phẩm an toàn.

Tuy nhiên không phải chỉ riêng Việt Nam mà hầu nhƣ tất cả các nƣớc nông

nghiệp ngƣời nông dân ít đƣợc trang bị đầy đủ kiến thức về sản xuất để đảm bảo

tính bền vững. Vì vậy ở không ít nơi ngƣời nông dân sử dụng ồ ạt các loại thuốc trừ

sâu, thuốc diệt cỏ có nguồn gốc hóa học vì không hiểu biết hay đã biết đƣợc tác hại

nhƣng vẫn cố ý sử dụng để tăng sản lƣợng, thu lợi nhuận. Chính việc sử dụng mà

không tuân thủ các quy định về liều lƣợng và cách thức đã làm dịch bệnh trở nên

nhiều hơn, nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Trong đó, SXDL da láng

(Spodoptera exigua) là một trong những loài sâu ăn tạp khá phổ biến, phá hoại trên

nhiều loại cây trồng nhƣ họ bầu bí, họ thập tự, hành, lạc, nho,… có khả năng kháng

thuốc hóa học rất cao nếu ngƣời dùng lạm dụng quá nhiều thuốc trừ sâu hóa học

không đúng cách. Vì vậy xu hƣớng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đang

trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, đảm bảo sức

khỏe cho con ngƣời, đồng thời tính an toàn môi trƣờng cao.

Trong các biện pháp sinh học đƣợc sử dụng hiện nay thì dùng tuyến trùng ký

sinh gây bệnh côn trùng (EPN) gồm hai giống Steinernema và Heterorhabditis đang

đƣợc các nƣớc trên thế giới và Việt Nam đặc biệt chú ý. Tuy nhiên, các loài tuyến

trùng EPN này sẽ không thực sự phát huy hiệu quả nếu không có mặt VKCS trong

ruột chúng là nguyên nhân chính gây ra cái chết của côn trùng. Hai loài VKCS phổ

biến từng đƣợc nghiên cứu và biết đến nhiều nhất gồm Photorhabdus, Xenorhabdus

nhƣng theo một số báo cáo gần đây thì Serratia macescens cũng có vai trò này.Với

vai trò đặc biệt, VKCS trở thành mấu chốt trong mối quan hệ giữa sâu hại – tuyến

Đồ án tốt nghiệp

trùng – vi khuẩn. Đây đƣợc coi là những loài vi khuẩn có đời sống rất đặc biệt khi

cộng sinh trong một vật chủ và gây hại cho một vật chủ khác thông qua vật chủ mà

nó cộng sinh. Mặt khác có thể thấy đƣợc khả năng kháng mạnh với các loài vi

khuẩn có hại gây bệnh cho gia súc và các loài nấm gây hại cho nông nghiệp, điều

này mở ra những ứng dụng rất lớn. Tuy nhiên ở Việt Nam hiện chỉ có một số

nghiên cứu tại Hà Nội có liên quan đến VKCS trong tuyến trùng EPN, ở các tỉnh

thành miền Nam chƣa có nghiên cứu về vấn đề phân lập và ứng dụng vi khuẩn

cộng sinh này. Trong nghiên cứu này sử dụng hai nguồn tuyến trùng gồm

Heterorhabditis indica (H – CP16) và Steinernem guangdongense (S – XT), H –

CP16 và S – XT là hai chủng tuyến trùng mới chƣa có bất kỳ nghiên cứu về các

chủng VKCS với nó cũng nhƣ việc đánh giá hiệu lực diệt sâu của chúng trên đối

tƣợng SXDL (Spodoptera exigua) . Vì những lợi ích rất quan trọng của hai chủng

tuyến trùng và VKCS ngƣời tiến hành đề tài đã chọn hƣớng cho đồ án tốt nghiệp là

: “Khảo sát hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S

– XT và H – CP16 trên sâu xanh da láng Spodoptera exigua và xác định tác

nhân gây bệnh côn trùng của tuyến trùng ”

2. Mục đích của nghiên cứu

Ứng dụng khả năng phòng trừ sâu hại và nhân nuôi in vivo tuyến trùng EPN trên

đối tƣợng SXDL Spodoptera exigua của hai chủng tuyến trùng S – XT và H –

CP16.

Xác định các chủng vi khuẩn là tác nhân gây bệnh côn trùng của hai chủng tuyến

trùng S – XT và H – CP16 và ứng dụng chúng trong đấu tranh sinh học bảo vệ thực

vật.

3. Nhiệm vụ của nghiên cứu

Đánh giá hiệu lực diệt sâu và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng S –

XT và H – CP16 trên đối tƣợng SXDL.

Phân lập các chủng vi khuẩn là tác nhân gây bệnh côn trùng của hai chủng tuyến

trùng S – XT và H – CP16.

Đồ án tốt nghiệp

Khảo sát các hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập và bƣớc đầu xác

định mối quan hệ giữa chúng với hai loài tuyến trùng khảo sát.

4. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài.

Xác định đƣợc chỉ số LD50 và khả năng sinh sản của hai chủng tuyến trùng trên

đối tƣợng SXDL.

Phân lập đƣợc hai chủng vi khuẩn SB, HB lần lƣợt trên tuyến trùng S – XT và H

– CP16. Kết quả định danh cho thấy 2 chủng SB, HB đều thuộc loài Serratia

macescens.

Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng kháng sinh, hoạt tính enzyme, tỉ lệ ức

chế nấm bệnh gây hại cây trồng, hiệu lực diệt sâu và sự tƣơng tác với kí chủ tuyến

trùng của hai chủng vi khuẩn SB, HB.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN)

1.1.1. Khái niệm EPN

EPN viết tắt của từ Entomopathogenic Nematodes, đây là thuật ngữ dùng để chỉ

các loài tuyến trùng kí sinh thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis, chúng

vừa có khả năng ký sinh lại vừa có khả năng gây bệnh giết chết côn trùng.

Thực chất các loài tuyến trùng kí sinh này là tổ hợp đƣợc hình thành trong tự

nhiên và có sự chuyên hóa cao, trong đó các loài tuyến trùng thuộc giống

Steinernema cộng sinh với vi khuẩn Xenorhabdus, còn Heterorhabditis thì cộng

sinh với vi khuẩn Photorhabdus. Sở dĩ đƣợc gọi là cộng sinh vì cả vi khuẩn và

tuyến trùng đều dựa vào nhau để tồn tại, phát triển, sinh sản. Đây là một hiện tƣợng

cộng sinh bắt buộc, cả tuyến trùng và vi khuẩn không thể tồn tại độc lập trong tự

nhiên (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).

1.1.2. Vai trò và ưu thế của EPN

Vai trò của EPN đƣợc thấy trƣớc tiên nhƣ là các thiên địch tự nhiên có tác dụng

điều chỉnh mật độ quần thể côn trùng, trong đó có nhiều loài sâu hại. Thực tế cho

thấy, trong tự nhiên nơi đâu có sự tồn tại của EPN thì nơi đó hầu nhƣ không bùng

phát dịch hại do côn trùng gây ra (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).

EPN đang nhận đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng có

những ƣu thế sau :

a. Phƣơng pháp s đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng

có những ƣu thế sau :t độ quần thể cô

b. EPN có kháp s đƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng

có những ƣu thế sau

c. Các loài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chú

d. Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng

e. Áp dhoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng

có những ƣu thế

Đồ án tốt nghiệp

f. Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng

có

g. Có khoài sâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là

h. Tó khoà bsâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và in vitro và in vivo. to

những ƣu thế sau :t độ quần thể côn trù

i. Dà bsâu hđƣợc sự quan tâm trong nghiên cứu và in vitro và in v

1.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng

1.2.1. Phân loại

Tuyến trùng ký sinh côn trùng đã đƣợc tìm thấy trong sáu bộ tuyến trùng:

- Aphelenchida

- Diplogasterida

- Mermithida

- Oxyurid

- Rhabditida

- Tylenchida

Trong các bộ trên thì bộ Rhabditida, Mermithida và Tylenchida là quan trọng

nhất.

Trong bộ Rhabditida, tuyến trùng trong hai họ sau đây đã đƣợc đề cập:

- Hrong bộ Rhabditida, tuyến trùng tSteinernema và Neosteinernema

- Heosteinernemaitida, tuyến trùng trong Heterorhabditis.

Steinernema đã đƣợc Steiner mô tả năm 1923 với tên gọi Aplectana, vì tên này

đã đƣợc sử dụng trƣớc đó, nên năm 1927, Travassos đổi tên thành Steinernema,

trƣớc năm 1982 rất nhiều loài của tuyến trùng này có tên khác là Neoaplectana.

Hiện nay có khoảng 56 loài đã đƣợc mô tả. Neosteinernema đƣợc Nguyễn và Smart

mô tả năm 1994, tuyến trùng này chỉ có một loài và ký sinh trên mối.

Heterorhabditis đƣợc Poinar mô tả năm 1976, Heterorhabditis có 12 loài. Đây đƣợc

đánh giá là nhóm tuyến trùng quan trọng nhất trong bảo vệ mùa màng, vì vậy có

nhiều nghiên cứu tập trung về các giống này.

Đồ án tốt nghiệp

Vòng đời của EPN khoảng 10 - 12 ngày và trung bình từ một vật chủ cho khoảng

5×104 ấu trùng tùy thuộc vào loài và trọng lƣợng vật chủ.

Bảng 1.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng

Phân loại Tên

Nematoda Ngành

Chromadorea Lớp

Chromadoria Phân

lớp

Rhabditida Bộ

Panagrolaimomorpha Phân

bộ

Họ Steinernematidae Heterorhabditiae

Giống Steinernema Neosteinernema Heterorhabditis

1.2.2. Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis

Ấu trùng tuyến trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJ) mang vi khuẩn cộng sinh trong ruột.

Khi vào đến bên trong vật chủ, chúng xâm nhập vào xoang máu, tuyến trùng sẽ

phóng thích các vi khuẩn cộng sinh từ ruột của chúng vào trong máu của côn trùng.

Vi khuẩn sẽ phát triển nhanh nhờ huyết tƣơng của côn trùng tạo ra hiện tƣợng ngộ

độc máu làm côn trùng chết trong khoảng từ 24 đến 48 giờ đồng hồ. Vi khuẩn sẽ

phân hủy mô trong cơ thể côn trùng giúp ấu trùng tuyến trùng hấp thu chất dinh

dƣỡng để phát triển sang tuổi 4 và thành thành trùng thế hệ 1. Phụ thuộc vào nguồn

dinh dƣỡng mà tuyến trùng có cách phát triển khác nhau trong cơ thể côn trùng nhƣ

hình 2.1.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng

a. Chu trình sinh sản tuyến trùng trong cơ thể côn trùng

Khi nguồn thức ăn phong phú thì tuyến trùng sẽ sống theo vòng tròn nhƣ hình

2.1. Trứng của tuyến trùng thế hệ 1 sẽ nở ra ấu trùng tuyến trùng thế hệ 1 và chúng

lại tiếp tục ăn vi khuẩn để phát triển sang ấu trùng tuổi 2, 3, 4 và thành trùng thế hệ

thứ 2. Thành trùng thế hệ mới sẽ tiếp tục chu trình sống và sinh sản nhƣ ở thế hệ 1.

b. Chu trình sống khi không đủ dinh dưỡng

Khi không có đủ nguồn dinh dƣỡng thì tuyến trùng sẽ sống theo chu kỳ ngắn nhƣ

vòng nửa vòng cung phía dƣới của hình 2.1. Trứng của thành trùng thế hệ thứ 1 sẽ

nở ra ấu trùng tuổi 1, từ đây phát triển sang dạng ấu trùng tuổi 2, kế đó sẽ chuyển

sang dạng trung gian giữa ký sinh và tiềm sinh, cuối cùng thành ấu trùng gây

nhiễm, chờ thời cơ để xâm nhập vào vật chủ.

1.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus

Photorhabdus và Xenorhabdus đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh

với côn trùng cũng nhƣ cung cấp dinh dƣỡng cho tuyến trùng. Đây đƣợc đánh giá là

hai chi vi khuẩn đặc biệt nhất trong giới vi sinh vật khi cộng sinh với một vật chủ là

tuyến trùng và ký sinh gây hại với một vật chủ khác là côn trùng (Steven Forst và

David Clarke, 2011).

Đồ án tốt nghiệp

Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus

thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đƣờng ruột).

1.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae

Enterobacteriaceae là một họ vi khuẩn lớn, gồm trên 100 loài mang những đặc

điểm cơ bản sau:

a. Nơi cư trú

Họ vi khuẩn đƣờng ruột gồm những vi khuẩn thƣờng trú trên cơ thể, ở ống tiêu

hóa của ngƣời và động vật, có thể gây bệnh hoặc không gây bệnh.

b. Hình thái

Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn, không sinh nha

bào. Một số giống vi khuẩn thƣờng không di động (Klebsiella, Shigella), một số vi

khuẩn khác di động (E. coli, Salmonella) nhờ có tiên mao ở xung quanh thân tế

bào. Một số giống có vỏ nhìn thấy đƣợc nhờ kính hiển vi thƣờng nhƣ Klebsiella.

c. Sinh lý

Các vi khuẩn đƣờng ruột là gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, phát triển

đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng.

d. Tính chkhuẩn đường

Lên men glucose, có sinh hơi hoặc không sinh hơi, oxidase âm tính, hầu hết

catalase dƣơng tính, khử nitrate thành nitrite.

Lên men một số đƣờng nhƣ glucose, galactose hoặc không lên men một số đƣờng

nhƣ lactose, manose, saccharose.

Có thể có một số enzyme nhƣ urease, tryptophanase.

Khả năng sinh ra H2S khi dị hóa protein, axít amin hoặc các dẫn chất có lƣu

huỳnh.

Đồ án tốt nghiệp

1.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus

Bảng 1.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus

STT Phân loại

Giới Bacteria 1

Ngành Proteobacteria 2

3 Lớp Gramma proteobacteria

4 Bộ Enterobacteriales

5 Họ Enterobacteriaceae

6 Chi Photorhabdus Xenorhabdus

Hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus có mối quan hệ với nhau, có thể thấy mối

quan hệ giữa hai chi qua hình 2.1.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus

Đồ án tốt nghiệp

1.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản

Đây là hai chi có sự tƣơng tự cả về hình thái, sinh lý và sinh hóa, tuy nhiên có thể

phân biệt chúng theo một số đặc điểm cơ bản đƣợc nhắc đến trong bảng 1.3.

Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus

STT Đặc điểm Photorhabdus Xenorhabdus

Trình tự 16S Tại vị trí 208 – 213 Tại vị trí 208 – 211 1 rRNA TGAAAG TTCG

Tế bào có hình que, Tế bào có hình que Đặc điểm 2 kích thƣớc vào khoảng và kích thƣớc là (0,3 - 2 hình thái (0,5 - 2 × 1 – 10 µm) × 2 – 10 µm)

Phát triển Điều kiện Điều kiện phát triển tốt nhất là 280C hoặc 3 nuôi cấy tối ƣu ở 280C, một vài chủng phát triển ở 37 - 380C. nhỏ hơn, một vài chủng phát triển ở 40C.

Loài vật chủ 5 Heterorhabditis Steinernema cộng sinh

Ngoài ra còn có một số đặc điểm cơ bản khác về mặt sinh hóa thì tùy thuộc từng

loài và chủng cụ thể.

a. Đặc điểm sinh lý nổi bật

Photorhabdus và Xenorhabdus là Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có cả hai quá trình

lên men và hô hấp trong tế bào.

Đặc điểm nổi bật nhất phải nhắc đến là hiện tƣợng biến đổi pha, đây đƣợc coi là

một hiện tƣợng rất độc đáo trong hai chi vi khuẩn này.

Hiện tượng biến đổi pha:

Đây là thuật ngữ để chỉ giai đoạn biến đổi tự nhiên xảy ra ở một số vi khuẩn về

một số điểm nhƣ hình thái, màu sắc, tính chất hóa lý trong tế bào vi khuẩn. Nguyên

nhân do biến đổi trong cấu trúc DNA đã làm thay đổi cấu trúc phân tử của các

Đồ án tốt nghiệp

protein mà chúng tổng hợp ra điều này làm thay đổi các kiểu hình và kháng nguyên

ở pha thứ cấp. Đối với vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus, pha I (sơ cấp) là

dạng tế bào tự nhiên có quan hệ với tuyến trùng, còn pha II (thứ cấp) có thể xuất

hiện một cách tự phát khi vi khuẩn đi vào pha cân bằng không tăng trƣởng.

Đặc điểm của hai pha:

Đặc điểm trƣớc tiên để dễ dàng phân biệt hai pha là khả năng hấp thu màu

môi trƣờng để tạo màu khuẩn lạc ở pha sơ cấp nhƣng ngƣợc lại pha thứ cấp lại

không thể hấp thu màu nên không tạo màu đặc trƣng nhƣ pha I. Một đặc điểm rất

quan trọng khác là khả năng sinh enzyme và chất kháng sinh mạnh ở pha I nhƣng

hầu nhƣ không có ở pha II. Có thể thấy đƣợc một số các đặc điểm khác nhau cơ bản

Bảng 1.4. Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của

ở bảng 1.4.

Xenorhabdus / Photorhabdus

Đặc điểm Dạng sơ cấp Dạng thứ cấp

Hình thái khuẩn lạc Tròng, lồi, dạng hạt, Phẳng, trong mờ, cạnh

trên nutrient agar màu đục, cạnh không đều.

đều.

Hình thái khuẩn lạc Các khuẩn lạc hút Không xốp, màu đỏ,

trên MacConkey nƣớc, có màu đỏ trung trung tính, trắng, vàng.

tính, đỏ, đỏ hồng.

Hình thái khuẩn lạc Dạng xốp, xanh Không có dạng xốp,

trên NBTA dƣơng, oliu hoặc xanh lá. màu đỏ hoặc nâu sẫm.

Xung quanh khuẩn lạc Không tạo thành vùng

có vùng trong, một phần trong suốt bao quanh.

agar bị biến màu.

Sắc tố tạo thành trong Phụ thuộc chủng và Phụ thuộc chủng và

môi trƣờng lỏng môi trƣờng. Ở P. môi trƣờng. Thƣờng có

luminesens có màu thay màu vàng thẫm, da cam.

Đồ án tốt nghiệp

đổi từ tím đến màu tía Màu thay đổi không

khi tăng nồng độ NaOH. mạnh khi thêm NaOH do

nồng độ sắc tố thấp.

Hình dạng và hình Tế bào dạng que, kích Tế bào tƣơng đối dài,

thái tế bào thƣớc nỏ đến trung bình kích thƣớc nhỏ đến trung

(dài 3 - 5 , rộng 1,5 – bình (6-7 , rộng 1 -

2 ). Cơ thể có thể vùi 1,5 ). Cơ thể ít có thể

hình oval hoặc hình vùi

vuông.

Phát huỳnh quang ở Dƣơng tính Âm tính

Photorhabdus

Hoạt tính kháng Dƣơng tính Âm tính

khuẩn

Sinh trƣởng của tuyến Tuyến trùng sinh Nhân giống tuyến

trùng trong nhân nuôi vi trƣởng tốt, tăng nhanh trùng khó khăn, sinh

khuẩn kích thƣớc, số lƣợng thế trƣởng đình trệ, chết

hệ sau và khả năng sống nhiều.

sót.

b. Đặc điểm hình thái nổi bật

Khuẩn mao:

Khuẩn mao là những sợi lông rất mảnh, rất ngắn, cứng, mọc quanh bề mặt tế bào

nhiều vi khuẩn Gram âm. Chúng có đƣờng kính khoảng 7 - 9 nm, rỗng ruột (đƣờng

kính trong là 2 - 2,5 nm), số lƣợng khoảng 250 - 300 sợi/vi khuẩn, có một tiểu đơn

vị lớn hơn 17 kDa, vai trò chính là giúp vi khuẩn bám dính. Khuẩn mao của vi

khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus đƣợc đánh giá có vai trò trong gây độc vì

bám vào tế bào, mô côn trùng tạo điều kiện cho các yếu tố gây độc khác hoạt động.

Đồ án tốt nghiệp

Tiên mao:

Tiên mao là những sợi lông dài, dƣới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy rõ

khi nhuộm theo phƣơng pháp riêng, vai trò chính là giúp cho vi khuẩn vận động.

Mặt khác, chúng đóng một vai trò quan trọng trong gây độc vì nó sẽ đƣa vi khuẩn

đến những vị trí thích hợp để gây bệnh, né tránh những vị trí bất lợi và tìm đến các

nguồn dinh dƣỡng.

Trong hầu hết chủng X. nematophila đã đƣợc kiểm tra, tế bào sơ cấp đều thể

hiện hai đặc tính là di động và quần tụ bầy đàn trong khi tế bào thứ cấp không có

tiên mao và không thể di động. Trong một nghiên cứu để tìm ra nguyên nhân thiếu

tiên mao trong tế bào thứ cấp, Givaudan và cộng sự (1996) tách dòng gen mã hóa

tiên mao fliC và filD của X. nematophila cho thấy fliCD operon không bị thay đổi

trong tế bào thứ cấp nhƣng không đƣợc sao chép. Sự sao chép của fliCD operon bị

điều khiển bởi flhDC (đây là operon ở Enterobacteriaceae kiểm soát sự biểu hiện

của hơn 50 gen mã hóa chức năng tiên mao). Việc không có tiên mao ở tế bào thứ

cấp là do thiếu yếu tố sigma fliA đây là yếu tố cần cho việc sao chép của fliCD.

c. Đặc điểm sinh hóa

Photorhabdus:

Các đặc tính sinh hóa có sự khác nhau giữa các chủng của chi Photorhabdus, hầu

hết âm tính trong các mô tả của Enterobacteriaceae

Bảng 1.5. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Photorhabdus

Kết quả Tên thử nghiệm Pha I Pha II

Catalase +

Khử nitrate -

Thủy phân gelatine +

Tan huyết cừu Hầu hết +

Tan máu ngựa Hầu hết +

Phân giải tween 20 +

Đồ án tốt nghiệp

Tween - 40, 60, 80 và 85 Hầu hết +

Acid hóa fructose, D - mannose, Hầu hết +

maltose, ribose, N – acetylglucosamine

Lên men từ glycerol + yếu

Nguồn cacbon và năng lƣợng từ +

fumarate, glucosamine, L - glutamate,

L - malate, L - proline, Succinate, L –

tyrosine

Phát quang + + yếu

Xenorhabdus:

Xenorhabdus âm tính với hầu hết thử nghiệm của Enterobacteriaceae.

Bảng 1.6. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus

Kết quả Tên thử nghiệm Pha I Pha II

Catalase +

Khử nitrate -

Thủy phân gelatine +

Tan huyết cừu Hầu hết +

Tan máu ngựa Hầu hết +

Phân giải tween 20 +

Tween - 40, 60, 80 và Hầu hết + 85

Acid hóa glucose +

Di động + yếu +

Hấp thu màu môi - + trƣờng

Kháng sinh - +

Đồ án tốt nghiệp

1.4. Tổng quan về Serratia marcescens

1.4.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens

Lịch sử của sắc tố màu đỏ trên thực phẩm đƣợc nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6

trƣớc công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh

mì. Sau đó, vào năm 332 trƣớc công nguyên, những ngƣời lính trong quân đội

Macedonian của Alexander nhận thấy rằng bánh mì của họ đôi khi dƣờng nhƣ có

“máu” trên đó. Và họ cho rằng hiện tƣợng kỳ lạ này chính là bằng chứng cho thấy

máu sẽ sớm chảy trong thành phố Tyre và Alexander sẽ giành chiến thắng.

Năm 1800, Christian phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện

kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học Gaughran (1969),

đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó, sự cố nhƣ

vậy đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1169 tại Đan Mạch.

Trong bóng tối và sự ẩm ƣớt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh đƣợc

sử dụng trong Thánh lễ thƣờng xuyên bị nhiễm Serratia marcescens, tuy nhiên,

điều này lại khiến nhiều ngƣời nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là

một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011).

Bizio, một dƣợc sĩ ở Padua (Italya), là ngƣời đầu tiên phát hiện và đặt tên

Serratia marcescens cho nguyên nhân gây nên sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang

màu đỏ máu. Năm 1817, Bizio đã làm ẩm một miếng bánh mì và polenta sau đó để

ở nơi khô ráo. Sau 24 giờ, cả bánh mì và polenta đều đƣợc bao phủ bởi một lớp vi

sinh vật màu đỏ. Năm 1819, Bizio đã đặt tên cho vi sinh vật màu đỏ này là Serratia,

theo tên nhà vật lý nổi tiếng ngƣời Italya đã phát minh ra tàu hơi nƣớc là Serrati, tên

loài marcescens có nguồn gốc từ tiếng Latin, có nghĩa là phân hủy vì vi sinh vật này

phân hủy rất nhanh bánh mì và polenta.

Ban đầu Bizio mô tả Serratia marcescens nhƣ một loại nấm, do ông nhìn thấy

những đốm đỏ dƣới kính hiển vi. Thời gian sau đó, vào những năm 1850, các nhà

khoa học đã phân loại lại Serratia marcescens là vi khuẩn.

Đồ án tốt nghiệp

1.4.2. Phân loại Serratia marcescens

Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan với

nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi Serratia là

Serratia marcescens.

Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:

- Giới: Bacteria

- Ngành: Proteobacteria

- Lớp: Gramma proteobacteria

- Bộ: Enterobacteriales

- Họ: Enterobacteriaceae

- Chi: Serratia

- Loài: Serratia marcescens

1.4.3. Đặc điểm của Serratia marcescens

1.4.3.1. Đặc điểm sinh lý

Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia

marcescens có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC

và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012).

Hình 1.3. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011)

Đồ án tốt nghiệp

Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar đƣợc mô tả

là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng

chính là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia

marcescens thƣờng bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012).

Hình 1.4. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở 25oC sau 48 giờ (David, 2012)

Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch, tạo thành

nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8 %); các cụm tế bào này có chiều dài từ 5 – 30 μl.

Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.

1.4.3.2. Đặc điểm sinh hóa

Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng có oxy hoặc trong

trƣờng hợp không có oxy. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên

men để lấy năng lƣợng và nhờ có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatas,

peroxides,… bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi

trƣờng oxy hóa.

Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ

Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase

(Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia

marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease,

protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Trong đó, thủy phân casein là

Đồ án tốt nghiệp

một đặc điểm chung của Serratia marcescens. Casein là một protein kết tủa trong

sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. Serratia marcescens sử

dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein.

Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens đƣợc thể hiện qua bảng 1.7.

(Tariq và John, 2010).

Bảng 1.7. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens

Đặc điểm sinh STT Kết quả hóa

+ – – + + + + – – + + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Di động Indole Methyl Red Voges Proskauer Citrate Dnase Catalase Oxidase Urease Gelatinase Chitinase

Môi trƣờng chuyển sang acid, 12 Triple sugar iron

không sinh khí và không sinh H2S

peoduction

– + + + + + + – – – – 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Hydrogen sulphide Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase Lên men glucose Lên men sucrose Lên men sorbitol Lên men fructose Lên men xylose Lên men rhaminose Lên men lactose Lên men arabinose

Đồ án tốt nghiệp

1.4.3.3. Đặc điểm phân bố

Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nƣớc, trong đất, trong thực

vật, côn trùng, cũng nhƣ trong ống tiêu hóa của ngƣời và động vật có xƣơng sống.

Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sông và

Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể đóng

một vai trò quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc khoáng

hóa hữu cơ sắt, cũng nhƣ hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964).

Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn

trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế.

Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng

đối với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng

huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006).

Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất là

trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng của

chúng (Singlton và Sainsbury, 2001).

Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong các

loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo cáo

mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia

marcescens với Steinernema carpocapsae.

1.4.4. Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens

1.4.4.1. Sắc tố

Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi khuẩn

Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), đƣợc biết đến nhƣ là một yếu tố đặc

biệt, nhƣng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm:

prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin,

metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn

dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin

hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008).

Đồ án tốt nghiệp

Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin đƣợc sản xuất bởi biogroup A1

và A2/6, nó không đƣợc sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT (Grimont,

1977). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thƣờng

gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont, 1977;

Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hóa sinh tổng hợp prodigiosin đã đƣợc

biểu hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Các dòng đƣợc tạo

thành này có khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn MAP và MBC, hoặc tổng hợp

giai đoạn MAP ở bên ngoài (Francine và Patrick, 2006). Prodigiosin đƣợc biết đến

là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì

vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể ngƣời, có thể chúng sẽ không tổng

hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và

Falkiner, 1997).

Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic

semialdehyde acid, đƣợc sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid

(3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự, 1988). Enzyme

này đƣợc cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens. Tuy

nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a, đã bị mất khả năng phát triển trên

các hợp chất thơm, để có thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick,

2006).

1.4.4.2. Biosurfactants

Các chủng sinh sắc tố và một số chủng không sinh sắc tố của Serratia

marcescens đều sản xuất biosurfactants có thể hoạt động nhƣ một chất thấm. Chất

thấm này đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn ở 30°C nhƣng không đƣợc sản xuất ở

37°C trong phase cân bằng của quá trình tăng trƣởng. Ba aminolipid, từ W1 đến

W3, có các hoạt động thấm ƣớt và đã đƣợc tách bằng sắc ký lớp mỏng (Matsuyama

và cộng sự, 1986). Trong đó, W1 đƣợc xác định là serratamolide, một

cyclodepsipeptide mà trƣớc đó đã từng đƣợc phát hiện bởi Wasserman và cộng sự

(1961).

Đồ án tốt nghiệp

1.4.4.3. Acid béo

Các acid béo chủ yếu trong toàn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens là

3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic, và octadecanoic acid.

Các acid béo này chiếm khoảng 50 – 80% thành phần tế bào, trong đó, n-

tetradecanoic acid chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983).

1.4.4.4. Enzyme

Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease, chitinase,

DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,...

Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có

chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng nhƣ kiểm soát sinh

học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc,… (Joshi và cộng sự,

1989).

Một nghiên cứu đã cho thấy Serratia marcescens sản xuất ít nhất ba enzyme

chitinase (ChiA, ChiB, ChiC), một chitobiase và một protein chitin-binding

(CBP21) (Fuchs và cộng sự, 1986; Jones và cộng sự, 1986; Sundheim và cộng sự,

1988; Harpster và Dunsmuir, 1989; Bruberg và cộng sự, 1996; Tews và cộng sự,

1996; Watanabe và cộng sự, 1997; Gal và cộng sự, 1998, Suzuki và cộng sự, 1998),

chúng có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 57, 52, 48, 36, và 21 kDa, cùng với các hoạt

động chitinolytic (Fuchs và cộng sự, 1986).

1.4.5. Yếu tố độc lực của Serratia marcescens

Yếu tố độc lực là các yếu tố đóng vai trò thúc đẩy khả năng gây bệnh của các tác

nhân gây bệnh bằng cách cho phép các tác nhân gây bệnh nhập vào vật chủ, tránh

sự tự bảo vệ của vật chủ và sinh trƣởng phát triển, gây ảnh hƣởng đến vật chủ, mà

phổ biến là chính bản thân tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (Weiss

và Hewlett, 1986).

Một số yếu tố độc lực của Serratia marcescens đã đƣợc nghiên cứu, bao gồm

sự bám dính, tính kị nƣớc, mannose-resistant, mannose-sensitive, LPS,…

Trong đó, yếu tố quan trọng đầu tiên trong quá trình tƣơng tác giữa tác nhân

gây bệnh và vật chủ là sự bám dính.

Đồ án tốt nghiệp

Các yếu tố bám dính của vi sinh vật đƣợc gọi là các adhesion, chúng có thể

có bản chất polypeptide hoặc polysaccharide. Đối với các adhesin có bản chất

polypeptide thì đƣợc chia thành hai nhóm là nhóm có fimbriae và nhóm không

có fimbriae. Mà các vi khuẩn Gram âm, nhƣ là Serratia marcescens, thƣờng bám

dính nhờ các fimbriae này.

Các fimbriae (hay còn gọi là các pili) là những cấu trúc phụ của vi sinh vật có

dạng nhƣ sợi lông trên bề mặt vi khuẩn. Các fimbriae đƣợc cấu tạo bởi nhiều

protein xếp chặt với nhau tạo nên hình dạng giống nhƣ trụ xoắn ốc. Thƣờng thì chỉ

có một loại protein là cấu trúc chính của một phân nhóm fimbriae tuy nhiên các

protein phụ trợ khác cũng có thể tham gia vào cấu trúc của đỉnh hoặc gốc fimbriae.

Đỉnh của các fimbriae có chức năng gắn với tế bào vật chủ.

Bên cạnh đó, LPS hay còn đƣợc gọi là lipoglycan, là các phân tử lớn lƣỡng tính

nằm trong lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn, bao gồm lipid và polysaccharide liên kết

với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ màng tế

bào khỏi các tác động từ bên ngoài. Cấu tạo của LPS gồm 3 phần: O – antigen, lõi

oligosaccharide và lipid A. Mà lipid A chính là thành phần gây độc của phân tử

LPS, gây bên sự giải phóng hàng loạt các cytokine gây viêm.

Ngoài ra, việc sản xuất các enzyme khác nhau bởi Serratia marcescens cũng

đƣợc xem nhƣ một yếu tố độc lực, chẳng hạn enzyme chitinase, lipase,

chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).

1.5. Mối quan hệ cộng sinh

1.5.1. Vai trò của tuyến trùng

Tuyến trùng đóng một vai trò quan trọng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:

- Vector vùng đóng một vai tròIJ khi xâm nh đóng một vai trò quan trọng

trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e, chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA

(Hejazi và Falkiner, 1997).ide liên kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPS đƣợc

coi nhƣ nội độc tố, bảo vệ màng tế bào khỏi các táđây vi khuẩn sẽ sinh sôi, tạo độc

tố giết chết vật chủ.

Đồ án tốt nghiệp

- Bkhi xâm nh đóng một vai trò quan trọng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e,

chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).ide liên

kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPSqua lỗ hậu môn để vi khuẩn vào xoang

máu côn trùng. Tạiác chất kháng thể để chống lại vi khuẩn cộng sinh, tuyến trùng sẽ

tiết ra các chất làm trung hòa và làm mất tác dụng của kháng thể này (Nguyễn Ngọc

Châu, 2008).

1.5.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh

S.5.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e,

chloroperoxidase và cả protein ngoại bào HasA (Hejazi và Falkiner, 1997).ide liên

kết với nhau nhờ liên kết cộng hóa trị. LPSqua lỗ hậu môn để vi khuẩn vào xoang

máu

Cung c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e,

chloroperoxviệc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh trong bọc của r4 giờ - 48

giờ,ày các IJ (tu c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao

gồm:e, chloroperoxviệc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh trong bọc của r4 giờ -

48 giờ,ày các ian này phụ

Hotu c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e,

chloroperoxviệc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh trong bọc của r4 giờ - 48

giờ,ày các ian này phụ ên kế vào tổ hợp tuyến trùng, vi khuẩn và lo

Ngăn c Vai trò của vi khuẩn cộng sinhng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm:e,

chloroperoxviệc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh trong bọc của r4 giờ - 48

giờ,ày các ian này phụ ên kế vào tổ hợp tuyến

1.5.3. Tổng quát mối quan hệ trong tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn

Mối liên hệ giữa tuyến trùng và vi khuẩn có thể đƣợc khái quát hóa qua ba giai

đoạn nhƣ sau:

a) Giai đon hệ

Tuyến trùng sẽ tồn tại ở dạng ấu trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJ) đƣợc bao bọc bởi

lớp vỏ cutin của ấu trùng tuổi 2. Đây là hình thức tồn tại mà không cần đến dinh

dƣỡng, chúng sẽ tồn tại bền bỉ trong đất cho đến khi tìm đƣợc vật chủ. IJ của

Đồ án tốt nghiệp

Steinernema sẽ mang vi khuẩn ở bọng trƣớc ống ruột, trong khi đó Ciche và Ensign

(2000) cho thấy Heterorhabditis mang vi khuẩn nằm rải rác giữa ruột nhƣng chủ

yếu vẫn là nửa trƣớc ống ruột. IJ tìm vật chủ theo hai hình thức:

* Hình tht chủ theo : Vh tht chủ tHeterorhabditis và mrorhabditi

Steinernema thì có tập tính săn lùng vật chủ. Nhờ khả năng nhận biết khí CO2

mà vật chủ thải ra giúp chúng định hƣớng đƣợc mục tiêu và di chuyển nhanh đến

vật chủ.

* Hình thtập tính s: Vh thtập tínSteinernema thì chúng a ính chn lùng

đất chờ khi vật chủ đi qua chúng sẽ tấn công.

Sau khi đã tìm thấy vật chủ chúng sẽ vào cơ thể vật chủ theo hai hình thức:

* Hình th đã tìm thấ: Heterorhabditis s vật chủ chúng sẽ vào cơ thể vật

miệng để đâm thủng biểu bì tại nơi xung yếu nhất là ranh giới giữa các đốt trong

cơ thể, sau đó đi trực tiếp vào xoang máu của vật chủ.

* Hình thđi trực ti: Steinernema seinernemarực tiếp vào xoang máu của

qua miệng, lỗ thở, hậu môn và sau cùng sẽ di trú vào xoang máu.

b) Giai đong, lỗ thở,

Đây là giai đoạn kết hợp việc phục hồi của IJ, sự phóng thích vi khuẩn vào huyết

tƣơng và giết chết vật chủ côn trùng. Tuy nhiên đồng thời với việc xâm nhập của IJ

là một loạt các phản ứng của cơ thể vật chủ côn trùng để chống lại cả tuyến trùng và

vi khuẩn. Phản ứng của tế bào để đáp lại thông qua tế bào máu để tiêu diệt các vi

sinh vật bằng cơ chế thực bào. Khi mà sinh vật xâm nhập trên diện rộng (ở đây là

tuyến trùng) thì tế bào máu sẽ phối hợp với nhau tạo thành một lớp bao vây quanh

sinh vật là gọi là nốt sần. Cách khác là tế bào máu hoạt hóa enzyme phenoloxidase

tạo thành lớp melanin quanh vi sinh vật gây hại. Và các phản ứng miễn dịch dịch

thể gồm sản xuất lyzozyme và sản xuất các pepetide kháng sinh nhƣ cecropin.

* Phà một lIJ:

Trong huyết tƣơng, tuyến trùng vẫn tồn tại ở dạng IJ và tiếp tục phát triển. Bƣớc

phát triển này của tuyến trùng gọi là sự phục hồi. IJ của Heterorhabditis sẽ phục hồi

Đồ án tốt nghiệp

và phát triển thành dạng lƣỡng tính, trong khi đó IJ của Steinernema phát triển

thành hai dạng giới tính rõ ràng.

* Gây btriể

Đây là yếu tố mấu chốt của mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng và vi khuẩn,

vi khuẩn sẽ sản xuất ra các yếu tố độc tố gây ra cái chết của côn trùng chuẩn bị cho

các bƣớc kế tiếp.

c) Giai đouẩn, vi khuẩ

Trong giai đoạn này là sự phát triển mạnh của vi khẩn đạt mật độ tế bào cao nhất

và quá trình biến đổi sinh học xác côn trùng thành nguồn dinh dƣỡng thích hợp cho

tuyến trùng sinh sôi và phát triển.

* Biong giai đoạn này là sự phát t

Huyết tƣơng là một nguồn dinh dƣỡng rất phong phú cho sự phát triển của vi

khuẩn. Gian đoạn này bắt đầu sau khoảng 24 giờ – 48 giờ sau khi nhiễm, côn trùng

sẽ bị khống chế hoàn toàn bởi các chất gây độc của vi khuẩn sau đó bị phân hủy dần

vì các enzyme ngoại bào mà vi khuẩn tiết ra. Ví dụ nhƣ trong môi trƣờng nhân tạo

Photorhabdus và Xenorhabdus sản xuất ra phức hợp protease, lipase, lecithinase,

chitinase trong suốt giai đoạn tăng trƣởng. Ngoài ra P. luminescens cũng tiết ra một

metalloprotease trong cả điều kiện invitro và invivo.

* Nâng đoiết ra một metalloprotease tron

Sản xuất enzyme phân giải cơ thể côn trùng để lấy dinh dƣỡng cho tuyến trùng

và chính nó:

Khả năng sinh sôi của tuyến trùng phụ thuộc vào sự hiện diện của vi khuẩn trong

cơ thể côn trùng. Trong trƣờng hợp của Photorhabdus – Heterorhabditis cho thấy

Heterorhabditis chỉ phát triển khi có Photorhabdus, điều này cho thấy vai trò rất

quan trọng trong việc chuyển hóa sinh học xác côn trùng. Ở một nghiên cứu khác,

Steinernema có thể sinh sôi dù không có sự hiện diện của Xenorhabdus, nhƣng sự

sinh sôi này có sự hạn chế về số lƣợng.

* B nhưng sự sinh sôi này có sự hạn chế về số lượng.iệc chuyển hóa sinh học

Đồ án tốt nghiệp

Phụ thuộc điều kiện nuôi cấy, thời gian của một thế hệ ấu trùng xâm nhiễm thoát

ra ngoài là khoảng 7 – 21 ngày sau khi chúng vào côn trùng. Trong suốt thời gian

này điều rất quan trọng là xác chết côn trùng phải đƣợc bảo vệ khỏi sinh vật lạ. Cả

Photorhabdus và Xenorhabdus sản xuất ra kháng sinh để chống lại các loài sinh vật

khác.

d) Giai đot ra k

Giai đoạn trƣởng thành của IJ và hình thành tập đoàn IJ mới cộng sinh với vi

khuẩn.

Sự trưởng thành của IJ: IJ sẽ sử dụng dinh dƣỡng đƣợc cung cấp để phát triển

thành dạng thành trùng trƣởng thành.

Hình thành tập đoàn IJ: Khi phát triển đến trƣởng thành trong cơ thể vật chủ,

tuyến trùng tiếp tục phát triển qua một, hai hay nhiều thế hệ và tạo ra nhiều IJ sau

khi kết thúc quá trình sinh sản trong vật chủ. Sau đó các IJ đồng loạt chui ra ngoài

xác côn trùng và phát tán vào môi trƣờng đất xung quanh xác chết và trở thành ấu

trùng xâm nhiễm.

Bảng 1.8. Vòng đời của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh

Giai đoi Vòng đoi của tuyến trùng Vòng đoi của tuyến tr

Tuyg đoi của tuyến trùng –

vi khuẩn cộng sin Vi khuoi của tuyến I Tìm vđoi của tuyến trùn trùng – vi khuẩn cộng sin Xâm nhoi của tuyến trùng –

vi khuẩn cộng

Vi khum) của tuyến

trùng – vi khuẩn cộng s Ph (suoi của tuyến trùng – vi II (suoi Si khum) của tuyến khuẩn cộ trùng

Làm chết côn trùng.

II (muết Tuy(muết côn trùng.t Vi khuết côn trùng.trùng

Đồ án tốt nghiệp

–

Si khuết côn trùng.trùng

– vi khuẩn cộng sinht tán

vào m

Bi khđết côn trùng.trùng

–

Hình thành th

III Tuykhđết côn trùng.trùng – hùng.trùng – vi khuẩn

cộng sinht tá

1.5.4. Mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùng EPN và Serratia sp.

Không nhƣ mối quan hệ cộng sinh truyền thống giữa tuyến trùng EPN và hai chi

VKCS Photorhabdus, Xenorhabdus đƣợc báo cáo trƣớc đây. Trong công bố của

Eyualem Abebe và cộng sự, 2011 đã khẳng định mối quan hệ cộng sinh mới giữa

tuyến trùng Caenorhabditis briggsae và chủng Serratia sp. SCBI khi gây nhiễm

trên ấu trùng BSL. Mặc dù mối quan hệ này có nhiều nét tƣơng đồng với tổ hợp

Heterohabditis – Photorhabdus nhƣ việc Serratia sp. SCBI cũng đƣợc phát hiện

trong ống tiêu hóa của tuyến trùng C. briggsae, đƣợc truyền cho các thế hệ tuyến

trùng thông qua cơ thể tuyến trùng cái. Tuy nhiên hầu nhƣ chỉ có tuyến trùng trƣởng

thành mới mang vi khuẩn Serratia sp. SCBI (gần cơ quan sinh sản) và mối quan hệ

cộng sinh này dƣờng nhƣ không bắt buộc. Vì thực tế Serratia sp. SCBI đều có khả

năng giết chết sâu bằng cách nhiễm trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tuyến trùng.

Đây chính là bằng chứng của việc cộng sinh không bắt buộc và Serratia sp. SCBI

trong mối quan hệ này cũng không đóng vai trò là thức ăn chính của tuyến trùng C.

briggsae.

Trong nghiên cứu tƣơng tự của Zhang và cộng sự, năm 2009 cũng tìm thấy một

chủng vi khuẩn DZ0503SBS1(T) gram âm, tạo sắc tố đỏ, có khả năng phát quan, di

động trong ống tiêu hóa của tuyến trùng Heterorhabditidoides chongmingensis.

Đồ án tốt nghiệp

Việc giải trình tự 16s rRNA, cho thấy chủng DZ0503SBS1(T) tƣơng đồng 99,8%

với Serratia marcescens subsp. sakuensis JCM 11315(T), 99,5% với S. marcescens

subsp. marcescens DSM 30121(T). Do vậy, tiến hành giải trình tự acid béo ở vỏ

màng nhầy, kết quả thu đƣợc chủng DZ0503SBS1(T) chƣa từng tồn tại trong chi

Serratia và đƣợc đặt tên là Serratia nematodiphila sp. nov. DZ0503SBS1(T).

1.6. Khái quát về các loài côn trùng bị EPN và vi khuẩn tiêu diệt

Côn trùng là nguồn cung cấp dinh dƣỡng hết sức phong phú gồm protein, lipid và

một số thành phần khác, ngoài ra nó còn cung cấp chỗ trú ngụ tạm thời cho một vài

thế hệ tuyến trùng.

1.6.1. Đặc trưng côn trùng bị EPN tiêu diệt

N1. Đặc trSteinernema thì xác chng côn trùng bị EPN tiêu diệ

Nthì xác cHeterorhabditis thì da có màu đ n trùng bị EPN

Da xác ch màu đ n trùng bị EPN tiêu diệtết sức

1.6.2. Các loài côn trùng bị EPN tiêu diệt

a) Sâu hác

EPN có hiệu quả trong diệt trừ nhiều loài sâu hại nhƣ: sâu khoang (Spodopetera

litura); sâu keo da láng (S. exigua); sâu keo (S. mauritia); sâu xám (Agrotis

ypsilon); sâu đo xanh (Plusia sp.); sâu cuốn lá đậu tƣơng (Lamprosema indicata);

SXDL bông (Helicoverpa armigera); sâu cuốn lá bông (Sylepta flava); SXDL

bƣớm trắng ( Pieris rapae); sâu cuốn lá đơn (Parnara guttata); sâu tơ (Plutella

xylostella).

b) B. rel

Sùng bọ rầy là một loài côn trùng gây hại trầm trọng cho các sân cỏ và sân golf ở

nƣớc Mỹ. Hai loại tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis đã đƣợc thí nghiệm

bằng cách xịt lên sân cỏ và cho thấy có thể diệt 100% côn trùng hiện diện trên sân

cỏ. Các loài S. carpocapsae, S. glaseri, S. arenarium, H. bacteriophora, H. megidis.

c) Côn trùng hsaeurculionidae trên cam quýt

Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhà kính, ngoài đồng với các loại tuyến

trùng S. carpocapsae, S. glaseri, S. riobrave và H. bacteriophora cho thấy các loại

Đồ án tốt nghiệp

tuyến trùng này có thể diệt trừ một phần hoặc toàn bộ côn trùng gây hại cam quýt

trong tiểu bang Florida.

d) Dcho th

Dế nhũi là một côn trùng gây hại trầm trọng cho sân cỏ, sân đánh golf. Nguyễn

và Smart, 1990 đã tìm ra đƣợc một loài tuyến trùng từ Brazil và Uruguay và đƣợc

đặt tên là S. scapterisci. Loài tuyến trùng này có khả năng ký sinh hầu hết các loài

dế nhũi trong tiểu bang Florida và các tiểu bang Florida và các tiểu bang có khí hậu

ấm ở miền nam nƣớc Mỹ.

1.7. Khái quát về SXDL Spodoptera exigua

SXDL da láng là một loài sâu đa thực, ngoài cây hành chúng còn gây hại khá

nhiều loại cây trồng khác thuộc họ đậu đỗ, họ bầu bí, họ thập tự, họ cà, cây bông

vải, cây bắp, cây nho... vì thế việc phòng trị chúng vốn đã khó (vì loài này kháng

thuốc rất nhanh) lại càng khó hơn. Sâu non ăn lá, lúc nhỏ chừa lại biểu bì, sâu

tuổi lớn ăn thủng lỗ trên lá, không hình dạng, mật độ sâu cao có thể làm ảnh

hƣởng đến năng suất.

1.7.1. Đặc điểm hình thái

Thành trùng có kích thƣớc trung bình, thân dài 18-20 mm, sải cánh rộng 30-35

mm, màu nâu xám nhạt, cuối bụng con cái có một chùm lông.

Trứng đƣợc đẻ tập trung vào nửa đêm thành từng ổ, mỗi ổ có hàng trăm trứng.

Trên ổ trứng có phủ một lớp lông màu trắng hoặc vàng nhạt.

Sâu non có màu xanh nhạt, da bóng láng trên lƣng có năm sọc, 2 sọc ở mỗi bên

hông rất to và đậm, sọc giữa lƣng có màu đen xen kẽ màu trắng. Nhộng màu nâu

sẫm hay đỏ sẫm thƣờng ở trong đất.

1.7.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái

1.6.2.1. Vòng đời (30 – 40 ngày)

Trứng: 2 – 5 ngày

Sâu non: 15 – 20 ngày

Nhộng: 7 – 10 ngày

30 Trƣởng thành: 2 – 3 ngày

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.5. Vòng đời SXDL da láng

Trƣởng thành chủ yếu hoạt động vào ban đêm, nhất là những đêm có trăng.

Trứng đƣợc đẻ thành ổ trên lá.

Sâu non mới nở sống tập trung quanh ổ trứng, ăn chất xanh của lá để lại màng

biểu bì. Sâu tuổi 3 bắt đầu phân tán ăn toàn bộ thịt lá chỉ chừa lại gân, sâu còn ăn cả

ngọn, hoa và đục vào trái. Sâu non có 6 tuổi, sâu non ăn rất mạnh, cắn phá thành

từng lỗ không hình dạng trên lá mật độ cao có thể làm các ruộng cây màu xơ xác.

Sâu non ban ngày ẩn trong tán lá hoặc dƣới đất, phá hại mạnh vào ban đêm và

những khi trời âm u, ít nắng. Sâu đẫy sức hóa nhộng trong đất, lùm cỏ hoặc dƣới

lớp lá khô.

1.7.2.2. Thiên địch

Nhóm ký sinh có hai loài ong kén nhỏ thuộc họ Braconidae.

Loài ruồi thuộc họ Tachinidae.

Nhóm vi sinh vật có vi khuẩn tấn công.

Đồ án tốt nghiệp

1.7.3. Một số biện pháp phòng trừ

* Biện pháp canh tác:

Trƣớc khi trồng cần đƣa nƣớc làm ngập ruộng để diệt nhộng.

Cày ải phơi ruộng để diệt sâu và nhộng.

Vệ sinh đồng ruộng hủy bỏ tàn dƣ cây trồng.

Mật độ trồng thích hợp.

Bón phân cân đối hợp lý cũng là biện pháp hạn chế bớt sâu bệnh phát triển.

* Biện pháp cơ học:

Ở những thửa ruộng nhỏ có thể ngắt bỏ ổ trứng và thu sâu non khi sâu non đang

sống tập trung quanh ổ.

* Biện pháp hóa học:

Dùng chế phẩm NPV đặc hiệu trừ SXDL da láng có hiệu quả cao. Nên kết

hợp dùng thuốc thảo mộc Rotenone hay Azadirachtin. Thuốc vi sinh nhƣ: Biocin

16WP; Olong 55WP; Biocin 8000SC; Vi-BT; Xentari 15FC; Delfin WG... Ngoài ra

có thể dùng các loại thuốc nhóm Pyrethroid, Abamectin…lƣu ý dùng luân phiên

thuốc.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Thời gian

Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 25/05/2015 đến ngày 15/08/2015.

2.1.2. Địa điểm

Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng,

trƣờng Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

2.2. Vật liệu – thiết bị - hoá chất

2.2.1. Nguồn vi sinh vật

Tuyến trùng Steinernema quangdongsense XT (S – XT) và Heterorhabditis

indica CP 16 (H – CP16) do TS. Nguyễn Ngọc Châu, Viện Sinh thái Tài nguyên

Sinh vật Việt Nam cung cấp.

Nguồn vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi do

cô Đỗ Thị Tuyến, Phòng các hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện sinh học nhiệt đới

cung cấp.

Nguồn nấm Fusarium sp., Colletotrichum sp., Rhizoctonia sp., Neoscytalidium

sp. do TS. Nguyễn Thị Hai phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực

phẩm – Môi trƣờng – Đại học Công Nghệ TP. HCM cung cấp.

