Khóa luận tốt nghiệp đại học: Khảo sát thành phần hóa học của loài địa y Parmotrema Sancti Angelii

Xác nhận của hội đồng phản biện:

......................................................................................................................................

KÝ TÊN VÀ DUYỆT

(Ký và ghi rõ họ tên)

iii

LỜI CẢM ƠN

Trên thực tế, để đạt được thành công thì sự cố gắng, nỗ lực của bản thân vẫn chưa

đủ mà còn có sự động viên, giúp đỡ của mọi người xung quanh, dù ít hay nhiều thì nó

vẫn tiếp thêm sức mạnh cho bản thân để hoàn thành mục tiêu tốt hơn. Để hoàn thành tốt

bài báo cáo khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý

Thầy Cô, gia đình và bạn bè.

Với lòng cảm ơn sâu sắc, em xin gửi đến Các thầy cô Khoa Hóa Học Trường

ĐHSP TPHCM đã dành hết tri thức và tâm huyết của mình truyền dạy cho chúng em

những kiến thức quý báu là hành trang giúp em bước tiếp trên con đường trồng người.

Đặc biệt em xin cảm ơn Thầy Dương Thúc Huy, người đã tận tình hướng dẫn, động viên

em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Nếu không có được sự giúp đỡ của Thầy thì bài

báo cáo khóa luận này khó có thể hoàn thiện được.

Ngoài ra, em cũng xin cảm ơn đến các anh chị khóa trên và các bạn sinh viên

trong bộ môn Hóa Hữu Cơ khoa Hóa học đã giúp đỡ, góp ý và động viên em rất nhiều

trong quá trình em thực hiện đề tài.

Cuối cùng, em xin đặc biệt cảm ơn đến gia đình và người thân, là chỗ dựa vững

chắc về vật chất lẫn tinh thần đã hỗ trợ em rất nhiều trong suốt chặng đường học tập của

mình giúp em có thể tập trung học tập tại trường cũng như hoàn thành bài báo cáo khóa

luận của mình.

Do thời gian thực hiện khóa luận khá ngắn nên không thể tránh khỏi sai sót, em

kính mong những góp ý cũng như kinh nghiệm quý báu của quý thầy cô để giúp bài báo

cáo khóa luận của em được hoàn thiện hơn.

Cuối cùng em xin chúc toàn thể quý Thầy Cô và các bạn dồi dào sức khỏe và

thành công!

Tp Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 04 năm 2018

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN..................................................................................................... iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU ................................................... vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................. vii

DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... vii

DANH MỤC PHỤ LỤC ................................................................................... vii

LỜI MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 2

1.1 Định nghĩa và phân loại địa y .................................................................. 2

1.2 Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y ........................... 2

1.3 Nghiên cứu hóa học về các hợp chất trong địa y ..................................... 3

1.4 Nghiên cứu hóa học của một số loài địa y thuộc chi Parmotrema .......... 3

Ứng dụng trong dược học và y học ................................................... 9

Ứng dụng trong nông nghiệp .......................................................... 12

Ứng dụng trong mĩ phẩm và công nghiệp nước hoa ...................... 13

1.5 Vai trò của địa y ....................................................................................... 9

Chương 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................ 14

2.1 Máy móc, thiết bị, hóa chất ................................................................... 14

2.2 Thu hái và xử lý mẫu nguyên liệu, ly trích và cô lập các hợp chất ....... 14

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 17

3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất A18 ......................................... 17

3.2 Biện luận cấu trúc phổ ........................................................................... 17

Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................... 22

4.1 Kết luận .................................................................................................. 22

4.2 Đề xuất ................................................................................................... 22

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

Ac Acetone

AcOH Acetic acid

C Chloroform

d Mũi đôi (Doublet)

EA Ethyl acetate

H n-Hexane

HMBC Tương quan 1H-13C qua 2, 3 nối (Heteronuclear Multiple Bond

Coherence)

HSQC Tương quan 1H-13C qua 1 nối (Heteronuclear Single Quantum

Correlation)

J Coupling constant (Hằng số tương tác spin-spin)

MeOH Methanol

MS Phổ khối lượng (Mass Spectrometry)

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy)

N.D Không xác định (Not Determined)

s Mũi đơn (Singlet)

SKC Sắc ký cột

δ Chemical shift (Độ chuyển dịch hóa học)

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Ba dạng chính của địa y

Hình 1.2. Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y

Hình 1.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema

Hình 2.1. Loài địa y Parmotrema tsavoense

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình ly trích và cô lập các hợp chất trên loài Parmotrema

tsavoense

Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC của hợp chất A18

Hình 4.1. Cấu trúc hợp chất đã cô lập

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y

Bảng 1.2. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất

địa y

Bảng 1.3. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y

Bảng 1.4. Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y

Bảng 1.5. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao

Bảng 3.1. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất A18 và furfuric acid

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất A18

Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất A18

Phụ lục 3. Phổ HSQC của hợp chất A18

Phụ lục 4. Phổ HMBC của hợp chất A18

Phụ lục 5. Phổ MS của hợp chất A18

vii

LỜI MỞ ĐẦU

Vào những năm giữa thế kỉ 19, các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu các cấu

trúc hóa học của hợp chất có trong địa y và thử nghiệm hoạt tính của chúng. Trong quá

trình thử nghiệm ấy, các nhà nghiên cứu nhận thấy hoạt tính của các hợp chất có thể ức

chế nhiều loại vi khuẩn, virus. Vì vậy, các loại thuốc được điều chế và tổng hợp từ các

hợp chất thiên nhiên của các loài địa y dần được phát triển. Ngay từ thời trung đại, nhiều

người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc chữa bệnh. Trong những năm gần

