Thành phần hóa học cao chloroform rễ cây hà thủ ô trắng Streptocaulon juventas: Khóa luận tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC

  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GÓP PHẦN TÌM HIỂU THÀNH PHẦN

HÓA HỌC CAO CHLOROFORM

RỄ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG

Streptocaulon juventas

TRẦN THỊ TÚ QUYÊN

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC

  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GÓP PHẦN TÌM HIỂU THÀNH PHẦN

HÓA HỌC CAO CHLOROFORM

RỄ CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG

Streptocaulon juventas

Giảng viên hướng dẫn: TS. Bùi Xuân Hào

Sinh viên thực hiện: Trần Thị Tú Quyên

Mã số sinh viên:

K40.201.069

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2018

NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN

...............................................................................................................................

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày … tháng… năm 2018

Giảng viên phản biện

Khóa luận tốt nghiệp

Trần Thị Tú Quyên

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên, khoa Hóa

học, trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh.

Em xin chân thành cảm ơn Thầy Bùi Xuân Hào đã luôn nhiệt tình trong việc truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cũng như luôn theo sát quá trình làm việc của em để kịp thời hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em được hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Bên cạnh những bài học thực nghiệm, Thầy còn truyền cho em tinh thần nghiên cứu khoa học giúp em có được động lực trong việc nghiên cứu và học tập.

Em xin cảm ơn quý Thầy Cô trong phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên nói riêng cũng như quý Thầy Cô khoa Hóa học – trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tâm trong công tác giảng dạy, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học hữu ích trong suốt thời gian em học tập tại trường.

Em cũng xin dành một lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình là điểm tựa vững chắc và là nguồn động viên cho em trong suốt quá trình học tập của mình. Thành công của em ngày hôm nay không thể có được nếu không có sự yêu thương và chăm sóc của ba mẹ và người thân trong gia đình.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Nguyễn Hữu Toàn, Phạm Bảo Quý, Đào Thị Bích Ngọc, Trần Thanh Nhã, chị Trần Thị Thu Sương, các anh chị học viên cao học trong phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên và các bạn sinh viên K40 khác trong phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ Trường đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã luôn giúp đỡ, động viên và hỗ trợ về kiến thức cũng như những kinh nghiệm thực nghiệm cho em trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Xin gửi những lời chúc tốt đẹp nhất đến các bạn, các anh chị và mong mọi người mãi thành công trên con đường tương lai sau này.

Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!

Khóa luận tốt nghiệp

Trần Thị Tú Quyên

MỤC LỤC

MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 2

1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT ...................................................................................... 2

1.1.1. Mô tả chung .................................................................................................... 2

1.1.2. Vùng phân bố .................................................................................................. 2

1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH ............................................................... 2

1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền ...................................................................... 2

1.2.2. Nghiên cứu về dược tính ................................................................................. 2

1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ........................................ 2

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.................................................................................. 10

2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP........................................................ 10

2.1.1. Hoá chất ........................................................................................................ 10

2.1.2. Thiết bị .......................................................................................................... 10

2.1.3. Phương pháp tiến hành ................................................................................. 10

2.2. NGUYÊN LIỆU .................................................................................................. 10

2.2.1. Thu hái nguyên liệu ...................................................................................... 10

2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu ................................................................................. 11

2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO ............................................................................. 11

2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO CHLOROFORM ........... 12

2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform ...................................................... 12

2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C của bảng 2.1 ..................................... 12

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 15

3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT Q2 ......................................................... 15

3.2. KHẢO SÁT HỢP CHẤT Q1 .............................................................................. 19

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................. 20

4.1. KẾT LUẬN ......................................................................................................... 20

4.2. ĐỀ XUẤT ........................................................................................................... 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 21

Khóa luận tốt nghiệp

Trần Thị Tú Quyên

MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng Anh Tiếng Việt Ký hiệu, chữ viết tắt

1H-NMR

13C-NMR

Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance

HSQC Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance Heteronuclear Single Quantum Correlation

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của proton (1) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của carbon (13) Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Mũi đơn Mũi đôi Mũi ba Mũi đôi đôi Mũi ba đôi Mũi đa Độ chuyển dịch hoá học Hằng số ghép spin Một phần một triệu Tia cực tím

Singlet Doublet Triplet Double of doublet Triplet of doublet Multiplet Chemical shift Coupling constant Part per million Ultra Violet Retention factor Ethyl Acetate Chloroform Methanol n-Hexane Acetic acid Acetone

Etyl acetat Cloroform Metanol Hexan Axit axetic Aceton Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng

Mét Xăng – ti- mét Mi-li-mét

s d t dd td m  J ppm UV Rf EA C Me H AcOH Ac SKC SKLM g mg MHz Hz m cm mm Gam Miligam Mega Hertz Hertz Meter Centimeter Milimeter

Khóa luận tốt nghiệp

Trần Thị Tú Quyên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform ...........................................................

Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C ...............................................................

Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C.3 ............................................................

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất Q2 ............................................................................

Khóa luận tốt nghiệp

Trần Thị Tú Quyên

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế cao chloroform từ rễ cây hà thủ ô trắng ............................

Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập hợp chất ............................................................................. 13

Khóa luận tốt nghiệp

Trần Thị Tú Quyên

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây và củ hà thủ ô trắng ....................................................................................

Hình 3.1. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất Q2 ....................................

Trần Thị Tú Quyên

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR (CDCl3) của hợp chất Q2...........................................................

Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR (CDCl3) của hợp chất Q2 .........................................................

Phụ lục 3. Phổ HSQC (CDCl3)họp chất Q2 ......................................................................

Phụ lục 4. Phổ HMBC (CDCl3)hợp chất Q2 .....................................................................

Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR (CDCl3)của hợp chất Q1 ............................................................

