Khóa luận tốt nghiệp: Khảo sát thành phần hóa học của các cao Petroleum Ether từ nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TPHCM

KHOA HÓA HỌC – BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ

------

VÕ THỊ BÍCH PHƯỢNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC

CAO PETROLEUM ETHER TỪ NẤM ĐÔNG

TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps sinensis)

CBHD : TS. BÙI XUÂN HÀO

TS. ĐẶNG HOÀNG PHÚ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 04/2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TPHCM

KHOA HÓA HỌC – BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ

------

VÕ THỊ BÍCH PHƯỢNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC

CAO PETROLEUM ETHER TỪ NẤM ĐÔNG

TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps sinensis)

CBHD : TS. BÙI XUÂN HÀO

TS. ĐẶNG HOÀNG PHÚ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 04/2019

NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

Xác nhận của Giảng Viên

LỜI CẢM ƠN

Đề tài được thực hiện và hoàn thành tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ với sự hướng dẫn của

thầy Bùi Xuân Hào và thầy Đặng Hoàng Phú.

Trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài, em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sâu

sắc đến thầy Đặng Hoàng Phú và thầy Bùi Xuân Hào đã dành nhiều thời gian, tâm huyết chia

sẻ những kinh nghiệm, truyền đạt kiến thức chỉ dẫn tận tình, chu đáo, tạo mọi điều kiện để

hoàn thành tốt đề tài này.

Cảm ơn các anh chị, các bạn trong phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ đã chia sẻ, giúp đỡ và hỗ

trợ rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn.

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI MỞ ĐẦU

1. TỔNG QUAN ...................................................................................................................... 1

1.1. Giới thiệu chung về cây Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps sinensis) ........................... 1

1.1.1. Tên gọi .............................................................................................................. 1

1.1.2. Nguồn gốc ......................................................................................................... 1

1.1.3. Mô tả thực vật ................................................................................................... 2

1.1.4. Phân bố ............................................................................................................. 2

1.1.5. Trồng trọt, thu hái ............................................................................................. 3

1.2. Thành phần hóa học ....................................................................................................... 3

1.3. Hoạt tính sinh học .......................................................................................................... 8

2. THỰC NGHIỆM .................................................................................................................. 9

Điều kiện thực nghiệm .................................................................................................... 9

Giới thiệu chung............................................................................................................ 10

Tiến hành thực nghiệm ................................................................................................. 10

Sơ đồ quá trình cô lập các hợp chất .............................................................................. 11

Quá trình cô lập phân đoạn P3.1 ................................................................................... 12

3. KẾT QUẢ, BIỆN LUẬN ................................................................................................... 13

KẾT LUẬN

i

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên ................................................................. 2

Hình 1.2: Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200m trên mực nước biển tại

Tibet .......................................................................................................................................... 3

ii

Hình 2.1: Cấu trúc hợp chất CS ............................................................................................. 13

DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ

Bảng 2.1: Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất CS so sánh với hợp chất 22-hydroxyisohopane

trong dung môi chloroform-d. ................................................................................................ 14

iii

Sơ đồ 2.1: Quá trình cô lập các hợp chất .............................................................................. 11

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

PE Petroleum ether

D Doublet (Mũi đôi)

Dd Doublet of doublets (Mũi đôi - đôi)

S Singlet (Mũi đơn)

SKLM Sắc ký lớp mỏng

SKC Sắc ký cột

NMR Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

Hz, MHz Hertz, Megahertz

ppm Part per million

J Hằng số ghép

1H NMR

Độ dịch chuyển hóa học 𝛿

Proton Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

13C NMR

của proton 1H)

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt

iv

nhân của carbon 13C)

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1.1: Phổ 1H NMR của hợp chất CS trong dung môi chloroform-d

v

Phụ lục 1.2: Phổ 13C NMR của hợp chất CS trong dung môi chloroform-d

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, xã hội ngày càng phát triển, chất lượng cuộc sống con người ngày càng

được nâng cao nhất là nhu cầu về sức khỏe. Việc tìm kiếm và sử dụng các loại dược liệu quý

với nguồn gốc từ thiên nhiên đang được quan tâm và rất phổ biến. Đông trùng hạ thảo là một

trong số các dược liệu quý đó, đã được sử dụng lâu đời trong lịch sử Đông y.

