Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel từ chủng nấm mốc Trichoderma spp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

KKKHHHẢẢẢOOO SSSÁÁÁTTT KKKHHHẢẢẢ NNNĂĂĂNNNGGG SSSIIINNNHHH TTTỔỔỔNNNGGG HHHỢỢỢPPP

EEENNNZZZYYYMMMEEE XXXYYYLLLAAANNNAAASSSEEE VVVÀÀÀ TTTIIINNNHHH SSSẠẠẠCCCHHH BBBẰẰẰNNNGGG

ĐĐĐỒỒỒ ÁÁÁNNN TTTỐỐỐTTT NNNGGGHHHIIIỆỆỆPPP

SSSẮẮẮCCC KKKÝÝÝ LLLỌỌỌCCC GGGEEELLL TTTỪỪỪ CCCHHHỦỦỦNNNGGG NNNẤẤẤMMM MMMỐỐỐCCC

TTTRRRIIICCCHHHOOODDDEEERRRMMMAAA SSSPPPPPP...

Ngành:

MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn

: KS. ĐỖ THỊ TUYẾN

Sinh viên thực hiện

: LÊ NGỌC MỸ

MSSV: 1191111028

Lớp: 11HSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không sao chép đồ

án/khóa luận tốt nghiệp của người khác dưới mọi hình thức nào. Đây là nghiên cứu

hoàn toàn của riêng tôi, những số liệu trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực và

chưa được công bố bởi tác giả nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan trên.

LỜI CÁM ƠN

Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp em đã được áp dụng những lý thuyết

đã học vào thực tế và thêm được những kinh nghiệm bổ ích cho công việc sau này. Em

xin chân thành cảm ơn :

Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM đã cho phép em làm đồ án tốt nghiệp tại Viện,

cung cấp những thiết bị, máy móc hiện đại giúp ích rất nhiều cho việc thực hiện đồ án.

Ks. Đỗ Thị Tuyến đã hướng dẫn, giúp đỡ cho em rất tận tình, giải thích những

thắc mắc trong khi thực hiện đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ các tài liệu để em hoàn

thành đồ án một cách tốt nhất.

Các thầy cô trong khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ

Thuật Công nghệ TP.HCM đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho

em trong những năm học vừa qua.

Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn đồng hành, chia sẽ, động

viên. Các bạn trên Viện và bạn Nguyễn Thị Hoài An đã giúp đỡ em thực hiện tốt đồ án

tốt nghiệp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

KKKHHHẢẢẢOOO SSSÁÁÁTTT KKKHHHẢẢẢ NNNĂĂĂNNNGGG SSSIIINNNHHH TTTỔỔỔNNNGGG HHHỢỢỢPPP

EEENNNZZZYYYMMMEEE XXXYYYLLLAAANNNAAASSSEEE VVVÀÀÀ TTTIIINNNHHH SSSẠẠẠCCCHHH BBBẰẰẰNNNGGG

ĐĐĐỒỒỒ ÁÁÁNNN TTTỐỐỐTTT NNNGGGHHHIIIỆỆỆPPP

SSSẮẮẮCCC KKKÝÝÝ LLLỌỌỌCCC GGGEEELLL TTTỪỪỪ CCCHHHỦỦỦNNNGGG NNNẤẤẤMMM MMMỐỐỐCCC

TTTRRRIIICCCHHHOOODDDEEERRRMMMAAA SSSPPPPPP...

Ngành:

MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn

: KS. ĐỖ THỊ TUYẾN

Sinh viên thực hiện

: LÊ NGỌC MỸ

MSSV: 1191111028

Lớp: 11HSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là sinh viên Lê Ngọc Mỹ, lớp 11HSH02 xin cam đoan không sao chép đồ

án/khóa luận tốt nghiệp của người khác dưới mọi hình thức nào. Đây là nghiên cứu hoàn

toàn của riêng tôi, những số liệu trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực và chưa

được công bố bởi tác giả nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan trên.

LỜI CÁM ƠN

Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp em đã được áp dụng những lý thuyết

đã học vào thực tế và thêm được những kinh nghiệm bổ ích cho công việc sau này.

Em xin chân thành cảm ơn :

Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM đã cho phép em làm đồ án tốt nghiệp tại

Viện, cung cấp những thiết bị, máy móc hiện đại giúp ích rất nhiều cho việc thực hiện

đồ án.

Ks. Đỗ Thị Tuyến đã hướng dẫn, giúp đỡ cho em rất tận tình, giải thích những

thắc mắc trong khi thực hiện đồ án tốt nghiệp, cung cấp đầy đủ các tài liệu để em hoàn

thành đồ án một cách tốt nhất.

Các thầy cô trong khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học trường Đại học Kỹ

Thuật Công nghệ TP.HCM đã tận tình dạy dỗ và truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm

cho em trong những năm học vừa qua.

Và em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn đồng hành, chia sẽ, động

viên. Các bạn trên Viện và bạn Nguyễn Thị Hoài An đã giúp đỡ em thực hiện tốt đồ

án tốt nghiệp.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... v

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ ........................................................................... viii

LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1

1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1

2. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................... 3

3. Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................................ 3

4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 3

5. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp ........................................................................... 3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4

1.1. Giới thiệu chung về cơ chất xylan, enzyme xylanase ....................................... 4

1.1.1. Cơ chất xylan .............................................................................................. 4

1.1.2. Hệ enzyme xylanase .................................................................................... 5

1.1.3. Hệ xylanase của Trichoderma spp. ............................................................ 5

1.1.4. Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thủy phân xylan ....................................... 6

1.2. Giới thiệu chung về nấm sợi Trichoderma spp. ............................................... 6

1.2.1. Phân loại Trichoderma spp ........................................................................ 6

1.2.2. Đặc điểm sinh học của Trichoderma spp. .................................................. 7

1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Trichoderma spp. ..................................... 7

1.2.4. Một số ứng dụng của Trichoderma ............................................................ 8

1.3. Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzyme .................................... 9

1.4. Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme .................................... 10

i

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

1.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp xylanase .................................... 11

1.5.1. Bã mía ...................................................................................................... 11

1.5.2. Cám mì .................................................................................................... 11

1.6. Phƣơng pháp lên men bán rắn thu nhận enzyme và các yếu tố ảnh hƣởng

đến sinh tổng hợp xylanase trong điều kiện nuôi cấy bán rắn ............................... 12

1.6.1. Độ ẩm của môi trường nuôi cấy ........................................................... 12

1.6.2. Sự thông khí .......................................................................................... 13

1.6.3. Nguồn carbon ....................................................................................... 13

1.6.4. Nguồn nitrogen ..................................................................................... 13

1.6.5. pH .......................................................................................................... 14

1.6.6. Các nguyên tố khoáng........................................................................... 14

1.7. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch chế phẩm enzyme ............................. 15

1.8. Sợ lƣợc về sắc ký lọc gel ............................................................................. 16

1.8.1. Bản chất của phương pháp ...................................................................... 16

1.8.2. Đặc tính của gel ....................................................................................... 17

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................................... 18

2.1. Nguyên liệu .................................................................................................. 18

2.2. Hóa chất và thiết bị ...................................................................................... 18

2.2.1. Hóa chất ................................................................................................ 18

2.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 18

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase từ nấm

mốc Trichoderma spp. ........................................................................................... 19

2.3.1. Phương pháp mô tả hình thái Trichoderma ......................................... 19

2.3.2. Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu ........... 19

2.3.3. Phương pháp đo đường vành khuyên phân giải ................................... 20

ii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

2.3.4. Quy trình khảo sát một số yếu tố .............................................................. 21

2.3.5. Thuyết minh quy trình............................................................................... 22

2.4. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 24

2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase ..

............................................................................................................... 24

2.4.2. Khảo sát các tác nhân tủa enzyme xylanase ......................................... 26

2.4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme xylanase .......... 30

2.5. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu và xử lí kết quả ................. 34

2.5.1. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu .................................... 34

2.5.2. Xử lý số liệu .......................................................................................... 37

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .............................................................. 38

3.1. Quan sát hình thái Trichoderma spp. trên môi trƣờng PGA ....................... 38

3.1.1. Quan sát đại thể .................................................................................... 38

3.1.2. Quan sát vi thể ...................................................................................... 39

3.2. Định tính enzyme xylanase của Trichoderma spp. ..................................... 40

3.3. Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp. ................................................... 41

3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase của

Trichoderma spp. ................................................................................................... 41

3.5.1. Khảo sát dung môi và tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase ..... 51

3.5.2. Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme xylanase từ dịch chiết bằng

phương pháp kết tủa ........................................................................................... 53

3.5.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme xylanase ......... 58

3.6. Tinh sạch enzyme xyalanse bằng phƣơng pháp chạy sắc ký lọc gel ........... 60

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 62

4.1. Kết luận ........................................................................................................... 62

iii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

4.2. Đề nghị ............................................................................................................ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 64

PHỤ LỤC A ................................................................................................................ 1

PHỤ LỤC B ................................................................................................................ 2

PHỤ LỤC C ................................................................................................................ 4

iv

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BM Bã mía

CM Cám mì

Acid 2-hydroxyl-3,5-dinitrobenzoic DNS

DC Dịch chiết

HT Hoạt tính

HL Hàm lƣợng

HTR Hoạt tính riêng

IU (UI) Unit Internation, đơn vị quốc tế

v

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

DANH MỤC BẢNG

STT Bảng Nội dung Trang

1 1.1 Thành phần hóa học của bã mía 11

2 1.2 Thành phần hóa học của cám mì 11

Nồng độ chất khoáng cần thiết cho sinh trƣởng nấm 3 1.3 14 mốc và xạ khuẩn

4 2.1 Bảng số liệu dựng đƣờng chuẩn Bradford 35

5 2.2 Tỷ lệ pha loãng dung dịch Xylose chuẩn 36

Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 6 3.1 42 Trichoderma spp. với tỷ lệ cơ chất khác nhau

Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 7 3.2 44 Trichoderma spp. có độ ẩm môi turờng khác nhau

Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 8 3.3 45 Trichoderma spp. có pH khác nhau

Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 9 3.4 47 Trichoderma spp. có nồng độ dinh dƣỡng khác nhau

Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 10 3.5 48 Trichoderma spp. có thời gian nuôi cấy khác nhau

Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 11 3.6 50 Trichoderma spp. có tỷ lệ giống khác nhau

Kết quả khảo sát các dung môi để tách chiết enzyme 12 3.7 51 xylanase

13 3.8 Kết quả tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase 52

Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzyme 14 3.9 53 xylanase

Kết quả khảo sát tỷ lệ acetone dùng để tủa enzyme 15 3.10 55 xylanase

16 3.11 Kết quả khảo sát tỷ lệ nồng độ muối dùng để tủa 56

vi

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

enzyme xylanase

17 3.12 So sánh kết quả tủa enzyme xylanase 57

Kết quả ảnh hƣởng của pH đến chế phẩm enzyme 18 3.13 58 xylanase

Kết quả ảnh hƣởng của nhiệt độ đến chế phẩm 19 3.14 59 enzyme xylanase

20 3.15 Hiệu suất tinh sạch 61

vii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

DANH MỤC HÌNH

STT Hình Nội dung Trang

1 1.1 Sơ đồ cấu trúc cách tế bào thực vật 4

2 1.2 Trichoderma spp. 6

3 3.1 Hình thái đại thể của Trichoderma spp. 38

4 3.2 Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 24h 39

5 3.3 Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 36h 39

6 3.4 Hình thái vi thể của Trichoderma spp. ở 48h 39

7 3.5 Kết quả vành phân giải Xylanase của Trichoderma spp. 40

DANH MỤC ĐỒ THỊ

STT Đồ thị Nội dung Trang

Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính

1 3.1 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có 42

tỷ lệ cơ chất khác nhau

Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính

2 3.2 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có 44

độ ẩm khác nhau

Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính

3 3.3 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có 46

độ ẩm khác nhau

Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính

4 3.4 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có 47

độ ẩm khác nhau

Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính 5 3.5 49 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có

viii

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

độ ẩm khác nhau

Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng Protein và hoạt tính

3.6 Xylanase từ môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có 6 50

độ ẩm khác nhau

Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của 7 3.7 51 các dung môi tách chiết enzyme xylanase

3.8 Biểu diễn tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase 8 52

Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme 9 3.9 54 xylanase từ các phân đoạn tủa bằng cồn

Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme 10 3.10 55 xylanase từ các phân đoạn tủa bằng acetone

Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme 11 3.11 56 xylanase từ các phân đoạn tủa bằng muối

Biểu diễn kết quả so sánh tủa enzyme xylanase từ các 12 3.12 57 tác nhân tủa

Biểu diễn hoạt tính xylanase theo pH của chế 13 3.13 58 phẩm enzyme xylanase

Biểu diễn hoạt tính xylanase theo nhiệt độ của 3.14 14 59 chế phẩm enzyme xylanase

15 3.15 Sắc ký đồ trên excel khi chạy sắc ký enzyme xylanase 60

ix

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

LỜI MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Ngày nay, công nghệ vi sinh – hóa sinh phát triển nhanh chóng tạo điều kiện

cho nghiên cứu phát triển, giúp ứng dụng vào thực tế nông nghiệp cũng nhƣ công

nghiệp thực phẩm rất có hiệu quả. Việc sử dụng các chế phẩm enzyme trong nông

nghiệp và công nghiệp thực phẩm đƣợc sử dụng nhiều trong thực tế sản xuất nhằm

nâng cao chất lƣợng cũng nhƣ năng suất của sản phẩm, đồng thời tiết kiệm chi phí

sản xuất. Vì vậy, việc nghiên cứu và sản xuất ra enzyme và các chế phẩm enzyme

ngày càng đƣợc quan tâm nhiều hơn.