đây, những nghiên cứu hóa học và sinh học về địa y trên thế giới trở nên phổ biến. Ngoài

công dụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, phẩm nhuộm,

nước hoa (Muller, 2001)[1]. Theo các tác giả Boustie (2005)[2], Huneck (1999)[3], Muller

(2001)[1] từ xưa cho đến nay có khoảng gần 1.000 hợp chất địa y đã được cô lập và thử

nghiệm các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung

thư, kháng viêm, kháng enzyme…

Xuất phát từ những ứng dụng y học của các nhà nghiên cứu và kế thừa những

nghiên cứu đã có về chi Parmotrema trong nước cũng như nghiên cứu hóa học trên loài

địa y Parmotrema tsavoense của (Duong TH, 2015)[4], (Huynh BLC, 2014)[5] tôi tiếp

tục nghiên cứu trên loài địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow) Krog &

Swincow nhằm cô lập các hợp chất phenolic có nhiều hoạt tính sinh học.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1 Định nghĩa và phân loại địa y

Địa y là một dạng thực vật bậc thấp, là kết quả cộng sinh giữa nấm (mycobiont)

và một thành phần quang hợp (photobiont), thường là tảo (algae). Địa y sinh sản theo

phương thức sinh sản vô tính.

Hiện nay có khoảng 17.000 loài địa y đã được tìm thấy. Thông thường địa y được

chia thành 3 dạng chính:

 Dạng khảm (crustose lichen): hình vảy, chặt và dán vào giá thể.

 Dạng phiến (foliose lichen): hình lá với nhiều thùy như lá cây.

 Dạng sợi (fructicose lichens): hình cành, sợi, như bụi cây.

Pleopsidium flavum Lobaria linita Usnea longissima

(Crustose lichen) (Foliose lichen) (Fructicose lichens)

Hình 1.1. Ba dạng chính của địa y

Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn

thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và

các loài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước và khoáng chất. Kết quả từ sự cộng sinh này

giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở

vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá

cây, thân cây, kim loại, thủy tinh (Choi và cộng sự, 2008)[6].

1.2 Vai trò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y

 Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao.

 Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại bức xạ có hại.

 Các carboxylic acid từ địa y là tác chất tạo phức mạnh và giúp cho địa y lấy được

các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate) (Choi và cộng sự, 2008)[6].

 Giúp xua đuổi thú ăn thịt và côn trùng.

1.3 Nghiên cứu hóa học về các hợp chất trong địa y

Có nhiều cách phân loại các hợp chất trong địa y. Tuy nhiên, các hợp chất hóa học

trong địa y được chia làm ba nhóm chính dựa theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng

(Hình 1.2) (Huneck, 1997)[7].

 Nguồn gốc shikimic acid: terphenylquinone và dẫn xuất của acid tetronic.

 Nguồn gốc mevalonic acid: triterpenoid.

Tảo

Nấm

 Nguồn gốc acetate-malonate (polyketide): các acid dây dài và các acid phenol.

Hình 1.2. Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y

1.4 Nghiên cứu hóa học của một số loài địa y thuộc chi Parmotrema

 Parmotrema praesorediosum

(+)-Praesorediosic acid (1), (+)-protopraesorediosic acid (2), atranorin (15) và

chloroatranorin (16) được cô lập bởi David F. và cộng sự (1990)[8].

Lecanoric acid (18) và stictic acid (22) được cô lập bởi Ramesh P. và cộng sự

(1994)[9]

Huynh B. L. Chi và cộng sự đã cô lập được prasoether A (47), zeorin (55), và

1β,3β-diacetoxyhopan-29-oic acid (56) (2011)[10].

 Parmotrema sancti-angelii

Atranorin (15), lecanoric acid (18) và α-collatolic acid (30) được cô lập bởi Neeraj

V. và cộng sự (2011)[11].

Hà Xuân Phong (2012)[12] đã cô lập được 10 hợp chất từ loài địa y Parmotrema

sancti-angelii: 8-(2,4-dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-hydroxy-3-pentyl-1H-

isochromen-1-one (42), gyrophoric acid (17), lecanoric acid (18), orsellinic acid (5),

methyl orsellinate (6), methyl β-orsellinate (9), methyl haematomate (10) và ba hợp chất

bicyclo mới Sancti A-C (52-54).

Methyl -orsellinate (9), salazinic acid (20) và atranorin (15) được cô lập bởi

Nguyen Thi Thu Tram và cộng sự (2016)[13].

 Parmotrema conformatum

Protocetraric acid (25), malonprotocetraric acid (27) và (+)-(12R)-usnic acid (49)

được cô lập bởi Keogh M. F. (1977)[14].

 Parmotrema dilatum

Depside atranorin (15), các depsidone salazinic acid (20), norstictic acid (23),

hypostictic acid (24) và protocetraric acid (25) được cô lập từ Parmotrema dilatum bởi

Honda N. K. và cộng sự (2010)[15].

 Pamotrema lichexanthonicum

Depside atranorin (15), depsidone salazinic acid (20) và xanthone lichexanthone

(50) được cô lập từ cao chloroform của loài địa y Pamotrema lichexanthonicum bởi

Micheletti A. C. và cộng sự (2009)[16].

 Parmotrema mellissii

Methyl orsellinate (6), ethyl orsellinate (7), n-butyl orsellinate (8), methyl β-

orsellinate (9), methyl haematommate (10), ethyl chlorohaematommate (11), atranorin

(15), chloroatranorin (16), α-alectoronic acid (29), α-collatolic acid (30), 2′′′-O-methyl-

α-alectoronic acid (31), 2′′′-O-ethyl-α-alectoronic acid (32), dehydroalectoronic acid

(33), dehydrocollatolic acid (34), parmosidone A (35), parmosidone B (36),

parmosidone C (37), isocoumarin A (42), isocoumarin B (43), β-alectoronic acid (44),

2′′′-O-methyl-β-alectoronic acid (45), 2′′′-O-ethyl-β-alectoronic acid (46), (+)-(12R)-

usnic acid (49) và skyrin (51) được cô lập từ loài địa y Parmotrema mellissii thu hái ở

thành phố Đà Lạt bởi Lê Hoàng Duy (2012)[17].