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

LỜI MỞ ĐẦU

Cây hà thủ ô trắng có tên khoa học Streptocaulon juventas (Lour) Merr., thuộc họ

thiên lý Asclepiadaceae. Cây hà thủ ô trắng có công dụng làm cho người già trẻ lại, giúp

cho sự giao hợp được bền lâu, tóc bạc hóa đen, đau lưng, nhức mỏi. Trong kháng chiến

tại các vùng dân tộc, người ta dùng củ và thân lá cây này chữa cảm sốt, cảm nắng, sốt

rét. Ngoài ra, có nơi người ta sắc cây này với nước cho phụ nữ đẻ mà không có sữa uống

để ra sữa [1]. Bên cạnh việc được sử dụng trong các bài thuốc y học cổ truyền, các hợp

chất được cô lập từ cây hà thủ ô đã được chứng minh có tác dụng ức chế mạnh với một

số tế bào ung thư như A549, HT-1080, Hela,…

Việc nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các chất

có trong cây hà thủ ô trắng đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển y học. Kết

quả thu được từ các nghiên cứu mở ra hướng phát triển mới trong việc tổng hợp các hợp

chất có những hoạt tính quý, có tác dụng chữa bệnh. Hơn nữa, nghiên cứu về thành phần

hóa học từ các loại thảo mộc còn góp phần củng cố bằng chứng khoa học cho nền y học

cổ truyền.

Nhằm đóng góp một phần hiểu biết thêm về thành phần hóa học của cây thuốc dân

gian này, chúng tôi thực hiện đề tài “Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học cao

chloroform rễ cây hà thủ ô trắng”. Hi vọng với đề tài này có thể đóng góp một phần nhỏ

những chứng cứ khoa học có giá trị vào kho dược liệu của Y học dân tộc Việt Nam.

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

Cây hà thủ ô trắng còn có tên là hà thủ ô nam, bạch hà thủ ô, củ vú bò, dây sữa bò,

dây mốc, cây sừng bò cây đa lông, khâu cần cà (Thổ), khâu nước (Lạng Sơn), mã liên

an, mã lìn ón, khua mak tang ning (Lào), khua khao (Luang Prabang), chừa ma sìn

(Thái). [1]

Tên khoa học: Streptocaulon juventas (Lour) Merr.

Thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae).

Hình 1.1. Cây và củ hà thủ ô trắng

1.1.1. Mô tả chung

Hà thủ ô trắng là một loại dây leo dài từ 2 đến 5m. Thân và cành màu hơi đỏ hay

nâu đỏ, có rất nhiều lông, khi già thì nhẵn dần. Lá mọc đối, hình mác dài, đầu nhọn, đáy

tròn hoặc hơi hình nón cụt, có lông mịn và nhiều ở mặt dưới, mặt trên cũng có lông ngắn

hơn. Phiến lá dài 4-14 cm, rộng 2-9 cm, cuống lá dài 5-8 cm cũng có nhiều lông. Hoa

màu nâu nhạt hoặc vàng tía mọc thành xim, rất nhiều lông. Quả đại tách đôi ngang ra

trông như sừng bò. Quả hình thoi, màu xám nhiều lông, dài 7-11 cm, rộng 8 mm. Hạt

dẹt, phồng ở lưng, dài 5-7 mm, rộng 2 mm, có chùm lông mịn dài 2 cm.

Toàn cây bấm thân, lá, quả non chỗ nào cũng ra thứ nhựa trắng như sữa.

Rễ củ dài mẫm và trắng, giữa có lõi trông như củ sắn nhưng có vị đắng.[1]

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

1.1.2. Vùng phân bố

Cây hà thủ ô trắng mọc hoang ở khắp những đồi núi trọc ở nước ta. Thường ưa

những nơi đất đồi cứng vùng Vĩnh Phúc, Hà Tây, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng,

Lạng Sơn.[1]

Ngoài ra, cây còn mọc ở Trung Quốc, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào,

Myanmar, Thái Lan.

1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH

1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền

Cây hà thủ ô trắng làm cho người già trẻ lại, giúp cho sự giao hợp được bền lâu,

tóc bạc hóa đen. Người ta dùng củ và thân lá cây chữa cảm sốt, cảm nắng, sốt rét.[1]

Dịch trích nước rễ cây hà thủ ô trắng dùng giải độc, chữa cảm sốt, trị vết sưng đau,

vết thương do rắn cắn, làm thuốc bổ cho các bệnh khác như thấp khớp, suy nhược thần

kinh, và chứng khó tiêu.

1.2.2. Nghiên cứu về dược tính

Năm 2002, có nghiên cứu dùng cao chiết cồn đậm đặc của rễ củ hà thủ ô trắng tăng

cholesterol ngoại sinh trên chuột. [2]

Sau đó, nghiên cứu trong dịch chiết rễ cây hà thủ ô trắng có ức chế mạnh đối với

các dòng tế bào ung thư là ung thư cổ tử cung Hela ở người, tế bào ung thư phổi người

A549, tế bào ung thư đại tràng chuột 26-L5, tế bào ung thư phổi chuột LLC, các dòng

tế bào ung thư ác tính chuột B16-BL6 [6], tế bào ung thư phổi lớn tế bào NCl-H460,

nguyên bào phổi của thai nhi tế bào MRC-5 [11], cùng các tế bào khối u khác như: PC3,

SMMC7721, CNE [13].

Ngoài ra, trong dịch chiết của cây hà thủ ô trắng có thể ức chế sự phát triển của tế

bào ung thư bạch cầu HL-60 ở người đáng kể.[14]

1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Năm 2003, Jun-ya Ueda và cộng sự đã phát hiện ra hai mươi mốt hợp chất:

acovenosigenin A digitoxoside (1), digitoxigenin gentiobioside (2), digitoxigenin 3-O-

[O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)-3-O-acetyl-β-D-

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

digitoxopyranoside] (3), digitoxigenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-

glucopyranosyl-(1 → 4)–O-β-D-digitalopyranosyl-(1 → 4)–β-D-cymaropyranoside] (4),

periplogenin 3-O-(4-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-digitalopyranoside) (5), (4R)-4-

hydroxy-3- (1-metyletyl)pentyl rutinoside (6), (R)-2-etyl-3-metylbutyl rutinoside (7),

acovenosigenin A (8), periplogenin 3-O-β-digitoxoside (9), periplocymarin (10),

periplogenin (11), digitoxigenin (12), digitoxigenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1 →

6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)–β-D-digitoxopyranoside] (13), digitoxigenin

sophoroside (14), echujin (15), periplogenin glucoside (16), corchorusoside C (17),

subalpinoside (18), acid caffeic (19), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (20), 2-phenylethyl

rutinoside (75). [6]

