Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI

AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ

MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh

MSSV: 40201104

Giáo viên hướng dẫn: Ths. Huỳnh Thị Nhàn

Ths. Nguyễn Thị Tuyết Nhung

TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI

AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ

MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh

MSSV: 40201104

Giáo viên hướng dẫn: Ths. Huỳnh Thị Nhàn

Ths. Nguyễn Thị Tuyết Nhung

TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cô

Huỳnh Thị Nhàn vì đã giao cho em đề tài nghiên cứu này. Cảm ơn cô vì đã tận tình

hướng dẫn, hỗ trợ em trong suốt thời gian nghiên cứu.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Ngọc Hưng, thầy Nguyễn

Thành Lộc, thầy Trần Bữu Đăng, cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết, cô Phạm Thị Thảo Uyên

và cô Văn Thị Cẩm Duyên đã giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận.

Và em cũng không quên gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lê Thị Hồng Vân, thầy

Huỳnh Lời, thầy Lê Văn Huấn và Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn

(Sapharcen) – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em được sử dụng

trang thiết bị, máy móc cần thiết phục vụ đề tài này và cũng hết lòng hướng dẫn, giúp

đỡ em.

Cảm ơn gia đình, tất cả bạn bè đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và là chỗ dựa tinh thần,

nguồn động viên cho em trong những lúc khó khăn. Đặc biệt, cảm ơn bạn Nguyễn Thanh

Thơi đã đồng hành cùng em trong quá trình thực hiện đề tài.

Một lần nữa em xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học – trường Đại học Sư

phạm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy em trong bốn năm qua.

Cuối cùng xin cảm ơn tất cả mọi người. Kính chúc thầy cô, tất cả bạn bè và gia

đình thật nhiều sức khỏe.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Phan Thị Ngọc Trinh

XÁC NHẬN CỦA CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

...........................................................................................................................................

Chủ tịch Hội đồng

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3

1.1. Auramine O ......................................................................................................... 3

1.1.1. Khái quát chung .............................................................................................. 3

1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học ................................................................ 3

1.1.3. Độc tính........................................................................................................... 4

1.2. Rhodamine B ....................................................................................................... 4

1.2.1. Khái quát chung .............................................................................................. 4

1.2.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học ................................................................ 4

1.2.3. Độc tính........................................................................................................... 5

1.3. Tình hình nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước .. 5

1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............. 8

1.4.1. Định nghĩa....................................................................................................... 8

1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký ............................................................... 8

1.4.3. Phân loại sắc ký hấp phụ ................................................................................ 9

1.4.4. Một số đại lượng đặc trưng của hệ sắc ký .................................................... 10

1.4.5. Hệ thống HPLC ............................................................................................ 15

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .................................................................................. 18

2.1. Hóa chất và dụng cụ .......................................................................................... 18

2.1.1. Hóa chất ........................................................................................................ 18

2.1.2. Dụng cụ - thiết bị .......................................................................................... 19

2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 20

2.3. Các bước tiến hành sắc ký ................................................................................ 20

2.3.1. Chuẩn bị dung môi ........................................................................................ 20

2.3.2. Chuẩn bị mẫu đo ........................................................................................... 20

2.3.3. Cách vận hành thiết bị .................................................................................. 21

2.4. Khảo sát các điều kiện phân tích sắc ký .......................................................... 22

2.4.1. Khoảng bước sóng của detector .................................................................... 22

2.4.2. Tối ưu hóa pha động ..................................................................................... 22

2.5. Thẩm định phương pháp .................................................................................. 26

2.5.1. Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn .............................................. 26

2.5.2. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)............. 27

2.5.3. Xác định độ lặp lại của phép đo.................................................................... 28

2.6. Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu ..................................................................................... 29

2.6.1. Lấy mẫu ........................................................................................................ 29

2.6.2. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích ............................................................................ 30

2.7. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị ................................................................ 30

2.7.1. Khảo sát giai đoạn chiết pha rắn (SPE) ........................................................ 30

2.7.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết .................................................................. 32

2.7.3. Xác định hệ số thu hồi của quy trình ............................................................ 33

2.7.4. Tính chọn lọc của quy trình .......................................................................... 33

2.8. Phân tích một số mẫu gia vị .............................................................................. 33

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 34

3.1. Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký ................................................................ 34

3.1.1. Chọn khoảng bước sóng cho detector........................................................... 34

3.1.2. Tối ưu hóa pha động ..................................................................................... 34

3.2. Thẩm định phương pháp .................................................................................. 46

3.2.1. Xây dựng đường chuẩn ................................................................................. 46

3.2.3. Xác định LOD, LOQ .................................................................................... 48

3.2.4. Xác định độ lặp lại của phương pháp ........................................................... 50

3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị ................................................................ 50

3.3.1. Khảo sát giai đoạn SPE ................................................................................. 50

3.3.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết .................................................................. 53

3.3.3. Tính chọn lọc của quy trình .......................................................................... 54

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................. 56

4.1. Kết luận .............................................................................................................. 56

4.2. Đề xuất ................................................................................................................ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 58

PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 60

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Một số phương pháp xác định AO và RB ...................................................... 5

Bảng 2.1. Danh mục dung môi ..................................................................................... 18

Bảng 2.2. Danh mục hóa chất ....................................................................................... 18

Bảng 2.3. Danh mục thiết bị và máy móc phục vụ đề tài nghiên cứu .......................... 19

Bảng 2.4. Cách pha các dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn của AO và RB .. 27

Bảng 2.5. Thông tin về các mẫu gia vị phân tích .......................................................... 29

Bảng 3.1. Kết quả bước sóng hấp thụ cực đại, độ hấp thụ quang của AO và RB trong

MeOH và ACN .............................................................................................................. 34

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của CH3COOH đến sự phân tách AO, RB ................................ 37

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của HCOOH đến sự phân tách AO, RB .................................... 38

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của H3PO4 đến sự phân tách AO, RB ........................................ 39

Bảng 3.5. Chương trình gradient pha động khảo sát tốc độ dòng ................................. 40

Bảng 3.6. Khảo sát tỷ lệ dung môi ban đầu .................................................................. 41

Bảng 3.7. Các chương trình sắc ký với đệm acetate (pH = 4,2) ................................... 42

Bảng 3.8. So sánh kết quả khảo sát giữa dung môi MeOH với dung môi ACN .......... 43

Bảng 3.9. Chương trình pha động tối ưu ...................................................................... 45

Bảng 3.10. Giá trị nồng độ và diện tích của peak AO, RB thu được khi tiến hành phân

tích HPLC ...................................................................................................................... 46

Bảng 3.11. Kết quả xác định LOD ................................................................................ 48

Bảng 3.12. Kết quả xác định LOQ ................................................................................ 49

Bảng 3.13. Kết quả độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích peak ............................... 50

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát của giai đoạn SPE ........................................................... 51

Bảng 3.15. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN khảo sát ...................................................... 52

Bảng 3.16. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN và hệ số thu hồi của giai đoạn SPE ............ 52

Bảng 3.17. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ

vị hương lần 1 ................................................................................................................ 53

Bảng 3.18. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ

vị hương lần 2 ................................................................................................................ 54

Bảng 4.1. Thành phần pha động ................................................................................... 56

Bảng 4.2. Phương trình đường chuẩn của AO và RB ................................................... 56

DANH MỤC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của AO .............................................................................. 3

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của RB .............................................................................. 4

Hình 1.3. Sơ đồ sự tương tác trong cột sắc ký ................................................................ 9

Hình 1.4. Thời gian lưu trong HPLC [6] ...................................................................... 10

Hình 1.5. Giản đồ về sự tách hai peak sắc ký A và B [6] ............................................. 14

Hình 1.6. Các thiết bị trong hệ thống HPLC ............................................................... 15

Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn chương trình 5 (MeOH – CH3COOH pH = 3,6) ................ 23

Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn chương trình 6 (ACN – CH3COOH pH = 3,6) .................. 24

Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH từ 3,0 đến 4,5 ................ 25

Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH 2,3 và 2,6 ....................... 25

Hình 2.5. Cách xác định S/N [4] ................................................................................... 27

Hình 2.6. Sơ đồ các giai đoạn chiết pha rắn ................................................................. 30

Hình 2.7. Sơ đồ quy trình chiết mẫu gia vị ................................................................... 32

Hình 3.1. Sắc đồ của chương trình 5 ............................................................................ 35

Hình 3.2. Sắc đồ của chương trình 6 ............................................................................ 35

Hình 3.3. Sắc đồ của chương trình 7 ............................................................................ 36

Hình 3.4. Sắc đồ của chương trình 8 ............................................................................ 36

Hình 3.5. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acetic acid (pH = 3,0) ............................ 37

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số không đối xứng T theo pH ........... 38

Hình 3.7. Sắc đồ khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid formic (pH = 3,0) ................ 38

Hình 3.8. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid phosphoric 0,03% .......................... 39

Hình 3.9. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,6 mL/phút ......................... 40

Hình 3.10. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút ....................... 40

Hình 3.11. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,85 mL/phút ..................... 40

Hình 3.12. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 1,0 mL/phút ....................... 41

Hình 3.13. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn AO .................. 47

Hình 3.14. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn RB................... 47

Hình 3.15. Sắc đồ xác định LOD của AO và RB ......................................................... 48

Hình 3.16. Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB ......................................................... 49

Hình 3.17. Độ tinh khiết của peak AO, RB xác định bằng phần mềm ......................... 55

Hình 3.18. Sắc đồ chuẩn AO 0,03 ppm và RB 0,02 ppm trong nền mẫu ngũ vị hương

....................................................................................................................................... 55

Hình 4.1. Sơ đồ giai đoạn SPE tối ưu ........................................................................... 57

KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Viết đầy đủ Tiếng Việt (Tiếng Anh) Viết tắt

Acetonitrile ACN

Auramine O AO

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association AOAC

Official Analytical Chemists)

Nồng độ (Concentration) C

Chất phân tích CPT

Ethanol EtOH

Chiều cao peak sắc ký H

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid HPLC

Chromatography)

IARC Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới (International Agency

for Research on Cancer)

Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography) LC

Nồng độ hóa chất cho các thí nghiệm hít phải trong không khí LC50

có thể tiêu diệt 50% các động vật thử nghiệm trong một thời

gian nhất định (Lethal Concentration, 50%)

Lượng chất độc hoặc phóng xạ cần thiết để tiêu diệt 50% số LD50

lượng sinh vật thử nghiệm sau một khoảng thời gian nhất định

(Lethal Dose, 50%)

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOD

Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) LOQ

Methanol MeOH

Pha động (Mobile Phase) MP

Phổ khối lượng (Mass Spectrometry) MS

PAD, DAD Detector mảng diot quang (Photo Array Diode Detector)

Mảng diot quang (Photo Diode Array) PDA

Một phần triệu (Parts Per Milion) ppm

Rhodamine B RB

Pha đảo (Reversed Phase) RP

Diện tích peak sắc ký Speak

Pha tĩnh (Stationary Phase) SP

Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction) SPE

Số thứ tự STT

Thời gian lưu (Retention Time) tR

Tỷ lệ về thể tích v:v

UV/Vis Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet Visible)

MỞ ĐẦU

Nhằm đáp ứng nhu cầu đời sống ngày càng cao của con người thì công nghiệp thực

phẩm ngày càng phát triển nhanh. Trong những năm gần đây, vệ sinh an toàn thực phẩm

là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Việc sử dụng các chất phụ gia trong sản xuất và bảo

quản gia vị đang ngày càng được coi trọng.

Để tạo màu sắc đẹp và bắt mắt cho gia vị thì trong quá trình sản xuất, một số cơ sở

sản xuất sử dụng thêm các phẩm màu công nghiệp cho vào gia vị. Điều này khiến người

tiêu dùng đang bị đánh lừa bởi vẻ ngoài của các sản phẩm gia vị đang được bày bán trên

thị trường. Trong số các phẩm màu công nghiệp này, phải kể đến Auramine O (AO) và

Rhodamine B (RB), hai phẩm màu công nghiệp bị cấm sử dụng trong thực phẩm, gia vị

và được xếp vào nhóm chất có khả năng gây ung thư. Hiện nay, AO và RB chỉ còn sản

xuất ở các nước châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ,…).

Trong một vài năm trở lại đây, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt Nam nổi

cộm với vấn đề bột gia vị, thực phẩm nhiễm phẩm màu độc hại. Cụ thể, AO từng bị phát

hiện trong một số loại thực phẩm như thịt gà, măng chua, dưa cải chua; RB cũng bị phát

hiện trong hạt dưa, ớt bột,… Mặc dù, AO và RB là hai chất cấm sử dụng trong thực

phẩm, gia vị nhưng vẫn được thêm vào, điều này thật đáng lo ngại.