 Parmotrema nilgherrense

α-Alectoronic acid (29), α-collatolic acid (30) và dehydrocollatolic acid (34) được

cô lập bởi Kharel M. K. và cộng sự (2000)[18].

Depside atranorin (15) được cô lập bởi Neeraj V. và cộng sự (2011)[11].

 Parmotrema planatilobatum

Năm 2011, Duong Thuc Huy[10] và cộng sự đã cô lập được 7 hợp chất gồm có

methyl β-orsellinate (9), methyl orsellinate (6), orsellinic acid (5), methyl

haematommate (10), atranorin (15), lecanoric acid (17), (+)-(12R)-usnic acid (49).

Năm 2012, orcinol (4), gyrophoric acid (17), protocetraric acid (25), 9’-O-

methylprotocetraric acid (26) và methyl 2-(3-(2,6-dihydroxy-4-methylbenzyl)-2,4-

dihydroxy-6-methylphenoxy)-3-formyl-4-hydroxy-6-methylbenzoate (48) được cô lập

bởi Duong Thuc Huy và cộng sự[19].

8-(2,4- dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-hydroxy-3-pentyl-1H-isochromen-

1-one (42), 8-(2,4- dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-methoxy-3-pentyl-1H-

isochromen-1-one (43), -collatolic acid (44) và lichesterinic acid (3) được cô lập bởi

Duong Thuc Huy và cộng sự (2014)[20].

 Parmotrema reticulatum

Atranorin (15), chloroatranorin (16), salazinic acid (20) và consalazinic acid (21)

được cô lập từ cao acetone bởi Fazio A. T. và cộng sự (2009)[21].

 Parmotrema saccatilobum

Atranorin (15) và chloroatranorin (16) được cô lập từ cao n-hexane của loài địa y

Parmotrema saccatilobum bởi Bugni T. S. và cộng sự (2009)[22].

 Parmotrema stuppeum

Orsellinic acid (5), methyl orsellinate (6), atranorin (15) và lecanoric acid (17)

được cô lập bởi Jayaprakasha G. K. (2000)[23].

 Parmotrema subisidiosum

Depside atranorin (15) và hai depsidone salazinic acid (20) và consalazinic acid

(21) được cô lập từ cao acetone bởi O’Donovan D. G. và cộng sự (1980)[24].

 Parmotrema tsavoense

Parmosidone A-E (35-39) được cô lập bởi Duong Thuc Huy và cộng sự (2015)[25].

Protocetraric acid (25), 9’-O-methylprotocetraric acid (26), virensic acid (28), (+)-

prasoediosic acid (1), atranorin (15), methyl haematommate (10), methyl -orsellinate

(9), methyl orsellinate (6) và zeorin (55) được cô lập bởi Bui. Thi Lan Anh và cộng sự

(2015)[26].

Methyl (E)-2,4-dihydroxy-6-methyl-3-(3-oxobut-1-en-1-yl)benzoate (12), atranol

(13) và 2-O-methylatranol (14) được cô lập bởi Duong Thuc Huy (2017)[27].

Parmosidone F (40) và atranol (13) được cô lập bởi Nguyen Thi Quynh Nhu và

cộng sự (2017)[28]. Parmosidone G (41) và methyl (E)-2,4-dihydroxy-6-methyl-3-(3-

oxobut-1-en-1-yl)benzoate (12) được cô lập bởi Nguyen Ngoc Man (2017)[29].

 Parmotrema tinctorum

Isolecanoric acid (19) được cô lập bởi Sakurai A. và cộng sự (1987)[30].

Ethyl orsellinate (7) được cô lập bởi Santos L. C. và cộng sự (2004)[31].

Atranorin (15) và lecanoric acid (18) được cô lập bởi Honda N. K. và cộng sự

(2013)[32].

Các acid béo

Hợp chất phenolic đơn vòng

Depside

Hình 2.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema

Depsidone

Hình 2.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp)

Diphenylethers

Hình 2.3. Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema (tiếp)

1.5 Vai trò của địa y

Ứng dụng trong dược học và y học

Các hợp chất từ địa y chủ yếu có hoạt tính kháng virus, kháng viêm, kháng khuẩn,

chống oxy hóa, gây độc tế bào,…

Một số hợp chất từ địa y là những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả.

Protolichesterinic acid được thử nghiệm in vitro kháng khuẩn Helicobacter pylori (acid

này là thành phần trong thuốc cổ truyền giảm đau dạ dày với tên Iceland moss) (Muller

2001)[17]. Một số lượng lớn các hợp chất địa y kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn hay

nấm như alectosarmentin, pannarin và chloropannarin, emodin và physcion, evernic

acid, leprapinic acid và dẫn xuất, các hợp chất phenol đơn vòng, puvinic acid và dẫn

xuất, usnic acid và dẫn xuất. Trong các hợp chất địa y, usnic acid và dẫn xuất của nó

cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cực kì mạnh trên khá nhiều dòng vi khuẩn (Bảng 1.1)

(Muller 2001)[1].

