Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại Viện Tim mạch Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

VŨ PHƯƠNG THẢO

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA

ĐỘ NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI KIỂU

GEN CYP2C19*2, CYP2C19*3 VÀ MỘT

SỐ YẾU TỐ KHÁC TRÊN BỆNH NHÂN

ĐAU THẮT NGỰC KHÔNG ỔN ĐỊNH

TẠI VIỆN TIM MẠCH VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: VŨ PHƯƠNG THẢO

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA

ĐỘ NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI KIỂU

GEN CYP2C19*2, CYP2C19*3 VÀ MỘT

SỐ YẾU TỐ KHÁC TRÊN BỆNH NHÂN

ĐAU THẮT NGỰC KHÔNG ỔN ĐỊNH

TẠI VIỆN TIM MẠCH VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2013.Y

Người hướng dẫn: 1. ThS.BS. Nguyễn Thị Thúy Mậu

2. ThS.BS. Vũ Ngọc Trung

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự

quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình và bạn bè.

Lời đầu tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin trân trọng cảm

ơn ThS.BS. Nguyễn Thị Thúy Mậu và ThS.BS. Vũ Ngọc Trung là người hướng dẫn

khoa học, người thầy đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành

nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp ĐHQGHN, mã số QG.15.32 đã

cung cấp kinh phí, tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Khoa Y Dược cùng các thầy cô bộ

môn Y Dược học cơ sở đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi

thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các bác sỹ và nhân viên Viện Tim

mạch Việt Nam đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện nghiên cứu.

Xin bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình, người thân và bạn bè,

những người đã luôn ở bên cổ vũ, khuyến khích, động viên và tạo mọi điều kiện giúp

đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này.

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới những bệnh nhân đã tham gia vào nhóm

nghiên cứu, sự đóng góp của các bệnh nhân đã giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt

nghiệp này.

Hà Nội, ngày 28 tháng 05 năm 2018

Sinh viên

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Vũ Phương Thảo

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

American college of Cardiology: Trường môn Tim mạch Hoa Kỳ American Heart Association: Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ ACC AHA

Adenosin diphosphate ADP

CK - MB Creatine Kinase Myocardial Band isoenzyme

Cyclooxygenase C-Reactive Protein: Protein phản ứng C COX CRP

Deoxyribonucleic Acid DNA

Deoxyrinucleotidtriphosphate dNTP

Động mạch vành Đau thắt ngực không ổn định ĐMV ĐTNKÔĐ

Đái tháo đường ĐTĐ

Ethylendiamin Tetraacetic Acid EDTA

Giải trình tự GTT

Glycoprotein GP

Group protein G-protein

Hội chứng động mạch vành cấp HCĐMVC

High Density Lipoprotein: Lipoprotein có tỷ trọng phân tử cao HDL

Low Density Lipoprotein: Lipoprotein có tỷ trọng phân tử thấp LDL

Mean Corpuscular Volume: Thể tích trung bình hồng cầu MCV

Mean Platelet Volume: Thể tích trung bình tiểu cầu MPV

Nhồi máu cơ tim NMCT

Ngưng tập tiểu cầu NTTC

Polymerase chain reaction: Phản ứng chuỗi polymerase PCR

Prostaglandin H2 PGH2

Prostaglandin I2 PGI2

PLT RBC RLCH lipid RFLP

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Platelet Count: Số lượng tiểu cầu Red Blood Cell: Số lượng hồng cầu Rối loạn chuyển hóa lipid Restriction fragment length polymorphism: Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn Single Nucleotide polymorphism: Đa hình đơn nucleotide Tăng huyết áp SNP THA

TXA2 Thromboxan A2

vWF von Willebrand factor: yếu tố von Willebrand

WBC White Blood Cell: Số lượng bạch cầu

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

XVĐM Xơ vữa động mạch

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự mồi nhân dòng các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 ............. 24

Bảng 2.2. Quy trình PCR cho alen *2 ...................................................................... 25

Bảng 2.3. Quy trình PCR cho alen *3 ...................................................................... 25

Bảng 2.4. Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *2 ................................. 26

Bảng 2.5. Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *3 ................................. 26

Bảng 2.6. Cách đọc kết quả kiểu gen CYP2C19 ..................................................... 27

Bảng 3.1. Phân bố các yếu tố nguy cơ ở nhóm nghiên cứu .................................... 32

Bảng 3.2. Kết quả cận lâm sàng của nhóm nghiên cứu .......................................... 33

Bảng 3.3. Kết quả đo độ NTTC của bệnh nhân ĐTNKÔĐ .................................... 34

Bảng 3.4. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của sản phẩm tách DNA ............... 34

Bảng 3.5. Kết quả kiểu gen và tần số alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 .............. 39

Bảng 3.6. Tần số phân bố các kiểu gen CYP2C19 của nhóm nghiên cứu .............. 39

Bảng 3.7. Tỉ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý do kiểu gen quy định .......... 40

Bảng 3.8. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*3 .................................... 40

Bảng 3.9. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*2 .................................... 40

Bảng 3.10. Độ NTTC giữa các kiểu tác dụng dược lý do kiểu gen quy định ........... 41

Bảng 3.11. Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố nguy cơ: Hút thuốc lá,

RLCH lipid, ĐTĐ, THA và béo phì ...................................................... 42

Bảng 3.12. Mối liên quan giữa độ NTTC với số lượng yếu tố nguy cơ .................. 43

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Bảng 3.13. Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố cận lâm sàng ............. 43

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Phân bố số lượng bệnh nhân ĐTNKÔĐ theo giới ............................... 31

Biểu đồ 3.2. Đặc điểm về tuổi của bệnh nhân ĐTNKÔĐ ......................................... 31

Biểu đồ 3.3. Phân bố số lượng yếu tố nguy cơ của bệnh nhân ĐTNKÔĐ ............... 32

Biểu đồ 3.4. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*2 .................................. 41

Biểu đồ 3.5. Độ NTTC giữa tác dụng (giảm + kém) và tác dụng bình thường ........ 41

Biểu đồ 3.6. Tần số alen của gen CYP2C19 ............................................................. 51

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Biểu đồ 3.7. So sánh tần số phân bố các alen CYP2C19 .......................................... 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ ................................................................ 4

Hình 1.2. Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng .......................... 5

Hình 1.3. Bám dính và ngưng tập tiểu cầu .................................................................. 7

Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của aspirin lên quá trình NTTC ....................................... 8

Hình 1.5. Quá trình chuyển hóa clopidogrel và công thức cấu tạo của các chất sau

mỗi bước chuyển hóa .............................................................................. 9

Hình 1.6. Cơ chế tác dụng clopidogrel lên quá trình NTTC ..................................... 10

Hình 1.7. Mô tả single nucleotide polymorphism (SNP) .......................................... 10

Hình 1.8. Vị trí gen CYP2C19 trên nhiễm sắc thể số 10 .......................................... 12

Hình 1.9. Vị trí của các exon (hộp đen) và một số alen trên gen CYP2C19 ............ 12

Hình 1.10. Vai trò của enzyme Cytochrome P450 trong chuyển hóa thuốc ............. 15

Hình 1.11. Quy trình PCR ......................................................................................... 16

Hình 1.12. Các kiểu cắt RE ....................................................................................... 17

Hình 2.1. Nguyên lý của xét nghiệm độ NTTC........................................................28

Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel Agarose 0,7%............................................35

Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR nhân vùng gen chứa alen CYP2C19*2 (719 bp) và

CYP2C19*3 (898 bp) trên gel agarose 1%................................................35

Hình 3.3. Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*2.. ..................................................36

Hình 3.4. Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*3.....................................................37

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm cắt của alen CYP2C19*2 trên gel agarose 1,5%

...................................................................................................................38

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt của alen CYP2C19*3 trên gel agarose 1,5%

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

...................................................................................................................38

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................................. 3

1.1. Đau thắt ngực không ổn định ..................................................................... 3

1.1.1. Định nghĩa ....................................................................................... 3

1.1.2. Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ ..................................................... 3

1.1.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán đau thắt ngực không ổn định ......................... 5

1.2. Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu ............................................................... 5

1.2.1. Sinh lý tiểu cầu ................................................................................. 5

1.2.2. Quá trình ngưng tập tiểu cầu ........................................................... 6

1.2.3. Điều trị ức chế NTTC trong ĐTNKÔĐ ........................................... 7

1.2.4. Thuốc chống NTTC aspirin và clopidogrel ..................................... 8

1.3. Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C19 ...................................... 10

1.3.1. Đa hình đơn nucleotide .................................................................. 10

1.3.2. Gen CYP2C19 và vai trò của chúng trong chuyển hóa thuốc ....... 11

1.3.2.1. Gen CYP2C19……………………………………………...11

1.3.2.2. Vai trò của CYP2C19 trong chuyển hóa thuốc .................... .13

1.3.3. Các phương pháp phát hiện kiểu gen CYP2C19 ........................... 15

1.4. Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen

CYP2C19 và các yếu tố khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ trên thế giới và

trong nước .............................................................................................. 19

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................ 19

1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................. 19

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 21

2.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 21

2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn ....................................................................... 21

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ......................................................................... 21

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 21

2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 21

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

2.4. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu ................................................. 21

2.4.1. Hóa chất ......................................................................................... 21

2.4.2. Thiết bị ........................................................................................... 22

2.5. Các bước nghiên cứu ............................................................................... 22

2.5.1. Quy trình nghiên cứu ..................................................................... 22

2.5.2. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu .................................................. 23

2.5.3. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số ........................... 23

2.5.3.1. Tách chiết DNA tổng số ....................................................... 23

2.5.3.2. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số ....................................... 23

2.5.4. Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3

bằng PCR và kiểm tra chất lượng sản phẩm ................................. 24

2.5.4.1. Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2,

CYP2C19*3 bằng PCR ................................................................. 24

2.5.4.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR…………………….....24

2.5.5. Tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................... 25

2.5.6. Xác định kiểu gen của SNP CYP2C19*2, *3 sử dụng phương pháp

cắt bằng enzyme giới hạn (RFLP) có đối chiếu với phương pháp

giải trình tự .................................................................................... 26

2.5.7. Cách đọc kết quả kiểu gen CYP2C19 ........................................... 27

2.5.8. Xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu ............................................ 27

2.6. Xử lý và phân tích số liệu........................................................................ 29

2.7. Các loại sai số và cách khắc phục ........................................................... 29

2.7.1. Sai số mắc phải .............................................................................. 29

2.7.2. Cách khắc phục sai số .................................................................... 30

2.8. Đạo đức nghiên cứu ................................................................................ 30

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................ 31

3.1. Kết quả…………………………….....………………………………...31

3.1.1. Một số đặc điểm chung .................................................................. 31

3.1.2. Kết quả đo một số chỉ số cận lâm sàng.......................................... 32

3.1.3. Kết quả đo độ NTTC ..................................................................... 34

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

3.1.4. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 ............ 34

3.1.5. Mối quan hệ giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19*2 và

CYP2C19*3 .................................................................................. 40

3.1.6. Mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố khác .......................... 42

3.2. Bàn luận ................................................................................................... 44

3.2.1. Một số đặc điểm chung…………….……………………………..45

3.2.1.1. Đặc điểm về giới……………………………………….…..45

3.2.1.2. Đặc điểm về tuổi…………………………………………..45

3.2.1.3. Các yếu tố nguy cơ của ĐTNKÔĐ………………….……..45

3.2.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng ....................................................... 47

3.2.3. Kết quả đo độ NTTC ..................................................................... 48

3.2.4. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 ............ 49

3.2.5. Mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19*2 và

CYP2C19*3………………………………………………………54

3.2.6.1. Mối liên quan giữa độ NTTC và giới……….......................54

3.2.6. Mối liên quan giữa độ NTTC với các yếu tố khác ........................ 54

3.2.6.2. Mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố nguy cơ……...54 KẾT LUẬN………………………………………………………………..........57

KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 58

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 59

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đau thắt ngực không ổn định (ĐTNKÔĐ) là một dạng trong hội chứng động mạch vành cấp (HCMVC). Nguyên nhân dẫn đến ĐTNKÔĐ là do sự nứt vỡ của các

mảng xơ vữa không ổn định, hình thành nên các cục máu đông nhưng chưa gây tắc

hoàn toàn động mạch vành. Tuy nhiên, ĐTNKÔĐ có thể diễn biến nặng thành nhồi

máu cơ tim thực sự và gây nên các biến cố tim mạch [26]. Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh,

tử vong ngày càng tăng và trở thành gánh nặng cho ngành y tế. Mỗi năm tại Hoa Kì có hơn 5 triệu bệnh nhân nhập viện cấp cứu với cơn đau ngực và các triệu chứng liên

quan, trong đó 1,4 triệu bệnh nhân là ĐTNKÔĐ hoặc nhồi máu cơ tim không ST

chênh [33]. Do đó, để giảm tỷ lệ tử vong cùng các biến cố tim mạch cho bệnh nhân

ĐTNKÔĐ thì một trong những điều trị cốt lõi là chống hình thành huyết khối thông qua ức chế hoạt động của tiểu cầu [53].

Clopidolgrel là một thuốc chống ngưng tập tiểu cầu (NTTC) được chỉ định đối

với bệnh nhân HCĐMVC và can thiệp mạch vành qua da. Kết hợp clopidogrel với

aspirin được khuyến cáo là lựa chọn đầu tay trong điều trị ức chế ngưng tập tiểu cầu

theo nhiều cơ chế khác nhau. Bản thân clopidogrel là một tiền chất thuộc nhóm

thienopyridine không có hoạt tính. Để trở thành chất có hoạt tính ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 trên màng tiểu cầu gây giảm ngưng tập tiểu cầu, chúng cần được

chuyển hóa qua hệ thống cytochrome P450 (chủ yếu là CYP2C19) ở gan [54], [68].

Nghiên cứu cho thấy, clopidogrel có tác dụng làm giảm tới 50% các biến chứng tim

mạch chính (nhồi máu cơ tim, đột quỵ) ở những bệnh nhân HCĐMVC. Tuy nhiên,

hiện tượng kháng clopidogrel chiếm tỉ lệ khá lớn, dao động từ 5- 44% trong các quần

thể khác nhau, gây nên giảm khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu của clopidogrel

[30]. Do đó, vẫn còn một tỉ lệ đáng kể bệnh nhân có nguy cơ tử vong, nhồi máu cơ

tim (NMCT), đột quỵ, huyết khối trong stent lên quan đến giảm đáp ứng clopidogrel

[66]. Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau trong đáp ứng điều trị là do ảnh hưởng của enzyme CYP2C19 lên quá trình chuyển hóa của clopidogrel [66].

Enzyme CYP2C19 có tính đa hình cao với khoảng 25 alen đã được xác định, trong đó quan trọng nhất là alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3, chiếm tần số cao trong quần thể người châu Á [66]. Đa hình di truyền CYP2C19*2 và CYP2C19*3 có thể mã hóa tạo enzym giảm hoặc mất chức năng chuyển hóa thuốc, qua đó giảm khả năng chuyển clopidogrel thành dạng có hoạt tính kháng tiểu cầu dẫn đến tăng các biến cố tim mạch. Hơn nữa, ở những bệnh nhân mang alen CYP2C19*2, nguy cơ xảy ra các biến cố tim mạch tăng gấp 3 lần so với những người không mang alen này [71]. Tuy

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

1

nhiên, cơ chế đáp ứng điều trị kém clopidogrel chưa được làm sáng tỏ đầy đủ, không

chỉ do yếu tố di truyền như đa hình gen CYP2C19 mà còn do ảnh hưởng của nhiều

yếu tố khác như sự tương tác thuốc, không tuân thủ điều trị, giới tính, tuổi hay các

yếu tố lâm sàng kèm theo như tăng huyết áp (THA), đái tháo đường (ĐTĐ), hút thuốc lá, rối loạn chuyển hóa lipid (RLCH lipid), béo phì…[30].

Hiện nay, năm 2015, tại Việt Nam đã có một nghiên cứu của Trần Hòa tại Đại

học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh về mối tương quan giữa kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và tiên lượng ở bệnh nhân được can thiệp đặt stent động mạch vành

(ĐMV) có điều trị clopidogrel. Tuy nhiên, nghiên cứu này chỉ tiến hành trên những

đối tượng bệnh nhân đã được can thiệp ĐMV tại khu vực phía Nam - Việt Nam. Do

vậy, tính đến thời điểm này, vẫn chưa có nghiên cứu nào về đa hình di truyền gen CYP2C19 ở bệnh nhân ĐTNKÔĐ tiến hành tại khu vực phía Bắc - Việt Nam nhằm

đưa ra câu trả lời cho các vấn đề nêu ở trên. Vì vậy, xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2,

CYP2C19*3 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định

tại Viện Tim mạch Việt Nam”.

Đề tài được tiến hành với 2 mục tiêu:

1. Xác định tần số phân bố kiểu gen CY2C19*2 và CYP2C19*3 trên bệnh nhân

đau thắt ngực không ổn định.

2. Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2,

CYP2C19*3 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Đau thắt ngực không ổn định

1.1.1. Định nghĩa

ĐTNKÔĐ là một dạng trong HCĐMVC, được định nghĩa bởi sự xuất hiện các

triệu chứng lâm sàng của thiếu máu cơ tim (cơn đau thắt ngực mới xuất hiện hoặc

biến đổi các dạng đau ngực, hoặc sự gia tăng cơn đau thắt ngực lúc nghỉ ngơi, hoặc

những biến đổi đau thắt ngực tương đương), không có sự xuất hiện các dấu ấn sinh học do tổn thương cơ tim (troponin), điện tâm đồ có thể thay đổi [29].

1.1.2. Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ

Xơ vữa động mạch (XVĐM) là quá trình tiến triển bởi sự hình thành các mảng

xơ vữa ở lớp nội mô của động mạch vừa và lớn, diễn ra liên tục và dẫn đến thiếu máu

cấp tính. Các yếu tố nguy cơ như: cholesterol máu cao, THA, ĐTĐ, hút thuốc lá, đóng

vai trò thiết yếu trong khởi phát XVĐM [43]. Chúng làm tổn thương đến tế bào nội mô

của mạch máu và gây rối loạn chức năng nội mô bằng cách làm giảm hoạt tính sinh

học của nitric oxyde, tăng sản xuất endothelin, làm tổn thương mạch máu, tăng biểu lộ

phân tử kết dính (selectin, phân tử kết dính tế bào mạch, phân tử kết dính giữa các tế

bào) và tăng cường quá trình đông máu [39].

Viêm đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của mảng xơ vữa. Khi các tế

bào nội mô bị tổn thương, các tế bào viêm đặc biệt là monocyte sẽ gắn với các phân

tử dính nội mô, đi vào lớp dưới nội mô và biệt hóa thành đại thực bào. Các đại thực

bào ăn các phân tử LDL, chuyển thành tế bào bọt và hình thành lên dải chất béo. Để

duy trì quá trình viêm, đại thực bào được hoạt hóa sẽ thu hút thêm các đại thực bào

khác bằng cách tiết ra các chất trung gian. Thêm vào đó, đại thực bào cũng kích thích

sự tăng sinh và hình thành tế bào cơ trơn ở lưới ngoại bào thông qua việc tiết ra các

cytokin, góp phần hình thành các mô xơ bởi lưới ngoại bào [43].

Nguy cơ vỡ mảng xơ vữa phụ thuộc vào kiểu mảng xơ vữa hơn là kích thước.

Lõi vữa của mảng xơ vữa giàu lipid và không có collagen nâng đỡ. Nghiên cứu cho thấy kích thước của lõi vữa tỉ lệ thuận với khả năng vỡ mảng xơ vữa [40]. Thêm vào đó, viêm là một nhân tố quan trọng làm mảng xơ vữa dễ bị tổn thương, liên quan đến tăng hoạt động của đại thực bào và lympho T tại vị trí mảng. Sự tăng hoạt động này làm kích thước của lõi xơ vữa lớn lên và làm mỏng vỏ bao xơ của mảng do đại thực bào tạo ra metalloproteinase – enzym tiêu khung ngoại bào và tế bào lympho T cũng tiết ra các enzyme tiêu khung ngoại bào mạnh như tryptase, chymase [56]. Bên cạnh

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

3

đó, các phân tích bệnh học còn cho thấy, có sự thiếu các tế bào cơ trơn tại các mảng

xơ vữa dễ tổn thương. Các chất trung gian trong quá trình viêm có thể làm cho các tế

bào cơ trơn chết theo chương trình hoặc ức chế sự tổng hợp các chất collagen từ tế

bào cơ trơn [56]. Tóm lại, các mảng xơ vữa có nguy cơ cao hay dễ bị tổn thương nếu chúng có các đặc điểm sau: lõi xơ vữa lớn, vỏ bao xơ mỏng, tập trung dày đặc đại

thực bào và lympho T, lượng nhỏ tế bào cơ trơn, tăng biểu hiện tại chỗ của

metalloproteinase sẽ làm thoái hóa collagen, tăng sinh mạch và xuất huyết tại mảng xơ vữa [40].

Hình 1.1. Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ

(Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJM199901143400207)

Khi mảng xơ vữa vỡ ra, lớp dưới nội mô lộ ra (giàu các yếu tố mô và tiền yếu tố đông máu) tiếp xúc với tiểu cầu, dẫn đến hoạt hóa các thụ thể trên bề mặt tiểu cầu, hoạt hóa quá trình ngưng kết tiểu cầu và kết quả là hình thành huyết khối. Nếu mảng vỡ nhỏ và cục huyết khối không làm tắc hoàn toàn động mạch vành, chỉ làm giảm dòng máu tới vùng cơ tim do động mạch đó nuôi dưỡng, thì biểu hiện lâm sàng là cơn đau

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

4

thắt ngực không ổn định. Nội soi động mạch vành cho thấy 73,7% bệnh nhân

ĐTNKÔĐ có huyết khối trong lòng động mạch vành [27,56].

