Kỹ Thuật Tách Chiết Nucleic Acid

Ọ

Môn: SINH H C PHÂN T Ử t ế ỹ

Đ tàiề

: K Thu t Tách Chi ậ Nucleic Acid

Ớ

L P : ĐHSH07LT NHÓM : 10

GVHD : Tr n H ng B o Quyên

ồ

ầ

ả

Thành Viên Nhóm 2

ậ

ươ ạ ầ ầ

1. Nguy n M u Hòa Ân ễ 2. Nguy n Văn Dũng ễ 3. L ng Văn H i ả 4. Ph m Th Bích Liên ị 5. Tr n Th Kim Ngân ị 6. Tr n Quang S n ơ 7. Phan Phúc Thi nệ 8. Tr n Thi n Tu n ấ

ệ

ầ

Các b

ng pháp

tách

ướ ơ ả và ph c c b n

ươ

chi

t nucleic acid.

ế

 Các b

c tách chi

t DNA, RNA, mRNA

ướ

ế

So sánh tách chi

t ế DNA/ RNA/ mRNA

So sánh tách chi

th c v t, đ ng

t ế DNA t

ừ ự ậ ộ

ẩ . v t và vi khu n ậ

ng pháp

tách

ươ

ướ ơ ả – ph c c b n t ACID NUCLEIC.

Các b chi ế

c ướ tách chi

t DNA. ế t DNA c b n g m 3 b ồ ơ ả

ế

ng pháp tách chi C 1: Phá v màng t

bào và màng nhân

c ướ :

Các b Ph ươ B ƯỚ

ỡ

ế

− Nghi n t

bào và mô trong h n h p t y : SDS, protease

ề ế

ợ ẩ

ỗ

th y phân protein, enzym lysozym, EDTA, . H n h p

ủ

ỗ

ợ

này s phá v màng t

bào và màng nhân, phóng thích

ẽ

ỡ

ế

DNA ra môi tr

ng đ ng th i protein liên k t v i DNA

ườ

ế ớ

ồ

ờ

cũng t

b phân h y.

ự ị

ủ

bào và màng nhân

Phá v màng t ỡ

ế

bào và màng nhân

Phá v màng t ỡ

ế

Các b

t DNA.

c ướ tách chi

ế

B

C 2:

Lo i b thành ph n không không ph i DNA,

ƯỚ

ạ ỏ

ầ

ả

ch y u là protein.

ủ ế

 Gây t a protein b ng dd

chloroform: phenol và ủ ằ

enzym protein K. Sau khi ly tâm ng nghi m g m 3 ệ ồ ố

i đáy ng nghi m, gi a l p dd: l p phenol n m d ớ ằ ớ ướ ữ ệ ố

là protein, trên cùng là d ch l ng ch a DNA. ứ ỏ ị

t DNA. Làm k t t a acid nucleic

2 cách thông

Các tách chi C 3: B ƯỚ

ế ế ủ

− Dùng ethanol n ng đ cao

d ngụ :

ộ ồ (ethanol: m u là 2,5: 1) ẫ

và t đ th p ng có l c ion cao ở nhi ệ ộ ấ , trong môi tr ườ ự

− Dùng isopropanol (isopropanol:m u là 1:1), không

(n ng đ mu i cao). ồ ộ ố

ẫ

ng c n s hi n di n c a mu i các DNA ầ ự ệ ệ ủ ố tr ng l ọ ượ

phân t th p không b k t t a ử ấ ị ế ủ , lo i b kh i d ch ạ ỏ ỏ ị

chi t b ng cách này ế ằ

Các b

t DNA.

c ướ tách chi

ế

 T a thu nh n b ng 2 cách trên đ

c thu nh n ủ ằ ậ ượ ậ

b ng ly tâm . Sau đó, r a k t t a ằ ử ế ủ vài l n trong ầ

ethanol 70% đ lo i b các mu i ho c các v t ể ạ ỏ ế ặ ố

isopropanol còn dính trong m u, sau đó ẫ x lý ử

 Làm khô và hòa tan trong dd TE ho c n

c DNA b ng RNase đ lo i b RNA. Thu đ ể ạ ỏ ằ ượ

ặ ướ c kh ử

ion đ ti p t c nghiên c u ứ ể ế ụ

S đ tách chi

t DNA t ng s

ơ ồ

ế

ổ

ố

Hình nh minh h a s i DNA trong ng ọ ợ ả nghi mệ

t RNA toàn ph n và

c ướ tách chi

ế

ầ

Các b mRNA.

Các RNA đ u là phân t

không b n ề ử ề , d b phân ễ ị

Chính vì v y, ph i có nhi u bi n pháp đ ể

h y b i các RNase, RNase có kh p n i. ủ ở ở ắ ơ

ệ ề ậ ả

môi tránh các t p nhi m b i các RNase t ễ ạ ở ừ

tr ng: ườ thao tác trong đi u ki n vô trùng ề ệ ; m i ọ

d ng c , hóa ch t c ấ đ u đ ề ượ kh trùng b ng ử ụ ụ ằ

nhi t ệ hay đ c ượ x lý v i DEPC h u tránh m i ti p ọ ế ử ầ ớ

xúc v i d ng c b ng tay tr n. ớ ụ ụ ằ ầ

t RNA toàn ph n và

c ướ tách chi

ế

ầ

Các b mRNA.