Năm 2005, Ma Chunhui và cộng sự cô lập được các hợp chất sau: periplogenin -

3β-acetate (21), -amyrol acetate (22), -amyrol tridecanoate (23), ursolic acid (24),

9,19-cyclolart-25-en-3β,24R-diol (25), 9,19-cyclolart-25-en-3β,24S-diol (26),

cycloeucalenol (27), 9,19-cycloart-23E-en-3 β, 25-diol (28), 25-methoxy-9,19-cycloart-

23E-en-3 β-ol (29), 11,12-epoxytaraxer-14-en-3β-acetate (30), oleanolic acid (76),

uzarigenin (77). [8]

Năm 2007, Myint Myint Khine và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất

cardenolide mới là: 17β-H-Periplogenin 3-O-β-D-digitoxoside (31), ∆5-Pregnene-

3β,16α-diol 3-O-[2,4-O-diacetyl-β-D-digitalopyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranoside]-

16-O-[β-D-glucopyranoside] (32). [9]

Năm 2008, Zhinhui Liu cùng cộng sự cô lập được chín hợp chất: β –sitosterol (33),

syringaldehyde (34), acid syringic (35), isofraxidin (36), scopoletin (37), scoparone

(38), acid ferulic (39), salicylaldehyde (40), daucosterol (74) . [14]

Năm 2009, Bùi Xuân Hào cùng các cộng sự đã phân lập được một dẫn xuất mới

có khung cardenolide: acovenosigenin A 3-O-glucoside (41). [3]

Năm 2011, Luay J. Rashan và cộng sự đã cô lập thêm sáu hợp chất cũng có khung

cardenolide: 17-H-periplogenin-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D-

digitalopyranoside (42), oleandrin (43), oleandrigenin-3-O-β-D-sarmentoside (44),

neritaloside (45), odoroside H (46), odoroside A (47). [7]

Năm 2013, Rui Xue và cộng sự đã cô lập được mười lăm hợp chất có khung

cardenolide: 1-14β-dihudroxy-5β-card-20 (22)-enolide 3-O-[O-β-D-

digitalopyranoside] (48), acovenosigenin A 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

digitalopyranoside] (49), 16-O-acetyl-hdroxyperiplogenin 3-O-β-D-digitoxopyranoside

(50), 16-O-acetyl-hydroxyacovenosigenin (51), 3-O-(β-glucopyranosyl)

acovenosigenin A (52), evonogenin (53), glucoevonogenin (54), digitoxigenin 3-O-[O-

β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D-

digitalopyranoside] (55), digitoxigenin (56), digitoxigenin 3-O-β-D-glucoside (57)

echunbioside (58), 1β, 3β, 14β-trihydroxy-5β-card-16,20 (22)-dienolide (59),

griffithigenin (60), ∆(16) -digitoxigenin –β-D-glucoside (61), emicymarin (78). [10]

Năm 2015, Chun Ye và cộng sự phân lập được chín hợp chất có khung cardenolide:

periplogenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-

acetyl-β-D-digitalopyranoside] (62), periplogenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-

O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranoside] (63), acovenosigenin A 3-O-

[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside]

(64), acovenosigenin A 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-

(1→4)-2-O-acetyl-β-D-digitalopyranoside] (65), 16-O-acetyl-hydroxyacovenosigenin

3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D-

D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β-D-digitalopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside]

digitalopyranoside] (66), acovenosigenin A 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-

(67), digitoxigenin 3-O-β-D-cellobioside (68), digitoxigenin-3-O-β-D-glucosyl-(1→4)-

3-O-acetyl-β-D-digitoxoside (69), 5β-Hydroxygitoxigenin (70). [4]

Năm 2017, Yi-Chao Ge và cộng sự cô lập được sáu hợp chất: 28, 29-nor-3β, 4β-

dihydroxyl-9, 19-cycloartan-26-acid (71), 28, 29-nor-3β, 4β-dihydroxyl-9, 19-

cycloartan-26-acid methylester (72), 30-nor-3-β-acetoxy-lupan-20-one (73), -amyrin

(79), betulinic acid (80), lupeol palmitate (81). [13]

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

Các công thức cấu tạo của một số hợp chất

trong cây Streptocaulon juventas (Lour) Merr.

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

Chú thích:

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

CHƯƠNG 2

THỰC NGHIỆM

2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP

2.1.1. Hoá chất

Silica gel 37 – 63 μm, Himedia dùng cho sắc kí cột.

254

Sắc kí lớp mỏng loại DC - Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F , Merck.

Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, chloroform , ethyl acetate,

acetone, methanol, acetic acid và nước cất.

Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng: sử dụng H2SO4 20%.

2.1.2. Thiết bị

Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.

Các cột sắc kí.

Máy cô quay chân không.

Bếp cách thuỷ.

Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.

Cân điện tử.

2.1.3. Phương pháp tiến hành

Phương pháp phân lập các hợp chất

Cô lập các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp sắc kí, bao gồm kỹ thuật sắc kí cột

silica gel pha thường và sắc kí lớp mỏng.

Được hiện hình bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng

thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%.

Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR

trên máy Bruker Avance được ghi tại phòng NMR, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam, số 18, Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội.

2.2. NGUYÊN LIỆU

2.2.1. Thu hái nguyên liệu

Mẫu cây dùng trong nguyên cứu đề tài là rễ cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

juventas (Lour) Merr.) được thu hái ở Tịnh Biên tỉnh An Giang vào tháng 10 năm 2016.

Mẫu cây đã được Th.S Hoàng Việt, trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố

Hồ Chí Minh nhận danh tên khoa học là “Streptocaulon juventas”, họ Thiên lý

(Asclepiadaceae).

2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi

xay thành bột mịn.

2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Bột rễ cây hà thủ ô được đun hoàn lưu với dung môi methanol ở nhiệt độ 64-65oC,

mỗi mẽ đun 3 lần mỗi lần đun trong 3 giờ. Sau đó đem lọc, thu được dịch, rồi đem cô

quay với áp suất thấp thu được cao methanol thô.

Cao methanol thô được chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform, cô quay dịch

chiết thu được cao chloroform. Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1.