2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng

a. Môi trường (Thành phần môi trƣờng xem phụ lục 1)

- Môi trƣờng MacConkey (Mac)

- Môi trƣờng NBTA

- Môi trƣờng Nutrient agar (NA)

- Môi trƣờng Nutrient broth (NB)

- Môi trƣờng Peptone glycerone agar (PGA)

- Môi trƣờng Peptone glycerone broth (PG)

- Môi trƣờng Triple Sugar Iron Agar (TSI)

- Môi trƣờng Phenol Red Lactose Broth

Đồ án tốt nghiệp

- Môi trƣờng Tryptone Broth

- Môi trƣờng Simmon Citrate

- Môi trƣờng Nitrate Broth

- Môi trƣờng thạch mềm NA

- Môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase

- Môi trƣờng Gelatine

- Môi trƣờng Casein

- Môi trƣờng huyền phù chitin

b. Hóa chất sử dụng - Cồn 70o, cồn 96o

- NaCl

- HCl, NaOH

- Hóa chất nhuộm Gram

- H2O2

- Thuốc thử Kovac’s

- Thuốc thử Griess A và Griess B

- Trichloroacetic acid (TCA)

- Nƣớc muối bão hòa

2.2.3. Dụng cụ và thiết bị

a. Dụng cụ

- Hộp nuôi sâu

- Đĩa petri nhựa

- Thùng nuôi bƣớm

- Chổi lông bắt sâu

- Giấy lọc

- Ống nghiệm

- Đĩa petri

- Erlen 50ml, 100 ml, 250ml

34 - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml

Đồ án tốt nghiệp

- Pipetman 100μl, 1000μl

- Đầu típ

- Đũa thủy tinh

- Bao hấp, giấy gói, thun

- Đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy vòng

- Bông không thấm, bông thấm

- Kim tiêm, que cấy

b. Thiết bị

- Tủ cấy vi sinh

- Tủ lạnh

- Cân phân tích

- Bếp từ

- Máy nƣớc cất

- Autolave

- Tủ hút

- Máy ly tâm

- Máy lắc

- Bể điều nhiệt

- Kính hiển vi

Đồ án tốt nghiệp

2.3. Bố trí thí nghiệm

Các bƣớc bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau:

Nguồn tuyến trùng

quản trong

Đánh giá hiệu lực Xâm nhiễm trên SXDL Bảo

Thu và bảo quản sâu chết bởi nƣớc cất tuyến trùng

Khảo sát sản lƣợng, Nguồn tuyến trùng chu kì kí sinh-phát tán IJ mới

Lựa chọn phƣơng pháp

khử trùng – phân lập

Chứng minh nội sinh Định lƣợng vi sinh vật

Khảo sát hình thái khuẩn lạc trên môi trƣờng NBTA, NA, MacConkey

Chủng thuần khiết

Hình 2.1. Quy trình khảo sát sản lƣợng, chu kì kí sinh- phát tuyến trùng trên kí chủ SXDL và phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng

Đồ án tốt nghiệp

Chủng vi khuẩn

TSI Kiểm tra tính thuần khiết

Lên men Soi khuẩn lạc

đƣờng Quan sát hình thái, sinh lý

Nhuộm Gram

Catalase

OF/O–OF/F Thử nghiệm sinh hoá

Định danh sinh hóa trên

KIT API 20E Indole

Khử nitrate Định danh bằng giải mã

trình tự gene 16S rRNA Khử citrate

Oxidase So sánh trình tự gene trên

Blast NCBI Di động

Hình 2.2. Quy trình khảo sát đặc điểm sinh lý, sinh hóa và định danh vi khuẩn

Chủng vi khuẩn

Tăng sinh 24 giờ

khử trùng – phân lập

Khảo sát hoạt tính sinh học

Khả năng Kháng Tƣơng tác Kháng Kháng Enzyme

diệt sâu khuẩn tuyến trùng nấm kháng sinh

Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn mới phân lập

Đồ án tốt nghiệp

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm

2.4.1. Phương pháp nuôi sâu trong phòng thí nghiệm

Phòng nuôi sâu phải đảm bảo điều kiện nhiệt độ thích hợp cho SXDL phát triển

27 ± 20 C, và ẩm độ 70 ± 5%.

SXDL da láng Spodoptera exigua đƣợc thu mẫu từ các ruộng hành tại tỉnh Vĩnh

Long.

Thế hệ P đƣợc nuôi trong hộp nhựa và cho ăn bằng thức ăn tự nhiên (hành hái tại

ruộng) cho tới khi hóa nhộng.

Sau khi sâu hóa nh tr, lót khăn giu hóa nh trong hộp nhựa và cho ăn bằng thức ăn

tự nhiên (hành hái tại ruộng) cho tới khi 5-6 ngày nhgiu hóa nh trong hộp n

Sau khi vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy, thức ăn là

mật ong pha loãng. Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh hàng ngày.

Ổau khi vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy, thức ăn là

mật ong pha loãng. Tiến hành kiểm tra thu trứng, thay thức ăn và vệ sinh

Sâu non F1 m u non vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong t u non vũ hóa,

bƣớm t đã chu vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy, thức ăn

là mật ong pha loãng. Tiến hành kiểm tra thu trứng, t30 sâu/ hu v(Ph/ hu vũ hóa,

bƣớm thế hệ. C/ hu vũ hóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghé

T C/ hu v F1 thC/ hu v Fhóa, bƣớm thế hệ P đƣợc ghép cặp trong các thùng giấy,

thức ăn là mật ong pha loãng. Tiến hành kiể

Nhân nuôi SXDL cho đnhi Fhóa, bƣớm thế hệ P đƣợc

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu tuyến trùng in vivo

2.4.2.1 Phương pháp thử nghiệm trong đĩa petri (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Đặt 2 giấy lọc whatman (hoặc một lớp cát) vào đĩa petri có đƣờng kính 10 cm.

Đƣa số lƣợng IJ theo yếu cầu vào trên giấy lọc trong một thể tích nƣớc sao cho

giấy lọc đủ ấm nhƣng không chảy nƣớc khi nghiên đĩa.

Thêm số vật chủ vào trong đĩa theo yêu cầu và đậy nắp lại.

Giữ ẩm bằng cách cho vào một túi nilon, có trao đổi khí với bên ngoài, ủ ít nhất

trong vòng 48 giờ (lâu hơn trong điều kiện nhiệt độ lạnh).

Đồ án tốt nghiệp

Các ký chủ không có dấu hiệu bị ký sinh do tuyến trùng mà có biểu hiện bị

nhiễm bởi các vi sinh vật khác ký sinh, có mùi hôi và bị thối rửa sẽ bị loại ngay.

Còn các ký chủ chết mà không có mùi hôi và có các biểu hiện là do tuyến trùng ký

sinh sẽ đƣợc giữ lại và tiếp tục theo dõi cho đến khi phát tán.

Ghi lại tỷ lệ tử vong và kiểm tra nhiễm tuyến trùng bằng cách giải phẫu xác chết

côn trùng hoặc đếm số tuyến trùng xâm nhập vào tử thi trong vòng 48 giờ sau khi.

Các số liệu sâu chết sau khi ghi nhận sẽ đƣợc đem đi xử lý bằng dùng công thức

Abbott (1925) để tính hiệu lực diệt sâu nhƣ sau:

H% = (1- ) x 100

Trong đó:

- H: tỷ lệ sâu chết (%)

- Ta: số sâu sống ở các công thức sau thí nghiệm

- Ca: số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm

2.4.2.2 Phương pháp bẫy nước thu tuyến trùng Whitetrap (White, 1927)

Sau khi côn trùng bị nhiễm tuyến trùng và chết thì tiến hành thu bằng bẫy nƣớc

nhƣ sau.

Dùng một đĩa petri thủy tinh có đƣờng kính 15 cm đổ vào khoàng 70 ml nƣớc

cất. Đặt vào trong một gƣơng cầu lõm úp ngƣợc không để nƣớc lọt vào bên trong,

đặt lên trên một tờ giấy lọc whatman sao cho vừa gƣơng cầu và mép gấp vừa chạm

mặt nƣớc.

Đặt sâu chết (sau 3-4 ngày) lên mép mặt cầu, giữ ấm trong túi nilon, quan sát đến

khi phát tán IJ thì ta thu nƣớc phía dƣới, lấy tuyến trùng và thêm nƣớc vào thu đợt

mới.

Tuyến trùng sau khi thu đƣợc lọc rửa và bảo quản.

2.4.2.3. Phương pháp lọc rửa tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2009)

Nếu dung dịch chứa tuyến trùng mang nhiều cặn bẩn có thể dùng rây lọc kích

thƣớc lỗ 50 μm để lọc lấy IJ.

Đồ án tốt nghiệp

Để cho tuyến trùng vào một cốc nƣớc cất, để lắng, gạn phần nƣớc phía trên bỏ đi

và cho nƣớc cất mới vào (2-4 lần) cho đến khi dung dịch trở nên sạch.

Có thể dùng formalin 0.1% để rửa tuyến trùng trong lần rửa đầu tiên nếu dung

dịch có nguy cơ ôi nhiễm.

Để đẩy nhanh quá trình lắng có thể li tâm dung dịach chứa tuyến trùng ở tốc độ

300 vòng/phút trong 1 phút.

Sau khi dung dịch trong ta tiến đếm xác định mật độ và tiến hành bảo quản.

2.4.2.4. Phương pháp đếm tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, 2008)

Có hai phƣơng pháp chính là đếm trực tiếp và pha loãng.

* Đếm trực tiếp:

Chỉ dùng khi lƣợng tuyến trùng ít (1- 50 IJ), đếm từng cá thể trực tiếp dƣới kính

hiển vi. Với độ phóng đại 10 – 40X.

* Pha loãng:

Khi nồng độ tuyến trùng trong mẫu cao hơn 200 IJ/ ml thì áp dụng phƣơng pháp

này.

Bước 1: Chuẩn bị dịch pha loãng. Lắc nhẹ dung dịch chứa tuyến trùng cho phân

bố mật độ đều, lấy 1 ml từ dịch này và thêm vào X ml nƣớc, X đƣợc ƣớc lƣợng để

số lƣợng tuyến trùng vào khoảng 100 IJ/ml. Đây là l: X+1 pha loãng.

Bước 2: Đếm dung dịch pha loãng: Lần lƣợt, 1 ml dung dịch sẽ đƣợc trải ra 4-5

đĩa đếm và đếm dƣới kính hiển vi. Tiến hành đếm từ 3-5 mẫu từ 2-3 dung dịch pha

loãng khác nhau.

Để xác định nồng độ tuyến trùng trong dung dịch ban đầu sử dụng công thức:

N x x (X+1) = S

Trong đó: N là số tuyến trùng trung bình trong 1 mẫu đếm, M là số ml trong 1

mẫu đếm, X+1 là số ml pha loãng, và S là nồng độ tuyến trùng trong dung dịch ban

đầu.

2.4.2.5. Phương pháp bảo quản tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Phong, 2013)

Tuyến trùng đƣợc bảo quản ở điều kiện lạnh 10oC.

Đồ án tốt nghiệp

Nƣớc cất, pH 6.5. Nồng độ bảo quản: 104 IJ/ml.

Thể tích bảo quản: 15 ml/lọ.

2.4.2.6. Phương pháp xác định hoạt động của tuyến trùng (Albrecht M.

Koppenhofer, 2007)

Để quan sát trạng thái sống – chết của tuyến trùng trong quá trình bảo quản dƣới

kính hiển hiển vi ta dựa vào một số đặc điểm khác nhau của tuyến trùng sống vàđã

chết.

Tuyến trùng còn sống sẽ bắt đầu di chuyển sau khi đƣợc khuấy động mạnh, nhìn

chung các IJ đã chết thƣờng nằm bất động với tƣ thế thẳng còn các IJ sống di

chuyển hoặc thƣờng nằm với tƣ thế cong.

Dƣới kính hiển vi, các IJ còn sống ngoại trừ phần đầu và đuôi thì có màu tối hơn

so với các IJ đã chết. Màu tối này là bởi lƣợng lipid dự trữ bên trong tuyến trùng.

Vì vậy các IJ đã chết có thân hình trong hơn do lƣợng lipid dự trữ không còn.

Cuối cùng kiểm tra khả năng xâm nhiễm của tuyến trùng bằng cách thử nghiệm

trên đĩa petri.

2.4.2.7. Thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16

trên đối tƣợng SXDL tuổi 4

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm xác định LD50 cho 2 chủng tuyến trùng S – XT và H –

CP16 trên đối tượng SXDL tuổi 4

Nghiệm thức Nồng độ gây nhiễm Số lƣợng sâu gây nhiễm

(IJ/sâu)

5 20 1

10 20 2

15 20 3

20 20 4

25 20 5

30 20 6

35 20 7

40 20 8

45 20 9

50 20 10

0 20 Đối chứng

- Điều kiện:

Nhiệt độ: nhiệt độ phòng.

Thời gian: 2 ngày.

Độ ẩm: 70- 95%.

Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp thí nghiệm trên đĩa prtei

và thu hoạch bằng phƣơng pháp bẫy nƣớc Whitetrap.

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 10 nghiệm

thức gây nhiễm và 1 nghiệm thức đối chứng.

- Chỉ tiêu theo dõi:

Nồng độ (mật độ) IJ gây nhiễm lên ký chủ.

Số lƣợng sâu chết.

Đồ án tốt nghiệp

- Ghi nhận và xử lý số liệu:

Ghi nhận số sâu chết, đặc điểm sâu chết do tuyến trùng.

Xác định tỷ lệ sâu chết bằng dùng công thức Abbott (1925).

Xác định chỉ số LD50.

Vẽ biểu đồ thể hiện mối tƣơng quan giữa tỷ lệ chết và nồng độ IJ gây nhiễm.

2.4.2.8. Thí nghiệm khảo sát sự tương quan giữa số lượng gây nhiễm - sản lượng IJ

và chu kì kí sinh – phát tán của các chủng tuyến trùng trên vật chủ SXDL

* Thí nghiệm a: Sự tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm và sản lƣợng IJ sinh ra

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm tƣơng quan giữa số lƣợng gây nhiễm và sản lƣợng IJ

sinh ra đối với 2 chủng tuyến trùng

Nghiệm thức Nồng độ gây nhiễm Số lƣợng sâu gây nhiễm

(IJ/sâu)

1 1 5

1 2 10

1 3 15

1 4 20

1 5 25

1 6 30

1 7 35

1 8 40

1 Đối chứng 0

- Điều kiện:

Sâu tuổi 4.

Nhiệt độ: nhiệt độ phòng

Độ ẩm: 70- 95%

Đồ án tốt nghiệp

Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp thí nghiệm trên đĩa petri

và thu hoạch bằng phƣơng pháp bẫy nƣớc Whitetrap.

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 5

nghiệm thức gây nhiễm và 1 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

- Chỉ tiêu theo dõi:

Tổng sản lƣợng IJ sinh ra ở mỗi nồng độ gây nhiễm từ đó suy ra nồng độ

nhiễm tối ƣu.

* Thí nghiệm b: Khảo sát chu kỳ kí sinh và phát tán của các chủng tuyến trùng

- Bố trí thí nghiệm:

Số lƣợng: 1 sâu/đĩa

Nồng độ: chọn nồng độ tối ƣu ở thí nghiệm 1

Thí nghiệm lặp lại 3 lần

- Điều kiện:

Sâu tuổi 4.

Nhiệt độ: nhiệt độ phòng

Độ ẩm: 70- 95%

Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp thí nghiệm trên đĩa prtei

và thu hoạch bằng phƣơng pháp bẫy nƣớc Whitetrap.

- Chỉ tiêu theo dõi:

Ngày bắt đầu phát tán và sản lƣợng IJ sinh ra ở mỗi ngày, từ đó xem xét độ

phát tán tập trung.

2.4.2.9. Thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng S – XT, H

– CP16 bằng phương pháp tiêm và bước đầu xác định tác nhân gây chết

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến trùng

S – XT, H – CP16 bằng phƣơng pháp tiêm

Nghiệm thức Nồng độ gây nhiễm Số lƣợng sâu gây nhiễm

(IJ/sâu)

5 6 1

10 6 2

0 6 Đối chứng

- Điều kiện:

Sâu tuổi 4.

Tuyến trùng đã khử trùng bề mặt.

Nhiệt độ: nhiệt độ phòng

Thời gian: theo dõi đến khi đối chứng hoá nhộng.

Độ ẩm: 70- 95%

Các nghiệm thức đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp tiêm, đối chứng.

Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 2

nghiệm thức gây nhiễm và 1 nghiệm thức đối chứng.

Sâu ở nghiệm thức đối chứng đƣợc tiêm dung dịch tiêm (0,85% NaCl và 0,1%

peptone).

Tiến hành rút và ria giọt huyết tƣơng từ sâu chết do tuyến trùng sau 48 giờ trên

môi trƣờng NBTA, bƣớc đầu xác định nguyên nhân gây chết sâu.

- Chỉ tiêu theo dõi:

Thời gian và dấu hiệu sâu chết do phƣơng pháp tiêm.

Sự hiện diện của vi sinh vật trên môi trƣờng NBTA.

Đồ án tốt nghiệp

2.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn

2.4.3.1. Phương pháp phân lập được cải tiến từ phương pháp của Akhurst (1980) và

Sun Ho Park và Yeon Su Yu (1999) (Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2009)

Tuyến trùng đƣợc trữ lạnh ở 10oC lấy ra để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để

tuyến trùng hoạt động trở lại.

Khử trùng bề mặt IJ

Rửa 2 – 3 lần bằng formalin 0,1%, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần.

Ly tâm ở 500 vòng/phút trong 2 phút hoặc để lắng tự nhiên, thu dịch tuyến trùng.

Ngâm trong dung dịch NaClO 0,5% 10 phút, lặp lại 2 lần, rửa lại bằng nƣớc cất

vô trùng 3 lần. Ly tâm ở 500 vòng/phút trong 2 phút hoặc để lắng tự nhiên, thu dịch

tuyến trùng.

Ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 30 phút để giải phóng vi khuẩn.

Cho vi khuẩn tăng sinh trên môi trƣờng NB trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng, điều

kiện tối và lắc 210 vòng/phút.

Sau khi tăng sinh pha loãng canh trƣờng vi khuẩn bằng nƣớc muối sinh lý 0,85%,

chọn 3 độ pha loãng cấy trang trên môi trƣờng MacConkey, ủ ở nhiệt độ phòng

trong bóng tối 48 giờ, mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần.

Sau thời gian ủ, chọn khuẩn lạc đặc trƣng cấy thuần lại trên môi trƣờng

MacConkey, Nutrient agar (NA) và Peptone glycerol agar (PGA) để khảo sát hình

thái khuẩn lạc.

Đồ án tốt nghiệp

Rửa 2 - 3 lần với formaline 0,1 %

Ngâm trong dung dịch NaClO 0,5% 15

phút

Ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút

Tăng sinh trên môi trƣờng NB 48 giờ,

trong tối, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng

Phân lập trên môi trƣờng thạch

MacConkey

Cấy thuần trên môi trƣờng thạch

MacConkey

Cấy trên môi trƣờng thạch NA và PGA

chọn chủng tổng hợp sắc tố

Mẫu tuyến trùng EPN

Hình 2.4. Quy trình phân lập vi khuẩn từ tuyến trùng EPN

Đồ án tốt nghiệp

2.4.3.2. Phương pháp phân lập được cải tiến từ phương pháp của Lawrwnce A.

Lacey (2011)

- Khử trùng bề mặt IJ:

Chuyển 2 ml dung dịch tuyến trùng (400 IJ) vào ống ly tâm, tiến hành ly tâm.

Loại bỏ nƣớc và thêm vào 1 ml dung dịch Javel 1%, giữ trong 1 phút.

Tiến hành ly tâm 15000 vòng/phút trong 3 phút.

Loại bỏ dung dịch Javel và thêm vào 1 ml nƣớc cất vô trùng.

- Lặp lại các bƣớc khử trùng 7 lần.

Tiếp tục ly tâm 15000 vòng/phút trong 3 phút.

- Bổ sung bụi thủy tinh vào nƣớc rửa của lần khử trùng cuối, ly tâm 15000

vòng/phút trong 30 phút, sử dụng đũa thủy tinh vô trùng nghiền nát tuyến trùng giải

phóng vi khuẩn.

- Cấy ria dịch ly tâm từ tuyến trùng lên đồng thời ba môi trƣờng (có bổ sung

pyruvate) NBTA, McConkey và peptone glycerol agar (PGA). Quan sát hình thái

khuẩn lạc.

- Tạo chủng thuần khiết, giữ giống lạnh đông và giống trong ống thạch nghiêng.

2.4.3.3. Phương pháp chứng minh nội sinh

Sau mỗi lần khử trùng bề mặt, hút 0,1 ml dịch trong từ ống ly tâm, trải đĩa trên

môi trƣờng PCA. Lặp lại 3 lần ở nƣớc rửa cuối cùng trong bƣớc khử trùng bề mặt.

Đối với phƣơng pháp phân lập mô tả bởi Nguyễn Hòang Anh Kha (2009), tiến

hành định tính sự hiện diện của vi sinh vật trong nƣớc rửa cuối cùng trƣớc khi phá

vỡ tuyến trùng.

Đối với phƣơng pháp Lawrwnce A. Lacey (2011), sự hiện diện của vi sinh vật

đƣợc kiểm tra qua 7 lần, mỗi lần ứng với nƣớc rửa cuối cùng của bƣớc khử trùng bề

mặt.

Vi khuẩn khuẩn phân lập đƣợc xem là nội sinh trong tuyến trùng khi trong nƣớc

rửa cuối cùng không có sự xuất hiện của bất kì vi sinh vật nào.

Đồ án tốt nghiệp

2.4.3.4. Phương pháp định lượng vi khuẩn nội sinh

- Khử trùng bề mặt IJ:

Đƣợc tiến hành tƣơng tự trong mục 2.4.3.3. Để giảm thiểu tối đa lƣợng tuyến

trùng bị mất sau mỗi lần ly tâm, sau mỗi lần rửa, dịch sẽ đƣợc lọc qua tấm giấy lọc

vô trùng.

- Lặp lại bƣớc khử trùng 7 lần.

- Chuyển toàn bộ tuyến trùng trên giấy lọc vào ống ly tâm chứa 1ml nƣớc cất vô

trùng.

- Ly tâm 15000 vòng/phút trong 30 phút có bổ sung bụi thủy tinh, và cuối cùng

đƣợc nghiền bởi đũa thủy tinh.

- Pha loãng dịch nghiền 10-1 – 10-5 trong nƣớc muối sinh lý. Ở mỗi nồng độ, tiến

hành trải 3 đĩa trên môi trƣờng NBTA để định tính và định lƣợng các chủng vi

khuẩn nội sinh trong tuyến trùng.

- Số lƣợng vi khuẩn trong 1 IJ đƣợc tính bở công thức sau:

N =

N là số vi sinh vật trong một IJ.

C là tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên tất cả các đĩa Petri đƣợc giữ lại;

V là thể tích trải đĩa;

n1 là số đĩa đƣợc giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;

ni là số đĩa đƣợc giữ lại ở độ pha loãng thứ i;

d là hệ số pha loãng tƣơng ứng với độ pha loãng thứ nhất;

400 là lƣợng IJ đem phân tích.

- Sự định lƣợng lặp lại 3 lần ở các mẫu ngẫu nhiên của mỗi chủng tuyến trùng.

2.4.4. Phương pháp định danh vi khuẩn phân lập

2.4.4.1. Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết

Tiến hành cấy ria các chủng vi khuẩn trong ống thạch nghiêng vừa phân lập

đƣợc trên môi trƣờng NBTA, MacConkey. Quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm

gram, soi khuẩn lạc lạc dƣới kính hiển vi ở vật kính 4X. Quan sát màu sắc khuẩn

Đồ án tốt nghiệp

lạc, hình dạng, bề mặt, hình dạng tế bào, loại Gram. Khuẩn lạc có màu sắc, bề mặt,

hình dạng đặc trƣng giống nhƣ kết quả ban đầu, không có các màu sắc và sắc tố lạ

thì đƣợc coi là tinh khiết.

2.4.4.2. Phương pháp quan sát hình thái, sinh lý

Gồm phƣơng pháp soi khuẩn lạc, nhuộm gram xem chi tiết tại phụ lục 1.

2.4.4.3. Thử nghiệm sinh hoá

Gồm các thử nghiệm TSI, khả năng lên men lactose, khả năng lên men arabinose,

catalase, oxidase, khả năng lên men - oxi hóa, khả năng sinh indole, khả năng khử

nitrate, khả năng sử dụng Citrate, khả năng di động xem chi tiết tại phụ lục 1. 2.4.4.4. Phương pháp định danh bằng APIKIT 20E

Sau khi kiểm tra độ thuần khiết và một số phản ứng sinh hóa đặc trƣng, tiến hành định danh chủng vi khuẩn bằng kit sinh hóa APIKIT 20E theo hƣớng dẫn nhà sản

xuất Biomerieux (xem phụ lục 1).

Sau khi đọc kết quả test API, dò các hệ số bằng bằng phần mềm ứng dụng sẽ

kết luận đƣợc các chủng vi khủng thuộc loài vi sinh vật nào.

2.4.4.5. Giải trình tự 16S rRNA

Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gene rRNA 16S. RNA đƣợc trích ly

từ vi khuẩn phân lập thuần khiết và gene mã hóa rRNA 16S đƣợc khuếch đại bằng

phƣơng pháp PCR sử dụng mồi phổ biến (universal primer) BAC-F-(5'-AGA GTT

TGA TC(AC) TGG CTC AG-3') BAC-R (5'AAG GAG GTG (AT)TC CA(AG)

CC-3'), sau đó đƣợc giải mã trình tự (do công ty NamKhoa Biotek tiến hành). Trình

tự sau đó đƣợc so sánh với các chủng của GENBANK.

2.4.5. Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học

2.4.5.1. Phương pháp định tính enzyme

Thử nghiệm hoạt tính lipase

Pha môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50 oC đổ ra các đĩa petri. Dùng que cấy thẳng cấy sinh

khối của hai chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri môi trƣờng thử nghiệm

Đồ án tốt nghiệp

hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đo đƣờng kính vòng tủa trên bề

mặt môi trƣờng. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Thử nghiệm hoạt tính protease

Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, lắc 150

vòng/phút trong tối bằng môi trƣờng NB.

Pha môi trƣờng geltatine agar và môi trƣờng casein agar, hấp 121 oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50 oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch

trên mỗi đĩa agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Cho 20 μl

dịch trong của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào hai giếng thạch, giếng còn lại

cho 20 μl môi trƣờng nutrient broth để làm đối chứng. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt

phòng, 24 giờ.

Sau thời gian ủ, tráng TCA 10%. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d, mm),

với D là đƣờng kính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Thử nghiệm hoạt tính chitinase

Vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, lắc 150

vòng/phút trong tối bằng môi trƣờng NB.

Pha môi trƣờng thạch huyền phù chitin, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội đến khoảng 50 oC đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa

agar môi trƣờng, đƣờng kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Cho 20 μl dịch trong

của canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn vào hai giếng thạch, giếng còn lại cho 20 μl môi

trƣờng NB để làm đối chứng. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt phòng, 24 giờ.

Sau thời gian ủ, tráng thuốc thử lugol. Đo kích thƣớc vòng phân giải (D-d,

mm), với D là đƣờng kính vòng phân giải. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

2.4.5.2. Phương pháp khảo sát khả năng kháng kháng sinh

Sử dụng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán (do công ty Nam Khoa

Biotek tiến hành) theo tiêu chuẩn kháng sinh dành cho vi khuẩn đƣờng ruột. Chi tiết

xem phụ lục 1.