Các hợp chất anthraquinone có hoạt tính kháng virus. Hypericin có hoạt tính chống

lại sự sao chép ngược của virus HIV. Depside và depsidone có hoạt tính ức chế sự sao

chép của virus HIV dựa vào đặc điểm cấu trúc vòng 11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-11-

one của depsidone được đề nghị bởi Neamati. Depside có hoạt tính khá yếu trong khi

những β-depsidone có hoạt tính mạnh hơn. Acid béo loại γ-butyrolactone cũng có hoạt

tính kháng virus như protolichesterinic ức chế sự nhân bản DNA của virus HIV (Bảng

1.2) (Muller, 2001)[1].

Bên cạnh đó, hợp chất từ địa y có khả năng gây độc tế bào mạnh là usnic acid.

Cách đây 3 thập niên, usnic acid được tiến hành thử nghiệm lần đầu đối với hệ thống

thử nghiệm ung thư phổi Lewis bởi Kupchan và Kopperman (1975)[33]. Theo kết quả

nghiên cứu, usnic acid có tính thân dầu (lipophilicity) và tính này có ảnh hưởng quan

trọng đối với khả năng gây độc tế bào. Depside và depsidone cũng thể hiện độc tính tế

bào tương đối (Bảng 1.3) (Boustie, 2010) [34].

Ngoài ra, một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme (Bảng 1.4)

Bảng 1.1. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y

Hợp chất

Vi khuẩn

Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp.,

Clostridium perfringens, Bacillus subtilis,

Usnic acid và các dẫn xuất

Staphylococcus aureus, Staphylococcus

spp., Enterococcus spp., Mycobacterium

aurum

Protolichesterinic acid

Helicobacter pylori

Epidermophyton floccosum, Microsporum

canis, M. gypseum, Trichophyton rubrum,

Methyl orsellinate,

T. mentagrophytes, Verticillium achliae,

ethyl orsellinate,

Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,

methyl β-orsellinate,

methyl haematommate

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia

coli, Cvàida albicans

Staphylococcus aureus, Mycobacterium

Alectosarmentin

smegmatitis

1´-Chloropannarin, pannarin

Leishmania spp

Emodin, physcion

Bacillus brevis

Drechslera rostrata, Alternaria alternata

Pulvinic acid và dẫn xuất

Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí

Leprapinic acid và dẫn xuất

Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

Bảng 1.2. Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus của các hợp chất địa y

Hợp chất

Virus và enzyme của virus

Depsidone: virensic acid và dẫn xuất

Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn

vào nhiễm sắc thể virus HIV

tương tự

Butyrolactone acid: protolichesterinic

Nhân bản của HIV

acid

(+)-Usnic acid và 4 depside khác

Virus Epstein-Barr (EBV)

Emodin, dichloroemodin,

7-chloro-1-O-methylemodin,

HIV, cytomegalovirus và các virus khác

7-cloroemodin, 5,7- hypericin,

Bảng 1.3. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến của các hợp chất địa y

Hợp chất

Hoạt tính trên loại tế bào

(-)-Usnic acid

Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu

P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại tế

bào sừng hóa HaCat

Protolichesterinic acid

Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu

K-562 và khối u rắn Ehrlich

Pannarin, 1-chloropannarin,

Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào

sphaerophorin

Naphthazarin

Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa

Scabrosin ester và dẫn xuất, euplectin

Gây độc chống

lại

tế bào murine P815

mastocytoma và các dòng tế bào khác

Hydrocarpone, salazinic acid, stitic

Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan chuột

acid

Psoromic acid, chrysophanol, emodin

Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu

và dẫn xuất

Bảng 1.4. Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y

Hợp chất

Enzyme bị ức chế

Trypsin, Pankreaselastase,

Atranorin

Phosphorylase

Baeomycesis acid

5-Lipoxygenase

Bis-(2,4-dihydroxy-6-n-propylphenyl)methane,

divarinol, cao chiết từ Cetraria juniperina,

Tyrosinase

Hypogymnia physodes và Letharia vulpina

Chrysophanol

Glutathione reductase

Confluentic acid, 2β-O-methylperlatolic acid

Monoaminoxidase B

4-O-Methylcryptochlorophaeic acid

Prostataglandin biosynthesis

(+)-Protolichesterinic acid

5-Lipoxygenase (Sao chép ngược HIV)

Vulpinic acid

Phosphorylase

Norsolorinic acid

Monoamino oxidase

Physodic acid

Arginine decarboxylase

Usnic acid

Ornithine decarboxylase

Ứng dụng trong nông nghiệp

Một số hợp chất từ địa y thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển đối với thực vật

bậc cao (Bảng 1.5).

Ngoài ra, một số hợp chất phenol đơn vòng, depside và depsidone còn có khả năng

ức chế sự tăng trưởng của một số loài giun, ấu trùng, ốc,… Caperatic acid và các cao

chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và Xanthoparmelia cumberlvàia kìm

hãm sự tăng trưởng của loài ốc Pallifera varia. Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc

ấu trùng của loài giun Toxocara canis. Một số hợp chất depside, depsidone,

dibenzofuran như atranorin, pulvinic acid dilactone, stictic acid, norstictic acid, salazinic

acid, vulpinic acid, usnic acid… làm giảm sự tăng trưởng của ấu trùng ăn tạp Spodoptera

littoralis nhưng không ảnh hưởng đến sự sống còn của chúng.

Bảng 1.5. Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao

Địa y hoặc các hợp chất của địa y

Hoạt tính

Barbatic acid, lecanoric acid, diffractaic

Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp

acid, 4-O-demethylbarbatic acid, evernic

acid, β-orcinolcarboxylic acid, orsellinic

acid

Ergochrome AA (acid secalonic A)

Gây độc cho thực vật

Evernic acid

Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau bina

Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây

Lecanoric acid

Allium cepa

Các hợp chất phenol đơn vòng

Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật

Các quinone từ Pyxine spp

Ức chế sự nguyên phân của rễ cây Allium cepa

Ức chế sự nảy mầm và phát triển của Lepidium

Usnic acid

sativum

Ứng dụng trong mĩ phẩm và công nghiệp nước hoa

Trong công nghiệp nước hoa, usnic acid được sử dụng phổ biến, nhất là công

nghiệp nước hoa Pháp. Ngoài ra, atranorin, pannarin, gyophoric acid và usnic acid còn

được áp dụng trong việc điều chế thuốc rám nắng.