- Trích nóng với methanol - Lọc bã

Bột rễ hà thủ ô (20 kg)

Bã khô Dịch methanol

Cô quay thu hồi dung môi

Methanol thu hồi Cao methanol thô (2.02 kg)

- Chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform. - Cô quay thu hồi dung môi

Cao còn lại Cao chloroform (400g)

Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế cao chloroform từ rễ cây hà thủ ô trắng

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO CHLOROFORM

2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform

Cao chloroform (400g) được sắc kí cột (SKC) silica gel, giải lý với hệ dung môi

H:EA có độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% EA, sau đó giải ly lần lượt với các hệ

dung môi EA:Me 9:1, EA:Me:H2O 8:1:1, EA:Me:H2O 4:1:1, EA:Me:H2O 2:1:1 và

100%Me. Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ theo dõi quá trình giải ly bằng sắc

ký lớp mỏng (SKLM). Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gộp chung thành

một phân đoạn. Kết quả thu được 12 phân đoạn (A-L)

Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform

Khối lượng Sắc kí lớp STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú (g) mỏng

A H 3.6 Nhiều vết Chưa khảo sát 1

B H: EA 99:1 5.0 Nhiều vết Chưa khảo sát 2

C H:EA 95:5 5.6 Nhiều vết Khảo sát 3

D H:EA 9:1 6.0 Nhiều vết Đã khảo sát 4

E H:EA 85:15 8.4 Nhiều vết Chưa khảo sát 5

F H:EA 8:2 13 Nhiều vết Chưa khảo sát 6

G H:EA 1:1 19.6 Nhiều vết Chưa khảo sát 7

H EA 26.8 Nhiều vết Chưa khảo sát 8

I EA:Me 9:1 31.0 Nhiều vết Chưa khảo sát 9

J 41.2 Nhiều vết Chưa khảo sát 10 EA:Me:H2O 8:1:1

K 53 Nhiều vết Chưa khảo sát 11 EA:Me:H2O 4:1:1

L 71.6 Vệt dài Chưa khảo sát 12 EA:Me:H2O 2:1:1

Ghi chú: H: hexan, EA: ethyl acetat, Me: methanol, H2O: nước.

2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C của bảng 2.1

Phân đoạn C cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn C được thực hiện SKC

silica gel, giải ly với hệ dung môi H:C:EA có độ kém phân cực giảm dần từ 100% đến

0% H và tỉ lệ C:EA là 1:1 được giữ nguyên. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc

kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C

Khối lượng Sắc kí lớp STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú mỏng (mg)

20.4 H Nhiều vết Chưa khảo sát C.1 1

H:C:EA 9:0,5:0,5 1840.4 Nhiều vết Chưa khảo sát C.2 2

H:C:EA 8:1:1 1836.2 Nhiều vết Khảo sát C.3 3

H:C:EA 6:2:2 600.9 Nhiều vết Chưa khảo sát C.4 4

C:EA 1:1 140.6 Nhiều vết Chưa khảo sát C.5 5

Ghi chú: H: hexan, C: Chloroform, EA: ethyl acetat.

2.4.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C.3 của bảng 2.2

Phân đoạn C.3 cho SKLM hai vết tách rõ nên phân đoạn C.3 được SKC silica gel

với hệ dung môi H:C:EA 40:1:1, sau đó giải ly tiếp tục với hệ 30:1:1. Tiến hành các

bước tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 5 phân đoạn (C.3.1-

C.3.5), được trình bày trong bảng 2.3.

Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn C.3

Khối lượng Sắc kí lớp STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú (mg) mỏng

C.3.1 H:C:EA 40:1:1 4.4 1 vết tách rõ Chưa khảo sát 1

C.3.2 H:C:EA 40:1:1 204.7 2 vết tách rõ Chưa khảo sát 2

C.3.3 H:C:EA 30:1:1 394.6 1 vết tách rõ Khảo sát 3

C.3.4 H:C:EA 30:1:1 800.9 2 vết tách rõ Khảo sát 4

C.3.5 H:C:EA 30:1:1 427.6 1 vết tách rõ Khảo sát 5

Phân đoạn C.3.3 có SKLM cho vết rõ có màu cam, thu được hợp chất có dạng hình

vảy, màu trắng. Phân đoạn C.3.5 có SKLM cho vết rõ màu nâu, thu được hợp chất có

dạng hình kim màu trắng. Phân đoạn C.3.4, qua một lần SKC tách ra hai vết trùng với

phân đoạn C.3.3 và C.3.5. Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.2.

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

Cao chloroform 400 g

- Sắc kí cột silica gel - Giải ly H:EA, EA:Me:H2O - Cô quay thu hồi dung môi

A 3.6 g B 5.0 g C 5.6 g D 6.0 g E 8.4 g F 13.0 g G 19.6 g H 26.8 g I 31.0 g J 41.2 g K 53.0 g L 71.6 g

- Sắc kí cột silica gel - Giải ly H:C:EA C.2 1840.4 mg C.3 1836.2 mg C.4 600.9 mg C.1 20.4 mg C.5 140.6 mg

C.3.1 4.4 mg - Sắc kí cột silica gel - Giải ly H:C:EA C.3.3 394.6 mg C.3.4 800.9 mg C.3.5 427.6 mg C.3.2 204.7 mg

Q2 427.6 mg Q1 394.6 mg

Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập hợp chất

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT Q2

Hợp chất Q2 (427.6 mg) thu được từ phân đoạn C.3.5 có những đặc điểm như sau:

- Dạng tinh thể hình kim, màu trắng, hòa tan được trong dung môi chloroform.

- Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình bằng H2SO4 20%, hơ nóng

bảng mỏng cho vết có màu nâu (dung môi giải ly hexan:chloroform:ethyl acetat 8:1:1,

Rf = 0.4).

- Phổ 1H-NMR (CDCl3, phụ lục 1, Bảng 3.1) .

- Phổ 13C-NMR (CDCl3, phụ lục 2, Bảng 3.1) δC ppm 199.7 (>C=O, C-11), 171.0

(-COCH3, C-31), 165.0 (>C=, C-13), 130.4 (-CH=, C-12), 80.67 (>CH-O-, C-3).