Đông trùng hạ thảo là một dạng kí sinh giữa loài nấm túi Cordyceps với ấu trùng của một số

loài côn trùng. Ngoài ra, Đông trùng hạ thảo còn được biết đến với các ứng dụng trong y học

như: điều trị ho, điều trị bệnh ở thận, suy nhược, tăng cương chức năng hệ miễn dịch,… Do

vậy, việc nuôi trồng và phân tích các thành phần hoạt tính sinh học từ Đông trùng hạ thảo để

thu được các hợp chất có tính ứng dụng trong các lĩnh vực đã và đang được các nhà khoa học

quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, việc nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo còn gặp nhiều

khó khăn về cơ sở vật chất và kiến thức. Vì vậy, đề tài này nhằm nghiên cứu cấu trúc, khảo

sát thành phần hóa học của cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps

vi

sinensis).

PHẦN 1: TỔNG QUAN

vii

1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung về cây Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps sinensis)

1.1.1. Tên gọi

Đông trùng hạ thảo (Chinese caterpillar fungus), còn gọi là trùng thảo, hạ thảo đông

trùng hay đông trùng hạ thảo, là một loại đông dược quý có bản chất là dạng ký sinh của

loài nấm Cordyceps sinensis (thuộc nhóm Ascomycetes) trên cơ thể sâu Hepialus fabricius

[1].

C. sinensis còn được gọi là “nấm sâu bướm” vì thực chất nó kí sinh trên ấu trùng (sâu

non) của các loài bướm thuộc bộ Cánh vẩy [2]. Vào cuối mùa thu, các chất trên biểu bì

của sâu non ngày đêm tương tác với các bào tử nấm và hình thành các sợi nấm đâm sâu

vào ấu trùng. Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát triển mạnh và gây chết vật chủ, sau đó

hình thành quả thể, phát triển và chui ra khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính vào đầu vật chủ

[3]. Do đó có nó tên là Đông trùng hạ thảo vì mùa đông nấm sống trên cơ thể côn trùng,

mùa hè lại phát triển ra ngoài cơ thể giống như cây cỏ [4].

Nấm C. sinensis được phân loại như sau: [5]

Giới: Fungi

Phân giới: Dikarya

Ngành: Ascomycota

Lớp: Sordariomycetes

Bộ: Hypocreales

Họ: Clavicipitaceae

Chi: Cordyceps

Loài: Cordyceps sinensis

1.1.2. Nguồn gốc

Đông trùng hạ thảo là hiện tượng loài sâu thuộc chi Hepialus trong tổng Họ

Lepidoptera (Cánh bướm) bị kí sinh bởi một loài nấm túi có tên khoa học là Cordyceps

sinensis (Berk) thuộc tổng Họ Ascomycetes (Nang Khuẩn). Thường gặp nhất là sâu non

của loài Hepialus Fabricius hoặc Hepialus Armoricanus. Ngoài ra còn 40 loài khác thuộc

1

chi Hepialus cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh [1,6].

1.1.3. Mô tả thực vật

Cordyceps là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae. Hiện nay người ta đã tìm thấy

hơn 680 loài trong chi Cordyceps, nhưng thuật ngữ Cordyceps thường được đề cập chính

xác loài C. sinensis [7].

Đông trùng hạ thảo khi còn sống, người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là

một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm [8].

Phần lá có hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 - 11cm do sợi nấm mọc dính liền

vào đầu sâu non mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính

khoảng 0.3 – 0.8 cm. Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn

khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn [1].

Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân, nhưng 4

đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu

non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm

nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà [1].