2.4.5.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn- phương pháp cấy chéo

51 Chuẩn bị môi trƣờng NA đƣợc vô trùng tại 1210C, 1 atm, trong 15 phút.

Đồ án tốt nghiệp

Các chủng vi khuẩn thử nghiệm sẽ đƣợc thực hiện cấy ria từ ống nghiệm giữ

giống lên đĩa petri chứa môi trƣờng NA để tạo khuẩn lạc thuần riêng rẽ. Ủ các đĩa

qua đêm ở nhiệt độ phòng.

Chủng vi khuẩn chỉ thị sẽ đƣợc thực hiện cấy ria từ ống nghiệm giữ giống lên đĩa

petri chứa môi trƣờng nutrient agar để tạo khuẩn lạc thuần riêng rẽ. Ủ các đĩa qua

đêm ở 37oC.

Tiến hành đối kháng:

Đối kháng không tiếp xúc: Từ đĩa petri của vi khuẩn thử nghiệm, chọn một

khuẩn lạc thuần riêng rẽ rồi thực hiện cấy một đƣờng thẳng dọc xuống, ủ 24 giờ.

Sau đó, từ đĩa petri của vi khuẩn chỉ thị, cũng chọn một khuẩn lạc thuần riêng rẽ rồi

thực hiện cấy một đƣờng thẳng từ mép ngoài vào sát với vạch cấy vi khuẩn thử

nghiệm nhƣng không đƣợc chạm nhau. Thực hiện lần lƣợt với hai chủng vi khuẩn

thử nghiệm và ba chủng vi khuẩn chỉ thị, mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Sau đó,

đem tất cả các đĩa petri đi ủ 24 giờ, ở nhiệt độ phòng và 37oC trong bóng tối.

Đối kháng tiếp xúc: Từ đĩa petri của vi khuẩn thử nghiệm, chọn một khuẩn lạc

thuần riêng rẽ rồi thực hiện cấy một đƣờng thẳng dọc xuống, sau đó, từ đĩa petri của

vi khuẩn chỉ thị, cũng chọn một khuẩn lạc thuần riêng rẽ rồi thực hiện cấy một

đƣờng thẳng ngang qua, sao cho hai đƣờng giao nhau tại trung tâm của đĩa petri.

Thực hiện lần lƣợt với hai chủng vi khuẩn thử nghiệm và ba chủng vi khuẩn chỉ thị,

mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Sau đó, đem tất cả các đĩa petri đi ủ 24 giờ, ở

nhiệt độ phòng và 37oC trong bóng tối.

- Đọc kết quả:

Đối kháng không tiếp xúc: Dùng thƣớc hoặc compa đo khoảng cách giữa mép

của vạch xạ khuẩn với vạch của vi khuẩn thử nghiệm. Khoảng cách càng lớn chứng

tỏ khả năng đối kháng của vi khuẩn thử nghiệm càng mạnh.

Đối kháng tiếp xúc: Nếu xảy ra hiện tƣợng kháng khuẩn thì ở điểm giao nhau

của hai đƣờng cấy, vi khuẩn chỉ thị không phát triển đƣợc. Nếu không có hiện

tƣợng kháng khuẩn thì ở điểm giao nhau của hai đƣờng cấy, vi khuẩn chỉ thị vẫn

phát triển bình thƣờng.

Đồ án tốt nghiệp

2.4.5.4. Khảo sát hoạt tính kháng nấm

Chuẩn bị môi trƣờng NA, PDA đƣợc vô trùng tại 121oC, 1 atm, trong 15 phút.

Các chủng vi khuẩn thử nghiệm sẽ đƣợc thực hiện cấy ria từ ống nghiệm giữ

giống lên đĩa petri chứa môi trƣờng NA để tạo khuẩn lạc thuần riêng rẽ. Ủ các đĩa

qua đêm ở nhiệt độ phòng.

Các chủng nấm từ ống nghiệm giữ giống sẽ đƣợc hoạt hóa bằng cách dùng dây

cấy vô trùng cấy điểm sang đĩa petri chứa môi trƣờng potato dextro agar có bổ sung

kháng sinh chloramphenicol 0,02% để ức chế sự phát triển của các vi khuẩn. Ủ

trong 3 ngày.

Tiến hành đối kháng: Trên đĩa thạch môi trƣờng PDA (giảm ½ đƣờng, thêm 1%

peptone), tiến hành cấy khoanh thạch của nấm chỉ thị (đƣờng kính 5mm) từ đĩa

PDA đặt ngay tâm đĩa petri, Ủ 48 giờ. Sau đó, dùng que cấy vòng cấy vạch các

chủng vi khuẩn thử nghiệm cách mép ngoài đĩa 1,5 cm (2 vạch chủng vi kuẩn phải

nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đƣờng kính). Ủ các đĩa ở 72 giờ hoặc

hơn tuỳ vào khả năng tăng trƣởng của nấm, nhiệt độ phòng.

Đọc kết quả: đo chiều rộng của vòng ức chế, dựa vào kích thƣớc của vòng ức chế

để đánh giá hiệu lực đối kháng.

2.4.5.5. Khảo sát hiệu lực diệt sâu bằng phương pháp tiêm

- Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ:

Pha môi trƣờng Peptone Glyxerol và dung dịch tiêm, dụng cụ để pha loãng;

đem hấp vô trùng ở 121oC, 1 atm, trong 15 phút. Chuẩn bị lá thầu dầu để nuôi sâu,

- Chuẩn bị vi khuẩn:

kiêm tiêm vô trùng (30G)

Mật độ tế bào vi khuẩn tƣơng ứng với từng độ pha loãng tại mỗi nghiệm thức

đƣợc xác định bằng phƣơng pháp trải đĩa và đếm khuẩn lạc.

bằng cách hút 1ml canh trƣờng cho vào 9 ml dung dịch pha loãng, thực

Pha loãng vi khuẩn thử nghiệm: từ canh trƣờng tăng sinh của hai chủng vi

và10-10.

khuẩn Serratia marcescens SB và Serratia marcescens HB, tiến hành pha loãng nồng độ 10-1 hiện tƣơng tự cho các nồng độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8, 10-9

Đồ án tốt nghiệp

Tăng sinh vi khuẩn chỉ thị E.coli, pha loãng đến các nồng độ sao cho đạt 5 x

104, 5 x 103, 5 x 102 cfu/5μl.

- Chuẩn bị sâu:

Trứng SXDL da láng Spodoptera exigua đƣợc ấp nở và nuôi lớn bằng lá thầu

dầu cho đến đầu tuổi 4.

- Tiến hành thí nghiệm:

Chuẩn bị hộp đựng sâu thí nghiệm: các hộp nhựa thí nghiệm đƣợc rửa sạch,

khử trùng bằng dung dịch clorine 5% và rửa lại bằng nƣớc sôi, sau đó để khô tự

nhiên. Tiếp theo, cắt lá thầu dầu thành từng mảnh nhỏvới kích thƣớc khoảng 3 m ×

3 cm, rồi cho lần lƣợt 5 mảnh vào một hộp nhựa.

và

Mỗi hộp đối chứng âm chứa 10 SXDL và mỗi SXDL đƣợc tiêm 5μl dung dịch

pha loãng. Mỗi hộp thí nghiệm chứa 10 SXDL và mỗi SXDL đƣợc tiêm 5μl dung dịch vi khuẩn ở nồng độ 10-6. Thực hiện lần lƣợt cho các nồng độ 10-7, 10-8, 10-9 10-10. Tiến hành tƣơng tự với đối chứng E. coli tại các nồng độ đã bố trí.

Tiến hành rút và ria giọt huyết tƣơng từ sâu chết trên môi trƣờng NBTA, xác

nhận tác nhân gây chết sâu.

- Đọc kết quả:

Theo dõi số lƣợng sâu tử vong lần lƣợt sau 6 giờ để đánh giá hiệu quả diệt sâu

của hai chủng vi khuẩn SB, HB và đối chứng E. coli, so sánh và mô tả hình thái sâu

tử vong ở từng nghiệm thức so với đối chứng dƣơng, đồng thời tính toán LD50 và

LD90 của hai chủng này.

2.4.5.6. Khảo sát sự tính tương tác tổ hợp vi khuẩn và tuyến trùng EPN

Chuẩn bị môi trƣờng Lipid Agar, pipetman hấp tiệt trùng ở 121oC, 1 atm, trong

15 phút.

Chủng vi khuẩn thử nghiệm đƣợc tăng sinh 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, lắc 150

vòng/phút trong tối bằng môi trƣờng NB.

Tuyến trùng dự trữ đƣợc đƣa về nhiệt độ phòng, pha loãng đạt 5 IJ/μl.

Đồ án tốt nghiệp

Tiến hành thí nghiệm: Dùng pipetman chuyển 800 μl canh trƣờng vi khuẩn lên

bề mặt Lipid agar, xoay nhẹ đĩa để canh trƣờng trải đều. Sau đó, tiếp tục chuyển 20

μl dung dịch tuyến trùng đã pha loãng. Ủ ở nhiệt độ phòng 12 - 14 ngày.

Đối chứng là các đĩa Lipid Agar chứa 20 μl dung dịch tuyến trùng đã pha loãng

và 800 μl nƣớc cất.

Đọc kết quả: sau mỗi 3 ngày, chuyển một lƣợng nƣớc vừa phải lên bề mặt đĩa để

tráng và thu hỗn hợp tuyến trùng. Tiến hành đếm số lƣợng tuyến trùng hoạt động

dƣới kính hiển vi vật kính 4X. Đọc kết quả lần cuối vào ngày thứ 12. Tính tỉ lệ chết

(%) ở mỗi đĩa sau thời gian 3, 6, 9, 12 ngày. Vẽ đồ thị xử lý thống kê so sánh tỉ lệ

chết giữa đối chứng và thí nghiệm.

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả đánh giá LD50 của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16

SXDL (Spodoptera exigua) là loài sâu đa thực gây hại chủ yếu trên hành và

nhiều loại cây trồng khác thuộc họ thập tự, bầu bí, họ cà, nho,… Tuy nhiên, từ trƣớc

đến nay, vẫn chƣa có bất kì kết quả đánh giá về hiệu lực của 2 chủng tuyến trùng S

– XT và H – CP16 trên SXDL đƣợc công bố. Vì vậy, việc thí nghiệm xác định LD50

của 2 chủng tuyến trùng trên SXDL góp phần xác định thêm phổ kí chủ cho 2 chủng

tuyến trùng này.

Dấu hiệu nhận biết đối tƣợng kí chủ chết do tuyến trùng ký sinh

Nhận biết dấu hiệu sâu chết do tác nhân tuyến trùng cũng đóng vai trò quan trọng

trong quá trình ghi nhận và xử lý số liệu khi tiến hành thí nghiệm. Kết quả theo dõi

hình thái sâu sau khi chết, kết hợp với theo dõi sự phát tán của IJ cho thấy, dấu hiệu

sâu chết bởi tuyến trùng ký sinh sẽ không có mùi hôi, không nhiễm các vi sinh khác

nhƣ nấm và có màu sắc, biểu hiện đặc trƣng (hình 3.1).

Sâu chết do bị nhiễm tuyến trùng S – XT: màu sắc cơ thể chuyển từ hồng nhạt

sang hồng đậm đến nâu đỏ phần bụng căng tròn, cứng, không mềm nhũn.

Sâu chết do bị nhiễm tuyến trùng H – CP16: cơ thể ửng màu đỏ sậm, phần bụng

căng tròn, cứng hơn so với sâu chết bởi tuyến trùng S – XT.

B

A

C Hình 3.1. Dấu hiệu SXDL chết bởi tuyến trùng

A. SXDL trƣớc khi nhiễm; B. SXDL chết bởi tuyến trùng S – XT; C. SXDL chết

bởi tuyến trùng H – CP16

Đồ án tốt nghiệp

3.1.1. Chủng S – XT

Thí nghiệm trên SXDL tuổi 4 đƣợc tiến hành với 10 công thức nồng độ gây

nhiễm từ 5-50 IJ/sâu và 1 công thức đối chứng không gây nhiễm IJ, ở mỗi nghiệm

thức lặp lại 3 lần với tổng số là 220 sâu. Kết quả đƣợc t nh bày trong bảng sau:

Bảng 3.1. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng S – XT

Tỷ lệ sâu chết (%) Số lƣợng IJ/sâu Số lƣợng thí nghiệm Số sâu chết Sau 2 ngày phơi nhiễm

0 (đối chứng) 20 0 0

5 20 12 60

10 20 13 65

15 20 15 75

20 20 17 85

25 20 18 90

30 20 19 95

35 20 19 95

40 20 20 100

45 20 20 100

50 20 20 100

LD50= 4,84 ± 0.01IJ

Theo dõi tỉ lệ sâu chết sau 2 ngày phơi nhiễm cho thấy: SXDL tuổi 4 có độ mẫn

cảm cao với chủng S – XT. Từ những nồng độ phơi nhiễm rất nhỏ 5 IJ/sâu, tỉ lệ chết

đã đạt 60%. Tỉ lệ chết tăng dần từ 65 – 75% ở các nồng độ phơi nhiễm từ 10 – 15

IJ/sâu. Ở các nghiệm thức có nồng độ phơi nhiễm từ 20 – 35 IJ/sâu thì tỉ lệ chết lên

đến 85 – 95%. Với nồng độ phơi nhiễm 40 – 50 IJ/sâu thì tỉ lệ chết đạt cực đại

100%.

Đồ án tốt nghiệp

Giá trị LD50 đối với SXDL tuổi 4 tƣơng ứng là 7,4 cho thấy chủng S – XT có độc

tính rất mạnh, mặc dù SXDL cũng là đối tƣợng kháng mạnh với nhiều thuốc hóa

100

học.

)

y = -0.025x2 + 2.3023x + 47.25 R² = 0.9886

( t ế h c ệ l ỷ T

25 40 Nồng độ gây nhiễm (IJ/sâu)

Hình 3.2. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng S

– XT trên SXDL tuổi 4 Giá trị tƣơng quan R2= 0,9886 thể hiện sự tƣơng quan chặt chẽ giữa nồng độ gây

nhiễm IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng S – XT trên SXDL tuổi 4.

Kết quả phân tích thống kê hàm bậc 2 dựa trên số liệu thực nghiệm cho thấy với đồ thị y = -0,025x2 + 2,3023x + 47,25, tỉ lệ chết có quan hệ tuyến tính với nồng độ

gây nhiễm IJ/sâu, giá trị cực trị 46 IJ/sâu ứng với tỉ lệ chết 100%. Vì đồ thị là một

hàm parabol lồi nên các nồng độ gây nhiễm khác nằm ngoài đoạn [43;49] khác với

giá trị cƣc đại thì ứng với tỉ lệ chết thấp hơn. Hơn thế nữa, nếu nồng độ gây nhiễm

càng vƣợt trên khỏi giá trị cực trị 46 IJ/sâu thì càng không còn mối quan hệ tuyến

tính giữa tỉ lệ chết và nồng độ gây nhiễm IJ/sâu.

3.1.2. Chủng H – CP16

Thí nghiệm trên SXDL tuổi 4 đƣợc tiến hành với 10 công thức nồng độ gây

nhiễm từ 5 – 50 IJ/sâu và 1 công thức đối chứng không gây nhiễm IJ, ở mỗi

Đồ án tốt nghiệp

nghiệm thức lặp lại 3 lần với tổng số là 220 sâu. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng

Bảng 3.2. Hiệu lực gây chết SXDL tuổi 4 của chủng H – CP16

Tỷ lệ sâu chết (%) Số lƣợng IJ/sâu Số lƣợng thí nghiệm Số sâu chết Sau 2 ngày phơi nhiễm

0 (đối chứng) 20 0 0

5 20 11 55

10 20 14 70

15 20 15 75

20 20 17 85

25 20 18 90

30 20 18 90

35 20 19 95

40 20 20 100

45 20 20 100

50 20 20 100

LD50= 4,81 ± 0,01 IJ

Theo dõi tỉ lệ sâu chết sau 2 ngày phơi nhiễm cho thấy: SXDL tuổi 4 có độ mẫn

cảm cao với chủng H – CP16. Từ những nồng độ phơi nhiễm rất nhỏ 5 IJ/sâu, tỉ lệ

chết đã đạt 55%. Tỉ lệ chết tăng dần từ 70 – 75% ở các nồng độ phơi nhiễm từ 10 –

15 IJ/sâu. Ở các nghiệm thức có nồng độ phơi nhiễm từ 20 – 35 IJ/sâu thì tỉ lệ chết

lên đến 85 – 95%. Với nồng độ phơi nhiễm 40 – 50 IJ/sâu thì tỉ lệ chết đạt cực đại

100%.

Giá trị LD50 đối với SXDL tuổi 4 tƣơng ứng là 7,5 cho thấy chủng H – CP16 có

độc tính rất mạnh. Kết quả này cũng phù hợp với một số công bố trƣớc đây trong

việc đánh giá hiệu lực đƣơc xem là có tiềm năng của hai chủng tuyến trùng H –

MP11 và H – NT3 trên SXDL tƣơng ứng lần lƣợt với LD50 = 12 và LD50 = 14

Đồ án tốt nghiệp

(Nguyễn Ngọc Châu, 2008). Điều này cho thấy hiệu quả trong việc sử dụng chủng

100

H – CP16 trong phòng trừ SXDL là rất khả thi.

)

y = -0.025x2 + 2.3083x + 46.583 R² = 0.9818

( t ế h c ệ l ỷ T

10 25 40 Nồng độ gây nhiễm (IJ/sâu)

Hình 3.3. Tƣơng quan giữa nồng độ gây IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng H –

CP16 trên SXDL tuổi 4 Giá trị tƣơng quan R2= 0,9818 thể hiện sự tƣơng quan chặt chẽ giữa nồng độ gây

IJ/sâu với tỉ lệ sâu chết của chủng H – CP16 trên SXDL tuổi 4.

Tƣơng tự nhƣ chủng S – XT, kết quả phân tích thống kê hàm bậc 2 dựa trên số liệu thực nghiệm của củng H – CP16 cho thấy với đồ thị y = -0,025x2 + 2,3083x +

46,583, tỉ lệ chết có quan hệ tuyến tính với nồng độ gây nhiễm IJ/sâu, giá trị cực trị

46 IJ/sâu ứng với tỉ lệ chết ≈ 100%. Vì đồ thị là một hàm parabol lồi nên các nồng

độ gây nhiễm khác nằm ngoài đoạn [45;47] khác với giá trị cực đại thì ứng với tỉ lệ

chết thấp hơn. Hơn thế nữa, nếu nồng độ gây nhiễm càng vƣợt trên khỏi giá trị cực

trị 46 IJ/sâu thì càng không còn mối quan hệ tuyến tính giữa tỉ lệ chết và nồng độ

gây nhiễm IJ/sâu.

3.2. Khả năng sinh sản của tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên SXDL

Bƣớm sáp lớn (BSL) đƣợc xem là côn trùng lý tƣởng cho việc nhân sinh khối đối

với hầu hết các chủng tuyến trùng EPN do BSL rất nhạy cảm với tuyến trùng và cho

hệ số nhân rất lớn. Tuy nhiên việc nhân nuôi BSL gặp nhiều khó khăn trong điều

Đồ án tốt nghiệp

kiện phòng thí nghiệm. Do vậy việc tìm ra những loài côn trùng khác nhạy cảm và

có hệ số nhân cao đáp ứng cho nhân nuôi in vivo tuyến trùng EPN là điều cần thiết.

SXDL (Spodoptera exigua) là đối tƣợng sâu hại phổ biến và nhân nuôi đơn giản.

Thông qua thí nghiệm đánh giá hiệu lực LD50 cũng cho thấy đây là loài sâu khá mẫn

cảm với 2 chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 nên thí nghiệm nghiên cứu đánh

giá tỉ lệ nhân của 2 chủng tuyến trùng trên đối tƣợng này là điều kiện cần để kết

luận khả năng nhân nuôi in vivo 2 chủng tuyến trùng trên SXDL.

Bảng 3.3. Khả năng sinh sản của chủng S – XT trên SXDL

Nồng độ gây Chủng S - XT, Sản lƣợng IJ/sâu

nhiễm (IJ/sâu) Tỷ lệ nhân

Thấp nhất Cao nhất Trung bình (lần)

5 12009 2411

10 30030 12130 12053 ± 51 a 30700 30420 ± 260 b 3042

15 45907 3066

20 45307 2280

25 44320 1786

30 35030 1277

35 25039 722

40 9549 46101 45994 ± 72 c 45973 45594 ± 253 c 44930 44645 ± 218 c 39980 38300 ± 2180 d 25482 25277 ± 1589 e 9810 9658 ± 101 f 241

P - Value = 0

Bảng 3.4. Khả năng sinh sản của chủng H – CP16 trên SXDL

Chủng H - CP16, Sản lƣợng IJ/sâu Nồng độ gây Tỷ lệ nhân nhiễm (IJ/sâu) Thấp nhất Cao nhất Trung bình (lần)

5 22109 4424

10 56231 22130 22120 ± 7 a 56723 56498 ± 178 b 5650

15 85937 86121 86007 ± 76 c 5734

Đồ án tốt nghiệp

20 85327 4281

25 84324 3426

30 71029 2421

35 50100 1437

40 18550 85983 85614 ± 246 c 86693 85651 ± 884 d 73861 72624 ± 1063 e 50488 50301 ± 134 e 18812 18662 ± 100 f 467

P - Value = 0

3.2.1. Khả năng nhân của 2 chủng tuyến trùng trên SXDL tuổi 4

3.2.1.1. Chủng S – XT

Kết quả thí nghiệm tỉ lệ nhân của chủng S – XT đƣợc trình bày trong bảng 3.3

Ở những nồng độ gây nhiễm khác nhau thì tỉ lệ nhân của chủng S – XT trên

SXDL cũng có sự sai khác. Tuy nhiên có thể thấy ở một vài nồng độ gây nhiễm ban

đầu chủng S – XT có tỉ lệ nhân cao nhƣ ở nồng độ 10 IJ/sâu và 15 IJ/sâu có tỉ lệ

nhân tƣơng ứng lên tới 3042 và 3066 lần/SXDL.

Nghiên cứu tƣơng tự của Nguyễn Ngọc Phong (2013) đối với chủng S – XT trên

sâu khoang cho thấy tỉ lệ nhân dao động từ 590 – 3580 lần/sâu. Nhƣng do sâu

khoang là đối tƣợng lớn hơn 8 – 9 lần so với SXDL nên sự chênh lệch về tỉ lệ nhân

là điều có thể xảy ra. Ngoài ra, một số nghiên cứu trên đối tƣợng có sinh khối lớn

hơn là ấu trùng bƣớm sáp lớn của Nguyễn Ngọc Châu (2008) cho thấy tỉ lệ nhân

của chủng S – TK10 trên BSL chỉ dao động trong khoảng 500 đến 1200 lần, trên

chủng S – TX1 là 500 – 3570 lần.

Nhƣ vậy, có thể thấy hệ số nhân của chủng S – XT trên SXDL là không hề thua

kém so với các chủng khác thuộc giống Steinernema nhân nhiễm trên các đối tƣợng

sinh khối lớn hơn. Điều này mở ra một triển vọng có thể sử dụng SXDL cho việc

nhân sinh khối tuyến trùng chủng S – XT bởi đây cũng là một đối dễ nuôi trong

điều kiện phòng thí nghiệm bằng thức ăn nhân tạo hoặc tự nhiên nhƣ thầu dầu (M

Senthamizhsel Van, 1988). Tuy nhiên để sản xuất in vivo thì cần xem xét thêm một

Đồ án tốt nghiệp

số điều kiện nhƣ quá trình phát tán IJ, và quan trọng hơn nữa là tƣơng quan nồng độ

gây nhiễm và sản lƣợng IJ sinh ra.

3.2.1.2. Chủng H – CP16

Kết quả thí nghiệm tỉ lệ nhân của chủng H – CP16 đƣợc trình bày trong bảng 3.4

Thống kê kết quả của chủng H – CP16 trên SXDL cho thấy tỉ lệ nhân có sự sai

khác giữa các nghiệm thức và dao động trong khoảng 467 – 5734 lần/sâu. Số liệu tỉ

lệ nhân ở những nồng độ ban đầu đạt giá trị khá cao, cao nhất đạt 5734 lần/sâu ứng

với nồng độ gây nhiễm ban đầu 15 IJ/sâu.

Sự dao động này phụ thuộc vào tổ hợp nhiều yếu tố nhƣ số lƣợng IJ ban đầu gây

nhiễm, mỗi loại sâu và mỗi chủng tuyến trùng. Do vậy, cùng một chủng tuyến trùng

H – CP16 gây nhiễm trên sâu khoang (đối tƣợng sinh khối khá lớn), tỉ lệ nhân trong

nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Phong (2013) dao động từ 817 – 4413 lần/sâu

khoang.

Mặc dù có thể thấy đƣợc tỉ lệ nhân này là tốt hơn so với chủng S – XT và H –

CP16 gây nhiễm trên sâu khoang nhƣng so với các chủng khác thuộc giống

Hetrohabditis thì tƣơng đối thấp hơn. Kết quả khảo nghiệm trên 2 chủng H – MP11

và H – NT3 trên BSL có tỉ lệ nhân khá cao, cao nhất lên đến 13700 và 14000

lần/BSL ứng với H –NT3 và H – MP11 (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). Tuy nhiên để

kết luận khả năng sinh sản của chủng H – CP16 trên SXDL thấp hơn so với các

chủng khác thuộc giống Heterohabditis thì cần xem xét thêm nhiều yếu tố khác.

3.2.2. Mối tương quan giữa số lượng IJ gây nhiễm và sản lượng IJ sinh ra

Bên cạnh yếu tố di truyền thì nồng độ IJ đối với côn trùng vật chủ cũng là một

yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sản lƣợng IJ sinh ra, chúng có mối liên hệ là một

hàm bậc hai, nghĩa là nồng độ gây nhiễm thích hợp nhất thì sản lƣợng IJ sinh ra sẽ

là cao nhất (Nguyễn Ngọc Châu, 2008).

Từ thí nghiệm xác định hệ số nhân của hai chủng tuyến trùng trên SXDL là khá

tốt và để đánh giá toàn diện hơn về khả năng nhân nhiễm sinh khối EPN trên SXDL

Đồ án tốt nghiệp

với mục đích tìm ra nồng độ gây nhiễm thích hơp của hai chủng tuyến trùng S – XT

và H – CP16 sao cho cao nhất thì việc tiến hành thí nghiệm tìm mối tƣơng quan

giữa nồng độ gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra cũng là một điều kiện cần thiết yếu

để để kết luận khả năng nhân nuôi in vivo 2 chủng tuyến trùng trên SXDL.