1.1.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán đau thắt ngực không ổn định

Chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn của ACCF/AHA (2012) (American

college of Cardiology Foundation/ American Heart Association) [53]:

- Lâm sàng: cơn ĐTNKÔĐ có thể hiện diện dưới các dạng thức khác nhau:

+ Cơn đau thắt ngực xuất hiện dưới đây (4-8) tuần. + Cơn đau thắt ngực trầm trọng dần thêm (tần số hoặc cường độ hoặc thời gian

các cơn đau, giảm đáp ứng với các dẫn xuất nitrat).

+ Cơn đau thắt ngực kéo dài lúc nghỉ ngơi (>15-20 phút) nhưng đáp ứng với

các dẫn xuất nitrat (nếu không có thể đó là nhồi máu cơ tim không có sóng Q).

- Điện tâm đồ lúc nghỉ có thể thay đổi.

- Men CK-MB, troponin T, Ic không tăng.

1.2. Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu

1.2.1. Sinh lý tiểu cầu

Tiểu cầu là thành phần hữu hình nhỏ nhất của máu, hình đĩa, đường kính 3-4µm,

không nhân, được sản xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu ở tủy xương. Quan sát dưới kính

hiển vi, tiểu cầu có cấu trúc siêu phức tạp, gồm hệ thống màng, hệ thống vi quản, hệ

thống ống đặc, nhiều hạt và hệ thống các kênh mở. Màng tiểu cầu gồm 2 lớp lipid kép

bao quanh tiểu cầu, có các glycoprotein (GP) tác dụng như các thụ thể (receptor) bề

mặt và là nơi diễn ra các hoạt động đông máu của tiểu cầu [10]. Ngoài ra, màng tiểu

cầu cũng có thể nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong [63].

Hình 1.2. Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [10]

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

5

1.2.2. Quá trình ngưng tập tiểu cầu

Ở trạng thái sinh lý bình thường, khi mạch máu nguyên vẹn, tiểu cầu bị bất

hoạt, không bám dính được do hoạt động của nitric oxide, prostacyclin và do khả

năng kìm hãm kích hoạt ADP của ADPase (adenosin diphotphatase) từ các tế bào nội mô. Tuy nhiên, khi mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu sẽ nhanh chóng bám dính vào

thành mạch, thay đổi hình dạng, bài tiết và ngưng tập thông qua một loạt phản ứng

dẫn đến hình thành nút tiểu cầu tại mô tổn thương. Quá trình tạo tiểu cầu hoạt hóa có thể được chia thành các bước: bám dính, ngưng tập và phóng thích các chất [50].

➢ Giai đoạn bám dính

Khi mạch máu bị tổn thương, các yếu tố kháng tiểu cầu nội sinh bị suy yếu, để

lộ lớp dưới nội mô có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố von Willebrand (vWF), fibronectin, lamilin…[50,63]. Khi tốc độ dòng máu cao, vWF

đóng vai trò quan trọng trong bám dính tiểu cầu ban đầu thông qua liên kết với phức

hợp GP Ib/IX/V. Tuy nhiên, khi tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh thì bám dính tiểu

cầu ban đầu chủ yếu thông qua liên kết của collagen với phức hợp GP Ia//IIa. Những

tương tác này giúp tiểu cầu lưu thông chậm lại, từ đó giúp các cặp thụ thể - phối tử

tương tác, ràng buộc hơn nữa dẫn đến sự bám dính tĩnh [50,52]. Đặc biệt, sự tương

tác ban đầu giữa collagen và GP VI làm hoạt hóa các thụ thể GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa.

vWF và collagen hình thành liên kết mạnh với GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa [50].

➢ Giai đoạn ngưng tập

Trong giai đoạn NTTC, tiểu cầu dính với nhau tạo thành từng đám (nút tiểu

cầu). GP IIb/IIIa là một thụ thể có vai trò quan trọng trong giai đoạn này, có khoảng

4000 - 5000 phức hợp GP IIb/IIIa trên bề mặt của màng tiểu cầu bất hoạt. Khi tiểu

cầu hoạt hóa, các GP IIb/IIIa mới được hoạt hóa, chúng hoạt động như thụ thể gắn

với fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin. Tuy nhiên chúng gắn với fibrinogen là chủ yếu vì fibrinogen có nồng độ cao trong huyết tương và GP IIb/IIIa có ái lực với

fibrinogen là mạnh nhất. Khi liên kết này xảy ra trên các tiểu cầu sẽ tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa. Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau, diễn ra liên tục cho đến

khi tạo thành nút tiểu cầu [10,50]. Một số chất có khả năng gây NTTC như: ADP, adrenalin, thromboxan A2, collagen, ristocetin…, trong đó ADP là chất gây NTTC

quan trọng nhất vì chúng không phụ thuộc vào tác nhân khác và còn giúp cho phản

ứng ngưng tập của các tác nhân khác diễn ra đầy đủ hơn. Hơn nữa, ADP còn có nguồn

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

6

gốc từ hồng cầu. Do đó, ở những thành mạch bị tổn thương, hồng cầu sẽ bài tiết ADP,

làm tăng nhanh nồng độ ADP, giúp tăng NTTC, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban

đầu, làm ngừng chảy máu. ADP phát huy hiệu quả tối đa khi gắn kết với cả 3 thụ thể

trên tiểu cầu: P2Y1, P2Y12, P2X1, trong đó P2Y1, P2Y12 là 2 thụ thể cần thiết cho hiện tượng NTTC xảy ra tối đa. Chúng là một trong những trọng tâm của nghiên cứu

về thuốc ức chế NTTC trong dự phòng và điều trị huyết khối [10].

➢ Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu

Sau khi bị ngưng tập bởi các chất gây ngưng tập, các tiểu cầu sẽ xảy ra một

loạt các biến đổi như quá trình thay đổi hình dạng và phóng thích các yếu tố của tiểu

cầu. Quá trình này rất phức tạp, tiểu cầu biến đổi cả về hình thái và sinh hóa [69].

Hình 1.3. Bám dính và ngưng tập tiểu cầu

(Nguồn:https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC4265014_40681_20 14_24_Fig1_HTML&req=4 )

1.2.3. Điều trị ức chế NTTC trong ĐTNKÔĐ

Chống hình thành huyết khối thông qua ức chế hoạt hóa tiểu cầu là điều trị cốt lõi trong ĐTNKÔĐ, giúp làm giảm các biến cố tim mạch và giảm tỉ lệ tử vong cho

người bệnh [53]. Theo cơ chế tác dụng, các thuốc chống NTTC được phân loại như sau [63]:

- Thuốc ức chế Cyclooxygenase (aspirin). - Thuốc ức chế thụ thể ADP (clopidogrel [Plavix], prasugrel [Effient],

ticlopidine [Ticlid]).

- Thuốc ức chế phosphodiesterase (cilostazol [Pletal]).

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

7

- Thuốc ức chế thụ thể GPIIb/IIIa (abciximab [ReoPro], eptifibatide [Integrilin],

tirofiban [Aggrastat]).

- Thuốc ức chế tái hấp thu Adenosin (dipyridamole [Persantine]). - CPTPs (cyclo-pentyl-triazolo-pyrimidines [Ticagrelor]).

1.2.4. Thuốc chống NTTC aspirin và clopidogrel

1.2.4.1. Aspirin

Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của aspirin lên quá trình NTTC

(Nguồn: http://tmedweb.tulane.edu/pharmwiki/doku.php/introduction_to_eicosanoids)

Aspirin là thuốc chống tiểu cầu được nghiên cứu rộng rãi nhất và được sử dụng

phổ biến trên lâm sàng. Hơn 100 thử nghiệm ngẫu nhiên ở những bệnh nhân có nguy

cơ cao đều cho thấy aspirin làm giảm tử vong do mạch máu xuống khoảng 15% và

các biến cố tim mạch không gây tử vong xuống khoảng 30%. Aspirin ức chế chọn

lọc exzyme cyclooxygenase (COX) do gắn vào gốc Ser ở vị trí 529 của COX-1 và

gắn vào gốc Ser ở vị trí 516 của COX-2, làm bất hoạt enzyme này, dẫn đến ngăn chặn quá trình biến đổi acid arachidonic thành prostaglandin H2 (PGH2). PGH2 là cơ chất của nhiều isomerase tạo ra các prostanoid có hoạt tính sinh học khác nhau, chủ yếu là thromboxan A2 (TXA2) và PGI2. TXA2 khi gặp các tác nhân kích thích (collagen, thrombin, ADP) sẽ được tổng hợp và phóng thích bởi tiểu cầu, chúng có tác dụng gây co mạch mạnh và gây NTTC không hồi phục thông qua thụ thể TXA2. Aspirin ức chế COX-1 gây ức chế tạo TXA2, dẫn đến ức chế NTTC. Vì tiểu cầu không có nhân,

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

8

không thể tổng hợp thêm COX-1 mới nên sự ức chế này rất mạnh, diễn ra trong suốt

đời sống của tiểu cầu. Tuy nhiên, aspirin còn ức chế men prostacyclin synthetase dẫn đến ức chế sự tổng hợp chất prostaglandin kháng đông là PGI2 (có tác dụng ức chế NTTC và giãn mạch) của tế bào nội mạc, kết quả là kích thích NTTC. Nhưng do các tế bào nội mạc có nhân có thể tổng hợp ra men mới nên tác dụng này không mạnh

bằng tác dụng ức chế men COX và không kéo dài [54,68].

1.2.4.2. Clopidogrel

Clopidogrel không có hoạt tính chống NTTC. Sau khi được hấp thu tại ruột,

có tới 85% lượng clopidogrel được chuyển hóa bởi các enzyme esterase:

carboxylesterase (CES), butyrylcholinesterase (BchE) thành chất không có hoạt tính.

Chỉ có 15% lượng thuốc được chuyển hóa qua hai bước ở gan bởi hệ thống enzyme P-450 (chủ yếu là CYP2C19) tạo thành chất có hoạt tính. Chất này có tác dụng ức

chế chọn lọc và không hồi phục quá trình gắn phân tử ADP (adenosin diphosphate) vào các thụ thể (P2Y12) của nó lên bề mặt tiểu cầu, dẫn đến các cảm thụ GPIIb/IIIa

không được hoạt hóa và dẫn đến các tiểu cầu không kết dính được với nhau [54,68].

Hình 1.5. Quá trình chuyển hóa clopidogrel và công thức cấu tạo của các chất sau mỗi bước chuyển hóa

(Nguồn: https://www.researchgate.net/figure/Clopidogrel-metabolism-and-its- conversion-to-an-active-metabolite-Clopidogrel-AM-via_fig1_313838290)

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

9

Hình 1.6. Cơ chế tác dụng clopidogrel lên quá trình NTTC

(Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0808227 )

1.3. Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C19

1.3.1. Đa hình đơn nucleotide

Đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism – SNP – đọc là

“snip”) là biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA ở người. Gen là một đoạn phân

tử DNA mang thông tin mã hóa cho một sản phẩm nhất định. Một gen chứa rất nhiều

nucleotide (gồm 4 loại A, T, G và C). Mỗi SNP đại diện cho sự khác biệt một

nucleotide trong gen đó, tạo nên sự khác biệt về một gen giữa các cá thể. Ví dụ, một

SNP có thể thay thế nucleotide cytosine (C) bằng nucleotide thymine (T). Các SNP

là sự khác biệt duy nhất, là cơ sở tồn tại giữa các cá nhân [44].

Hình 1.7. Mô tả single nucleotide polymorphism (SNP) (Nguồn: https://www.tubascan.eu/tubascan/snp/)

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

10

SNP được xác định khi tần số xuất hiện của một alen phải lớn hơn hoặc bằng

1%. Mặc dù, theo lý thuyết, có thể xuất hiện 1 trong 4 loại nucleotide, nhưng thông

thường SNP chỉ xuất hiện 2 loại alen. Có thể giải thích điều này là do SNP bắt nguồn

từ một đột biến điểm xảy ra trong hệ gen, chuyển một nucleotide này sang một nucleotide khác. Nếu đột biến xảy ra trong tế bào sinh sản của cơ thể, thì các thế hệ

sau sẽ mang đột biến này, và qua nhiều thế hệ sẽ hình thành SNP trong quần thể. Tuy

nhiên, chỉ có 2 alen – một alen gốc và một alen đột biến. Để có alen thứ 3, cần phải có một đột biến mới xảy ra ở đúng vị trí trước đó trong hệ gen, và cá thể mang đột

biến phải di truyền lại được cho các thế hệ sau. Khả năng xảy ra là rất hiếm, do đó

phần lớn SNP chỉ có 2 alen [78].

SNP có thể xảy ra trong vùng mã hóa nhưng không gây ra sự thay đổi trong trình tự axit amin, có thể xảy ra ở một vùng mã hóa với sự thay đổi trình tự axit amin,

có thể xảy ra trong vùng điều khiển gây ra sự thay đổi biểu hiện gen, hoặc có thể xảy ra trong một vùng giữa các gen [75].

SNP xuất hiện một lần trong mỗi 300 nucleotide, nghĩa là có khoảng 10 triệu

SNP trong hệ gen của con người. Chúng có thể hoạt động như các marker sinh học,

giúp các nhà khoa học xác định vị trí các gen có liên quan đến bệnh tật. Khi SNP xảy

ra trong một gen hoặc ở vùng điều khiển gần gen, chúng có thể liên quan trực tiếp

đến bệnh tật bằng cách ảnh hưởng đến chức năng gen. Hầu hết các SNPs không ảnh

hưởng đến sức khoẻ con người. Tuy nhiên, một số SNP đã chứng tỏ được vai trò rất

quan trọng trong nghiên cứu sức khoẻ con người. Các SNP có thể giúp dự đoán phản

ứng của một cá nhân đối với một số loại thuốc nhất định, sự nhạy cảm với các yếu tố

môi trường như chất độc và nguy cơ phát triển thành bệnh lý cụ thể. SNP cũng có thể

được sử dụng để theo dõi sự di truyền của gen bệnh trong gia đình. Các nghiên cứu

tiếp theo trong tương lai sẽ được tiến hành để xác định các SNP liên quan đến các bệnh phức tạp như bệnh tim, tiểu đường và ung thư [44].

1.3.2. Gen CYP2C19 và vai trò của chúng trong chuyển hóa thuốc

1.3.2.1. Gen CYP2C19

Enzym cytochrome P450 là các protein màng có chứa hem (hem protein) nằm

ở lưới nội chất của tế bào gan. Enzyme CYP bao gồm CYP3A4, CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2 và CYP2E1, trong đó CYP2C19 là một enzyme quan trọng trong siêu họ

cytochrome P450 [80].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

11

Gen mã hóa cho CYP2C19 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 ở người

(10q23.33), có kích thước 90,637bp, từ cặp nucleotide 94,762,624 đến cặp nucleotide

94,853,260.

Hình 1.8. Vị trí gen CYP2C19 trên nhiễm sắc thể số 10

(Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP2C19#location )

Gen CYP2C19 gồm 9 exon, mã hóa cho protein CYP2C19 dài 490 axit amin.

Gen CYP2C19 có tính đa hình cao với 25 alen đã được xác định. Bên cạnh alen CYP2C19*1 quy định enzym CYP2C19 có hoạt tính chuyển hóa thuốc bình thường

thì các alen như alen *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *17 quy định enzyme CYP2C19 giảm,

mất hoặc tăng hoạt tính [73]. Trong đó alen *2, *3 là 2 đa hình alen quan trọng nhất,

chiếm tần số cao trong quần thể người châu Á [68].

(Nguồn: https://www.researchgate.net/figure/51745678_fig1_Figure-1-Illustration- of-the-CYP2C19-gene-highlighting-the-location-of)

Hình 1.9. Vị trí của các exon (hộp đen) và một số alen trên gen CYP2C19

➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 có chức năng bình thường

Alen CYP2C19*1: quy định biểu hiện enzym CYP2C19 có chức năng hoạt

động bình thường.

➢ Alen mã hóa cho enzym CYP2C19 giảm hoặc mất hoạt tính

- Alen đa hình CYP2C19*2

Alen có kí hiệu rs4244285 ở vị trí (c.681G>A) là đa hình xác định của alen

CYP2C19*2, đây là dạng đột biến đồng hoán thay G bằng A ở exon 5 làm xuất hiện một vị trí cắt nối intron - exon bất thường. Đa hình này tạo ra 3 kiểu gen gồm

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

12

kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG, kiểu gen dị hợp tử đột biến GA và kiểu gen

đồng hợp tử đột biến AA. Đột biến này làm khung đọc mRNA bị cắt ngắn hơn

bình thường và tạo ra dạng enzym không có hoạt tính. CYP2C19 *2 là dạng alen

mã cho enzyme CYP2C19 mất hoạt tính phổ biến nhất với tần số xuất hiện khoảng 12% ở người da trắng, 15% ở người Mỹ gốc Phi và 29-35% ở người châu Á [68].

- Alen đa hình CYP2C19*3

CYP2C19*3 cũng là dạng alen mã hóa cho enzym CYP2C19 mất hoạt tính có kí hiệu rs4986893 ở vị trí (c.636G>A), đây là dạng đột biến thay G bằng A ở exon 4

làm xuất hiện mã kết thúc sớm ở axit amin 212. Đa hình này tạo ra 3 kiểu gen, trong

đó, kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG, kiểu gen dị hợp tử đột biến GA và kiểu gen

đồng hợp tử đột biến AA. Tần số của alen CYP2C19*3 trong phần lớn các quần thể là dưới 1%, tuy nhiên tỷ lệ này cao hơn ở người châu Á với 2-9% [68].

Ngoài ra, các alen khác mã hóa cho enzym giảm hoặc mất hoạt tính là

CYP2C19*4 (rs28399504), *5 (rs56337013), *6 (rs72552267), *7 (rs72558186) và

*8 (rs41291556). Các alen này có tần số dưới 1% trong các quần thể người [68].

Một số alen khác cũng được xác định trong các quần thể khác nhau với rất ít

dữ liệu được mô tả hoặc được dùng các thuật toán phân tích để dự đoán ảnh hưởng

của chúng lên chức năng protein [68].

1.3.2.2. Vai trò của CYP2C19 trong chuyển hóa thuốc

Siêu họ enzyme Cytochrome 450 (Cyt-P450) tham gia vào quá trình chuyển

hóa phần lớn các thuốc khác nhau như thuốc chống ngưng tập tiểu cầu

clopidogrel (Plavix), thuốc chống động kinh mephenytoin, thuốc ức chế bơm proton

omeprazole, thuốc an thần diazepam…, trong đó enzyme CYP2C19 là enzyme chính

tham gia vào quá trình chuyển hóa thuốc clopidogrel [80].

Một thuốc A khi đưa vào trong cơ thể sẽ đi theo một hoặc các con đường sau [6]:

- Được hấp thu và thải trừ không biến đổi: bromid, lithi, saccharin. - Chuyển hóa thành chất B (pha I), sau đó thành chất C (pha II) và thải trừ. - Chuyển hóa thành chất D ( pha II) rồi thải trừ.

Chất A có thể có hoặc không có hoạt tính sinh học, sinh ra chất B có thể có

hoặc không có hoạt tính. Chất C, D luôn là chất không có hoạt tính. Chất A có thể

sinh ra nhiều loại chất B hoặc C [6].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

13

Pha I. Qua pha này thuốc ở dạng tan trong lipid sẽ phân cực hơn, dễ tan trong

nước hơn. Thuốc có thể mất, giảm, tăng hoặc trở nên có hoạt tính sinh học. Pha I xảy

ra các phản ứng như phản ứng khử, phản ứng thủy phân, nhưng thường gặp nhất là

phản ứng oxy hóa với sự tham gia của Cyt-P450 [80].

Pha II. Các thuốc đi qua pha này chủ yếu trở thành phức hợp không có hoạt

tính, dễ tan trong nước và bị thải trừ. Các phản ứng ở pha II đều là các phản ứng liên

hợp: một phân tử nội sinh (acid glucuronic, glutathion, sulfat, glycin, acetyl) sẽ ghép với một nhóm hóa học của thuốc để tạo thành các phức hợp tan mạnh trong nước.

Thông thường, các phản ứng ở pha I sẽ tạo ra các nhóm chức cần thiết cho các phản

ứng ở pha II như nhóm -OH, -COOH, -NH2, -SH... [80].

Như đã nói ở trên, ở pha I, phản ứng chính là phản ứng oxy hóa và là phản ứng phổ biến nhất có xúc tác của các enzym oxy hóa, đặc biệt là cyptochrome P450. Chu

trình phản ứng được thực hiện theo các bước chính sau [6]:

Bước 1. Thuốc (Drug) phản ứng với Cyt-P450 dạng oxy hóa (Fe3+) tạo phức hợp Drug - P450 (Fe3+). Cyt-P450 lúc này biến đổi đương lượng từ trạng thái spin thấp thành trạng thái spin cao. Sự biến đổi thế năng oxy hóa gây ra bằng cách này

giúp vận chuyển điện tử thứ nhất thuận lợi.

Bước 2. Nhận điện tử thứ nhất từ NADPH, dưới tác dụng xúc tác của enzym

Cyt-P450-reductase tạo phức hợp Drug-P450 dạng khử (Fe2+).

Bước 3. Phức hợp dạng khử này phản ứng với một phân tử oxy để tạo thành

phức hợp oxy hoạt hóa.

Bước 4. Phức hợp vừa tạo thành nhận tiếp điện tử thứ 2 từ phân tử NADPH

thứ 2 hoặc từ NADH. Hai điện tử nhận được khử phân tử oxy trong phức hợp thuốc

- enzym tạo thành hợp chất trung gian.

Bước 5. Oxy được hoạt hóa sẽ phản ứng với 2H+ (từ 2 phân tử NADPH+) tạo

thành phân tử nước, tách ra khỏi hợp chất trung gian trên.

Bước 6. Hợp chất mới thu được, được oxy hóa bằng nguyên tử oxy còn lại và được giải phóng (drug-OH); enzym Cyt-P450 trở về trạng thái oxy hóa ban đầu (Fe3+), hoàn thành một chu kì phản ứng.