Hình 1.1: Nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên

1.1.4. Phân bố

Cordyceps sinensis (Đông trùng hạ thảo ) là một loại nấm dược liệu quý hiếm, nổi

tiếng ở Trung Quốc và được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Hoa hàng ngàn thế kỷ

qua. Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo hay các loài thuộc chi Cordyceps phụ thuộc

2

vào nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng của môi trường. Nó phân bố rộng rãi khắp Trung Quốc,

cao nguyên Tây Tạng, Bhutan, Nepal và vùng đông bắc Ấn Độ, ở độ cao 3500 – 5000m

so với mực nước biển [4].

Hình 1.2: Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200m trên mực nước biển

tại Tibet

Và theo một số nghiên cứu cho thấy, các loài của chi nấm Cordyceps còn được tìm

thấy ở Thái Lan, Nhật Bản và Việt Nam [8]. Như vậy, có thể thấy thành phần loài nấm

Đông trùng hạ thảo khá phong phú ở trên các vùng sinh thái khác nhau và nhiều loài có

phạm vi phân bố rộng, các loài có đặc điểm phân bố đặc hữu cho từng vùng.

1.1.5. Trồng trọt, thu hái

C. sinensis được Cục Quản lý thực phẩm và dược phẩm hoa Kỳ xem như một loại thực

phẩm chức năng [9], vì vậy nhu cầu mua bán loài nấm này trên thị trường rất phổ biến và

ngày càng tăng ở nhiều quốc gia.

Tuy nhiên, với mức độ phổ biến của C. sinensis đã dẫn đến việc khai thác quá mức và

hậu quả là sự cạn kiệt nguồn tài nguyên này trong tự nhiên [10]. Do đó, các nhà nghiên

cứu đã nỗ lực tìm cách nuôi trồng C. sinesis trong môi trường nhân tạo nhằm đáp ứng nhu

cầu sản xuất với quy mô lớn [10]. Hiện nay, nhờ áp dụng các phương pháp nuôi cấy lên

men hiện đại như công nghệ nuôi cấy trong lò phản ứng sinh học (bioreactor) [9], người

ta đã có thể dễ dàng cô lập được các chủng nhân tạo từ nấm thiên nhiên, đáp ứng nhu cầu

của con người và góp phần bảo tồn nguồn tài nguyên thiên niên [11].

1.2. Thành phần hóa học

Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối (biomass) của Đông trùng hạ thảo có

3

17 đến 19 loại acid amin khác nhau: lipid và nhiều nguyên tố vi lượng (Na, K, Ca, Mg,

Al, Mn, Cu, Zn, Bo, Fe... trong đó cao nhất là P [12]. Đông trùng hạ thảo còn chứa nhiều

loại vitamin (trong 100 g đông trùng hạ thảo có 0.12 g vitamin B12; 19 mg vitamin A;

116.03 mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K...),

ngoài ra còn có khoảng 25 - 30 % protein, 8% chất béo và đường mannitol [1].

Bằng các phương pháp sắc ký, phổ nghiệm, các thành phần hóa học của Cordyceps tự

nhiên được phân lập bao gồm: polysaccharide, cordycepin acid, glutamic acid, acid amin,

polyamines, saccharide và các dẫn xuất đường, steroid, nucleotide và nucleoside, 28 acid

 Polysaccharide

béo bão hòa và không bão hòa,....[1].

Công trình của Xiao JH. năm 2008 về cấu trúc hóa học của polysaccharide trong nấm

Cordyceps [13]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Guan đã đề ra phương pháp “Saccharide

mapping” để phân tích định tính các polysaccharide trong C. sinensis [14]. J. Guan và các

cộng sự cho rằng các monomer tạo thành polysaccharide trong nấm chủ yếu thông qua các

liên kết (1→4)-𝛽, (1→4)-𝛼, (1→6)- 𝛼-glucosidic và (1→4)- 𝛽-D-mannosidic [15].

Một loạt các phương pháp như methyl hóa, giảm cấp Smith, aceto-giải, thủy giải trong

D-glucan tìm thấy trong C. sinensis với khung sườn bao gồm các đơn vị (1→4)-D-glucosyl

môi trường acid và phổ NMR đã được thực hiện để xác định các đặc trưng về cấu trúc của

liên kết với nhau và một đơn vị (1→6)-D-glucosyl phân nhánh [16].