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM

2.1 Máy móc, thiết bị, hóa chất

Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC được ghi bằng máy Bruker Avance 500 tại Phòng

Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM

(phổ 1H-NMR được đo ở tần số 500 MHz và phổ 13C-NMR được đo ở tần số 125 MHz).

Dung môi sử dụng là n-hexane, chloroform, acetone, ethyl acetate và acetic acid

được cung cấp bởi hãng Chemsol (Việt Nam). Sắc kí cột pha thuận sử dụng silica gel

kích thước hạt (0.040–0.063 mm, Merck). Sắc kí lớp mỏng sử dụng bản mỏng 20 cm

x20 cm phủ silica gel 60 F254 (Merck).

2.2 Thu hái và xử lý mẫu nguyên liệu, ly trích và cô lập các hợp chất

Loài địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swinscow) Krog & Swinscow thu hái

trên đá trên núi Tà Cú, tỉnh Bình Thuận (tháng 8/2012-12/2012). Tên khoa học được

xác định bởi tiến sĩ Wetchasart Polyiam, Tổ nghiên cứu địa y, Bộ môn Sinh học, Khoa

Khoa học, Đại học Ramkhamhaeng, Bangkok, Thái Lan. Mẫu ký hiệu số US-B027 và

được lưu trong quyển tiêu bản thực vật tại bộ môn Hoá hữu cơ, Khoa Hoá, Đại học Khoa

học Tự nhiên.

Hình 2.1. Loài địa y Parmotrema tsavoense

Bột khô địa y nghiền nhỏ (1,350 g) được ngâm dầm trong methanol và dịch chiết

cô quay dưới áp suất thấp. Trong quá trình methanol bay hơi, tủa trắng P (30.3 g) xuất

hiện dần và được lọc riêng. Phần dung dịch lọc còn lại được tiếp tục cô quay thu được

cao methanol thô (249.8 g). Phần cao methanol thô đã được tiến hành nghiên cứu bởi

Duong TH (2015) [5]. Phần bột địa y khô còn lại tiếp tục được ngâm dầm trong acetone

thu được cao acetone thô AC (8.54 g). Tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường trên

cao acetone, giải ly với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone: acetic acid

(12:5:1:1) để thu được 10 phân đoạn AC0 (341.6 mg), AC1 (1.2 g), AC2 (1.3 g), AC3

(209.0 mg), AC4 (264.9 mg), AC5 (1.31 g), AC6 (476.3 mg), AC7 (971.1 mg), AC8

(1.2 g) và AC9 (1.1 g). Phân đoạn AC5 (1.31 g) được thực hiện sắc ký cột, giải ly với

hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone: acid acetic (30:5:1:1) để thu được 8 phân

đoạn kí hiệu từ AC5.1 đến AC5.8. Từ phân đoạn AC5.5 tiến hành sắc ký cột giải ly

nhiều lần thu được hợp chất A18 (2.3 mg).

g 1

.

9 C A

1

8 .

5 C A

.

g 2

.

8 C A

1 ) g 3 0 3 ( P a ủ T

7 .

5 C A

.

7 C A

g m 1 1 7 9

6 .

5 c A A

.

6 C A

g m 3 6 7 4

3 : 1 : 8 c A A E C

C K S

5 .

g m 3

8 1 A

.

2 ) g

g

5 C A

g m 4 8 7

1 : 1 : 5 : 0 3 H O c A : c A A E H

C K S

H O e M g n o r t

c A g n o r t

1 3

.

5 C A

,

1 0 5 3 1 (

) g

i ạ l

.

m ầ d m â g N

1 : 1 : 5 : 2 1 H O c A : c A A E H

C K S

m ầ d m â g N

4 5 8 (

ỏ h n n ề i

4 n ò c y

.

h g n y

5 C A

.

4 C A

a ị đ t ộ B

g m 9 4 6 2

ô h t c A o a C

a ị đ t ộ B

3 .

3 C A

5 C A

g m 0 9 0 2

g 3

.

2 .

2 C A

1 e s n e o v a s t a m e r t o m r a P y a ị đ i à o l n ê r t t ấ h c p ợ h c á c p ậ l ô c à v h c í r t y l h n ì r t y u q ồ đ ơ S

5 C A

.

. 2 . 2 h n ì H

g 2

.

1 C A

1 .

) g 8 9 4 2 ( ô h t

5 C A

H O e M o a C

.

0 C A

g m 6 1 4 3

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất A18

Hợp chất A18 thu được từ phân đoạn cao acetone thô của loài địa y Parmotrema

tsavoense là chất bột, màu trắng.

Phổ 1H-NMR (Phụ lục 1).

Phổ 13C-NMR (Phụ lục 2).

Phổ HSQC (Phụ lục 3).

Phổ HMBC (Phụ lục 4).

Phổ MS (Phụ lục 5).