Việt Nam là một nƣớc nhiệt đới có nền nông nghiệp khá phát triển, phong

phú và đa dạng trên đà phát triển mạnh. Lƣợng phế phẩm và phụ phẩm của nông

nghiệp, công nghiệp cũng rất dồi dào nhƣng lại không đƣợc xử lý đúng mức. Theo

đó các chất thải hữu cơ cũng gia tăng lên không ngừng. Trong đó phụ liệu của nhà

máy mía đƣờng là một ví dụ điển hình và chiếm khoảng 20% mía nguyên liệu. Theo

đánh giá của ngành mía đƣờng, nếu công suất nhà máy là 1000 tấn/ngày thì mỗi

ngày nhà máy thải ra môi trƣờng khoảng 25 tấn bã mía gây ô nhiễm nghiêm trọng.

Chính vì thế, đang có nhiều hƣớng giải quyết lƣợng bã mía sau sản xuất trên

một số nhà máy sử dụng bã mía làm nhiên liệu đốt lò hơi, cách này rất lãng phí mà

lại ô nhiễm môi trƣờng sống. Còn các nhà máy khác lại cố gắng tận dụng bã mía

vào các mục đích tốt hơn nhƣ làm ván ép, thức ăn gia súc…Nhƣng những biện pháp

trên chƣa khả thi vì thành phần ván ép từ bã mía chƣa tốt và chắc bền nhƣ ván ép từ

gỗ, còn thức ăn gia súc không thực sự đảm bảo nguồn dinh dƣỡng cho vật nuôi

cũng nhƣ tốn nhiều chi phí cho sản xuất. Nếu để lâu bã mía sẽ bị vi sinh vật mùn

hóa, lúc này có thể làm phân bón cho cây trồng nhƣng phải mất một thời gian rất

lâu để vi sinh vật phân hủy vì thế không có khả năng giải quyết đƣợc thực trạng

lƣợng bã mía tồn đọng ngày càng nhiều, hao tốn diện tích.

Enzyme là một protein đặc biệt đƣợc sinh vật tổng hợp và tham gia các phản

ứng sinh hóa, là thành phần không thể thiếu trong mọi tế bào sinh vật. Chúng đóng

vai trò quyết định mối quan hệ giữa cơ thể sống và môi trƣờng.

1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Cuối thế kỷ 19 và suốt thế kỷ 20, ngành công nghệ enzyme rất phát triển và

phát triển thành ngành công nghiệp sản xuất enzyme dựa vào hoạt động sống của vi

sinh vật. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những thuận lợi to lớn cho nhiều

nƣớc.

Từ lâu, xylanase đã đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm nhƣ:

làm bánh mỳ, nƣớc hoa quả, rƣợu vang, bia, thu nhận đƣờng xylose. Xylanase đã,

đang và ngày càng đƣợc bổ sung nhiều hơn vào thức ăn chăn nuôi. Kết quả cho

thấy, bổ sung xylanase một cách độc lập hay kết hợp với các enzyme khác vào thức

ăn làm tăng đáng kể khối lƣợng và giảm thiểu bệnh tật ở vật nuôi. Xylanase có tác

dụng phân giải xylan, một thành phần quan trọng của hemicellulose có nhiều trong

thức ăn của vật nuôi, giải phóng đƣờng xylose và xylooligosaccharide dẫn đến làm

giảm độ nhớt của thức ăn, giúp cho vật nuôi tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dƣỡng tốt

hơn, cải thiện hệ vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi.

Ở Việt Nam, nguồn vi sinh vật sinh enzyme trong đó có Xylanase khá phong

phú, phần lớn có nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn. Đây là một thuận lợi lớn cho sự

phát triển lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất Xylanase từ vi sinh vật. Mặt khác, nƣớc

ta là một nƣớc nông nghiệp nên hàng năm các phế phụ phẩm nông nghiệp nhƣ rơm,

lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ lạc... rất lớn, đây là nguồn cung cấp chất lên men rẻ tiền

và dễ kiếm.

Muốn thu đƣợc enzyme có hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và

chọn giống vi sinh vật để chọn những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải lựa

chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trƣờng tối ƣu cũng nhƣ tiêu chuẩn hóa

điều kiện nuôi cấy.

Ở Việt Nam hiện nay, công nghệ enzyme vẫn chƣa phát triển, nguồn enzyme

còn hạn chế phụ thuộc vào enzyme nhập khẩu từ nƣớc ngoài. Vì vậy, việc nghiên

cứu và phát triển công nghệ enzyme để ứng dụng vào công nghiệp, đời sống là rất

cần thiết.

2

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Từ những lý do trên chúng tôi xây dựng đề tài: “Khảo sát một số yếu tố ảnh

hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme xylanase và tinh sạch bằng sắc ký

lọc gel từ nấm mốc Trichoderma spp.”.

2. Mục đích nghiên cứu

Tìm ra môi trƣờng tốt nhất để chủng nấm mốc Trichoderma spp. thực hiện

tối ƣu hóa môi trƣờng

Tinh sạch enzyme xylanase đƣợc thu nhận từ nấm mốc Trichoderma spp.

3. Nhiệm vụ nghiên cứu

Khảo sát thành phần môi trƣờng cảm ứng để chủng nấm mốc Trichoderma

spp. cho hoạt lực enzyme cao nhất. Các thành phần của môi trƣờng ảnh hƣởng đến

hoạt lực enzyme bao gồm: tỷ lệ cám mì : bã mía, độ ẩm, nồng độ dinh dƣỡng, pH,

thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống.

Tách chiết và tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.

4. Phƣơng pháp nghiên cứu

Phƣơng pháp Bradford dùng để xác định hàm lƣợng protein.

Phƣơng pháp Xylose dùng để xác định hoạt tính enzyme xylanase.

Phƣơng pháp tủa enzyme bằng các tác nhân khác nhau.

Phƣơng pháp tinh sạch enzyme xylanase bằng sắc ký lọc gel.

5. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp

Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu

Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp

Chƣơng 3: Kết quả và biện luận

Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị

3

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cơ chất xylan, enzyme xylanase

1.1.1. Cơ chất xylan

Xylan là thành phần chính của hemicelluloses thực vật, đứng thứ hai sau

cellulose và chiếm khoảng một phần ba nguồn carbon hữu cơ có thể phục hồi trên

trái đất (Prade, 1995). Trong đó, hemicelluloses là phức hợp polysaccharide gồm

xylan, xyloglucan, glucomannan và arabinogalactan (Shallom, D và Shoham, Y ,

2003). Phức hợp này cùng với cellulose, pectin và một lƣợng nhỏ glycoprotein và

các hợp chất phenolic hình thành vách tế bào sơ cấp. Sau đó, vách tế bào sơ cấp

đƣợc phát triển thành vách thứ cấp.

Ngoài thành phần chính là cellulose và hemicelluloses, trong vách thứ cấp

còn có thêm lignin – đƣợc hình thành bởi quá trình đồng hóa các dẫn xuất

phenylpropan nhƣ cumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol tạo nên

thành phần polymer của vách tế bào thực vật (Kulkarni, N et al, 1999). Ba thành

phần chính trong cấu trúc vách tế bào thực vật kết hợp với nhau nhờ các liên kết

cộng hóa trị và không cộng hóa trị. Xylan đƣợc tìm thấy ở điểm giao giữa lignin và

cellulose, đây là giao điểm quan trọng của sự gắn kết và toàn vẹn của vách tế bào

thực vật (Beg, Q.K., et al. 2001).

Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc vách tế bào thực vật

4

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Xylan đƣợc tìm thấy trong một lƣợng lớn trong gỗ cứng của thực vật hạt kín

(15 – 30%) và gỗ mềm của thực vật hạt trần (7 – 10%), cũng nhƣ trong cây hàng

năm (< 30%) (Singh, S, et al., 2003). Xylan là polysaccharide phức, có cấu trúc thay

đổi giữa các loài thực vật khác nhau. Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi D-xylose

đƣợc nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside, tảo biển tổng hợp xylan với cấu

trúc khác là D-glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,3-glucoside. Nhìn chung,

xylan là polysaccharide có cấu trúc gồm các đơn vị xylose liên kết với liên kết β-

1,4-glucoside (Whistler và Richards, 1970). Phần lớn xylan là heteropolysacharide,

có các nhóm thế khác nhau trong khung sƣờn và chuỗi bên (Biely, 1995). Các nhóm

thế phổ biến trên khung sƣờn xylan là acetyl, arabinofuranosyl và glucuronysyl

(Whitsler và Richards, 1970). Với các nhóm thế khác nhau nhƣ vậy, xylan đƣợc

phân loại thành homoxylan thẳng, arabinoxylan, acetyxylan, glucuronoxylan và

glucu-arabinoxylan.

1.1.2. Hệ enzyme xylanase

Xylanase thủy phân liên kết β-1,4 trong khung sƣờn xylan. Xylanase đƣợc

biết thuộc họ 10 và 11 (hơn 300 trình tự gen đã đƣợc biết) và khoảng hơn 20 gen

xylanase đƣợc xếp vào họ 5, 8, 43 (Shallom, Shoham, 2003).

Cho đến nay, đã có 87 xylanase đƣợc xác định cấu trúc lập thể. Hầu hết

xylanase của vi sinh vật là protein đơn phân tử. Ngày nay, xylanase đa phân tử ngày

càng đƣợc miêu tả nhiều hơn. Những enzyme này chứa những cấu trúc đƣợc coi là

vùng xúc tác (catalytic domain) hoặc một số vị trí gắn với carbohydrate. Những

enzyme xylanase chứa CBDs có hiệu quả thủy phân cao trên cơ chất kết tinh và

nồng độ cao trên bề mặt cơ chất lỏng.

1.1.3. Hệ xylanase của Trichoderma spp.

Vi sinh vật sinh ra nhiều loại endoxylanase với các đặc tính lý hóa, cấu trúc,

hoạt tính và hiệu suất rất đa dạng và phức tạp. Các chủng Trichoderma sản xuất ra

tất cả các enzyme thủy phân xylan. Nhiều loài đã đƣợc phân tách và giải trình tự.

5

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Hệ enzyme thủy phân xylan đƣợc sản xuất bởi chủng Trichoderma, chủ yếu là

T.reesei, là những enzyme đƣợc xác định rõ trong nhóm thủy phân vách tế bào.

1.1.4. Cảm ứng sinh tổng hợp enzyme thủy phân xylan

Xylanase là enzyme cảm ứng đƣợc vi sinh vật tiết vào môi trƣờng nuôi cấy

có mặt xylan hoặc cơ chất giàu xylan (Balakrishnan và cộng sự, 1997). Xylan là

polymer cao phân tử không thể xâm nhập vào tế bào. Do vậy, sự sinh tổng hợp

xylanase đƣợc cảm ứng chủ yếu bởi các phân đoạn của xylan nhƣ xylose, xylobiose,

xylooligosacharide của xylose, có trọng lƣợng phân tử thấp đƣợc tạo ra trong môi

trƣờng nhờ một lƣợng nhỏ enzyme xúc tác (Bastawde 1992, Kulkarni và cộng sự,

1999).

Nhiều nghiên cứu cho rằng, ligocellulose có trong cám mì, trấu, bã mía…là

yếu tố cảm ứng vi sinh vật sinh xylanase (Beg và cộng sƣ, 1998, Puchart và cộng

sự, 1999). Các loại nấm sợi sử dụng xylan nhƣ nguồn carbon để cảm ứng sinh tổng

hợp xylanase.

1.2. Giới thiệu chung về nấm sợi Trichoderma spp.

1.2.1. Phân loại Trichoderma spp

Lớp: Euascomycetes

Bộ: Hypoceales

Họ: Hypocreaceae

Giống: Trichoderma

Hình 1.2. Trichoderma spp.

Có 5 loài chính: Trichoderma Harzianum, Trichoderma koningii,

Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma viride.

6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

1.2.2. Đặc điểm sinh học của Trichoderma spp.

Trichoderma là nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng cách đính bào tử từ

khuẩn ty. Khuẩn lạc có màu trắng hoặc từ lúc trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến

lục đậm.

Khuẩn ty không màu, cuống sinh bào tử phân nhiều nhánh, ở cuối nhánh

phát triển thành khối tròn mang các bào tử không có vách ngăn, không màu, liên kết

nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip hoặc

hình thuôn, có thành trơn hoặc nhám. Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển

nhanh, đƣờng kính khuẩn lạc lớn hơn 9cm sau 5 ngày trên môi trƣờng thạch đĩa OA

(oatmeal agaro) ở 20ºC.

1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Trichoderma spp.

Trichoderma phân bố chủ yếu ở trong đất và phân hủy gỗ, xác thực vật. Các

loài Trichoderma là thành phần chiếm ƣu thế trong hệ vi sinh vật đất với môi

trƣờng sống biến đổi đa dạng. Trichoderma rất khó tìm thấy trên thực vật sống và

không sống nội kí sinh thực vật (Gary J Samuels, 2000). Các chủng Trichoderma

spp. đƣợc tìm thấy rất nhiều trong môi trƣờng tự nhiên, đặc biệt trong môi trƣờng

đất, chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác, …),

chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%) và sống đƣợc ở đất acid và

base (pH 3 – 8). Hầu hết các loài Trichoderma sống hoại sinh, thƣờng gặp trên xác

bã thực vật, ở những nơi ẩm ƣớt… Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức

ăn khác nhau từ carbonhydrate, amino acid đến ammonia.