Cấu trúc của một mannoglucan trung hòa (tỉ lệ mol của các đơn vị Man và Glc là 1:9)

cũng được xác định bằng các phương pháp phân tích hóa học và phổ nghiệm cho thấy nó

bao gồm khung sườn 𝛼-D-glucan với các liên kết (1→4) và (1→3) và mạch nhánh là các

(1→6)- 𝛼-D-mannopyranosyl liên kết với mạch chính thông qua O-6 của các đơn vị (1→3)-

𝛼-D-glucopyranosyl [17].

Từ quả thể C. sinensis, bằng cách chiết với nước nóng và phân đoạn với ethanol, người

ta thu được galactomanan với cấu trúc bao gồm mạch chính mannan chứa các đơn vị

(1→2)- 𝛼-D-mannopyranosyl và mạch nhánh galactosyl chứa các đơn vị (1→3), (1→5),

(1→6)-D-galactofuranosyl [18].

Ngoài ra, bằng phương pháp sắc ký ghép nối đầu dò khối phổ GC-MS, thành phần các

carbohydrate được chiết tách từ cả C. sinensis tự nhiên và nhân tạo đều được xác định,

bao gồm 10 monosaccharide (rhamnose, ribose, arabinose, xylose, mannose, glucose,

4

galactose, mannitol, fructose và sorbose) [18].

Xylose Arabinose Rhamnose

Fructose Mannose Ribose

Sorbose Galactose D-mannosidic

 Nucleosides

Nucleosides là một trong những thành phần chính trong Cordyceps. Năm 1964,

3-deoxyadenosine, cụ thể là cordycepin, được phân lập từ Cordyceps militaris [11],

một loài liên quan thường được sử dụng thay thế C. sinensis. Kể từ đó, hơn 10

nucleoside và các hợp chất liên quan của nó đã được phân lập từ Đông trùng hạ thảo

bao gồm: adenine, adenosine, uracil, uridine, guanine, guanosine, hypoxanthine,

inosine, thymine, thymidine, deoxyuridin [1].

R=H: uracil guanine R=NH2: adenine

5

R=CH3: thymine R=OH: hypoxanthine

R=NH2: adenosine

cordycepin R=OH: inosine

R=NHCH2CH2OH: N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine

Guanosine myriocine uridine

 Amio acids

Tổng hàm lượng acid amin trong sợi nấm lên men được xác định là 9.23%, thấp

hơn so với Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên (18.10%). Ba acid amin chính trong quả

thể nấm là acid glutamic, acid aspartic, arginine, và hàm lượng của chúng lần lượt là

2.64–2.66%, 1.70–1.84% và 1.53–1.60% [1,20].

 Steroid

Ergosterol, một trong những thành phần hóa học từ tế bào của sợi nấm, là steroid

chiếm phần lớn và được tìm thấy trong hầu hết các loại nấm [20]. Hàm lượng ergosterol

trong chất nền của C. sinensis được tìm thấy là khoảng 0.92 g /L và cao hơn khoảng

6

ba lần so với hàm lượng trong sinh khối [1].

Ergosterol ergosterol peroxide

cereisterol Ergosteryl-3-O- 𝛽-D-glucopyranoside

campesterol 𝛽-sitosterol

Stigmasterol daucosterol

7

Cholesterol cholesteryl palmitate

 Peptides

Theo nghiên cứu, hơn 20% axit amin có thể được tìm thấy trong Cordyceps. Trong

đó, một số hợp chất tiêu biểu như: Cyclodipeptides, Cordymin,...[1].

1.3. Hoạt tính sinh học

Nhiều hoạt chất trong Đông trùng hạ thảo có hoạt tính sinh học cao. Dưới đây là một

số hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu:

 Polysaccharides: là thành phần chủ yếu tạo nên hầu hết các hoạt tính sinh học của

C. sinensis như: tăng cường hệ miễn dịch, bảo vệ gan, hạ huyết áp, tăng lipid trong

máu, chống ung thư và chống oxy hóa,... [21,22].