Kết quả của quá trình chuyển hóa làm thuốc từ không có hoạt tính thành dạng

có hoạt tính.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

14

Hình 1.10. Vai trò của enzyme Cytochrome P450 trong chuyển hóa thuốc

(Nguồn: https://doctorlib.info/medical/biochemistry/32.html)

1.3.2.3. Mối liên quan giữa kiểu gen và hoạt tính enzym chuyển hóa thuốc

Hoạt tính enzyme chuyển hóa thuốc dựa vào kiểu gen theo các alen được

phân loại trong bảng như sau [67]:

Tần suất Hoạt tính enzym Kiểu gen

35 - 50% bệnh nhân Bình thường *1/*1

18 - 45% bệnh nhân Trung bình *1/*2, *1/*3

*2/*2, *2/*3, *3/*3 2 - 15% bệnh nhân Kém

1.3.3. Các phương pháp phát hiện kiểu gen CYP2C19

1.3.3.1. PCR - RFLP

➢ PCR

PCR (polymerase chain reaction) được dùng để khuếch đại một chuỗi DNA.

Nguyên tắc của PCR là dùng DNA polymerase để tổng hợp phân tử DNA mới từ trình tự của DNA làm khuôn với tiền chất là các dNTP. Chuỗi phản ứng gồm các bước: khởi đầu, biến tính, gắn mồi, kéo dài chuỗi và kết thúc. Cụ thể, người ta tổng

hợp và sử dụng hai đoạn oligonucleotide có vị trí liên kết chặn ở 2 đầu của đoạn DNA cần nhân dòng. Đoạn thứ nhất có trình tự bổ sung với đầu 5’ của mạch mã hóa là mồi xuôi, đoạn thứ hai có trình tự bổ sung với đầu 5’ của mạch đối mã là mồi ngược.

DNA khuôn được biến tính bởi nhiệt, tạo điều kiện cho mồi xuôi, mồi ngược đính vào các vị trí ở 2 đầu đoạn DNA cần nhân dòng. Với sự có mặt của các tiền chất là dNTP, DNA polymerase sẽ nhân dòng đoạn trình tự DNA được giới hạn bởi 2 đoạn mồi. Trong PCR, DNA được gây biến tính và sự tổng hợp DNA diễn ra lặp lại qua

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

15

nhiều chu kì nhờ khả năng điều nhiệt của máy. Kết quả là, sau mỗi chu kì, số phân tử

DNA lại tăng gấp đôi. Đây là phản ứng có độ nhạy cao. Vậy nên, chỉ một vài bản sao DNA, ta có thể thu được hàng tỉ bản sao sau khoảng 30 chu kì (số bản sao DNA= 2n với n là số chu kì phản ứng) [11].

Hình 1.11. Quy trình PCR

(Nguồn: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:PCR_Steps.JPG)

➢ RFLP

Kĩ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphism) là kĩ thuật nghiên

cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt của các enzym

giới hạn (Restriction Enzyme, RE). DNA khi ủ với enzym giới hạn trong dung dịch

đệm thích hợp với nhiệt độ và pH thích hợp sẽ tạo ra các phân đoạn DNA có kích

thước khác nhau. Nguyên tắc của kĩ thuật này là dựa trên độ đặc hiệu của các RE đối

với vị trí nhận biết của chúng trên DNA. Sự khác biệt về vị trí cắt giữa 2 cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau [51].

Mỗi enzym giới hạn nhận biết một đoạn nucleotide khác nhau rất đặc hiệu với

nó và được gọi là trình tự nhận biết. Các trình tự này có cấu tạo từ 4 đến 6 bp và phải có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palindromic), tức là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi được đọc theo chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi đơn. Ví dụ như đoạn DNA

được đóng khung dưới đây [51]:

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

16

Có 2 loại kiểu cắt RE: cắt đầu bằng và cắt đầu dính.

Hình 1.12. Các kiểu cắt RE

(Nguồn: https://schoolworkhelper.net/restriction-endonucleases-or-restriction-enzymes/)

Cắt đầu bằng: Phân tử DNA được cắt ngay chính giữa palindromic, tạo ra hai

DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu không có khả năng tự kết hợp trở lại.

Cắt đầu dính: Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo hai đầu lệch

nhau một vài bazơ. Hai đầu phân tử DNA sau khi cắt có trình tự bổ sung với nhau,

do đó chúng có thể bắt cặp trở lại, hoặc có thể bắt cặp với các phân tử DNA khác

được cắt bởi cùng enzym giới hạn tạo ra những phân tử lai. Tính chất này được ứng

dụng trong nhân dòng phân tử và tạo DNA tái tổ hợp, góp phần thúc đẩy sự phát triển

của công nghệ di truyền [11,51].

Phân tích PCR - RFLP dựa trên nguyên tắc đa hình vị trí giới hạn trong các

phân đoạn DNA đã được nhân bản bởi PCR. Tức là đoạn DNA đích sẽ được khuếch

đại bằng kĩ thuật PCR, sau đó chúng được cắt bằng các RE. Các phân đoạn tạo thành

có thể được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhờ nhuộm màu gel, tính đặc thù

của các đoạn này có thể được quan sát trực tiếp hoặc chụp ảnh qua máy soi DNA. Sự

phân bố của những vị trí cắt trong phân tử DNA sẽ được phản ánh thông qua số lượng

và kích thước của các phân đoạn. Sự hiện diện của các đoạn cắt này đặc trưng cho

từng tổ hợp DNA/ enzym giới hạn. Do đó, người ta có thể sử dụng PCR – RFLP để

đánh giá trực tiếp tính biến dị di truyền của sinh vật. Ưu điểm của phương pháp là kỹ thuật đơn giản, nhanh, tiết kiệm chi phí và độ tin cậy cao [51].

1.3.3.2. PCR - Giải trình tự

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định trật tự chính xác của các nucleotide trong phân tử DNA. Hầu hết các phương pháp giải trình tự (GTT) DNA hiện nay đều dựa trên phương pháp Sanger. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào việc bổ sung các dẫn xuất tương ứng của các dNTP là 2’, 3’dideoxynucleotide

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

17

(ddNTP - mất cả 2 nhóm OH ở vị trí C2 và C3 trên phân tử đường pentose) vào thành

phần phản ứng tổng hợp DNA. Khi ddNTP được gắn vào mạch, do thiếu nhóm C3’-

OH nên sự tổng hợp sẽ dừng lại, tạo ra các đoạn DNA chênh lệch nhau [11].

Phản ứng GTT được chia làm 4 ống nghiệm tách biệt, mỗi ống bổ sung một hỗn hợp 4 loại dNTP thông thường, một trong những loại dNTP này được đánh dấu

phóng xạ để phát hiện mạch mới đang tổng hợp. Ngoài ra, từng loại trong 4 loại

ddNTP sẽ được thêm lần lượt vào mỗi ống với nồng độ bằng 1/10 loại dNTP tương ứng. Phần lớn trường hợp, dNTP sẽ liên kết vào mạch DNA đang tổng hợp, nhưng

ddNTP cũng sẽ liên kết vào một số mạch DNA đang tổng hợp và làm kết thúc quá

trình sao chép. Kết quả là hình thành hỗn hợp nhiều phân tử DNA được sao chép

không hoàn chỉnh, đầu 5’ giống nhau nhưng khác nhau ở đầu 3’ về chiều dài và loại nucleotide kết thúc chuỗi. Sản phẩm được phân tách trên gel polyacrylamide và đọc

trình tự theo thứ tự băng xuất hiện với chiều từ cực dương sang âm [11].

Kỹ thuật Sanger cần nhiều thao tác kỹ thuật, đồng thời việc đọc kết quả điện

di bằng mắt có thể xảy ra sai sót. Vậy nên hiện nay, để GTT DNA các hệ gen lớn đều

dựa vào phương pháp GTT tự động. Phương pháp này sử dụng bộ các ddNTP được

gắn chất phát quang khác nhau cho mỗi loại. Các ddNTP khi được kích thích bởi

nguồn sáng của máy giải trình tự sẽ phát ra tín hiệu khác nhau. Thông tin này được

một cảm biến tín hiệu kết hợp với máy tính sẽ xử lý và tự động chuyển thành trình tự

DNA. Ưu điểm của phương pháp là khả năng tự động hóa phần lớn các bước của quá

trình phân tích và có độ nhạy, tốc độ đọc, mức độ chính xác cao (đặc biệt là đoạn

DNA dài từ 30 đến 1000 bp) [11].

1.3.3.3. RT - PCR (Real-time PCR)

Real-time PCR (hay còn gọi là PCR định lượng – qPCR) là kỹ thuật mới dựa

trên phản ứng PCR. Ở phương pháp này, sự khuếch đại của một phân tử DNA đích sẽ được theo dõi sau từng chu kì nhiệt của phản ứng, nghĩa là trong thời gian thực (real- time) chứ không phải ở cuối phản ứng như trong PCR thông thường.

Nguyên lý: RT- PCR cũng là một phản ứng tái bản các trình tự đặc hiệu nhưng có sử dụng thêm chất phát huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang được phát hiện ngay

trong bước bắt cặp mồi và kéo dài chuỗi DNA. Do đó Real-time PCR còn có thể sử dụng để định lượng hoặc bán định lượng DNA như định lượng số bản copy của virus

viêm gan B,C. Bên cạnh đó, phương pháp cũng có thể giúp xác định tỷ lệ biến đổi

gen có trong mẫu, phát hiện các khác biệt SNP và xác định kiểu di truyền [77].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

18

1.4. Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19

và các yếu tố khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ trên thế giới và trong nước

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về mối tương quan giữa độ

NTTC với kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân bệnh mạch vành.

Nghiên cứu của Sibbing và các cộng sự (2009) trên 2485 bệnh nhân can thiệp

động mạch vành qua da cho thấy: tỉ lệ các biến cố huyết khối đặt stent ở những bệnh nhân mang alen đột biến CYP2C19*2 tăng gấp 3 lần so với những bệnh nhân mang

đồng hợp tử kiểu dại với p=0,007 [71].

Nghiên cứu đa trung tâm, ngẫu nhiên, mù đôi ELEVATE-TIMI (2011) tiến

hành trên 333 bệnh nhân bị bệnh tim tại 32 điểm từ tháng 10/2010 đến tháng 9/2011. Các bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2 liều clopidogrel 225 mg có tác

dụng dược lý tương đương với liều chuẩn 75 mg, còn với bệnh nhân mang kiểu gen

đồng hợp tử CYP2C19*2 thì liều 300mg cũng không có tác dụng chống NTTC [49].

Yang J và cộng sự (2013) cho thấy rằng ở những người mang 1 alen đột biến

(*1/*2, *1/*3) và 2 alen đột biến (*2/*3, 2 /*2, *3/*3) có độ NTTC tối đa với ADP cao

hơn so với những người mang kiểu dại (*1/*1) với p lần lượt là 0,002 và 0,0039 [81].

Yu Chen và các cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu trên 336 bệnh nhân

HCĐMVC có can thiệp mạch vành qua da, theo dõi sau 1 tháng và 6 tháng. Với nhóm

bệnh nhân mang alen CYP2C19*2, có độ NTTC cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm

mang kiểu gen dại ở cả thời điểm nhập viện và sau 1 tháng (p lần lượt là 0,005 và 0,003).

Đồng thời, nguy cơ các biến cố tim mạch chính ở bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 cũng

cao hơn so với nhóm bệnh nhân mang alen kiểu dại CYP2C19*1 với p=0,003 [37].

Các nghiên cứu trên đều cho thấy, alen CYP2C19*2 chiếm tỉ lệ khá cao trong

quần thể nghiên cứu. Những bệnh nhân mang alen này cũng cho thấy có biến cố tim mạch nặng hơn so với những người không mang gen. Điều này phần nào khẳng định

vai trò của CYP2C19*2 trong kháng thuốc clopidogrel.

1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Tính tới thời điểm này, chưa có nghiên cứu nào về mối liên quan giữa độ

NTTC với kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ ở Việt Nam, mới chỉ có các

nghiên cứu về mối liên quan độ NTTC với một số yếu tố trên bệnh lý khác nhau.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

19

Nguyễn Thị Nữ, Cung Thị Tý và Đỗ Trung Phấn (1997) nghiên cứu “Chỉ số

NTTC ở người trưởng thành Việt Nam bình thường” với chất kích tập tiểu cầu collagen

nồng độ 1mg/ml là 65,5±6,7%; với chất kích tập ADP nồng độ 10µM là 67±6,5%.

Không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về độ NTTC giữa nam và nữ [17].

Trương Thị Minh Nguyệt (2003) nghiên cứu độ NTTC trên bệnh nhân thiếu

máu cục bộ cơ tim với chất kích tập ADP nồng độ 5µM là 71,6±8,83%, trong đó độ

NTTC ở nhóm NMCT cấp là 74,46±9,95%, tăng có ý nghĩa so với nhóm chứng ở tất cả các bệnh nhân thiếu máu cục bộ cơ tim có các yếu tố nguy cơ như THA, ĐTĐ, béo

phì, hút thuốc lá, tiền sử gia đình bị tim mạch. Mức tăng độ NTTC có mối liên quan

đồng biến mức độ vừa với hàm lượng fibrinogen huyết tương và có xu hướng tăng

theo số lượng nhóm nguy cơ [15].

Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007) cũng nghiên cứu về độ NTTC ở bệnh nhân

NMCT cấp trước và ĐMV cho thấy: độ NTTC ở người bị NMCT cấp là 74,3±10,2%, cao hơn so với người bình thường là 67±6,5%. Bệnh nhân NMCT cấp có nhiều yếu

tố nguy cơ thì độ NTTC sẽ cao hơn người có ít yếu tố nguy cơ. Độ NTTC giảm rõ rệt

sau liều điều trị tấn công của thuốc chống NTTC (Plavix+ Aspirin+ Lovenox) so với

trước can thiệp [18].

Trần Hòa và Trương Quang Bình (2015) nghiên cứu mối tương quan giữa kiểu

gen giảm chức năng CYP2C19*2, CYP2C19*3 và tiên lượng ở bệnh nhân được can

thiệp đặt stent động mạch vành có điều trị clopidogrel. Hiện tại nghiên cứu vẫn đang

thực hiện và chưa công bố kết quả cuối cùng.

Như vậy, cho tới nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về mối liên quan

giữa độ NTTC với đa hình di truyền gen CYP2C19 trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ. Do

đó, việc tiếp tục nghiên cứu theo hướng này điều rất cần thiết, giúp công tác điều trị và phòng bệnh ĐTNKÔĐ được tốt hơn.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

20

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn

Tất cả các bệnh nhân được chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn ACCF/AHA

(American College of Cardiology Foundation/ American Heart Association) (2012).

Bệnh nhân sau khi nhập viện, điều trị với liệu pháp kháng tiểu cầu kép vào

ngày thứ 3 với liều duy trì aspirin (100mg/ngày) kết hợp clopidogrel (75mg/ngày).

2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân phải dùng thêm bất cứ một loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu nào

khác ngoài aspirin và clopidogrel.

- Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng. - Tai biến mạch não dưới 3 tháng. - Mới phẫu thuật dưới 1 tuần. - Nguy cơ cao chảy máu. - Suy thận, suy gan giai đoạn cuối.

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

➢ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 1/2018 ➢ Địa điểm thu mẫu: Viện Tim mạch Việt Nam ➢ Địa điểm nghiên cứu:

- Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - Viện Tim mạch Việt Nam - Viện nghiên cứu hệ gen

2.3. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang

Cỡ mẫu nghiên cứu: Chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện. Đối tượng nghiên cứu thỏa mãn các tiêu chuẩn, đồng ý tham gia nghiên cứu, được lựa chọn liên tục cho đến khi đủ cỡ mẫu (54 bệnh nhân) tại Viện Tim mạch Việt Nam.

2.4. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

2.4.1. Hóa chất

- Cặp mồi tự thiết kế, được đặt tổng hợp từ hãng IDT- Mỹ.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

21

- Lambda DNA/HindIII Marker, code SM0103, hãng Fermentas. - GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, code SM0321, hãng Thermo Scientific. - Q5 High – Fidelity DNA polymerase, hãng Neb (New England Biolabs). - E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code D3392, hãng Omega-Biotek. - GeneJET PCR Kit, hãng Thermo Fisher Scientific. - Chất kích tập là ADP 5 µM của hãng Nippon Corporation (Nhật Bản).

2.4.2. Thiết bị

- Máy PCR Prime Thermal Cycler (Code: 5PRIME/02, Anh). - Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức). - Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ. - Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu Chrono – LOG của Mỹ.

2.5. Các bước nghiên cứu

2.5.1. Quy trình nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ như sau:

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

22

2.5.2. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu

➢ Cách lấy mẫu: 4ml máu lấy từ tĩnh mạch người bệnh, được chuyển vào ống chuyên dụng có sẵn chất chống đông EDTA, đảm bảo không bị nhiễm bẩn. Ghi đầy đủ thông tin của bệnh nhân và mã code để tránh nhầm các mẫu với nhau. Lượng máu ở mỗi ống đủ cho hơn một lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu để có thể lặp lại việc tách DNA tổng số cho đến khi kiểu gen của bệnh nhân được xác định.

➢ Bảo quản mẫu: Mẫu được bảo quản trong điều kiện ngăn đá tủ lạnh dân dụng không quá 1 ngày, sau đó được vận chuyển đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học đến phòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Mẫu tiếp tục được bảo quản trong điều kiện lạnh -30˚C đến khi sử dụng.

➢ Kí hiệu mẫu: Ống mẫu phải có đầy đủ các thông tin bao gồm: mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu. Thông tin của mỗi mẫu phải được lưu lại trong sổ gồm: mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu sau khi bàn giao và khi sử dụng.

2.5.3. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số

2.5.3.1. Tách chiết DNA tổng số

Chúng tôi sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số.

Nguyên lý kit: Dưạ trên sự hấp thụ chọn lọc của các axit nucleic vào màng

silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính bao gồm:

- Phá vỡ tế bào để giải phóng DNA. - DNA liên kết với màng silica-gel. - Loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer. - Thu nhận DNA tổng số.

2.5.3.2. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số

Sau khi tách chiết, DNA tổng số được kiểm tra theo hai phương pháp sau:

➢ Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang

Thực nghiệm được tiến hành tại bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Chúng tôi sử dụng máy Eppendorf Bio Photometer Plus. Các bước của quy trình thao tác chung:

- Đo Blank: Đo với môi trường được sử dụng để bảo quản/ pha loãng mẫu DNA. - Đo mẫu DNA.

Các mẫu được đo ở 2 bước sóng: 260nm và 280nm, mỗi mẫu đo ít nhất 2 lần

và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

23

➢ Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di

- Điều kiện điện di: Điện di trên gel agarose 0,7% pha trong đệm TAE 1X,

hiệu điện thế 90V, thời gian chạy 60 phút.

- Thể tích mẫu điện di: 5 µl mẫu + 1µl DNA 6X loading dye, 5µl Ruler 100.

2.5.4. Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR

và kiểm tra chất lượng sản phẩm

2.5.4.1. Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR

Nguyên lý: Nguyên lý của kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn trình tự DNA

mong muốn là: DNA mới được tổng hợp từ 1 DNA khuôn ban đầu bằng enzym

polymerase. Thành phần chính của phản ứng bao gồm: DNA khuôn, mồi, dung dịch

đệm, 4 loại deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP) và DNA polymerase. Quy trình gồm 3 giai đoạn chính:

- Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95˚C) để tách hai mạch của chuỗi DNA

xoắn kép.

- Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống thích hợp để mồi tự bắt cặp vào sợi DNA khuôn. Nhiệt độ này phụ thuộc vào mồi sử dụng như trình tự và số lượng

nucleotide của mồi.

- Giai đoạn kéo dài: Enzyme DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch polynucleotide

mới dựa vào mạch khuôn và 4 loại dNTP tại nhiệt độ 72˚C [24].

Trình tự mồi nhân dòng các alen *2 và *3 được trình bày dưới đây:

Bảng 2.1. Trình tự mồi nhân dòng các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3

Alen Mồi Trình tự Độ dài

sản phẩm

CYP2C19*2-F TGGAATTTGAAGTATCTTTGAGCCC *2 719 bp

CYP2C19*2-R CAATGAATCACAAATACGCAAGCAG

CYP2C19*3-F GCAACCATTATTTAACCAGCTAGG *3 898 bp

CYP2C19*3-R CTGTCTCATCAGCTAGAATCCCA

Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng PCR cho từng alen *2, *3. Quy trình PCR của 2 alen này được thể hiện trong bảng 2.2 và bảng 2.3 như sau:

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

24

Bảng 2.2. Quy trình PCR cho alen *2

Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng

DNA template 5-100 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút

dNTP mix, 2 mM 0,2 mM - 35 chu kì:

Q5® Reaction Buffer 5X 1X + 98˚C trong 10 giây

Mồi *2F 10 mM 0,25 µM

+ 59˚C trong 30 giây + 72˚C trong 30 giây Mồi *2R 10mM 0,25 µM

- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút Q5 pol 2 u/µl 0,02 u/µl

Bảng 2.3. Quy trình PCR cho alen *3

Thành phần Nồng độ hoạt động Điều kiện phản ứng

DNA template 40-170 ng - Biến tính: 98˚C trong 3 phút

dNTP mix, 2 mM 0,2 mM - 35 chu kì:

Q5® Reaction Buffer 5X 1X + 98˚C trong 10 giây

+ 68˚C trong 30 giây Mồi *3F 10 mM 0,25 µM

+ 72˚C trong 30 giây Mồi *3R 10mM 0,25 µM

- Kết thúc: 72˚C trong 5 phút Q5 pol 2 u/µl 0,02 u/µl

2.5.4.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR

Phương pháp điện di được sử dụng để kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR. Quy

trình được tiến hành tương tự như điện di kiểm tra chất lượng tách chiết DNA.