3.2 Biện luận cấu trúc phổ

Phổ 1H-NMR ở vùng từ trường yếu cho thấy sự hiện diện một tín hiệu của nhóm

hydroxy tại δH 11.30 (1H, s), hai tín hiệu proton của nhóm olefin mũi đôi tại δH 8.12

(1H, d, J =16.5 Hz) và δH 7.24 (1H, d, J =16.5 Hz) ghép đôi với nhau với hằng số ghép

J =16.5 Hz giúp xác định cấu hình trans của chúng. Ngoài ra phổ còn cho thấy hai tín

hiệu của hai proton gắn trực tiếp với vòng thơm mũi đơn tại δH 6.70 (1H, s) và 6.58 (1H,

s), một tín hiệu của nhóm methylene mũi đơn tại δH 4.10 (2H, s), một tín hiệu của nhóm

methoxy mũi đơn tại δH 3.87 (3H, s) và bốn tín hiệu của nhóm methyl tại δH 2.5 (3H, s),

2.34 (3H, s), 2.32 (3H, s) và 2.09 (3H, d, J =1.1 Hz).

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp chất A18 có sự hiện diện của

hai carbon olefin (δC 132.8 và 131.1), hai carbon methine thơm (δC 115.6 và 113.3) một

nhóm methylene (δC 20.8), một nhóm methoxy (δC 51.2) và năm nhóm methyl (δC 26.9,

19.4, 18.5, 17.2 và 8.0) và các carbon tứ cấp khác.

Phân tích độ dịch chuyển hóa học của hai proton nhóm olefin mũi đôi tại δH 8.12

và 7.24, chứng tỏ chúng phải có sự cộng hưởng với nhóm carbonyl lân cận (-CH=CH-

C(=O)-) và nhóm CH liên kết ở vị trí  với nhóm -C(O)- có độ chuyển dịch hóa học ở

vùng từ trường thấp hơn do hiệu ứng cộng hưởng ở C-8. Cụ thể, H-8 liên kết với C-8 tại

δC 132.8 và H-10 liên kết với C-10 tại δC 131.1.

Trên phổ HMBC nhận thấy sự tương quan của proton H-8 với những carbon tại

δC 197.7 (C-11), 162.5 (C-4) và 114.0 (C-3) và proton nhóm methyl CH3-12 tương quan

với những carbon tại δC 197.7 (C-11) và 131.1 (C-10) giúp xác định sự hiện diện của

nhóm thế but-1-en-3-onyl (-CH=CH-C(O)-CH3-) tại C-3. Sự tương quan của proton H-

5 với những carbon tại δC 114.0 (C-3), 111.3 (C-1) và 19.4 (C-9) và proton của nhóm

methyl CH3-9 tương quan với những carbon tại δC 115.6 (C-5) và 145.5 (C-6) giúp xác

định vị trí lân cận của các nhóm methyl CH3-9 và H-5. Dựa vào độ chuyển dịch hóa học

của carbon C-4 giúp xác định carbon này gắn trực tiếp với oxygen. Từ đó suy ra được

cấu trúc nhân A. Dựa theo dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của A18 và so sánh với

furfuric acid[35], nhận thấy dữ liệu phổ của chúng có sự tương đồng trên nhân thơm A.

Vì vậy, hợp chất phải sở hữu khung sườn depsidone.

Độ dịch chuyển hóa học 1H-NMR và 13C-NMR của nhóm methylene CH2-8’ giúp

xác định nhóm này phải liên kết với 2 nhân benzen. Trên phổ HMBC cho thấy proton

của nhóm methylene CH2-8’ tương quan với những carbon tại δC 118.3 (C-5”), 137.9

(C-6”), 143.9 (C-1’), 152.4 (C-5’) và 158.7 (C-4”) đều có δC >100 ppm giúp củng cố

nhận định là nhóm methylene phải liên kết trực tiếp với 2 nhân thơm B và C. Dựa vào

độ chuyển dịch hóa học của carbon C-1’ và C-5’ và C-4” giúp xác định 3 carbon này

gắn trực tiếp với oxygen.

Ở nhân B, phổ HMBC cho tương quan của proton H-2’ với những carbon tại δC

144.2 (C-4’), 117.6 (C-6’) và 17.2 (C-7’) và proton của nhóm methyl CH3-7’ tương quan

với những carbon tại δC 144.2 (C-4’), 113.3 (C-2’) và 128.5 (C-3’) giúp xác định các

proton H-2’ và nhóm methyl CH3-7’ ở lân cận nhau. Theo tính toán độ chuyển dịch hóa

học các carbon trên nhân thơm B và so sánh dữ liệu phổ của hợp chất A18 với các tài

liệu tham khảo của furfuric acid[35] và các chất tương tự từ đó xác định vị trí nhóm

methylene trên nhân thơm B. Từ đó xác định được cấu trúc nhân B.

Ở nhân C, phổ HMBC có proton của nhóm methyl CH3-9” tương quan với carbon

tại δC 118.3 (C-5”), 137.9 (C-6”) và 106.2 (C-1”) giúp xác định nhóm thế methyl này

nằm kế cận với nhóm thế methylene CH2-8’. Proton của nhóm methyl CH3-8” tương

quan với những carbon tại δC 109.3 (C-3”) và 158.7 (C-4”) giúp xác định vị trí của nhóm

này trên nhân thơm C. Proton của nhóm 7”- OCH3 tương quan với carbon tại δC 172.7

(C-7”) giúp xác định nhóm methyl ester tại C-7”. Dựa vào các dữ liệu trên và so sánh

với dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của furfuric acid nhận thấy có sự tương đồng

trên nhân C, từ đó xác định cấu trúc nhân C của hợp chất A18 giống nhân C của furfuric

acid.

-. Theo tính toán dựa

Ngoài ra, khối phổ phân giải cao của hợp chất A18 xuất hiện mũi ion giả phân tử

tại m/z bằng 547.1605, tương ứng với công thức phân tử C30H27O10

trên cấu trúc đã xác định ta thấy ion [M-H]- có giá trị m/z là 547.1600, chênh lệch 0.5‰.