Theo Garrett (1956), khả năng cạnh tranh dinh dƣỡng cao của Trichoderma

spp. Do các đặc tính sau:

- Sinh trƣởng mạnh và bào tử nảy mầm rất nhanh.

- Có khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân cao.

- Có khả năng tạo chất kháng sinh.

- Chịu đƣợc chất kháng sinh.

7

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Các loài Trichoderma spp. khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng

khác nhau. Chẳng hạn nhƣ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có

khả năng sống trong môi trƣờng có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và

Trichoderma polysporum thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum phân

bố ở vùng có khí hậu ấm áp.

1.2.4. Một số ứng dụng của Trichoderma

1.2.4.1. Bảo vệ thực vật

Trichoderma đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học. Chúng có

khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm gây bệnh thực vật, đồng thời kích

thích sự tăng trƣởng của cây trồng. Quá trình kiểm soát sinh học bởi Trichoderma

theo các cơ chế sau:

Sự kí sinh nấm: Trichoderma có khả năng cảm ứng tiết ra một lƣợng lớn các

enzyme chitinase, glucanase, cellulose, protease… thủy phân vách tế bào sợi nấm

gây bệnh làm cho chúng không phát triển đƣợc và bị tiêu diệt.

Khả năng tiết kháng sinh: Trichoderma còn có khả năng tiết một số chất

kháng sinh dễ bay hơi hoặc không bay hơi và một số hợp chất ức chế tăng trƣởng.

Ngoài ra, Trichoderma có khả năng cạnh tranh chất dinh dƣỡng và không

gian, làm bất hoạt hệ enzyme ở nấm gây bệnh.

1.2.4.2. Cải thiện năng suất cây trồng

Ngày nay, các nƣớc có nền công nghiệp phát triển có xu hƣớng sử dụng phân

bón hữu cơ sinh học thế hệ mới, thực chất là sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và

thuốc trừ sâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học để khắc phục những hạn

chế khi sử dụng phân bón hóa học, thuốc trừ sâu mà vẫn cho năng xuất cây trồng.

Khi khảo sát các loài Trichoderma ở các lớp đất sâu, ngƣời ta thấy rằng

Trichoderma làm tăng số lƣợng các rễ nằm sâu trong đất, điều này góp phần giúp

các cây lƣơng thực nhƣ ngô có khả năng chống chịu hạn tốt.

Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy mầm và sự ra hoa. Đã

có nhiều công trình khoa học chứng minh rằng Trichoderma harzianum và

8

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Trichoderma koningii kích thích sự nẩy mầm và tăng trƣởng của cây. Đối với các

hoa đƣợc trồng trong nhà kính, Trichoderma harzianum đẩy mạnh sự ra hoa bằng

cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lƣợng hoa.

1.2.4.3. Xử lý ô nhiễm môi trường

Trichoderma harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp

chất tự do 2, 4, 6-trichlorophenol; 4,5-dichloroguaiacol và alcohol oxidase trong

môi trƣờng chứa muối khoáng.

Trichoderma harzianum CCT – 4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion

trong đất trong 24 giờ, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô

nhiễm trong đất và trong đầm lầy.

Trichoderma reesei Rut-30 có thể xử lý chất thải sinh hoạt đô thị, hứa hẹn

một nguồn sản xuất enzyme cellulose rẻ tiền, đồng thời giảm lƣợng rác thải.

1.2.4.4. Các lĩnh vực khác

Các enzyme ngoại bào đƣợc tổng hợp từ Trichoderma bao gồm cellulase,

hemicellulase, đƣợc ứng dụng rỗng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ: sản xuất

thức ăn gia súc, sản phẩm thực phẩm và đồ uống, công nghiệp dệt và sản xuất

giấy…

1.3. Vai trò của giống trong công nghệ sản xuất enzyme

Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đóng vai trò quyết định:

- Giống vi sinh vật quyết định đến năng suất của enzyme.

- Giống vi sinh vật ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm sinh học (hay là

hoạt tính enzyme).

- Giống vi sinh vật quyết định vốn đầu tƣ cho sản xuất.

- Giống vi sinh vật quyết định giá thành cho sản phẩm. Nhƣ vậy giống vi

sinh vật có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinh vật.

9

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

1.4. Yêu cầu giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme

Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và đƣợc

sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó giống vi sinh vật ứng dụng trong công

nghệ enzyme cần có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là:

Giống vi sinh vật phải tạo ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này

phải có số lƣợng và chất lƣợng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì vậy trong quá

trình trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lƣợng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng

nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể vi sinh vật

cần tổng hợp nhiều chất và tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau. Chính vì thế

giống vi sinh vật dùng cho sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải

trội hơn các sản phẩm khác cả về số lƣợng và chất lƣợng.

Cho năng suất sinh học cao. Có khả năng thích nghi nhanh và phát triển

mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp.

Có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phƣơng nơi

nhà máy hoạt động.

Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật

thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.

Có tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo ra sản phẩm mong muốn, dễ tách sản

phẩm ra khỏi tạp chất.

Ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản.

Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên

men công nghiệp ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết.

10

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

1.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp xylanase

1.5.1. Bã mía

Thành phần hóa học của bã mía

Bã mía (sản phẩm của quá trình ép mía) là phế liệu chiếm nhiều nhất trong

sản xuất đƣờng. Từ 100 tấn mía cây đƣa vào nhà máy, ta có 10 – 12 tấn đƣờng, 23 –

28 tấn bã mía, 3 – 4 tấn mất rỉ, 1,5 – 3 tấn bùn lọc. Bã mía sau khi ép thƣờng ngậm

45 – 50 % nƣớc.

Ngoài nƣớc bã mía còn chứa thành phần chất xơ chủ yếu là cellolose. Các

chất hòa tan trong nƣớc (nƣớc này là nƣớc thẩm thấu và nƣớc mía nguyên chất)

gồm đƣờng và các chất tạp khác, các chất hòa tan chiếm số lƣợng nhỏ từ 2 đến 4%.

Bã mía (toàn Tủy mía (%) Thành phần Xơ bã mía (%) bộ)

55,40 46,00 56,50 Cellulose

29,30 24,50 26,11 Hemicelluloses

3,55 3,45 2,25 Lipid và sáp

3,02 2,40 1,30 Chất khoáng

22,30 19,95 19,15 Lignin

2,42 2,22 0,46 Silic

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của bã mía (A.G.Keller, 1964).

1.5.2. Cám mì

Cám mì là sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến bột mì.

Cám mì Thành phần

14 – 15,5% Protein thô

8 – 10% Chất xơ thô

4,5 – 6% Chất béo thô

11 – 14% Độ ẩm

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của cám mì

11

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Cám mì là loại thức ăn tốt cho gia súc. So với cám gạo, cám mì có hàm

lƣợng protein cao hơn (bình quân 15,5%), ít hơn dầu (bình quân 4%), 8 – 10% xơ

thô với độ ẩm 11 – 14%, năng lƣợng trao đổi là 2420 Kcal/g. Cám mì thƣờng có hai

loại: loại có màu vàng nâu nhạt, hoàn toàn là cám; loại màu ngà trắng, ngoài vỏ cám

còn lẫn cả tinh bột.

1.6. Phƣơng pháp lên men bán rắn thu nhận enzyme và các yếu tố ảnh

hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase trong điều kiện nuôi cấy bán

rắn

Ngày nay, nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng bán rắn đƣợc quan tâm và sử

dụng rộng rãi nhằm tăng giá trị cho các sản phẩm từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền,

các phế liệu nông nghiệp và chất thải công nghiệp. Canh trƣờng bán rắn sau khi

ngừng nuôi cấy có thể đem nghiền nhỏ, sấy khô, đông khô đến độ ẩm 8 – 12% để sử

dụng nhƣ chế phẩm enzyme thô.

Lên men bán rắn là sự sinh trƣởng của vi sinh vật trên cơ chất ẩm. Ở đây, vi

sinh vật phát triển và bao phủ bề mặt môi trƣờng rắn, các nguồn dinh dƣỡng (cám

mì, bã mía…) đƣợc làm ẩm và dùng làm môi trƣờng. Vi sinh vật sử dụng chất dinh

dƣỡng trong môi trƣờng và oxy trong không khí để tạo hệ sợi nấm phát triển, sự

tổng hợp enzyme sẽ hoàn thành say khoảng 36 – 40 giờ, có khi lâu hơn tùy chủng.

Để tăng sự tổng hợp một số enzyme ngƣời ta thêm vào canh trƣờng một số

chất cảm ứng cần thiết. Ngoài ra, để cấu trúc đƣợc thoáng, ngƣời ta bổ sung thêm

trấu, mùn cƣa… Song, nếu thêm nhiều hơn 15 – 20%, chúng sẽ làm nghèo dinh

dƣỡng của môi trƣờng. Vậy cần bổ sung nguồn nitrogen vô cơ, phosphor…

1.6.1. Độ ẩm của môi trường nuôi cấy

Độ ẩm không những ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và trao đổi chất của vi

sinh vật mà còn ảnh hƣởng đáng kể đến đặc tính lý hóa của cơ chất. Độ ẩm trong

môi trƣờng lên men bán rắn đƣợc thể hiện qua hàm lƣợng nƣớc của cơ chất rắn, ảnh

hƣởng đến áp suất thẩm thấu do các chất tan trong cơ chất.

12

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Các cơ chất khác nhau có khả năng giữ nƣớc khác nhau. Do đó, quá trình lên

men bán rắn đƣợc thực hiện với hàm lƣợng nƣớc trong cơ chất khác nhau từ 30 –

80%.

Độ ẩm thích hợp để thu canh trƣờng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao là

53 – 70% tùy thuộc đặc điểm sinh lý của chủng giống, thành phần, cấu trúc cơ học

của môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy. Trong nuôi cấy bán rắn, độ ẩm quá cao cản

trở sự thoáng khí, làm giảm hoạt động sống của vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu cho

thấy, nấm mốc và xạ khuẩn đều phát triển tốt trong môi trƣờng xốp có độ ẩm từ 60

– 65%.

1.6.2. Sự thông khí

Vi sinh vật tổng hợp xylanase thƣờng hiếu khí, do đó độ thông khí của môi

trƣờng ảnh hƣởng lớn đến quá trình tổng hợp enzyme của chúng. Trong nuôi cấy

bán rắn, việc cung cấp oxy thƣờng rất thuận lợi, phụ thuộc độ xốp của cơ chất, độ

dày của môi trƣờng, nhiệt độ và độ thoáng khí của phòng nuôi cấy. Trong các yếu

tố trên, độ xốp của cơ chất và độ dày của lớp môi trƣờng là chủ yếu quan trọng hơn

cả.

1.6.3. Nguồn carbon

Nguồn carbon là thành phần dinh dƣỡng cơ bản đối với sự sinh trƣởng và

phát triển của vi sinh vật. Khi nuôi cấy bán rắn theo hƣớng tận dụng phế phụ liệu thì

nên lựa chọn cơ chất vừa là nguồn carbon vừa là cơ chất cảm ứng.

1.6.4. Nguồn nitrogen

Nguồn nitrogen cũng là một trong những nguồn dinh dƣỡng cơ bản, thiết yếu

đối với vi sinh vật và ảnh hƣởng rất rõ đến sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật.

Nitrogen vô cơ có thể ở dạng các muối nitrat và amonium. Đối với nấm sợi,

muối nitrat là nguồn nitrogen thích hợp để sinh tổng hợp enzyme. Muối này làm

kiềm hóa môi trƣờng, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành enzyme. Muối

amonium, khi đƣợc đồng hóa tạo nên các aniom vô cơ làm thấp pH của môi trƣờng.

Điều này không những ức chế vi sinh vật mà còn làm mất hoạt tính enzyme sau khi

tạo thành.

13

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Nguồn nitrogen hữu cơ có thể là các hợp chất hữu cơ phức tạp nhƣ dịch nấm

men, nƣớc chiết đậu nành…

1.6.5. pH

pH của môi trƣờng cũng có ảnh hƣởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng

sinh tổng hợp xylanase của vi sinh vật, đối với những loài vi sinh vật khác nhau có

sự ảnh hƣởng khác nhau. Sự sinh trƣởng của vi sinh vật có thể làm thay đổi đáng kể

pH trong cơ chất.

Sự thay đổi này phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động trao đổi chất của vi sinh

vật và khả năng đệm của cơ chất rắn. Tuy nhiên, pH rất khó kiểm soát trong môi

trƣờng lên men bán rắn. Ngƣỡng pH thích hợp cho các loại nấm mốc từ 3 – 8.

1.6.6. Các nguyên tố khoáng

Nhu cầu chất khoáng ở vi sinh vật là rất ít, nhƣng không thể thiếu. Nhu cầu

này không giống nhau đối với từng loài, từng giai đoạn phát triển của vi sinh vật.

theo nghiên cứu, Nguyễn Lân Dũng, 2007 nhận thấy nồng độ cần thiết về chất

khoáng đối với vi nấm thƣờng thay đổi trong phạm vi nhƣ ở bảng 1.3.