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các phòng kiểm nghiệm

đã được trang bị các kỹ thuật hiện đại để phân tích và xác định hàm lượng của các phẩm

màu công nghiệp đã sử dụng trái phép trong sản xuất, nhằm kiểm soát chất lượng thực

phẩm. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong số những phương pháp được sử

dụng nhiều hiện nay. HPLC có nhiều ưu điểm như: phân tích nhanh chóng, xác định

đồng thời được nhiều chất, ít tốn mẫu, thao tác đơn giản… Tại Việt Nam, trong những

năm gần đây, đã có những công trình nghiên cứu xác định RB trong thực phẩm, gia vị

bằng phương pháp HPLC [1],[8]; xác định AO trong thức ăn chăn nuôi bằng phương

pháp HPLC [5]. Qua đó, chúng tôi thấy rằng chưa có những nghiên cứu về quy trình xác

định đồng thời AO và RB trong bột gia vị.

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu quy

trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu gia vị

bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến” với mong muốn

đề xuất quy trình phân tích hiệu quả, phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng thí

nghiệm với hai mục tiêu:

- Xây dựng được quy trình xác định đồng thời AO và RB bằng phương pháp HPLC

kết nối detector tử ngoại khả kiến.

- Áp dụng quy trình này để xác định đồng thời AO và RB trong mẫu gia vị.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Auramine O

1.1.1. Khái quát chung

Auramine O (dạng muối hydrochloride) thuộc nhóm thuốc nhuộm

diphenylmethane [22]. AO được sử dụng làm chất nhuộm màu cho giấy và mực, ở mức

độ thấp hơn đối với hàng dệt và da. AO đã được phát hiện trong các mẫu thực phẩm từ

Ấn Độ, bao gồm cả đậu Hà Lan tươi và các sản phẩm đậu ở Trung Quốc. Việc sản xuất

AO bị cấm ở Châu Âu và Hoa Kỳ, hiện nay chủ yếu sản xuất ở Ấn Độ và Trung Quốc

[19]. Bên cạnh đó, AO không có trong danh sách phụ gia thực phẩm trong quy chuẩn

Việt Nam.

AO thường chứa dextrin hoặc các chất pha loãng khác được thêm vào để chuẩn

hóa hàm lượng thuốc nhuộm. AO được sử dụng như là nguyên liệu tạo màu vàng, kết

hợp với các thuốc nhuộm khác, nó tạo ra hoặc tăng cường màu xanh hoặc đỏ. Năng suất

lượng tử của thuốc nhuộm huỳnh quang này phụ thuộc vào độ nhớt của dung môi; trong

ethanol 95% hoặc saccarose 60% thì cao gấp 87 và 10 lần so với trong nước. Ngoài ra

AO còn được dùng làm chất nhuộm màu huỳnh quang, khi kết hợp với thuốc nhuộm RB

làm cho các vi sinh vật kháng acid phát huỳnh quang [23].

1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của AO

- Công thức phân tử: C17H21N3 HCl. Khối lượng mol phân tử: 303,834 g/mol

- Danh pháp: 4,4'-Carbonimidoylbis [N, N-dimethylbenzenamine] hydrochlorid

- Tên gọi khác: Auramine O, Basic Yellow 2, Vàng ô

- AO dạng tinh khiết là chất bột màu vàng. Tan trong nước và EtOH, tan rất ít trong

xylene [22] (10 mg/mL trong nước; 20 mg/mL trong EtOH; 60 mg/mL trong ethylene

glycol methyl ether [19]). AO nóng chảy ở trên 250 °C. Bước sóng hấp thụ cực đại là

370 nm, 432 nm. Bước sóng phát xạ cực đại là 550 nm. pKa: 9,8 ; 10,7 [22]

1.1.3. Độc tính

Một nghiên cứu ở Anh đã báo cáo ca lâm sàng ung thư bàng quang ở công nhân

làm việc trong ngành công nghiệp sản xuất AO [19]. Các nhà khoa học cũng đã tiến

hành nhiều nghiên cứu thử nghiệm tác hại của AO trên động vật. Kết quả cho thấy, AO

làm tổn thương ADN trên gan, thận, tuỷ xương của chuột nhắt và chuột cống với liều

LD50 là 135 mg/kg, gây chết hoặc làm xuất hiện các khối u lympho trên chuột. Tổ chức

nghiên cứu ung thư thế giới IARC đã xếp AO vào nhóm 2B là nhóm các chất hoặc hỗn

hợp có thể gây ung thư cho người [19].

1.2. Rhodamine B

1.2.1. Khái quát chung

Rhodamine B thuộc nhóm thuốc nhuộm xanthene. RB được sử dụng làm thuốc

nhuộm cho giấy, len, lụa và mỹ phẩm [24]. Ngoài ra RB còn được sử dụng trong sinh

học như là chất nhuộm phát huỳnh quang, thường được kết hợp với AO trong phép

nhuộm Auramine - Rhodamine để phát hiện trực khuẩn lao, Mycobacterium tuberculosis

(MTB) [13].

1.2.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của RB

- Công thức phân tử: C28H31ClN2O3. Khối lượng mol phân tử: 479,02 g/mol

- Danh pháp:

9-(2-carboxyphenyl)-6-(diethylamino)-N,N-diethyl-3H-xanthen-3-iminium

- Tên gọi khác: Rhodamine B; Brilliant Pink B; Basic Violet 10; Tetraethylrhodamine

- RB là tinh thể màu tối có ánh xanh, ở dạng bột màu nâu đỏ. Tan tốt trong MeOH,

EtOH, nước (khoảng 50 g/L). Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 199°C đến 201°C. Bước

sóng hấp thụ cực đại:  = 542 – 554 nm [3]. pKa: 3,1; 3,25 [4]

1.2.3. Độc tính

RB gây độc tính cấp theo đường miệng, số liệu thống kê cho biết LD50 ở chuột là

lớn hơn 2000 mg/kg. Kích thích và gây tổn thương mắt nghiêm trọng khi thử nghiệm

với thỏ. Khi RB kết hợp với hemoglobin trong máu hình thành methemoglobin sẽ gây

các triệu chứng như: đau đầu, loạn nhịp tim, giảm huyết áp, khó thở và co thắt. Nếu tích

tụ trong thời gian dài còn gây hại cho thủy sinh vật. Chẳng hạn, LC50 thử nghiệm với

Gambusia affinis (cá muỗi) là 10 – 100 mg/L trong 96 giờ [2].

1.3. Tình hình nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước

Bảng 1.1. Một số phương pháp xác định AO và RB

CPT, nền

Đánh giá

Xử lý mẫu

Phương pháp

mẫu

phương pháp

Trong nước

trong

- Dung môi chiết:

HPLC – MS/MS

- Khoảng

tuyến

thức ăn chăn

MeOH

- Cột Agilent C18 (1,8 µm x 2,1

tính: 0,5 – 50

nuôi [5]

- Giai đoạn SPE:

mm x 50 mm) và tiền cột tương

ng/mL

cột C18

ứng

- LOD: 8 µg/kg

- Pha động: gradient hai kênh,

- LOQ: 20 µg/kg

 Rửa

tạp bằng

ACN (A) và HCOOH 0,1% (B)

- Hệ số thu hồi:

dung môi MeOH :

82,4 – 109,2%

H2O (20:80, v:v)

 Rửa giải bằng

dung môi MeOH

trong

- Dung môi chiết:

LC – MS/MS

- LOD: 3,0 µg/kg

mẫu thịt và

ACN

- Cột sắc ký pha đảo C18 (1,8 µm

(mẫu

thịt); 5,0

các mẫu thực

x 2,1 mm x 100 mm)

µg/kg (mẫu thực

phẩm

khác

- Pha động: gradient hai kênh,

phẩm khác)

[10]

dung dịch ammonium acetate

0,005 M (A) và MeOH (B)

RB trong bột

- Dung môi chiết:

HPLC – UV/Vis

- LOD: 0,2 ppm

gia vị [1]

hỗn hợp ACN

- Cột sắc ký: Symmetry C18 (5

- LOQ: 0,6 ppm

acetone (90:10, v:v)

- Hệ số thu hồi:

m x 4,6 mm x 150 mm)

84,8 – 87,2 %

- Pha động: ACN : ammonium

acetate (60:40, v:v)

RB trong gia

- Dung môi chiết:

HPLC – UV/Vis hoặc HPLC –

vị và hạt dưa

MeOH

DAD

[12]

- Cột phân tích HPLC C18 (5 µm

x 4,6 mm x 250 mm)

- Pha động: đẳng dòng, ACN:

H2O (75:25, v:v)

RB trong hạt

- Dung môi chiết:

HPLC – UV/Vis

Theo

phương

dưa, bánh xu

hỗn hợp MeOH :

pháp phân

tích

- Pha tĩnh: RP – C8 (5 m x 4,6

xê, sirô dâu,

trực tiếp:

H2O (40:60, v:v)

150

mm)

nước

ngọt

- LOD: 1,00 ppb

- Pha động: đẳng dòng, 85%

hương dâu [8]

- LOQ: 3,33 ppb

ACN – 15% đệm (HCOOH –

Theo

phương

0,007 mM

sodium

–

pháp

đường

heptansunfonate), pH = 3,0

chuẩn:

- LOD: 15,0 ppb

- LOQ: 50,2 ppb

RB trong bột

- Dung môi chiết:

HPLC – UV/Vis

- Khoảng

tuyến

ớt [18]

hỗn hợp ACN

- Cột: Waters Novapark ODS (4

tính: 0,2 – 50 ppm

acetone (90:10, v:v)

μm x 3,9 mm x 150 mm) với cột

- Hệ số thu hồi: 84

bảo vệ

– 92%

- Pha động: gradient hai kênh, 10

mM ammonium acetate, pH = 3,6

(A) và ACN (B)

Auramine và

- Dung môi chiết:

HPLC – UV/Vis

- Khoảng

tuyến

trong

10 mL 5% amonia

- Côt: µ-Bondapak C18 (3,9 mm

tính: 0,2 – 25 ppm

bánh quy, kẹo

trong 75% MeOH

x 300 mm) với tiền cột 90 mm

(Auramine); 0,2 –

ngọt [15]

- Giai đoạn SPE:

50 ppm (RB)

cột Polyamide

Ngoài nước

- Pha động: ACN – sodium

 Rửa tạp: H2O

acetate (20 mM, pH = 4,0; 80:20,

- LOD:

 Rửa giải: 3%

v:v)

0,107 – 0,754

acetic

acid

mg/L

MeOH (1:1, v:v)

- LOQ: 0,371 –

2,27 mg/L

- Hệ số thu hồi: 75

– 96,5%

AO và RB

- Dung môi chiết:

HPLC – MS/MS

- LOD: 0,05 μg/kg

trong bột ớt,

- Cột XTerra C18 RP (5 µm x 2,1

- LOQ: 0,3 μg/kg

hỗn hợp ACN : H2O

tương ớt, xúc

(90:10, v:v)

mm x 150 mm)

xích [16]

- Pha động: gradient hai kênh, 5

mM ammonium acetate, pH = 3,0

(A), MeOH (B)

AO và RB

- Dung môi chiết:

HPLC – MS/MS

- LOD: 0,03 –

trong các sản

ACN

- Cột: Waters XTerra C18 (5 µm

0,75 ppm

phẩm từ đậu

- Giai đoạn SPE:

x 2,1 mm × 150 mm)

- LOQ: 0,1 – 2,0

và thịt [17]

- Pha động: gradient hai, 5 mM

ppm

 Pha

loãng dịch

ammonium acetate, pH = 3,0 (A)

- Hệ số thu hồi:

chiết bằng nước

và MeOH (B)

71,2 – 116,9%

đến còn không

quá 5% ACN

 Rửa giải: MeOH

 Cô dịch

chiết

bằng khí nitơ.

Phần còn lại tái

tạo với ACN

AO, RB trong

- Dung môi chiết:

HPLC – UV/Vis

- Hệ số thu hồi:

gia vị và thực

hỗn hợp ACN

- Cột Waters C18 (5 µm x 4,6 mm

73,1 – 103,3%

phẩm [21]

acetone (90:10, v:v)

x 250 mm)

(AO)

- Pha động: gradient hai kênh, 10

mM ammonium acetate, pH = 3,0

(A) và ACN, pH = 3,0 (B)

1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là sắc ký lỏng

cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp này ra đời năm 1967 –

1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển.

Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự

phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích cũng là phương pháp được ứng

dụng trong nhiều ngành kiểm nghiệm [7].