Từ đó giúp khẳng định một lần nữa cấu trúc của hợp chất A18. Vậy hợp chất A18 có

cấu trúc được xác định như Hình 3.1, đặt tên là Parmosidone H.

Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và một số tương quan HMBC của hợp chất A18

Bảng 3.1. So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất A18 và furfuric acid

A18 Furfuric acid

N δH, J (Hz) δH, J (Hz) δC δC

111.3 112.7 1

N.D 164.0 2

114.0 111.7 3

162.5 163.7 4

6.70 (1H, s) 115.6 6.76 (1H, s) 116.9 5

145.5 151.6 6

N.D 160.7 7

8.12 (d, 1H, J =16.5 Hz) 132.8 10.55 (1H, s) 191.7 8

2.09 (d, 3H, J =1.1 Hz) 19.4 2.10 (3H, s) 20.1 9

7.24 (d, 1H, J =16.5 Hz) 131.1 - - 10

197.7 - - 11

26.9 - - 2.34 (3H, s) 12

143.9 155.9 1’

113.3 118.5 6.58 (1H, s) 2’

128.5 134.7 3’

144.2 142.5 4’

152.4 145.4 5’

117.6 113.7 6’

17.2 2.23 (3H, s) 14.4 2.32 (3H, s) 7’

20.8 3.97 (2H, s) 21.4 4.10 (2H, s) 8’

- 171.0 - 9’

109.5 106.2 1”

157.2 N.D 2”

113.7 109.3 3”

156.6 158.7 4”

119.7 118.3 5”

128.6 137.9 6”

171.1 172.7 7”

9.9 2.05 (N.D) 8.0 1.96 (3H, s) 8”

17.8 2.50 (3H, s) 18.5 2.43 (3H, s) 9”

Hai hợp chất A18 và furfuric acid cùng được đo trong dung môi acetone-d6.

51.7 3.87 (3H, s) 51.2 3.86 (3H, s) 7”-OMe

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1 Kết luận

Từ mẫu địa y Parmotrema tsavoense (Krog & Swinscow) Krog & Swinscow thu

hái trên đá trên núi Tà Cú, tỉnh Bình Thuận đã cô lập được hợp chất A18. Bằng các

phương pháp phổ nghiệm hiện đại kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo xác định được

cấu trúc của hợp chất hữu cơ là Parmosidone H (Hình 4.1). Đây là hợp chất mới.

Parmosidone H

Hình 4.1. Cấu trúc hợp chất đã cô lập

4.2 Đề xuất

Hầu hết các hợp chất mang khung sườn depsidone cô lập từ loài địa y Parmotrema

tsavoense đều có hoạt tính sinh học mang tính ứng dụng cao. Vì vậy, tôi sẽ tiếp tục cô

lập thêm Parmosidone H để thử nghiệm hoạt tính của nó và nghiên cứu các phân đoạn

còn lại từ loài địa y này.

Tài liệu tham khảo

[1] Muller K. (2001), “Pharmaceutically relevant metabolites from lichens”, Applied

Microbiology and Biotechnology, 56, 9−16.

[2] Boustie J., Grube M. (2005), “Lichens - a promising source of bioactive

secondary metabolites”, Plant Genetic Resources, 3, 273–287.

[3] Huneck S. (1999), “The significance of lichens and their metabolites”,

Naturwissenschaften, 86, 559–570.

[4] Huynh B. L. C., Duong T. H., Do T. M. L., Pinnock G. T., Pratt L. M., Yamamoto

S., Watarai H., Tanahashi T., Nguyen K. P. P. (2015), “New γ-lactone carboxylic

acids from the Lichen Parmotrema prasorediosum (Nyl.) Hale, Parmeliacea”,

Records of Natural Products, 10(3), 332-340.

[5] Huynh Bui Linh Chi (2014), Chemical constituents of lichen Parmotrema

prasorediosum collected in Vienam, A thesis for Doctor of Philosophy,

University of Science, National University -Ho Chi Minh City.

[6] Yit Heng Choi (2008), Generic potential of lichen-forming fungi in polyketide

biosynthesis, A thesis Submitted in fulfilment of the requirement for degree of

Doctor of Philosophy, RMIT University, 10-20.

[7] Huneck S., Yoshimura I. (1997), Identification of lichen substances, Springer,

Berlin, 155−311.

[8] David F., Elix J. A., Binsamsudin M. W. (1990), “Two new aliphatic acids from

the lichen Parmotrema praesorediosum (Nyl.) Hale”, Australian Journal of

Chemistry, 43, 1297–1300.

[9] Ramesh P., Shere E., Baig A. (1994), “Chemical investigation of South Indian

lichen: Parmelia praesorediosa (Nyl.) and Parmelia reticulate (Tayl.)”, Indian

Journal of Heterocyclic Chemistry, 3(3), 211−212.

[10] Duong Thuc Huy, Huynh Bui Linh Chi, Ha Xuan Phong, Ton That Quang,

Nguyen Kim Phi Phung (2011), “Some phenolic compounds of the lichen

Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale (Parmeliaceae)”, Journal of Science

and Technology Development, 14(6), 5–10.

[11] Neeraj V., Behera B. C., Parizadeh H., Bo S. (2011), “Bactericidal activity of

some lichen secondary compounds of Cladonia ochrochlora, Parmotrema

nilgherrensis and Parmotrema sancti-angelii”, International Journal of Drug

Development and Research, 3(3), 222−232.

[12] Ha Xuan Phong (2012), “Chemical constituents of lichen Parmotrema sancti-

angelii collected in Vienam”, A thesis for Master of Science, University of

Science, National University-Ho Chi Minh City.

[13] Nguyen Thi Thu Tram, Nguyen Trong Tuan, Nguyen Phuc Dam, Nguyen Thi

Ngoc Van, Nguyen Pham Hong Thanh (2016), “Study on chemical constituents

of the lichen Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale.”, Vietnam Journal of

Chemistry, International Edition, 54(4), 524-527.