2.5.5. Tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit GeneJET PCR theo các bước sau:

1. Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1:1. Mix đều. 2. Nếu DNA <500 bp, thêm isopropanol 100% với tỉ lệ 1:2. Mix đều. 3. Chuyển 800µl hỗn hợp từ bước 1 (hoặc bước 2) vào cột tách GeneJET, sau đó

ly tâm trong 30 - 60 giây, loại bỏ phần dịch lọc.

4. Thêm 700µl Wash Bufer vào cột, ly tâm trong 30 - 60 giây, bỏ phần dịch lọc. 5. Ly tâm cột lọc trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn Wash Bufer. 6. Chuyển cột lọc sang ống ly tâm vô trùng 1,5ml. Thêm 50µl Elution Buffer. Ủ

trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm, thu dịch lọc.

7. Bảo quản sản phẩm tinh sạch ở -20˚C.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

25

2.5.6. Xác định kiểu gen của SNP CYP2C19*2, *3 sử dụng phương pháp cắt

bằng enzym giới hạn (RFLP) có đối chiếu với phương pháp giải trình tự

Sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR sẽ được pha loãng hoặc cô đặc đến nồng độ

40 - 50ng/µl và tiến hành cắt bằng enzym giới hạn (RFLP). Mỗi mẫu sẽ được cắt (quá trình ủ) ở 2 thời gian trong vùng thời gian cắt hoàn toàn tối ưu để đảm bảo phản ứng

cắt xảy ra hoàn toàn, cũng như để kiểm tra tính lặp lại của phản ứng.

Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của alen *2, *3 được thể hiện dưới đây:

Bảng 2.4. Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *2

Thành phần Điều kiện phản ứng Thể tích

Sản phẩm PCR alen *2 đã tinh sạch 5 µl

10X Buffer Tango 1 µl

SmaI 1U/µl 1 µl

- Ủ: 300C trong 2 điều kiện: 1 giờ và 3 giờ - Bất hoạt: 650C trong 20 phút Nước khử ion 8 µl

Kết quả được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%, ở 100V trong 60

phút (so sánh với marker 100bp). Alen *2: điểm đa hình thay thế G bằng A:

Kiểu gen AA điện di cho 1 băng duy nhất có kích thước: 719 bp.

Kiểu gen GG (kiểu gen dại) điện di cho 2 băng có kích thước: 526 bp và 193 bp.

Kiểu gen GA điện di cho 3 băng có kích thước: 719bp, 526bp và 193 bp.

Bảng 2.5. Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *3

Thành phần Thể tích

Sản phẩm PCR alen *3 đã tinh sạch 5 µl

10X FastDigest Buffer 1 µl

Điều kiện phản ứng - Ủ: 370C trong 2 điều kiện: 15 phút và 30 phút - Bất hoạt: 800C trong 5 phút FastDigest BamHI 1 µl

Nước khử ion 8 µl

Kết quả được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5%, ở 100V trong 60

phút (so sánh với marker 100bp). Alen *3: điểm đa hình thay thế G bằng A: Kiểu gen AA điện di cho 1 băng duy nhất kích thước: 898 bp. Kiểu gen GG (kiểu gen dại) điện di cho 2 băng có kích thước: 523 bp và 375 bp. Kiểu gen GA điện di cho 3 băng có kích thước: 898 bp, 523 bp và 375 bp.

Sau khi có kết quả kiểu gen của SNP CYP2C19*2 và CYP2C19*3 sử dụng phương pháp RFLP, chúng tôi cũng tiến hành GTT ở 15 mẫu bệnh nhân đầu để kiểm tra độ chính xác của phương pháp RFLP. Quy trình RFLP được coi là tối ưu tốt và

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

26

cho kết quả chính xác khi cả hai phương pháp có kết quả như nhau. Do đó, với các mẫu bệnh nhân tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành phương pháp RFLP để xác định kiểu gen của SNP CYP2C19*2 và CYP2C19*3, vì phương pháp cho kết quả nhanh và tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân. Chúng tôi lấy 20µl sản phẩm PCR lên băng đặc hiệu và sáng nét gửi đi tinh sạch và giải trình tự 2 chiều tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả GTT được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9, dựa trên các pic thu được. Với mỗi SNP, kết quả cũng cho ra các loại kiểu gen như ở phương pháp RFLP.

2.5.7. Cách đọc kết quả kiểu gen CYP2C19

Để tìm được kiểu gen của từng bệnh nhân trong nghiên cứu, chúng tôi cần tìm được kiểu gen của từng alen tức là phải xác định được từng SNP. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn 2 SNP: CYP2C19*2 và CYP2C19*3 để phân tích. Mặc dù gen CYP2C19 còn một số SNP khác nhưng tần số xuất hiện của các SNP thấp qua các nghiên cứu ở quần thể người Châu Á và mức độ ảnh hưởng của chúng không nhiều đến đáp ứng của clopigogrel cũng như hạn chế về mặt kinh phí, nên với nghiên cứu này, chúng tôi đã coi các SNP trên là alen kiểu dại (CYP2C19*1). Sau khi đã có kết quả của 2 SNP CYP2C19*2 và CYP2C19*3, tổ hợp kết quả kiểu gen của 2 SNP này sẽ ra kết quả kiểu gen CYP2C19 của từng bệnh nhân như trong bảng dưới đây:

Bảng 2.6. Cách đọc kết quả kiểu gen CYP2C19

Kiểu gen của từng alen Kiểu gen CYP2C19 Tác dụng dược lý

CYP2C19*2: GG *1/*1 Chuyển hóa thuốc bình thường CYP2C19*3: GG

CYP2C19*2: GA *1/*2 CYP2C19*3: GG Chuyển hóa thuốc trung bình CYP2C19*2: GG *1/*3 CYP2C19*3: GA

*2/*2 CYP2C19*2: AA CYP2C19*3: GG

Chuyển hóa thuốc kém *2/*3 CYP2C19*2: GA CYP2C19*3: GA

*3/*3 CYP2C19*2: GG CYP2C19*3: AA

2.5.8. Xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu

➢ Nguyên lý chung: Khi thêm chất kích tập như ADP, collagen thì tiểu cầu có khả năng ngưng tập, qua đó phản ánh một trong những chức năng quan trọng của tiểu cầu.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

27

Kỹ thuật đo độ NTTC được sử dụng phổ biến là thông qua sự thay đổi mật độ quang

(phương pháp đo quang) hoặc độ trở kháng để đánh giá chức năng tiểu cầu [4].

➢ Nguyên lý của phương pháp đo quang: Trong phương pháp quang học, một quang phổ kế có bước sóng thích hợp cố định được dùng làm thiết bị đo độ NTTC. Một chùm tia ánh sáng đỏ chiếu qua một ống chứa huyết tương giàu tiểu cầu và một

chùm tia khác chiếu qua một ống chứa huyết tương nghèo tiểu cầu. Khi đo, người ta

sử dụng một mẫu huyết tương giàu tiểu cầu của mẫu máu cần đo để thiết lập điểm chuẩn mà ở đó ánh sáng bị cản hoàn toàn và có độ dẫn truyền ánh sáng là 0%. Bên

cạnh đó, người ta sử dụng huyết tương nghèo tiểu cầu của mẫu máu cần đo như trên

để thiết lập điểm chuẩn mà ở đó ánh sáng đi qua hoàn toàn và độ dẫn truyền ánh sáng

là 100%. Khi cho các chất kích tập như ADP, collagen, thrombin, epinephrine, arachidonic acid, ristocetin...vào huyết tương giàu tiểu cầu thì các tiểu cầu sẽ ngưng

tập với nhau tạo thành đám vì vậy độ dẫn truyền ánh sáng sẽ tăng lên. Do đó, độ

NTTC sẽ được phản ánh bằng độ dẫn truyền ánh sáng. Kết quả thể hiện bằng % độ

dẫn truyền ánh sáng của huyết tương giàu tiểu cầu mà khi đó tiểu cầu đã ngưng tập

tối đa [22].

Hình 2.1. Nguyên lý của xét nghiệm độ NTTC (Nguồn: Principles of platelet aggregation in clinical trials, JAVA clinical Research)

Trị số bình thường [1]:

- Chất kích tập ADP: 59- 88%. - Chất kích tập Collagen: 58- 78%.

NTTC bị thay đổi trong nhiều bệnh rối loạn chức năng tiểu cầu. Ví dụ như NTTC bị giảm với chất kích tập là ristocetin ở những bệnh nhân có hội chứng Bernard

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

28

Soulier (thiếu GP Ib) hoặc vWF, giảm với chất kích tập là ADP ở những bệnh nhân

dùng aspirin…[2].

➢ Cách tiến hành:

Đo độ NTTC được tiến hành trên máy Chrono – LOG của Mỹ. Chất kích tập được sử dụng là ADP 5µM của hãng Nippon Corporation (Nhật Bản). Các bước tiến

hành được trình bày dưới đây:

- 4ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân được lấy theo cách thức không garo tĩnh mạch, để máu tự chảy qua kim lấy máu vào ống xét nghiệm có chứa sẵn chất chống

đông natri citrat 3,8%, theo tỉ lệ 9 thể tích máu/1 tỉ lệ chống đông.

- Trộn đều nhẹ nhàng chất chống đông với máu. - Làm xét nghiệm không quá 30 phút kể từ khi lấy máu. Đảm bảo máu được

vận chuyển nhẹ nhàng, không bị vỡ hồng cầu.

- Các mẫu máu đo độ NTTC trước tiên cần thu huyết tương giàu tiểu cầu bằng cách ly tâm nhẹ trong 10 phút với tốc độ 500 vòng/phút (số lượng tiểu cầu từ 200-

400 G/L), sau đó ly tâm mạnh trong 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút để thu được

huyết tương nghèo tiểu cầu. Sử dụng máy ly tâm KUBOTA 5910 (Nhật Bản).

- Độ NTTC được đánh giá dựa vào độ ngưng tập tối đa MA% (Maximum aggregation): chỉ số NTTC ở người bình thường với chất kích tập ADP 10µM là

67±5%.

2.6. Xử lý và phân tích số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0

Sử dụng các test thống kê: Tính trị số trung bình, trung vị, T-test, chi-square,

ANOVA test,…ở những chỗ phù hợp. Kết quả trình bày dưới dạng tần số, tỉ lệ %,

trung bình ± độ lệch chuẩn (có phân phối chuẩn). Giá trị p<0,05 trong các kiểm định

thống kê được coi là có sự sai khác mang ý nghĩa thống kê.

2.7. Các loại sai số và cách khắc phục

2.7.1. Sai số mắc phải

- Sai số trong quá trình lựa chọn bệnh nhân. - Sai số trong quá trình làm thí nghiệm và xét nghiệm: sai số hệ thống do máy móc, do các loại test, kit. Sai số ngẫu nhiên do người làm thí nghiệm hoặc xét nghiệm, do ảnh hưởng của môi trường lên kết quả xét nghiệm.

- Sai số trong quá trình thu thập số liệu

+ Trong quá trình thăm khám bệnh nhân.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

29

+ Trong quá trình ghi chép bệnh án: không ghi chép được các đặc điểm lâm

sàng quan trọng, ghi chép không đúng hoặc thiếu các thông tin quan trọng trong

biểu mẫu. - Sai số trong quá trình nhập, xử lý và phân tích số liệu.

2.7.2. Cách khắc phục sai số

- Sai số trong quá trình lựa chọn bệnh nhân: Khắc phục bằng cách cố gắng lựa

chọn các bệnh nhân có đặc điểm tương đồng với nhau về tuổi và giới.

- Sai số trong quá trình làm sạch và nhập số liệu: Khắc phục bằng cách đọc

phiếu thu thập thông tin/bệnh án cẩn thận, làm sạch số liệu trước khi nhập liệu.

- Sai số trong quá trình xét nghiệm: Khắc phục bằng cách chuẩn hóa các quy trình xét nghiệm, các bộ test, kit. Cán bộ phòng thí nghiệm được đào tạo, tập huấn, làm thành thạo các quy trình. Máy móc, thiết bị được chuẩn hóa. Ước tính sai số do

máy móc thiết bị gây ra để điều chỉnh hợp lý. - Sai số trong quá trình thu thập số liệu:

+ Chuẩn hóa quy trình thăm hỏi bệnh nhân và ghi chép bệnh án.

+ Các biểu mẫu được xây dựng và được các bác sĩ, điều dưỡng, điều tra viên

tham gia góp ý chỉnh sửa và tiến hành thu thập thử để hoàn thiện biểu mẫu.

2.8. Đạo đức nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu được thông qua tại hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại

học Quốc gia Hà Nội, ngày 02/10/2015, theo mã số đề tài QG.15.32. Bệnh nhân

trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ về mục đích và mục tiêu

nghiên cứu, các lợi ích cũng như những ảnh hưởng bất lợi của nghiên cứu tới bệnh

nhân. Những bệnh nhân tham gia nghiên cứu sẽ được ký bản đồng thuận tham gia

nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút khỏi nghiên cứu ở bất kỳ thời điểm nào. Các

thông tin của bệnh nhân được đảm bảo bí mật tuyệt đối và chỉ sử dụng cho mục

đích nghiên cứu.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

30

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả

3.1.1. Một số đặc điểm chung

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 54 bệnh nhân ĐTNKÔĐ, thu được một số kết quả lâm sàng về tỉ lệ giới tính, tuổi và các yếu tố nguy cơ được thể hiện trong các bảng biểu dưới đây.

Biểu đồ 3.1. Phân bố số lượng bệnh nhân ĐTNKÔĐ theo giới

Nhận xét:

Trong nhóm nghiên cứu, số bệnh nhân nam là 45 (chiếm 83,3%) cao hơn so

với số bệnh nhân nữ là 9 (chiếm 16,7%).

Biểu đồ 3.2. Đặc điểm về tuổi của bệnh nhân ĐTNKÔĐ

Nhận xét:

Bệnh ĐTNKÔĐ có xu hướng tăng dần theo tuổi, phần lớn các bệnh nhân có độ tuổi trên 50 với tuổi trung bình là 63,57±10,28 trong đó, nhỏ nhất là 42 tuổi đến lớn nhất là 83 tuổi.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

31

Bảng 3.1. Phân bố các yếu tố nguy cơ ở nhóm nghiên cứu

Tổng (N= 54) Nam (N= 45) Nữ (N= 9) Yếu tố

nguy cơ % N % N % P (2) N

68,5% 36 80% 1 11,1% <0,001 Hút thuốc lá 37

27,8% 11 24,4% 4 44,4% 0,221 RLCH lipid 15

0,008 22,2% 7 15,6% 5 55,6% ĐTĐ 12

68,5% 30 66,7% 7 77,8% 0,512 Tăng huyết áp 37

11,1% 6 13,3% 0 0% 0,245 Béo phì 6

Nhận xét:

Hút thuốc lá và tăng huyết áp là hai yếu tố nguy cơ hay gặp nhất với 68,5%

trong nhóm nghiên cứu, các yếu tố còn lại bao gồm RLCH lipid, ĐTĐ, béo phì chiếm

tỉ lệ thấp hơn với 27,8%, 22,2% và 11,1%. Tỷ lệ bệnh nhân hút thuốc lá ở nam giới

cao hơn so với nữ giới (p<0,05), trong khi tỷ lệ bệnh nhân ĐTĐ ở nữ giới lại cao hơn

so với nam giới (p<0,05). Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh nhân với mỗi yếu tố nguy cơ còn lại ở hai giới có độ tương đồng cao (p>0,05).

Biểu đồ 3.3. Phân bố số lượng yếu tố nguy cơ của bệnh nhân ĐTNKÔĐ

Nhận xét:

Các yếu tố nguy cơ chính của ĐTNKÔĐ có mặt ở hầu hết bệnh nhân. Chỉ có

1/54 bệnh nhân chưa tìm thấy yếu tố nguy cơ, còn phần lớn có từ 2 yếu tố nguy cơ trở lên (39/54 bệnh nhân) chiếm 72,2%.

3.1.2. Kết quả đo một số chỉ số cận lâm sàng

Khi nhập viện, các bệnh nhân được làm một số xét nghiệm cận lâm sàng để theo

dõi và đánh giá tình trạng bệnh. Kết quả đo được trình bày trong bảng 3.2 như sau:

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

32

Bảng 3.2. Kết quả cận lâm sàng của nhóm nghiên cứu

Tổng số P Chỉ số N N N (𝑿̅ ±SD) Nam (𝑿̅ ±SD) Nữ (𝑿̅ ±SD)

RBC (T/L) 52 4,63±0,54 43 4,68±0,56 9 4,35±0,28 0,094 (4,5 - 5,9)

WBC (G/L) 52 8,13±2,60 43 8,17±2,55 9 7,92±3,01 0,798 (4,0 - 10)

52 255,87±66,56 43 248,81±62,47 9 289,56±78,83 0,095 PLT (G/L) (150 - 450)

MCV (fL) 52 87,86±7,27 43 88,14±7,89 9 86,51±2,88 0,543 (80 - 100)

MPV (fL) 52 9,17±1,16 43 9,12±1,15 9 9,42±1,22 0,484 (5 - 20)

Cholesterol

(mmol/l) 42 4,20±1,01 36 4,08±0,95 6 4,90±1,12 0,065

(<5,2)

Triglycerid

(mmol/l) 43 2,08±1,14 37 1,95±1,14 6 2,91±0,74 0,055

(<2,26)

HDL (mmol/l) 43 1,01±0,25 37 0,99±0,25 6 1,13±0,28 0,200 (>=1,45)

LDL (mmol/l) 43 2,32±0,71 37 2,30±0,66 6 2,45±1,05 0,646 (<=3,4)

CRP (mg/dL) 50 0,81±1,81 41 0,92±1,98 9 0,29±0,31 0,350 (<0,5)

Fibrinogen

51 3,68±1,05 42 3,67±1,11 9 3,73±0,72 0,890 (g/l)

(2 - 4)

51 91,75±14,17 42 90,55±14,45 9 97,38±11,88 0,192 PT(%) (70 - 140)

APTT

bệnh/chứng 51 1,08±0,17 42 1,09±0,18 9 1,02±0,13 0,233

(0,85-1,2)

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

33

Nhận xét:

Sự khác biệt về một số kết quả cận lâm sàng ở hai giới của nhóm nghiên cứu

đều không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).

3.1.3. Kết quả đo độ NTTC

Ngoài các kết quả cận lâm sàng, chúng tôi cũng tiến hành đo độ NTTC của các bệnh nhân vào ngày thứ 3 sau khi dùng liệu pháp kháng tiểu cầu kép aspirin và clopidogrel để đánh giá hiệu quả điều trị. Kết quả đo độ NTTC như sau:

Bảng 3.3. Kết quả đo độ NTTC của bệnh nhân ĐTNKÔĐ

p % % Tổng số Min Max 𝑿̅ ±SD

Độ NTTC 31,3±11,66 10 61 Nam 𝑿̅ ±SD 30,93±11,98 Nữ 𝑿̅ ±SD 33,11±10,30 0,614

Nhận xét:

Kết quả cho thấy trung bình độ NTTC của các bệnh nhân là 31,3±11,66, dao

động từ 10% đến 61%. Độ NTTC ở hai giới có độ tương đồng cao (p>0,05).

3.1.4. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3

3.1.4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số

Khâu tách chiết DNA tổng số là bước quan trọng trong quá trình xác định kiểu gen nhằm đạt được mục tiêu đã đề ra. Tuy nhiên, để đánh giá chất lượng sản phẩm DNA tổng số tách được, chúng tôi đã sử dụng phương pháp điện di (đánh giá định tính) và đo OD (đánh giá định lượng) DNA tổng số. Kết quả đo OD và điện di được trình bày như sau:

➢ Kết quả đo OD

Bảng 3.4. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của sản phẩm tách DNA

Max Min

170,05 Nồng độ (ng/µl) 13,10

2,146 1,806 OD260/OD280

Nhận xét:

Nồng độ DNA được tách từ các mẫu máu toàn phần dao động từ 13,10 ng/µl đến 170,05 ng/µl và có độ tinh sạch cao (tỉ lệ OD260/OD280 trong khoảng từ 1,806 đến 2,146).

➢ Kết quả điện di DNA tổng số

Sản phẩm tách DNA tổng số cũng được đánh giá bằng cách điện di trên gel

agarose 0,7% với hiệu điện thế 90V, chạy trong một giờ.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

34

Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel Agarose 0,7% Làn M: Lambda DNA/HindIII Marker Làn 16-38 : DNA tổng số của bệnh nhân có mã tương ứng

Nhận xét:

Kết quả điện di cho thấy: chất lượng DNA tổng số cho kết quả tốt, tất cả mẫu đều có một băng điện di, ít bị đứt gãy, băng lên rõ. Sản phẩm DNA được tách đáp ứng đủ điều kiện cho thí nghiệm PCR nhân dòng các phân đoạn gen tiếp theo.

3.4.1.2. Kết quả khuếch đại vùng gen chứa alen CYP2C19*2, CYP2C19*3

Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các vùng gen chứa alen *2, *3 nhằm

thu được vùng gen đặc hiệu đối với từng alen được thể hiện như sau:

Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR nhân vùng gen chứa alen CYP2C19*2 (719 bp) và CYP2C19*3 (898 bp) trên gel agarose 1%

Làn M: Ruler 100bp Plus DNA Ladder Lần 2(-), 3(-): Đối chứng âm Làn 2-41 đến 2-45, 2-49: sản phẩm PCR vùng chứa *2 của các bệnh nhân với mã tương ứng Làn 3-41 đến 3-45 : sản phẩm PCR vùng chứa *3 của các bệnh nhân với mã tương ứng

Nhận xét:

Kết quả điện di cho thấy, các cặp mồi được sử dụng là đặc hiệu, các thành phần khác và điều kiện phản ứng đã được tối ưu tốt. Với mỗi alen, các mẫu DNA đều tạo một băng duy nhất, rõ nét, không có băng phụ, không có smear. Kích thước băng điện di của sản phẩm PCR nhân vùng gen chứa CYP2C19*2 và *3 lần lượt là 719 bp và 898 bp. Các sản phẩm PCR có thể được sử dụng cho quy trình GTT và RFLP.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

35

3.1.4.3. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 bằng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải trình tự

Trước khi tiến hành RFLP và giải trình tự, sản phẩm PCR phải được tinh sạch và đo nồng độ DNA. Chúng tôi sử dụng kit E.Z.N.A.® Cycle-Pure Kit (Omega- biotek) để tinh sạch 25µl sản phẩm PCR theo quy trình khuyến cáo của hãng.