1.4.1. Định nghĩa

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử CPT lên hai

pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu CPT gọi là pha tĩnh, một pha di

chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử CPT có ái lực khác nhau với pha

tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [4].

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách và phân tích các

chất với pha động là chất lỏng, làm việc với áp suất từ 150 – 250 bar. Trong đó, pha tĩnh

có thể là chất lỏng (nó được giữ trong cột tách như một lớp màng nhờ một chất mang

trơ) hoặc là chất rắn. Cùng với pha tĩnh, trong kỹ thuật HPLC, pha động có thể chỉ là

một dung môi nước hay dung môi hữu cơ; hỗn hợp của dung môi hữu cơ và nước…

hoặc cũng có thể là dung môi có thêm các chất đệm, chất dẫn điện, chất tạo phức, …[6]

Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc ký cột

lỏng hiệu năng cao [6].

Trong kỹ thuật phân tích HPLC, tùy theo cơ chế của quá trình sắc ký trong cột tách

mà người ta chia thành: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký rây

phân tử [6].

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất

thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm,

dược phẩm, môi trường…

1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại

sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ. Nếu pha tĩnh là chất trao

đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố

hay sắc ký chiết. Nếu pha tĩnh là rây phân tử thì ta có sắc ký rây phân tử. Để rửa giải

CPT ra khỏi cột tách, cần một dung môi rửa giải, đó là pha động [6].

Với ba thành phần chính của hệ sắc ký: pha tĩnh, pha động, CPT; hiệu quả của sự

tách sắc ký được quyết định bởi tổng của các mối tương tác: giữa CPT và pha tĩnh (F1),

giữa CPT và pha động (F2), giữa pha tĩnh và pha động (F3) [6].

Hình 1.3. Sơ đồ sự tương tác trong hệ sắc ký

Tổng của ba lực tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột

trước. Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được xác định bởi ba lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng. Ở đây, F1 là lực giữ CPT trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với CPT ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Còn thành phần F3 trong một hệ sắc ký có thành phần pha động

và các điều kiện khác là không đổi thì F3 của các chất hầu như không khác nhau. Vì vậy,

trong một hệ sắc ký, nếu các CPT có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh thì có

khả năng các CPT sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và sẽ có sự tách các CPT

khỏi nhau khi đi qua cột [6].

1.4.3. Phân loại sắc ký hấp phụ

Trong sắc ký hấp phụ, quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau

của pha tĩnh đối với các CPT và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo CPT ra

khỏi cột. Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Có

hai kiểu hấp phụ:

- Sắc ký hấp phụ pha thường (Normal Phase): pha tĩnh phân cực, pha động không

phân cực;

- Sắc ký hấp phụ pha đảo (Reversed Phase): pha tĩnh ít hay không phân cực, pha

động phân cực.

Sắc ký hấp phụ được áp dụng rộng rãi, thành công để tách hỗn hợp các chất có

tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình.

Hiện nay, chúng ta sử dụng loại sắc ký hấp phụ pha đảo là chủ yếu.

1.4.4. Một số đại lượng đặc trưng của hệ sắc ký

1.4.4.1. Thời gian lưu tR, thời gian lưu thực

Các CPT trong hỗn hợp mẫu, khi được nạp vào cột sắc ký sẽ bị lưu giữ ở trong cột

tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Thời gian lưu là thời gian tính từ lúc

bắt đầu bơm mẫu vào cột cho tới khi peak đạt giá trị cực đại. Như vậy nếu gọi tRi là thời

gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có:

(1.1) tRi = to +

Trong đó:

là thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc ký (thời gian lưu hiệu chỉnh).

to là thời gian không lưu giữ (thời gian CPT nằm trong pha động)

: trường hợp này chỉ có khi tRi là rất nhỏ (thường là khi tRi

Nếu to = 0 thì ta sẽ có tRi = nhỏ hơn 4 phút) [6].

Hình 1.4. Thời gian lưu trong HPLC [6]

của một CPT trong quá trình sắc ký phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ví dụ

Giá trị

như:

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp;

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động;

- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế;

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độ chất

tạo phức nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc

ký. Trong sắc ký, các chất ion thì yếu tố này thể hiện rõ nét.

có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc ký. Vì nó cho biết các CPT trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nào trong các điều kiện

Giá trị thời gian lưu

thí nghiệm và một hệ pha đã chọn. Đồng thời, đó cũng là đại lượng để chúng ta phát

hiện định tính một chất.

Trong một phép phân tích, nếu nhỏ quá thì sự tách kém, ngược lại nếu quá

lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại thấp, thời gian phân tích dài. Điều này kéo theo nhiều

vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Để

thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố đã trình bày ở trên.

(1.2)

(1.3)

Mặt khác, trong một hệ sắc ký còn có:

) (1.4) tRi = to ( 1 +

là hệ Trong đó ui và uo là tốc độ tuyến tính của CPT i và của pha động (cm/s);

số dung lượng của CPT i; L là chiều dài của cột sắc ký [6].

1.4.4.2. Hệ số phân bố Ki và hệ số dung lượng

Quá trình tách sắc ký của các chất dựa trên cơ sở sự phân bố của CPT giữa pha

động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong hệ sắc ký. Sự phân bố này được đặc trưng bởi một

đại lượng gọi là hệ số phân bố Ki của chất i. Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng độ

của CPT i ở trong pha tĩnh và pha động:

(1.5)

Trong đó, Ci(SP) và Ci(MP) là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và pha động. Hệ

số Ki cho biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha

tĩnh).

Hệ số phân bố Ki chưa nói lên được sức chứa của cột tách vì thế, người ta phải đưa

thêm vào hệ số dung lượng . Hệ số dung lượng cho ta biết tỷ số khối lượng của

CPT i phân bố vào trong mỗi pha là bao nhiêu, ta có:

(1.6)

Trong đó, mi(SP) và mi(MP) là khối lượng CPT i trong pha tĩnh và trong pha động.

Mối quan hệ giữa hệ số dung lượng và hệ số phân bố Ki thể hiện qua phương

trình sau:

(1.7)

Với Vi(SP) và Vi(MP) là thể tích của CPT i trong pha tĩnh và trong pha động.

1.4.4.3. Hệ số tách

Hệ số tách α (hay còn gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B) là đại

lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ

số phân bố và là tỷ số của hệ số phân bố của hai chất [6].

(1.8)

Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α ≠ 1.

1.4.4.4. Số đĩa lý thuyết

Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký, người ta dùng khái niệm

số đĩa lý thuyết N. Đây là một đại lượng hình thức, có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc ký

như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) đĩa lý thuyết là H. Tất nhiên đây là lớp

có tính chất động, và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như:

- Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh;

- Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh;

- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (CPT);

- Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc ký;

- Độ nhớt của pha động.

Vì thế với một hệ nhất định và trong những điều kiện sắc ký đã chọn, thì chiều cao

đĩa lý thuyết H có những giá trị xác định ứng với các CPT khác nhau. Chiều cao đĩa lý

thuyết H và số đĩa lý thuyết N được xác định theo công thức:

(1.9)

(1.10)

Trong đó, Wi là chiều rộng đáy peak sắc ký của CPT i.

Trong thực tế, số đĩa lý thuyết hiệu dụng Nef và chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng

Hef của một cột sắc ký mới là đại lượng giúp ta đánh giá đúng khả năng của một cột tách

và hiệu quả của nó là như thế nào, tốt hay không tốt trong mỗi trường hợp cụ thể.

(1.11)

(1.12)

Nếu giá trị Nef quá nhỏ thì không có sự tách tốt của các chất, hoặc sự tách không

hoàn toàn. Nếu Nef quá lớn thì cũng không cần thiết, vì khi đó peak sắc ký của các chất

tách xa nhau quá và việc rửa giải là tốn nhiều pha động. Trong thực tế, Nef nằm trong

khoảng 5000 đến 8000 là vừa đủ [6].

1.4.4.5. Độ phân giải R

Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc ký. Hai

cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao. Độ phân giải

của hai peak cạnh nhau được tính theo công thức sau:

(1.13)

Trong đó, WA và WB là bề rộng đáy của peak sắc ký của hai chất A và B.

Nếu R càng lớn, hai chất A và B càng tách ra xa nhau, khi này giữa hai peak sẽ có

một đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của biểu đồ sắc ký. Song nếu đoạn

đường nền này dài quá thì cũng không cần thiết, vì như thế ta tốn nhiều dung môi (pha

động) để rửa giải các chất hơn. Do đó, giá trị R chỉ vừa đủ để hai chất tách khỏi nhau là

được.

a) b ) c)

Hình 1.4. Giản đồ về sự tách hai peak sắc ký A và B [6]

a) Tối thiểu để có sự tách.

b) Đủ để hai chất tách khỏi nhau.

c) Hai chất tách xa hẳn nhau.

Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách nhau

là R = 1,0. Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp.

1.4.4.6. Hệ số không đối xứng

Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của peak trên sắc ký đồ

thu được. T được tính theo công thức sau đây:

(1.13)

Trong đó, a và b là bề rộng ở bên phải và bên trái peak sắc ký ở chiều cao 10% so

với chiều cao cực đại của peak sắc ký. Nếu tỷ số này nằm trong vùng từ khoảng 0,90

đến 1,10 thì cột đã nạp dùng được [6].

1.4.5. Hệ thống HPLC

(5)

(6)

Hình 1.5. Các thiết bị trong hệ thống HPLC

Trong đó:

1 – Bình chứa dung môi pha động

2 – Bộ phận khử khí

3 – Bơm cao áp

4 – Bộ phận tiêm mẫu

5 – Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt

6 – Đầu dò (nhận tín hiệu)

7 – Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và

điều khiển toàn bộ hệ thống

8 – Thiết bị in dữ liệu

1.4.5.1. Bình đựng dung môi

Hiện nay, máy HPLC thường có bốn kênh dung môi nối vào đầu bơm cao áp, cho

phép chúng ta sử dụng bốn bình chứa dung môi cùng lúc để rửa giải theo tỷ lệ mong

muốn và tổng tỷ lệ dung môi của bốn đường là 100%.

Tuy nhiên theo kinh nghiệm, chúng ta ít khi sử dụng bốn đường dung môi cùng

một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa cùng một lúc là hai hoặc ba đường. Khi đó, hệ

pha động luôn được pha trộn đồng nhất để quá trình rửa giải được ổn định.

1.4.5.2. Bộ phận khử khí

Mục đích sử dụng bộ khử khí là loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha

động. Nếu như trong quá trình phân tích mà pha động còn sót các bọt khí thì kết quả

phân tích sẽ bị ảnh hưởng, cụ thể như sau:

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi đưa vào hệ không đúng với lý thuyết sẽ

làm cho thời gian lưu của peak thay đổi;

- Trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm

sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt

động.

1.4.5.3. Bơm cao áp

Đây là bộ phận có nhiệm vụ bơm pha động vào cột tách thực hiện quá trình sắc ký

theo một chương trình phù hợp. Bơm phải tạo được áp suất khoảng 150 – 250 bar và

bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 mL/phút. Hiện nay đã có

nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar. Hiện tại bơm có hai pistone để thay

phiên nhau đẩy dung môi liên tục.

1.4.5.4. Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với thể

tích của vòng mẫu là 5 – 100 . Có hai cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ

công (tiêm bằng syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler).

1.4.5.5. Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Các

kết quả thực nghiệm về HPLC đều chỉ ra rằng, các hạt pha tĩnh có đường kính nhỏ và

đồng đều luôn cho hiệu quả tách sắc ký cao và ổn định. Chính vì thế mà hiện nay, hầu

hết người ta chỉ dùng hạt pha tĩnh có đường kính nhỏ hơn 10 µm, phổ biến là đường

kính hạt từ 5 – 7 µm cho mục đích phân tích và từ 15 – 25 µm cho mục đích sản xuất

(sắc ký điều chế) [6]. Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ

cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt.

1.4.5.6. Đầu dò

Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi

cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo

tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải

thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của CPT.

A = k.C (1.14)

Trong đó: A là cường độ tín hiệu đo được

C là nồng độ CPT

k là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn

Hiện nay, người ta chế tạo các loại detector khác nhau cho kỹ thuật HPLC, cụ thể

đã có các loại:

- Detector phổ hấp thụ phân tử (UV, UV/Vis hay PDA);

- Detector phổ huỳnh quang;

- Detector phổ phát xạ nguyên tử;

- Detector phổ hấp thụ nguyên tử;

- Detector khối phổ;

- Detector điện hóa đo dòng và cực phổ;

- Detector đo chiết suất;

- Detector đo độ dẫn điện;

- Detector đo hiệu ứng nhiệt [6]

1.4.5.7. Bộ phận ghi tín hiệu

Bộ phận này được dùng để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Trong

các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện

tích của peak, chiều cao, … Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính

có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, độ

phân giải, ... đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng

như: nồng độ, RSD%….