Ly trích RNA toàn ph n cũng g m 3 b

ầ

ồ

ướ

c nh trích ư

ly DNA:

B bào mô trong dung d ch có m t c 1ướ : Nghi n t ề ế ộ ị

SDS) n ng đ cao, m t tác m t ch t t y m nh ( ấ ẩ ạ ộ ở ồ ộ ộ

nhân gây bi n tính protein m nh ( guamidium ế ạ

thiocyanate), m t ch t kh ( ử 2- mercaptoethanol). ấ ộ

Các ch t có tác d ng c ch ho t đ ng các ụ ứ ạ ộ ế ấ

RNase n i bào và tách các protein liên k t kh i ế ỏ ộ

phân t RNA. ử

t RNA toàn ph n và

c ướ tách chi

ế

ầ

Các b mRNA.

B c 2: Lo i protein b ng x lý phenol: ướ ử ằ ạ

chloroform và ly tâm, RNA s hòa tan trong pha ẽ

n c.ướ

B ethanol c 3ướ : T a RNA: làm t a RNA b ng ủ ủ ằ

ho c ặ isopropanol r i ồ ly tâm. D i d ng k t t a ướ ạ ế ủ

0C trong n

trong ethanol ho c đông l nh -70 ạ ặ ở c ướ

có ch a ch t c ch Rnase là R-nasine và cu i ấ ứ ứ ế ố

cùng là b c tách RNA kh i DNA b ng enzym ướ ằ ỏ

Dnase. Thu đ c RNA toàn ph n ượ ầ

Các b

t mRNA.

c ướ tách chi

ế

 RNA t

bào g m: rRNA (80-85%), tRNA(15- ế ồ

 mRNA có m t đ c đi m chung là có c u trúc ể

20%), snRNA (<1%) mRNA chi m kho ng 1- 5% ế ả

ộ ặ ấ

- Ta có th tách mRNA ra kh i m u b ng cách d a

đuôi polyA

ự ể ẫ ằ ỏ

đ c tính liên k t b sung A - T c a nucleic acid, s ử ế ổ ủ ặ

d ng s c ký ái l c trên c t oligodT - cellulose. ự ụ ắ ộ

Các b

t mRNA.

c ướ tách chi

ế

Tuy nhiên, mRNA đ i v i eukaryote có đi m ố ớ

ể

chung là c u trúc đuôi polyA . D a vào c u trúc ấ ự ấ

này và đ c tính b sung A – T c a nucleic acid, ặ ổ ủ

ta có th tách mRNA ra kh i m u b ng s c ký ể ẫ ằ ắ ỏ

ái l c trên ự c t oligodT-cellulose ộ

ồ

ằ

ắ

Thu h i mRNA b ng s c ký ái l cự

Các b

t mRNA.

c ướ tách chi

ế

Hi n nay trên th tr

ng có nh ng ị ườ ệ ữ b kit s ử ộ

d ng các viên bi t ụ ừ có mang oligodT trên b ề

m tặ . Sau khi các mRNA bám lên b m t các ề ặ

viên bi t thông qua liên k t b sung v i ừ ế ổ ớ

oligodT, các viên bi này đ c thu nh n l i qua ượ ậ ạ

ly tâm và mRNA s đ ẽ ượ c tách ra kh i các viên ỏ

bi này và gi i. Kĩ thu t này cho phép thu l ữ ạ ậ

nh n mRNA ng ậ c t ả ừ ữ nh ng m u có kh i l ẫ ố ượ

r t nh . ấ ỏ

Các b

t mRNA.

c ướ tách chi

ế

Các b

t mRNA.

c ướ tách chi

ế

K thu t siêu ly ậ ỹ tâm

Ph

ng Pháp ly tâm đ ng t tr ng

ươ

ỷ ọ

ẳ

ng pháp ly tâm đ ng t ỷ

ẳ

Ph ươ tr ngọ

ươ

ng pháp ly tâm Ph  Ly tâm phân đo nạ

ắ

ươ

ự

ể ạ

ắ

ng pháp s c ký Ph S c ký ái l c trên polyU - sepharose hay ắ trên oligodT - cellulose đ tinh s ch mRNA.  S c ký l c gel trong phân tách các nucleic do sau quá trình đánh

ự

 S c ký trao đ i ion trên vi c t đ thu h i

ọ acid ra kh i các nucleic t ỏ d u DNA ho c RNA. ặ ấ

ộ ể ồ

ỏ ổ ấ

ng r t nh DNA. ượ ký l ng cao áp. Ph ng pháp có đ phân

ộ

ắ nh ng l ữ S cắ gi ạ ả oligonucleotide t ng h p (đ phân gi ợ nucleotide), plasmid, phân tách các đo n DNA. ỏ ộ ươ c dùng trong tinh s ch các i cao này đ ượ i m t ộ ả ổ ạ

Ph

ng pháp s c ký

ươ

ắ

ắ ự

S c ký ái l c: trên poly U-Sepharose hay trên oligodT-cellulose, dùng đ tinh s ch mRNA. ể ạ

ấ ắ ệ ỏ

ậ

i cao dùng ỹ trong ả

ộ ỉ

S c ký l ng hi u su t cao (high performance liquid chromatography) là k thu t m i có đ ộ ớ tinh s ch các phân gi ạ oligonucleotide có đ phân g ai 1 nucleotide, plasmid hay các đo n DNA. ạ