Nồng độ cần thiết (g/l) Chất khoáng

1 – 2 K2HPO4

1 – 2 KH2PO4

0,2 – 0,5 MgSO4.7H2O

0,02 – 0,1 MnSO4.4H2O

0,02 – 0,05 FeSO4.7H2O

0,01 – 0,02 Na2MoO4

0,02 – 0,1 ZnSO4.7H2O

< 0,06 CoCl2

0,02 – 0,1 CaCl2

0,01 – 0,05 CaSO4.5H2O

Bảng 1.3. Nồng độ chất khoáng cần thiết cho sinh trƣởng nấm mốc và xạ

khuẩn.

14

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

1.7. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch chế phẩm enzyme

Trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào chất của tế bào. Các phân tử

enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào. Do đó để có thể chiết rút

enzyme nội bào trƣớc hết cần phá vỡ cấu trúc của tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của

tế bào bằng biện pháp cơ học (nghiền với bột thủy tinh hoặc đồng hóa bằng các thiết

bị đồng hóa) bằng tác dụng của các dung môi hữu cơ (rƣợu butylic, aceton,

glycerin…) của sóng siêu âm.

Việc tách enzyme ra khỏi tế bào gặp nhiều khó khăn, do đó khi tách chúng

phải hết sức lƣu ý:

- Enzyme có trong tế bào vi sinh vật với lƣợng không lớn so với các thành

phần khác. Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là việc rất

khó khăn. Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi

chịu các tác động bên ngoài.

- Enzyme là protein mà protein enzyme luôn đi cùng với những loại

protein không phải enzyme nhƣng lại có tính chất lý hóa rất giống nhau.

Do đó việc tách protein enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc

nào cũng đạt đƣợc kết quả tốt và không phải gặp những khó khăn nhất

định.

- Đa số các ngành sản xuất thực phẩm cũng nhƣ công nghiệp nhẹ thì lại đòi

hỏi phải dùng enzyme sạch. Để tách chiết enzyme từ môi trƣờng rắn

ngƣời ta thƣờng dùng nƣớc, các dung môi trung tính và các dung dịch

đệm thích hơp. Trong đó, nƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi và cho kết quả tốt

nhất. Các enzyme đƣợc chuyển từ tế bào vào nƣớc do sự chênh lệch nồng

độ. Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzyme đƣợc cô đặc dƣới áp suất thấp

sao cho hàm lƣợng chất khô không nhỏ hơn 50 – 55%.

Theo phƣơng pháp khuếch tán bằng nƣớc, có thể chiết đƣợc lƣợng enzyme

trên 90 – 95% và trong dịch chiết không chứa các tạp chất không tan. Nƣớc thƣờng dùng để chiết có nhiệt độ 25 – 28oC. Dịch chiết thu đƣợc có màu nâu sẫm, khá

trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và đƣợc làm lạnh kịp thời xuống còn 10 –

15

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

12oC. Trong dịch chiết ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác,

để loại bỏ chúng cần thực hiện nhiều phƣơng pháp khác nhau.

Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lƣợng thấp ngƣời ta thƣờng dùng

biện pháp thẩm tích đối với nƣớc hay các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc

qua gel.

Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lƣợng cao khác, thƣờng

dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau. Phƣơng pháp biến tính chọn lọc nhờ các

tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trƣờng, phƣơng pháp kết tủa phân đoạn

bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phƣơng pháp sắc ký, điện di,

phƣơng pháp lọc gel.

1.8. Sợ lƣợc về sắc ký lọc gel

1.8.1. Bản chất của phương pháp

Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lƣợng phân

tử và phân tích tƣơng tác phân tử.

Một số thông số vật lý của phƣơng pháp

- Giới hạn tách (exclution limit): là trọng lƣợng phân tử (MW) của phân tử

nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel. Ví dụ: giới hạn tách của G –

50 có FR từ 1.500 – 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn đều

không chui vào hạt gel.

- Phạm vi tách (Fructionation range): ví dụ: sephadex G – 50 có FR từ

1.500 – 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW

nói trên sẽ đƣợc tách dễ dàng bởi G – 50.

- Độ ngậm nƣớc (water regain): là trong lƣợng nƣớc mà 1 gam bột gel khô

hút nƣớc. Ví dụ: G – 50 có WR là 0,5 ± 0,3g. Giá trị này chƣa tính đến

lƣợng nƣớc bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích

của cột.

- Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp

thu khi trƣơng nở trong nƣớc. G – 50 có thể tích nền 9 – 11ml/g gel khô.

16

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

- Hạt gel (gel particle): hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thƣớc hạt xác

định bằng mesh hoặc đƣờng kính hạt (bead diameter) tính theo µm. Hạt

có kích thƣớc lớn (50 – 100 mesh, 100 – 300 µm) cho tốc độ dòng chảy

qua cột cao, nhƣng kết quả tách thấp. Ngƣợc lại những hạt mịn (400

mesh, 10 – 40 µm) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không

tốt. Thƣờng ngƣời ta chọn hạt gel có kích thƣớc 100 – 200 mesh, 50 - 150

µm.

- Thể tích trống (void volume): là tổng thể tích không gian bao quanh hạt

gel trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000

Daltons.

- Thể tích thổi (elution volume): là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần

tách ra khỏi cột.

1.8.2. Đặc tính của gel

Có 4 loại gel thƣờng đƣợc sử dụng.

- Dextran có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia – LKB

(Thụy Điển) cung cấp với tên thƣơng mại là Sephadex. Giới hạn tách của gel

dextran là 600.000 Daltons, vì dextran tự nhiên chứa ít liên kết ngang nên khó giữ

nguyên vẹn hạt nếu kích thƣớc lỗ to hơn. Tuy nhiên nếu dextran đƣợc bổ sung thêm

các liên kết ngang bởi N,N’ – methylene bisacrylamide thì dextran có giới hạn tách

gia tăng.

- Gel polyacrylamide: tạo bởi quá trình đồng hóa polymer của acrylamide và

N,N’ – methylene bisacrylamide (Bio – Rad cung cấp – Biogel – P là tên thƣơng

mại).

- Gel agarose: là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ

galactose và anhydrogalactose. Mạng gel đƣợc ổn định nhờ liên kết hydro nhiều

hơn 1 do các liên kết ngang. Hãng Bio – Rad cung cấp agarose với tên thƣơng mại

là Bio – gel A, còn Pharmacia – cung cấp tên thƣơng mại là sepharose và seperose.

- Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thƣơng mại là ultragel, nó

cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng.

17

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Nguyên liệu

- Lúa

- Cám mì

- Bã mía

- Giống mốc Trichoderma

2.2. Hóa chất và thiết bị

- Thuốc thử Coomassie

- Thuốc thử DNS

- Thuốc thử lugol

- Dung dịch đệm Citrate

- Acetone, acetate pH5, NaCl

2.2.1. Hóa chất

2.2.2. Thiết bị

Tủ hút

Kính hiển vi

Máy đo quang phổ

Máy vortex

Microwave

Tủ ủ

Autoclave

Cân phân tích

Buồng đếm hồng cầu

Máy khuấy

Đo pH

Máy ly tâm

18

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase

từ nấm mốc Trichoderma spp.

2.3.1. Phương pháp mô tả hình thái Trichoderma

2.3.1.1. Quan sát đại thể

- Dùng que cấy móc vô trùng gạt nhẹ lên bào tử đính của sợi nấm,

chuyển sang đĩa petri chứ môi trƣờng PGA, cắm đầu móc xuống giữa

mặt thạch.

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 – 3 ngày.

- Quan sát hình dạng và màu sắc khuẩn lạc của sợi nấm ở mặt trên và

mặt dƣới của khuẩn lạc.

2.3.1.2. Quan sát vi thể

- Lót giấy thấm ở mặt đáy đĩa petri, đặt vào một miếng lame, gói giấy

và đem khử trùng.

- Nhỏ 3 giọt môi trƣờng PGA vào lame và chờ đông lại, cấy 1 điểm vào

giữa môi trƣờng PGA rồi đậy miếng lamen lên.

- Làm ẩm 4 góc giấy bằng nƣớc cất vô trùng.

- Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng.

- Sau 2, 3 ngày lấy miếng lame ra khỏi đĩa petri, nhỏ vài giọt cồn thấm

bằng giấy sau đó nhỏ tiếp NaOH 10% thấm khô.

- Quan sát kính hiển vi với độ phóng đại x40.

2.3.2. Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu

 Cách tiến hành

Cân 1g giống bào tử  ống nghiệm chứa 9ml nƣớc cất bổ sung Tween 80 0,1%  vortex  độ pha loãng 10-1  tiếp tục pha loãng cho đến 10-4  cho vào buồng đếm hồng cầu  quan sát X40 và đếm bào tử.

 Công thức tính số bào tử trong 1g cơ chất

19

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Trong đó :

- N: số lƣợng bào tử trong 1ml dịch huyền phù

- a: số lƣợng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con)

- b: số ô con trong 5 ô lớn (16 x 5 = 80) - 103: số chuyển mm3 thành ml (1000 mm3 = 1ml)

- n: độ pha loãng của mẫu

2.3.3. Phương pháp đo đường vành khuyên phân giải

 Nguyên tắc

Khi cho enzyme tác dụng với cơ chất trong môi trƣờng thạch, các hợp chất

này đƣợc phân giải thành các hợp chất đơn giản hơn. Có thể định tính và định lƣợng

sơ bộ hoạt tính xylanase dựa vào vòng phân giải xylan do các hợp chất không phản

ứng màu với thuốc thử.

 Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ

- Môi trƣờng định tính hoạt tính xylanase của dịch enzyme theo phƣơng pháp

cấy điểm: PGA bổ sung xylan.

- Thuốc thử glugol. - Đĩa petri hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, 15 phút.

 Cách tiến hành

Đổ đĩa môi trƣờng định tính hoạt tính xylanase  dùng que cấy điểm

Trichoderma vào giữa môi trƣờng  cho thuốc thử glugol vào sau khi khảo sát ở 8h

; 16h ; 24h ; 32h ; 40h ; 48h ; 56h ; 64h ; 72h  đo vòng phân giải.

20

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

2.3.4. Quy trình khảo sát một số yếu tố

Giống Trichoderma

Cấy chuyền (môi trƣờng thạch nghiêng PGA)

Cất giữ giống (môi trƣờng lúa)

Khảo sát sinh tổng hợp enzyme (môi trƣờng bán rắn)

Khảo sát tỷ lệ cơ chất Khảo sát độ ẩm môi trƣờng

Khảo sát pH

Khảo sát thời gian nuôi cấy

Khảo sát nồng độ dinh dƣỡng Khảo sát tỷ lệ giống

21

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

2.3.5. Thuyết minh quy trình

2.3.5.1. Giống mốc Trichoderma

Viện Sinh học Nhiệt Đới cung cấp đƣợc nuôi trong môi trƣờng PGA thạch

nghiêng ở nhiệt độ thƣờng trong thời gian là 36h, khi bào tử đƣợc hình thành

đem bảo quản ở nhiệt độ lạnh.

2.3.5.2. Cấy chuyền

 Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ

- Môi trƣờng PGA: khoai tây 200g, agar 20g, glucose 20g, nƣớc cất

1000ml, hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, 15 phút.

- Que cấy mốc, ống nghiệm.

 Cách tiến hành

- Cho môi trƣờng vào 1/3 ống nghiệm hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, 15

phút, lấy ra và để nghiêng sao cho thạch không bị dính lên trên nút

bông, chờ cho thạch đông lại.

- Dùng que cấy đã hấp khử trùng cấy ria trên bề mặt thạch

- Giống sau khi cấy nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.

2.3.5.3. Cất giữ giống

 Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ

- Môi trƣờng lúa bổ sung (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaCl2,

UREA, pepton, hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, 15 phút.

- Pipetman, đầu típ, đũa thủy tinh, que cấy vòng tất cả đều đƣợc thanh

trùng.

 Cách tiến hành

- Cho 1ml nƣớc cất vào trong ống giống, dùng que cấy mài nhẹ trên bề

mặt thạch để tách bào tử, cho chúng hoàn toàn nằm trong pha nƣớc

nhƣ các dịch huyền phù.

- Sau đó đổ toàn bộ nƣớc chứa bào tử vào trong môi trƣờng nhân giống

và trộn kỹ.

22

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

2.3.5.4. Khảo sát sinh tổng hợp enzyme xylanase từ Trichoderma spp.

 Chuẩn bị môi trƣờng và dụng cụ

- Môi trƣờng khoáng Czapeck: KNO3, KH2PO4, MgSO4, FeSO4, KCl

- Môi trƣờng bán rắn: 20g cám mì – bã mía bổ sung khoáng Czapeck.

- Thuốc thử Coomassie

- Thuốc thử DNS

- Pipetman, đầu típ, đũa thủy tinh, nƣớc tinh khiết, bình định mức 50ml,

tất cả đều đƣợc thanh trùng.

 Cách tiến hành

- Cho vào môi trƣờng lúa nhân giống 20ml nƣớc tinh khiết, dùng đũa

thủy tinh khuấy để bào tử hòa lẫn vào nƣớc.

- Dùng pipetman hút 2 ml cho vào môi trƣờng bán rắn.

- Sau khi cấy, nuôi ở nhiệt độ phòng ở 48h.

- Đo hàm lƣợng protein: sử dụng thuốc thử Coomassie và đo ở bƣớc

sóng 595 nm.

- Đo hoạt tính enzyme: sử dụng thuốc thử DNS, cơ chất xylan và đo ở

bƣớc sóng 540 nm.