1.4.5.8. Thiết bị in dữ liệu

Sau khi đã phân tích xong các mẫu, người phân tích có thể in kết quả do phần mềm

tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ.

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM

2.1. Hóa chất và dụng cụ

2.1.1. Hóa chất

2.1.1.1. Chất chuẩn

, Sigma-Aldrich USA.

- Auramine O: dạng rắn, độ tinh khiết

, Sigma-Aldrich India.

- Rhodamine B: dạng rắn, độ tinh khiết

Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm được chuẩn bị từ việc cân chính xác lượng chất

chuẩn và hòa tan trong MeOH tinh khiết, được bảo quản trong tủ lạnh. Các dung dịch

chuẩn làm việc được pha loãng bằng MeOH từ dung dịch chuẩn gốc.

2.1.1.2. Dung môi – hóa chất

Bảng 2.1. Danh mục dung môi

Hàm lượng Tên dung Nhà sản xuất Tiêu chuẩn STT nguyên trạng (%) môi

Merk KGaA - Đức Dùng cho 1 Methanol Lapscan HPLC

Dùng cho 2 Acetonitrile Merk KGaA - Đức HPLC

Bảng 2.2. Danh mục hóa chất

Hàm lượng STT Tên hóa chất Nhà sản xuất Tiêu chuẩn nguyên trạng (%)

1 Acid acetic Merck KGaA - Đức Dùng cho 100%

(băng) HPLC

2 Acid formic Scharlau, Scharlab Dùng cho 98-100%

S.L – Spain HPLC

3 Acid Scharlau, Scharlab Dùng cho 85%

phosphoric S.L – Spain HPLC

4 Acetone Merck KGaA - Đức Dùng cho -

HPLC

5 Ammonia Guangdong Dùng cho 25-28%

Guanghua Sci-Tech phân tích

Co., Ltd

2.1.2. Dụng cụ - thiết bị

2.1.2.1. Thiết bị

Bảng 2.3. Danh mục thiết bị và máy móc phục vụ đề tài nghiên cứu

STT Loại thiết bị Hãng sản xuất Tên thiết bị

Separations Hệ HPLC / PDA 2996 Waters 1 Module 2695

ZORBAX Agilent – USA Cột sắc ký Eclipse XDB- 2 5 μm x 4,6 mm x 250 mm C18

Eclipse XDB- Agilent – USA Cột bảo vệ 3 C18 4-Pack

Waters Oasis HLB Cột chiết pha rắn 600 mg 4 Agilent C18

Máy deion Water Pro PS LABCONCO 5

S100H Máy siêu âm Elma – Germany 6 Elmasonic

DNA miVac, Genevac Ltd. Ipswich Máy ly tâm 7 England concentrator

Lambda 25

Máy đo quang UV/Vis Perkin Elmer 8

Spectrometor

Tủ sấy WTB binder - 9

12 – Port

Vacuum Bộ chiết pha rắn Agilent 10

Manifold

2.1.2.2. Một số dụng cụ khác

- Bình định mức, pipet, cốc thủy tinh các loại

- Micropipet: 10-100 , 100-1000 , 1000-5000

- Vial (1,5 mL, 10 mL); ống ly tâm (50 mL); phễu chiết (250 mL).

- Ống nhỏ giọt, bình tia, giấy parafin, giấy nhôm, màng bọc thực phẩm, đầu lọc

0,2 µm PTFE, rây tiêu chuẩn Ø = 200 mm đường kính lỗ 0,5 mm.

2.2. Nội dung nghiên cứu

Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

- Tối ưu hoá các thông số trong chương trình sắc ký để phân tách chất chuẩn AO

và RB trên hệ thống HPLC;

- Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị nhằm đem lại hiệu quả chiết tách, làm sạch

và làm giàu mẫu tốt nhất;

- Sử dụng quy trình phân tích AO và RB trong một số mẫu gia vị.

2.3. Các bước tiến hành sắc ký

2.3.1. Chuẩn bị dung môi

Các dung môi là loại tinh khiết dành cho HPLC. Các hóa chất dùng cũng phải là

loại tinh khiết phân tích.

- Kiểm tra các chai đựng dung môi và các chai đựng dung môi để rửa: kênh A

(MeOH), kênh B (H2O), kênh C (ACN), kênh D (dung dịch acid hay đệm, hoặc là hỗn

hợp dung môi), chai rửa kim (MeOH) và chai rửa seal (MeOH 10 - 20%).

- Lọc tất cả dung môi sử dụng màng lọc cellulose acetate hoặc cellulose nitrate

0,45 (tốt nhất là 0,2 ). Nếu là hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước (hoặc dung

dịch đệm) thì lọc qua màng lọc polyamide hay nilon. Dung môi hữu cơ thì lọc qua màng

lọc teflon, riêng ACN và MeOH nguyên chai không cần lọc.

- Siêu âm tất cả các bình dung môi ở các kênh A, B, C, D để đuổi khí trong khoảng

10 - 15 phút cho mỗi bình, khi siêu âm phải mở nắp bình. Sau đó, đặt các bình đúng vị

trí quy định và để các đầu lọc luôn cắm ngập trong dung môi.

2.3.2. Chuẩn bị mẫu đo

Mẫu chuẩn: pha dung dịch chuẩn có thành phần CPT giống như mẫu thử trong

cùng dung môi. Nồng độ các thành phần CPT trong dung dịch chuẩn tương đương như

mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng

tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.

Mẫu thử: xử lý mẫu thử theo đúng quy trình đã khảo sát và tối ưu hóa. Đảm bảo

các yêu cầu sau:

- Dung môi hòa tan CPT phải tương thích với pha động, trong nhiều trường hợp

dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu;

- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng

cách lọc hay chiết …;

- Phải lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm;

- Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Nồng độ

CPT cao quá có thể gây ra nghẽn cột.

2.3.3. Cách vận hành thiết bị

Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất và phần mềm

điều khiển hệ thống sắc ký HPLC. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo trình tự sau:

1) Kiểm tra hệ thống: nguồn điện, hệ thống bơm, hệ thống đầu dò, kết nối LC –

PDA, buồng chứa cột tách.

2) Chuẩn bị: dung môi, mẫu phân tích.

3) Khởi động thiết bị

- Khởi động hệ thống bơm: bật chế độ đuổi khí, thực hiện chế độ đuổi khí, rửa kim,

cân bằng cột.

- Khởi động máy tính.

- Khởi động đầu dò, để kéo dài thời gian sử dụng đầu dò, nên bật công tắc sử dụng

đầu dò sau khi hoàn tất việc khử khí và cân bằng cột.

4) Khởi động chương trình

- Tạo một “Method” để sử dụng.

- Thiết lập thông số sắc ký: tỷ lệ dung môi pha động, bước sóng khảo sát, thành

phần mẫu, các thông số khác của quá trình phân tích yêu cầu.

5) Tiến hành phân tích

6) Rửa hệ thống

Đặc biệt cột sắc ký phải được rửa theo quy định sau mỗi lần chạy sắc ký.

Ví dụ: - Sắc ký pha thường: rửa bằng MeOH; không rửa bằng nước.

- Sắc ký pha đảo: khi chạy pha động thành phần chứa muối thì phải rửa

nước trước cho sạch.

7) Xử lý kết quả

8) Tắt hệ thống

9) Ghi nhật ký sử dụng máy

2.4. Khảo sát các điều kiện phân tích sắc ký

2.4.1. Khoảng bước sóng của detector

Phương pháp nghiên cứu được lựa chọn là sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối

detector PDA, vì thế việc xác định khoảng bước sóng của detector là cần thiết. Trước

khi tiến hành định tính và định lượng AO và RB trên máy HPLC thì phải xác định được

bước sóng ứng với cực đại hấp thụ của AO và RB. Dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ

quang phân tử của chất trong dung dịch để xác định bước sóng ứng với cực đại hấp thụ.

AO và RB là các hợp chất có màu, nên có thể tiến hành khảo sát phổ hấp thụ

quang trong vùng khả kiến trên máy Lambda 25 UV/Vis Spectrometor ở phòng Phân

tích Trung tâm 1. Dung dịch đo là chuẩn đơn AO, chuẩn đơn RB và chuẩn hỗn hợp (AO

và RB) với:

Nồng độ CPT 2,0 ppm đối với mỗi chất

Dung môi 100% MeOH; 100% ACN

Khoảng quét phổ 300 – 600 nm

2.4.2. Tối ưu hóa pha động

Pha động là một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả tách trong kỹ thuật

phân tích HPLC. Để tìm được điều kiện tối ưu cho pha động, chúng tôi tiến hành thay

đổi từng yếu tố và khảo sát theo thứ tự sau:

1 – Khảo sát dung môi pha động

2 – Khảo sát chương trình hóa dung môi

3 – Khảo sát pH của pha động

4 – Khảo sát tốc độ dòng

5 – Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu

2.4.2.1. Khảo sát dung môi pha động

Trong sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC), pha động là hệ dung môi phân cực, đó

là những dung môi hữu cơ tan tốt trong nước và trong nhiều trường hợp nước cũng là

một thành phần của pha động. Hệ pha động được sử dụng nhiều như MeOH, ACN hay

hỗn hợp MeOH với nước, ACN với nước hoặc có thêm chất đệm pH,…[3]. Vì vậy việc

lựa chọn dung môi phù hợp sẽ là một trong những yếu tố mang lại hiệu quả cho quá

trình tách sắc ký. Đối với mẫu đơn giản, pha động gồm hỗn hợp MeOH/nước có tỷ lệ

thể tích thường chọn là 80/20 [4].

Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành so sánh hiệu quả tách sắc ký

giữa dung môi MeOH và ACN. Và hệ pha động sử dụng là dung môi hữu cơ (MeOH

hoặc ACN) kết hợp thêm nước để tạo hệ pha động phân cực hơn. Chúng tôi tiến hành

so sánh hiệu quả tách của hệ MeOH/H2O và ACN/H2O trong hai trường hợp: thành phần

pha động giữ cố định (đẳng dòng) và thành phần pha động thay đổi (gradient).

Tiến hành tiêm mẫu là hỗn hợp dung dịch chuẩn gồm AO nồng độ 5,0 ppm và RB

nồng độ 5,0 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện như sau:

- Cột tách: ZORBAX Eclipse XDB – C18 (5 μm x 4,6 mm x 250 mm)

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Bước sóng cực đại ở 430 nm và 540 nm

- Thể tích vòng mẫu: 20 μL

- Nhiệt độ cột: 35±5oC

- Nhiệt độ buồng mẫu: 20±5oC

- Pha động:

* Chế độ rửa giải đẳng dòng:

- Thời gian phân tích: 40 phút

 Chương trình 1: MeOH: HCOOH pH = 3,0 (40:60, v:v)

 Chương trình 2: MeOH: HCOOH pH = 3,0 (50:50, v:v)

 Chương trình 3: ACN: HCOOH pH = 3,0 (40:60, v:v)

 Chương trình 4: ACN: HCOOH pH = 3,0 (50:50, v:v)

* Chế độ rửa giải gradient:

100

)

H O E M

(

V %

0 2 4 14 16 18 20 6 8 12

10 Thời gian (phút)

Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn chương trình 5 (MeOH – CH3COOH pH = 3,6)

100

)

N C A

(

V %

0 2 4 14 16 18 20 6 8 12

10 Thời gian (phút)

Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn chương trình 6 (ACN – CH3COOH pH = 3,6)

2.4.2.2. Khảo sát chế độ rửa giải

Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải

các chất phân tích ra khỏi cột tách. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa

giải của pha động thay đổi, tức làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích ra khỏi cột

và do đó làm thay đổi hệ số dung lượng của chất phân tích. Sau khi lựa chọn được dung

môi pha động ở mục 2.4.2.1, chúng tôi thực hiện các bước khảo sát như sau:

 Khảo sát chương trình đẳng dòng

Thực hiện phân tích sắc ký với một số chương trình đẳng dòng như sau:

- Chương trình 7: MeOH và HCOOH (pH = 3,0) (80:20, v:v)

- Chương trình 8: MeOH và đệm acetate (pH = 4,2) (80:20, v:v)

 Khảo sát chương trình gradient

Lựa chọn các đoạn gradient và đặt tỷ lệ thành phần dung môi ở đầu mỗi đoạn

gradient, thời gian gradient.