 Adenosine: có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của cơ

thể. Giúp cải thiện tuần hoàn tim mạch, giảm sinh trưởng các tế bào thoái hóa và

tăng lượng oxy trong máu,... [21].

 Cordycepin: có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn, chống virus, ngăn ngừa ung thư, ngừa

di căn, điều hòa miễn dịch,...[21].

 Mannitol: với công dụng làm giảm mỡ, đường máu và cholesterol và phòng chống

bệnh tim mạch,...[23].

 Cordymin: Các peptide cordymin từ C. sinensis , có tác dụng bảo vệ thần kinh trong

não thiếu máu do ức chế viêm và tăng hoạt động chống oxy hóa liên quan đến bệnh

sinh bệnh, có thể được sử dụng như một tác nhân phòng ngừa tiềm năng chống lại

chấn thương do thiếu máu cục bộ não [5].

 Cordysinin: Năm cordysinin, A-E, từ sợi nấm của C. sinensis đã được xác định và

đã được chứng minh là có hoạt tính kháng viêm và 1-(5-hydroxymethyl-2-furyl) β-

carboline được chứng minh là ức chế đáng kể nhất anion superoxide thế hệ và

8

elastase [7].

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM

2. THỰC NGHIỆM

Điều kiện thực nghiệm

Việc nghiên cứu thành phần hóa học của cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ

thảo được thực hiện với các điều kiện sau:

 Sắc kí cột

- Silica gel pha thường (Merk, DC Kieselgel 60 F254).

 Sắc kí lớp mỏng

- Silica gel pha thường (Merk, DC Kieselgel 60 F254).

- Silica gel pha đảo RP18 (Whatman, KC18F, 200𝜇𝑚).

 Thuốc thử

- Dung dịch vanillin.

 Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân:

- Máy Bruker Avance 500 [500 MHz (1H) và 125 MHz (13C)].

 Máy ghi phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS:

- Máy Bruker Micro OTOF-QII.

 Đèn UV:

- Máy Spectroline MODEL ENF-240C/FE (USA) hai bước sóng 254nm và

365nm.

 Dung môi thực nghiệm:

Là các dung môi chưng cất:

- Methanol

- n-Hexane

- Ethyl acetate

- Acetone

- Chloroform

 Phổ cộng hưởng từ của hợp chất CS1 và CS2 được ghi tại phòng phân tích trung tâm,

trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, Tp.HCM.

 Phổ HR-ESI-MS được ghi tại Viện hàn lâm khoa học và công nghệ, số 1 Mạc Đĩnh

9

Chi, Quận 1, Tp.HCM.

Giới thiệu chung

Trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Đông

trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) được nuôi cấy ở Phòng thí nghiệm Sinh Hóa, trường

Đại học Khoa Học Tự Nhiên.

Sinh khối nấm được định danh bởi PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy, giảng viên Khoa

Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở, Tp.HCM.

Tiến hành thực nghiệm

Sinh khối nấm C. sinensis sau khi được chiết ngấm kiệt với ethanol. Dung môi được

thu hồi dưới áp suất kém, thu được cao ethanol thô.

Cao ethanol khô được hòa tan vào nước và trích lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi

petroleum ether, ethyl acetate và n-butanol, thu được các cao tương ứng và dịch nước sau

khi chiết. Cao petroleum ether (15.3 g), sử dụng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ

giải ly n-hexane: ethyl acetate (độ phân cực tăng dần từ 0% - 100% ethyl acetate), thực

hiện sắc ký bản mỏng thu được 250 lọ. Từ đây gom lại thành 10 phân đoạn (P1-10).

10

Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành khảo sát phân đoạn P3.