20µl sản phẩm PCR lên băng điện di đặc hiệu, được tinh sạch với nồng độ tối thiểu là 15 ng/µl sẽ mang đi GTT 2 chiều tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả GTT được phân tích trên phần mềm BioEdit version 7.1.9, từ đó xác định được kiểu gen trên từng alen *2 và *3. Kết quả kiểu gen thể hiện trong hình 3.3 và 3.4 dưới đây:

Hình 3.3. Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*2. A. Kiểu dại GG, B. Dị hợp đa hình GA, C. Đồng hợp đa hình AA

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

36

Hình 3.4. Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*3.

A. Kiểu dại GG, B. Dị hợp đa hình GA

Nhận xét:

CYP2C19*2 có kiểu gen dại là GG, kiểu gen dị hợp và đồng hợp đa hình lần

lượt là GA và AA. CYP2C19*3 có kiểu gen dại là GG, kiểu gen dị hợp đa hình là

GA. Sản phẩm GTT cho hình ảnh rõ nét. Các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide

rõ ràng và không bị nhiễu.

Tính đến thời điểm này, phương pháp GTT vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc phân tích kiểu gen nhằm phát hiện các SNP với độ chính xác cao. Tuy

nhiên phương pháp này còn hạn chế do chi phí đắt và mất nhiều thời gian. Mặt khác,

CYP2C19*2 và CYP2C19*3 có vị trí cắt đặc hiệu với enzym giới hạn. Vì vậy, chúng

tôi tiến hành phân tích kiểu gen bằng phương pháp RFLP với hai alen này. Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, mẫu sẽ được xử lý để đạt nồng độ 40- 50 ng/µl và được cắt theo quy trình đã tối ưu. Chúng tôi tiến hành ủ trong thời gian tối ưu nhất và lặp lại 2 lần với mỗi alen để kiểm tra độ tương đồng và kết quả. Phương pháp điện di được sử dụng để thể hiện kết quả sản phẩm cắt 2 alen và được trình bày trong hình 3.5, 3.6 dưới đây:

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

37

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm cắt của alen CYP2C19*2 trên gel agarose 1.5% Làn M: 100 bp DNA ladder Làn 2-52, 2-57, 2-66: Kiểu gen của bệnh nhân với mã tương ứng, mỗi mẫu được làm 2 lần

Nhận xét:

Hình ảnh điện di rõ nét cho thấy enzym cắt sử dụng cho alen *2 là đặc hiệu, các yếu tố của phản ứng cắt được tối ưu. Kiểu gen đồng hợp đa hình AA điện di cho 1 băng kích thước 719 bp, kiểu gen dại GG điện di cho 2 băng kích thước 526 và 193 bp, kiểu gen dị hợp GA điện di cho 3 băng kích thước 719, 526 và 193 bp.

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt của alen CYP2C19*3 trên gel agarose 1.5% Làn M: 100 bp DNA ladder. Làn 3-156, 3-157: Kiểu gen của bệnh nhân với mã tương ứng, mỗi mẫu được làm 2 lần

Nhận xét:

Hình ảnh điện di rõ nét cho thấy enzym cắt sử dụng cho alen *3 là đặc hiệu, các yếu tố của phản ứng cắt được tối ưu. Kiểu gen dại GG điện di cho 2 băng kích thước 523 và 375 bp, kiểu gen dị hợp GA điện di cho 3 băng kích thước 898, 523 và 375 bp.

Khi so sánh kết quả phân tích kiểu gen của 2 alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 ở 15 mẫu bệnh nhân đầu giữa phương pháp GTT và phương pháp RFLP, chúng tôi

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

38

thấy có độ tương đồng cao. Vì vậy, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP với các mẫu bệnh nhân tiếp theo để giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Kết quả kiểu gen và tần số alen của CYP2C19*2 và CYP2C19*3 được trình bày trong bảng dưới đây:

Bảng 3.5. Kết quả kiểu gen và tần số alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3

Alen Số lượng kiểu gen trên từng alen (%) Tần số alen

GG GA AA G A p-value (KĐ chi-square)

CYP2C19*2 28 (51,9%) 20 (37%) 6 (11,1%) 0,70 0,30 0,41

CYP2C19*3 48 (88,9%) 6 (11,1%) - 0,94 0,06 0,67

Nhận xét:

Alen *2: Kiểu gen GG chiếm tỉ lệ cao nhất với 51,9%, kiểu gen GA chiếm 37%, trong khi kiểu gen AA chỉ chiếm 11,1%. Với alen *3, phần lớn bệnh nhân có kiểu gen GG (chiếm 88,9%), còn lại là 11,1% kiểu gen GA và không thấy sự xuất hiện của kiểu gen AA. Kiểm định chi-square cho thấy các alen *2, *3 tuân theo định luật Hardy- Weinberg, mẫu nghiên cứu có tính đại diện cho quần thể bệnh nhân ĐTNKÔĐ ở người Việt Nam, trong đó, tần số alen đa hình của *2 chiếm tỉ lệ cao hơn tần số alen đa hình *3. Ngoài ra, trong tần số alen đa hình *3: alen A chiếm tỉ lệ khá thấp (0,06) so với alen G (0,94).

Từ kết quả kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 kết hợp với bảng cách đọc kết quả kiểu gen (bảng 2.6), chúng tôi đưa ra bảng kết quả tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 và tỉ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý do kiểu gen quy định như sau:

Bảng 3.6. Tần số phân bố các kiểu gen CYP2C19 của nhóm nghiên cứu

Tổng (N= 54) Nam (N= 45) Nữ (N= 9)

Kiểu gen CYP2C19 N % N2 % % N1

*1*1 24 44,4% 19 42,2% 5 55,6%

*1*2 18 33,3% 16 35,6% 2 22,2%

*1*3 4 7,4% 4 8,9% 0 0,0%

*2*2 6 11,1% 4 8,9% 2 22,2%

*2*3 2 3,8% 2 4,4% 0 0,0%

p 0,541

Nhận xét:

Bảng kết quả tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 cho thấy: kiểu gen *1*1 (kiểu dại) chiếm tỉ lệ cao nhất (44,4%). Các kiểu gen *1*2, *2*2 và *1*3 chiểm tỉ lệ giảm

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

39

dần với 33,3%; 11,1% và 7,4%. Kiểu gen *2*3 chiếm tỉ lệ rất nhỏ với 3,8%. Ngoài ra, không có sự khác biệt về tỉ lệ kiểu gen ở hai giới (p>0,05).

Bảng 3.7. Tỉ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý do kiểu gen quy định

Tổng (N= 54) Nam (N= 45) Nữ (N= 9)

Tác dụng dược lý theo kiểu gen N % N % N %

Tác dụng bình thường 24 44,4% 19 42,2% 5 55,6%

Tác dụng giảm 22 40,7% 20 44,4% 2 22,2%

Tác dụng kém 8 14,9% 6 13,4% 2 22,2%

p 0,447

Nhận xét:

Bảng 3.7 cho thấy sự phân bố của các nhóm gen theo tác dụng dược lý với tác dụng bình thường (*1*1), tác dụng giảm (*1*2, *1*3) và tác dụng kém (*2*2, *2*3). Chiếm tỉ lệ cao nhất là nhóm tác dụng bình thường với 44,4%, theo sau là nhóm tác dụng giảm với 40,7%. Chiếm tỉ lệ thấp nhất trong tổng số bệnh nhân nghiên cứu là nhóm tác dụng kém với 14,9%. Ngoài ra, không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê giữa tác dụng gen do kiểu gen quy định trong hai giới (p>0,05).

3.1.5. Mối quan hệ giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3

Bảng 3.8. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*3

p

GG N= 48 GA N= 6 AA N= 0 CYP2C19*3 636G>A

30,73±11,06 35,83±16,21 - 0,317

Độ NTTC (%) (𝐗̅ ± SD)

Nhận xét:

Bảng kết quả cho thấy ở alen CYP2C19*3, không có sự khác biệt về độ NTTC

giữa các kiểu gen GG và GA (p>0,05).

Bảng 3.9. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*2

p

CYP2C19*2 681G>A GG N= 28 GA N= 20 AA N= 6

27,29±10,59 35,55±12,16 35,83±9.30 0,029

Độ NTTC (%) (𝐗̅ ± SD)

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

40

Biểu đồ 3.4. Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*2

Nhận xét:

Bảng 3.9 và biểu đồ 3.4 cho thấy: có mối liên quan giữa độ NTTC với các kiểu gen trong alen *2 (p=0,029). Hơn nữa, kiểu gen dị hợp đa hình GA có độ NTTC cao hơn so với kiểu dại GG (p=0,016). Tuy nhiên, chưa thấy có sự khác biệt về độ NTTC ở kiểu gen AA so với kiểu gen GG và kiểu gen GA với p lần lượt là 0,077 và 0,959.

Bảng 3.10. Độ NTTC giữa các kiểu tác dụng dược lý do kiểu gen quy định

Tác dụng dược lý N p

Tác dụng bình thường 24 Độ NTTC (%) (𝐗̅ ± SD) 27,42±11,11

Tác dụng giảm 22 32,18±10,40 0,018 Tác dụng kém 8 40,5±12,19

Tổng số 54 31,30±11,66

Biểu đồ 3.5. Độ NTTC giữa tác dụng (giảm+kém) và tác dụng bình thường

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

41

Nhận xét:

Bảng 3.10 và biểu đồ 3.5 cho thấy: độ NTTC giữa các tác dụng dược lý do kiểu gen quy định có mối liên quan với nhau (p=0,018).Với nhóm tác dụng dược lý (giảm và kém), độ NTTC cao hơn so với nhóm tác dụng dược lý bình thường (p= 0,027). Tuy nhiên, so sánh theo cặp, không có sự khác biệt giữa nhóm tác dụng giảm và kém (p=0,074). Vì vậy, chúng tôi gộp nhóm tác dụng dược lý giảm và kém thành 1 nhóm và nhóm tác dụng bình thường là 1 nhóm khi phân tích mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố nguy cơ được trình bày dưới đây.

3.1.6. Mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố khác

Hút thuốc lá, RLCH lipid, ĐTĐ, THA và béo phì là những yếu tố nguy cơ thường gặp của ĐTNKÔĐ. Do đó chúng tôi tiến hành tìm hiểu mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố nêu trên theo 2 nhóm tác dụng dược lý như sau:

Bảng 3.11. Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố nguy cơ: Hút

thuốc lá, RLCH lipid, ĐTĐ, THA và béo phì

Tác dụng bình thường (N= 24) Tác dụng (giảm+kém) (N= 30)

Độ NTTC Độ NTTC Yếu tố

N p p N

16 (%) (X̅ ± SD) 25,38±9,00 (%) (X̅ ± SD) 33,57±11,89 21 Có hút thuốc 0,21 0,55 8 31,50±14,25 36,33±10,24 9 Không hút thuốc

9 41,83±15.77 6 Có RLCH lipid 27,89±11,01

0,876 0,071 15 27,13±11,54 32,54±9,46 24 Không RLCH lipid

5 31,00±6,75 33,29±6,90 7 Có ĐTĐ 0,43 0,772 19 26,47±11,96 34,74±12,47 23 Không ĐTĐ

17 27,53±11,56 36,00±12,06 20 Có THA 0,94 0,281 7 27,14±10,81 31,20±9,41 10 Không THA

2 19,00±4,24 40,50±13,00 4 Có béo phì 0,27 0,254 33,46±11,02 26 Không béo phì 22 28,18±11,27

Nhận xét:

Theo kết quả bảng 3.10 và biểu đồ 3.5, có sự khác biệt về trung bình độ NTTC giữa nhóm tác dụng dược lý bình thường và nhóm tác dụng dược lý (giảm+kém)

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

42

(p<0,05). Tuy nhiên, chưa tìm thấy mối liên quan giữa độ NTTC với các yếu tố nguy

cơ: Hút thuốc lá, RLCH lipid, ĐTĐ, THA và béo phì trong nhóm nghiên cứu này.

Bảng 3.12. Mối liên quan giữa độ NTTC với số lượng yếu tố nguy cơ

Tác dụng bình thường Tác dụng (giảm+kém)

(N= 24) (N= 30) Số lượng

yếu tố N p p N

Độ NTTC (%) (𝐗̅ ± SD) 31,14±14,38 7 ≤1 Độ NTTC (%) (𝐗̅ ± SD) 31,25±10,00 8

10 2 16 22,30±8,49 0,164 32,81±9,54 0,117

7 ≥3 6 31,00±9,13 42,83±14,87

Nhận xét:

Với cỡ mẫu trong nghiên cứu này, chúng tôi chưa thấy có mối liên quan giữa

độ NTTC với số lượng yếu tố nguy cơ (p>0,05).

Bảng 3.13. Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố cận lâm sàng

Tác dụng bình thường Tác dụng (giảm+kém)

(N= 24) (N= 30) Yếu tố

r p r p

-0,034 0,863 -0,206 RBC (T/L) 0,334

-0,106 0,592 -0,089 WBC (G/L) 0,678

-0,019 0,925 0,098 PLT (G/L) 0,649

0,163 0,409 -0,003 MCV (fL) 0,988

-0,090 0,649 0,020 MPV (fL) 0,926

-0,161 0,432 0,180 CRP (mg/dL) 0,399

0,079 0,695 0,226 Fibrinogen (g/l) 0,289

0,057 0,779 0,004 PT (%) 0,984

0,133 0,507 -0,150 0,484 APTT bệnh/chứng

Nhận xét:

Chúng tôi sử dụng phép phân tích hồi quy tuyến tính cho 2 biến định lượng để phân tích mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố cận lâm sàng. Trong đó r là hệ số tương quan, r >0,7 (tương quan rất chặt chẽ), r <0,3 (ít tương quan), tương quan

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

43

đồng biến khi r có giá trị dương, tương quan nghịch biến khi r có giá trị âm. Bảng kết

quả trên cho thấy các chỉ số cận lâm sàng được chọn có mối tương quan tương đối

yếu so với độ NTTC ở cả 2 nhóm tác dụng bình thường và tác dụng (giảm+kém). Do

đó, với cỡ mẫu của nghiên cứu này, chúng tôi chưa kết luận được gì về mối tương quan giữa độ NTTC và một số yếu tố cận lâm sàng.

3.2. Bàn luận

ĐTNKÔĐ là một dạng trong hội chứng động mạch vành cấp. Nguyên nhân chính dẫn đến ĐTNKÔĐ là do sự nứt, vỡ của các mảng xơ vữa không ổn định, hình thành nên

các cục máu đông nhưng chưa gây tắc hoàn toàn động mạch vành. Tuy nhiên, ĐTNKÔĐ

có thể diễn biến nặng thành nhồi máu cơ tim thực sự và gây nên các biến cố tim mạch

[26]. Bệnh động mạch vành nói chung và ĐTNKÔĐ nói riêng là nguyên nhân hàng đầu đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe người bệnh, gây tử vong thương tật cao trên thế giới

và ngày càng gia tăng ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam.

Chống hình thành huyết khối thông qua ức chế hoat động tiểu cầu là điều trị

cốt lõi trong ĐTNKÔĐ ở Việt Nam, được dựa trên các hướng dẫn quốc tế luôn cập

nhật như hướng dẫn của Hội tim mạch Hoa Kì nhằm nâng cao sức khỏe và cải thiện

tiên lượng sống cho người bệnh [29].

Hiện nay, liệu pháp kháng tiểu cầu kép gồm aspirin và clopidogrel vẫn là lựa

chọn hàng đầu trong điều trị chống NTTC nhằm ngăn ngừa các biến cố tim mạch.

Tuy nhiên một số lượng lớn bệnh nhân ĐTNKÔĐ vẫn xảy ra các biến cố thiếu máu

cơ tim cục bộ mặc dù tuân thủ đúng phác đồ điều trị [16]. Các nghiên cứu đã chỉ ra

rằng có sự khác nhau giữa các bệnh nhân điều trị clopidogrel [30,79]. Clopidogrel là

một tiền chất không có tác dụng sinh học, được chuyển hóa thành thuốc có hoạt tính

nhờ cytochrome P450 ở gan (chủ yếu là CYP2C19) với tác dụng làm giảm độ NTTC

thông qua ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 trên màng tiểu cầu, làm cho các tiểu cầu không kết dính lại với nhau [54,68].

Enzym CYP2C19 được biết đến là enzym có tính đa hình cao với 25 alen. Hoạt tính enzym khác nhau phụ thuộc vào sự xuất hiện của các alen trong kiểu gen. Cụ thể, *1 là alen kiểu dại, biểu hiện hoạt tính enzyme bình thường trong khi các alen *2 và *3

gây mất hoạt tính enzym [68]. Cơ chế đáp ứng kém với clopidogrel hiện vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ, không chỉ do yếu tố di truyền như đa hình gen CYP2C19 mà còn

do các yếu tố phi di truyền như không tuân thủ điều trị, tương tác thuốc, béo phì, tuổi

cao, RLCH lipid, hút thuốc, THA, tiểu đường, tiền sử NMCT,...[30].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

44

Trong nghiên cứu này, bên cạnh việc xác định tần số phân bố kiểu gen

CYP2C19, chúng tôi còn tiến hành đánh giá mối tương quan giữa độ NTTC với đa

hình CYP2C19 và một số yếu tố ảnh hưởng khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ ở Việt

Nam. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, có mối liên quan về độ NTTC giữa bệnh nhân mang alen quy định enzym hoạt động bình thường và bệnh nhân mang

alen quy định enzym mất hoạt tính chuyển hóa (p<0,05).

3.2.1. Một số đặc điểm chung

3.2.1.1. Đặc điểm về giới

ĐTNKÔĐ chiếm tỉ lệ cao ở nam giới. Theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi,

có 45 bệnh nhân nam (chiếm 83,3%) và 9 bệnh nhân nữ (chiếm 16,7%). Kết quả này

phù hợp với kết quả của các nghiên cứu khác như Đinh Hữu Nghị là 81,3% nam [13], Đỗ Thị Tuyến là 78,9% nam [23], Nghiêm Hoàng Lan Phương là 85,7% nam [18].

Nhiều nghiên cứu cho thấy, nữ giới bị can thiệp động mạch vành thường muộn hơn

so với nam giới khoảng 9 năm và sự can thiệp này có xu hướng lan tỏa hơn với tình

trạng nhiều bệnh lý đi kèm khiến tiên lượng ở nữ giới nặng nề hơn [36,72].

3.2.1.2. Đặc điểm về tuổi

Kết quả nghiên cứu trên 54 bệnh nhân ĐTNKÔĐ cho thấy: ĐTNKÔĐ có xu

hướng tăng dần theo tuổi với tuổi trung bình là 63,57±10,28 dao động từ 42 tuổi đến

83 tuổi. Kết quả của chúng tôi tương tự với các kết quả nghiên cứu khác như Đỗ Thị

Tuyến là 64±12,2 [23], Sibbing và cộng sự là 66.5±10,2 [71]. Kết quả của chúng tôi

là phù hợp vì tuổi cao là một trong những yếu tố nguy cơ ĐTNKÔĐ. Khi tuổi cao,

mức độ dày nội mạc mạch máu và sự già hóa tổ chức động mạch tăng lên, làm giảm

khả năng trao đổi chất, giảm tính thấm với các chất có phân tử lớn và trở thành bệnh

lý [15]. XVĐM là nguyên nhân chính dẫn đến ĐTNKÔĐ, mức độ XVĐM cũng tăng

dần theo tuổi [3]. Tuy nhiên, bệnh có thể gặp ở những người bệnh trẻ tuổi nhưng do nhiều yếu tố khác nhau làm xuất hiện tình trạng rối loạn chuyển hóa.

3.2.1.3. Các yếu tố nguy cơ của ĐTNKÔĐ

Hút thuốc lá là một trong những yếu tố nguy cơ nguy hiểm nhất của ĐMV vì chúng làm giảm khuếch tán, vận chuyển oxy đến các tổ chức và tế bào cơ tim làm co

thắt ĐMV. Nhiều nghiên cứu cho thấy những người hút thuốc lá nặng có tỷ lệ tử vong do bệnh tim mạch cao gấp 1,5 lần so với người không hút thuốc. Nicotin trong thuốc lá làm nhịp tim nhanh, huyết áp tăng, lưu lượng tim và công của tim cũng tăng. Nicotin còn làm giải phóng ra nhiều catecholamine, tăng huy động axit béo, giảm dự

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

45

trữ mỡ và tăng cholesterol máu, đẩy nhanh sự phát triển của XVĐM [7,15]. Trong

nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ hút thuốc lá chiếm 68,5% cao hơn nhiều so với kết quả

của Trần Thị Hải Hà khi nghiên cứu trên bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp 16,3% [9].

Ngoài ra, tỉ lệ bệnh nhân hút thuốc lá ở nam giới cao hơn đáng kể so với nữ giới (80% và 11,1%). Kết quả này phù hợp với số liệu của WHO và điều tra y tế quốc gia năm

2002 với tỉ lệ hút thuốc ở nam giới Việt Nam là 56%, nữ là 1,8% [4].

THA là bệnh phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt Nam, thường đi kèm với các yếu tố nguy cơ khác tạo tác dụng hiệp đồng, đặc biệt là phối hợp với RLCH lipid.