Chương trình sắc ký dùng để khảo sát cố định các yếu tố: cột tách, nhiệt độ cột

tách, bước sóng, tốc độ dòng, thể tích vòng mẫu, nồng độ hai chất phân tích là 2,0 ppm.

2.4.2.3. Khảo sát pH của pha động

Dựa vào giá trị pKa của AO và RB, để hạn chế tồn tại đồng thời nhiều dạng phân

tử AO, RB và loại bỏ sự kéo đuôi của peak AO, RB trong quá trình tách sắc ký thì nên

tiến hành khảo sát với điều kiện giá trị pH < 7. Theo khuyến cáo của hãng Agilent, cột

tách C18 làm việc trong khoảng pH từ 2 đến 9 nên chúng tôi chọn các acid cho chương

trình dung môi pha động như sau:

- Acid acetic có pH bằng 3,0; 3,6; 4,0 và 4,5

- Acid formic có pH bằng 3,0

- Acid phosphoric có pH bằng 2,3 và 2,6

Tiến hành cố định các yếu tố: cột tách, nhiệt độ, bước sóng, thể tích vòng mẫu.

Đối với các giá trị pH từ 3,0 đến 4,5 tiến hành với tốc độ dòng 1,0 mL/phút và

chương trình gradient pha động như đồ thị dưới đây:

100

)

H O e M

(

V %

Thời gian (phút)

Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH từ 3,0 đến 4,5

Đối với các giá trị pH 2,3 và 2,6 tiến hành với tốc độ dòng 0,7 mL/phút và chương

trình gradient pha động như đồ thị dưới dây:

100

)

H O e M

(

V %

10 Thời gian (phút)

Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH 2,3 và 2,6

Thực hiện phân tích sắc ký với chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng nồng độ 2,0 ppm,

tính toán các giá trị hệ số dung lượng, hệ số không đối xứng, độ phân giải để chọn loại

acid thích hợp cho pha động.

2.4.2.4. Khảo sát tốc độ dòng

Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng

đến quá trình thiết lập cân bằng của CPT giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá

nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng peak, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên, nếu tốc độ

dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn,

nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy, chúng ta cần phải khảo

sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích. Chúng tôi cố định các yếu tố: pha

tĩnh, thể tích vòng mẫu, nhiệt độ cột, nhiệt độ buồng mẫu và bước sóng khảo sát và tiến

hành khảo sát hệ sắc ký với các tốc độ dòng khác nhau: 0,6; 0,7; 0,85; 1,0 mL/phút và

các điều kiện đã được tối ưu ở các mục trên.

2.4.2.5. Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu

Sau khi chọn được tốc độ dòng tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi

pha động ban đầu với hai mức: 30% MeOH và 43,7% MeOH để thiết lập điều kiện sắc

ký tối ưu cho quá trình phân tích HPLC.

2.5. Thẩm định phương pháp

2.5.1. Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích.

Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi

nồng độ của CPT nằm trong khoảng tuyến tính.

Đối với mỗi chất, trong một giới hạn nhất định của nồng độ, độ lớn diện tích peak

sắc ký phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của chất trong mẫu phân tích. Để định lượng

chính xác một chất thì nồng độ của chất đó trong mẫu phải nằm trong khoảng tuyến tính

này, do đó việc xác định khoảng tuyến tính của AO và RB là hết sức quan trọng.

Theo tài liệu tham khảo [14], khoảng tuyến tính của AO và RB là 0,05 – 100 ppm.

Khoảng tuyến tính của AO và RB là khoảng nồng độ tương đối rộng khi sử dụng phương

pháp HPLC. Tuy nhiên, hàm lượng AO và RB trong mẫu là hàm lượng vết, vì thế việc

xây dựng đường chuẩn với khoảng nồng độ nhỏ gần với nồng độ của AO và RB trong

mẫu sẽ cho kết quả chính xác hơn, đồng thời tiết kiệm hóa chất, thời gian và công sức

tiến hành.

Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn của AO và RB với

dãy các nồng độ dung dịch chuẩn sau: 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 ppm.

Bảng 2.4. Cách pha các dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn của AO và RB

Nồng độ chuẩn hỗn Thể tích dung dịch Thể tích dung Nồng độ chuẩn

hợp lấy pha (ppm) chuẩn hỗn hợp lấy dịch cuối (mL) hỗn hợp cuối

pha (µL) (ppm)

2 25 1 0,05

10 10 1 0,1

10 20 1 0,2

10 50 1 0,5

10 100 1 1

10 200 1 2

2.5.2. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện là giá trị nồng độ thấp nhất của CPT mà hệ thống phân

tích còn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của đường

nền.

Giới hạn định lượng được xem là nồng độ thấp nhất của CPT mà hệ thống phân

tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so với tín hiệu mẫu

trắng hay tín hiệu nền.

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2 – 3 lần nhiễu đường

nền, thông thường lấy S/N = 3. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn

gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10 [9].

Hình 2.5. Cách xác định S/N [4]

2.5.3. Xác định độ lặp lại của phép đo

Một phương pháp phân tích tốt ngoài yêu cầu về độ đúng của phương pháp, người

ta còn chú ý đến độ lặp lại của phương pháp. Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo

sát bằng cách tiêm lặp cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp AO và RB (có nồng độ nằm trong

khoảng tuyến tính) vào hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 2.4.

Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc

ký Speak và thời gian lưu tR.

Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành tiêm lặp bảy lần chuẩn hỗn hợp AO và

RB cùng nồng độ 2,0 ppm.

2.6. Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu

2.6.1. Lấy mẫu

Chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu gia vị ở một số chợ trên khu vực TP. Hồ Chí Minh.

Danh sách các mẫu gia vị được liệt kê trong Bảng 2.5.

Bảng 2.5. Thông tin về các mẫu gia vị phân tích

Địa điểm – thời gian lấy STT Tên mẫu Hình Đặc điểm mẫu

Bột gia vị Chợ Nhật Tảo (quận 10) Bột khô, 1 nấu bò kho 7h15 ngày 20/12/2017 màu đỏ cam

Bột khô, Chợ Thành Thái (quận 10) 2 Bột cà ri màu vàng 7h45 ngày 20/12/2017 cam

Chợ Thị Nghè (quận 1) Bột khô, 3 Bột ớt 16h15 ngày 19/04/2018 màu đỏ

Bột khô, Bột ngũ vị Chợ Thành Thái (quận 10) 4 màu vàng hương 7h45 ngày 25/04/2018 nâu

2.6.2. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích

Đối với mỗi loại mẫu gia vị lấy ít nhất 100 g. Đối với mẫu gia vị dạng thô, nghiền

cẩn thận mẫu bằng máy nghiền cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua rây có đường kính lỗ

0,5 mm. Sau đó trộn kỹ. Mẫu sau khi đồng nhất có thể phân tích ngay hoặc được bảo

quản trong túi zipper, để nơi thoáng mát và ít ánh sáng [11],[12].

2.7. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị

Nền mẫu gia vị có nhiều tạp chất vì vậy sẽ ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích.

Cũng như đã nêu, AO và RB trong các mẫu gia vị là hàm lượng vết. Để tăng độ nhạy

phép phân tích định lượng và loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu, chúng tôi đã kết hợp giai

đoạn chiết pha rắn trong quy trình xử lý mẫu.

2.7.1. Khảo sát giai đoạn chiết pha rắn (SPE)

2.7.1.1. Khảo sát loại cột SPE

Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành so sánh hiệu quả giữa cột chiết pha rắn

C18 và cột Oasis HLB.

Mẫu sử dụng trong giai đoạn khảo sát này được chuẩn bị như sau: dung dịch chuẩn

hỗn hợp của AO và RB được pha trong nước cất hai lần. Tiến hành thao tác thí nghiệm

lặp hai lần đối với cột C18 và cột Oasis HLB.

Hoạt hóa cột: 3 mL MeOH, 3 mL H2O

Nạp mẫu: 15 mL dung dịch mẫu đã chuẩn bị

HPLC

Rửa tạp: 4 mL hỗn hợp 5% MeOH trong H2O

Rửa giải 1: 3 mL HCOOH 2% trong MeOH (95:5, v:v)

HPLC Rửa giải 2: 1 mL HCOOH 2% trong MeOH (95:5, v:v)

HPLC Rửa giải 3: 1 mL HCOOH 2% trong MeOH (95:5, v:v)

Hình 2.6. Sơ đồ các giai đoạn chiết pha rắn

Các bước nạp mẫu, rửa tạp đều thu lại để tiêm vào hệ thống HPLC để kiểm tra tín

hiệu của CPT trên sắc đồ.

Khi so sánh hệ số thu hồi giữa cột C18 và Oasis HLB, chúng tôi chọn được cột

chiết tối ưu, đồng thời chọn được thể tích hỗn hợp dung dịch rửa giải phù hợp nhất.

2.7.1.2. Khảo sát tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết

Chúng tôi chọn hỗn hợp ACN : NH3 (0,5%, v:v) (70:30, v:v) để khảo sát quy trình

chiết mẫu gia vị. Vì tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết cao (70%) ảnh hưởng

sự lưu giữ CPT trên cột SPE nên chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ phần trăm thể tích

ACN trong dịch chiết trước khi cho qua cột SPE. Chuẩn bị các dịch chiết khảo sát như

sau: 15 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp AO và RB có cùng nồng độ 0,4 ppm với tỷ lệ phần

trăm ACN lần lượt là 5; 10; 20; 30; 50; 100%. Sau đó nạp 15 mL dung dịch đã chuẩn bị

như trên qua cột SPE theo các bước đã tối ưu như mục 2.7.1.1. Sau đó thu dung dịch rửa

giải, lọc qua màng 0,2 µm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC. Tiến hành so sánh hệ số

thu hồi để lựa chọn tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết thích hợp.

2.7.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết

Tiến hành khảo sát với quy trình chiết mẫu như sau:

Cân 3 g mẫu gia vị đã được đồng nhất cho vào ống ly tâm 50 mL

Thêm 30 mL hỗn hợp ACN : NH3 (0,5%, v:v) (70:30, v:v)

Lắc đều 10 phút

Siêu âm 30 phút

Ly tâm 10 phút

Thu lấy dịch chiết vào bình định mức

Ly tâm 10 phút

Lặp 1 lần

Thu lấy dịch chiết vào bình định mức trên

Hình 2.7. Sơ đồ quy trình chiết mẫu gia vị

Để khảo sát thể tích dung dịch chiết tối ưu cho quy trình chiết, sau khi chiết lần

thứ nhất với 30 mL hỗn hợp ACN : NH3 (0,5%, v:v) (70:30, v:v), tiến hành thêm tiếp 15

mL hỗn hợp ACN : NH3 (0,5%, v:v) (70:30, v:v) để chiết lần thứ hai. Dịch chiết sau mỗi

lần ly tâm của lần chiết thứ hai được thu tập hợp vào một bình định mức riêng với lần

chiết đầu. Dựa vào kết quả khảo sát mục 2.7.1.2, chúng tôi tiến hành pha loãng các dịch

chiết bằng nước cất để được tỷ lệ phần trăm ACN phù hợp trong dịch chiết.

Tiếp theo, lấy 20 mL dịch chiết trong mỗi bình định mức trên để tiến hành giai

đoạn SPE. Thu lấy dung dịch rửa giải, lọc qua màng 0,2 µm trước khi tiêm vào hệ thống

HPLC. Quá trình thêm thể tích hỗn hợp chiết được lặp lại cho đến khi thu được dung

dịch phân tích không còn cho tín hiệu của AO và RB trên sắc đồ.

2.7.3. Xác định hệ số thu hồi của quy trình

Để đánh giá và kiểm tra độ đúng của quy trình, chúng tôi đã tiến hành xác định hệ

số thu hồi của quy trình.

Trong đề tài này, để xác định hệ số thu hồi của quy trình xác định đồng thời AO

và RB trong mẫu gia vị, chúng tôi đã thực hiện phân tích mẫu gia vị và mẫu gia vị có

thêm chuẩn. Thêm một lượng chuẩn AO và RB xác định vào mẫu thử, phân tích mẫu

thêm chuẩn đó, làm lặp lại 3 lần bằng quy trình đã khảo sát, tính hệ số thu hồi theo công

thức sau đây:

Trong đó:

R%: hệ số thu hồi

Cm+c: nồng độ CPT trong mẫu có thêm chuẩn

Cm: nồng độ CPT trong mẫu thử

Cc: nồng độ chất chuẩn thêm theo lý thuyết

Sau đó, tính hệ số thu hồi là trung bình của hệ số thu hồi các lần làm lặp. Hệ số thu

hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau. Trong đề tài này, lượng chuẩn thêm

vào mẫu thử là 1,0 ppm và theo AOAC thì kỳ vọng hệ số thu hồi trong khoảng 80 –

110% [9].