Thí nghiệm 1: Khảo sát tỷ lệ cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

xylanase ở tỷ lệ cám mì – bã mía

4:6 6:4 5:5 3:7 7:3 Tỷ lệ

Thí nghiệm 2: Khảo sát độ ẩm môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme xylanase

Độ ẩm 45 50 55 60 65 70 (%)

Thí nghiệm 3: Khảo sát pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase

4,5 5 5,5 6 6,5 pH

23

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme xylanase

Thời 8h 16h 24h 32h 40h 48h 56h 64h 72h 80h gian

Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ dinh dƣỡng đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme xylanase

x1 x2 x3 x4 x5 Nồng độ

Thí nghiệm 6: Khảo sát tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

xylanase

Tỷ lệ 1.12×1011 2.24×1011 3.36×1011 4.48×1011 5.6×1011 giống

2.4. Bố trí thí nghiệm

Sau khi thu nhận kết quả khảo sát sinh tổng hợp enzyme xylanase ta tiến hành

thu chế phẩm enzyme nhằm phục vụ cho các thí nghiệm khảo sát enzyme về sau.

Mục đích của quá trình này nhằm khảo sát từng thông số kỹ thuật ảnh hƣởng

đến quá trình sinh tổng hợp enzyme xylanase và quá trình tách chiết, tinh sạch sơ bộ

enzyme.

2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase

Mục đích nhằm chọn tỷ lệ dung dịch đệm tối ƣu để tách chiết enzyme cho

các thí nghiệm sau. Chọn ra tỷ lệ dung môi tốt nhất để thu nhận dịch chiết enzyme

xylanase.

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi để tách chiết enzyme

 Chuẩn bị: Chế phẩm enzyme, các dung môi (nƣớc cất, đệm Citrate, đệm

Acetate, muối sinh lý NaCl).

24

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

 Cách tiến hành

Cân chế phẩm enzyme

Bổ sung dung môi (tỷ lệ chế phẩm : dung môi là 1:8)

Khuấy trong 30 phút

Lọc

Dịch chiết

Đo hàm lƣợng Protein và Hoạt tính enzyme

Thí nghiệm 2: Khảo sát các tỷ lệ của dung môi tốt nhất để tách chiết thu

nhận enzyme.

 Chuẩn bị: Chế phẩm enzyme, dung môi tốt nhất (kết quả của thí nghiệm 1).

25

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

 Cách tiến hành

Cân chế phẩm enzyme

Tỷ lệ 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10

Chế phẩm 3 3 3 3 3 3 3 3 enzyme (g)

Dung môi 9 12 15 18 21 24 27 30 (ml)

Khuấy trong 30 phút

Lọc

Dịch chiết

Đo hàm lƣợng protein và Hoạt tính enzyme

2.4.2. Khảo sát các tác nhân tủa enzyme xylanase

Mục đích khảo sát: Khảo sát các tỷ lệ các tác nhân với dịch chiết để chọn tỷ

lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất.

26

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Dịch chiết protein

(NH4)2SO4 Cồn 960 Acetone

3

50%

1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

55% 60% 65% 70%

3

1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

Xác định hoạt tính và hàm luợng

Chọn lấy tỷ lệ, nồng độ tốt nhất

Thí nghiệm 3. Khảo sát tủa bằng cồn 96o  Chuẩn bị: Dịch chiết protein, cồn 96o.

 Cách tiến hành:

Để tránh làm biến tính protein, cồn 960 phải đƣợc làm lạnh trƣớc khi tiến

hành tủa. Thể tích dịch chiết protein và thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Lắc đều hỗn hợp bảo quản lạnh ở 4oC trong 1 giờ. Sau đó ly tâm

10.000 vòng/phút trong thời gian là 5 phút. Thu tủa rồi đem đi xác định hoạt tính và

hàm lƣợng. Chọn tỷ lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất.

27

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Dịch chiết protein

3

1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng

Chọn lấy tỷ lệ tốt nhất

Thí nghiệm 4. Khảo sát tủa bằng muối (NH4)2SO4

 Chỉ tiêu khảo sát: Khảo sát các nồng độ muối (NH4)2SO4 với dịch chiết để

chọn nồng độ cho hoạt tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất.

 Vật liệu: Dịch chiết protein, dung dịch muối (NH4)2SO4 (50%, 55%, 60%,

65%, 70%).

 Cách tiến hành

Để tránh làm biến tính protein, dịch chiết protein thô đƣợc cho vào

ống ly tâm 5ml đặt trong chậu nhỏ chứa đá lạnh vụn xung quanh. Thể tích

dịch chiết protein và muối tƣơng ứng với các nồng độ 50%, 55%, 60%, 65%, 70%. Khuấy hỗn hợp bảo quản lạnh ở 40C trong 30 phút. Sau đó ly tâm

10.000 vòng/phút trong thời gian là 5 phút. Thu tủa rồi đem đi xác định hoạt

tính và hàm lƣợng. Chọn nồng độ cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất.

28

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Dịch chiết protein

3

50% 55% 60% 65 % 70%

Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng

Chọn lấy nồng độ tốt nhất.

Thí nghiệm 5. Khảo sát tủa bằng Acetone

 Chỉ tiêu khảo sát: Khảo sát các tỷ lệ cồn với dịch chiết để chọn tỷ lệ cho hoạt

tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất.

 Chuẩn bị: Dịch chiết protein, dung dịch Acetone.

 Cách tiến hành:

Để tránh làm biến tính protein, Acetone phải đƣợc làm lạnh trƣớc khi

tiến hành tủa. Thể tích dịch chiết protein và thể tích dung dịch Acetone

tƣơng ứng với các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6.

Lắc đều hỗn hợp bảo quản lạnh ở 40C trong 30 phút. Sau đó ly tâm

10.000 vòng/phút trong thời gian là 5 phút. Thu tủa rồi đem đi xác định hoạt

tính và hàm lƣợng. Chọn tỷ lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất.

29

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Dịch chiết protein

3

1:3 1:4 1:5 1:6 1:1 1:2

Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng

Chọn lấy tỷ lệ tốt nhất

Sau khi khảo sát các tác nhân tủa giữa dịch chiết với từng chất ta so sánh

xem tỷ lệ và nồng độ nào cho hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất thì chọn

2.4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme xylanase

Mục đích: Khảo sát nhiệt độ và pH cho hoạt tính enzyme tốt nhất.

Thí nghiệm 6. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính enzyme trong dịch

chiết

 Vật liệu: Dịch tủa enzyme, các dụng cụ - thiết bị để chạy sắc ký.

30

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

 Cách tiến hành

Dịch tủa protein

3

pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7

Xác định hoạt tính

Chọn lấy pH tốt nhất.

Sau khi khảo sát pH, ta có hoạt tính và hàm lƣợng protein ứng với từng pH.

Ta chọn pH cho kết quả hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất để thu nhận dịch tủa.

Thí nghiệm 7. Khảo sát ảnh hƣởng theo nhiệt độ

 Chuẩn bị: Dịch tủa enzyme.

 Cách tiến hành

Dịch tủa enzyme

3

40oC 50oC 60oC 70oC 30oC

Xác định hoạt tính

Chọn lấy nhiệt độ tốt nhất.

31

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Sau khi khảo sát nhiệt độ, ta có hoạt tính và hàm lƣợng protein ứng với từng

nhiệt độ. Ta chọn nhiệt độ cho kết quả hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất.

2.4.4. Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký lọc gel

- Chuẩn bị cột sắc ký: sử dụng cột sắc ký Bio – Rad.

- Tốc độ dòng chảy: 1 ml/phút.

- Cột 50 x 1.5 cm.

- Phân đoạn: 2 ml.

- Thể tích: 2 ml.

 Cách tiến hành

Bƣớc 1: Chuẩn bị gel

Cho 10 g bột gel Biogel P – 100 từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0.1 N,

pH 7 đựng trong cốc, không khuấy, để yên trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng cho quá

trình trƣơng nở xảy ra hoàn toàn tạo thể huyền phù đồng nhất của các hạt, sau khi

quá trình trƣơng nở xảy ra hoàn toàn gạn lớp nổi trên bề mặt bỏ đi, đổ thêm đệm

cho ngập phần gel và đuổi bọt khí bằng máy đuổi khí.

Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi

trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại

hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.

Bƣớc 2: Nhồi cột

Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm

đầy 20% thể tích cột. Rót đều, vừa rót vừa khuấy nhẹ để gel hấp phụ lắng từ từ theo

trọng trƣờng. Tránh không cho tạo thành bọt khí, phải rót liên tục. Dịch đệm thừa

cho chảy qua van dƣới cột. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở

khóa đầu ra của cột cho đến khi cột đƣợc nạp đầy gel. Khi cột đã đƣợc nạp đầy gel,

đặt một đĩa giấy lọc hoặc ít bông thủy tinh lên trên bề mặt nền cột để bảo vệ mặt cột

khi cho mẫu vào hoặc khi thay đổi dịch rửa trôi, khóa đầu ra của cột và gắn adaptor

vào.

32

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Cho chạy máy sắc ký để ổn định cột bằng đệm phosphate pH 7 với lƣợng

đệm chạy bằng 2 – 3 lần thể tích cột. Sau khi cột đã ổn định đóng đầu ra của cột và

điều chỉnh adaptor xuống sát lớp nền gel.

Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền gel qua adaptor.

Bƣớc 3: Nạp mẫu vào cột

Chuẩn bị mẫu: Mẫu chạy bằng sắc ký phải sạch, hòa tan mẫu trong NaOH

0.1 N. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0.45 micrometre) để làm gia tăng độ bền và

thời gian sử dụng cột.

Dùng xi lanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký.

Bƣớc 4: Thêm dung dịch đệm rửa

Sau khi mẫu thấm hết vào cột, bổ sung ngay vài ml dung dịch đệm rửa, để

cho mẫu còn đọng lại thấm hết vào nền cột. Mẫu và dung dịch đệm di chuyển qua

cột. Các phân tử di chuyển vào và ra ngoài lỗ hạt gel. Sau đó nối cột với bình chứa

dịch cột thổi.

Bƣớc 5: Thổi cột

Dịch thổi cột đƣợc giữ ổn định ở tốc độ thích hợp. Điều này rất quan trọng vì

tốc độ cột thổi cao cho kết quả tách mẫu thấp, ngƣợc lại nếu tốc độ thổi cột thấp kéo

dài thời gian tách mẫu, các peak bị loãng ra cho kết quả thấp. Thổi cột liên tục bằng

dung dịch đệm phosphate.

Bƣớc 6: Thu mẫu và xác định mẫu tách đƣợc

Dịch ra khỏi cột đƣợc đo hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm bằng detector trong hệ

thống sắc ký và đƣợc thể hiện độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP –

Data View trên máy tính. Dịch đƣợc thu tự động bằng máy thu mẫu (collector).

Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các

peak sẽ đƣợc phân tích hàm lƣợng protein sau sắc ký theo phƣơng pháp Bradford.

+ Hiệu suất tinh sạch protein

ượ

Xác định hiệu suất quá trình tinh sạch bằng hệ thống sắc ký lọc gel

ượ ư

Hiệu suất tinh sạch = x 100%.

+ Hiệu suất về hoạt tính enzyme:

33

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

ư

+ Hoạt tính riêng của enzyme:

Hiệu suất về hoạt tính enzyme =

+ Độ tinh sạch enzyme

HTR của enzyme =

Độ tinh sạch enzyme = ư

2.5. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu và xử lí kết quả

2.5.1. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

2.5.1.1. Phương pháp xác định độ ẩm

Trong đó:

- A: cơ chất nuôi cấy (g)

- B: độ ẩm muốn bổ sung vào môi trƣờng (%)

- C: độ ẩm trong cơ chất A (%)

- 100: độ ẩm 100%

- F: lƣợng nƣớc cần bổ sung vào môi trƣờng để đạt độ ẩm thích hợp

(ml)

2.5.1.2. Phương pháp Bradford xác định hàm lượng protein

 Nguyên tắc

Phƣơng pháp này dựa trên những bƣớc sóng hấp thụ cực đại của thuốc

nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang

tính acid, khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bƣớc sóng

595nm. Độ hấp thu trực tiếp có liên hệ trực tiếp với nồng độ protein.

 Chuẩn bị hóa chất

- Thuốc thử Bradford

34

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

- Albumin: cân chính xác 10mg albumin, thêm 50 – 60 ml nƣớc cất

khuấy tan albumin  cho vào bình định mức 100ml, dẫn nƣớc cho

đến vạch  dung dịch albumin chuẩn có nồng độ 0,1 mg/ml

 Cách tiến hành

Chuẩn bị 10 ống nghiệm đánh số 0  9, tiến hành thí nghiệm theo bảng sau:

Ống số 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Nồng độ

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 albumin

(µg/ml)

Albumin 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 (0,1mg/ml)

10 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Nƣớc cất

Thuốc thử

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Bradford

(ml)

Bảng 3.1. Bảng số liệu dựng đƣờng chuẩn Bradford

 Tính toán kết quả

Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn và mật độ quang của mẫu khảo sát ta suy ra

đƣợc nồng độ protein của mẫu là X (µg/ml) có trong mg nguyên liệu.