3.2.2.1. Chủng S – XT

Thí nghiệm đánh giá khả năng sinh sản của chủng tuyến trùng S – XT trên SXDL

cho thấy kết quả nhƣ sau:

Với nồng độ gây nhiễm ban đầu là 5 IJ/sâu sản lƣợng IJ sinh ra cao nhất đạt

12130 IJ/sâu, trung bình là 12130 IJ/sâu. Sản lƣợng này tăng lên 30420 IJ/sâu khi

tăng nồng độ gây nhiễm ban đầu lên 10 IJ/sâu. Khi đến nồng độ gây nhiễm ban đầu

là 15 IJ/sâu thì sản lƣợng tăng cao đáng kể trung bình đạt 45994 IJ/sâu, cá biệt có

giá trị cao nhất lên đến 46101 IJJs/sâu. Ở các nồng độ gây nhiễm tiếp theo không

tăng nữa mà có xu hƣớng giảm theo qui luật khi số lƣợng IJ sinh đã đạt giá trị cực

đại của hàm bậc 2, ở nồng độ gây nhiễm từ 20 đến 40 giá trị trung bình giảm dần và

về mặt số liệu nhìn thấy thì sản lƣợng thấp hơn nhiều so với sản lƣợng cao nhất đạt

ở nồng độ gây nhiễm 15 IJ/sâu, thấp nhất ở nồng độ gây nhiễm cuối cùng 40IJ/sâu

với sản lƣợng trung bình là 9658 IJ/sâu.

Các kết quả thu đƣợc từ các nghiệm thức cũng cho thấy sự chênh lệch về số

lƣợng IJ giữa những lần thấp nhất và cao nhất là khá nhỏ, thấp nhất ở nồng độ

nhiễm 5 IJ/sâu với sự chênh lệch là 121 IJ và cao nhất tại nồng độ 30 IJ/sâu với sự

chênh lệch 4950 IJ. Nhƣ vậy có thể nói, sản lƣơng của chủng S – XT trên kí chủ

SXDL là khá ổn định và là một trong nhƣng yếu tố lí tƣởng cho việc nhân nuôi in

vivo tuyến trùng.

Về mặt thống kê thì P – Value = 0 < 0,05, nghĩa là có sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê về sản lƣợng IJ sinh ra giữa các nồng độ gây nhiễm khác nhau ở mức ý

nghĩa 0,05. Và từ bảng phân tích số liệu, cũng dễ dàng nhận thấy sự khác biệt có ý

nghĩa giữa sản lƣơng sinh ra ở nồng độ nhiễm ban đầu 15, 20, 25 IJ/sâu với các sản

lƣợng IJ sinh ra ở các nồng độ khác nhau với độ tin cậy 95%. Tuy không có sự khác

Đồ án tốt nghiệp

biệt về mặt thống kê giữa 3 nồng độ cho sản lƣợng IJ cao nhất là 15, 20, 25 IJ/sâu,

nhƣng khi xét về mặt kinh tế thì có lẽ nồng độ 15 IJ/sâu là tối ƣu nhất trong các

50000

45000

nghiệm thức với sản lƣợng IJ cao nhất cũng nhƣ cho tỉ lệ nhân cao nhất.

y = -118.19x2 + 5160.3x - 9266.5 R² = 0.9804

) J I (

40000

35000

30000

25000

g n ù r t n ế y u t

20000

15000

g n ợ ƣ

l

10000

n ả S

5000

Nồng độ gây nhiễm (IJ/sâu)

Hình 3.4. Tƣơng quan giữa số lƣơng gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra của

chủng S – XT

Kết quả phân tích thống kê hàm bậc 2 dựa trên số liệu thực nghiệm cho thấy với đồ thị y = -118,19x2 + 5160,3x – 9266,5 số lƣợng IJ thu đƣợc đạt cực đại ứng với

giá trị cực trị của hàm số là 22 IJ/sâu.Vì đồ thị là một hàm parabol lồi nên các giá trị

gây nhiễm khác càng ít hơn hoặc càng cao hơn so với giá trị cực trị thì tất nhiên sẽ cho sản lƣơng IJ thấp hơn. Giá trị tƣơng quan R2= 0,9804 thể hiện sự tƣơng quan

chặt chẽ giữa nồng độ gây nhiễm IJ/sâu với sản lƣợng IJ sinh ra của chủng S – XT

trên SXDL.

So sánh với một số thí nghiệm tƣơng tự nhƣ các chủng S – TX1, S – TK10 đƣợc

gây nhiễm trên BSL và H – CP16 trên sâu khoang tuổi 5 với sản lƣợng trung bình

cao nhất đạt đƣợc là 55800 IJ/BSL, 34400 IJ/BSL và 143330 IJ/ sâu khoang

(Nguyễn Ngọc Phong, 2013) thì sản lƣợng IJ sinh ra khi nhiễm S – XT trên SXDL

ít hơn hẳn. Điều này có thể là do sinh khối của SXDL bé hơn nhiều so với sâu

khoang tuổi 5 và BSL, khối lƣợng trung bình của một sâu khoang tuổi 5 có thể đạt

Đồ án tốt nghiệp

0,6 – 0,7 g, BSL với khối lƣợng trung bình từ 0,2 – 0,3 g (Nguyễn Ngọc Phong,

2013), trong khi khối lƣợng trung bình một SXDL tuổi 5 chỉ đạt 0,073 ± 0,006 g (

Prem Gupta, 1997). Nhƣng dù sao với khả năng sản sinh số lƣợng IJ nhƣ vậy thì

SXDL cũng là một đối tƣợng tiềm năng cho việc nhân nuôi in vivo S – XT phục vụ

cho quy mô thí nghiệm.

3.2.2.2. Chủng H – CP16

Thí nghiệm đánh giá khả năng sinh sản của chủng tuyến trùng H – CP16 trên

SXDL cho thấy kết quả nhƣ sau:

Chủng H – CP16 đƣợc tiến hành thí nghiệm trên SXDL thì ở nồng độ gây nhiễm

thấp nhất 5 IJ/sâu, sản lƣợng đạt cao nhất là 22130 IJ/sâu, trung bình đạt 22109

IJ/sâu. Khi tăng nồng độ gây nhiễm ban đầu lên 10 IJ/ sâu thì sản lƣơng IJ sinh ra

cũng tăng đáng kể, cao nhất đạt 56723 IJ/sâu và trung bình đạt 86007 IJ/sâu, hơn

gấp 2 lần so với nồng độ nhiễm 5 IJ/sâu. Từ nồng độ nhiễm 15 – 25 IJ/sâu sản

lƣơng IJ sinh ra tăng không đáng kể, sản lƣơng trung bình cao nhất đạt đƣợc tại

nồng độ nhiễm 15 IJ/sâu là 86007 IJ. Khi tiếp tục tăng nồng độ nhiễm lên 30 – 40

IJ/sâu thì sản lƣợng IJ sinh ra không tăng nữa mà giảm dần đến trung bình thấp nhất

ở nồng độ gây nhiễm 40IJ/sâu là 18550 IJ/sâu. Điều này cho thấy, tƣơng tụ nhƣ

chủng S – XT, sản lƣợng IJ sinh ra trên SXDL của chủng H – CP16 cũng biến thiên

theo qui luật của hàm số bậc hai.

Sự chênh lệch sản lƣợng IJ sinh ra giữa những lần cao nhất và thấp nhất khi

nhiễm tại những nồng độ IJ khác nhau là không đáng kể. Ở nồng độ nhiễm 5 IJ/sâu,

sự chênh lệch thấp nhất là 21 IJ. Sự chênh lệch cao nhất cũng chỉ là 2369 IJ tại nồng

độ nhiễm 25 IJ/sâu. Có thể thấy, dù cảm nhiễm trên SXDL là chủng S – XT hay H –

CP16 thì sản lƣợng tuyến trùng sinh ra khá là ổn định. Đây cũng là một trong những

yếu tố thuận lợi cho việc nhân nuôi in vivo tuyến trùng EPN trên ký chủ này.

Tƣơng tự nhƣ chủng S –XT, về mặt thống kê thì P – Value = 0 < 0.05 và từ bảng

phân tích số liệu, dễ dàng nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa sản lƣợng sinh ra

ở nồng độ nhiễm ban đầu 15, 20 IJ/sâu với các sản lƣợng IJ sinh ra ở các nồng độ

Đồ án tốt nghiệp

khác nhau với độ tin cậy 95%. Sản lƣợng IJ giữa hai nồng độ nhiễm 15 và 20 IJ/sâu

không có sự sai khác về mặt thống kê, nhƣng có lẽ nồng độ 15 IJ/sâu vẫn tối ƣu hơn

khi tỉ lệ nhân đạt đến 5734 lần hơn hẳn 1453 lần so vơi tỉ lệ nhân đạt đƣợc ở nồng

100000

90000

độ nhiễm 20 IJ/sâu.

y = -223.8x2 + 9843.9x - 19134 R² = 0.9841

) J I (

80000

70000

60000

50000

g n ù r t n ế y u t

40000

30000

g n ợ ƣ

l

20000

n ả S

10000

40 Nồng độ gây nhiễm (IJ/sâu)

Hình 3.5. Tƣơng quan giữa số lƣơng gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra của

chủng H – CP16

Kết quả phân tích thống kê hàm bậc 2 dựa trên số liệu thực nghiệm cho thấy với đồ thị y = -223,8x2 + 9843,9 x – 19134 số lƣợng IJ thu đƣợc đạt cực đại ứng với giá

trị cực trị của hàm số là 22 IJ/sâu. Quĩ đạo của đồ thị cũng là một hàm parabol lồi

nên các giá trị gây nhiễm khác càng biến thiên so với giá trị cực trị thì tất nhiên sẽ cho sản lƣơng IJ thấp hơn. Giá trị tƣơng quan R2= 0,9841 thể hiện sự tƣơng quan

chặt chẽ giữa nồng độ gây nhiễm IJ/sâu với sản lƣơng IJ sinh ra của chủng H –

CP16 trên SXDL.

Và khi so sánh với sản lƣợng IJ sinh ra khi nhiễm H – CP16 trên sâu khoang tuổi

5 hoặc H – MP11, H – NT3 trên BSL thì có thể thấy sản lƣợng trên SXDL thấp hơn

hẳn, chỉ đạt cao nhất 86007 IJ/sâu trong khi H – CP16 nhiễm trên sâu khoang, H –

MP11, H – NT3 trên BSL lần lƣợt đạt 176510, 18000 và 233500 IJ/sâu. Nhƣng vì

Đồ án tốt nghiệp

sinh khối của SXDL quá bé so với sâu khoang tuổi 5 hoặc BSL nên với giá trị

86007 IJ/sâu thì có thể cho rằng SXDL cũng là một trong những kí chủ lí tƣởng cho

chủng H – CP16.

3.2.3. Chu kỳ kí sinh và phát tán của hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H –

CP16 trên SXDL

3.2.3.1. Chu kỳ kí sinh hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H – CP16 trên SXDL

Thí nghiệm khảo sát chu kì kí sinh của hai chủng tuyến trùng trên SXDL dựa trên

nồng độ nhiễm tối ƣu là kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm tƣơng quan giữa số lƣợng

gây nhiễm và sản lƣơng IJ sinh ra, đƣợc bố trí với số lƣợng 6 sâu ứng với mỗi

chủng tuyến trùng. Kết quả thu đƣợc:

Bảng 3.5. Chu kỳ kí sinh của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên

SXDL

Chu kì ký sinh (ngày) Chủng tuyến

trùng Trung bình

S - XT 5,8 ± 0,32

H - CP16 6,8 ± 0,32

Dù từng đƣợc báo cáo là chu kỳ kí sinh của chủng tuyến trùng S – XT trên sâu

khoang là 8 – 10 ngày và H – CP16 là 9 – 12 ngày (Nguyễn Ngọc Phong, 2013).

Nhƣng vì SXDL là một đối tƣơng vật chủ mới, khá nhỏ so với sâu khoang nên chu

kỳ kí sinh cũng ngắn hơn. Theo bảng số liệu thì chu kỳ sinh của chủng S – XT trên

SXDL thƣờng kéo dài khoảng 6 ngày, cá biệt một trƣờng hợp 5 ngày. Chu kỳ kí

sinh trung bình của chủng H – CP16 kéo dài khoảng 7 ngày, một số trƣờng hợp 6

ngày. Việc nắm bắt và biết đƣợc cụ thể số ngày kí sinh của từng chủng tuyến trùng

trên từng loại vật chủ cũng là yếu tố quan trọng trong nhân nuôi sinh khối in vivo

tuyến trùng EPN.

Đồ án tốt nghiệp

3.2.3.2. Chu kỳ phát tán của hai chủng tuyến trùng EPN S – XT và H – CP16 trên

SXDL

Các thí nghiệm về hệ số nhân và tối ƣu hóa khả năng sinh sản của S-XT và H-

CP16 trên đối tƣợng SXDL đã cho thấy, SXDL là một đối tƣợng tiềm năng cho việc

phân tích sinh khối EPN. Ngoài 2 yếu tố trên thì cũng cần xem xét thêm về chu kỳ

phát tán của EPN trên đối tƣợng này bởi một chủng tuyến trùng có thời gian phát

tán ngắn. IJ phát tán tập trung với lƣợng nhiều thì việc thu IJ cho bảo quản và tạo

chế phẩm sẽ thuận lợi hơn rất nhiều so với chủng tuyến trùng có thời gian phát tán

kéo dài và IJ phát tán một cách rải rác.

Vì vậy, tiến hành thì nghiệm xác định thời gian phát tán của IJ 2 chủng S-XT và

H-CP16 trên đối tƣợng này thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

Chủng S – XT

Kết quả với chủng tuyến trùng S – XT trên đối tƣợng SXDL đƣợc trình bày trong

bảng 3.8 cho thấy : Các ấu trùng xâm nhiễm phát tán ra ngoài trong khoảng thời

gian 5 ngày, sản lƣợng IJ đạt cao nhất vào ngày thứ 2 của chu kỳ phát tán chiếm

62,09% với số lƣợng 28571 IJ. Thấp nhất đạt 195 IJ ứng với ngày thứ 5 của chu kỳ.

Số lƣợng này là khá nhỏ so với tổng số tuyến trùng thu đƣợc. Sản lƣợng ngày đầu

tiên và thứ 3 là tƣơng đối đồng đều đạt 6235 IJ, 7820 IJ. Từ ngày thứ 4, sản lƣơng

giảm manh chỉ còn 3429 IJ.

Nhƣ vậy có thể thấy thời gian phát tán của chủng tuyến trùng S – XT trên SXDL

là khá ngắn và có độ tập trung cao. Hầu nhƣ lƣợng tuyến trùng sinh ra chỉ tập trung

trong 4 ngày đầu (có thể bỏ đi ngày thứ 5 vì số lƣợng IJ phát tán quá ít không đáng

kể). Đây là một yếu tố khá lí tƣởng cho việc sản xuất và bảo quản tuyến trùng EPN.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.6. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng S – XT

Ngày Sản lƣợng phát tán từng ngày Tỉ lệ (%)

13,55 6235 1

62,09 28571 2

16,57 7626 3

7,45 3429 4

0,42 195 5

35000

28571

30000

25000

20000

100 46017 Tổng

n á t t á h p J I

15000

g n ợ ƣ

l

10000

7626

n ả S

6235

5000

3429

195

3 Thời gian (ngày)

Hình 3.6. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng S – XT

Nếu đem so sánh với một số chủng tuyến trùng khác thuộc giống Steinernema thì

con số 4 ngày là khá tốt. Nhƣ một số khảo nghiệm đối với chủng tuyến trùng S –

TK10 và S – TX1 tren BSL thì kết quả ghi nhận đƣợc quá trình phát tán của chủng

S – TK 10 IJ là 4 ngày, trong đó IJ sinh ra tập trung cao ở ngày đầu tiên chiếm hơn

50% và giảm dần trong 3 ngày tiếp theo. Với chủng S – TX 1 thì IJ phát tán khá rải

Đồ án tốt nghiệp

rác trong 7 ngày, sản lƣợng cao nhất tập trung ở ngày thứ 4 và giảm dần đến ngày

thứ 7 (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). Một nghiên cứu tƣơng tự nhƣ của Elawad và

cộng sự (1999) với 2 loài tuyến trùng S. abbasi và S. riobravis trên BSL cũng có

thời gian phát tán trong vòng 6 ngày.

Chủng H – CP16

Với chủng tuyến trùng H – CP16 thời gian bắt đầu phát tán ra ngoài của chủng

tuyến trùng này so với S - XT kéo dài hơn, bắt đầu từ ngày thứ 7 – 8 ngày sau khi

gây nhiễm.

Bảng 3.7. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng H – CP16

Ngày Sản lƣợng phát tán từng ngày Tỉ lệ (%)

1 4741 5,51

2 40455 46,99

3 23208 26,96

4 12790 14,86

5 4657 5,41

6 246 0,29

Tổng 86097 100

Kết quả thí nghiệm đối với chủng tuyến trùng H-CP16 đƣợc thể hiện ở bảng 3.9

cho thấy : IJ phát tán ra ngoài trong thời gian 6 ngày. Số lƣợng IJ thu đƣợc vào ngày

đầu tiên không đáng kể chỉ chiếm 5.51% lƣợng phát tán. IJ thu đƣợc cao nhất vào

ngày thứ 2 là 40455 IJ chiếm 46,99% so với tổng số lƣợng IJ phát tán trong cả 6

ngày. Các ngày tiếp theo sản lƣợng IJ thu đƣợc giảm dần, tuy nhiên sản lƣợng vẫn

còn khá cao vào các ngày thứ 3 và thứ 4 với số lƣợng IJ thu đƣợc tƣơng ứng là

23208 IJ và 12790 IJ. Nhƣ vậy nhìn chung thì ấu trùng xâm nhiễm của chủng H-

CP16 phát tán tập trung chủ yếu ở giai đoạn nửa đầu của chu kỳ, trong vòng 4 ngày

đầu thì số IJ đã chiếm hơn 90% sản lƣợng.

Đồ án tốt nghiệp

Nhìn về tổng thể chu kỳ phát tán của H-CP16 khá giống với các chủng tuyến

trùng khác thuộc loài Heterohabditis. Nhƣ một số nghiên cứu của Nguyễn Ngọc

Châu (2008) cho thấy : đối với chủng H – NT3 và H – MP11 trong vòng 3 ngày

đầu tiên thì đã có 92,8% số lƣợng IJ của HNT-3 và 95,7% của H-MP11 phát tán ra

45000

40455

40000

35000

30000

23208

25000

ngoài.

n á t t á h p J I

20000

g n ợ ƣ

12790

15000

l

10000

n ả S

4741

4657

5000

246

Thời gian (ngày)

Hình 3.7. Số lƣợng IJ phát tán qua các ngày của chủng H – CP16

Qua thí nghiêm trên về 2 chủng tuyến trùng H-CP16 và S-XT trên đối tƣợng

SXDL có thể kết luận rằng chủng tuyến trùng S-XT có thời gian phát tán ngắn hơn

so với chủng H-CP16. Tuy nhiên về mặt sản lƣợng thì chủng H-CP16 cao hơn S-XT

với sản lƣợng thu đƣợc tƣơng ứng là 86097 IJ và 46017 IJ. Đây cũng là điều thƣờng

thấy đối với 2 giống tuyến trùng Steinernema và Heterohabditis. Điển hình là

nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Phong (2013) trên đối tƣợng sâu khoang tuổi 5 với

kết quả thời phát tán của chủng S – XT là 5 ngày với tổng sản lƣợng 59050 IJ và

chủng H – CP16 là 6 ngày vói tổng sản lƣợng 87880 IJ.

3.3. Xác định tác nhân gây chết sâu

Thí nghiệm diệt sâu bằng phƣơng pháp tiêm là một bƣớc chuyển nối trung gian

giữa việc nghiên cứu tuyến trùng EPN và VKCS – tác nhân đƣợc cho là gây chết

Đồ án tốt nghiệp

sâu thực sự. Thí nghiệm sử dung tuyến trùng đã qua khử trùng bề mặt, cũng nhƣ

kim tiêm 30G, dung dich tiêm (0,85% NaCl và 0,1% peptone) để đảm bảo tối đa

tính vô trùng, tránh gây tổn thƣơng và rối loạn chu trình sinh trƣởng – phát triển

trên sâu. Sâu sau khi chết đƣợc tiến hành rút huyết tƣơng và ria trên đĩa thạch

NBTA.

Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Bảng 3.8. Kết quả diệt sâu ở một số nồng độ gây nhiễm của hai chủng S – XT và

H – CP16 bằng phƣơng pháp tiêm

Số sâu chết Nồng độ gây Tỷ lệ chết (%) S – XT H – CP16 nhiễm (IJ/sâu) sau 16 giờ 8 giờ 16 giờ 8 giờ 16 giờ

0 (đối chứng) 0 0 0 0 0%

5 1 5 0 6 100%

10 6 6 100%

Với kết quả thu đƣợc khi đƣợc đƣa trực tiếp tuyến trùng vào xoang máu của ký

chủ thì hiệu lực diệt của cả hai chủng tuyến trùng là cực mạnh. Thời gian giết chết

vật chủ rất nhanh, tại nồng độ gây nhiễm 5 IJ/sâu thì tỷ lệ chết 100% sau 16 giờ, và

khi nâng nồng độ gây nhiễm lên 10 IJ/sâu thì thời gian gây chết 100% chỉ còn 8 giờ.

Nguyên nhân có lẽ do tuyến trùng không phải mất thời gian trong quá trình cảm

nhiễm ký chủ và xâm nhập vào xoang máu. Việc đƣa thẳng tuyến trùng vào xoang

máu, tạo điều kiện cho tuyến trùng tiếp xúc ngay với huyết tƣơng sâu là chất cảm

ứng cho tuyến trùng phóng thích VKCS.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8. Sâu chết bởi tuyến trùng bằng phƣơng pháp tiêm

A. Sâu chết bởi chủng S – XT tại nồng độ 5 IJ/sâu;

B. Sâu chết bởi chủng H – CP16 tại nồng độ 5 IJ/sâu;

C. Sâu chết bởi chủng S – XT tại nồng độ 10 IJ/sâu;

D. Sâu chết bởi chủng H – CP16 tại nồng độ 10 IJ/sâu

E. Đối chứng hóa nhộng (tiêm dung dịch 0,85% NaCl + 0,1% Peptone)

Dựa vào hình 3.6, có thể thấy rằng, sâu ở nghiệm thức đối chứng vẫn khoẻ mạnh

và hoá nhộng. Nhƣ vậy việc tiêm bằng kim tiêm 30G và dung dịch tiêm không ảnh

hƣởng đến quá trình phát triển của SXDL. Sâu chết bởi phƣơng pháp tiêm tuyến

trùng có dấu hiệu chết tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp cảm nhiễm thông thƣờng: sâu

không có mùi thối, không nhiễm vi sinh vật nào khác, phần bụng căng cứng ửng

hồng. Cá biệt, tại nồng độ tiêm 10 IJ/sâu, có lẽ vì thời gian chết quá ngắn, nên sâu

chết chƣa có dấu hiệu ửng hồng rõ rệt, tuy nhiên vẫn không có dấu hiệu nhiễm bất

kì vi sinh khác, không mùi thối và không mềm nhũn (hình 3.8).

Nhƣ vậy khi tiêm tuyến trùng vào sâu, sâu chết nhanh hơn khi cho cảm nhiễm

thông thƣờng, chứng tỏ tuyến trùng là tác nhân gây chết sâu. Để xác định vi khuẩn

gây bệnh cho sâu khi nhiễm tuyến trùng cần tiến hành phân lập vi khuẩn theo hai

cách: 1) trong giọt huyết tƣơng sâu ngay sau khi sâu chết do tuyến trùng (theo

Poinar & Thomas, 1966), 2) khử trùng bề mặt tuyến trùng mới phát tán từ cơ thể

sâu chết (theo Arkhurst, Sun Ho Park,1999).

Đồ án tốt nghiệp

3.4. Phân lập vi khuẩn nội sinh tuyến trùng

Tuyến trùng đƣợc khử trùng bề mặt và tiêm vào sâu gây chết nhanh nhƣ mô tả ở

trên đƣợc rút huyết tƣơng sau khi sâu chết 48 giờ và cấy ria trên môi trƣờng đặc

trƣng để phân lập vi khuẩn cộng sinh tuyến trùng EPN là môi trƣờng NBTA chứa

kháng sinh theo Eugenio (2001). Sau khi ủ 24 giờ, thu nhận đƣợc trên tất cả các

mẫu huyết tƣơng là khuẩn lạc vi khuẩn tròn, lồi, màu đỏ sẫm, có khả năng kiềm hoá

làm đổi màu môi trƣờng NBTA sang màu xanh dƣơng (hình 3.9).

B

A

Hình 3.9. Khuẩn lạc vi khuẩn từ huyết tƣơng sâu trên môi trƣờng NBTA

A. Khuẩn lạc vi khuẩn từ giọt huyết tƣơng sâu chết bởi tuyến trùng S – XT ;

B. Khuẩn lạc vi khuẩn từ giọt huyết tƣơng sâu chết bởi tuyến trùng H – CP16

Đồng thời, lấy tuyến trùng làm nguồn phân lập. Muốn phân lập đƣợc vi khuẩn

cộng sinh, hay nội sinh tuyến trùng, việc khử trùng bề mặt tuyến trùng phải đƣợc

kiểm tra chặt chẽ bằng cách lấy nƣớc rửa sau khử trùng đem trải đĩa trên môi

trƣờng. Kết quả áp dụng hai quy trình khử trùng theo Nguyễn Hoàng Anh Kha

(2013) và Lawrwnce A. Lacey (2011) đƣợc trình bày trên bảng 3.11 và phụ lục 2.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.9. Kết quả khử trùng bề mặt tuyến trùng

PP Nguyễn Hoàng Anh Cải tiến từ Lawrence A.

Kha (cải tiến từ phương Lacey (2011)

pháp của Akhurst (1980)

và Sun Ho Park và Yeon

Su Yu (1999))

Dung dịch khử trùng formalin 0,1 % và NaClO Nƣớc Javel 1% (NaClO)

0,5 %

VSV xuất hiện trong nƣớc + +++

rửa lần 1

VSV xuất hiện trong nƣớc ++

rửa lần 2

VSV xuất hiện trong nƣớc +

rửa lần 3

VSV xuất hiện trong nƣớc -

rửa lần 4

VSV xuất hiện trong nƣớc -

rửa lần 5

VSV xuất hiện trong nƣớc -

rửa lần 6

VSV xuất hiện trong nƣớc -

rửa lần 7

Theo bảng 3.11, kết quả định tính cho thấy sự hiện diện của vi sinh vật trong

nƣớc rửa khử trùng bề mặt tuyến trùng theo phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ

phƣơng pháp của Akhurst (1980) và Sun Ho Park và Yeon Su Yu (1999) là dƣơng

tính. Mặc dù phƣơng pháp sử dụng đến cả 2 loại dung dịch diệt khuẩn là formalin

0,1 % và NaClO 0,5 % nhƣng có lẽ ở nồng độ quá thấp và thiếu đi sự lặp lại bƣớc

Đồ án tốt nghiệp

khử trùng nên không thể diệt hết vi sinh vật có mặt trong nƣớc rửa cũng nhƣ trên bề

mặt tuyến trùng.