- Phổ HSQC cho phép xác định tương quan một nối giữa proton và carbon (CDCl3,

phụ lục 3, Bảng 3.1)

- Phổ HMBC cho phép xác đinh tương quan hai hoặc ba nối giữa proton và carbon

(CDCl3, phụ lục 4)

 BIỆN LUẬN CẤU TRÚC

Phổ 1H-NMR của hợp chất Q2 cho thấy sự hiện diện của các proton tám nhóm

methyl tại δH 0.88 (3H, s, H-23); δH 0.89 (3H, s, H-24); δH 1.19 (3H, s, H-25), δH 1.17

(3H, s, H-26); δH 1.29 (3H, s, H-27); δH 0.82 (3H, s, H-28); δH 0.812 (3H, d, J 2, H-29);

δH 0.95 (3H, s, H-30), một nhóm acetoxy δH 2.05 (3H, s, H-32) và một proton của olefin

cho tín hiệu δH 5.54 (1H, s, H-12).

Phổ 13C-NMR của hợp chất Q2 cho thấy sự hiện diện của ba mươi hai carbon trong

khoảng δC 17-200 ppm trong đó có carbon nhóm ceton δC 199.7; carbon của nhóm ester

δC 171.0; hai carbon của liên kết đôi δC 130.4, 165.0.

Phổ HSQC cho ta thấy tương quan của các proton và carbon ta thấy được có chín

nhóm methyl, tám nhóm methylene, sáu nhóm metin được thể hiện rõ ở Bảng 3.1.

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

Phổ HMBC cho thấy rõ tương quan giữa proton H-3 δH 4.52 với các carbon cộng

hưởng δC 28.1 (C-23); δC 16.7 (C-24); δC 171.0 (C-31). Proton H-32 có cộng hưởng ở

δH 2.05 có tương quan với carbon có cộng hưởng tại δC 171.0 (C-31). Từ đó có thể kết

luận C-3 gắn nhóm acetate.

Trong phổ HMBC, proton H-23 cộng hưởng ở δH 0.88 có tương quan với các

carbon cộng hưởng ở δC 16.7 (C-24); δC 80.7 (C-3); δC 55.0 (C-5); δC 38.0 (C-4). Proton

H-24 cộng hưởng ở δH 0.89 có tương quan với các carbon cộng hưởng ở δC 28.1 (C-

23); δC 80.7 (C-3); δC 55.0 (C-5); δC 38.0 (C-4). Từ các tương quan có thể xác định được

vị trí C-5. Proton H-25 có cộng hưởng ở δH 1.19 có tương quan với các carbon cộng

hưởng ở δC 38.9 (C-1), δC 55.0 (C-5); δC 61.5 (C-9); δC 36.8 (C-10). Proton H-26 có

cộng hưởng ở δH 1.17 có tương quan với các carbon ở cộng hưởng δC 43.7 (C-14); δC

32.87 (C-7); δC 61.5 (C-9). Proton H-9 có cộng hưởng ở δH 2.35 có tương quan với các

carbon ở cộng hưởng δC 45.1 (C-8); δC 36.8 (C-10); δC 199.7 (C-11); δC 43.7 (C-14); δC

18.5 (C-25); δC 16.6 (C-26). Từ các tín hiệu phổ trên ta có thể thấy nhóm carbonyl sẽ

gắn tại vị trí C-11.

Trong phổ HMBC, proton H-12 có cộng hưởng tại δH 5.54 có tương quan với các

carbon ở cộng hưởng δC 61.5 (C-9); δC 43.7 (C-14); δC 59.0 (C-18). Proton H-28 cộng

hưởng ở δH 0.82 có tương quan với carbon có cộng hưởng ở δC 33.9 (C-17); δC 40.9 (C-

22); δC 27.5 (C-16). Proton H-30 có cộng hưởng ở δH 0.95 tương quan với các carbon ở

cộng hưởng δC 39.3 (C-20); δC 30.9 (C-21); δC 39.2 (C-19). Proton H-29 có cộng hưởng

ở δH 0.81 tương quan với các carbon ở cộng hưởng δC 59.0 (C-18). Proton H-19 có tương

quan với các carbon có cộng hưởng ở δC 30.9 (C-21); 39.3 (C-20).

Từ dữ liệu phổ, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất và các tín hiệu phổ

của một số carbon trong hợp chất 11-oxo--amyrin ethylated [5] cho thấy có sự tương

đồng về cấu trúc khung sườn nên đề nghị cấu trúc của hợp chất Q2 là 11-oxo--amyrin

acetate:

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

11-oxo--amyrin acetat (Q2)

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất Q2

Hợp chất 11-oxo--amyrin Hợp chất Q2 (CDCl3) Vị trí ethylated (CDCl3) carbon Loại carbon Loại carbon δH (ppm) δC (ppm) δC (ppm)

38.9

-CH2-

1 38.9

23.6

>CH2-

4.52 (dd, J

2 28.7

>CH-

80.7

>CH-

4.5; 12 Hz)

3 80.9

>C<

38.0

>C<

4 38.2

>CH-

0.80 (s)

55.0

>CH-

5 55.2

17.5

-CH2-

6 18.9

32.8

-CH2-

7 32.35

>C<

45.1

>C<

8 40.2

>CH-

2.35 (s)

61.5

>CH-

9 47.2

>C<

36.8

>C<

10 36.9

-CO-

199.7

-CO-

11 199.6

-CH=

5.54 (s)

130.4

-CH=

12 130.4

>C=

165.0

>C=

13 164.9

>C<

43.7

>C<

14 42.0

27.2

-CH2-

15 27.1

27.5

-CH2-

16 26.4

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

>C<

33.9

1.54 (d, J

33.3 17

>CH-

59.0

11.5 Hz)

1.42 (dd, J

59.0 18

>CH-

5.5; 16.4

39.2

>CH-

Hz)

19 39.6

39.3

>CH-

20 39.2

30.9

-CH2-

21 31.2

40.9

>CH2-

22 41.7

28.1

0.88 (s)

-CH3

23 28.8

16.7

0.89 (s)

-CH3

24 16.3

18.5

1.19 (s)

-CH3

25 15.5

16.6

1.17 (s)

-CH3

26 16.9

20.5

1.29 (s)

-CH3

27 23.7

28.8

0.82 (s)

-CH3

0.81 (d, J =

28 28.4

17.5

-CH3

2 Hz)

29 17.5

0.95 (s)

20.5

-CH3

30 21.3

171.0

-COCH3

-COCH2CH3

31 170.9

2.05 (s)

21.1

-COCH3

-COCH2CH3

32 34.36

-COCH2CH3

14.2

Hình 3.1. Một số tương quan trong phổ HMBC của hợp chất Q2

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

3.2. KHẢO SÁT HỢP CHẤT Q1

Hợp chất Q1 (394.6 mg) thu được ở phân đoạn C.3.3 có những đặc điểm sau:

- Dạng vảy, màu trắng.