Vậy hàm lƣợng protein có trong 1g nguyên liệu là:

HL (mg/ml)

Trong đó:

- X (µg/ml): nồng độ protein trong mẫu khảo sát dựa vào phƣơng trình

đƣờng chuẩn

- n: hệ số pha loãng mẫu từ 1g chế phẩm protein thô ban đầu

2.5.1.3. Xây dựng đường chuẩn xylose

35

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

 Chuẩn bị dung dịch xylose nồng độ 10mM: hòa tan 150mg xylose trong đệm

Na-citrate 0,05M pH 5,3 chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch

đệm đến vạch. Dung dịch này tiếp tục đƣợc pha loãng với dung dịch đệm

Na-citrate 0,05M pH 5,3 theo bảng sau:

Độ pha loãng Xylose (µMol/ml) BXU

1:1 (0,15g/100ml) 10,0 33,3

1:2 (25ml/50ml) 5,0 16,7

1:3 (16ml/50ml) 3,2 10,7

1:5 (10ml/50ml) 2 6,7

Bảng 3.2. Tỷ lệ pha loãng dung dịch Xylose chuẩn

+ Hút vào mỗi ống nghiệm 1,8 ml dung dịch xylan 1%

+ Thêm 3 ml dung dịch DNS và 200 µl dung dịch xylose chuẩn.

+ Chuẩn bị ống đối chứng với 200 µl dung dịch đệm Na-citrate 0,05M pH 3,5 thay

cho dung dịch xylose chuẩn.

+ Đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 540 nm trên máy quang phổ.

 Tiến hành phản ứng

+ Hút 1,8 ml dung dịch cơ chất cho vào 3 ống nghiệm có dung tích 25ml (hai ống

nghiệm cho mỗi lần xác định) và một ống đối chứng.

+ Đặt vào bể ổn định nhiệt có nhiệt độ 50º trong 5phút.

+ Tại thời điểm 0, bắt đầu tính giờ, thêm 200µl dung dịch enzyme đã pha loãng vào

ống nghiệm thứ nhất, và trộn bằng máy vortex, tiếp tục thêm enzyme vào khoảng

trên mỗi ống nghiệm ngoài trừ ống đối chứng.

+ Sau 5 phút phản ứng, thêm 3 ml dung dịch DNS vào mỗi ống và lắc đều.

+ Thêm 3 ml thuốc thử DNS, sau đó thêm 200µl dung dịch enzyme vào ống đối

chứng.

+ Đun sôi cách thủy các ống nghiệm trong thời gian 5 phút, sau đó làm mát trong

nƣớc lạnh cho đến nhiệt độ phòng.

+ Đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 540 nm và tính theo đƣờng chuẩn xylose trên máy

quang phổ.

36

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

 Tính toán kết quả

Một đơn vị hoạt tính xylanase (BXU) là lƣợng enzyme thủy phân xylan sinh ra

lƣợng đƣờng khử tƣơng ứng với 1 nmol xylose trong 1 giây ở các điều kiện phản

ứng.

Một đơn vị hoạt tính xylanase (UI) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme thủy phân

xylan sinh ra đƣờng khử tƣơng ứng với 1µmol xylose trong 1 phút ở các điều kiện

phản ứng.

BXU ; 1UI = 1 µmol xylose/ml/phút

Nhƣ vậy 1 UI =

Trong đó:

HT (UI) =

- X: số µmol xylose suy ra từ đƣờng chuẩn

- K: hệ số pha loãng

- v: thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme

- t: thời gian phản ứng

2.5.2. Xử lý số liệu

Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel.

37

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Quan sát hình thái Trichoderma spp. trên môi trƣờng PGA

3.1.1. Quan sát đại thể

Mặt dư i khẩn lạc Mặt trên khuẩn lạc

Bào tử

Hình 3.1. Hình thái đại thể của Trichoderma spp.

Hình thái đại thể sau khi quan sát ở thời gian 24h thì tơ có dạng bông, khi

còn non khuẩn lạc có màu trắng, khi già thì khuẩn lạc có màu xanh lục, đây là màu

38

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

của bào tử đính. Trichoderma spp. này không tiết sắc tố màu vàng ra môi trƣờng

thạch.

3.1.2. Quan sát vi thể

Sau khi nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong

thời gian 24h thì khuẩn ty có vách ngăn,

cuống sinh bào tử có dạng phân nhánh

giống nhƣ cành cây.

Hình 3.2. Hình thái vi thể của Trichoderma spp. nuôi ủ ở 24h

Sau khi nuôi ủ trong thời gian là 36h thì

khuẩn lạc lên tơ già, mỗi nhánh mang

nhiều tế bào sinh ra bào tử đính, mang

bào tử đính riêng rẽ, bào tử đính dính

nhau thành cụm.

Hình 3.3. Hình thái vi thể của Trichoderma spp. nuôi ủ ở 36h

Sau 48h nuôi cấy, bào tử phát triển

mạnh, đính dính nhau thành nút thắt bào

tử.

Hình 3.4. Hình thái vi thể của Trichoderma spp. nuôi ủ ở 48h

39

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

3.2. Định tính enzyme xylanase của Trichoderma spp.

16h 11mm 32h 31mm

40h 34mm 48h 49mm

56h 58mm 64h 59mm

Hình 3.5. Kết quả vành phân giải xylanase của Trichoderma spp.

40

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Khi nuôi ủ ở thời gian 8h thì vi sinh vật chƣa phát triển nên chƣa thấy đƣợc

vòng phân giải enzyme.

Bắt đầu từ 16h đến 40h nấm mốc phát triển enzyme xylanase thủy phân cơ

chất xylan tạo vòng phân giải lớn dần (11mm đến 34mm). Thời điểm từ 48h đến

56h tơ non phát triển mạnh và đạt kích thƣớc 49mm.

Thời gian sau nuôi ủ 56h và 64h là giai đoạn nấm mốc phát triển tiếp tục bắt

đầu sinh bào tử.

Nhƣng ở thời gian nuôi cấy 56h và 64h thì nấm mốc sinh bào tử cho nên sinh

ra enzyme xylanase không tốt bằng thời gian 48h nấm mốc phát triển tơ non.

3.3. Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp.

Nhằm xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật có trong giống mốc Trichoderma

spp. sau khi nuôi cấy ở thời gian là 48h, ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

Kết quả số tế bào đếm đƣợc trong 1g mốc giống ở nồng độ pha loãng 10-4 là

4.48×1011.

Sau đó ta tiến hành cấy vào môi trƣờng lên men bán rắn.

3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp xylanase của

Trichoderma spp.

Thí nghiệm 1: Kết quả khảo sát tỷ lệ cơ chất đến sinh tổng hợp xylanase

Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein

và xác định hoạt tính xylanase. Ta có kết quả ở bảng 3.1 nhƣ sau:

41

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Bảng 3.1. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của Trichoderma

spp. với tỷ lệ cơ chất khác nhau

Thời gian HL HT Nồng độ Tỷ lệ nuôi cấy protein xylanase Độ ẩm dinh CM:BM (h) (mg/g) (IU/g) dƣỡng

21,87 78,96 6:4

25,33 94,16 7:3

50 x1 48 26,40 100,70 5:5

26,77 101,34 3:7

40

160

35

140

30

120

35,47 139,48 4:6

) g / g m

( n

25

100

Hàm lượng protein (mg/g)

20

80

15

60

Hoạt tính Xylanase (IU/g)

) g / U I ( e s a n a l y X h n

i e t o r p g n ợ ƣ

l

10

40

m à H

í t t ạ o H

5

20

0

0

6:4

7:3

5:5

3:7

4:6

Tỷ lệ cơ chất

Đồ thị 3.1. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi

trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. với tỷ lệ cơ chất khác nhau

Kết quả đồ thị cho thấy hoạt tính xylanase ở tỷ lệ 6:4 là 78,96 UI/g tăng dần

lên và đạt cao nhất ở môi trƣờng có tỷ lệ 4:6 là 139,48 UI/g. Hàm lƣợng protein ở

môi trƣờng 4:6 cao nhất là 35,47mg, và giảm dần xuống thấp nhất ở 6:4 là 21,87

mg.

42

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Kết quả này giải thích nhƣ sau: bã mía có khả năng giữ nƣớc cao và có cấu

trúc phức tạp hơn cám mì, khi pha chế môi trƣờng có tỷ lệ cám mì – bã mía khác

nhau cùng với một lƣợng nƣớc, thì môi trƣờng có tỷ lệ cám mì – bã mía là 6:4 có độ

ẩm và lƣợng bã mía thấp hơn các môi trƣờng khác. Còn môi trƣờng có tỷ lệ cám mì

– bã mía là 4:6 có độ ẩm và hàm lƣợng bã mía cao hơn nên có độ xốp và độ thoáng

khí cũng cao hơn, thích hợp hơn cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp xylanase của

Trichoderma. Nhƣng khi ở tỷ lệ 6:4 thì hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein

giảm xuống còn 78,96 UI/g và 21,87 mg do hàm lƣợng bã mía ít không tạo đƣợc độ

thông thoáng cho nấm mốc phát triển.

Dựa vào kết quả trên cho thấy môi trƣờng có tỷ lệ 4:6 là tốt nhất nhƣng còn

phụ thuộc vào các yếu tố khác nhƣ độ ẩm, pH… nên cần phải tiếp tục khảo sát.

Chúng tôi chọn tỷ lệ 4 cám mì : 6 bã mía là môi trƣờng nuôi cấy cho các thí nghiệm

tiếp theo.

Thí nghiệm 2. Kết quả khảo sát độ ẩm môi trƣờng đến sinh tổng hợp

xylanase

Độ ẩm vừa ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng vừa ảnh hƣởng đến sự trao đổi

chất của vi sinh vật trong quá trình lên men bán rắn. Trong thí nghiệm này chọn tỷ

lệ 4 cám mì : 6 bã mía để khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm. Thêm nƣớc cất vào môi

trƣờng bán rắn điều chỉnh độ ẩm 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%. Sau đó cấy dịch

huyền phù từ môi trƣờng nhân giống cấp 1 (môi trƣờng lúa).

Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein

và xác định hoạt tính xylanase. Ta có kết quả ở bảng 3.2 nhƣ sau:

43

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Bảng 3.2. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của Trichoderma

spp. có độ ẩm môi trƣờng khác nhau

Thời gian HL protein HT xylanase Tỷ lệ nuôi cấy Độ ẩm pH (mg/g) (IU/g) CM:BM (h)

45% 32,53 93,10

50% 34,13 99,22

55% 39,73 149,68 4:6 5 48 60% 38,67 119,07

65% 36,27 114,21

45

160

40

140

35

120

30

100

70% 34,40 108,09

) g / g m ( n

Hàm lượng protein (mg/g)

25

80

20

Hoạt tính Xylanase (IU/g)

60

15

) g / U I ( e s a n a l y X h n

i e t o r p g n ợ ƣ

40

l

10

20

5

í t t ạ o H

m à H

0

0

45% 50% 55% 60% 65% 70%

Độ ẩm

Đồ thị 3.2. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi

trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có độ ẩm khác nhau

Trong thí nghiệm này ta chọn tỷ lệ 4 cám mì : 6 bã mía để khảo sát độ ẩm.

Theo kết quả ở bảng 3.2 và đồ thị 3.2. Cho ta thấy hoạt tính xylanase và hàm lƣợng

protein tăng dần từ môi trƣờng có độ ẩm từ 45 – 55% và đạt cao nhất tại độ ẩm 55%

là 149,68 UI/g và 39,73 mg, sau đó giảm xuống khi độ ẩm đạt 60%.

44

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Điều này có thể do tăng độ ẩm thích hợp có tác dụng làm phồng cơ chất, tăng

độ xốp tạo điều kiện cho Trichoderma tiếp xúc với cơ chất dễ dàng hơn. Còn ở môi

trƣờng có độ ẩm càng thấp thì hoạt lực xylan và hàm lƣợng protein cũng thấp do cơ

chất bị khô làm bất lợi cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp xylanase của

Trichoderma spp. Đối với môi trƣờng có độ ẩm cao hơn 55% thì hoạt lực xylan và

hàm lƣợng protein cũng giảm. Có thể do môi trƣờng này quá ẩm, độ xốp giảm cản

trở sự khuếch tán oxy từ bên ngoài vào môi trƣờng.

Thí nghiệm 3. Kết quả khảo sát pH môi trƣờng đến sinh tổng hợp xylanase

Bảng 3.3. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi

cấy Trichoderma spp. có pH khác nhau

Thời gian Nồng độ HL protein HT xylanase Tỷ lệ nuôi cấy Độ ẩm dinh (mg/g) (IU/g) pH CM:BM (h) dƣỡng

29,33 110,20 4.5

32,80 135,75 5

4:6 55% x1 48 41,60 150,74 5.5

37,07 141,45 6

36,27 136,38 6.5

45

45

160

40

140

35

120

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

) g / g m

( n

30

100

Hàm lượng protein (mg/g)

25

80

20

Hoạt tính Xylanase (IU/g)

60

) g / U I ( e s a n a l y X h n

i e t o r p g n ợ ƣ

15

l

40

10

m à H

í t t ạ o H

20

5

0

0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

pH

Đồ thị 3.3. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi

trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có pH khác nhau

Theo kết quả bảng 3.3 và đồ thị 3.3 ta thấy hoạt tính xylanase và hàm lƣợng

protein ở môi trƣờng pH 4.5 là thấp nhất (110,20 UI/g và 29,33 mg/g), tăng dần pH

lên đến 5.5 hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein đạt cao nhất là 150,74 UI/g và

41,60 mg/g, ở pH 6.0 và 6.5 thì hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein giảm dần.

Hiện tƣợng này có thể do môi trƣờng quá kiềm hoặc quá acid, do đó ảnh

hƣởng đến sự ion hóa của cơ chất, độ bền bên trong cơ chất làm ảnh hƣởng đến sự

sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzyme của Trichoderma hoạt động trong môi trƣờng

pH thích hợp thì hoạt tính enzyme cũng tăng theo thời gian nuôi cấy.