2.7.4. Tính chọn lọc của quy trình

Tính chọn lọc liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy

trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích

có tính chọn lọc. Trong sắc ký cần xác định peak sắc ký có phải là một peak đơn hay

peak có lẫn các tạp chất khác. Đối với hệ thống sắc ký kết nối detector PDA có thể xác

định tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết của peak. Và chúng tôi có thể xác

định độ tinh khiết của peak trực tiếp qua phần mềm điều khiển [9].

2.8. Phân tích một số mẫu gia vị

Tiến hành xử lý mẫu gia vị theo quy trình thực nghiệm đã khảo sát ở mục 2.2.5.

Dung dịch rửa giải sau giai đoạn SPE được lọc qua màng 0,2 µm trước khi tiêm vào hệ

thống HPLC.

Tiến hành tiêm lặp ba lần mỗi mẫu gia vị đã chuẩn bị vào hệ thống HPLC, ghi kết

quả. Dựa vào phương trình hồi quy, tính nồng độ các CPT.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký

Sau khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát, chúng tôi thu được kết quả như sau:

3.1.1. Chọn khoảng bước sóng cho detector

Kết quả khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại, độ hấp thụ quang của AO và RB được

trình bày trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả bước sóng hấp thụ cực đại, độ hấp thụ quang của AO và RB trong

MeOH và ACN

Bước sóng hấp thụ Nồng độ Độ hấp thụ Dung Chất phân tích (ppm) (A) môi cực đại ( )

AO 2,0 430,70 0,3355 MeOH RB 2,0 545,34 0,5007

AO 2,0 440,99 0,3255 ACN RB 2,0 555,33 0,4022

Nhận xét:

- Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn AO và RB trong MeOH cao hơn trong ACN nên

chúng tôi chọn MeOH làm dung môi pha chuẩn.

- Dựa vào bước sóng hấp thụ cực đại của AO và RB, chúng tôi chọn khoảng bước

sóng khảo sát của detector PDA là 400 – 600 nm.

3.1.2. Tối ưu hóa pha động

3.1.2.1. Khảo sát dung môi pha động

Sắc đồ của chương trình 1, 2, 3 và 4 lần lượt được trình bày ở Phụ lục 7, 8, 9 và

10.

Chương trình 2 với 50% MeOH thì thời gian lưu của AO ngắn hơn so với chương

trình 1 với 40% MeOH. Nhưng cả hai chương trình 1 và 2 thì RB vẫn bị lưu giữ trên cột

trong khoảng thời gian 40 phút. Điều này chứng tỏ độ phân cực của AO lớn hơn RB.

Chương trình 3 với 50% ACN và chương trình 4 với 40% ACN thì cả AO và RB

đều được rửa giải, cho thấy lực rửa giải với hai CPT của ACN cao hơn MeOH. Nhưng

peak của AO bị tách đầu, peak RB bị không thon, nhọn.

Vậy trong trường hợp rửa giải đẳng dòng chưa chọn được dung môi pha động là

MeOH hay ACN.

Tiếp tục so sánh hai chương trình rửa giải gradient như đã trình bày ở mục 2.4.2.1.

RB AO

Hình 3.1. Sắc đồ của chương trình 5

Hình 3.2. Sắc đồ của chương trình 6

Kết quả rửa giải gradient pha động cho thấy với ACN thì CPT được rửa giải ra

sớm khoảng 6 phút dễ bị lẫn với peak tạp. Với dung môi ACN thì AO và RB chưa tách

tốt, peak RB có hiện tượng bị kéo đuôi. Với MeOH thì peak được thon, gọn hơn tuy

nhiên có hiện tượng sụt nền. Chiều cao peak với MeOH thì cao hơn với ACN. Qua một

số so sánh hiệu quả rửa giải, chúng tôi chọn MeOH là một trong những thành phần của

dung môi pha động.

3.1.2.2. Khảo sát chế độ rửa giải

Sau khi tiến hành phân tích sắc ký với chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi

MeOH và HCOOH (pH = 3,0) theo tỷ lệ 80:20 (v:v), chúng tôi thu được sắc đồ như

Hình 3.3.

AO RB

Hình 3.3. Sắc đồ của chương trình 7

Sau khi tiến hành phân tích sắc ký với chương trình đẳng dòng sử dụng dung môi

MeOH và đệm acetate (pH = 4,2) theo tỷ lệ 80:20 (v:v), chúng tôi thu được sắc đồ như

Hình 3.4.

Hình 3.4. Sắc đồ của chương trình 8

Kết quả cho thấy, khi tiến hành chương trình dung môi pha động với chế độ rửa

giải đẳng dòng thì các peak AO và RB đều không đủ tiêu chuẩn định lượng. Vì vậy, để

định lượng AO và RB cần thực hiện chương trình dung môi pha động với chế độ rửa

giải gradient.

3.1.2.3. Khảo sát pH của pha động

Kết quả khảo sát pH được thể hiện trong các bảng bên dưới.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của CH3COOH đến sự phân tách AO, RB

Acid acetic Thông số pH = 3,0 pH = 3,6 pH = 4,0 pH = 4,5

AO RB AO RB AO RB AO RB

Thời gian lưu (tR) 6,83 7,78 7,17 7,93 6,58 8,52 6,75 8,02

Hệ số dung lượng (k’) 3,33 5,41 2,21 2,82

4,30 1,78 2,33 1,92

0,32 2,00 1,55 1,50 2,25 2,71 1,24 1,52 Hệ số không đối xứng (T) 1,37 1,07 6,57 5,06 Độ phân giải AO và RB

Khi sử dụng acid acetic điều chỉnh pH của pha động thì đường nền không ổn định.

Vùng phía trước peak AO thường bị dâng nền, vùng phía sau peak AO và RB bị sụt nền.

Hình 3.5. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acetic acid (pH = 3,0)

Với việc sử dụng chất chuẩn AO và RB có độ tinh khiết từ 85% và 95% trở lên,

trong các sắc đồ chúng tôi nhận thấy trước các peak AO và RB có xuất hiện peak nhỏ

phía trước, với pH = 3,0 thì peak nhỏ phía trước ở gần phút 7,4. Nghĩa là các thành phần

không tinh khiết trong chất chuẩn cũng hấp thụ trong vùng tử ngoại khả kiến. Khi sử

dụng acid acetic điều chỉnh pH của pha động thì chưa tách được các peak tạp này ra xa

peak của CPT.

Dựa vào số liệu ở Bảng 3.2, chúng tôi thiết lập mối quan hệ giữa hệ số đối xứng T

của peak sắc ký với giá trị pH được điều chỉnh bằng acid acetic như Hình 3.6.

T

3 3.5 4.5 5

4 pH

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số không đối xứng T theo pH

Đồ thị cho thấy để thu được peak sắc ký đối xứng cao thì nên giảm pH của pha

động. Dưới đây là kết quả khảo sát pH với acid formic.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của HCOOH đến sự phân tách AO, RB

Acid formic (pH = 3,0) Thông số RB AO

Thời gian lưu (tR) 7,97 6,50

Hệ số dung lượng (k’) 2,19 1,60

Hệ số không đối xứng (T) 1,66 2,00

Độ phân giải AO và RB 1,47

Khi sử dụng acid formic điều chỉnh pH của pha động thì vẫn chưa tách được peak

tạp ra xa chất cần phân tích, đường nền không ổn định, peak sắc ký của AO kéo đuôi

như trong Hình 3.7.

Hình 3.7. Sắc đồ khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid formic (pH = 3,0) 38

Dưới đây là kết quả khảo sát pH với acid phosphoric.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của H3PO4 đến sự phân tách AO, RB

Acid phosphoric

Thông số pH = 2,6 (H3PO4 0,03%) pH = 2,3 (H3PO4 0,072%)

AO RB AO RB

Thời gian 16,42 19,38 16,24 19,17 lưu (tR)

Hệ số dung 4,78 5,83 4,52 5,79 lượng (k’)

Hệ số không 1,00 1,19 1,38 1,19 đối xứng (T)

Sắc đồ chuẩn AO và RB khi sử dụng acid phosphoric 0,03% điều chỉnh pH pha

động như Hình 3.8. RB

Hình 3.8. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid phosphoric 0,03%

Như vậy, khi sử dụng acid phosphoric để điều chỉnh pH của pha động thì các peak

AO và RB tách tốt, độ phân giải Rs > 1,5, các peak tạp được tách ra xa peak của chất cần

phân tích, đường nền ổn định, hệ số không đối xứng (T) của AO và RB nằm trong

khoảng 0,9 – 1,2 nên peak AO và RB có tính đối xứng cao.

Khi sử dụng acid phosphoric 0,072% cho kết quả tương đồng với acid phosphoric

0,03%. Giá trị các thông số về thời gian lưu, hệ số dung lượng, hệ số không đối xứng

không khác nhau nhiều. Vì vậy để bảo vệ cột chúng tôi chọn acid phosphoric 0,03% để

ổn định pH pha động.

Tuy nhiên, thời gian lưu của AO và RB quá lâu nên cần khảo sát chương trình

dung môi pha động (rửa giải gradient) và tốc độ dòng để giảm thời gian lưu nhằm đạt

được tính kinh tế trong quá trình phân tích.

3.1.2.4. Khảo sát tốc độ dòng

Chúng tôi khảo sát các mức tốc độ dòng là 0,6 mL/phút; 0,7 mL/phút; 0,85

mL/phút và 1,0 mL/phút với chương trình pha động như Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Chương trình gradient pha động khảo sát tốc độ dòng

Thời gian (phút) %MeOH %H3PO4 (0,03%)

0 43,7 56,3

5 43,7 56,3

13 80 20

20 30 70

Sau khi thực hiện phân tích HPLC với các điều kiện trên, chúng tôi thu được các

sắc đồ:

Hình 3.9. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,6 mL/phút

Hình 3.10. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút

Hình 3.11. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,85 mL/phút

Hình 3.12. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 1,0 mL/phút

Với các mức tốc độ dòng khảo sát, các peak AO kéo đầu nhiều. Khi tốc độ dòng

0,85 và 1,0 mL/phút, cường độ tín hiệu có giảm nhưng thời gian lưu AO và RB ngắn

hơn. Do đó để tiết kiệm thời gian phân tích chúng tôi chọn tốc độ dòng là 1,0 mL/phút

để khảo sát yếu tố tiếp theo.

3.1.2.5. Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu

Như đã khảo sát tốc độ dòng được lựa chọn là 1,0 mL/phút. Với tốc độ dòng này,

chúng tôi lựa chọn tỷ lệ dung môi ban đầu ở hai mức: 30% MeOH và 43,7% MeOH.

Bảng 3.6. Khảo sát tỷ lệ dung môi ban đầu

Tốc độ dòng 1,0 mL/phút

Thời gian Thời gian % % H3PO4 % H3PO4 % MeOH (phút) (0,03%) (phút) MeOH (0,03%)

0 30 70 0 43,7 56,3

5 30 70 5 43,7 56,3

16 80 20 13 80 20

20 30 70 20 30 70

- Peak của AO và RB đều thon, gọn. - Peak RB thon, gọn nhưng peak AO bị

- Các peak tạp tách ra xa peak AO, RB. kéo đầu.

- Các peak tạp tách ra xa peak AO, RB.

- Đường nền phía sau RB bị dâng.

Với 30% MeOH ở thời điểm ban đầu đã kết luận được điều kiện tối ưu để phân

tách AO và RB nhưng giá trị pH của pha động thấp, gần với giới hạn chịu đựng của cột

tách C18 nên chúng tôi đã khảo sát bổ sung chương trình sắc ký sử dụng đệm acetate

(pH = 4,2)

Bảng 3.7. Các chương trình sắc ký với đệm acetate (pH = 4,2)

Tốc độ dòng 1,0 mL/phút

Thời gian Thời gian % MeOH % đệm % ACN % đệm (phút) (phút)

0 0 30 70 70 30

5 5 30 70 70 30

16 16 80 20 20 80

20 20 30 70 70 30

- Peak AO kéo đuôi. - Peak AO và RB kéo đuôi.

- Cường độ peak AO, RB nhỏ. - Cường độ peak AO, RB nhỏ.

Tốc độ dòng 1,5 mL/phút

Thời gian Thời gian % MeOH % đệm % ACN % đệm (phút) (phút)

0 30 70 0 30 70

5 30 70 5 30 70

16 80 20 16 80 20

20 30 70 20 30 70

- AO kéo đuôi. - AO và RB kéo đuôi.