Sơ đồ quá trình cô lập các hợp chất

250 g Sinh khối nấm

Chiết ngấm kiệt với EtOH Thu hồi dung môi dưới áp suất kém

51.021 g Cao ethanol

Hòa tan vào nước chiết với dung môi: petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol Thu hồi dung môi dưới áp suất kém

Cao n-butanol (4.329 g) Cao nước (5.435 g) Cao ethyl acetate (0.247 g)

SKC (n-hexane : ethyl acetate) (0 → 100%) thu được 10 phân đoạn từ P1 → P10 P3 (2.6172 g)

SKC (n-hexane : ethyl acetate) (0 → 100%) thu được 12 phân đoạn từ P3.1→ P3.12 Phân đoạn P3.1

(104.3 mg)

Sắc kí điều chế H : CHCl3 (8:2)

CS

(3.0 mg)

11

Sơ đồ 2.1: Quá trình cô lập các hợp chất

Quá trình cô lập phân đoạn P3.1

Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cao

petroleum ether được trích ly từ nấm Đông trùng hạ thảo.

Sắc kí cột hấp phụ trên silica gel cao petroleum ether (15.3 g) với hệ dung môi n-

hexane : ethyl acetate có độ phân cực tăng dần (0→100% EtOAc), dựa trên sắc kí lớp mỏng

hiện màu bằng dung dịch vanilin nung nóng gom thành 10 phân đoạn (P1 → P10).

Sắc kí cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn P3.1 (104.3 mg) với hệ dung ly n-hexane

: chloroform có độ phân cực tăng dần (0→100% CHCl3), dựa trên sắc kí lớp mỏng hiện

màu với dung dịch vanilin nung nóng thu được 5 phân đoạn (𝑃3.1.1 → P3.1.5).

Thực hiện tách phân đoạn trên bản mỏng silica gel pha thường (Merk DC Kieselgel 60

F254) đối với phân đoạn P3.1.2 (11.6 mg) và phân đoạn P3.1.3 (27.9 mg). Sau đó tiến hành

sắc kí bản mỏng điều chế với hệ dung môi giải ly n-hexane : chloroform : acid acetic (8 :

12

2 : 0.01) thu được hợp chất là CS.

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ

BIỆN LUẬN

3. KẾT QUẢ, BIỆN LUẬN

Hợp chất CS thu được có đặc điểm sau: màu trắng, kết tủa vô định hình, tan trong dung

môi chloroform. Sắc ký lớp mỏng với hệ giải ly H : CHCl3 : AcOH (9 : 1 : 0.01) cho 1

vết không hấp thu UV, hiện màu bằng dung dịch vanillin/H2SO4 nung nóng cho màu hồng.

Phổ 1H NMR của hợp chất CS (phụ lục 1.1) cho thấy sự xuất hiện của 7 tín hiệu proton

nhóm methyl tại δH (ppm) 0.76 (3H, s), 0.81 (3H, s), 0.82 (3H, s), 0.85 (3H, s), 0.96 (6H,

s), 1.18 (3H, s), 1.21 (3H, s). Đây là các tín hiệu đặc trưng của khung lupan.

Phổ 13C NMR (phụ lục 1.2) cho thấy sự xuất hiện 1 tín hiệu carbon gắn với oxygen tại

𝛿𝐶 (ppm) 73.6, 6 tín hiệu carbon nhóm methyl tại 𝛿𝐶 (ppm) 33.4, 21.5, 16.1, 16.7, 17.0,

15.8 và các tín hiệu carbon nhóm methylene, carbon tứ cấp tại 𝛿𝐶 (ppm) 18.7 – 54.0.

Từ những dữ liệu phổ trên, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo của hợp chất 22-

hydroxyisohopane cho thấy có sự tương đồng. Vậy cấu trúc của hợp chất CS2 được đề

nghị là 22-hydroxyisohopane.

13

Hình 2.1: Cấu trúc hợp chất CS

Bảng 2.1: Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất CS so sánh với hợp chất 22- hydroxyisohopane trong dung môi chloroform-d.