Thí nghiệm 4. Kết quả khảo sát nồng độ dinh duỡng đến sinh tổng hợp

xylanase

Cơ chất mà tất cả chất dinh dƣỡng cho vi sinh vật là cơ chất lý tƣởng. Tuy

nhiên, nhiều cơ chất nghèo dinh dƣỡng, vì vậy cần phải bổ sung thêm các chất dinh

dƣỡng từ bên ngoài khi pha chế môi trƣờng có nồng độ dinh dƣỡng x1, x2,….,x5,

chỉnh độ ẩm đến 55% và pH 5,5 với tỷ lệ cám mì – bã mía là 4:6.

Sau khi nuôi cấy 48h, xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme

xylanase.

46

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Bảng 3.4. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi

cấy Trichoderma spp. có nồng độ dinh dƣỡng khác nhau

Thời gian Nồng độ HL protein HT xylanase Tỷ lệ nuôi cấy dinh pH Độ ẩm (mg/g) (IU/g) CM:BM (h) dƣỡng

x1 32,53 120,34

x2 34,40 128,57

x3 4:6 5.5 55% 48 35,47 135,75

x4 42,40 170,80

45

180

40

160

35

140

x5 39,47 149,47

) g / g m

30

120

( n

Hàm lượng protein (mg/g)

25

100

20

80

Hoạt tính Xylanase (IU/g)

) g / U I ( e s a n a l y X h n

15

60

i e t o r p g n ợ ƣ

l

10

40

m à H

í t t ạ o H

5

20

0

0

x1

x2

x3

x4

x5

Nồng độ dinh dƣỡng

Đồ thị 3.4. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi

trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có nồng độ dinh dƣỡng khác nhau

Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme xylanase và hàm lƣợng protein tăng dần

lên từ môi trƣờng có nồng độ dinh dƣỡng x1 đến x3, Ở nồng độ dinh dƣỡng x4

(170,80 IU/g và 42,40 mg) là cao nhất, sau đó giảm dần xuống môi trƣờng có nồng

độ dinh dƣỡng x5 hoạt tính enzyme xylanase và hàm lƣợng protein là 149,47 UI/g

và 39,47 mg/g.

47

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Thí nghiệm 5. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp

xylanase

Bảng 3.5. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi

cấy Trichoderma spp. có thời gian nuôi cấy khác nhau

Thời

HL protein HT xylanase gian Tỷ lệ Nồng độ nuôi cấy pH Độ ẩm (mg/g) (IU/g) CM:BM dinh dƣỡng (h)

30,93 156,65 8h

32,80 162,77 16h

34,13 170,54 24h

36,27 177,76 32h

36,80 180,51 40h 4:6 5.5 55% x4 44,93 199,72 48h

43,73 190,64 56h

42,13 185,58 64h

41,6 169,32 72h

39,73 160,87 80h

48

250

50

45

200

40

35

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

( n

150

30

) g / g m

Hàm lượng protein (mg/g)

25

Hoạt tính Xylanase (IU/g)

100

20

) g / U I ( e s a n a l y X h n

i e t o r p g n ợ ƣ

l

15

í t t ạ o H

m à H

50

10

5

0

0

8h 16h 24h 32h 40h 48h 56h 64h 72h 80h

Thời gian nuôi cấy

Đồ thị 3.5. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi

trƣờng nuôi cấy Trichoderma spp. có thời gian nuôi cấy khác nhau

Theo kết quả bảng 3.5 và đồ thị 3.5 ta thấy hoạt tính xylanase và hàm lƣợng

protein tăng rõ rệt từ 8 – 48h, đạt giá trị cao nhất tại 48h, sau đó bắt đầu giảm dần

xuống. Điều này có thể giải thích, sau 48h nuôi cấy Trichoderma spp. thì chúng

phát triển mạnh và cơ chất bị thủy phân gần hết sau 48h nên hoạt tính và hàm lƣợng

bắt đầu giảm xuống.

49

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Thí nghiệm 6. Kết quả khảo sát tỷ lệ giống đến sinh tổng hợp xylanase

Bảng 3.6. Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng nuôi

cấy Trichoderma spp. có tỷ lệ giống khác nhau

Tỷ lệ Nồng độ Thời HL HT giống Tỷ lệ Độ ẩm pH dinh gian nuôi protein xylanase (bào CM:BM dƣỡng cấy (h) (mg/g) (UI/g)

42,40 135,97

44,27 152,43

tử/g) 1.12x1011 2.24x1011 3.36x1011 4:6 5.5 55% x4 64 45,33 165,52

49,87 212,39

52

250

50

200

48

4.48x1011 5.60x1011 46,40 173,54

) g / g m

( n

150

46

Hàm lượng protein (mg/g)

44

100

Hoạt tính Xylanase (IU/g)

) g / U I ( e s a n a l y X h n

i e t o r p g n ợ ƣ

42

l

50

40

í t t ạ o H

m à H

38

0

Tỷ lệ giống

Đồ thị 3.6. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trƣờng

nuôi cấy Trichoderma spp. có tỷ lệ giống khác nhau

Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme và hàm lƣợng protein đạt cao nhất tại 4.48x1011 (212,39 UI/g và 49,87 mg/g). Kết quả mật độ bào tử phải là 4.48x1011 để

đảm bảo các tiểu phần cơ chất đƣợc bảo phủ bởi hệ sợi nấm nhằm hạn chế sự tạp

50

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

nhiễm. Nếu tỷ lệ giống quá cao dẫn đến sự cạnh tranh về dinh dƣỡng, oxy diễn ra

mạnh nên cơ chất bị phân hủy hết làm cho hoạt tính enzyme bị giảm xuống.

Từ các nghiệm thức khảo sát sinh tổng hợp enzyme chúng tôi chọn kết quả

tốt nhất để bố trí nghiệm tinh sạch protein enzyme.

3.5. Kết quả bố trí thí nghiệm

3.5.1. Khảo sát dung môi và tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase

Thí nghiệm 1. Khảo sát ảnh hƣởng của các dung môi dung môi để tách

chiết enzyme xylanase theo tỷ lệ 1:4 ta có kết quả sau

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát các dung môi để tách chiết enzyme xylanase

HL Protein HT enzyme HTR Dung môi (mg/g) (UI/g) (UI/mg)

58,8 176,77 3,068 H2O

Acetate 57,6 160,16 2,780

Citrate 65,8 173,58 2,638

80

70

NaCl 50,03 151,43 3,029

) g / g m

60

( n

50

Hàm lượng protein (mg/g)

40

30

Hoạt tính xylanase (UI/g)

) g / I U ( e s a n a l y x h n

i e t o r p g n ợ ƣ

l

20

í t t ạ o H

10

m à H

0

180 175 170 165 160 155 150 145 140 135

NaCl H2O CitrateAcetate

Dung môi

Đồ thị 3.7. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của các dung

môi tách chiết enzyme xylanase

51

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Chúng tôi nhận thấy trong quá trình tách chiết enzyme bằng các dung môi

cùng một tỉ lệ là 1:4 thì nƣớc cất thu đƣợc hoạt tính riêng cao nhất 3,006 (UI/mg).

Điều này đúng với lý thuyết, khi tách chiết enzyme bằng nƣớc thu đƣợc hàm lƣợng

protein enzyme chiếm vào khoảng 90% trở lên. Vậy dựa vào bảng kết quả chúng tôi

tiến hành tách chiết ezyme bằng nƣớc cất cho các thí nghiệm sau.

Thí nghiệm 2. Khảo sát tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase

Bảng 3.8. Kết quả tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase

HL protein HT enzyme HTR Tỷ lệ (mg/g) (UI/g) (UI/mg)

1:3 46,29 2,287 105,88

1:4 47,06 2,932 138,01

1:5 56,16 4,602 176,77

1:6 43,8 2,855 125,07

1:7 43,63 3,092 134,92

1:8 38,41 2,711 152,28

1:9 51,31 3,068 157,42

60

50

40

1:10 52,0 2,565 133,38

) g / g m ( n

Hàm lượng protein (mg/g)

30

Hoạt tính Xylanase (IU/g)

) g / U I ( e s a n a l y x h n

20

i e t o r p g n ợ ƣ

l

í t t ạ o H

10

m à H

0

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:09 1:10

Tỷ lệ dung môi

Đồ thị 3.8. Biểu diễn tỷ lệ nƣớc cất để tách chiết enzyme xylanase

52

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Sau khi khảo sát quá trình tách chiết enzyme bằng nƣớc cất qua các tỷ lệ

chúng tôi thấy hoạt tính riêng cao nhất là 4,602 (UI/mg) tƣơng ứng với tỉ lệ 1:5.

Quá trình chiết là quá trình khuếch tán chất tan (enzyme) trong canh trƣờng vào

nƣớc. Quá trình khuếch tán tuân theo định luật Flick: “Lƣợng chất khuếch tán tỉ lệ

thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất tan với gradient nồng độ

và thời gian khuếch tán”. Khi tỉ lệ canh trƣờng : nƣớc cất tăng, diện tích bề mặt tiếp

xúc giữa nƣớc và canh trƣờng tăng. Lƣợng nƣớc cất làm chênh lệch nồng độ chất

tan giữa bề mặt tiếp xúc với các lớp nƣớc bên ngoài.

Cả hai yếu tố trên làm cho lƣợng chất tan chiết đƣợc tăng khi tỷ lệ nƣớc cất

tăng. Tuy nhiên, khi lƣợng nƣớc cất đạt đến một giới hạn nào đó thì nồng độ

enzyme trong dịch chiết giảm nhanh, dẫn đến hoạt tính của enzyme cũng giảm

nhanh. Qua kết quả trên chúng tôi quyết định chọn chiết enzyme bằng nƣớc cất với

tỉ lệ 1:5.

3.5.2. Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme xylanase từ dịch chiết bằng phương

pháp kết tủa

Thí nghiệm 3. Tủa cồn 96o

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzyme xylanase

HL Protein HT enzyme HTR DC : Cồn (mg) (UI/g) (UI/mg)

40,33 189,4 4,69 1:1

42,33 166,6 3,94 1:2

44,66 178 3,99 1:3

44,50 197 4,43 1:4

52,50 317,4 6,05 1:5

52 313,6 6,03 1:6

53

350

60

300

50

250

40

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

) g / g m ( n

Hàm lượng protein (mg/g)

200

30

150

Hoạt tính Xylanase (IU/g)

20

) g / U I ( e s a n a l y x h n

i e t o r p g n ợ ƣ

100

l

10

50

m à H

í t t ạ o H

0

0

1:1

1:2

1:3

1:4

1:5

1:6

Tỷ lệ dịch E/Cồn

Đồ thị 3.9. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme xylanase từ các

phân đoạn tủa bằng cồn

Từ kết quả bảng 3.9 ta rút ra kết luận rằng tủa enzyme bằng cồn ở tỷ lệ 1:5 ta

sẽ thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao nhất 6,05 (UI/mg) nên chúng

tôi chọn tủa trong dung môi cồn ở tỉ lệ 1:5.

Khi thể tích dung môi tăng dần thì hoạt tính enzyme càng tăng, vì khi số

phân tử dung môi trong hỗn hợp tăng chúng sẽ tách triệt để hơn lớp phân tử nƣớc

bao xung quanh lớp phân tử protein, làm giảm tính tan của protein và làm tăng khả

năng kết tủa của chúng. Nếu ta tiếp tục tăng thể tích dung môi thì hằng số điện môi

giảm, các phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành không hoạt động, do đó

hoạt tính enzyme cũng giảm. Ngoài ra, càng về sau, khi enzyme bị tủa hết, nếu tiếp

tục tăng lƣợng dung môi thì sẽ có nhiều protein tạp khác bị tủa.

54

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Thí nghiệm 4: Acetone

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tỷ lệ acetone dùng để tủa enzyme xylanase

DC : HL Protein HT enzyme HTR

Acetone (mg/g) (UI/mg) (UI/g)

1:1 56,66 5,47 310

1:2 58,03 6,22 361,1

1:3 60,03 6,33 380,13

1:4 66,08 6,47 427,6

1:5 63,66 6,27 399,1

450

70

400

60

350

50

300

1:6 57,63 5,21 300,51

) g / g m ( n

Hàm lượng protein (mg/g)

40

250

200

30

Hoạt tính Xylanase (IU/g)

150

20

) g / U I ( e s a n a l y x h n

i e t o r p g n ợ ƣ

100

l

10

50

í t t ạ o H

m à H

0

0

1:1

1:2

1:3

1:4

1:5

1:6

Tỷ lệ dịch E/Acetone

Đồ thị 3.10. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme xylanase từ các

phân đoạn tủa bằng acetone

Từ kết quả bảng 3.10 ta rút ra kết luận rằng tủa enzyme bằng acetone ở tỷ lệ

1:4 ta sẽ thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao nhất 6,47 (UI/g) nên

chúng tôi chọn tủa trong dung môi muối ở tỷ lệ 1:4.