- Cường độ peak AO, RB nhỏ - Cường độ peak AO, RB nhỏ.

Từ kết quả trên, nhận thấy việc sử dụng đệm điều chỉnh pH chưa mang lại hiệu

quả.

Ngoài ra, để đảm bảo tìm được đúng điều kiện tối ưu cho quy trình phân tích HPLC

chúng tôi đã thực hiện bổ sung một số chương trình sắc ký và so sánh kết quả thu được.

Với điều kiện pH được điều chỉnh bằng H3PO4 0,03%, chúng tôi tiến hành so sánh hiệu

quả giữa dung môi MeOH và ACN.

Bảng 3.8. So sánh kết quả khảo sát giữa dung môi MeOH với dung môi ACN

Tốc độ dòng 0,7 mL/phút

Thời gian % Thời gian % H3PO4 % H3PO4 % ACN (phút) MeOH (0,03%) (phút) (0,03%)

0 30 70 0 30 70

5 30 70 5 30 70

16 80 20 16 80 20

20 30 70 20 30 70

- Thời gian lưu của các CPT dài, rửa giải - Thời gian lưu của các CPT ngắn hơn.

ở cuối thời gian chạy sắc ký. - Cường độ peak nhỏ.

- Cường độ peak lớn.

Tốc độ dòng 0,7 mL/phút

Thời gian % Thời gian % H3PO4 % H3PO4 % ACN (phút) MeOH (0,03%) (phút) (0,03%)

0 43,7 56,3 0 43,7 56,3

5 43,7 56,3 5 43,7 56,3

13 80 20 13 80 20

20 30 70 20 30 70

- Thời gian lưu của các CPT dài. - Thời gian lưu của các CPT ngắn hơn.

- Cường độ peak lớn. - Peak AO ra trước 5 phút nên dễ bị lẫn với

các peak tạp khi phân tích mẫu thực tế.

- Cường độ peak nhỏ.

Tốc độ dòng 1,0 mL/phút

Thời gian % Thời gian % % H3PO4 % H3PO4

(phút) MeOH (0,03%) (phút) ACN (0,03%)

0 30 70 0 30 70

5 30 70 5 30 70

16 80 20 16 80 20

20 30 70 20 30 70

- Thời gian lưu của các CPT dài. - Thời gian lưu của các CPT ngắn hơn

- Cường độ peak lớn. - Cường độ peak nhỏ.

- Peak AO, RB thọn, gọn. - Peak AO tù.

 Kết luận

Sau khi tối ưu hóa dung môi pha động, chế độ rửa giải, pH của pha động, tốc độ

dòng, tỷ lệ dung môi pha động ban đầu. Đồng thời kiểm tra cường độ tín hiệu, sự nhiễu

nền, tR lưu, hình dạng peak của AO và RB, chúng tôi thu được các kết quả tối ưu như

Bảng 3.9.

Bảng 3.9. Chương trình pha động tối ưu

Thời gian

Tốc độ dòng

% MeOH

% (H3PO4 0,03%)

Curve

(phút)

(mL/phút)

1,0

3.2. Thẩm định phương pháp

3.2.1. Xây dựng đường chuẩn

Kết quả ở mục 3.1.1 cho thấy độ hấp thụ của AO và RB đều cao trong MeOH nên

chúng tôi đã tiến hành pha các dung dịch chuẩn AO, RB trong dung môi MeOH để xây

dựng đường chuẩn.

Bảng 3.10. Giá trị nồng độ và diện tích của peak AO, RB thu được khi tiến hành phân

tích HPLC

Diện tích peak sắc ký Nồng độ AO và Lần đo RB (ppm) AO RB

Lần 1 113,989 93,910

Lần 2 113,710 124,479 0,05 Lần 3 117,010 119,236

Trung bình 114,9 ± 4,5 113 ± 41

Lần 1 245,700 240,125

Lần 2 246,130 236,670 0,1

Trung bình 245,9 ± 2,7 238 ± 22

Lần 1 521,200 561,683

Lần 2 521,292 561,241 0,2

Trung bình 521,25 ± 0,58 561,5 ± 2,8

Lần 1 1437,478 1498,623

Lần 2 1433,890 1488,640 0,5

Trung bình 1436 ± 23 1494 ± 63

Lần 1 2950,071 2971,018

Lần 2 2956,904 2982,394 1,0

Trung bình 2953 ± 43 2977 ± 72

Lần 1 6004,887 5855,801

Lần 2 5976,327 5837,512 2,0

Trung bình 5991 ± 181 5847 ± 116

Dựa vào bảng số liệu thu được sau khi tiến hành sắc ký, sử dụng phần mềm

Microsoft Excel xây dựng đường chuẩn. Kết quả đường chuẩn của AO và RB được trình

bày dưới đây:

6000

5000 y = 3022,8x - 62,647 R² = 0,9999

)

4000

U A

3000

2000

( h c í t n ệ i D

1000

0 2 0.5 1.5

1 Nồng độ AO (ppm)

Hình 3.13. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn AO

6000

5000

)

y = 2949,4x - 20,993 R² = 0,9997

4000

U A

2000

3000

( h c í t n ệ i D

1000

0 2 0.5 1.5

1 Nồng độ RB (ppm)

Hình 3.14. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn RB

3.2.3. Xác định LOD, LOQ

Tính toán sơ bộ LOD của AO, RB bằng phương pháp HPLC theo đường chuẩn:

(ppm)

Dựa trên LOD tính được theo đường chuẩn, chúng tôi pha loãng dung dịch chuẩn

AO và RB đến nồng độ 0,02 ppm, sau đó tiến hành tiêm vào hệ thống HPLC và xác định

LOD dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N). Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.11. Kết quả xác định LOD

CPT Nồng độ (ppm) H h

AO 0,02 392 308 2,545

RB 0,02 645 442 2,919

Như vậy, LOD của AO và RB đều là 0,02 ppm.

Hình 3.15. Sắc đồ xác định LOD của AO và RB

Giới hạn định lượng AO, RB được xác định bằng phương pháp HPLC dựa vào tỷ

lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N). Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.12. Kết quả xác định LOQ

CPT Nồng độ (ppm) H h

AO 0,05 1042 200 10,420

RB 0,05 1321 274 9,642

Như vậy, LOQ của AO và RB đều là 0,05 ppm.

Hình 3.16. Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB

3.2.4. Xác định độ lặp lại của phương pháp

Bảng 3.13. Kết quả độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích peak

tR

Speak

Lần

AO

RB

AO

RB

14,467

17,400

5664,660

5588,101

14,450

17,383

5753,625

5646,242

14,450

17,383

5787,972

5693,114

14,450

17,383

5761,298

5711,542

14,450

17,383

5812,427

5704,386

14,450

17,383

5802,885

5776,700

14,433

17,367

5800,698

5748,406

14,4500±0,0091 17,3830±0,0088

5769±47

5695±58

Trung bình

0,068%

0,055%

0,88%

1,1%

RSD%

Kết luận: Tại mức nồng độ khảo sát 2,0 ppm thì RSD% nằm trong khoảng 0,06 –

1,1% phù hợp với yêu cầu của AOAC.

3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị

3.3.1. Khảo sát giai đoạn SPE

3.3.1.1. Khảo sát loại cột SPE

Pha 100 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng nồng độ 0,2 ppm. Cách pha

như sau: lấy 200 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp AO và RB có cùng nồng độ là 100 ppm,

định mức bằng nước đến 100 mL.

Các ký hiệu mẫu, thể tích dung dịch thu sau rửa giải, diện tích peak, hệ số thu hồi

được trình bày trong Bảng 3.14.

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát của giai đoạn SPE

Hệ số thu hồi Speak Ký hiệu Thể tích rửa (%) Cột mẫu giải (mL) AO RB AO RB

A1 2351,89 2446,77 3

A2 40,12 32,60 86,97 87,96 1

A3 - - 1 C18 B1 2259,24 2474,34 3

B2 45,71 32,55 83,91 88,90 1

B3 - - 1

C1 1914,16 2554,57 3

C2 858,17 110,88 85,01 94,94 1

C3 408,02 151,74 1 Oasis D1 2113 2745,30 3

D2 587,14 56,89 88,60 100,39 1

D3 1

Ghi chú:

- A1, A2, A3: tương ứng với ba lần rửa giải của mẫu A

- B1, B2, B3: tương ứng với ba lần rửa giải của mẫu B

- C1, C2, C3: tương ứng với ba lần rửa giải của mẫu C

- D1, D2, D3: tương ứng với ba lần rửa giải của mẫu D

Các mẫu A, B, C và D có nồng độ CPT và thể tích dung dịch như nhau. Mẫu A và

B sử dụng khảo sát lặp với cột C18; mẫu C và D sử dụng khảo sát lặp với cột Oasis

HLB.

Kết luận: Theo khuyến cáo của hãng Waters, thể tích rửa giải tối đa 4 mL ứng với

cột 6cc/ 200mg nên chúng tôi đã tiến hành khảo sát với thể tích rửa giải 5mL. Kết quả

khảo sát ở Bảng 3.14 cho thấy, hệ số thu hồi của AO và RB trong trường hợp sử dụng

cột chiết Oasis HLB cao hơn so với cột C18, đồng thời hệ số thu hồi trong khoảng phù

hợp cho phân tích định lượng. Vì vậy, chúng tôi chọn cột Oasis HLB để tiến hành giai

đoạn chiết pha rắn trong quy trình xử lý mẫu gia vị và chọn thể tích dung dịch rửa giải

là 5 mL hỗn hợp HCOOH 2% trong MeOH (95:5, v:v).

3.3.1.2. Khảo sát tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết

Để khảo sát tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết, chúng tôi tiến hành pha

các dung dịch được thêm chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng nồng độ với tỷ lệ phần trăm

thể tích ACN tương ứng là 5, 10, 20, 30, 50, 100%.

Bảng 3.15. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN khảo sát

Ký hiệu Thể tích chuẩn hỗn hợp Thể tích Tỷ lệ ACN Thể tích H2O

mẫu 100 ppm thêm vào (mL) ACN (mL) (mL) (%)

A 0,06 14,94 0 100

B 0,06 7,50 7,44 50

C 0,06 4,50 10,44 30

D 0,06 3,00 11,94 20

E 0,06 1,50 13,44 10

F 0,06 0,75 14,19 5

Ghi chú: Các mẫu A, B, C, D, E, F có cùng nồng độ chuẩn AO và RB là 0,4 ppm

và cùng thể tích là 15 mL; khác nhau về tỷ lệ ACN như được trình bày trong Bảng 3.15.

Kết luận: Đối với mẫu A và B, các giai đoạn rửa giải đều không thu được tín hiệu

của AO và RB trên sắc đồ, tuy nhiên giai đoạn nạp mẫu có tín hiệu của AO và RB. Đối

với các mẫu C, D, E và F không thu được tín hiệu AO và RB ở giai đoạn nạp mẫu; chỉ

thu được tín hiệu Ao và RB ở giai đoạn rửa giải. Và kết quả của các mẫu C, D, E và F

được trình bày trong Bảng 3.16.

Bảng 3.16. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN và hệ số thu hồi của giai đoạn SPE

Ký hiệu Tỷ lệ ACN Hệ số thu hồi Speak

mẫu (%) AO RB AO RB

C 30 4181,88 4900,17 102,00 108,64

D 20 5416,33 6313,22 129,22 140,58

E 10 4837,68 5945,87 116,46 132,28

F 5 3192,78 4996,56 80,19 110,82

Kết quả trên cho thấy tỷ lệ phần trăm thể tích ACN trong dịch chiết trước khi cho

qua cột SPE tối ưu là 30%. Và trong những bước tiếp theo của quy trình thì tỷ lệ phần

trăm thể tích ACN trong dịch chiết có thể không quá 30%.

3.3.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết

Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát thể tích dung dịch chiết là 45 mL

với lần chiết thứ nhất là 30 mL, lần chiết thứ hai là 15 mL. Mẫu bột ngũ vị hương được

sử dụng để khảo sát thể tích dung dịch chiết.

Bảng 3.17. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ

vị hương lần 1

Ký hiệu Thể tích rửa Hệ số thu hồi (%) Speak

mẫu giải (mL) AO RB AO RB

4057,51 879,37 5 A1 50,49 52,53 1917,10 292,37 5 A2

3919,52 845,92 5 B1 30,07 51,19 1758,73 306,74 5 B2

3511,53 - - - 5 C1

1730,49 - - - 5 C2

Ghi chú:

- Ký hiệu mẫu A và B được thêm vào 0,06 mL chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng

nồng độ 100 ppm, mẫu C không thêm chuẩn.