Trong các trường hợp mắc bệnh và tử vong do tim mạch hàng năm thì có tới 30-40%

nguyên nhân do THA [25]. THA làm đẩy nhanh quá trình XVĐM, phì đại cơ tim và

giảm khả năng cung cấp máu của ĐMV. Ngoài ra, THA động mạch còn đi kèm với nhiều biến chứng phức tạp về mạch máu kết hợp với tăng hoạt hóa tiểu cầu và tổn

thương nội mạc. Các yếu tố này góp phần khởi phát, thúc đẩy những diễn biến phức tạp của quá trình XVĐM và tác động mạnh mẽ lên ĐMV [12]. Nghiên cứu của chúng

tôi cho tỉ lệ THA khá cao là 68,5%, tương tự với nghiên cứu của Tomoyuki và cộng sự

(2013) thực hiện trên bệnh nhân can thiệp động mạch vành qua da tại Nhật Bản với

61,9% bệnh nhân THA [76]. Ngoài ra, trong nghiên cứu này, chúng tôi không thấy có

sự khác biệt về tỉ lệ THA ở hai giới. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Đinh

Hữu Nghị (2005) trên bệnh nhân NMCT cấp [13].

Một yếu tố quan trọng nữa của bệnh ĐMV là ĐTĐ. Bệnh nhân mắc ĐTĐ có

các biến cố tim mạch như NMCT, đột quỵ, suy tim, tắc mạch…Một số nghiên cứu

đã chỉ ra rằng, người bị ĐTĐ typ II có nguy cơ bị bệnh mạch vành cao gấp 2- 4 lần

và tăng tỉ lệ tử vong sau đặt stent mạch vành so với người không bị ĐTĐ. Ngoài ra,

ở nam, nguy cơ tử vong tăng gấp 2 lần khi mắc bệnh mạch vành kèm ĐTĐ trong khi

ở nữ là 4 lần [15]. Các rối loạn chuyển hóa trong ĐTĐ thường phối hợp với các RLCH lipid máu và THA, gây ra XVĐM và tình trạng tiền huyết khối. Kiểm soát đường

huyết chặt chẽ ở bệnh nhân ĐTĐ sẽ giúp giảm nguy cơ biến chứng mạch máu, đặc

biệt là ở nữ giới [67]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 22,2% bệnh nhân ĐTĐ, thấp hơn so với nghiên cứu của Ewa Laskowska (2015) trên bệnh nhân NMCT là

34,4% [41]. Ngoài ra, tỉ lệ mắc ĐTĐ ở nữ giới cao hơn đáng kể so với nam giới (p= 0,008), kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Đinh Hữu Nghị với p<0,05 [13].

Béo phì là một trong những yếu tố nguy cơ của hội chứng chuyển hóa và bệnh tim mạch. Béo phì thường phối hợp với tình trạng đề kháng insulin và giảm HDL-C huyết tương. Bệnh nhân có trọng lượng cơ thể bằng 120% trọng lượng lý tưởng sẽ có

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

46

nguy cơ mắc bệnh tim mạch tăng gấp 2 lần và sẽ giảm 33-55% khi họ giảm cân [21].

Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 11,1% bệnh nhân béo phì, thấp hơn kết quả của

Lê Phúc Nguyên 20% [14]. Tỉ lệ bệnh nhân nam mắc béo phì có xu hướng cao hơn

so với nữ (13,3% và 0%), phù hợp với kết quả của Nghiêm Hoàng Lan Phương với tỉ lệ mắc béo phì ở nam là 23,3% và ở nữ là 0% [18].

RLCH lipid là yếu tố nguy cơ không thể thiếu của bệnh mạch vành, đặc biệt là

tăng cholesterol toàn phần, tăng LDL-C và giảm HDL-C [8]. Cholesterol toàn phần đóng vai trò quan trọng trong hình thành các mảng xơ vữa. Nồng độ cholesterol càng cao thì

tần suất mắc bệnh mạch vành càng cao. Nếu cholesterol toàn phần <2g/l thì nguy cơ mắc

bệnh mạch vành là 1. Nguy cơ này tăng đến 2,25 và 3,25 nếu cholesterol toàn phần là

2,4g/l và >2,6g/l [20]. RLCH lipid làm thúc đẩy mạnh mẽ hình thành mảng XVĐM, với sự tham gia của LDL-C. Bởi sau khi xâm nhập được vào thành mạch máu, lắng đọng ở

bên trong lòng mạch, chúng gây tăng sinh tế bào bọt, làm thành mạch bị tổn thương, dẫn đến tăng sinh, thoái hóa tế bào cơ trơn, và kết quả là XVĐM [46]. Tỉ lệ bệnh nhân RLCH

lipid trong nghiên cứu của chúng tôi là 27,8%, thấp hơn nhiều so với nghiên cứu của

Ewa Laskowska là 62,4% [41], của Tomoyuki là 71% [76]. Ngoài ra, tỉ lệ bệnh nhân

RLCH lipid ở hai giới có độ tương đồng cao (p>0,05). Kết quả này phù hợp với nghiên

cứu của Nghiêm Hoàng Lan Phương [18] và Trịnh Xuân Thắng [19].

Các yếu tố nguy cơ tim mạch có khuynh hướng xuất hiện cùng nhau và có tác

dụng cộng hưởng. Những người có nhiều yếu tố nguy cơ thì khả năng mắc bệnh tim

mạch sẽ cao hơn những người có yếu tố nguy cơ ít hoặc không có yếu tố nguy cơ

[19]. Theo nghiên cứu của chúng tôi, hầu hết các bệnh nhân đều mang yếu tố nguy

cơ, trong đó có tới 72,2% số bệnh nhân có từ 2 yếu tố nguy cơ trở lên (biểu đồ 3.3),

kết quả này cao hơn so với nghiên cứu của Nghiêm Hoàng Lan Phương là 48,6%

[18] và Trần Thị Hải Hà là 65% [9]. Người có ≥ 2 yếu tố nguy cơ chính (bao gồm Cholesterol ≥ 5,2 mmol/l, huyết áp ≥ 140/90 mmHg, hút thuốc lá) thì nguy cơ mắc

bệnh mạch vành tăng gấp 5,5 lần ở nam và 5,7 lần ở nữ còn nguy cơ tử vong chung

cũng tăng gấp 3,2 và 2,3 lần tương ứng ở nam và nữ [19].

3.2.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đo một số chỉ số cận lâm sàng để theo dõi và đánh giá tình trạng bệnh nhân, bao gồm một số chỉ số huyết học: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, thể tích hồng cầu trung bình, thể tích tiểu cầu trung bình và một số chỉ số hóa sinh, đông máu như: các chỉ số về mỡ máu, CRP, fibrinogen, PT, APTT. Hầu hết trung bình các chỉ số nằm trong giới hạn bình thường và có độ tương đồng cao giữa

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

47

hai giới (bảng 3.2). Kết quả này phần lớn tương tự với nghiên cứu của Đỗ Thị Tuyến,

tuy nhiên trong nghiên cứu của Đỗ Thị Tuyến, các chỉ số Cholesterol toàn phần và

LDL-C có sự khác biệt giữa hai giới (p<0,05) [23].

3.2.3. Kết quả đo độ NTTC

Hiện nay, đo độ NTTC là một trong những phương pháp được sử dụng nhiều nhất

để nghiên cứu chức năng tiểu cầu, đặc biệt trong các trường hợp có tăng NTTC, góp

phần quyết định việc điều trị thuốc ức chế NTTC [35]. Mặc dù có nhiều chất kết tập được sử dụng để đánh giá độ NTTC như: ADP (adenosin diphosphate), collagen,

ristocetin, arachidonic…[10] nhưng trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng ADP làm chất kích tập tiểu cầu bởi nhiều lý do. ADP gây kích tập tiểu cầu độc lập, không bị phụ

thuộc vào các tác nhân khác và giúp phản ứng NTTC do các tác nhân này xảy ra đầy đủ

hơn. Không chỉ thế, ADP cũng tham gia vào nhiều phản ứng khác ở tiểu cầu như làm

thay đổi hình dạng, bài tiết, tạo thromboxane A2, hoạt hóa GP IIb/IIIa [28]. ADP còn là

đích tác dụng của một số thuốc chống NTTC hiện nay như ticlopidin, clopidogrel...

Hiện nay, aspirin đã trở thành thuốc kháng tiểu cầu được sử dụng phổ biến

trong phòng ngừa nguyên phát và thứ phát bệnh tim mạch [31]. Tác dụng của aspirin

là ngăn cản quá trình chuyển acid arachidonic thành thromboxane A2 (TXA2- một

chất co mạch mạnh và kích thích gây NTTC). Bên cạnh đó, aspirin cũng làm bất hoạt

chức năng hoạt hóa tiểu cầu gây ảnh hưởng đến chức năng tiểu cầu. Aspirin tác động

một phần đối với NTTC do tác động của collagen, thrombin và ADP [54,69]. Ở những

bệnh nhân sử dụng aspirin, aspirin làm giảm ngưng tập tiểu cầu với ADP [2].

Clopidogrel là một tiền thuốc thuộc nhóm thienopyridine thế hệ thứ hai. Sau

khi hấp thu tại ruột, chỉ có 15% lượng thuốc được chuyển hóa tại gan qua hai bước

oxy hóa liên tiếp bởi các enzym cytochrome P-450 (chủ yếu là CYP2C19) trở thành

chất có hoạt tính kháng tiểu cầu, 85% lượng thuốc còn lại được chuyển hóa bởi các

enzym esterase trở thành chất không có hoạt tính. Clopidogrel ức chế chọn lọc và không hồi phục quá trình gắn phân tử ADP vào các thụ thể P2Y12 của nó lên bề mặt tiểu cầu, làm cho các cảm thụ GPIIb/IIIa không được hoạt hóa, từ đó ngăn cản tiểu cầu kết dính với nhau. Do vậy, clopidogrel được dùng để ức chế sự hình thành huyết khối trong động mạch vành, động mạch ngoại vi và động mạch não [68]. Hiện nay, clopidogrel kết hợp với aspirin là liệu pháp điều trị kháng tiểu cầu phổ biến nhất ở bệnh nhân HCĐMVC, đặc biệt là có can thiệp động mạch vành qua da [16].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá độ NTTC trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ sử dụng kháng tiểu cầu kép gồm aspirin (liều nạp 300mg, liều duy trì 100mg/ngày)

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

48

kết hợp với clopidogrel (liều nạp 300mg, liều duy trì 75mg/ngày). Chúng tôi gây

NTTC bằng chất kích tập ADP thu được kết quả trung bình độ NTTC là 31,3±11,66%.

Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nghiêm Hoàng Lan Phương trên bệnh nhân

nhồi máu cơ tim cấp tại thời điểm dùng kháng tiểu cầu kép [18]. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với Nguyễn Thị Nữ, Cung Thị Lý và Đỗ Trung

Phấn khi nghiên cứu chỉ số NTTC với chất kích tập ADP ở người trưởng thành Việt

Nam bình thường là 67±6,5% [17]. Điều này có thể giải thích do chúng tôi đo độ NTTC vào ngày thứ 3 sau khi dùng aspirin và clopidogrel.

3.2.4. Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3

Xã hội càng phát triển thì yêu cầu về chất lượng khám chữa bệnh càng được chú trọng hơn với mục tiêu giảm chi phí, xác định đúng căn nguyên của bệnh để có

các phác đồ điều trị đích thích hợp. Từ yêu cầu thiết yếu đó, kĩ thuật y sinh học phân

tử ra đời giúp đưa ra chẩn đoán sớm và liệu pháp điều trị phù hợp nhờ phát hiện bất

thường, dấu hiệu, nguy cơ bệnh tật khi phân tích đoạn gen nào đó của người bệnh.

Tuy nhiên, quá trình tiến hành thí nghiệm để xác định các đa hình đơn gen

(SNP) của từng bệnh nhân phải trải qua nhiều khâu, trong đó tách DNA tổng số là

khâu đầu tiên và rất quan trọng. DNA sau tách chiết phải đảm bảo yêu cầu về nồng

độ, không bị đứt gãy, không tạp nhiễm và có độ tinh sạch cao vì chất lượng DNA ảnh

hưởng rất lớn đến kết quả của các khâu tiếp theo. Do đó, để kiểm tra chất lượng,

chúng tôi không chỉ sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang ở các bước sóng

260nm và 280nm nhằm đánh giá độ tinh sạch, định lượng DNA thu được, mà còn

đánh giá độ nguyên vẹn chiều dài DNA thông qua phương pháp điện di trên gel

agarose 0,7%. Kết quả thể hiện trong bảng 3.4 và hình 3.1 cho thấy sản phẩm DNA

tổng số đáp ứng đủ điều kiện cho các thí nghiệm phân tích tiếp theo.

Bước kế tiếp của đề tài là khuếch đại vùng gen chứa các alen CYP2C19*2

(c.681>A) thuộc exon 5 và alen CYP2C19*3 (c.636>A) thuộc exon 4 trước khi tiến hành GTT hay quy trình RFLP. Chúng tôi sử dụng phương pháp PCR đơn mồi dùng một cặp mồi đặc hiệu với đoạn gen cần khuếch đại. Kết quả điện di sản phẩm PCR được thể hiện trong hình 3.2 cho thấy các điều kiện phản ứng PCR đã tối ưu tốt, băng đạt yêu cầu với kích thước đoạn gen thu được là 719 bp chứa alen *2 và 898 bp chứa alen *3. Sản phẩm PCR được tinh sạch trước khi thực hiện GTT.

Kết quả GTT các mẫu nghiên cứu thể hiện trong hình 3.3 và 3.4 cho thấy hình

ảnh rõ nét, các đỉnh màu tương ứng với các nucleotide rõ ràng và không bị nhiễu.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

49

Trong các mẫu nghiên cứu, alen CYP2C19*2 cho 3 loại kiểu gen: đồng hợp

tử kiểu dại GG, dị hợp tử đa hình GA và đồng hợp tử đa hình AA. Trong khi đó, alen

CYP2C19*3 chỉ cho hai loại kiểu gen: đồng hợp tử kiểu dại GG, dị hợp tử đa hình

GA và không có bệnh nhân nào mang kiểu gen đồng hợp tử đa hình AA.

Hiện nay, phương pháp GTT vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc phân

tích kiểu gen nhằm phát hiện các SNP với độ chính xác cao nhưng chi phí đắt và mất

nhiều thời gian. Mặt khác, *2 và *3 có vị trí cắt đặc hiệu với enzym giới hạn tương ứng là SmaI và FastDigest BamHI. Vì vậy, ngoài GTT, chúng tôi tiến hành phân tích kiểu

gen bằng phương pháp RFLP. Kết quả điện di được thể hiện trong hình 3.5 và 3.6.

Với alen *2, kiểu gen đồng hợp đa hình AA điện di cho 1 băng duy nhất kích

thước 719 bp, kiểu gen dại GG điện di cho 2 băng có kích thước 526 bp và 193 bp, kiểu gen dị hợp tử đa hình GA điện di cho 3 băng có kích thước 719, 526 và 193 bp.

Điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR nhân dòng alen *2 đã được tối ưu hóa với 1µl enzym SmaI cắt 40-50ng/µl DNA ở 30˚C trong 1giờ và 3 giờ nhằm kiểm tra tính

lặp lại của phản ứng. Với alen *3, kiểu gen đồng hợp đa hình AA điện di cho 1 băng

duy nhất kích thước 898 bp, kiểu gen dại GG điện di cho 2 băng có kích thước 523

bp và 375 bp, kiểu gen dị hợp tử đa hình GA điện di cho 3 băng có kích thước 898,

523 và 375 bp. Điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR nhân dòng alen *3 đã được

tối ưu hóa với 1µl enzym FastDigest BamHI cắt 40-50ng/µl DNA ở 37˚C trong 15

phút và 30 phút nhằm kiểm tra tính lặp lại của phản ứng.

Chúng tôi nhận thấy xác định kiểu gen bằng phương pháp RFLP cho kết quả

tương đương khi so sánh với phương pháp GTT. Hơn nữa, kỹ thuật RFLP thao tác

đơn giản, tiết kiệm thời gian và chi phí. Vậy nên, với các mẫu bệnh nhân nghiên cứu

còn lại, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP để phân tích alen *2 và *3.

Mục tiêu đầu của chúng tôi là xác định tần số phân bố kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3. Chúng tôi tiến hành phân tích kiểu gen của từng alen trên 54 bệnh nhân ĐTNKÔĐ thu được kết quả như trong bảng 3.5. Kết quả phân tích cho thấy, các

alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 tuân theo định luật Hardy-Weinberg, do đó mẫu nghiên cứu có tính đại diện cho quần thể bệnh nhân ĐTNKÔĐ người Việt Nam.

Năm 2017, Marchini J.F. và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trên 169 bệnh nhân có can thiệp động mạch vành qua da tại Brazil cho thấy sự khác biệt khá lớn về tần số kiểu gen ở alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3. Với alen CYP2C19*2 trong khi nghiên cứu của Marchini J.F. cho tỉ lệ GG (74,0%), GA (23,7%), AA (2,4%) thì nghiên cứu của chúng tôi là GG (51,9%), GA (37%), AA (11,1%). Với alen

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

50

CYP2C19*3, theo Marchini J.F., cho tỉ lệ GG (100%), không thấy sự có mặt của kiểu gen dị hợp tử GA và đồng hợp tử AA đa hình, trong khi nghiên cứu của chúng tôi cho tỉ lệ GG (88,9%), GA (11,1%). Từ đây ta có thể thấy được sự ảnh hưởng của chủng tộc lên sự phân bố alen trong từng kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 [59].

Tìm được kiểu gen của từng alen hay xác định từng SNP sẽ giúp chúng tôi xác định được kiểu gen của từng bệnh nhân. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn 2 SNP là CYP2C19*2 và CYP2C19*3 để phân tích. Tuy gen CYP2C19 còn các SNP khác như CYP2C19*4, *5, *6, *7,…nhưng tần số xuất hiện thấp cũng như hạn chế kinh phí nên chúng tôi coi các SNP này là các alen kiểu dại (CYP2C19*1). Sau khi phân tích kiểu gen kết hợp với bảng cách đọc kết quả kiểu gen (bảng 2.6), chúng tôi đã tìm được kiểu gen của từng bệnh nhân. Bảng 3.6 cho thấy chiếm tỉ lệ cao nhất là kiểu gen *1*1 (kiểu dại) với 44,4%, các kiểu gen còn lại chiếm tỉ lệ thấp hơn là *1*2 (33,3%), *2*2 (11,1%), *1*3 (7,4%), *2*3 (3,8%) và *3*3 (0,0%).

Wichittra Tassaneeyakul và cộng sự (2006) nghiên cứu trên 127 người Myanma cho thấy: *1*1 (44,1%), *1*2 (39,4%), *2*2 (9,4%), *1*3 (5,5%), *2*3 (1,6%) và *3*3 (0,0%). Kết quả cho thấy tần số phân bố kiểu gen trong quần thể người Myanma có sự tương đồng cao so với quần thể nghiên cứu của chúng tôi [74].

Nghiên cứu của Tomoyuki và cộng sự (2013) trên 155 bệnh nhân can thiệp động mạch vành ở Nhật Bản (khu vực Bắc Á) cho thấy tần số xuất hiện của các kiểu gen có sự khác biệt so với kết quả của chúng tôi: *1*1 (40,0%), *1*2 (27,7%), *2*2 (7,1%), *1*3 (17,4%), *2*3 (6,5%), *3*3 (1,3%) [76]. Cụ thể, ở nghiên cứu này, alen *2 chiếm tỉ lệ thấp hơn trong khi alen *3 chiếm tỉ lệ cao hơn so với nghiên của chúng tôi (khu vực Đông Nam Á). Để giúp so sánh thuận tiện hơn cũng như để có cái nhìn dễ dàng, tổng quan hơn, chúng tôi đã tính toán tần số phân bố của từng alen gen CYP2C19 (biểu đồ 3.6) dựa vào bảng tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 (bảng 3.6) và tiến hành so sánh kết quả này với các khu vực trong và ngoài Đông Nam Á.

Biểu đồ 3.6. Tần số alen của gen CYP2C19

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

51

Kết quả biểu đồ 3.6 cho thấy, alen kiểu dại *1 chiếm tỉ lệ cao nhất với 65%,

các alen còn lại *2, *3 chiếm tỉ lệ thấp hơn lần lượt là 29% và 6%. Ở biểu đồ 3.7

chúng tôi so sánh tần số phân bố các alen CYP2C19 ở Việt Nam và một số khu vực

trên thế giới. Ở Đông Nam Á, không có sự khác biệt về tần số phân bố 3 alen giữa Việt Nam, Malaysia và Myanma [74,82]. Tuy nhiên ở khu vực Bắc Á, tỉ lệ alen *3 ở

Hàn Quốc và Nhật Bản có xu hướng cao hơn so với các nước ở khu vực Đông Nam

Á [55]. Nhưng khi so sánh tần số phân bố các alen của gen CYP2C19 của các nước Đông Nam Á với Đông Âu và người Mỹ gốc Phi thì thấy có sự khác biệt rõ rệt. Ở các

khu vực này đều có tỉ lệ rất nhỏ hay không có của alen *3 [65]. Từ việc so sánh,

chúng tôi nhận thấy tần số phân bố alen trong nghiên cứu của chúng tôi tương đồng

với các nước Đông Nam Á nhưng có sự khác biệt với các nước thuộc khu vực khác cũng như chủng tộc khác. Kết luận này không chỉ giúp ích được các bác sĩ lâm sàng

biết được tỉ lệ đa hình gen CYP2C19 của quần thể Việt Nam mà còn giúp xác định

được nguyên nhân kháng thuốc, từ đó cá thể hóa điều trị cho từng bệnh nhân.