CS2 22-hydroxyisohopane Vị trí δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm)

Tín hiệu của khung lupan (27H ở vùng δH 0.72 – 2.40) Tín hiệu của khung lupan (27H ở vùng δH 0.72 – 2.40)

14

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 40.3 18.7 42.1 33.3 56.1 18.7 34.4 41.9 50.4 37.4 20.9 22.0 49.9 41.9 33.3 26.6 54.0 44.1 41.3 24.2 51.2 74.0 33.4 21.6 16.1 16.7 17.0 15.8 30.8 33.4 0.96 (6H, s) 0.96 (6H, s) 0.79 (3H, s) 0.82 (3H, s) 0.85 (3H, s) 0.76 (3H, s) 1.18 (3H, s) 1.21 (3H, s) 0.95 (6H, s) 0.95 (6H, s) 0.79 (3H, s) 0.81 (3H, s) 0.81 (3H, s) 0.76 (3H, s) 1.18 (3H, s) 1.21 (3H, s) 40.3 18.7 42.1 33.3 56.1 18.7 34.4 41.9 50.4 37.4 20.9 22.0 49.9 41.9 33.3 26.6 53.9 44.1 41.3 24.2 51.1 74.0 33.4 21.6 16.2 16.7 17.0 15.8 30.9 33.4

KẾT LUẬN

Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học phân

đoạn P3 cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis). Bằng phương

pháp sắc ký cột và sắc ký bản mỏng trên silica gel pha thường và pha đảo, sắc kí bản mỏng

điều chế đối với các hệ dung môi giải ly khác nhau đã cô lập hợp chất ký hiệu là CS.

Thông qua các kết quả phân tích phổ nghiệm (1H NMR, 13C NMR) và so sánh với các tài

liệu tham khảo, chúng tôi đã xác định được cấu trúc của hợp chất là: 22-hydroxyisohopane.

22-hydroxyisohopane

15

Trong đó, hợp chất CS lần đầu tiên được cô lập ở chi Cordyceps.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hui-Chen Lo,1 Chienyan Hsieh, 2 Fang-Yi Lin, 3 and Tai-Hao Hsu3, “A Systematic

Review of the Mysterious Caterpillar Fungus Ophiocordyceps sinensis in Dong-

ChongXiaCao (冬蟲夏草 Dōng Chóng Xià Cǎo) and Related Bioactive Ingredients”, J Tradit

Complement Med, vol.3, no.1, pp. 16–32, 2013.

2. W. Chen, W. Zhang, W. Shen and K.Wang, “Effects of the acid polysaccharide fraction

isolated from a cultivated Cordyceps sinensis on macrophages in vitro”, Cell. Immunol, vol.

262, no. 1, pp. 69-74, 2010.

3. J. S. Zhu, G. M. Halpern and K. Jones, “The Scientific Rediscovery of an Ancient Chinese

Herbal Medicine: Cordyceps sinensis Part I”, J. Altern. Complement. Med, vol. 4, no. 3, pp.

289-303, 1998.

4. S. P. Li, F. Q. Yang and K. W. K. Tsim, “Quality control of Cordyceps sinensis, a valued

traditional Chinese medicine”, J. Pharm. Biomed. Anal, vol. 41, no. 5, pp. 1571-1584, 2006.

5. J Wang, YM Liu, W Cao, KW Yao, ZQ Liu, JY Guo, “Anti-inflammation and antioxidant

effect of cordymin, a peptide purified from the medicinal mushroom Cordyceps sinensis, in

middle cerebral artery occlusion-induced focal cerebral ischemia in rats”, Metab Brain Dis,

vol.27, pp. 159–65, 2012.

6. G.D. Wang, “Cordyceps: Ecology Culture and Application”, Science & Technology

Documents Publishing House, Beijing, 1995.

7. ML Yang, PC Kuo, TL Hwang, TS Wu, “Anti-inflammatory principles from Cordyceps

sinensis”, J Nat Prod, vol. 74, pp. 1996–2000, 2011.

8. H. John, C. Matt, M Inc Aloha, SantaCruz, California, U.S.A, “Cordyceps. Wasser SP

Institute of Evolution”, University of Haifa, Mt.Carmel, Haifa, Israel, 2005, thesis.

9. M. G. Shaashidhar, P. Giridhar, K. Udaya Sankar and B. Manohar: “Bioactive principles

from Cordyceps sinensis: A potent food supplement – A review”, J. Funct. Foods, vol. 5, no.