Trong khi đó, ở phƣơng pháp cải tiến từ quy trình Lawrence A. Lacey, trong

nƣớc rửa khử trùng bề mặt lần thứ nhất cho đến lần thứ 3 vẫn còn sự hiện diện của

vi sinh vật theo chiều hƣớng thƣa dần. Từ lần rửa thứ 4 đến lần rửa cuối cùng không

còn sự hiện diện của bất kì vi sinh nào trong nƣớc rửa. Đây là kết quả của việc dù

chỉ sử dụng một chất khử trùng là javel nhƣng phƣơng pháp của Lawrence A. Lacey

đã có sự cải thiện hơn về nồng độ khi nâng nồng độ javel lên tới 1 % và tiến hành

lặp lại bƣớc khử trùng bề mặt tới 7 lần.

Nhƣ vậy, phƣơng pháp phân lập đƣợc cải tiến từ phƣơng pháp của Lawrence A.

Lacey (2011) đảm bảo vi sinh vật phân lập từ tuyến trùng là vi sinh vật nội sinh.

Sau khi bảo đảm nƣớc rửa vô trùng, tuyến trùng đƣợc phá vỡ bằng cách ly tâm

cùng với bột thủy tinh kết hợp nghiền. Sau đó cấy ria dịch ly tâm từ tuyến trùng lên

đồng thời ba môi) NBTA, McConkey và peptone glycerol agar (PGA). Chỉ có một

dạng khuẩn lạc màu đỏ mọc trên môi trƣờng NBTA giống khi phân lập từ giọt

huyết tƣơng sâu.

Sau khi phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng MacConkey tìm thấy hai chủng vi

khuẩn có hình thái khuẩn lạc tròn, màu đỏ sẫm, có quần sáng nhạt bao quanh và làm

đổi màu môi trƣờng McConkey (Hình 3.10). Hình thái khuẩn lạc và màu sắc tƣơng

tự nhƣ vi khuẩn Serratia marcescens SS1 và SH1(hình xem phụ lục 2) phân lập từ

cùng nguồn gốc vào năm 2013 do Nguyễn Hoàng Anh Kha thực hiện. Tuy nhiên

chƣa thể kết luận có phải đúng là các chủng đã đƣợc phân lập từ trƣớc không, khảo

sát cần đƣợc tiếp tục. Vì vậy tạm thời ngƣời thực hiện đề tài đặt tên chủng vi khuẩn

phân lập đƣợc từ Steinernema quangdongsense XT là SB và chủng phân lập đƣợc

từ Heterorhabditis indica CP 16 là HB.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc hai chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ tuyến trùng

khử trùng bề mặt trên NBTA, MacConkey, NA và PGA

Đồ án tốt nghiệp

3.5. Kết quả định lƣợng tổng số vi khuẩn trong tuyến trùng (cfu/IJ)

Đối với tuyến trùng gây bệnh côn trùng EPN, số lƣợng VKCS cƣ trú bên trong

tuyến trùng là chỉ tiêu chất lƣợng của tuyến trùng tƣơng đƣơng độc lực. Tuyến trùng đã qua khử trùng bề mặt bị phá vỡ, pha loãng tại các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3

và tiến hành trải trên môi trƣờng đĩa thạch NBTA. Kết quả thu đƣợc, đối với chủng

SB mật độ vi khuẩn là 114,3 cfu/IJ và với chủng HB là 98 cfu/IJ (chi tiết xem phụ

lục 4). Ở một số nghiên cứu tƣơng tự chỉ ra rằng mật độ vi khuẩn cộng sinh trung

bình của chủng S. carpocapsae đạt khoảng 40 cfu/IJ hoặc cá biệt hơn nữa, mật độ vi

khuẩn chỉ ≥ 2 cfu/IJ đối với chủng tuyến trùng H. bacteriophora (Vanya Emelianof,

2008). Nhƣ vậy ứng với mỗi chủng tuyến trùng khác nhau thì mật độ VKCS cũng

khác nhau, số lƣợng cfu/IJ của chi Steinernema thƣờng lớn hơn so với chi

Heterohabditis do kích thƣớc trung bình của chi Steinernema cũng to hơn so với các

giống EPN khác.

Ngoài ra, hình thái khuẩn lạc thu đƣợc từ việc phá vỡ tuyến trùng đã khử trùng

bề mặt cũng chính là các khuẩn lạc thu đƣợc khi phân lập, không có sự xuất hiện

của bất kỳ khuẩn lạc khác (hình xem phụ lục 2). Điều này có nghĩa 2 chủng SB, HB

phân lập đƣợc có nguồn gốc nội sinh bên trong tuyến trùng, loại trừ giả thuyết

Serratia cũng nhƣ các vi sinh khác tạp nhiễm trên bề mặt tuyến trùng.

Nhƣ vậy, khi phân lập vi khuẩn từ huyết tƣơng sâu sau khi lây nhiễm tuyến trùng

bằng phƣơng pháp tiêm tuyến trùng làm sâu chết và phân lập trực tiếp từ tuyến

trùng sau khi khử trùng bề mặt đến độ nƣớc rửa vô trùng đều thu đƣợc một loại

khuẩn lạc màu đỏ đặc trƣng trên môi trƣờng NBTA, McConkey, NA và PGA. Số

lƣợng khuẩn lạc đếm đƣợc từ mỗi tuyến trùng S-XT trung bình là (114,3 ± 3,1)

cfu/IJ và H-CP16 là (98 ± 0,7) cfu/IJ là những bằng chứng cho thấy rằng vi khuẩn

phân lập đƣợc từ tuyến trùng là vi khuẩn nội sinh và có thể chính vi khuẩn nội sinh

này là tác nhân gây chết sâu.

Đồ án tốt nghiệp

3.6. Quan sát hình thái, sinh lý

Hình thái khuẩn lạc

Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng SB.

A. Khuẩn lạc trên môi trƣờng NA; B. Khuẩn lạc soi nghiêng trên NA; C. Khuẩn

lạc trên môi trƣờng PGA; D. Khuẩn lạc soi nghiêng trên PGA; E. Khuẩn lạc trên

môi trƣờng Mac; F. Khuẩn lạc soi nghiêng trên Mac; G. Khuẩn lạc trên môi trƣờng

NBTA; H. Khuẩn lạc soi nghiêng trên môi trƣờng NBTA

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.12. Hình thái khuẩn lạc của chủng HB.

A. Khuẩn lạc trên môi trƣờng NA; B. Khuẩn lạc soi nghiêng trên NA; C. Khuẩn

lạc trên môi trƣờng PGA; D. Khuẩn lạc soi nghiêng trên PGA; E. Khuẩn lạc trên

môi trƣờng Mac; F. Khuẩn lạc soi nghiêng trên Mac; G. Khuẩn lạc trên môi trƣờng

NBTA; H. Khuẩn lạc soi nghiêng trên môi trƣờng NBTA

Cả hai chủng SB và HB đều tạo khuẩn lạc tròn, lồi, đỏ sẫm, có quầng sáng bao

quanh và làm đổi màu môi trừơng MacConkey và NBTA (Hình 3.11, hình 3.12).

Nguyên nhân của sự đổi màu môi trƣờng xung quanh vì hai chủng SB và HB đều

không có khả năng sử dụng đƣờng lactose trong môi trƣờng nên sử dụng peptone là

nguồn carbon chính, chính vì thế đã làm tăng pH của môi trƣờng và làm đổi màu

chỉ thị neutral red từ đỏ sang vàng, chỉ thị bromothymol blue từ xanh lá (hoặc vàng)

sang xanh dƣơng.

Cả hai chủng SB và HB đều tổng hợp sắc tố đỏ trên các môi trƣờng NA, PGA,

MacConkey, NBTA làm cho khuẩn lạc có màu đỏ. Trong đó, tổng hợp mạnh nhất

trên môi trƣờng PGA do vậy khuẩn lạc có màu đỏ sậm hơn (Hình 3.11 và 3.12) nhƣ

theo mô tả của các tài liệu về khả năng tổng hợp sắc tố của Serratia marcescens

Đồ án tốt nghiệp

(Grimont và Grimont, 2006; Anita và cộng sự, 2006; Chidambaram và cộng sự,

2009; Antony và cộng sự, 2011).

Khi quan sát so sánh hình thái hiển vi với hai chủng SS1 và SH1 (ĐATN Nguyễn

Hoàng Anh Kha, 2013) thì rõ ràng có sự khác biệt giữa 4 chủng SB, HB với SS1 và

SH1(hình xem phụ lục 2). Với SS1 và SH1 việc quan sát và nhận biết tâm khuẩn lạc

là khá dễ dàng, trong khi đó ở 2 chủng SB, HB việc quan sát tâm rất khó nhận biết,

màu sắc của tâm chỉ đỏ nhạt hơn một ít so với màu sắc toàn khuẩn lạc trên môi

trƣờng PGA. Quầng sáng bao quanh khuẩn lạc của chủng SS1 và SH1 cũng khá rõ

hơn so với chủng SB, HB khi so sánh trên cùng môi trƣờng nuôi cấy. Về màu sắc,

dù quan sát tổng thể khuẩn lạc trên đĩa hay dƣới kính hiển vi thì đều thấy rằng màu

sắc khuẩn lạc của chủng SB, HB là đậm hơn hẳn so với chủng SS1 và SH1. Và

ngay từ việc quan sát hình thái khuẩn lạc cũng cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa SS1

và SH1 trong khi tồn tại giữa hai chủng SB, HB là sự tƣơng đồng khó phân biệt.

Quan sát vi thể

Hai chủng phân lập đƣợc là Gram âm, phù hợp với những mô tả về Serratia

marcescens (Williams và Qadri, 1980; Grimont và Grimont, 2006; David R.C.,

2012). Có thể thấy ở hình 3.24, tế bào SB và HB bắt màu hồng, hình que ngắn. Đối

chứng Serratia marcescens SH1 là vi khuẩn gram âm hình que ngắn, đối chứng

Bacillus sp. là vi khuẩn gram dƣơng, bắt màu tím.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.13. Kết quả nhuộm Gram của hai chủng SS1 và SH1.

A. Chủng SB; B. Chủng HB; C. Đối chứng SH1; D. Đối chứng Bacillus sp.

3.7. Thử nghiệm sinh hóa

Qua các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa cơ bản cho thấy cả hai chủng vi khuẩn phân

lập là vi khuẩn Gram âm, khả năng di động mạnh, có khả năng oxi hóa và lên men

,lên men glucose và sucrose, nhƣng không lên men lactose, không lên men

Arbinose, không sinh H2S, không sinh khí, indole âm tính, catalase dƣơng tính, khử

nitrate thành nitrite, không có oxidase (bảng 3.13)

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.10. Bảng tóm tắt đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng phân lập

Chủng phân lập SB HB

Nguồn phân lập S – XT H – HCP16

Tròn, lồi, màu đỏ, Tròn, lồi, màu đỏ,

Khuẩn lạc trên MacConkey đổi màu môi trƣờng đổi màu môi trƣờng

xung quanh xung quanh

Khuẩn lạc trên NA Tròn, lồi, màu đỏ Tròn, lồi, màu đỏ

Tròn, lồi. màu đỏ Tròn, lồi, màu đỏ Khuẩn lạc trên PGA cực sậm cực sậm

Trạng thái khuẩn lạc Nhớt Nhớt

Gram - -

Que ngắn Que ngắn Hình thái

Di động + +

Glc+, Lac/Suc+, Glc+, Lac/Suc+, TSI H2S-, sinh hơi- H2S-, sinh hơi-

OF/O – OF/F + +

Lên men lactose - -

Lên men arbinose - -

Đồng hóa Citrate + +

Indole - -

Catalase + +

Oxidase - -

Khử nitrate + +

Đồ án tốt nghiệp

3.8. Kết quả định danh bằng KIT API 20E (Biomerieux)

Từ các kết quả thử nghiệm sinh hóa, bƣớc đầu có thể nhận định chủng SB, HB

thuộc họ Enterobacteriaceae. Vì vậy để việc định danh sơ bộ chính xác hơn, ngƣời

thực hiện đề tài tiến hành định danh chủng vi khuẩn SB và HB bằng KIT API 20E

thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

Bảng 3.11. Kết quả định danh bằng KIT API 20E của hai chủng SB và HB

STT Tên phản ứng HB SB

(+) (-) ONPG ADH (+) (-) 1 2

(+) LDC (+) 3

(+) ODC (+) 4

(+) CIT (+) 5

(-) (-) 6 H2S

(-) URE (-) 7

(-) TDA (-) 8

(-) IND (-) 9

(+) VP (+) 10

(+) GEL (+) 11

(+) GLU (+) 12

(+) MAN (+) 13

(+) INO (+) 14

(+) SOR (+) 15

(-) RHA (-) 16

(+) SAC (+) 17

(-) MEL (-) 18

(+) AMY (+) 19

Đồ án tốt nghiệp

20 ARA (-) (-)

21 OX (-) (-)

22 NO2 (+) (+)

23 N2 (-) (-)

24 McC (+) (+)

Từ bảng 3.14, tiến hành dò kết quả đối chứng với phần mềm API web kết quả

đƣợc các thông số quan trọng sau (xem hình phụ lục 2):

+ Trắc đồ: 530772153

+ Phân loại: Serratia marcescens

+ Phần trăm chứng minh: 97,4%

Từ đây, khẳng định đƣợc rằng chủng SB và HB là thuộc loài Serratia

marcescens.

3.9. Kết quả giải trình tự rRNA 16S

Kết quả giải trình tự 16S rRNA của chủng SB:

TTGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTA

ACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGGGGCAGCTTGCTCCCTGGGTGA

CGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGG

GGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACC

AAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGA

TTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTG

GTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACT

CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG

ATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACT

TTCAGCGAGGAGGAAGGTGGTGAGCTTAATACGCTCATCAATTGACGTT

ACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT

Kết quả giải trình tự 16S rRNA của chủng HB:

Đồ án tốt nghiệp

GTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGC

AAGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGGTGACGAGCGGC

GGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACT

ACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGG

GGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAG

TAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGA

GGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGG

AGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCC

ATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGA

GGAGGAAGGTGGTGAGCTTAATACGTTCATCAATTGAC

Từ trình tự gene 16S rRNA thu đƣợc của hai chủng SS1 và SH1 đƣợc trình lên

GenBank thông qua chƣơng trình BLAST tại trang web NCBI

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Kết quả đạt đƣợc cho thấy hai chủng vi khuẩn phân lập đƣợc chƣa đƣợc đƣa lên

GenBank và có trình tự 16S rRNA tƣơng đồng với các chủng Serratia marcescens.

Điều đặc biệt là có sự tƣơng đồng rất lớn giữa các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc

với các chủng S. marcescens có hoạt tính sinh học nhƣ khả năng tổng hợp sắc tố,

khả năng sinh tổng hợp các enzyme nhƣ protease kiềm, protease chịu nhiệt, enzyme

chitinase, calatase; khả năng kháng nấm bệnh hại cây trồng và một số hợp chất giúp

kích thích tăng trƣởng thực vật và một số chủng Serratia nematodiphila phân lập

đƣợc từ tuyến trùng. Điều này cho thấy khả năng khai thác các hoạt tính sinh học từ

hai chủng vi khuẩn phân lập đƣợc rất nhiều. Điển hình trong đồ án này, ngƣời thực

hiện đề tài đã dùng hai chủng phân lập đƣợc để khảo sát khả năng kháng khuẩn,

kháng nấm, kháng sâu và kết quả thu đƣợc rất khả quan.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.14. Cây phát sinh loài của SB và HB

Theo cây phân loại thì chủng SB, HB, SH1 và HB cũng nhƣ các vi khuẩn thuộc

loài Serratia marcescens và S. nematodiphila DZ0503SBS1(T) có tỉ lệ tƣơng đồng

cao về gene 16S rRNA, từ 99-100 %, nhƣng lại rất khác biệt so với các loài Serratia

khác và các vi khuẩn cộng sinh truyền thống của tuyến trùng EPN là Xenorhabdus

spp. và Photorhabdus luninescens.

3.10. Khả năng tiết enzymme ngoại bào

Xoang máu và ống tiêu hóa của côn trùng đƣợc cấu thành từ các thành phần

chính gồm lipid, protein và chitin. Vì vậy, ngoài yếu tố độc lực là tác nhân chính

gây chết sâu, đòi hỏi những vi sinh vật có khả năng gây bệnh côn trùng phải đáp

ứng đƣợc ít nhất 2 trong 3 enzyme lipase, protease và chitinase.

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả khi tiến hành trên môi trƣờng casein, cả hai chủng SB và HB đều có

vòng phân giải rất lớn, xung quanh vòng phân giải là phức hợp TCA – casein có

màu trắng đục dễ dàng nhận thấy (hình 3.15).

Kết quả khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính lipase cho thấy khả năng phân giải

lipit rất mạnh của 2 chủng SB và HB. Tween 20 bị enzyme lipase thủy phân tạo ra các acid béo và các acid béo này tạo phức với Ca2+ làm môi trƣờng xung quanh vết

cấy trắng đục (hình 3.15).

Khi tiến hành trên môi trƣờng thạch huyền phù chitin chứa 1% chitin, kết quả cả

hai chủng SB và SB đều có hoạt tính chitinase. Kết quả tƣơng đồng với các báo cáo

về sự hiện diện của enzyme chitinase trong S. marcescens (Brurberg và cộng sự,

2000; Singh và cộng sự, 2007; Brurberg và cộng sự, 1996; Kazushi và cộng sự,

1999).

Tóm lại, cả hai chủng SB, HB đều có khả năng tổng hợp enzyme lipase, protease,

chitinase ngoại bào. Đáng chú ý là khả năng phân giải lipid và protein rất mạnh, còn

về chitinase, tuy chỉ dừng ở mức trung bình nhƣng đây đƣợc xem là điều hợp lý khi

hầu nhƣ tất cả VKCS tuyến trùng đều tấn công ký chủ ở xoang máu là nơi giàu

protein, lipid và hầu nhƣ không có chitin.

Bảng 3.12. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của SB và HB

Đƣờng kính vòng phân giải (D – d) mm

trên môi trƣờng tƣơng ứng STT Chủng khảo sát Tween 20 Chitin agar Casein agar agar

32,8 ± 4,8 80 20,5 ± 0.5 SB 1

36 ± 4 80 19,5 ± 0,5 HB 2

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.15. Khả năng tiết enzyme ngoại bào

A1, A2, A3: Khả năng tiết enzyme protease, lipase, chitinase của SB

B1, B2, B3: Khả năng tiết enzyme protease, lipase, chitinase của HB

Đồ án tốt nghiệp

3.11. Khả năng kháng kháng sinh

Vì Serratia marcescens là vi khuẩn có thể gây bệnh cơ hội nên xác định kháng

sinh đồ của vi khuẩn này quan trọng khi ứng dụng nuôi cấy mặc dù vi khuẩn trong

đề tài không có nguồn gốc từ bệnh phẩm.

Kháng sinh đồ sử dụng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán do công ty

Nam Khoa Biotek tiến hành theo tiêu chuẩn kháng sinh dành cho vi khuẩn đƣờng

ruột cho kết quả trên hình 3.16

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.16. Kết quả kháng sinh đồ

A. Chủng SB

B. Chủng HB

C. Chủng SH1

Đồ án tốt nghiệp

Hầu hết các chủng vi khuẩn thuộc chi Serratia, trong đó có S.marcescens thƣờng

kháng ampicillin, amoxicillin, amoxicillin-clavulanate, ampicillin-sulbactam,

cephalosporin phổ hẹp, cephamycins, cefuroxime, nitrofurantoin và colistin (CLSI,

2011; Stock và cộng sự, 2003). Cũng theo nghiên cứu của Stock và cộng sự thì một

số chủng Serratia nhƣ S.marcescens, S.odorifera, và S. rubidaea kháng nội với

tetracycline

Kết quả kháng sinh đồ ở hình 3.16 cho thấy chủng SB và HB kháng 3 loại kháng

sinh thông dụng là amoxicillin-clavulanic acid, ampicillin, tetracycline, đúng nhƣ

mô tả ở các báo cáo trên. Sở dĩ S.marcescens kháng kháng sinh amoxicillin-

clavulanic acid bởi vì amoxicilin rất dễ bị phá hủy bởi beta – lactamase , do đó

không có tác dụng đối với những chủng vi khuẩn sản sinh ra các enzyme này

(S.marcescens SB, HB và SH1 thuộc chủng Enterobacteriaceae có khả năng sản

sinh ra enzyme này). Đối với 2 kháng sinh còn lại là ampicillin, tetracycline là 2

kháng sinh phổ rộng thế hệ cũ chủng SB, HB, SH1 cũng gây ra tính kháng. Ngoài ra

thì chủng SH1 cũng kháng yếu với kháng sinh cefuroxime, cefotaxime trong khi cả

2 chủng SB, HB nhạy cảm với cefotaxime.

Một số loại kháng sinh nhạy cảm với Serratia rất phổ biến nhƣ quinolone và

trimethoprim-sulfamethoxazole. Qua khảo sát tất cả 110 chủng S.marcescens thu

hồi từ các mẫu bệnh 2008-2010 đều nhạy cảm với trimethoprim-sulfamethoxazole.

Nói chung, hầu hết các loài Serratia rất nhạy cảm với các kháng sinh nhóm

aminoglycosides. (Stock và cộng sự, 2003). Do đó từ kết quả kháng sinh đồ, cũng

có thể thấy 3 chủng SB, HB và SH1 nhạy cảm với các kháng sinh ciprofloxacin,

amikacin, amikacin, ertapenem, ertapenem, chloramphenicol, chloramphenicol,

chloramphenicol, cefepime, piperacillin/tazobactam, gentamicin.

Đồ án tốt nghiệp

3.12. Hoạt tính kháng khuẩn

Tồn tại trong xoang máu, ống tiêu hóa của côn trùng là hệ vi sinh bình thƣờng,

các vi khuẩn đƣờng ruột khác, vì vậy để có thể chiếm ƣu thế khi xâm nhập và gây

chết vật chủ, các vi khuẩn có khả năng gây bệnh côn trùng phải có khả năng ức chế

các vi sinh khuẩn khác. Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế các vi khuẩn đƣờng

ruột của 2 chủng SB, HB đƣợc bố trí đối kháng với 3 chủng vi sinh chỉ thị thƣờng

gặp là Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi.

Theo nghiên cứu của Nguyễn Hiếu Dân (2013), hầu hết các chủng thuộc loài

Serratia marcescens đều tạo màu trong điều kiện khảo sát hoạt tính kháng khuẩn (nhiệt độ phòng hoặc 37oC) không thể xác định chính xác vòng kháng khuẩn nên

không sử dụng đƣợc phƣơng pháp đục lỗ thạch thông thƣờng (hình xem phụ lục 2).

Do đó ngƣời thực hiện đề tài chọn phƣơng pháp cấy đƣờng chéo theo hai hƣớng là

đối kháng không tiếp xúc và có tiếp xúc.

Đồ án tốt nghiệp

3.14.1. Đối kháng không tiếp xúc

Hình 3.17. Kết quả đối kháng không tiếp xúc

A. SB – E. coli; B. HB – E. coli; C. Đối chứng E. coli; D. SB – S. typhi ; E. HB –

S. typhi; F. Đối chứng S. typhi; G. SB – S. aureus; H. HB – S. aureus; I. Đối chứng

S. aureus

Kết quả đối kháng từ hình 3.19 cho thấy, khi chọn phƣơng pháp cấy chéo không

tiếp xúc giữa 2 chủng SB, HB với các chủng vi khuẩn chỉ thị cho thấy không có

hiện tƣợng đối kháng xảy ra. Từ đó có thể kết luận, hai chủng SB, HB không tổng

hợp các chất đối kháng hoặc kháng sinh nếu không có xảy ra sự cạnh tranh tiếp xúc.

Đồ án tốt nghiệp

3.14.2. Đối kháng tiếp xúc

Hình 3.18. Kết quả đối kháng tiếp xúc (mặt trên)

A. SB – E. coli; B. HB – E. coli; C. Đối chứng E. coli; D. SB – S. typhi ; E. HB –

S. aureus; F. Đối chứng S. aureus; G. SB – S. typhi; H. HB – S. typhi; I. Đối chứng

S. typhi

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.19. Kết quả đối kháng tiếp xúc (mặt dƣới)

A. SB – E. coli; B. HB – E. coli; C. Đối chứng E. coli; D. SB – S. typhi ; E. HB –

S. aureus; F. Đối chứng S. aureus; G. SB – S. typhi; H. HB – S. typhi; I. Đối chứng

S. typhi

Kết quả thu đƣợc sau thí nghiệm đối kháng cho thấy, cả 2 chủng SB, HB đối

kháng khá mạnh so với 3 chủng vi sinh chỉ thị. Tại điểm giao nhau giữa các đƣờng

cấy, các vi khuẩn chỉ thị không thể phát triển và hơn nữa là sự cạnh tranh sinh khối

của hai chủng SB và HB diễn ra và át chế trên cả các đƣờng cấy của vi sinh chỉ thị.

Nhƣ vậy, sự đối kháng và ức chế chỉ xảy ra khi chủng SB và HB tiếp xúc với các vi

khuẩn khác, điều này có vẻ hợp lý khi các VKCS tấn công chủ yếu ở xoang máu

côn trùng là nơi tồn tại nhiều vi khuẩn khác. Kết quả kháng khuẩn này cũng góp

phần làm rõ hơn tại sao trong cơ thể côn trùng chứa tổ hợp nhiều vi khuẩn nhƣng

Đồ án tốt nghiệp

kết quả cấy giọt huyết tƣơng sâu chết bởi tuyến trùng chỉ cho duy nhất một loại hình

thái khuẩn lạc, tròn lồi và đỏ trên đĩa thạch NBTA.

Nhƣ vậy, sử dụng phƣơng pháp cấy chéo có thể đánh giá đƣợc khả năng kháng

khuẩn của hai chủng SB và HB. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cũng chỉ có thể đánh

giá đƣợc ở mức độ định tính. Kết quả thí nghiệm cũng có nhiều nét tƣơng đồng với

khảo sát của Nguyễn Hiếu Dân (2013) khi 2 chủng Serratia marcescens SS1 và

SH1 đều kháng với E. coli, Salmonella và S. aureus (xem hình phụ lục 2)

3.13. Hoạt tính kháng nấm

Trong điều kiện tự nhiên, sau khi giết chết vật chủ, tổ hợp tuyến trùng – VKCS

luôn tạo ra các hợp chất ức chế nhằm ngăn chặn sự xâm nhập của các vi sinh vật

vào xác côn trùng mà điển hình nhất là các loài nấm gây bệnh trong đất trên đồng

ruộng. Kết quả từ việc đối kháng nấm Fusarium sp., Colletotrichum

gloeosporioides, Colletotrichum sp., Rhizoctonia sp., Neoscytalidium sp. của hai

chủng vi khuẩn SB, HB không chỉ là điều kiện cần để 2 chủng này trở thành tác

nhân gây bệnh côn trùng mà còn mở ra hƣớng nghiên cứu mới trong việc phòng trừ

nấm bệnh hại cây trồng.