- Sắc ký lớp mỏng cho một vết kéo vệt ngắn khi hiện hình bằng H2SO4 20%, hơ

nóng bảng mỏng xuất hiện vết có màu cam (dung môi giải ly hexan:chloroform:ethyl

acetat 9:0.5:0.5, Rf = 0.4)

- Phổ 1H-NMR (CDCl3, phụ lục 5)

 BIỆN LUẬN PHỔ 1H-NMR

Phổ 1H-NMR của hợp chất Q1 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton của

vòng thơm có tính đối xứng (δH 8.095, s), tín hiệu cộng hưởng δH 4.69 (1H, d, J 2), δH

4.57 (1H, dd, J 1; 1.5), δH 4.48 (2H, m), δH 4.26 (4H, m, J 0.5; 1), δH 2.38 (1H, td, J 6;

5.5), δH 2.04 (3H, s), δH 2.047 (3H, s), δH (2H, m), δH 1.734 (1H, t, J 6; 6.5), δH 1.684

(3H, s), δH 1.65 (dd, J 3).

Trong quá trình tinh chế chất, chất thu được chưa được tinh khiết. Vì vậy chưa thu

được phổ như mong muốn để quy kết cấu trúc của hợp chất Q1.

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1. KẾT LUẬN

Từ dịch chiết chloroform, một hợp chất đã được cô lập. Cấu trúc của hợp chất này

được xác định bằng các phương pháp phổ thực nghiệm, so sánh với tài liệu tham khảo

và được đề nghị là 11-oxo--amyrin acetate. Đây là hợp chất lần đầu tiên được cô lập

trong cây hà thủ ô.

11-oxo--amyrin acetate (Q2)

4.2. ĐỀ XUẤT

Trong thời gian tới chúng tôi sẽ tiếp tục tinh chế hợp chất Q1 tinh khiết để khảo

sát cấu trúc của hợp chất Q1. Bên cạnh đó, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiếp tục khảo

sát các phân đoạn khác của cây với nhiều hy vọng cô lập thêm được những hợp chất có

cấu trúc mới khác và sẽ tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các hợp chất cô lập

được, mong muốn đóng góp những chứng cứ khoa học có giá trị trong Y học.

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

[1]. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 836-837.

[2]. Phạm Thanh Tâm, Trần Hùng (2002), Chuyên đề Nghiên cứu Khoa học Dược, Y

Học TP. Hồ Chí Minh, 49-52.

Tài liệu Tiếng Anh

[3]. Bui Xuan Hao, Nguyen Thi Hong Yen, Nguyen Minh Duc, Tran Le Quan (2009),

Chemical constituents from the roots of Streptocaulon juventas, Science & Technology

Development, 12(10), 72-77.

[4]. Chun Ye, Hua Wang, Rui Xue, Na Han, Lihui Wang, Jingyu Yang, Yu Wang, Jun

Yin (2015), Minor cytotoxic cardenolide glycosides from the root of Streptocaulon

juventas, Steroids, 93, 39-46.

[5]. Iman Omer, Ibrahim Abdurrahman, Yang Cai-Xia (2017), New Triterpenoid from

the roots of Calotropis gigantea (L) Dryand (Asclepiadaceae), American Journal of

Organic Chemistry, 7(1), 13-15.

[6]. Jun-ya Ueda, Yasuhiro Tezuka, Arjun Hari Banskota, Quan Le Tran, Qui Kim Tran,

Ikuo Saiki, and Shigetoshi Kadota (2003), Antiproliferative Activity of Cardenolides

Isolated from Streptocaulon juventas, Biol. Pharm. Bull, 26(10), 1431-1435.

[7]. Luay J.Rashan, Katrin Franke, Myint Myint Khine, Gerhard Kelter, Heinz H.Fiebig,

Joachim Neumann, Ladger A. Wessjohann (2011), Characterization of the anticancer

properties of monoglycosidic cardenolides isolated from Nerium oleander and

Streptocaulon tomentosum, Journal of Ethnopharmacology, 134, 781-788.

[8]. Ma Chunhui, Huang Tianfang, Qi Huayi, Li Bogang, Zhang Guolin (2005),

Chemical study of Streptocaulon Griffithii, Chin j Appl Environ Biol, 11(3), 265-270.

[9]. Myint Myint Khine, Norbert Arnold, Katrin Franke, Andrea Porzel, Jurgen

Schimidt, Ludger Wessjohann (2007), Phytoconstituents from the root of Streptocaulon

tomentosum and their chemotaxonomical relevance for separation from S. juventas,

Biochemical Systematics and Ecology, 35, 517-524.

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

[10]. Rui Xue, Na Han, Chun Ye, Hai-bo, Jun Yin (2013), Cardenolide glycosides from

root of Streptocaulon juventas, Phytochemistry, 88, 105-111.

[11]. Rui Xue, Na Han, Chun Ye, Lihui Wang, Jingyu Yang, Yu Wang, Jun Yin (2014),

The cytotoxic activities of cardiac glycosides from Streptocaulon juventas and the

structure-activity relationships, Fitoterapia, 98, 228-233.

[12]. Rui Xue, Na Han, Mingyu Xia, Chun Ye, Zhihui Hao, Lihui Wang, Yu Wang,

Jingyu Yang, Ikuo Saiki, Jun Yin (2015), TXA9, a cardiac glycoside from Streptocaulon

juventas, exerts a potent anti-tumor activity against human non-small cell lung cancer

cells in vitro and in vivo, Steroids, 94, 51-59.

[13]. Yi-Chao Ge, Yu-Chun Cheng, Kui-Wu Wang, Hong Wang (2017), Unusual 28,

29-nor-9, 19 cycloartane triterpenoids from Chinese medical plant Streptocaulon

giffithii Hook, Phytochemistry Letters, 22, 185-188.