16

3, pp. 1013-1030, 2013.

10. J. C. Holliday, P. Cleaver, M. Loomis-Powers and D. Patel, “Analysis of quality and

techniques for hybridization of medicinal fungus Cordyceps sinensis (Berk) Sacc

(Ascomycetes)”, Int. J. Med. Mushroom, vol. 6, pp. 151-164, 2004.

11. C. H. Dong and Y. J. Yao, “In vitro evaluation of antioxidant activities of aqueous extracts

from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis”, LWT – Food Sci. Technol, vol. 41,

no. 4, pp. 669-677, 2008.

12. FQ Yang, K Feng, J Zhao, SP Li, “Analysis of sterols and fatty acids in natural and

cultured Cordyceps by one-step derivatization followed with gas chromatography-mass

spectrometry”, J Pharm Biomed Anal, vol.49, no. 8, pp. 1172, 2009.

13. JH Xiao, “Current status and ponderation on preparations and chemical structures of

polysaccharide in fungi of Cordyceps (Fr.) Link”, Chin Tradit Herb Drugs, vol.39, no. 60,

pp. 454, 2008.

14. J. Guan and S. P. Li, “Discrimination of polysaccharide from traditional Chinese

medicines using saccharide mapping-Enzymatic digestion followed by chromatographic

analysis”, J. Pharm. Biomed. Anal, vol. 51, no. 3, pp. 590-598, 2010.

15. J. Guan, J. Zhao, K. Feng D. J. Hu and S. P. Li, “Comparision and characterization of

polysaccharides from natural and cultured Cordyceps using saccharide mapping”, Anal.

Bioanal. Chem, vol. 99, no. 10, pp. 3465-3474, 2011.

16. Y. Wu, N. Hu, Y. Pan, L. Zhou and X. Zhou, “Isolation and characterization of a

mannoglucan from edible Cordyceps sinensis mycelium”, Carbohydr. Res, vol. 342, no. 6,

pp. 870-875, 2007.

17. T. Miyazaki, N. Oikawa and H. Yamada, “Studies on Fungal Polysaccharides. XX.

Galactomannan of Cordyceps sinensis”, Chem. Pharm. Bull, vol. 25, no. 12, pp. 3324-3328,

1977.

18. K. D. Shonkor, F. Shinya, M. Mina and S. Akihiko, “Efficient Production of Anticancer

Agent Cordycepin by Repeated Batch Culture of Cordyceps militaris Mutant”, Lecture Notes

17

in Engineering and Computer Science. vol. 38, pp.20-22, 2010.

19. J. Guan, F. Q. Yang and S. P. Li, “ Evaluation of carbohydrates in natural and cultured

Cordyceps by pressurized liquid extraction and gas chromatography coupled with mass

spectrometry”, Molecules, vol. 15, no. 6, pp. 4227-4241, 2010.

20. S.P. Li a, F.Q. Yang a, Karl W.K. Tsim, “Quality control of Cordyceps sinensis, a valued

traditional Chinese medicine”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol.41,

pp.1571–1584, 2006.

21. S Zhong, H Pan, L Fan, Lv G, Y Wu, B Parmeswaran, et al. “Advances in research of

polysaccharides in Cordyceps species”, Food Technol Biotechnol, vol.47, pp. 304-12, 2009.

22. R Singh, PS Negi, Z. Ahmed, “Genetic variability assessment in medicinal caterpillar

fungi Cordyceps spp. (Ascomycetes) in central himalayas”, India. Int J Med Mushrooms.,

vol.9, no. 11, pp. 185, 2009.

23. R. Russell, M. Paterson, “Cordyceps – A traditional Chinese medicine and anotherfungal

18

therapeutic biofactory” Phytochemistry, vol. 69, pp. 1469–1495, 2008.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1.1: Phổ 1H NMR hợp chất CS trong dung môi chloroform-d

Phụ lục 1.2: Phổ 13C NMR hợp chất CS trong dung môi chloroform-d