ĐC SB HB

Colletotrichum Trên

sp.

Dƣới

Đồ án tốt nghiệp

Colletotrichum Trên

gloeosporioides

Dƣới

Fusarium sp. Trên

Dƣới

Neoscytalidium Trên

sp.

Đồ án tốt nghiệp

Dƣới

Rhizoctonia sp. Trên

Dƣới

Hình 3.20. Kết quả đối kháng với các chủng nấm

Bảng 3.13. Tỷ lệ đối kháng nấm của 2 chủng SB, HB

Tỷ lệ ức chế (%)

SB HB

61,78 ± 13,04 62,22 ± 7,41

54,28 ± 1,90 51,09 ± 13,02

Colletotrichum sp. Colletotrichum gloeosporioides Fusarium sp. Neoscytalidium sp. Rhizoctonia sp. 50,79 ± 1,06 50,42 ± 1,94 61,83 ± 0,72 45,5 ± 6 45,42 ± 1,39 65,05 ± 2,51

Kết quả thu đƣợc từ hình ảnh và số liệu ghi nhận cả hai chủng SB, HB đều có

khả năng đối kháng trung bình với nấm Colletotrichum gloeosporioide, và khá cao

đối với Rhizoctonia sp. và Rhizoctonia sp.. Cá biệt đối với hai chủng nấm Fusarium

100

Đồ án tốt nghiệp

sp., Neoscytalidium sp.thì tỉ lệ đối kháng là khá thấp. Tuy nhiên, để đánh giá chính

xác hơn về khả năng kháng nấm thì phải tiến hành thêm nhiều thí nghiệm nhƣ khảo

sát môi trƣờng kháng nấm tối ƣu và tìm ra cơ chế kháng nấm của SB, HB với từng

chủng nấm nhƣng với kết quả ban đầu nhƣ bảng 3.18 thì tiềm năng kháng nấm của

2 chủng SB và HB là rất khả quan.

3.14. Hiệu lực diêt sâu

Thí nghiệm hiệu lực diệt sâu bằng phƣơng pháp tiêm trực tiếp vi khuẩn SB, HB

vào xoang máu là một trong những thí nghiệm quan trọng thiết yếu để chứng minh

2 chủng khuẩn này có thực sự là tác nhân gây chết SXDL hay không.

Trong trƣờng hợp của vi khuẩn Xenorhabdus spp. cộng sinh với tuyến trùng

Steinernema spp. và vi khuẩn Photorhabdus spp. cộng sinh với tuyến trùng

Heterorhabditis spp. cho thấy chúng đều có khả năng diệt sâu, nhƣng chúng lại

không thể tự xâm nhập vào mà phải nhờ tuyến trùng. Và trƣờng hợp của Serratia

marcescens SB và Serratia marcescens HB cũng tƣơng tự nhƣ vậy, chúng cũng cần

phải có vector đƣa chúng vào cơ thể sâu là kiêm tiêm vô trùng 30G.

Thí nghiệm khả năng diệt sâu của hai chủng SB và HB khi tiêm vào SXDL đƣợc

thu nhận sau 40 giờ, khi sâu tuổi 4 ở hộp đối chứng tiêm dung dịch tiêm (0,85%

NaCl + 0,1 % peptone) và đối chứng tiêm E. coli đã chuyển sang giai đoạn nhộng.

101

Đồ án tốt nghiệp

A B

C D

Hình 3.21. Khả năng diệt sâu của SB, HB sau 48 giờ tiêm vào sâu

A. SXDL đối chứng hóa nhộng; B. SXDL đối chứng tiêm E. coli hóa nhộng 100%;

C. SXDL tử vong do SB; D. SXDL tử vong do HB

Từ h ình 3.21, có thể thấy SXDL khi bị tử vong bởi SB và HB theo phƣơng pháp

tiêm th ì cơ thể chúng mềm và phần bụng bị chuyển sang màu đỏ, c òn sâu đối chứng

vẫn phát triển b ình thƣờng cho đến giai đoạn nhộng. Đối chứng E. coli hóa nhộng hoàn toàn dù đƣợc tiêm ở nồng độ khá cao lần lƣợt 5 x 104, 5 x 103, 5 x 102 cfu/sâu.

Đây là điều hoàn toàn hợp lí vì rõ ràng E. coli không phải là vi khuẩn có khả năng

gây bệnh côn trùng.

)

0,0102 cfu/sâu ĐC

( t ế h c u â s

ệ l

ỷ T

10,2 cfu/sâu 1,02 cfu/sâu 0,102 cfu/sâu

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Thời gian theo dõi sâu (giờ)

Hình 3.22. Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 giờ tiêm SB vào SXDL

102

ĐC

Đồ án tốt nghiệp

)

( t ế h c u â s

ệ l ỷ T

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

8,1 cfu/sâu 0,81 cfu/sâu 0,081 cfu/sâu 0,0081 cfu/sâu 0,00081 cfu/sâu

8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Thời gian theo dõi sâu (giờ)

Hình 3.23. Tỷ lệ sâu chết theo thời gian sau 48 giờ tiêm HB vào SXDL

Dựa vào h ình 3.22 và 3.23, có thể thấy hai chủng SB và HB khi đƣợc tiêm vào

SXDL đều có khả năng diệt sâu sau 48 giờ. Tuy nhiên, ở mật độ tế bào càng cao th ì

thì thời gian chết càng ngắn và tỷ lệ chết càng cao. Trong đó, ở những nồng độ ban

đầu khá thấp nhƣ 10,2 cfu/sâu; 1,2 cfu/sâu ở chủng SB và 8,1 cfu/sâu; 0,81 cfu/sâu

ở chủng HB đã cho khả năng diệt sâu lên đến 100% sau 20 giờ.

Khả năng diệt SXDL của chủng SB và HB là do khi chúng xâm nhập vào xoang

máu của sâu đã tiếp tục sinh trƣởng và phát triển, tạo ra độc tố gây ra sự nhiễm

trùng huyết, từ đó dẫn đến sự tử vong của sâu.

Dựa vào đồ thị biểu diễn khả năng diệt sâu của chủng SB và HB (xem phụ luc 4)

có thể tính đƣợc LD50 và LD90 của hai chủng này trên SXDL theo phƣơng pháp

tiêm. Kết quả đƣợc trình bày cụ thể trong bảng 3.14.

Bảng 3.14. LD50, LD90 của chủng SB và HB sau 48 giờ đƣợc tiêm vào sâu

SB HB . LD50 (cfu/sâu) 0,0031 ± 0,0004 0,0048 ± 0,0006

LD90 (cfu/sâu) 0,0440 ± 0,0035 0,0550 ± 0,0057

Dựa vào bảng kết luận rằng: Liều lƣợng gây chết 50% SXDL của SB khi tiêm

vào sâu là 0,0031 cfu/sâu và của HB khi tiêm vào sâu là 0,0048cfu/sâu. Liều lƣợng

103

Đồ án tốt nghiệp

gây chết 90% SXDL của SB khi tiêm vào sâu là 0,044 cfu/sâu và của HB khi tiêm

vào sâu là 0,055 cfu/sâu.

3.17. Khảo sát sự tƣơng tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn

Thí nghiệm khảo sát sự tƣơng tác giữa tuyến trùng và vi khuẩn với mục đích

bƣớc đầu xác định mối quan hệ tổ hợp giữa chủng SB và HB nội sinh trong tuyến

trùng S – XT và H – CP16 thông qua tỷ lệ chết của tuyến trùng trên môi trƣờng

thạch lipid agar sau 12 ngày ở nhiệt độ phòng. Kết quả thu đƣợc (số liệu cụ thể xem

phụ lục 4):

Bảng 3.15. Tỷ lệ chết của S – XT sau 12 ngày

Tỷ lệ chết trung bình (%)

Thời gian (ngày) S - XT

0 0

1,7 ± 0,44 4,3 ± 0,4 S - XT (đối chứng) 0 2,33 ± 0,89 10,33 ± 1,78 15,67 ± 1,56 3 6 9 12

Bảng 3.16. Tỷ lệ chết của H – CP16 sau 12 ngày

Tỷ lệ chết trung bình (%)

Thời gian (ngày) H – CP16

0 0

2,67 ± 0,44 5 H – CP16 (đối chứng) 0 1,33 ± 1,11 13,33 ± 1,11 19,33 ± 0,89 3 6 9 12

104

Đồ án tốt nghiệp

)

( t ế h c

S - XT/ SB

ĐC S - XT

g n ù r t n ế y u t ệ l ỷ T

Thời gian (ngày)

Hình 3.24. Tỷ lệ chết của chủng tuyến trùng S – XT

)

( t ế h c

H - CP16

ĐC H - CP16

g n ù r t n ế y u t ệ l ỷ T

Thời gian (ngày)

Hình 3.25. Tỷ lệ chết của chủng tuyến trùng H – CP16

Theo kết quả khảo sát thu đƣợc, trên môi trƣờng lipid agar không vi khuẩn (đối

chứng) tỉ lệ chết khá cao, tuyến trùng chết từ sau ngày khảo sát thứ 6; 2,33% đối với

chủng S –XT; 1,33% H – CP16 đối với chủng và số lƣợng cũng nhƣ tỉ lệ chết tiếp

tục tăng cho đến hết ngày khảo sát thứ 12. Trên nghiệm thức thí nghiệm thì tỷ lệ

chết khá thấp và tƣơng đối ổn định, sau 12 ngày khảo sát tỷ lệ chết ở tổ hợp S –

XT/SB và H – CP16/HB lần lƣợt tƣơng ứng là 4,3% và 5% trong khi đối chứng thì

tỷ lệ này lên đến 15,67% và 19,33%.

105

Đồ án tốt nghiệp

Tóm lại, từ giá trị tỷ lệ chết giữa các nghiệm thức so với đối chứng, bƣớc đầu

khẳng định, chủng SB và HB không làm giảm sức sống của tuyến trùng. Đây là

điều hợp lí vì cả hai chủng SB và HB đều có nguồn gốc nội sinh bên trong tuyên

trùng. Mặc khác có thể thấy khi ỏ trạng thái tổ hợp vi khuẩn – tuyến trùng thi sức

sống hai chủng S – XT và H – CP16 là khá ổn định. Từ đó, bƣớc đầu có thể khẳng

định mối quan hệ cộng sinh không bắt buộc giữa hai chủng tuyến trùng và vi khuẩn.

106

Đồ án tốt nghiệp

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Giá trị LD50 của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên SXDL

Spodoptera exigua tuổi 4 sau 48 giờ gây nhiễm lần lƣợt là 4,84 IJ/sâu và 4,81

IJ/sâu.

Tỉ lệ gây nhiễm thích hợp trên SXDL để cho hiệu suất cao nhất đối S – XT và H

– CP16 là 15 IJ/sâu.

Tỉ lệ nhân của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên SXDL là rất cao

với tỉ lệ tƣơng ứng là 3066 lần/sâu và 5734 lần/sâu, do đó có thể sử dụng SXDL cho

việc nhân nuôi in vivo đối với hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16.

Thời gian phát tán của hai chủng tuyến trùng S – XT và H – CP16 kéo dài từ 4 –

6 ngày, trong đó các ấu trùng xâm nhiễm phát tán tập trung vào giai đoạn 4 ngày

đầu của chu kỳ, nhiều nhất vào ngày thứ 2 phát tán.

Tác nhân gây chết SXDL là vi khuẩn nội sinh tuyến trùng S-XT và H-CP16 thể

hiện qua tiêm trực tiếp tuyến trùng vào cơ thể SXDL gây chết 100 % sau 16 giờ. Từ

giọt huyết tƣơng sâu chết và trực tiếp từ tuyến trùng khử trùng bề mặt đến khi nƣớc

rửa vô trùng phân lập đƣợc vi khuẩn định danh làSerratia marcescens SB

và Serratia marcescens HB. Từ S-XT và H-CP16 khử trùng bề mặt xác định đƣợc

mật độ S. marcescens SB và HB lần lƣợt là 114,3 cfu/IJ và 98 cfu/IJ.

Hai chủng vi khuẩn SB, HB đều có khả năng tiết enzyme ngoại bào lipase,

protease, chitinase, trong đó hoạt tính lipase và protease khá mạnh.

Cả hai chủng SB và HB đều kháng 3 loại kháng sinh thông dụng là amoxicillin-

clavulanic acid, ampicillin, tetracycline và nhạy cảm với kháng sinh nhóm

aminoglycosides.

Cả hai chủng SB và HB đều có khả năng cạnh tranh lấn át mạnh với các vi khuẩn

gây bệnh Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi.

Cả hai chủng SB và HB đều có khả năng kháng nấm bệnh cây, đối kháng 54,28%

và 51,09% với nấm Colletotrichum gloeosporioide; 61,83% và 65,05% với

107

Đồ án tốt nghiệp

Rhizoctonia sp; 61,78% và 62,22% với Colletotrichum sp., tuy nhiên chỉ 50,79%;

và 45,5% đối với chủng nấm Fusarium sp.; 50,42% và 45,42% đối với chủng

Neoscytalidium sp.

Hiệu lực diệt SXDL của hai chủng SB và HB là rất mạnh với giá trị LD50 lần lƣợt

là 0,0031 cfu/sâu và 0,0048 cfu/sâu, LD90 lần lƣợt là 0,044 cfu/sâu và 0,055 cfu/sâu

khi tiêm trực tiếp vào xoang máu.

Thả tuyến trùng S – XT và H – CP16 trên thảm vi khuẩn SB và HB tƣơng ứng

trên đĩa thạch lipid cho tỉ lệ chết sau 12 ngày < 5 % thấp hơn đối chứng không có vi

khuẩn là 15-20 %.

Từ đây có thể khẳng định trong mối quan hệ tuyến trùng S - XT và H – CP 16

với SXDL Spodoptera exigua, vi khuẩn Serratia marcescens SB và HB đóng vai trò

tác nhân gây chết sâu, thể hiện vai trò vi khuẩn cộng sinh không bắt buộc.

2. Kiến nghị

Tiếp tục mở rộng phổ kí chủ và đánh giá hiệu lực diệt sâu của hai chủng tuyến

trùng S – XT và H – CP16 trên nhiều đối tƣợng khác nhau.

Tìm kiếm các kí chủ mới cho triển vọng nhân nuôi in vivo tuyến trùng.

Thử nghiệm các phƣơng pháp kháng khuẩn khác để định tính cũng nhƣ định

lƣợng chính xác hơn về khả năng kháng khuẩn của hai chủng SB và HB.

Xác định cơ chế kháng và môi trƣờng kháng nấm tối ƣu cho hai chủng SB và

HB.

Tiếp tục các thí nghiệm chứng minh làm rõ mối quan hệ giữa tuyến trùng và vi

khuẩn.

Tách chiết và thử nghiệm hoạt tính sinh học từ các hợp chất của hai chủng SB và

HB.

108

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt:

Nguyễn Ngọc Châu, 2002. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng,3: 73-81, 8:

303-307.

Nguyễn Hiếu Dân (2013) Khảo sát hoạt tính sinh học của vi khuẩn Serratia

marcescens phân lập từ tuyến trùng EPN và hợp chất màu dạng prodigiosin

tổng hợp bởi vi khuẩn này, Đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học Công nghệ TP. HCM.

Nguyễn Hoàng Anh Kha (2013) Thu nhận sắc tố màu đỏ dạng prodigiosin tổng

hợp bởi vi khuẩn phân lập từ tuyến trùng EPN, Đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học

Công nghệ TP. HCM.

Nguyễn Ngọc Phong (2013) Đánh giá khả năng sinh sản của tuyến trùng EPN

trên sâu khoang Spodoptera exigua và nghiên cứu biện pháp bảo quản tuyến trùng,

Đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học Công nghệ TP. HCM.

Tài liệu tiếng Anh:

Akhurst, R. J., và N. E. Boemare. 1990.Biology and taxonomy of Xenorhabdus,

p. 75–87. In R.Gaugler and H.Kaya (ed.), Entomopathogenic nematodes in

biological control. CRC Press, Inc., BocaRaton, Fla.

Bergan T., Grimont P. A. D., Grimont F. (1983). Fatty acids of Serratia

determined by gas chromatography. Current Microbiology, 8, 7-11.

Brurberg M. B., Nes I. F., EIJink V. G. H. (1996). Microbiology. 142: 1581

Castillo-Avila W., Abal M., Robine S., Pérez-Tomás R. (2005). Non-apoptotic

concentrations of prodigiosin (H+/Cl− symporter) inhibit the acidification

oflysosomes and induce cell cycle blockage in colon cancer cells. Life Sci., 78,

121-127.

Dauenhauer S. A., Hull R. A., Williams R. P. (1984). Cloning and expression in

Escherichia coli of Serratia marcescens genes encoding prodigiosin biosynthesis.

Journal of Bacteriology, 158, 1128-1132.

109

Đồ án tốt nghiệp

David R. Caprette (2012). Enterobacteriaceae: Serratia marcescens. Rice

University. Houston, Texas, US.

Estrada, Castro, Regina Basurto-Ríos, Jorge Toledo, Jorge E. Ibarra (2012).

Phoresis between Serratia marcescens and Steinernema carpocapsae (Rhabditida:

Steinernematidae) during Infection of Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae)

Larvae. Florida Entomologist, 95(1),120-127.

Eugenio I. Vivas, Heidi Goodrich – Blair (2001). Xenorhabdus nematophilus as

a Model for Host – Bacterium Interactions: rpoS Is Necessary for Mutualism with

Nematodes. Deparment of Bacteriology, University of Wisconsin – Madison,

Madison, Wisconsin 53706.

Eyualem Abebe, Feseha-Abebe Akele,Julie Morrison, Vaughn Cooper. An insect

pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia.

Fuchs R. L., McPherson S. A., Drahos D. J. (1986). Cloning of a Serratia

marcescens gene encoding chitinase. Applied and Environmental Microbiology, 51,

504-509.

Gal S. W., Choi J. Y., Kim C. Y., Cheong Y. H., Choi Y. J., Lee S. Y., Bahk J.

D., Cho M. J. (1998). FEMS Microbiol. Lett, 160, 151.

Gillen A. L., Gibbs R. (2011). Serratia marcescens: The Miracle Bacillus.

Department of Biology and Chemistry, Literty University.

Giri A. V., Anandkumar N., Muthukumaran G., Pennathur G. (2004). A novel

medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia

marcescens isolated from soil. BMC Microbiol, 4, 1-10.

Givaudan, A., và A. Lanois. 2000. ﬂhDC, the ﬂagellar master operon of

Xenorhabdus nematophilus: Requirement for ﬂagella, lipolysis, extracellular

hemolysis, and full virulence in insects. J. Bacteriol. 182:107–115.

Gouge D. H., Snyder J. L. (2006). Temporal association of entomopathogenic

nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) and bacteria. J.

Invertebr. Pathol, 91, 147-157.

110

Đồ án tốt nghiệp

Givaudan, A., A. Lanois, và N. Boemare. 1996. Cloning and nucleotide sequence

of a ﬂagellin encoding genetic locus from Xenorhabdus nematophilus: Phase

variation leads to differential transcription of two ﬂagellar genes (FliCD). Gene

183:243–253.

Grimont P. A. D., Grimont F., Lysenko O. (1979). Species and biotype

identification of Serratia strains associated with insects. Current Microbiology,

2,139-142.

Han S. B., Kim H. M., Kim Y. H., Lee C. W., Jang E. S., Son K. H., Kim S. U.,

Kim Y. K. (1998). T-cell specific immunosuppression by prodigiosin isolated from

Serralia marcescens. In1. J Immunopharmacol, 20, 1-13.

Harpster M. H., Dunsmuir P. (1989). Nucleic Acids Res. 17, 5395.

Hejazi A., Falkiner F. R. (1997). Serratia marcescens. Journal of Medical

Microbiology, 46(11), 903‐912.

Jones J. D. G., Grady K. L., Suslow T. V., Bedbrook J. R. (1986). EMBO J. 5,

467.

Lawrwnce A. Lacey (2011). Manual of Techniques in Insect Pathology

Matsuyama T., Murakami T., Fujita M., Fujita S., Yano I. (1986).

Extracellular vesicle formation and biosurfactant production by Serratia

marcescens. Journal of General Microbiology, 132, 865-875.

Prem Gupta, Stephen M. Ferkovich (1997). Interaction of calyx fluid and venom

from Microplitis croceipes (Braconidae) on developmental disruption of the natural

host, Heliocoverpa zea, and two atypical hosts, Galleria mellonella and Spodoptera

exigua. U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Center for

Medical, Agricultural and Veterinary Entomology, Gainesville, FL 32604, USA

Singlton P., Sainsbury D. (2001). Dictionare of Microbiology and Molecular

Biology. 3rd Edn.

Sundheim L., Poplawsky A. R., Ellingboe A. H. (1988). Phys. Mol, Plant

Path, 33, 483.

111

Đồ án tốt nghiệp

Suzuki K., Suzuki M., Taiyoji M., Nikaidou N., Watanabe T. (1998). Biosci.

Biotechnol, Biochem, 62, 128.

Steven Forst và David Clarke, 2011. Bacteria – nematode symbiosis.

Entomopathogenic nematology, 3: 73.

Tariq A. L., John J. P. (2010). Molecular Characterization of Psychrotrophic

Serratia marcescens TS1 Isolate form Apple Garden at Badran Kashmir. Journal of

Agriculture and Biological Sciences, 6(3), 364-369.

Tews I., Vincentelli R., Vorgias C. E. (1996). Gene. 170, 63.

Trias J., Viñas M., Guinea J., Loren J. G. (1988). Induction of yellow

pigmentation in Serratia marcescens. Applied and Environmental Microbiology,

54, 3138-3141.

Watanabe T., Kimura K., Sumiya T., Nikaidou N., Suzuki K., Suzuki M.,

Taiyoji M., Ferrer S., Regue M. (1997). J. Bacteriol. 179, 7111.

Weiss A. A., Hewlett E. L. (1986). Virulence factors of Bordetella pertussis.

Annual Review of Microbiology, 40, 661‐686

Williams R. P., Qadri S. M. H. (1980). The pigment of Serratia. 31–79.von

Zhang C. X., Yang S. Y., Xu M. X., Sun J., Liu H., Kan F., Sun J., Lai R., Zhang K.

Y. Serratia nematodiphila sp. nov., associated symbiotically with the

entomopathogenic nematode Heterorhabditidoides chongmingensis (Rhabditida:

Rhabditidae). Int J Syst Evol Microbiol, 59 (2008) 1603-1638.

112

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC 1. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG, THUỐC THỬ,

PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

Thành phần môi trường MacConkey (Gram/Lít)

Peptone 20,00

Lactose 10,00

NaCl 5,00

Tinh thể violet 0.001

Neutral red 0.03

Bile salts 1.50

Agar 15,00

Thành phần môi trường nutrient agar (Gram/Lít)

Beef extract 3,00

Peptone 5,00

Agar 18,00

Thành phần môi trường nutrient broth (Gram/Lít)

Beef extract 3,00

Peptone 5,00

Môi trường Peptone glycerone agar

Peptone 5,00 gram/lít

Glycerone 10,00 ml/lít

Agar 18,00 gram/lít

Môi trường Peptone glycerone broth

Peptone 5,00 gram/lít

Glycerone 10,00 ml/lít

Thành phần môi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar) (Gram/Lít)

Peptic digest of animal tissue 10,00

Casein enzymic hydrolysate 10,00

Yeast extract 3,00

Đồ án tốt nghiệp

3,00 Beef extract

10,00 Lactose

10,00 Sucrose

1,00 Dextrose

5,00 Sodium chloride

0,20 Ferrous sulfate

0,30 Sodium thiosulfate

0,024 Phenol red

12,00

Agar pH cuối ở 25oC là 7,4 ± 0,2

Thành phần môi trường Phenol Red Lactose Broth (Gram/Lít)

Peptic digest of animal tissue 5,00

3,00 Beef extract

5,00 Lactose

0,018 Phenol red

pH cuối ở 25oC là 7,4 ± 0,2

Thành phần môi trường Tryptone Broth (Gram/Lít)

10,00 Tryptone

5,00

NaCl pH cuối ở 25oC là 6,9 ± 0,2

Thành phần môi trường Nitrate Broth (Gram/Lít)

Peptone 5,00

Beef extract 3,00

1,00

Potassium nitrate pH cuối ở 25oC là 7,0 ± 0,2

Môi trường thạch mềm NA (Gram/Lít)

5,00 Peptone

3,00 Beef extract

Đồ án tốt nghiệp

5,00

Agar pH cuối ở 25oC là 7,0 ± 0,2

Môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase (Gram/Lít)

Glucose 1,00

Yeast extract 3,6

Tween 20 30,00 ml

5,00 NH4Cl

0,10 K2HPO4

0,01 MgCl2

0,444 CaCl2

Agar pH cuối ở 25oC là 7,0 ± 0,2

Thành phân môi trường gelatine (Gram/Lít)

Gelatine 10,00

Agar 15,00

Thành phần môi trường casein (Gram/Lít)

Casein 10,00

Agar 15,00

Thành phần môi trường thạch huyền phù chitin

Dịch huyền phù chitin 1% 100ml

Agar 1,50g

Môi trường dịch chiết protein hạt mè

Hạt mè trắng xay nhuyễn. Cân 2g hạt mè cho vào erlen 250 và thêm 70 ml nước. Dùng NaOH 2N chỉnh về pH 8,5. Lắc đều. Gia nhiệt ở 80oC, 50 phút và khuấy liên

tục. Sau quá trình gia nhiệt, lọc hỗn hợp và thu dịch trong, định mức đến 100ml và

điều chỉnh pH về 7,5 bằng HCl 2N.

Môi trường dịch chiết protein hạt đậu phộng

Hạt đậu phộng bốc vỏ và xay nhuyễn. Cân 2g hạt đậu phộng cho vào erlen 250 và thêm 70 ml nước. Dùng NaOH 2N chỉnh về pH 8,5. Lắc đều. Gia nhiệt ở 80oC,

Đồ án tốt nghiệp

50 phút và khuấy liên tục. Sau quá trình gia nhiệt, lọc hỗn hợp và thu dịch trong,

định mức đến 100ml và điều chỉnh pH về 7,5 bằng HCl 2N.

Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1% theo phương pháp của Dai et al., (2011)

Do đặc tính của chitin không tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính

của enzyme chitinase cần huyền phù hóa chitin.

- Lấy 1g chitin hòa tan trong 20ml HCl đậm đặc, khuấy đều và để ở 4oC qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 200ml ethanol lạnh (-10oC) khuấy đều thật nhanh và ủ qua

đêm.

- Dịch huyền phù được thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (4000

vòng/phút trong 20 phút). Huyền phù này được rửa với nước cất nhiều lần cho đến

khi pH trung tính. Thêm vào tủa nước cất cho đến thể tích 100ml. Sau đó bảo quản

lạnh dịch huyền phù.