[14]. Zhihui Liu, Songbo Li, Na Han, Dongxue Sun, Yunfeng Cao, Jun Yin (2008),

Studies on the chemical constituents of the vines of Streptocaulon juventas (Lour.)

Merr., Asian Journal of Tranditional Medicines, 3(5), 193-198.

Khóa luận tốt nghiệp Trần Thị Tú Quyên

PHỤ LỤC

Strep.Juventas01-CDCl3-1H

4 6 2 . 7

3 4 5 . 5

7 3 5 . 4

8 2 5 . 4

3 1 5 . 4

4 0 5 . 4

3 7 7 . 2

5 4 7 . 2

5 4 3 . 2

8 8 0 . 2

9 5 0 . 2

9 4 0 . 2

7 0 7 . 1

5 0 7 . 1

0 0 7 . 1

2 8 6 . 1

5 7 6 . 1

0 5 6 . 1

3 4 6 . 1

4 3 6 . 1

6 2 6 . 1

5 1 6 . 1

4 0 6 . 1

7 6 5 . 1

5 6 5 . 1

9 4 5 . 1

6 2 5 . 1

3 9 4 . 1

3 7 4 . 1

2 6 4 . 1

8 3 4 . 1

1 3 4 . 1

0 2 4 . 1

1 1 4 . 1

5 0 4 . 1

9 9 3 . 1

5 5 3 . 1

6 3 3 . 1

0 3 3 . 1

1 1 3 . 1

3 9 2 . 1

4 0 2 . 1

2 9 1 . 1

9 6 1 . 1

3 3 1 . 1

7 8 0 . 1

0 8 0 . 1

7 4 9 . 0

5 0 9 . 0

4 8 8 . 0

8 7 8 . 0

7 5 8 . 0

6 1 8 . 0

2 1 8 . 0

9 9 7 . 0

Current Data Parameters NAME 110HAO_Strep.Juventas01 EXPNO 1 PROCNO 1

F2 - Acquisition Parameters Date_ 20180423 Time 15.33 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 16 DS 2 SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 sec RG 89.63 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 300.9 K D1 1.00000000 sec TD0 1

======== CHANNEL f1 ======== SFO1 500.2030889 MHz NUC1 1H P1 10.00 usec PLW1 22.00000000 W

F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.2000109 MHz WDW EM SSB 0 LB 0.30 Hz GB 0 PC 1.00

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0 ppm

.

0 0 1

2 0 1

1 0 1

3 0 1

3 2 4

7 0 1

5 5 2

0 6 3

9 6 1

9 8 4

8 8 5

9 4 7

2 4 1

6 2 1

7 4 4

3 9 7

6 3 6

5.543

1.00

5 .

0

4

1.02 .

5

4.537 4.528 4.513 4.504

4 . 0

3 . 5

S t r e p . J u v e n t a s 0 1 - C D C l 3 - 1 H

3 . 0

1.01

2.779 2.773 2.765 2.752 2.745 2.738

2 . 5

2.355 2.345

1.03

4.23

2.124 2.115 2.098 2.088 2.070

p p m

2 .

4.23

1

2 .

0

1 .

9

1.07

1 .

8

2.55

1 .

7

3.60 1 . 6

1.69 1 . 5

4.89 1 . 4

5.88 1 . 3

1 . 2

7.49 S t r e p . J u v e n t a s 0 1 - C D C l 3 - 1 H

1 . 1

1.42

1.26 1 . 0

4.47 0 . 9

7.93 0 . 8

6.36

2.124 2.115 2.098 2.088 2.070 2.059 2.049 1.904 1.887 1.877 1.731 1.724 1.707 1.705 1.700 1.682 1.675 1.650 1.643 1.634 1.626 1.615 1.604 1.591 1.567 1.565 1.549 1.526 1.493 1.473 1.462 1.438 1.431 1.420 1.411 1.405 1.399 1.386 1.355 1.336 1.330 1.311 1.293 1.276 1.255 1.204 1.192 1.169 1.133 1.114 1.106 1.087 1.080 1.060 1.053 1.025 1.020 1.015 0.998 0.992 0.988 0.947 0.905 0.884 0.878 0.857 0.816 0.812 0.799

p p m

Strep.Juventas01-CDCl3-C13CPD

9 6 . 9 9 1

0 0 . 1 7 1

6 9 . 4 6 1

1 4 . 0 3 1

7 6 . 0 8

7 2 . 7 7

2 0 . 7 7

6 7 . 6 7

5 4 . 1 6

1 0 . 9 5

2 0 . 5 5

3 1 . 5 4

5 6 . 3 4

2 9 . 0 4

0 3 . 9 3

2 2 . 9 3

0 9 . 8 3

4 0 . 8 3

3 8 . 6 3

3 9 . 3 3

2 8 . 2 3

0 9 . 0 3

3 8 . 8 2

6 0 . 8 2

1 5 . 7 2

4 2 . 7 2

9 5 . 3 2

0 3 . 1 2

3 1 . 1 2

9 4 . 0 2

3 5 . 8 1

7 4 . 7 1

Current Data Parameters NAME 110HAO_Strep.Juventas01 EXPNO 2 PROCNO 1

F2 - Acquisition Parameters Date_ 20180423 Time 19.50 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 256 DS 4 SWH 31250.000 Hz FIDRES 0.476837 Hz AQ 1.0485760 sec RG 198.57 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 301.6 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 1

======== CHANNEL f1 ======== SFO1 125.7892253 MHz NUC1 13C P1 10.00 usec PLW1 88.00000000 W

======== CHANNEL f2 ======== SFO2 500.2020008 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 22.00000000 W PLW12 0.34375000 W PLW13 0.22000000 W

F2 - Processing parameters SI 32768 SF 125.7753900 MHz WDW EM SSB 0 LB 1.00 Hz GB 0 PC 1.40