[14] Keogh M. F. (1977), “Malonprotocetraric acid from Parmotrema conformatum”,

Phytochemistry, 16(7), 1102.

[15] Honda N. K., Pavan F. R., Coelho R. G., Andrade Leite S. R., Micheletti A. C.,

Lopes T. I. B., Misutsu M. Y., Beatriz A., Bruma R. L., Leite C. Q. F. (2010),

“Antimycobacterial activity of lichen substances”, Phytomedicine, 328−332.

[16] Micheletti A. C., Beatriz A., Lima D. P. de, Honda N. K. (2009), “Chemical

constituents of Parmotrema lichexanthonicum Eliasaro & Adler – Isolation,

structure modification and evaluation of antibiotic and cytotoxic activities”,

Química Nova, 32(1), 12−20.

[17] Le Hoang Duy (2012), “Chemical study of common lichens in the south of

Vienam”, A thesis for Doctor of Philosophy, Kobe Pharmaceutical University,

13.

[18] Kharel M. K., Rai N. P., Manandhar M. D., Elix J. A., Wardlan J. H. (2000),

“Dehydrocollatolic acid, a new depsidone from the lichen Parmotrema

nilgherrense”, Australian Journal of Chemistry, 53(10), 891−892.

[19] Duong Thuc Huy, Huynh Bui Linh Chi, Ha Xuan Phong, Tuong Lam Truong,

Ton That Quang, Joel Boustie, Nguyen Kim Phi Phung (2012), “New diphenyl

ether from lichen Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale (Parmeliaceae)”,

Vietnamese Journal of Chemistry, 50(4A), 199-202.

[20] Duong Thuc Huy, Tran Thi Thanh Thuy (2014), “Collatolic acid derivatives from

lichen Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale (Parmeliaceae)”, Tạp chí Khoa

học ĐHSP TPHCM, 64, 35-41.

[21] Fazio A. T., María D. B., Mónica T. A., Laura B. R., María L. R., Lucia M.,

Armin H., Elfie Stocker W., Marta S. M. (2009), “Culture studies on the

mycobiont isolated from Parmotrema reticulatum (Taylor) Choisy: metabolite

production under different conditions”, Mycological Progress, 8, 359-365.

[22] Bugni T. S., Cynthia D. A., Ann R. P., Prem Rai, Chris M. I., Louis R. B. (2009),

“Biologically active components of a Papua New Guinea analgesic and anti-

inflammatory lichen preparation”, Fitoterapia, 80 (5), 270-273.

[23] Jayaprakasha G. K., Rao L. J. (2000), “Phenolic constituents from the lichen

Parmotrema stuppeum (Nyl.) Hale and their antioxidant activity”, Zeitschrift für

Naturforschung [C], 55(11-12), 1018−1022.

[24] O’Donovan D. G., Robert G., Keogh M. F. (1980), “Structure of the β-orcinol

depsidones, connorstictic acid and consalazinic acid”, Phytochemistry, 19,

2497−2499.

[25] Duong T. H., Chavasiri W., Boustie J., Nguyen K. P. P. (2015), “New meta-

depsidones and diphenyl ethers from the lichen Parmotrema tsavoense”,

Tetrahedron, 71.

[26] Bui Thi Lan Anh, Duong Thuc Huy (2015), “Chemical constituents of the lichen

Parmotrema tsavoense (Krog & Swincow) Krog & Swincow”, Journal of

Science, Ho Chi Minh City University of Education, 78, 119125.

[27] Duong Thuc Huy (2017), “A new monoaromatic compound from the lichen

Parmotrema tsavoense (Krog  Swinscow)”, Journal of Science, Ho Chi Minh

City University of Education, 14(3), 12-17.

[28] Nguyễn Thị Quỳnh Như, Nguyễn Thị Thanh Hương (2017), “Cô lập một số hợp

chất phenolic từ cao acetone thô của loài địa y Parmotrema tsavoense”, Kỉ yếu

hội nghị SV NCKH, Đại học Sư Phạm TP.HCM, 14-19.

[29] Nguyễn Ngọc Mẫn (2017), “Thành phần hóa học phân đoạn phân cực của cao

acetone thô từ loài địa y Parmotrema tsavoense”, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học

Sư Phạm TP.HCM, 36.

[30] Sakurai A., Goto Y. (1987), “Chemical studies on the lichen. I. The structure of

isolecanoric acid, a new ortho-depside isolated from Parmelia tinctorum Despr.”,

Bulletin of the Chemical Society of Japan, 60(5), 1917−1918.

[31] Santos L. C., Honda N. K., Carlos I. Z., Vilegas W. (2004), “Intermediate reactive

oxygen and nitrogen from macrophages induced by Brazilian lichens”,

Fitoterapia, 75(5), 473−439.

[32] Brandão L. F. G., Alcantara G. B., Matos M. de F. C., Bogo D., Freitas D. dos

S., Oyama N. M., Honda N. K. (2013), “Cytotoxic evaluation of phenolic

compounds from lichens against melanoma cells”, Chemical and Pharmaceutical

Bulletin, 61(2), 176–183.

[33] S. Morris Kupchan, Herbert L. Kopperman (1975), “l-Usnic acid: Tumor

inhibitor isolated from lichens”, Experientia, 31, 625-625.

[34] Boustie J., Tomashi S., Grube M. (2010), “Bioactive lichen metabolites: alpine

habitats as an untapped source”, Phytochemistry Review, 10(3), 287-307.

[35] Huneck S., Yoshimura I. (1997), Identification of lichen substsances, Springer

Verlag, Berlin, 327-328.