- Ký hiệu mẫu A1, B1, C1 tương ứng với lần chiết thứ nhất và A2, B2, C2 tương

ứng với lần chiết thứ hai của các mẫu A, B và C.

Nhận xét:

- Kết quả mẫu C cho thấy mẫu ngũ vị hương được sử dụng có chứa AO;

- Với thể tích dung dịch chiết là 45 mL thì chưa chiết được hết CPT ra khỏi mẫu

gia vị. Cho nên chúng tôi đề xuất thể tích dung dịch chiết là 50 mL với 3 lần chiết.

Chúng tôi tiến hành khảo sát tiếp như sau: phân tích 3 mẫu bột ngũ vị hương thêm

chuẩn và 1 mẫu ngũ vị hương không thêm chuẩn. Và sử dụng 50 mL hỗn hợp ACN :

NH3 (0,5%, v:v) (70:30, v:v) chia làm 3 lần chiết, sau đó dịch chiết được tập hợp vào

một bình định mức và định mức bằng nước đến 100 mL. Lấy 20 mL dịch chiết trong

bình định mức nạp qua cột SPE, rửa giải thu được 5 mL dung dịch, lọc qua màng 0,2

µm, tiêm vào hệ thống HPLC để xác định hệ số thu hồi.

Bảng 3.18. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu

ngũ vị hương lần 2

Ký hiệu Khối Thể tích Hệ số thu hồi (%) Speak

mẫu lượng rửa giải AO RB AO RB (g) (mL)

A 3,02688 3487,90 2179,93 33,18 75,83

B 3,00695 3812,62 2621,18 44,59 90,80 5

C 3,04706 3729,05 2525,63 40,48 87,56

D 3,04079 2499,03 - - -

Ghi chú: Mẫu A, B, C thêm 0,25 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng

nồng độ 100 ppm. Mẫu D không thêm chuẩn.

Nhận xét: hệ số thu hồi đối với AO chưa cao, hệ số thu hồi của RB trong mẫu B

và C lớn hơn 80% đáp ứng kỳ vọng theo AOAC.

3.3.3. Tính chọn lọc của quy trình

Chúng tôi đã khảo sát tín hiệu của chuẩn hỗn hợp AO và RB được thêm vào mẫu

thử thì thấy rằng peak của AO và RB bị ảnh hưởng nhiều bởi nền mẫu. Khi đó, độ tin

khiết xác định bằng phần mềm với nồng độ chuẩn AO, RB 1,0 ppm thì đạt 100%, có thể

kết luận CPT phân biệt rõ với những chất khác. Đối với trường hợp nồng độ chuẩn AO,

RB nhỏ hơn 0,1 ppm, diện tích các peak nhỏ và sẽ bị ảnh hưởng nhiều bởi nền nên gây

khó khăn trong bước định lượng dựa vào Speak.

a) Sắc đồ chuẩn hỗn hợp AO và RB 1,0 ppm được thêm vào mẫu thử

b) Sắc đồ ở 430 nm

c) Sắc đồ ở 540 nm

Hình 3.17. Độ tinh khiết của peak AO, RB xác định bằng phần mềm

RB AO

Hình 3.18. Sắc đồ chuẩn AO 0,03 ppm và RB 0,02 ppm trong nền mẫu ngũ vị hương

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1. Kết luận

Trong khoảng thời gian thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời

Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao kết nối với detector tử ngoại khả kiến”, chúng tôi đã thực hiện những công

việc sau:

1. Chọn được điều kiện để tách và xác định đồng thời AO và RB trong một số mẫu

gia vị bằng phương pháp HPLC

- Cột tách: ZORBAX Eclipse XDB – C18 (5 μm x 4,6 mm x 250 mm) và cột bảo

vệ tương ứng

- Pha động: gradient với hai kênh, A: MeOH, B: H3PO4 0,03%

Bảng 4.1. Thành phần pha động

Thời gian (phút)

% MeOH

% (H3PO4 0,03%)

Curve

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Thể tích vòng mẫu: 20 μL

- Nhiệt độ cột: 35±5oC

- Nhiệt độ buồng mẫu: 20±5oC

- Bước sóng: 430 nm (AO) và 540 nm (RB)

2. Xây dựng được đường chuẩn để xác định AO và RB. Xác định được LOD và

LOQ

Bảng 4.2. Phương trình đường chuẩn của AO và RB

AO RB

y = 3022,8x – 62,647 y = 2949,4x – 20,993 Phương trình hồi quy

R = 0,9999 R= 0,9998 Hệ số tương quan

- LOD = 0,02 ppm

- LOQ = 0,05 ppm

Hoạt hóa cột: 3 mL MeOH, 3 mL H2O

3. Tối ưu hóa được giai đoạn SPE sử dụng cột Oasis HLB

Nạp mẫu: 15 mL dung dịch mẫu đã chuẩn bị

Rửa tạp: 4 mL hỗn hợp 5% MeOH trong H2O

Rửa giải: 5 mL HCOOH 2% trong MeOH (95:5, v:v)

Hình 4.1. Sơ đồ giai đoạn SPE tối ưu

4. Chưa hoàn tất việc khảo sát thể tích chiết đối với mẫu gia vị nên chưa thể tiến

hành phân tích AO và RB trong mẫu gia vị.

5. Trong quá trình khảo sát, nhận thấy mẫu bò kho có tín hiệu của AO nên chúng

tôi đã gửi mẫu đi phân tích ở Trung tâm phân tích công nghệ cao Hoàn Vũ: hàm lượng

AO trong mẫu bột gia vị bò kho là 19,7 ppm và không phát hiện RB. Trong quá trình

khảo sát, chúng tôi cũng phát hiện trong mẫu bột ngũ vị hương có hàm lượng AO.

4.2. Đề xuất

- Tiến hành khảo sát tiếp thể tích dung dịch chiết cũng như là số lần chiết để tối

ưu hóa được quy trình xử lý mẫu gia vị.

- Áp dụng quy trình phân tích xác định đồng thời AO và RB cho một số mẫu gia

vị, trong đó có bột gia vị bò kho và bột ngũ vị hương.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Bùi Thị Kim Ngân (2010). Xác định Rhodamine B trong

thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Y học thực hành, 732 (9), 47

– 49.

2. Công ty TNHH Merck Việt Nam. Phiếu an toàn hóa chất theo Quy định (EU) số

1907/2006 (sửa đổi, bổ sung: 16/06/2017).

3. Khoa Hóa học (2000). Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trường Đại học

Tổng hợp Hà Nội.

4. Nguyễn Văn Ri (2007). Các phương pháp tách sắc ký. Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội.

5. Phạm Thị Thu Hà (2016). Nghiên cứu phương pháp xác định Auramine O trong thức

ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS. Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Dược Hà Nội.

6. Phạm Luận (2014). Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách. Nhà xuất bản Bách

khoa Hà Nội.

7. Phòng phân tích sắc ký (CASE). (09/02/2012). Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao (HPLC). 11/07/2017, truy cập từ http://case.vn/vi-VN/34/96/118/details.case

8. Trần Thị Thanh Nga (2011). Xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật

sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector UV. Luận văn Thạc sĩ khoa học,

Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội.

9. Trần Cao Sơn (2010). Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh

vật. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, trang 16 – 59.

10. Trung tâm Chất lượng nông nghiệp thủy sản vùng 1 – Cục Quản lý chất lượng Nông

lâm sản và thủy sản. Dự thảo TCVN Thực phẩm – Xác định hàm lượng Auramine –

Phương pháp sắc lý lỏng ghép khối phổ (LC – MS/MS). Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường

Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ.

11. Trung tâm Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng khu vực I. TCVN 4889:1989 Gia vị

- Lấy mẫu. Ủy ban Khoa học và kỹ thuật Nhà nước.

12. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia. TCVN 8670-2011 Thực

phẩm - xác định Rhodamine B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ.

13. Võ Đức Minh. (22/08/2013). Lao. 29/11/2017, truy cập từ

http://voer.edu.vn/m/lao/45519ef5

Tiếng Anh

14. Chiye Tatebe, Xining Zhong, Takashi Ohtsuki, Hiroki Kubota, Kyoko Sato &

Hiroshi Akiyama (2014). A simple and rapid chromatographic method to determine

unauthorized basic colorants (rhodamine B, auramine O, and pararosaniline) in

processed foods. Food Science & Nutrition, 2(5), 547– 556p.

15. Dixit, Sumita; Khanna, Subhash K.; Das, Mukul (2011). A Simple Method for

Simultaneous Determination of Basic Dyes Encountered in Food Preparations

by Reversed-Phase HPLC. Journal of AOAC International, 94 (6), 1874 – 1881p.

16. Juan Li, Xiao-Ming Ding, Dan-Dan Liu, Fei Guo, Yu Chen, Yan-Bing Zhang,

Hong-Min Liu (2013). Simultaneous determination of eight illegal dyes in chili products

by liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B,

942–943, 46–52p.

17. Juan Li, Xiaoming Ding, Jiaxin Zheng, Dandan Liu, Fei Guo1 Hongmin Liu,

Yanbing Zhang (2014). Determination of synthetic dyes in bean and meat products by

liquid chromatography with tandem mass spectrometry. J. Sep. Sci., 37, 2439–2445p.

18. Government Chemist (2006). Analysis illegal dyes in chilli powder by LC/UV. 15p.

19. IARC. Auramine and Auramine Production. IARC Monograph Volume 99. 30p.

20. I. Lopez Arbeloa and P Ruiz Ojeda (1981). Molecular Forms Of Rhodamine B.

Chemical Physics Letters, 79 (2), 347 – 350p.

21. KM Gray, MJ Walker, MJS Burn, M Mazur, K Niedzwiedzka, K Liszka and D

Thorburn Burns (2016). Illegal Dyes in Food and Speakes – A 2006 LGC LC

UV/Visible Method Reviewed and Updated for 19 Dyes. Journal of the Association of

Public Analysts, 18 – 39p.

22. Sabnis R.W (2010). Handbook of biological dyes and stains. The United States: John

Wiley & Sons, Inc; P, 27-29p.

23. Sigma-Aldrich, Inc. Auramine O (A9655) – Product Information Sheet. 2p.

24. Ruth Winter, M.S (2010). A Consumer’s Dictionary Of Cosmetic Ingredient (6th).

Potter/TenSpeed/Harmony; p576.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn AO 2,0 ppm trong MeOH

Phụ lục 2. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn AO 2,0 ppm trong ACN

Phụ lục 3. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn RB 2,0 ppm trong MeOH

Phụ lục 4. Quang phổ hấp thụ của chuẩn đơn RB 2,0 ppm trong ACN

Phụ lục 5. Quang phổ chuẩn hỗn hợp AO và RB trong MeOH

Phụ lục 6. Quang phổ chuẩn hỗn hợp AO và RB trong ACN

Phụ lục 7. Sắc đồ của chương trình 1

Phụ lục 8. Sắc đồ của chương trình 2

Phụ lục 9. Sắc đồ của chương trình 3

Phụ lục 10. Sắc đồ của chương trình 4

Phụ lục 11. Sắc đồ ở bước sóng 430 nm của chương trình 5

Phụ lục 12. Sắc đồ ở bước sóng 540 nm của chương trình 5

Phụ lục 13. Sắc đồ ở bước sóng 430 nm của chương trình 6

Phụ lục 14. Sắc đồ ở bước sóng 540 nm của chương trình 6

Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến

Chủ đề:

Báo cáo thực tập KHTN

Báo cáo thực tập hóa học

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI

AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ

MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh

MSSV: 40201104

Giáo viên hướng dẫn: Ths. Huỳnh Thị Nhàn

Ths. Nguyễn Thị Tuyết Nhung

TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI

AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ

MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh

MSSV: 40201104

Giáo viên hướng dẫn: Ths. Huỳnh Thị Nhàn

Ths. Nguyễn Thị Tuyết Nhung

TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ

KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

CPT, nền

Đánh giá

Xử lý mẫu

Phương pháp

mẫu

phương pháp

Trong nước

(5)

(6)

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM

)

H O E M

(

V %

)

N C A

(

V %

)

H O e M

(

V %

)

H O e M

(

V %

10 Thời gian (phút)

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

T

Thời gian

Tốc độ dòng

% MeOH

% (H3PO4 0,03%)

Curve

(phút)

(mL/phút)

)

U A

( h c í t n ệ i D

)

U A

( h c í t n ệ i D

tR

Speak

Lần

AO

RB

AO

RB

Trung bình

RSD%