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0 ppm

Strep.Juventas01-CDCl3-C13CPD

9 6 . 9 9 1

0 0 . 1 7 1

6 9 . 4 6 1

1 4 . 0 3 1

7 6 . 0 8

7 2 . 7 7

2 0 . 7 7

6 7 . 6 7

200

190

180

170

160

150

140

130

120

110

100

90

80 ppm

61.45

6 0

59.01

55.02

5 5

5 0

45.13

4 5

43.65

4 0

40.92 39.30 39.22 38.90 38.04 36.83

3 5

33.93

32.82

30.90

S t r e p . J u v e n t a s 0 1 - C D C l 3 - C 1 3 C P D

3 0

28.83 28.06 27.51 27.24

2 5

23.59

21.30 21.13 20.49

2 0

18.53 17.47 17.45 16.71 16.55

p p m

Strep.Juventas01-CDCl3-HSQC

ppm 10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130 ppm

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0 Strep.Juventas01-CDCl3-HSQC

ppm

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 ppm

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8 Strep.Juventas01-CDCl3-HMBC

ppm

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200 ppm

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0 Strep.Juventas01-CDCl3-HMBC

ppm

130

135

140

145

150

155

160

165

170

175

180

185

190

195

200 ppm

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5 Strep.Juventas01-CDCl3-HMBC

ppm

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65 ppm

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0 Strep.Juventas01-CDCl3-HMBC

ppm

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80 85 ppm

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8 Strep.Juventas01-CDCl3-HMBC

ppm

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80 ppm

1.3

1.2

1.1

1.0

0.9

0.8 Strep.Juventas03-CDCl3-1H

5 9 0 . 8

1 6 2 . 7

8 6 2 . 4

3 5 0 . 2

7 4 0 . 2

9 3 0 . 2

4 8 6 . 1

5 7 6 . 1

5 5 6 . 1

9 4 6 . 1

1 3 6 . 1

6 2 6 . 1

9 1 6 . 1

9 0 6 . 1

3 0 6 . 1

3 6 5 . 1

3 9 4 . 1

7 6 4 . 1

3 6 4 . 1

6 1 4 . 1

2 1 4 . 1

6 9 3 . 1

3 9 3 . 1

7 8 3 . 1

9 7 3 . 1

3 6 3 . 1

5 4 3 . 1

8 3 3 . 1

9 2 3 . 1

1 2 3 . 1

1 1 3 . 1

5 8 2 . 1

1 8 2 . 1

6 5 2 . 1

7 6 0 . 1

1 1 0 . 1

0 8 9 . 0

9 6 9 . 0

4 6 9 . 0

4 5 9 . 0

9 3 9 . 0

0 2 9 . 0

6 1 9 . 0

6 0 9 . 0

8 9 8 . 0

2 9 8 . 0

4 8 8 . 0

6 7 8 . 0

8 6 8 . 0

5 5 8 . 0

5 4 8 . 0

6 3 8 . 0

9 9 7 . 0

7 8 7 . 0

0 0 0 . 0 -

Current Data Parameters NAME 110HAO_Strep.Juventas03 EXPNO 1 PROCNO 1

F2 - Acquisition Parameters Date_ 20180423 Time 15.43 INSTRUM spect PROBHD 5 mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 16 DS 2 SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 sec RG 175.34 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 300.7 K D1 1.00000000 sec TD0 1

======== CHANNEL f1 ======== SFO1 500.2030889 MHz NUC1 1H P1 10.00 usec PLW1 22.00000000 W

F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.2000126 MHz WDW EM SSB 0 LB 0.30 Hz GB 0 PC 1.00

11

10

9

7

6

5

4

3

2

1

0

8 ppm

.

0 0 1

8 5 0

1 9 0

8 0 1

0 7 0

2 1 3

4 1 1

1 6 1

2 9 6

8 3 4

6 1 6

7 2 5

4 8 5

3 7 2

2 0 3

8 6 3

5 1 5

1 5 3

3 7 6

6 2 4

8.095

1.00

8 .

0

7 .

5

7.261

7 .

0 6 . 5

6 . 0

5 . 5

S t r e p . J u v e n t a s 0 3 - C D C l 3 - 1 H

5 . 0

0.58 4 . 5

0.91

1.08

4.688 4.684 4.572 4.570 4.568 4.565 4.523 4.503 4.487 4.477 4.466 4.455 4.300 4.289 4.279 4.268 4.257 4.246 4.235

p p m

2 .

5

2 .

0.70

4

2 .

3

2 .

1

3.12

2 .

0

1.14

1 .

9 1 . 8

1.61 1 . 7

6.92 1 . 6

1 . 5

4.38 1 . 4

6.16

5.27 1 . 3

5.84 1 . 2

S t r e p . J u v e n t a s 0 3 - C D C l 3 - 1 H

2.73 1 . 1

3.02 1 . 0

3.68

5.15 0 . 9

3.51 6.73

0 . 8

4.26

2.058 2.053 2.047 2.039 1.923 1.910 1.746 1.734 1.721 1.684 1.675 1.655 1.649 1.631 1.626 1.619 1.609 1.603 1.563 1.508 1.497 1.493 1.482 1.476 1.467 1.463 1.454 1.449 1.416 1.412 1.396 1.393 1.387 1.379 1.363 1.345 1.338 1.329 1.321 1.311 1.300 1.285 1.281 1.256 1.236 1.226 1.203 1.183 1.131 1.123 1.115 1.088 1.079 1.067 1.054 1.011 0.980 0.969 0.954 0.939 0.920 0.916 0.906 0.876 0.868 0.855 0.845 0.836 0.799 0.787

p p m

2 .

4

0.70

2.403 2.391 2.381 2.369 2.358 2.347

2 .

3

2 .

1

3.12

2.058 2.053 2.047 2.039

2 . 0

1.14 1 . 9

1.939 1.931 1.923 1.917 1.910 1.901 1.894

1 . 8

1.61 S t r e p . J u v e n t a s 0 3 - C D C l 3 - 1 H

1 . 7

6.92 1 . 6

1.746 1.734 1.721 1.684 1.675 1.655 1.649 1.631 1.626 1.619 1.609 1.603 1.563

1 . 5

4.38

1.508 1.497 1.493 1.482 1.476 1.467 1.463 1.454 1.449

p p m

1.563

1 .

5 5

1 .

5 0

4.38

1 .

4 5

1 .

4 0

6.16

1 .

3 5

5.27

1 .

3 0

1 . 2 5

5.84

1.508 1.497 1.493 1.482 1.476 1.467 1.463 1.454 1.449 1.416 1.412 1.396 1.393 1.387 1.379 1.363 1.345 1.338 1.329 1.321 1.311 1.300 1.285 1.281 1.256 1.236 1.226

1.203