Chuẩn bị hóa chất nhuộm Gram

- Dung dịch Crystal violet

2g crystal violet hòa tan trong 20ml ethanol 96%

0,8g ammon oxalat hòa tan trong 80ml nước cất

Trộn hai dung dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối,

sử dụng được vài tháng.

- Dung dịch Iodine

Hòa tan 1g iodine trong 3 – 5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho

tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối.

- Dung dịch tẩy màu: Ethanol 96%.

- Dung dịch nhuộm bổ sung

0,3g fuchsin kiềm hòa tan trong 10ml ethanol 96%

5g phenol hòa tan trong 95ml nước cất

Trộn hai dung dịch nói trên lại với nhau rồi pha loãng 5 lần. Bảo quản trong lọ

tối.

Thuốc thử Griess A và Griess B

Tên thuốc thử Thành phần Khối lƣợng/thể

Đồ án tốt nghiệp

tích

Acid sulfanilic 0,5 g

Griess A Acid acetic loãng (khoảng 150 ml 10%)

Alpha naphtylamin 0,1 g

Acid acetic loãng (khoảng Griess B 50 ml 10%)

Nước cất 20 ml

Phƣơng pháp quan sát hình thái sinh lý, sinh hóa

Soi khuẩn lạc

Nuôi cấy ria chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Mac, NA và PGA.

Dùng dao sắc, nhỏ, cắt một miếng thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc.

Quan sát dưới kính hiển vi ở hai góc độ là từ trên xuống và soi nghiêng ở vật kính

4X và 10X.

Nhuộm Gram

Tăng sinh chủng vi khuẩn phân lặp được và hai chủng đối chứng là E. coli và

Bacillus sp. trong môi trường NB 24 giờ, lắc 150 vòng/phút trong tối.

 Làm tiêu bản

- Chọn lame sạch và khô. Dùng que cấy vô trùng lấy một chút sinh khối vi sinh

vật làm vết bôi trên lame.

- Dùng kẹp gỗ hơ nhẹ mặt dưới của lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết

bôi.

 Nhuộm tiêu bản

- Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm

khô.

- Nhuộm lại bằng dung dịch Iodine trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.

- Tẩy cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi

tan hết màu, rửa nước, thấm khô.

Đồ án tốt nghiệp

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fuchsin 30 giây, rửa nước, thấm khô.

- Quan sát vi sinh vật dưới vật kính 100X với một giọt dầu soi kính. Vi khuẩn

gram âm sẽ bắt màu hồng, vi khuẩn gram dương sẽ bắt màu tím.

Thử nghiệm TSI

Pha các thành phần môi trường TSI trong nước cất, trộn đều, đun nóng và

thỉnh thoảng lắc. Đun sôi khoảng 1 phút để hòa tan các thành phần môi trường.

Phân phối môi trường vào các ống nghiệm có nấp để duy trì điều kiện hiếu khí sao

cho khi tạo thạch nghiêng thì đỉnh thạch nghiêng cách nắp ống nghiệm khoảng 2,5 cm và phần sâu có chiều cao khoảng 2,5 cm. Hấp ở 121oC trong 15 phút và tạo các

ống thạch nghiêng.

Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối

chứng E. coli vào sâu vào phần sâu của ống thạch nghiêng cách đáy ống nghiệm

khoảng 1 cm, sau đó ria trên bề mặt thạch nghiêng.

Sau khi cấy giống, các ống thạch nghiêng được ủ ở 37oC trong 24 giờ. Ghi

nhận sự sinh khí ở phần sâu, màu ở mặt thạch nghiêng và sự tạo thành màu đen bởi

FeS. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Thử nghiệm khả năng lên men lactose

Pha môi trường Phenol Red Lactose Broth, khuấy cho tan đều các thành phần

môi trường và phối vào ống nghiệm có nấp, mỗi ống nghiệm 10ml môi trường. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.

Dùng que cấy vòng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối

chứng E. coli vào ống nghiệm môi trường Phenol Red Lactose Broth. Sau khi cấy giống, các ống nghiệm được ủ ở 37oC trong 24 giờ. Ghi nhận sự đổi màu của môi

trường nuôi cấy. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Thử nghiệm khả năng lên men arabinose

Pha môi trường Phenol Red Lactose Broth, khuấy cho tan đều các thành phần

môi trường và phối vào ống nghiệm có nấp, mỗi ống nghiệm 10ml môi trường. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.

Đồ án tốt nghiệp

Dùng que cấy vòng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối

chứng E. coli vào ống nghiệm môi trường Phenol Red Arabinose Broth. Sau khi cấy giống, các ống nghiệm được ủ ở 37oC trong 24 giờ. Ghi nhận sự đổi màu của môi

trường nuôi cấy. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Thử nghiệm catalase

Dùng phương pháp thử nghiệm trên lame, vi khuẩn thử nghiệm và E. coli

được nuôi cấy trong 24 giờ, dùng que cấy thẳng lấy một ít sinh khối của vi khuẩn

thử nghiệm và E. coli đặt lên một lame sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối

vi sinh vật trên lame. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Thử nghiệm oxidase

Ta sử dụng giấy thử Oxidase, vi khuẩn thử nghiệm và E. coli được nuôi cấy

trong 24 giờ, dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối của vi khuẩn thử nghiệm và E.

coli bôi lên nửa giấy thử. Ghi nhận sự đổi màu của giấy thử. Thí nghiệm lặp lại 3

lần.

Thử nghiệm khả năng lên men - oxi hóa

Môi trường OF sau khi đun tan agar được phân đều vào các ống nghiệm (10ml), sau đó hấp khử trùng 121oC/15 phút. Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối của

vi khuẩn thử nghiệm và E. coli (sinh khối được tăng sinh 24 – 48 giờ), đâm sâu vào

môi trường OF đã được hấp khử trùng ở trên. Cho parafin lỏng (vô trùng) vào các

ống nghiệm dùng để thử nghiệm khả năng lên men glucose (tạo điều kiện kỵ khí).

Đọc kết quả sau 1,2 ngày. Ghi nhận sự đổi màu của môi trường. Thí nghiệm lặp lại

3 lần.

Thử nghiệm khả năng sinh indole

Pha môi trường Tryptone Broth, khuấy cho tan đều các thành phần môi trường

và phối vào ống nghiệm có nấp, mỗi ống nghiệm 10ml môi trường. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.

Dùng que cấy vòng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối

chứng E. coli vào ống nghiệm môi trường Tryptone Broth. Sau khi cấy giống, các ống nghiệm được ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Đồ án tốt nghiệp

Trước khi bổ sung thuốc thử Kovac’s bổ sung 1 ml petroleum ether, lắc đều để

tách indol trên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào ống dịch

nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi hữu cơ. Thí

nghiệm lặp lại 3 lần.

Thử nghiệm khả năng khử nitrate

Pha môi trường Nitrate Broth, khuấy cho tan đều các thành phần môi trường

và phối vào ống nghiệm có nấp, mỗi ống nghiệm 10ml môi trường. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.

Dùng que cấy vòng cấy sinh khối của hai chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối

chứng E. coli vào ống nghiệm môi trường Nitrate Broth. Sau khi cấy giống, các ống nghiệm được ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Ta dùng phương pháp thử nghiệm trên lame, sau thời gian ủ, lấy một giọt canh

trường nuôi cấy đặt lên lame sạch. Nhỏ một giọt thuốc thử Griess A và một giọt

thuốc thử Griess B lên giọt canh trường. Theo dõi sự hình thành màu hồng, nếu màu

hồng không hình thành ta cho thêm một ít bụi kẽm vào để kiểm tra nitrate. Thí

nghiệm lặp lại 3 lần.

Thử nghiệm khả năng khử Citrate

Pha các thành phần môi trường Simmons Citrate trong nước cất, trộn đều, đun

nóng và thỉnh thoảng lắc. Đun sôi khoảng 1 phút để hòa tan các thành phần môi

trường. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm có nấp để duy trì điều kiện hiếu

khí sao cho khi tạo thạch nghiêng thì đỉnh thạch nghiêng cách nắp ống nghiệm khoảng 2,5 cm và phần sâu có chiều cao khoảng 2,5 cm. Hấp ở 121oC trong 15 phút

và tạo các ống thạch nghiêng.

Dùng que vòng ria sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối chứng E.

trên bề mặt thạch nghiêng.

Sau khi cấy giống, các ống thạch nghiêng được ủ ở 37oC trong 24 giờ. Ghi

nhận sự đổi màu môi trường từ xanh lá sang xanh dương. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Thử nghiệm khả năng di động

Đồ án tốt nghiệp

Pha môi trường NA với 0,5% agar, hấp 121oC trong 15 phút. Để môi trường nguội đến khoảng 60oC đổ ra các đĩa petri. Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối của

hai chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối chứng E. coli vào giữa đĩa petri. Ủ ở nhiệt

độ phòng trong 24 giờ. Theo dõi khả năng di động của vi sinh vật trên đĩa thạch

mềm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Phƣơng pháp định danh bằng APIKIT 20E

Sau khi kiểm tra độ thuần khiết và một số phản ứng sinh hóa đặc trưng, tiến hành

định danh chủng vi khuẩn bằng kit sinh hóa APIKIT 20E:

- Pha môi trường NB tăng sinh 2 giống vi sinh vật là SB và HB. Ủ 300C lắc 150

vòng/ phút, trong 20-24 giờ sao cho khi thu canh trường OD600 khoảng 0,582.

- Pha môi trường NA và nước muối sinh lý 0,85% để cấy trang, thu khuẩn lạc.

- Tiến hành làm Mc Faland 3 theo hướng dẫn tài liệu:

Các mức McFaland

1 2 3 4 Nồng độ 0.05

0.1 0.2 0.3 0.4 0.05 BaCl2 1% (ml)

- Sau 24 giờ, kiểm tra có khuẩn lạc đặc trưng hay không. Nếu có tiến hành

9.9 9.8 9.7 9.6 9.95 H2SO4 1% (ml)

test

định danh API 20E.

- Dùng pipet pasteur thủy tinh đã hấp khử trùng hút nước cất vô trùng vào

khay nhựa để bộ KIT đạt độ ẩm nhất định.

- Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng cho vào nước muối sinh lý cho đến khi đạt độ

đục so với Mc Faland có nồng độ =3.

- Dùng pipet pasteur thủy tinh hút nước muối sinh lý đã có vi khuẩn vào từng

phản ứng của bộ KIT như sau:

Đối với ONPG, TDA, IND, GLU cho đến ARA: cho dịch vào sao cho

đầy tube.

Đồ án tốt nghiệp

Đối với ADH, LDC, ODC, H2S, URE: cho dịch vào không được đầy tube,

sao đó cho dầu khoáng vào ngập cả tube và cupble (đổ cho lồi lên).

Đối với CIT, VP, GEL: cho dịch vào sao cho đầy cả tube và cupble (đổ

cho lồi lên).

- Ghi lại tên người thực hiện, ngày và giờ sau khi cấy xong.

- Ủ bộ KIT ở nhiệt độ 370C, từ 18 – 24 giờ. Sau đó đọc kết quả.

- Đọc kết quả:

Sau 18 giờ: đọc tất cả các phản ứng và hiện tượng của các test ( trừ

TDA, IND, VP), rồi sau đó ghi nhận lại kết quả bằng cách : dương tính (+), âm

tính (-).

Sau 24 giờ: đọc lại tất cả các phản ừng và hiện tượng của các test kể cả

TDA, IND, VP, rồi sau đó ghi nhận lại kết quả bằng cách: dương tính (+), âm tính

(-).

Sau khi đọc kết quả test API dò các hệ số bằng bằng phần mềm ứng dụng sẽ

kết luận được các chủng vi khủng thuộc loài vi sinh vật nào.

Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng kháng sinh

* Tiến hành:

- Mỗi chủng vi khuẩn thử nghiệm trước 1 ngày cần được cấy vào môi trường

thạch không có chất ức chế (thạch dinh dưỡng, thạch máu hoặc thạch não tim), để

tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ.

- Ủ các đĩa thạch qua đêm ở 370C. Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan

vào 2 ml nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Vortex.

- Độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ được so sánh với độ đục chuẩn 0,5

McFarland dưới nền giấy trắng có kẻ các vạch đen. Lưu ý, cần phải trộn đều ống

đục chuẩn trước khi dùng.

- Nếu huyền dịch vi khuẩn không có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5

McFarland, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách cho thêm nước muối sinh lý

hoặc cho thêm vi khuẩn.

Đồ án tốt nghiệp

- Pha loãng 100 lần huyền dịch có độ đục tương đương độ đục McFaland bằng

cách lấy 20 µl huyền dịch này cho vào 2 ml nước muối sinh lý để được huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn /ml.

- Ngoài ra có thể chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn bằng cách lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa

thạch nuôi cấy qua đêm cho vào môi trường (canh thang Mueller-Hinton, canh thang não tim, hoặc canh thang trypton soy). Ủ ở 370C cho tới khi vi khuẩn mọc

đục, sau đó điều chỉnh để có được độ đục huyền dịch vi khuẩn phù hợp cho thử

nghiệm.

- Sử dụng ngay huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn/ml (trong vòng 15 phút) trang

đều lên mặt thạch Mueller-Hinton.

- Hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi.

- Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước

khi đặt kháng sinh.

- Lấy khoanh giấy kháng sinh ra khỏi tủ lạnh hoặc tủ âm, không được mở nắp, để

ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nước tích tụ trên khoanh

giấy kháng sinh.

- Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau

khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch.

- Sử dụng dụng cụ để đặt kháng sinh (Disk-dispensing apparatus), dụng cụ này

phải được đóng nắp chặt, cất trở lại vào trong tủ lạnh và làm ấm ở nhiệt độ phòng

trước khi sử dụng.

- Có thể sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh lên

đĩa thạch hoặc dùng dụng cụ để đặt khoanh giấy kháng sinh nhẹ nhàng lên đĩa

thạch.

- Không nên đặt quá 6 khoanh giấy lên đĩa thạch 90 mm.

- Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng

ức chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.

- Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh

giấy khuếch tán trên mặt thạch.

Đồ án tốt nghiệp

- Lộn ngược các đĩa thạch và ủ ấm ở 37 0C trong vòng 18 – 20 giờ.

* Đọc kết quả biện luận:

Kháng sinh

Ký

Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ

hiệu

R Hàm lượng Đĩa

Ampicillin Am ≥ 17 14 – 16 ≤ 13 10μg

Gentamicin Ge ≥ 15 13 – 14 ≤ 12 10 μg

Cefuroxime Cu ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg

Cefoxitin Cn ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg

Cefotaxime Ct ≥ 26 23 – 25 ≤ 22 30 μg

Amoxicillin-clavulanic acid Ac ≥ 18 14 – 17 ≤ 13 20 μg /10 μg

Amikacin Ak ≥ 17 15 – 16 ≤ 14 30 μg

Piperacillin/tazobactam Pt ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 100 μg /10 μg

Ciprofloxacin Ci ≥ 21 16 – 20 ≤ 15 5 μg

Ertapenem En ≥ 22 19 – 21 ≤ 18 10 μg

Ceftazidime Cz ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 30 μg

Chloramphenicol Cl ≥ 18 13 – 17 ≤ 12 30 μg

Imipenem Im ≥ 23 20 – 22 ≤ 19 10 μg

Bt ≥ 16 Trimethoprim/sulfamethoxaole 11 – 15 ≤ 10 1.25 μg /23.75 μg

Cefepime Cm ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg

Tetracycline Te ≥ 15 12 – 14 ≤ 11 30 μg

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC 2. HÌNH ẢNH

Hình 1. Kết quả định tính sự hiện diện của vi sinh vật trong nước rửa khử trùng

bề mặt tuyến trùng theo phương pháp phân lập được cải tiến từ phương pháp của

Akhurst (1980) và Sun Ho Park và Yeon Su Yu (1999) (Nguyễn Hoàng Anh Kha,

2009)

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2. Kết quả định tính sự hiện diện của vi sinh vật trong nước rửa khử trùng

bề mặt tuyến trùng theo phương pháp phân lập được cải tiến từ phương pháp của

Lawrwnce A. Lacey (2011)

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3. Hình thái khuẩn lạc hai chủng vi khuẩn phân lập được trên MacConkey.

A. SS1; B. SH1

A

B

A

Hình 4. Hình thái khuẩn lạc- thí nghiệm định lượng vi khuẩn trong tuyến trùng

A. SB; B. HB

B

Đồ án tốt nghiệp

Hình 5. Hình thái khuẩn lạc của chủng SS1.

A. Khuẩn lạc trên môi trường NA; B. Khuẩn lạc soi nghiêng trên NA; C. Khuẩn

lạc trên môi trường PGA; D. Khuẩn lạc soi nghiêng trên PGA; E. Khuẩn lạc trên

môi trường Mac; F. Khuẩn lạc soi nghiêng trên Mac

Hình 6. Hình thái khuẩn lạc của chủng SH1.

A. Khuẩn lạc trên môi trường NA; B. Khuẩn lạc soi nghiêng trên NA; C. Khuẩn

lạc trên môi trường PGA; D. Khuẩn lạc soi nghiêng trên PGA; E. Khuẩn lạc trên

môi trường Mac; F. Khuẩn lạc soi nghiêng trên Mac

Đồ án tốt nghiệp

Hình 7. Thử nghiệm khả năng lên men đường lactose

Hình 8. Thử nghiệm khả năng lên men đường Arabinose

Đồ án tốt nghiệp

Hình 9. Thử nghiệm khả năng lên men đường và sinh khí trên môi trường TSI

Hình 10. Thử nghiệm khả năng sinh indole

Đồ án tốt nghiệp

Hình 11. Thử nghiệm khả năng khử nitrate

Hình 12. Thử nghiệm khả năng đồng hóa citrate

Đồ án tốt nghiệp

Hình 13. Thử nghiệm khả năng sinh Oxidase

Hình 14. Thử nghiệm khả năng OF/F – OF/O

Đồ án tốt nghiệp

Hình 15. Thử nghiệm khả năng di động

Từ trái sang phải: E. coli + ; SB + ; HB +

Hình 16. Kết quả Apikit 20E của chủng SB

Hình 17. Kết quả Apikit 20E của chủng HB

Đồ án tốt nghiệp

H ình Khả năng kháng khuẩn của Serratia marcescens SH1 theo phương pháp đục lỗ thạch A. Đối với Bacillus subtilis B. Đối với Staphylococcus aureus C. Đối với Escherichia coli D. Đối với Salmonella

Hình 19. Khả năng kháng khuẩn của Serratia marcescens SS1 theo phương pháp đục lỗ thạch

A. Đối với Bacillus subtilis B. Đối với Staphylococcus aureus C. Đối với Escherichia coli D. Đối với Salmonella

Đồ án tốt nghiệp

H ình Khả năng kháng khuẩn của Serratia marcescens SH1 theo phương pháp cấy chéo

A. Đối với Bacillus subtilis B. Đối với Staphylococcus aureus C. Đối với Escherichia coli D. Đối với Salmonella

H ình Khả năng kháng khuẩn của Serratia marcescens SS1 theo phương pháp cấy chéo A. Đối với Bacillus subtilis B. Đối với Staphylococcus aureus C. Đối với Escherichia coli D. Đối với Salmonella

Đồ án tốt nghiệp

Hình 22. Đối chứng dương kháng khuẩn

Hình 23. Sâu xanh tuổi 4, tuổi 5

Đồ án tốt nghiệp

Hình 24. Sâu xanh tuổi 2, tuổi 3

Hình 25. Ổ trứng sâu xanh và sâu mới nở (tuổi 1)

Đồ án tốt nghiệp

Hình 26. Nhộng sâu xanh và sâu 1 ngày tuổi (tuổi 1)

Hình 27. Bướm sâu xanh

Từ trái sang : Bướm đực, Bướm cái

Đồ án tốt nghiệp

Hình 28. Từ trái sang : Tuyến trùng S – XT, H – CP16

Hình 29. Bố trí thí nghiệm tương tác Tuyến trùng – Vi khuẩn

Từ trái sang: Nghiệm thức, Đối chứng

Đồ án tốt nghiệp

Hình 30. Kết quả định danh APIKIT của hai chủng SB, HB

Hình 31. Đối chứng tiêm E. coli hóa nhộng 100%

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THỐNG KÊ

Summary Statistics for San Luong S – XT by Nong Do

Minimum Maximum Range

Nong Do Count Average Standard deviation 12053.0 66.9104 30420.0 348.281 45993.7 98.6374 45593.7 342.534 44646.7 307.3 38300.0 2832.26 25277.0 223.336 9658.0 135.709 31492.8 14120.1 5 10 15 20 25 30 35 40 Total 3 3 3 3 3 3 3 3 24 12009.0 12130.0 121.0 30030.0 30700.0 670.0 45907.0 46101.0 194.0 45307.0 45973.0 666.0 44320.0 44930.0 610.0 35030.0 39980.0 4950.0 25039.0 25482.0 443.0 261.0 9810.0 9549.0 46101.0 36552.0 9549.0

9658.0 X 12053.0 X 25277.0 X 30420.0 X 38300.0 X 44646.7 X 45593.7 X 45993.7 X 3 3 3 3 3 3 3 3

Multiple Range Tests for San Luong S – XT by Nong Do Method: 95.0 percent LSD Nong Do Count Mean Homogeneous Groups 40 5 35 10 30 25 20 15

ANOVA Table for San Luong S – XT by Nong Do Source Between groups 4.56877E9 Within groups 1.68745E7 4.58564E9 Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 618.86 . 0 7 6.52681E8 16 1.05466E6 23

Đồ án tốt nghiệp

Summary Statistics for San Luong H – CP16 by Nong Do

Col_1 Count Average Standard deviation Minimum Maximum Range 3 5 3 10 3 15 3 20 3 25 3 30 3 35 40 3 Total 24 22109.0 22130.0 21.0 56231.0 56723.0 492.0 85937.0 86121.0 184.0 85327.0 85983.0 656.0 84324.0 84935.0 611.0 70029.0 70982.0 953.0 50100.0 50488.0 388.0 18550.0 18812.0 262.0 18550.0 86121.0 67571.0 22119.7 10.504 56497.7 248.591 86007.0 99.5791 85613.7 335.722 84650.7 307.692 70624.0 518.825 50301.3 194.415 18662.3 134.931 59309.5 26291.7

18662.3 X 22119.7 X 50301.3 X 56497.7 X 70624.0 X 84650.7 X 85613.7 X 86007.0 X 3 3 3 3 3 3 3 3

Multiple Range Tests for San Luong H – CP16 by Nong Do Method: 95.0 percent LSD Col_1 Count Mean Homogeneous Groups 40 5 35 10 30 25 20 15

ANOVA Table for San Luong H – CP16 by Nong Do Source Between groups 1.58976E10 Within groups 1.20878E6 Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 30061.13 . 0 7 2.27108E9 16 75548.8 23 1.58988E10

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC 4. SỐ LIỆU THÔ VÀ BIỂU ĐỒ

Bảng 1. Hiệu lực gây chết sâu xanh tuổi 4 của chủng S – XT

Tỷ lệ sâu chết (%) Số lượng IJs/sâu Số lượng thí nghiệm Số sâu chết Sau 2 ngày phơi nhiễm

0 (đối chứng) 20 0 0

5 20 12 60

10 20 13 65

15 20 15 75

20 20 17 85

25 20 18 90

30 20 19 95

35 20 19 95

40 20 20 100

45 20 20 100

50 20 20 100

LD50= 4,84 ± 0,01 IJ

Bảng 2. Hiệu lực gây chết sâu xanh tuổi 4 của chủng H – CP16

Tỷ lệ sâu chết (%) Số lượng IJs/sâu Số lượng thí nghiệm Số sâu chết Sau 2 ngày phơi nhiễm

0 0 0 (đối chứng) 20

11 55 5 20

14 70 10 20

15 75 15 20

17 85 20 20

18 90 25 20

18 90 30 20

Đồ án tốt nghiệp

35 20 19 95

40 20 20 100

45 20 20 100

50 20 20 100

LD50= 4,81 ± 0,01 IJ

Bảng 3. Sản lượng tuyến trùng chủng S – XT

Chủng S - XT, Sản lượng IJs/sâu Nồng độ gây nhiễm (IJs/sâu)

Lần 1 Lần 2 Lần 3

12020 30030 46101 45501 44690 35030 25482 9549 12130 30700 45907 45307 44930 39980 25039 9810 12009 30530 45973 45973 44320 39890 25310 9615 5 10 15 20 25 30 35 40

Bảng 4. Sản lượng tuyến trùng chủng H – CP16

Nồng độ gây nhiễm (IJs/sâu) Chủng H - CP16, Sản lượng IJS/sâu

5 10 15 20 25 30 35 40 Lần 1 22120 56231 86121 85531 86693 71029 50488 18550 Lần 2 Lần 3 22130 22109 56723 56539 85937 85963 85327 85983 85935 84324 72982 73861 50100 50316 18812 18625

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 5. Tổng số vi khuẩn trong tuyến trùng (cfu/IJ)

cfu/IJs Chủng vi Mẫu Mẫu Mẫu khuẩn Trung bình 1 2 3

SB 119 110 114 114,33 ± 3,11

HB 97 99 98 98 ± 0,67

Bảng 6. Đường kính vòng nấm

Đường kính vòng nấm (cm)

HB SB Đối chứng Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

3,5 3,2 2 1,4 3,3 3,7 7,5

3 3,8 4,3 3,3 2 3,3 7

Colletotrichum sp. Colletotrichum gloeosporioides Fusarium sp. Neoscytalidium sp. Rhizoctonia sp. 3,2 4,2 2,4 3,3 4,4 2,4 4 4,5 2,1 3,1 3,8 2,4 3 4,2 2 3 3,9 2,3 6,3 8 6,2

Bảng 7. Số lượng tuyến trùng chết ở thí nghiệm tương tác tuyến trùng – vi khuẩn

Thời gian Số tuyến trùng chết/ đĩa (S - XT/ SB) Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3

Sau 3 ngày Sau 6 ngày Sau 9 ngày Sau 12 ngày 0 0 2 5 0 0 1 4 0 0 2 4

Bảng 8. Số lượng tuyến trùng chết ở thí nghiệm tương tác tuyến trùng – vi khuẩn

Thời gian Số tuyến trùng chết/ đĩa (H - CP16/ HB) Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3

Sau 3 ngày Sau 6 ngày Sau 9 ngày Sau 12 ngày 0 0 3 5 0 0 2 5 0 0 3 5

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 9. Số lượng tuyến trùng chết ở thí nghiệm tương tác tuyến trùng – vi khuẩn

Thời gian Số tuyến trùng chết/ đĩa (Đối chứng S - XT) Đĩa 1 Đĩa 3 Đĩa 2

Sau 3 ngày Sau 6 ngày Sau 9 ngày Sau 12 ngày 0 3 8 14 0 3 10 15 0 1 13 18

Thời gian Số tuyến trùng chết/ đĩa (Đối chứng H - CP16) Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3

Sau 3 ngày Sau 6 ngày Sau 9 ngày Sau 12 ngày 0 0 15 20 0 1 13 18 0 3 12 20