630
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM H A M MIỄN DỊCH
I. ĐẠI CƢƠNG
Hóa mô miễn dịch là một xét nghiệm để tìm sự hiện diện của các kháng nguyên
mặt trong tế bào mô, đượ làm trên các lát cắt nhằm xác định nguồn gốc
bản chất của tế bào giúp cho chẩn đoán, điều trị tiên lượng bệnh. kháng
nguyên không thể quan sát hình thái được nên người ta phải xác định vị trí của
trên tế bào bằng các phản ứng miễn dịch và hóa học.
II. CHỈ ĐỊNH
- Xác đnh nguồn gốc của những u không biệt hóa, không xác định được nguồn gốc
bằng mô học thường quy;
- Xác định sự mặt của một số kháng nguyên liên quan đến điều trị tiên lượng
bệnh, đặc biệt trong ung thư (Xác định thụ thể estrogen, progesteron trên tế bào
ung thư tuyến vú, ung thư nội mạc tử cung, ung tbuồng trứng. Xác định tế bào
chế tiết TSH, ACTH, HCG, hGH, Lactabumin ... trong các u thuộc hệ nội tiết);
- Chẩn đoán phân biệt u lành và ung thư (ít giá trị).
III. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Bác chuyên khoa giải phẫu bệnh kinh nghiệm hiểu biết sâu về hóa
miễn dịch.
- Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh.
2. Phƣơng tiện
- Dụng cụ, máy móc: Micropipete (từ 1-1000), cân điện tử, nồi áp suất chuyên
dụng, vi sóng, máy đo pH, hộp tiêu bản, tủ lạnh, tủ ấm, máy cắt tu bản, bếp
điện, máy nhuộm, lam kính, lamen).
- Hóa chất: Silane, kháng thể, các kít phát hiện, Diamino-Bezidin, Hematoxylin,
nước cất, cồn 900, cồn tuyệt đối, dung dịch Citrate-Buffer PH6, dung dch Tris-
Buffer-Saline (TBS) pH 7,6, dung dịch pha kháng thể, dung dịch H202.
IV. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Chuẩn bị tiêu bản: Bệnh phẩm cắt mỏng 3-4 micromet đặt lên lam kính đã được sử
nhúng với dung dịch silane. Tiêu bản phải được đặt trong tủ ấm 600C ít nhất 1
giờ.
- Tiêu bản sau khi tẩy paraffin được nhúng vào nước cất 2 lần x 5 phút.
631
- Khử peroxidase nội sinh bằng dung dịch H2O2 3% x 5 phút.
- Rửa tiêu bản bằng dung dịch Tris- Buffer- Saline (TBS) pH 7,6 x 5 phút
- Khử các protein không đặc hiệu bằng Bovine- Serum- Albumine x 5 phút
- Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 2 lần x 5 phút, không để khô tiêu bản
- Phủ kháng thể kháng kháng nguyên đầu x 60 phút
- Rửa TBS 2 lần x 5 phút
- Phủ Biotinylated Secondary Antibody x 30 phút
- Rửa TBS 2 lần x 5 phút
- Phủ phức hợp Avidin-Biotin (ABC) x 30 phút
- Rửa TBS 2 lần x 5 phút
- Phủ dung dịch Diamino Benzidine (DAB) x 10 phút
- Rửa nước chảy x 5 phút
- Nhuộm Hematoxyline 5 giây
- Khử nước, làm sạch tiêu bản, gắn lamen.
IV. ĐỌC KẾT QU
Đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học. Dựa vào vị trí kháng nguyên trong
để từ đó xác định chẩn đoán. Phản ứng dương tính khi màng bào tương hoặc
nhân, hoặc bào tương hoặc cả bào tương và màng bắt màu nâu đỏ.
632
NHUỘM SISH (VENTANA)
I. ĐẠI CƢƠNG
Xét nghiệm SISH gọi phương pháp lai tại chỗ gn bạc nhằm xác định tình trạng
khuyếch đại gen Her-2/neu.
II. CHỈ ĐỊNH
Theo chỉ định của Bác lâm sàng: chủ yếu các định tình trạng khuyếch đại gen
trong ung thư vú, ung thư dạ dày và một số loại ung thư khác để điều trị đích.
III. H A CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ
- Bộ kít Her-2 và CEP17.
- Lam kính, lamen, dung dịch rửa.
- Kính hiển vi quang học.
IV. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Mẫu mô được cắt mỏng 4 micromet, gắn lên tiêu bản đã được tráng silan.
- Cài đặt chương trình máy
- Dán nhãn và đặt lam vào máy
- Loại paraffin bằng EZprep
- Bộ lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC2: 30 phút ở 900C
- Xử trí protease: 16 phút
- Ủ lam với 100 àl probe Her-2 và CEP17 trong 4 phút
- Biến tính DNA trong 20 phút ở 800C
- Lai DNA tyrong 6 giờ ở 370C
- Rửa bằng nước bạc trong 8 phút ở 720C
- Ủ trong dung dịch SIL ISH DNP CHRC và ủ 4 phút
- Ủ 24 phút với RED ISH DIG FR
- Ủ 8 phút với RED ISH DIG FR
- Nhuộm hematoxilin II trong 4 phút
- Nhuộm với dung dịch Bluing trong 4 phút
- Láy lamen ra khỏi máy và làm sạch lam
- Làm khô lam trong 1 giờ ở 600C
633
- Ngâm lam trong xylen 3 phút x 2 lần
- Gắn lamen và đọc kết quả.
V. ĐỌC KẾT QUẢ
Đếm tín hiệu trong nhân tế bào ung thư vùng xâm nhập.
- T lệ Her-2/CEP17 < 1,8: không khuyếch đại
- T lệ Her-2/CEP17 ≥ 2,2: có khuyếch đại
- T lệ 1,8 ≤ Her-2/CEP17 < 2,2: khuyếch đại giáp biên cần khảo sát lại
- T lệ 2,5 < Her-2/CEP17 ≤ 5: khuyếch đại thấp
- T lệ Her-2/CEP17 > 5: khuyếch đại cao