Biểu đồ 3.7. So sánh tần số phân bố các alen CYP2C19

ở Việt Nam và các khu vực khác

Chúng tôi tiến hành phân loại tác dụng dược lý của enzym CYP2C19 theo kiểu gen với mục đích thực hiện các thử nghiệm dược di truyền trong thực hành lâm sàng

thường quy. Hoạt tính của enzym được phân loai thành 3 loại tác dụng dược lý: tác

dụng dược lý bình thường (*1*1) với 44,4%, tác dụng dược lý giảm (*1*2, *1*3) với 40,7% và tác dụng dược lý kém (*2*2, *2*3) với 14,9%. Tỉ lệ phân bố hoạt tính enzym CYP2C19 có sự khác nhau giữa các khu vực, đặc biệt là với những cá thể có hoạt tính enzym chuyển hóa kém. *2 là alen đa hình phổ biến nhất, tới 75-83% người có enzym chuyển hóa kém [62]. Tỉ lệ người mang enzym hoạt tính chuyển hóa kém ở quần thể người da trắng là 2-5%, ở châu Phi là 4-8% và ở châu Á là 11-23% [45].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

52

Bên cạnh đó, cũng có nhiều nghiên cứu độc lập về tỉ lệ mang enzym hoạt tính chuyển

hóa kém quần thể người châu Á: ở Nhật Bản là 18-23%, ở Trung Quốc là 15-17% và

ở Hàn Quốc là 12-16% [64]. Tỉ lệ bệnh nhân mang enzym hoạt tính chuyển hóa kém

trong nghiên cứu của chúng tôi là 14,9%, khá tương đồng với các nước châu Á nhưng có sự khác biệt với quần thể người da trắng và châu Phi.

Như vậy, trong nghiên cứu của chúng tôi, tần số alen đa hình *2 chiếm tỉ lệ

cao hơn so với tần số alen đa hình *3. Tần số xuất hiện của cả 3 alen *1, *2, *3 và tỉ lệ người mang enzym hoạt tính chuyển hóa kém có sự tương đồng cao với các nước

trong khu vực và có sự khác biệt với các nước khác khu vực cũng như khác chủng

tộc, qua đó thấy được ảnh hưởng của vị trí địa lý lên sự phân bố tần số các alen.

3.2.5. Mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3

Clopidogrel là một tiền thuốc được sử dụng phổ biến hiện nay, cùng với aspirin

để ngăn ngừa huyết khối ở bệnh nhân bệnh mạch vành. Tuy nhiên, để trở thành thuốc có

hoạt tính, clopidogrel phải trải qua hai bước chuyển hóa ở gan với sự tham gia của enzym

CYP2C19 [68]. Bệnh nhân có kiểu gen chứa *2 (c.681G>A) hoặc *3 (c.636G>A) sẽ làm

giảm hoặc bất hoạt chức năng của enzym, do đó làm giảm chuyển hóa clopidogrel, dẫn

đến giảm hiệu quả kháng tiểu cầu so với nhóm mang kiểu gen dại (*1) [38]. Khi đó, các

biến chứng huyết khối động mạch có thể xảy ra gồm NMCT, huyết khối stent, huyết

khối động mạch ngoại biên, đột quỵ, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của

người bệnh [61]. Bởi vậy, việc tìm hiểu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen

CYP2C19 của chúng tôi không chỉ giúp các bác sĩ lâm sàng đánh giá được hiệu quả điều

trị, mà còn tiên lượng được các biến cố xấu có thể xảy ra với bệnh nhân mang alen giảm

hoặc mất hoạt tính enzym. Kết quả bảng 3.9 và biểu đồ 3.4 cho thấy: với alen *2, có mối

liên quan giữa độ NTTC giữa các kiểu gen (p=0,029), hơn nữa độ NTTC với kiểu gen

dị hợp đa hình GA (35,55±12,16%) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với kiểu dại GG (27,29±10,59%) (p=0,016). Tuy nhiên trong nghiên cứu này, chúng tôi chưa thấy có sự khác biệt về độ NTTC giữa các kiểu gen của alen CYP2C19*3 (bảng 3.8). Có thể giải

thích kết quả này là do cỡ mẫu còn hạn chế trong khi tần số xuất hiện của alen đột biến trong kiểu gen CYP2C19*3 không cao. Điều này càng cho thấy vai trò quan trọng của

alen *2 trong ĐTNKÔĐ ở quần thể nghiên cứu này.

Như đã nói ở trên, bệnh nhân giảm đáp ứng với liệu pháp kháng tiểu cầu có thể xảy ra các biến cố tim mạch. Mặc dù trong nghiên cứu này chúng tôi mới chỉ so sánh trung bình độ NTTC giữa các kiểu gen, nhưng khi so sánh với các nước trên thế giới chúng tôi vẫn đề cập đến cả nguy cơ và tỉ lệ xảy ra các biến cố tim mạch. Sibbing

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

53

và các cộng sự (2009) nghiên cứu trên 2485 bệnh nhân can thiệp động mạch vành

qua da cho thấy: ở những bệnh nhân mang alen đột biến *2 có tỉ lệ các biến cố huyết

khối đặt stent tăng gấp 3 lần so với những bệnh nhân mang đồng hợp tử kiểu dại với

p=0,007 [71]. Nghiên cứu của Yang J và cộng sự (2013) cũng thấy ở những người mang 1 alen đột biến (*1/*2, *1/*3) và 2 alen đột biến (*2/*3, 2 /*2, *3/*3) có độ

NTTC tối đa với ADP cao hơn so với những người mang kiểu dại (*1/*1) (p<0,05)

[81]. Thêm vào đó, Arima và cộng sự (2015) cũng chỉ ra rằng ở bệnh nhân mang alen CYP2C19 mất chức năng có hoạt động tiểu cầu và tỉ lệ các biến cố tim mạch cao hơn

so với những người không mang alen này (p<0,05) [32]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu

CHARISMA (2012) trên 4819 bệnh nhân với bệnh mạch vành cho thấy alen

CYP2C19*2 không ảnh hưởng đến các biến cố thiếu máu [33]. Nghiên cứu của Zabala và các cộng sự (2012) cũng cho thấy, alen mất chức năng không làm tăng

nguy cơ tim mạch [83], chúng chỉ làm tăng biến cố huyết khối trong đặt stent. Vấn

đề gây tranh cãi này đã được một số nghiên cứu đưa ra chỉ có 5-12% có đáp ứng khác

nhau với clopidogrel [70]. Vậy nên vẫn còn những biến thể gen khác hay những nhân

tố khác chưa được xác định cũng có khả năng làm sáng tỏ vấn đề này. Mặc dù, trong

nghiên cứu này, chúng tôi không theo dõi các biến cố lâm sàng nhưng rõ ràng đa hình

CYP2C19*2 có liên quan rõ rệt đến tăng độ NTTC trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ.

3.2.6. Mối liên quan giữa độ NTTC với các yếu tố khác

3.2.6.1. Mối liên quan giữa độ NTTC và giới

Kết quả bảng 3.3 cho thấy độ NTTC giữa nam và nữ tương đồng cao (p>0,05).

Các nghiên cứu khác cũng cho kết quả tương tự [15,16].

3.2.6.2. Mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố nguy cơ

Ảnh hưởng lên độ NTTC không chỉ có các yếu tố di truyền mà còn có các yếu

tố phi di truyền như hút thuốc lá, béo phì, tăng huyết áp, đái tháo đường… [30]. Vậy

nên trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn tìm hiểu một số yếu tố nguy cơ ảnh hưởng lên độ NTTC để giúp các bác sĩ lâm sàng điều trị cho bệnh nhân đạt kết quả tốt hơn.

Ở kết quả bảng 3.10 và biểu đồ 3.5, có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về trung bình độ NTTC giữa các nhóm tác dụng dược lý theo kiểu gen (p=0,018). Với nhóm tác dụng (giảm+kém), độ NTTC cao hơn so với nhóm tác dụng bình thường (p=0,027). Tuy nhiên, khi so sánh theo cặp, trung bình độ NTTC giữa nhóm tác dụng giảm và kém không có khác biệt mang ý nghĩa thống kê (p=0,074). Vì vậy, chúng tôi gộp nhóm tác dụng (giảm và kém) thành 1 nhóm và nhóm tác dụng bình thường là 1

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

54

nhóm khi phân tích mối liên quan giữa đô NTTC và các yếu tố khác, để đảm bảo các

cá thể trong nhóm đều có tác dụng dược lý chuyển hóa thuốc là như nhau.

➢ Mối liên quan giữa độ NTTC với hút thuốc lá

Theo kết quả của chúng tôi, hút thuốc lá không có ảnh hưởng rõ rệt lên độ NTTC trên cả hai nhóm tác dụng dược lý bình thường và tác dụng dược lý (giảm+kém)

(p>0,05). Nghiên cứu PARADOX của Gurbel P.A và cộng sự (2013) trên hai nhóm

bệnh nhân ĐMV ổn định có hút thuốc và không hút thuốc, được dùng clopidogrel, cho thấy nhóm không hút thuốc có đáp ứng giảm với clopidogrel so với nhóm có hút thuốc

[47]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Ferreiro J và cộng sự (2014) lại thấy rằng ở những

bệnh nhân hút thuốc lá được điều trị bằng clopidogrel có xu hướng xảy ra nhồi máu cơ

tim và tử vong do bất kì nguyên nhân nào thấp hơn so với những bệnh nhân chỉ được điều trị bằng aspirin, trong khi xu hướng này không tìm thấy ở bệnh nhân không hút

thuốc [42]. Do đó, hiệu quả chống NTTC của clopidogrel trên bệnh nhân hút thuốc lá vẫn chưa được làm sáng tỏ và cần có những nghiên cứu tiếp theo để làm rõ cơ chế này.

➢ Mối liên quan giữa độ NTTC với THA

THA không chỉ làm hẹp lòng mạch, giảm tính đàn hồi mạch máu mà còn làm

áp lực dòng máu tăng cao kéo dài, gây thay đổi sinh lý bình thường của dòng máu và

cấu trúc thành mạch dẫn đến tiểu cầu tăng hoạt hóa, tăng NTTC [58]. Trong nghiên

cứu của Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007) cho thấy độ NTTC ở bệnh nhân THA

cao hơn có ý nghĩa thống kê so với độ NTTC ở bệnh nhân không THA (p<0,05) [18].

Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi, có thể do cỡ mẫu nhỏ nên mặc dù độ

NTTC ở bệnh nhân THA có xu hướng cao hơn so với bệnh nhân không THA nhưng

chưa có ý nghĩa thống kê trong cả hai nhóm bình thường và (giảm+kém).

➢ Mối liên quan giữa độ NTTC và RLCH lipid

Nghiên cứu của chúng tôi chưa thấy có mối liên quan về độ NTTC giữa bệnh nhân có và không có RLCH lipid ở các nhóm tác dụng dược lý bình thường và

(giảm+kém) với p>0,05. Tuy nhiên, nghiên cứu của Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007) cho thấy nhóm có RLCH lipid thì độ NTTC là 35,8±18,5% cao hơn so với nhóm không có RLCH lipid là 24,1±18,9%. Điều đó gợi ý rằng hiệu quả điều trị ở nhóm

không có RLCH lipid cao hơn nhóm có RLCH lipid [18]. Knobler H. và cộng sự cho rằng sự tăng nồng độ LDL-cholesterol và Triglycerid có liên quan đến tăng hoạt hóa

tiểu cầu. Khi nghiên cứu tình trạng hoạt hóa tiểu cầu trước và sau điều trị RLCH lipid

máu thấy rằng giảm nồng độ cholesterol song song với giảm hoạt hóa tiểu cầu [57].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

55

➢ Mối liên quan giữa độ NTTC với ĐTĐ

Theo nhiều tác giả trên thế giới, ĐTĐ làm thúc đẩy tình trạng XVĐM. ĐTĐ là sự kết hợp giữa tăng đường máu và insulin máu có thể dẫn tới bất thường các cơ cơ chế điều hòa chức năng tiểu cầu như: tương tác giữa tiểu cầu và thụ thể, tiểu cầu gắn thành mạch, giữa tiểu cầu và tiểu cầu, dẫn đến làm tăng hoạt tính và NTTC [60]. Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi chưa thấy có sự khác biệt về độ NTTC giữa bệnh nhân có và không có ĐTĐ ở cả hai nhóm tác dụng dược lý bình thường và (giảm+kém).

➢ Mối liên quan giữa độ NTTC với béo phì

Kết quả của chúng tôi cho thấy, béo phì chưa có mối liên quan lên độ NTTC ở nhóm tác dụng dược lý bình thường và (giảm+kém). Haberka M. và cộng sự (2015) nghiên cứu mối liên quan giữa béo phì và phản ứng tiểu cầu trên bệnh nhân đau thắt ngực ổn định sau can thiệp mạch vành qua da cho thấy: sau can thiệp mạch vành qua da dùng liều tải 600mg clopidogrel, phản ứng tiểu cầu ban đầu ở nhóm cân nặng bình thường thấp hơn nhóm béo phì. Tuy nhiên, sau 30 ngày điều trị với liều duy trì clopidogrel (75mg/ngày) và aspirin (100mg/ngày) thì có sự tương đồng cao về phản ứng tiểu cầu giữa nhóm béo phì và nhóm cân nặng bình thường. Qua đó, thấy được hiệu quả điều trị chống NTTC của aspirin và clopidogrel liều duy trì lên bệnh nhân béo phì [48].

➢ Mối liên quan giữa độ NTTC với số lượng các yếu tố nguy cơ

Trong nghiên cứu của chúng tôi, độ NTTC có xu hướng tăng theo số lượng các yếu tố nguy cơ nhưng chưa có ý nghĩa thống kê ở hai nhóm tác dụng bình thường và tác dụng (giảm+kém) (bảng 3.12). Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007) cho thấy độ NTTC nhóm 2 hoặc 3 yếu tố nguy cơ cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm có 0 hoặc 1 yếu tố nguy cơ. Số lượng yếu tố nguy cơ trên một bệnh nhân càng nhiều thì tình trạng tăng độ NTTC càng lớn và hiệu quả điều trị đạt được không bằng ở bệnh nhân có ít hoặc không có yếu tố nguy cơ [18].

Chúng tôi cũng tiến hành tìm hiểu mối liên quan giữa độ NTTC với một số chỉ số cận lâm sàng. Tuy nhiên, ở kết quả bảng 3.13 cho thấy, mối liên quan còn yếu nên trong phần này chúng tôi chưa đủ cơ sở để bàn luận thêm.

Mặc dù nghiên cứu này chúng tôi chưa thấy có sự khác biệt rõ rệt về độ NTTC ở các bệnh nhân có yếu tố nguy cơ nhưng sự tác động của kiểu gen, đặc biệt là CYP2C19*2 lên độ NTTC là rõ rệt và có ý nghĩa thống kê. Vậy nên, chúng tôi khuyến cáo nên đưa xét nghiệm gen CYP2C19*2 đối với bệnh nhân ĐTNKÔĐ điều trị bằng liệu pháp kháng tiểu cầu kép để hỗ trợ tiên lượng bệnh tật.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

56

KẾT LUẬN

Nghiên cứu thực hiện trên 54 bệnh nhân ĐTNKÔĐ được điều trị kháng tiểu cầu kép (aspirin và clopidogrel) tại Viện Tim mạch Việt Nam từ tháng 1/2017 đến

tháng 1/2018, chúng tôi rút ra một số kết luận theo 2 mục tiêu đã đề ra như sau:

1. Tần số phân bố kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định

➢ Alen CYP2C19*2 (c.681G>A):

- Tần số kiểu gen: GG (51,9%), GA (37%), AA (11,1%) - Tần số alen: G/A: 0,7/0,3 ➢ Alen CYP2C19*3 (c.636G>A):

- Tần số kiểu gen: GG (88,9%), GA (11,1%), AA (0%) - Tần số alen: G/A: 0,94/0,06

➢ Tần số kiểu gen: *1*1 (44,4%), *1*2 (33,3%), *1*3 (7,4%), *2*2 (11,1%),

*2*3 (3,7%).

➢ Tỉ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý do kiểu gen quy định:

Tác dụng bình thường: 44,4%

Tác dụng giảm: 40,7%

- - - Tác dụng kém: 14,9%

2. Mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định

➢ Trong 2 alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 thì alen CYP2C19*2 có mối liên

quan chặt chẽ nhất với độ NTTC. Ở những bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 thì độ

NTTC cao hơn hẳn so với những bệnh nhân không mang alen này (p<0,05). Tuy

nhiên, với alen CYP2C19*3 thì chúng tôi chưa thấy có mối liên quan với độ NTTC.

➢

Bên cạnh đó, chúng tôi cũng chưa thấy có mối liên quan giữa độ NTTC với các yếu tố nguy cơ (hút thuốc lá, THA, ĐTĐ, RLCH lipid, béo phì), số lượng yếu tố nguy cơ và các chỉ số cận lâm sàng như chỉ số huyết học (WBC, RBC, PLT, APTT,

Fbrinogen…), chỉ số sinh hóa (Cholesterol, Triglycerid, HDL-Cholesterol, LDL-

Cholesterol).

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

57

KIẾN NGHỊ

Với mục đích giúp các bác sĩ lâm sàng có thể đưa ra phác đồ điều trị phù hợp cũng như tiết kiệm chi phí và giảm biến cố tim mạch cho bệnh nhân ĐTNKÔĐ, sau

khi có kết quả nghiên cứu, chúng tôi đưa ra một số đề xuất như sau:

➢ Alen CYP2C19*2 có mối liên quan chặt chẽ với độ NTTC ở bệnh nhân

ĐTNKÔĐ. Do đó, chúng tôi kiến nghị cần có các nghiên cứu sâu hơn nhằm đánh giá

ảnh hưởng của kiểu gen CYP2C19*2 với các biến cố tim mạch, từ đó giúp định hướng điều trị cho bệnh nhân ĐTNKÔĐ trong thời gian tới.

➢ Khi có chỉ định xét nghiệm xác định kiểu gen của alen CYP2C19*2 nên sử dụng phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn (RFLP) vì phương pháp này giúp giảm

chi phí cho bệnh nhân đồng thời trả kết quả nhanh cho bác sĩ lâm sàng, giúp các bác sĩ có phác đồ điều trị phù hợp hơn cho người bệnh.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

58

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh (2014), Quy trình xét nghiệm đo độ ngưng

tập tiểu cầu.

2. Bệnh viện Trung ương quân đội 108 (2016), Kỹ thuật xét nghiệm. Các xét

nghiệm đánh giá chức năng cầm – đông máu.

3. Đào Thị Thanh Bình, Nguyễn Phú (2002), "Khảo sát mối tương quan giữa xơ

vữa động mạch cảnh và bệnh động mạch vành", Tạp Chí Thời Sự Tim Mạch Học Số 48 Tháng 22002, 9–12.

4. Bộ Y tế (2012), Quy trình kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh chuyên ngành Huyết

học – Truyền máu – miễn dịch – di truyền.

5. Bộ Y tế (2002), Niên giảm thống kê.

6. Nguyễn Thị Ngọc Dao (2011), Cytochrome - P450, Nhà xuất bản khoa học tự

nhiên và công nghệ.

7. Phạm Tử Dương (2002), Bệnh xơ vữa động mạch, chuyên ngành Tim-Thận -

Khớp, Hà Nội.

8. Nguyễn Thị Thu Hà (1999), Bệnh lý rối loạn cầm máu do tiểu cầu, Bài giảng

lớp tập huấn huyết học-truyền máu toàn quân.

9. Trần Thị Hải Hà (2004), Nghiên cứu độ ngưng tập tiểu cầu trên bệnh nhân nhồi

máu cơ tim cấp trước và sau điều trị, Luận văn Thạc sĩ Y Học, Đại học Y Hà

Nội.

10. Phạm Mạnh Hùng, Phan Tuấn Đạt (2016), "Cập nhật về thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu trong hội chứng động mạch vành cấp", Tạp Chí Tim Mạch Học Việt Nam

73.

11. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2009), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào,

Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.

12. Nguyễn Ngọc Minh, Nguyễn Đình Ái (1996), Nội mô và cầm máu, đôngmáu và

cầm máu: Kỹ thuật ứng dụng trong lâm sàng, NXB Y Học, Hà Nội.

13. Đinh Hữu Nghị (2005), Bước đầu tìm hiểu một số yếu tố nguy cơ tim mạch ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp tại Viện tim mạch Việt Nam từ 2002- 2004, Khóa luận tốt nghiệp bác sĩ đa khoa khóa 1999-2005, Đại học Y Hà Nội. 14. Lê Phúc Nguyên (2006), Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ hs-CRP trước và sau

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

can thiệp động mạch vành qua da ở bệnh viện trung ương Huế, Luận văn Thạc sĩ Y Học, Đại học Y khoa Huế.

15. Trương Thị Minh Nguyệt (2003), Nghiên cứu chức năng ngưng tập tiểu cầu có

chất kích tập ADP ở bệnh nhân thiếu máu cục bộ cơ tim, Luận văn Bác sĩ chuyên

khoa cấp II, Học viện Quân Y.

16. Nguyễn Thị Nữ (2005), Nghiên cứu ngưng tập tiểu cầu và một số yếu tố đông máu ở bệnh nhân tăng huyết áp có rối loạn lipid máu, Luận văn Tiến sỹ Y học,

Đại học Y Hà Nội.

17. Nguyễn Thị Nữ, Cung Thị Tý và Đỗ Trung Phấn (1997), Chỉ số ngưng tập tiểu

cầu ở người trưởng thành Việt nam bình thường, 66-68.

18. Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007), Nghiên cứu độ ngưng tập tiểu cầu ở bệnh

nhân nhồi máu cơ tim cấp trước và sau nong động mạch vành, Luận văn Thạc

sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.

19. Trịnh Xuân Thắng (2013), Nghiên cứu các yếu tố nguy cơ tim mạch ở người ≧

25 tuổi tại hai quận huyện hà nội, Luận văn thạc sĩ y học, ĐH Y Hà Nội.

20. Lê Thị Bích Thuận (2004), Nghiên cứu biến đổi Protein C phản ứng (CRP)

trong bệnh lý mạch vành, Luận án Tiến sỹ Y Khoa, Đại học Huế.