55

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Thí nghiệm 5. Muối

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tỷ lệ muối (NH4)2SO4 dùng để tủa enzyme

xylanase

Nồng độ HL Protein HT enzyme HTR

muối (%) (mg/g) (UI/mg) (UI/g)

50 57,60 4,88 281,5

55 61,72 4,68 289

60 63,67 5,47 348,5

65 67,44 7,618 513,8

600

70

68

500

66

70 58,26 5,45 317,4

) g / g m

400

64

( n

Hàm lượng protein (mg/g)

62

300

60

Hoạt tính Xylanase (IU/g)

) g / U I ( e s a n a l y x h n

200

58

i e t o r p g n ợ ƣ

l

56

100

í t t ạ o H

m à H

54

0

52

50

55

60

65

70

Nồng độ muối

Đồ thị 3.11. Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính enxyme xylanase từ các

phân đoạn tủa bằng muối

Từ kết quả bảng 3.11 ta rút ra kết luận rằng nếu có tủa enzyme bằng muối ở nồng độ 65o ta sẽ thu đƣợc chế phẩm enzyme có hoạt tính riêng cao nhất 7,618 (UI/mg) nên chúng tôi chọn tủa trong dung dịch muối ở nồng độ 65o.

56

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Bảng 3.12. So sánh kết quả tủa enzyme xylanase

Tác nhân HT enzyme HL protein cao HLR cao nhất

tủa cao nhất (UI/g) nhất (mg) (UI/mg)

Cồn 317,4 52,50 6,05

Acetone 427,6 66,08 6,47

8

7

6

Muối 513,8 67,44 7,618

) g / I U

5

4

HT enzyme

( e m y z n e h n

3

2

í t t ạ o H

1

0

Acetone

Cồn

Muối

Tác nhân tủa

Đồ thị 3.12. Kết quả tủa enzyme xylanase từ các tác nhân tủa

Sau khi tiến hành tủa enzyme với 3 dung môi khác nhau cho đƣợc kết quả sử

dụng dung dịch muối (NH4)2SO4 bão hòa thu đƣợc enzyme có hoạt tính cao nhất

nên chúng tôi quyết định chọn muối là tác nhân tủa cho các thí nghiệm tiếp theo.

57

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

3.5.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chế phẩm enzyme xylanase

Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến chế phẩm enzyme

xylanase

Bảng 3.13. Kết quả ảnh hƣởng của pH đến chế phẩm enzyme xylanase

Hoạt tính enzyme pH (UI/g)

3 208,13

4 308,03

5 238,09

6 117,54

350

300

250

7 134,87

) g / I U

200

150

HT enzyme

( e m y z n e h n

100

í t t ạ o H

50

0

pH 3

pH 4

pH 6

pH 7

pH 5 pH

Đồ thị 3.13. Biểu diễn hoạt tính xylanase theo pH của chế phẩm enzyme

xylanase

Enzyme rất nhạy với pH của môi trƣờng. pH của môi trƣờng thƣờng ảnh

hƣởng đến mức độ ion hóa cơ chất enzyme và đặc biệt ảnh hƣởng đến độ bền

enzyme. Chính vì thế, pH có ảnh hƣởng rất mạnh đến phản ứng enzyme. Mỗi

enzyme thích hợp với một vùng pH nhất định, qua thí nghiệm chúng tôi nhận thấy

58

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

rằng hoạt tính của enzyme xylanase ở pH 3 là 208,13 UI/g, tăng dần lên và cao nhất

là 308,03 UI/g khi ở pH 4. Càng tăng độ pH lên pH 5, 6, 7 thì hàm lƣợng enzyme

càng giảm dần xuống còn 117,54 UI/g. Từ bảng 3.13 và đồ thị 3.12 chúng tôi kết

luận pH tối ƣu cho hoạt động của chế phẩm enzyme là 4.

Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến chế phẩm enzyme

xylanase

Bảng 3.14. Kết quả ảnh hƣởng của nhiệt độ đến chế phẩm enzyme xylanase

Hoạt tính enzyme Nhiệt độ (UI/g)

30 158,18

40 377,4

50 421,3

60 407,93

450

400

350

70 374,63

) g / I U

300

250

200

( e m y z n e h n

HT enzyme

150

100

í t t ạ o H

50

0

30o

40o

60o

70o

50o Nhiệt độ

Đồ thị 3.14. Biểu diễn hoạt tính xylanase theo nhiệt độ của chế phẩm

enzyme xylanase

59

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Nhiệt độ là một yếu tố vật lý có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng enzyme,

chúng liên quan đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất, nâng cao ái lực giữa

enzyme và cơ chất. Nhiệt độ enzyme không cố định mà có thể thay đổi tùy theo cơ

chất, tốc độ phản ứng không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng.

Thông thƣờng khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng tăng nhƣng với một

ngƣỡng tới hạn, vƣợt quá ngƣỡng đó tốc độ phản ứng của enzyme sẽ giảm. Từ các kết quả trên cho thấy rằng ở nhiệt độ 30oC hoạt tính enzyme thấp (158,18 UI/g) khi tăng nhiệt độ lên 50oC thì hoạt tính enzyme tăng cao nhất (421,3 UI/g) và khi càng tăng nhiệt độ lên 60oC và 70oC thì hoạt tính enzyme có xu hƣớng giảm từ từ còn

407,93 và 374,63. Từ kết quả trên chúng tôi kết luận nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của chế phẩm là 50oC.

3.6. Tinh sạch enzyme xyalanse bằng phƣơng pháp chạy sắc ký lọc gel

Sau khi tiến hành chiết xuất enzyme bằng các dung môi nhƣ nƣớc cất, đệm

acetate pH5, NaCl và tủa enzyme bằng các tác nhân nhƣ cồn, muối, acetone, ta thu

đƣợc kết quả là chiết xuất enzyme bằng nƣớc cất và tủa enzyme bằng muối sẽ cho

hoạt tính enzyme cao nhất nên ta chọn các tác nhân đó để thu enzyme và tủa ở tỷ lệ

độ hòa tan muối là 65%. Quá trình tinh sạch đƣợc thực hiện trên gel Biogel P-100

của hàng Bio – Rad, Mỹ.

Sau khi ly trích enzyme bằng muối (NH4)2SO4 ta thu đƣợc dịch chiết

enzyme, tiến hành chạy sắc ký để tinh sạch sản phẩm. Trƣớc khi chạy sắc ký ta tiến

hành loại muối bằng màng thẩm tích. Màng này chỉ cho muối (NH4)2SO4 đi qua còn

protein đƣợc giữ lại, ta thu mẫu và tiến hành chạy sắc ký.

Sau khi chạy sắc ký ta thu đƣợc 2 peak. Sau đó tiến hành xác định hoạt tính

xylanase và hàm lƣợng protein của 2 peak.

60

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

0

10

20

30

40

50

60

-0.1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Đồ thị 3.15. Sắc ký đồ trên excel khi chạy sắc ký enzyme xylanase

Bảng 3.15. Hiệu suất tinh sạch

Σ HT Σ HL Hoạt tính riêng Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất (%)

544,0 340 1,6 1 100 Nghiệm thức Trƣớc sắc ký

371,5 13,9 26,7 16,7 68,3 Sau sắc ký

Ta thấy rằng enzyme sau tinh sạch có hoạt tính và hàm lƣợng protein thấp

hơn so với tổng hoạt tính enzyme và hàm lƣợng protein trƣớc tinh sạch. Điều này

xảy ra là do các thao tác, tủa, ly tâm…trong quá trình tinh sạch đó làm thất thoát

enzyme. Tuy nhiên hoạt tính riêng lại cao hơn nhiêu lần, hiệu suất tinh sạch khá

cao.

61

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Giá trị Hàm lƣợng Hoạt tính xylanase Các yếu tố tối ƣu Protein (mg/g) (UI/g)

4:6 35,47 139,48 Tỉ lệ CM:BM

55% 39,73 149,68 Độ ẩm (%)

5.5 41,60 150,74 pH

x4 42,40 170,80 Nổng độ dinh dƣỡng

46,93 199,72 Thời gian nuôi cấy

49,87 48h 4.48x1011 212,39 Tỷ lệ giống

Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ sử dụng các dung môi để tách chiết enzyme

xylanase cho chúng tôi kết quả là khi sử dụng nƣớc cất để tách chiết enzyme thì sẽ

cho hoạt tính enzyme (176,77 UI/g) và hàm lƣợng protein (68,8 mg/g) với tỷ lệ tách

1:5 là cao nhất.

Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme xylanase từ dịch chiết thô bằng phƣơng

pháp tủa cho chúng tôi kết quả khi dùng tác nhân tủa là muối ammonisulfate sẽ cho

hoạt tính enzyme (513,8 UI/g) và hàm lƣợng protein (67,44 mg/g) với nồng độ là

65% là cao nhất.

Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến chế phẩm enzyme xylanase cho chúng tôi

kết quả là với pH 4 sẽ cho hoạt tính enzyme (308,03 UI/g) là cao nhất.

Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm enzyme xylanase

cho chúng tôi kết quả là với nhiệt độ phản ứng giữa enzyme và cơ chất ứng với 50oC sẽ cho hoạt tính enzyme (421,3 UI/g) là cao nhất.

Hiệu suất và độ tinh sạch của enzyme xylanase sau khi tiến hành chạy sắc ký

lọc gel là:

Hoạt tính riêng Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất (%)

26,7 16,7 68,3

62

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

4.2. Đề nghị

- Thực hiện phƣơng pháp tối ƣu hóa môi trƣờng thực nghiệm

- Tiếp tục thực hiện phƣơng pháp sắc ký lọc gel với enzyme xylanase đƣợc tủa bằng

cồn và acetone.

- Thực hiện phƣơng pháp chạy điện di trên gel SDS để xác định trọng lƣợng phân tử

của protein.

63

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

[1]. Phạm Thị Trân Châu. PGS. TS. Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học,

tập 3 Enzyme và ứng dụng, Nxb Giáo dục.

[2]. Nguyễn Lân Dũng và các tác giả (1979), Một số phương pháp nghiên cứu vi

sinh vật, tập 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

[3]. Nguyễn Đức Lƣợng (2000), Công nghệ vi sinh vật tập 1 – Cơ sở vi sinh vật học

công nghiệp, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh.

[4]. Nguyễn Thị Uyên Thảo (2007), Nghiên cứu tạo chế phẩm xylanase từ vi nấm

Trichoderma, Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, trƣờng Đại Học Khoa học tự

nhiên TP.HCM.

[5]. Lê Ngọc Tú và cộng sự (1982), Enzyme và vi sinh vật, tập 2, Nxb Khoa Học và

Kỹ thuật, Hà Nội, trang 124 – 185.

[6]. Nguyễn Đức Lƣợng, Công nghệ enzyme và protein, NXB Đại học Quốc Gia

TP.HCM, 2004.

[7]. Lê Tú Ngọc và các tác giả, Hóa sinh công nghiệp, NXB KH & KT Hà Nội.

[8]. Nguyễn Thị Thu Thảo, Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ Trichoderma

spp. tạo chế phẩm bóc vỏ tiêu đen sản xuất tiêu tr ng, Luận văn Thạc sỹ khoa học

sinh học. Trƣờng Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM.

[9]. Trần Linh Thƣớc, Tài liệu thực tập chuyên đề cao học chuyên ngành vi sinh

hóa X, XI, trƣờng Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM.

Tài liệu Tiếng Anh

[11]. Bastawde K. B. (1998), “Xylanase structure, microbial xylanase, and their

mode of action”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 8, pp 353 –

368.

[12]. Collins T, Charles Gerday., Georges Feller (2004), “Xylanase, Xylanase

families and extremophilic xylanase”, Periodical 29, p3 – 23.

64

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

[13]. Esposito E., Silva M. D., (1998), “Systematics and environmental application

of the genus Trichoderma”. Crical reviews in Microbiology, 24 (2), pp 89 – 98.

[14]. Ridder E. R., Nokes S. E., Knutson B. L., (1999), “Optimization of solid –

state fermentation parametersfor the production of xylanase bt Trichoderma

longibrachiatum on wheat bran in a forced aeration system”, Transactions of The

ASABE. Vol. 42(6): 1785 – 1790, Published by the American Society of

Agricultural and Biological Engineers, St. Joseph, Michigan.

[15]. Shallom D, Shoham Y. (2003), “Microbial hemicellulase”, Current Opinion

Microbiol., 6 (3), pp. 219 – 228.

Tài liệu Internet

[16]. http://www.biopract.de/html/prod_e_enzyme2.htm

[17]. www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC

[18]. http://www.vusta.vn/Temps/Home/template2/?nid=7345

[19]. http://www.enzymes.co.uk/answer24.pectinase.htm

[20]. http://www.doctorfungus.org/thefungi/trichoderma.htm

[21].http://vinhphucdost.gov.vn/index.php?mode=14&id=26337&strContent=29&st

rShow=410

65

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

PHỤ LỤC A

Phụ lục A1: Đƣờng chuẩn Bardford

BRADFORD

y = 0.0034x + 0.0067 R² = 0.9974

0.25

0.2

0.15

D O

0.1

0.05

0

10

20

50

60

70

0

30 40 NỒNG ĐỘ

Phụ lục A2: Đƣờng chuẩn xylose

1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

PHỤ LỤC B

Hình B1: Nấm mốc hình thành bào tử trên môi trƣờng lúa

Hình B2. Nấm mốc trên môi trƣờng cám mì : bã mía

2

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Hình B3. Chế phẩm enzyme thô

Hình B4. Nấm mốc trên môi trƣờng thạch nghiêng

3

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

PHỤ LỤC C

Hình C1. Máy khuấy

Hình C2. Cân phân tích Hình C3. Kính hiển vi

4

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Hình C4. Máy Vortex Hình C5. Tủ hút

Hình C6. Microwave Hình C7. Máy đo quang phổ

Hình C8. Tủ ủ

5

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2013

Hình C9. Autoclave

6