21. Nguyễn Hải Thủy (2004), Chẩn đoán và điều trị rối loạn lipid máu, Bài giảng

sau đại học, Trường Đại học Y Huế, 333-334.

22. Quách Hữu Trung (2014), Nghiên cứu tình trạng kháng aspirin ở bệnh nhân có

yếu tố nguy cơ tim mạch cao, Luận án tiến sĩ y học, Viện nghiên cứu Khoa học

Y Dược Lâm sàng 108, Hà Nội.

23. Đỗ Thị Tuyến (2015), Nghiên cứu sự thay đổi các chỉ số huyết học ở bệnh nhân

nhồi máu cơ tim cấp được điều trị tại bệnh viện Đại học Y Hà Nội, Khóa luận

tốt nghiệp cử nhân y khoa khóa 2011-2015, Đại học Y Hà Nội.

24. Tạ Thành Văn (2010), PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất bản

Y học, Hà Nội.

25. Nguyễn Lân Việt (2004), Áp dụng một số giải pháp can thiệp thích hợp để

phòng, chữa bệnh tăng huyết áp tại cộng đồng, Đề tài NCKH cấp Bộ, tr 1-31. 26. Nguyễn Lân Việt (2015), Thực hành bệnh tim mạch, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

27. Phạm Nguyễn Vinh (2015), "Hội chứng vành cấp không ST chênh lên: Cơn đau thắt ngực không ổn định, và nhồi máu cơ tim không ST chênh lên", Bệnh Học Tim Mạch, chương 28:85-96.

28. Phạm Quang Vinh (2013), Huyết học- truyền máu cơ bản, NXB Y học, Hà Nội,

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

105-109.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

29. Anderson J.L., Adams C.D., Antman E.M., et al (2013), "2012 ACCF/AHA focused

update incorporated into the ACC/AHA 2007 guidelines for the management of patients with unstable angina/non-ST-elevation myocardial infarction: a report of the

American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task

Force on Practice Guidelines", Circulation, 127(23), e663–e828.

30. Angiolillo D.J, Alfonso F. (2007), "Platelet function testing and cardiovascular

out comes: steps forward in identifying the best predictive measure", Thromb Haemost, 98, 707–709.

31. Angiolillo D.J, Fernandez-Ortiz A, Bernardo E et al (2005), "Identification of low responders to a 300-mg clopidogrel loading dose in patients undergoing

coronary stenting", Thromb Res, 115(1–2), 101–108.

32. Arima Y., Hokimoto S., Akasaka T. el al (2015), "Comparison of the effect of

CYP2C19 polymorphism on clinical outcome between acute coronary

syndrome and stable angina", J Cardiol, 65(6), 494-500.

33. Bhatt D.L, Paré G. , Eikelboom J.W. (2012), "The relationship between

CYP2C19 polymorphisms and ischaemic and bleeding outcomes in stable

outpatients: the CHARISMA genetics study", Eur Heart J, 33,2143–2150.

34. Braunwald E., Antman E.M., Beasley J.W., Califf R.M., Cheitlin M.D.,

Hochman và J.S, et al (2001), "ACC/AHA guidelines for the management of

patients with unstable angina and non-ST-segment elevation myocardial

infarction. A report of the American College of Cardiology/American Heart

Association Task Force on Practice Guidelines (Committee on the Management

of Patients with Unstable Angina)", J Am Coll Cardiol, 36, 970-1062.

35. Breddin H.K. et al (1999), "Spontaneous platelet aggregation as a predictive risk

factor for vascular occlusions in healthy volunteers? Results of the HAPARG

in healthy volunteers",

Study. Haemostatic parameters as risk factors Atherosclerosis, 144(1), 211-9.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

36. Bride W, Lange R.A & Hillis L.D (1998), ”Retenosis after successful coronary angioplasty. Pathophysiology and prevention", N Engl J Med, 318, 1734–7. 37. Chen Y., Huang X., Tang Y. et al (2015), "Both PON1 Q192R and CYP2C19*2 influence platelet response to clopidogrel and ischemic events in Chinese patients undergoing percutaneous coronary intervention", Int J Clin Exp Med, 8(6), 9266–9274.

38. Chonlaphat S., Ramaimon T., Montri C. et al (2013), "CYP2C19 polymorphisms

in the Thai population and the clinical response to clopidogrel in patients with

atherothrombotic-risk factors", Pharmacogenomics Pers Med, 6, 85–91.

39. Corti R., Fuster V., Badimon J. (2001), "New understanding of atherosclerosis (clinically and experimentally) with evolving MRI technology in vivo", Ann N

Y Acad Sci, 947, 181–195.

40. Davies M.J, Richardson P.D, Woolf N et al (1993), "Risk of thrombosis in human atherosclerotic plaques: role of extracellular lipid, macrophage, and

smooth muscle cell content", Br Heart J, 69(5), 377–381.

41. Ewa L., Małgorzata O., et al (2015), "The influence of genetic polymorphisms of

CYP2C19 and ABCB1 on ADP-induced platelet aggregation in clopidogrel- treated patients: comparison between the index hospitalization for myocardial

infarction and the 3-month follow-up visit", Folia Medica Copernic, 3(2), 62–71.

42. Ferreiro J, Bhatt D.L, Ueno M et al (2014), "Impact of smoking on long-term

outcomes in patients with atherosclerotic vascular disease treated with aspirin

or clopidogrel: insights from the CAPRIE trial (Clopidogrel Versus Aspirin in

Patients at Risk of Ischemic Events)", J Am Coll Cardiol, 63(8), 769–777.

43. Fuster V., Badimon L., Badimon J. et al (1992), "The pathogenesis of coronary artery

disease and the acute coronary syndromes (2)", N Engl J Med, 326(5), 310–318.

44. Genetics Home Reference What are single nucleotide polymorphisms (SNPs)?.

.

45. Goldstein J.A, Ishizaki & Chiba K (1997), "Frequencies of the defective

CYP2C19 alleles responsible for the mephenytoin poor metabolizer phenotype

in various Oriental, Caucasian, Saudi Arabian and American black

populations", Pharmacogenetics, 7(1), 59–64.

46. Gupta A.K (1996), Ischemia and coronary heart disease, community outreach

health information system, Boston university Medical Center.

47. Gurbel P.A, Bliden K.P, Logan D.K et al (2013), "The influence of smoking

status on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of clopidogrel and

prasugrel: the PARADOX study", J Am Coll Cardiol, 62(6), 505–512.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

48. Haberka M. el al (2015), "Obesity and antiplatelet effects of acetylsalicylic acid and clopidogrel in patients with stable angina pectoris after percutaneous coronary intervention", Pol Arch Med Wewn, 125(9), 620-30.

49. Holmes M.V., Perel P., Shah T. et al (2011), "CYP2C19 genotype, clopidogrel

metabolism, platelet function, and cardiovascular events: a systematic review

and meta-analysis", JAMA, 306(24), 2704–2714.

50. Investigators T.C. in U.A. to P. R. E. T. (2001), "Effects of Clopidogrel in Addition to Aspirin in Patients with Acute Coronary Syndromes without ST-

Segment Elevation". N Engl J Med, 345(7), 494–502.

51. Jeremy W.D et al (2011), "From genes to genomes: concepts and applications of DNA technology", Restrict Endonucleases, (3th ed) UK: University of Surrey, tr 36–74.

52. Jian L.X, Chen Z.M, Chen Y.P (2005), "Addition of clopidogrel to aspirin in

45,852 patients with acute myocardial infarction: randomised placebo-

controlled trial". Lancet Lond Engl, 366(9497), 1607–1621.

53. Jneid H, Anderson J.L, et al (2012), "ACCF/AHA focused update of the guideline

for the management of patients with unstable angina/Non-ST-elevation myocardial

infarction (updating the 2007 guideline and replacing the 2011 focused update): a

report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart

Association Task Force on practice guidelines", Circulation, 126(7), 875–910.

54. John W. E. et al (2012), "Antiplatelet Drugs Antithrombotic Therapy and

Prevention of Thrombosis, 9th ed: American College of Chest Physicians

Evidence-Based Clinical Practice Guidelines", Chest, 14, e89S–e119.

55. Kim K.A, Song W.H, Kim K.R and Park J.Y (2010), "Assessment of CYP2C19

genetic polymorphisms in a Korean population using a simultaneous multiplex

pyrosequencing method to simultaneously detect the CYP2C19*2,

CYP2C19*3, and CYP2C19*17 alleles", J Clin Pharm Ther, 35(6), 697-703.

56. Kim Michael C, Kini Annapoorna S, Fuster Valentin (2002), "Definition of

Acute Coronary Syndromes", Heart 11th Ed, chap 48, 1215-1222.

57. Knobles H et al (1998), "Shear induced platelet adhesion and aggregation

subendothelium are increased in diabetic patients", J Endocrinlogy, 90, 181–90. 58. Lip G.Y, Edmunds E. (2001), "A cross sectional diual and follow -up study of

platelet activation and endothelial dysfuction in malignant phase hypertension",

Am J Intern Med, 249(3), 205–214.

59. Marchini J.F.M. et al (2017), "Decreased platelet responsiveness to clopidogrel correlates with CYP2C19 and PON1 polymorphisms in atherosclerotic patients", Braz J Med Biol Res, 50(1), e5660.

60. Marcus E. C. (2001), "Diabetes mellitus a hypercoagulable state", J Diabetes Its

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Complicat, 44–54.

61. Matetzky S., Shenkman B., Guetta V. (2004), "Clopidogrel resistance is

associated with increased risk of recurrent atherothrombotic events in patients

with acute myocardial infarction", Circulation, 109, 3171–3175.

62. Morais S.M, Wilkinson G.R, Blaisdell J et al (1994), "The major genetic defect responsible for the polymorphism of S-mephenytoin metabolism in

humans", J Biol Chem, 269(22), 15419–15422.

63. Morton J.K, Arnold H.S et al (2013), "Antithrombotic and Antiplatelet Therapy for Percutaneous Coronary Interventions", Card Catheter Handb, 130–146.

64. Nakamura K., Goto F. and Ray W.A. (1985), "Interethnic differences in

genetic polymorphism of debrisoquin and mephenytoin hydroxylation between

Japanese and Caucasian populations", Clin Pharmacol Ther, 38(4), 402–408.

65. Oestreich J.H, Best L.G, and Dobesh P.P (2014), "Prevalence of CYP2C19

variant alleles and pharmacodynamic variability of aspirin and clopidogrel in

Native Americans", Am Heart J.

66. Price M.J, Murray S.S, Angiolillo D.J et al (2012), "Influence of genetic

polymorphisms on the effect of high- and standard-dose clopidogrel after

percutaneous coronary intervention: the GIFT (Genotype Information and

Functional Testing) study", J Am Coll Cardiol, 59(22), 1928–1937.

67. Scott M. Grundy et al (2002), "Third Report of the National Cholesterol

Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and

Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) final

report", Circulation, 106(25), 3143–421.

68. Scott S.A, Sangkuhl K, Stein C.M et al (2013), "Clinical Pharmacogenetics

Implementation Consortium Guidelines for CYP2C19 Genotype and

Clopidogrel Therapy: 2013 Update", Clin Pharmacol Ther, 94(3), 317–323. 69. Sharathkumar Anjali A, Shapiro Amy (2008), Platelet function disorders,

World Federation of Hemophilia, Montreal.

70. Shuldiner A.R, O’Connell J.R, & Bliden K.P (2009), "Association of

cytochrome P450 2C19 genotype with the antiplatelet effect and clinical

efficacy of clopidogrel therapy", JAMA, 302(8), 849-57.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

71. Sibbing D, Stegherr J, Latz W et al (2009), "Cytochrome P450 2C19 loss-of- function polymorphism and stent thrombosis following percutaneous coronary intervention", Eur Heart J, 30(8), 916–922.

72. Steinlhubl S.R, Darrah S., & Brennan D (2003), "Optimal duration of

pretreatment with clopidogrel prior to PCI: Data from the CREDO trial",

Circulation, 108(Suppl I:I1742).

73. Stuart A.S., Katrin S., Alan R.S. et al (2012), "PharmGKB summary: very important pharmacogene information for cytochrome P450, family 2, subfamily

C, polypeptide 19", Pharmacogenet Genomics, 22(2), 159–165.

74. Tassaneeyakul W., Mahatthanatrakul W., Niwatananun K. and Na-Bangchang K. (2006), "CYP2C19 genetic polymorphism in Thai, Burmese and Karen

populations", Drug Metab Pharmacokinet, 21, 286–290.

75. Tom Brody (2016), Chapter 19 – Biomarkers. Clinical Trials.

76. Tomoyuki N., Masatoshi M., Kaname N. et al (2013), "Relationship Between CYP2C19 Loss-of-Function Polymorphism and Platelet Reactivities With

Clopidogrel Treatment in Japanese Patients Undergoing Coronary Stent

Implantation", Circ J, 77, 1436 – 1444.

77. Ugorcakova J., Hlavat T., Novotna T. et al (2012), "Detection of point

mutations in KRAS oncogene by real-time PCR-based genotyping assay in GIT

diseases", Bratisl Lek Listy, 113(2), 73–79.

78. Vignal A., Milan D., SanCristobal M. et al (2002), "A review on SNP and other types of

molecular markers and their use in animal genetics", Genet Sel Evol, 34(3), 275–305.

79. Wang T.H, Bhatt D.L & Topo E.J (2006), "Aspirin and clopidogrel resistance:

an emerging clinical entity", Eur Heart J, 27(6), 647–654.

80. Wrighton S.A et al (1992), "The Human Hepatic Cytochromes P450 Involved

in Drug Metabolism", Crit Rev Toxicol, 22 (1), 1-21.

81. Yang J, Zhao H.D, Tan J, Ding Y.L, Gu Z.Q and Zou J.J (2013), "CYP2C19

polymorphism and antiplatelet effects of clopidogrel in Chinese stroke patients", Pharm, 68, 183–186.

82. Yang Y.S, Wong L.P, Lee T.C., Mustafa A.M., Mohamed Z. and Lang C.C (2004), "Genetic polymorphism of cytochrome P450 2C19 in healthy

Malaysian subjects", Br J Clin Pharmacol.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

83. Zabalza M., Subirana and Sala J. (2012), "Meta-analyses of the association between cytochrome CYP2C19 loss- and gain-of-function polymorphisms and cardiovascular outcomes in patients with coronary artery disease treated with clopidogrel", Heart, 98, 100–108.

PHỤ LỤC

MẪU BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU

Mã số BN:

I. Hành chính:

1. Họ và tên: ..................................... Giới: .........................................................

2. Tuổi: ............................................. Sinh ngày: ................................................

3. Địa chỉ: ...........................................................................................................

4. Bệnh viện điều trị ......................... .................................................................

5. Chấn đoán: .....................................................................................................

Đau thắt ngực không ổn định: 

Nhồi máu cơ tim không ST chênh lên: 

Nhồi máu cơ tim có ST chênh lên: 

II. Lý do vào viện: ............................................................................................

III. Tiền sử và các yếu tố nguy cơ bệnh động mạch vành

- Béo phì 

- Tăng huyết áp 

- Rối loạn chuyển hóa Lipid 

- Hút thuốc lá 

- Đái tháo đường 

- Tiền sử đau thắt ngực 

- Tiền sử nhồi máu cơ tim 

- Tiền sử bệnh mạch vành 

IV. Tiền sử

- Tiền sử gia đình: ..............................................................................................

............................................................................................................................

- Tiền sử bản thân: .............................................................................................

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

............................................................................................................................

V. Lâm sàng:

- Cân nặng: .........................................................................................................

- Chiều cao: ........................................................................................................

- Huyết áp:..........................................................................................................

- Hô hấp: ............................................................................................................

- Tim mạch: ........................................................................................................

VI/ Cận lâm sàng:

1. Công thức máu

- Số lượng Hồng cầu (T/l): ................................................................................

- Số lượng Bạch cầu (G/l): .................................................................................

- Số lượng Tiểu cầu (G/l): ..................................................................................

- Thể tích hồng cầu trung bình –MCV(fl): ........................................................

- Thể tích tiểu cầu trung bình – MPV(fl): ..........................................................

2. Sinh hóa máu

- Cholesterol (mmol/l): ......................................................................................

- Triglycerid (mmol/l): .......................................................................................

- HDL (mmol/l): .................................................................................................

- LDL (mmol/l): .................................................................................................

- CRP (mg/dL): ..................................................................................................

- Fibrinogen (g/l): ..............................................................................................

- Độ NTTC (%): ................................................................................................

VII/ Điều trị:

- Các thuốc:

+ Clopidogrel: liều nạp ......................................................................................

+ Clopidogrel: liều duy trì .................................................................................

+ Aspirin: liều nạp .............................................................................................

+ Aspirin: liều duy trì.........................................................................................

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

- Thuốc khác: .....................................................................................................

VIII/ Kết quả phân tích các alen và kiểu gen:

- CYP2C19*2: ....................................................................................................

- CYP2C19*3: ....................................................................................................

- CYP2C19*17: ..................................................................................................

- Kiểu gen BN: ...................................................................................................

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

- Hoạt tính chuyển hóa thuốc: ............................................................................

Quy trình tách DNA tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit:

1. Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất về nhiệt độ phòng.

2. Lắc đều ống máu. Chuyển 250µl mẫu vào ống ly tâm vô trùng

3. Thêm 25 µl OB Protease Solutionvà 250 µl BL Buffer. Vortex trong 10 giây

4. Ủ 650C trong 10 phút. Chú ý: Sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15 giây

5. Thêm 260 µl Ethanol 100%. Vortex trong 20 giây

6. Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 giây để đảm bảo mẫu không dính trên thành và

nắp ống

7. Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube2ml.

8. Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µl)

9. Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

10. Bỏ dịch lọc và Collection Tube

11. Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2ml mới

12. Thêm 500 µl HBC Buffer

13. Ly tâm 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

14. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tub

15. Thêm 700 µl DNA Wash Buffer

16. Ly tâm trong 1 phút ở 10.000g

17. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube

18. Lặp lại các bước 14 đến 16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash Buffer

19. Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 vòng/ phút trong 2 phút để làm khô cột

20. Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2ml mới

21. Thêm 100 µl Elution Buffer (đã làm ấm đến 650C). Ủ 650C trong 5 phút

22. Ly tâm tại 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

23. Thêm 50 µl Elution Buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

24. Ly tâm tại 14.000 vòng/ phút trong 1 phút

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

25. Thu và bảo quản DNA ở -200C

DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU

VIỆN TIM MẠCH VIỆT NAM

STT

Họ và tên

Mã bệnh án

Giới

Tuổi theo năm

Mã số nghiên cứu

160016952

73

Nữ

1

Nguyễn Thị N Nguyễn Văn Đ

160017230

16 18

62

Nam

2

Nguyễn Đăng B

160019101

19

55

Nam

3

Nguyễn Thị H

4

160018967

20

62

Nữ

5

Biện Thị T Nguyễn Văn H

161601088 162001150

24 25

67 60

Nữ Nam

6

Bùi Huy C

160217843

27

66

Nam

7

Nguyễn Thị Đ

160217509

32

65

Nữ

8

9

Trần Mạnh S Tạ Văn T

161600759 160020215

34 37

56 56

Nam Nam

160216908

38

71

Nam

160217542

41

76

Nam

160021271

42

68

Nam

10 11 Hoàng Ngọc C 12 Hà Văn E 13 Đàm Hữu T

Trần Trọng T

160217449

43

83

Nam

160215698

44

65

Nữ

160216768

45

43

Nam

160021606

49

49

Nữ

160216824

50

66

Nam

14 15 Đỗ Bích P 16 Nguyễn Văn G 17 Vũ Thị S 18 Nguyễn Văn C

Bùi Ngọc S

160021816

52

69

Nam

160022054

57

80

Nam

19 20 Nguyễn Văn O Lê Văn H

161601279

58

66

Nam

21

160217921 161601320

59 66

69 47

Nam Nam

160023567

68

62

Nam

161601229

80

72

Nam

Trần Ngọc S

160029021 160028368

81 90

77 70

Nam Nam

160219292

91

51

Nữ

22 Bùi Hải H 23 Nguyễn Văn Đ 24 Nguyễn Văn T 25 Nguyễn Văn Q 26 27 Vũ Văn T 28 Hoàng Thị N Phạm Văn H

161601534

93

81

Nam

29

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Lương Văn T

98

160224873

76

Nam

100

160224660

76

Nam

30 31 Hoàng Minh T

Sâm Ngọc Đ

101

160224702

54

Nam

102

160224107

69

Nam

103

161601718

76

Nam

106

160224016

45

Nam

110

161601751

60

Nam

114

160031275

55

Nam

32 33 Nguyễn Văn S 34 Ngô Doãn C 35 Nguyễn Văn M 36 Ngô Quang Đ 37 Vũ Đức T

Phạm Xuân Đ

115

160223353

59

Nam

116

160226546

66

Nam

38 39 Ngô Đức Q Bùi Đức N

119

160228824

60

Nam

120

160229894

58

Nam

40 41 Hà Thế H

Trịnh Văn M

124

160043842

61

Nam

42

Phan Văn T

125

161602847

74

Nam

127

160044525

59

Nữ

43 44 Nguyễn Thị T

Lê Quang H

133

160235359

43

Nam

45

46 Đinh Văn T

139

170207907

75

Nam

47 Nguyễn Thị M

145

171600716

67

Nữ

48

Lưu Văn V

148

170013272

67

Nam

49 Dương Đình M

156

170217054

53

Nam

50 Nguyễn Văn A

157

170024682

42

Nam

51 Vũ Duy K

158

170024829

56

Nam

52 Hà Đăng Đ

160

170024952

77

Nam

53

Trần Hồng N

163

170026117

55

Nam

54 Nguyễn Ngọc T

164

170026251

64

Nam

XÁC NHẬN CỦA VIỆN

HỌC VIÊN

TIM MẠCH VIỆT NAM

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark