Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu xác định hàm lượng phenol trong cá biển

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHENOL

TRONG CÁ BIỂN

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHENOL TRONG CÁ BIỂN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Vũ Đức Lợi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành đến với PGS.TS. Vũ

Đức Lợi. Thầy đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt

nhất giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích nói

riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong

thời gian tôi học tập tại trường Đại học Khoa Học - Đại Học Thái Nguyên.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa phân tích của Viện

Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện

hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, các bạn học viên Cao học của Bộ

môn Hóa phân tích đã luôn động viên, tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian học

tập và thực hiện luận văn này.

Quảng Ninh, ngày 15/11/2016

Tác giả luận văn

Phạm Thị Bích Ngọc

a Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................... a

MỤC LỤC ................................................................................................. b

DANH MỤC VIẾT TẮT .......................................................................... d

DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................ e

DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................... f

MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................... 3

1.1. Giới thiệu về Phenol ........................................................................... 3

1.1.1. Cấu tạo và tính chất của phenol .................................................. 3

1.1.2. Một số ứng dụng của Phenol ....................................................... 5

1.1.3. Nguồn gốc và độc tính của Phenol .............................................. 5

1.1.4. Sự tồn tại và chuyển hóa của phenol trong môi trường ............... 8

1.2. Các phương pháp để xác định phenol .............................................. 12

1.2.1. Các phương pháp sắc ký ............................................................ 12

1.2.2. Phương pháp trắc quang ............................................................ 16

1.2.3. Phương pháp phát quang hóa học .............................................. 17

1.2.4. Phương pháp huỳnh quang ........................................................ 18

1.3. Phương pháp phân tích xác định Phenol trong luận văn ................. 19

1.3.1. Hệ thống máy sắc ký khí (GC) .................................................. 19

1.3.2. Đầu dò khối phổ (MS) ............................................................... 20

1.3.3. Các kỹ thuật xử lý mẫu trước khi phân tích ............................... 24

Chương 2. THỰC NGHIỆM ................................................................ 29

2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ..................................................... 29

2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................. 29

2.1.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................. 29

2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 29

2.2.1. Phương pháp tổng hợp tài liệu ................................................... 29

2.2.2. Phương pháp thực nghiệm ......................................................... 29

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................... 30

http://www.lrc.tnu.edu.vn

b Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

2.3. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích ......... 31

2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ........ 31

2.3.2. Độ chụm (độ lặp lại) của phương pháp ..................................... 32

2.3.3. Độ đúng (độ thu hồi) của thiết bị, của phương pháp ................. 32

2.4. Thực nghiệm .................................................................................... 33

2.4.1. Lấy mẫu ...................................................................................... 33

2.4.2. Xử lý mẫu ................................................................................... 34

2.4.3. Xây dựng đường chuẩn của phenol ........................................... 35

2.4.4. Trang thiết bị và hóa chất phục vụ nghiên cứu .......................... 36

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 38

3.1. Điều kiện phân tích xác định phenol trên thiết bị GC/MS ............... 38

3.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp GC/MS 38

3.3. Đường ngoại chuẩn định lượng phenol trên GC/MS ....................... 40

3.4. Kết quả xác định điều kiện chiết tách, làm sạch và và tạo dẫn xuất

chất phân tích .......................................................................................... 41

3.4.1. Kết quả lựa chọn dung môi tách chiết ....................................... 41

3.4.2. Kết quả khảo sát thể tích dung môi chiết ................................... 42

3.4.3. Kết quả khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất .................................... 43

3.4.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp chuẩn bị mẫu .......... 45

3.5. Kết quả xác định phenol trong các mẫu cá biển .............................. 47

KẾT LUẬN ............................................................................................ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................... 51

PHỤ LỤC

c Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC VIẾT TẮT

ATSDR : Agency for Toxic Substances and Disease Registry

: Chemical Ionization CI

Electron Inpact/Ionization EI :

Environmental Protection Agency EPA :

Electron Spray Ionization ESI :

GC/MS : Gas Chromatography Mass Spectometry

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

Ion Trap IT :

p-aminophenol PAP :

p-CBDA p-chlorobenzen đizonium fluoroborat :

http://www.lrc.tnu.edu.vn

d Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Tính chất hóa lý của phenol .......................................................... 4

Bảng 2.1. Vị trí và thời gian lấy mẫu .......................................................... 33

Bảng 2.2. Pha dung dịch chuẩn phenol ....................................................... 36

Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào hàm lượng phenol ................ 40

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát và lựa chọn dung môi chiết ............................. 41

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát thể tích dung môi dùng để chiết mẫu .............. 42

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thể tích anhydride axetic để tạo dẫn xuất đến

hiệu suất thu hồi phenol ................................................................ 43

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ K2CO3 đến hiệu suất thu hồi phenol .... 44

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ thu hồi mẫu và độ lặp lại ............................ 45

Bảng 3.7. Kết quả phân tích hàm lượng phenol trong mẫu cá biển tại Hà

Tĩnh ............................................................................................. 47

Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng phenol trong mẫu cá biển tại Hạ

Long ............................................................................................. 47

e Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Một số hình ảnh về phenol ............................................................. 3

Hình 1.2. Mô hình phân tử phenol ................................................................. 3

Hình 1.3. Minh họa sơ đồ hệ thống máy GC Model 6980N, HP ................ 19

Hình 1.4. Sơ đồ hệ thống máy sắc ký khí .................................................... 20

Hình 3.1. Quy trình phân tích phenol trong mẫu cá ................................... 35

Hình 3.2. Sắc đồ phân tích phenol trong mẫu cá có thêm chuẩn nồng độ

0,01 µg/g trên GC/MS ................................................................. 40

Hình 3.3. Đường chuẩn phenol xác định trên GC/MS ................................. 40

Hình 3.4. Hiệu suất thu hồi phenol khi sử dụng các loại dung môi chiết

khác nhau ..................................................................................... 41

Hình 3.5. Ảnh hưởng của hóa chất tạo dẫn xuất anhydrit axetic đến hiệu

suất thu hồi phenol ....................................................................... 44

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ K2CO3 đến hiệu suất thu hồi phenol .... 45

Hình 3.7. Sắc đồ phân tích phenol trong cá có thêm chuẩn nồng độ

0,10 mg/kg ................................................................................... 47

Hình 3.8. Hàm lượng Phenol trong các loài cá sống ở tầng mặt ................. 49

Hình 3.9. Hàm lượng Phenol trong các loài cá sống ở tầng đáy ................. 49

f Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

Trong thời đại hội nhập và phát triển hiện nay, xu hướng công nghiệp

hóa và hiện đại hóa đã và đang được phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới.

Nhiều cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật được tiến hành, nhiều ngành công

nghiệp mới ra đời đã góp phần tăng trưởng kinh tế và nâng cao mức sống của

người dân. Tuy nhiên, bên cạnh những thành tựu đã đạt được lại là một vấn đề

lớn về ô nhiễm môi trường.

Các chất ô nhiễm thải vào môi trường mỗi năm ngày càng tăng, đặc biệt

là nước thải không qua xử lý từ các khu công nghiệp xả thải vào môi trường

gây ra những thiệt hại không nhỏ tới hệ sinh thái.

Phenol là chất thải trong quá trình luyện cốc để sản xuất gang thép, trong

công nghiệp hóa chất và hóa dầu, phenol sẽ là nguồn ô nhiễm môi trường

nghiêm trọng, nếu không có phương pháp xử lý phù hợp. Phenol và các dẫn

xuất của phenol là các chất độc hại gây nguy hiểm cho sức khoẻ con người và

hệ sinh thái. Chúng có khả năng tích luỹ trong cơ thể sinh vật và có khả năng

gây nhiễm độc cấp tính, mãn tính cho con người.

Khi xâm nhập vào cơ thể phenol và các hợp chất của phenol gây ra nhiều

tổn thương cho hệ thần kinh, hệ tiêu hóa, hệ hô hấp và tim mạch.

Sự cố môi trường gây hải sản chết hàng loạt tại bốn tỉnh miền Trung từ

Hà Tĩnh đến Thừa Thiên Huế vào tháng 4 năm 2016 đã được Chính phủ công

bố nguyên nhân là do phenol và xyanua. Những hệ lụy của sự cố môi trường

này còn ảnh hưởng lớn tới hệ sinh thái biển và chuỗi thức ăn từ hải sản tại bốn

tỉnh ven biển miền Trung.

Do đó, việc nghiên cứu xác định chính xác hàm lượng phenol trong thực

phẩm là điều quan trọng và đặc biệt cần thiết để đảm bảo chất lượng và an toàn

vệ sinh thực phẩm. Chính vì vậy mà tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định

http://www.lrc.tnu.edu.vn

hàm lượng phenol trong cá biển” 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Mục tiêu của luận văn được đặt ra là:

- Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng phenol trong

mẫu cá biển bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ.

- Ứng dụng quy trình phân tích vừa xây dựng xác định và đánh giá hàm

lượng phenol trong các mẫu cá biển thu được tại Quảng Ninh và Hà Tĩnh.

Luận văn được thực hiện bằng phương pháp thực nghiệm. Các nội dung

chính của luận văn được thực hiện tại Viện Hoá học - Viện Hàn Lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về Phenol

1.1.1. Cấu tạo và tính chất của phenol [1],[2],[3]

Hình 1.1. Một số hình ảnh về phenol

Phenol là một loại hợp chất hữu cơ mà trong phân tử có chứa nhóm

hydroxyl (-OH) liên kết trực tiếp với nhân benzen (nhân thơm). Phenol đơn

chức chứa một nhân thơm, gốc hydrocacbon liên kết vào nhân thơm không có

hay nếu có là gốc no mạch hở CnH2n-7OH (n≥6).

Công thức phân tử: C6H5OH (M = 94đvC)

Hình 1.2. Mô hình phân tử phenol

Phenol đơn giản nhất là C6H5 OH. Tại nhiệt độ phòng, phenol tinh khiết

không màu, trong đục. Nó có thể tồn tại ở trạng thái kết tinh ở dạng bột màu

trắng hay ở trạng thái dung dịch rất đặc (tuy nhiên, trong công nghiệp phenol

http://www.lrc.tnu.edu.vn

3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

được sản xuất ra dưới dạng lỏng). Để lâu trong không khí, phenol tự chảy rữa

(vì hút ẩm tạo thành hyrat, nóng chảy ở 18oC) và nhuốm màu hồng (vì bị oxi

hóa một phần bởi oxi không khí). Phenol có vị ngọt và mùi hắc in. Mùi và vị

của phenol có thể cảm thấy được ở nồng độ thấp hơn nhiều so với mức nồng

độ nó có thể gây ra những tác động có hại (40-50ppb trong không khí, 1-8ppm

trong nước). Một số thông số hóa lý quan trọng của phenol được cho qua bảng

sau:

Bảng 1.1. Tính chất hóa lý của phenol

Thông số Giá trị Nguồn

Điểm nóng chảy (OC) 43 Lide 1993

Điểm sôi (OC) 181,8 Lide 1993

Áp suất hơi tại 25OC (mmHg) 0,3513 HDSB, 1996

3,24 ATSDR Khối lượng riêng ở trạng thái khí (so với không khí)

1,0576 Lide 1993

87 Lide 1993

79 ATSDR

1,7-8,6% Khối lượng riêng tại trạng thái lỏng tại 20OC (so sánh với nước tại 4OC) Độ tan trong nước (g/l) tại 25 OC Nhiệt độ bắt cháy (OC) Giải nồng độ cháy (nồng độ trong không khí)

1,46 HDSB, 1996 Log Kow

Khối lượng phân tử 94,12

Công thức tổng quát C6H6O

Công thức cấu tạo OH

Phenol tan nhiều trong các dung môi hữu cơ như rượu, glycol, dầu mỏ.

Tuy có khả năng tạo liên kết hidro với nước nhưng phenol ít tan trong nước

http://www.lrc.tnu.edu.vn

lạnh (9,5g/100g nước ở 25oC) vì phân tử có gốc thơm -C6H5. Khi đun nóng, độ tan tăng lên và ở trên 70oC phenol tan vô hạn trong nước. Phenol có thể bắt 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

cháy, tuy nhiên, khả năng cháy và phản ứng của phenol kém nên người ta không

cần những thiết bị chuyên trở đặc biệt cho phenol. Phenol là một trong những

hóa chất có tính chất ăn mòn.

Phenol có tính phản ứng kém. Nó chỉ phản ứng với các chất oxy hóa

mạnh, Ca(ClO)2, AlCl3 và các loại axít.

Tên thương mại của phenol (ATSDR, 1998): Phenol có một số tên

thương mại như sau: Carbolic acid; Phenic acid; Phenic alcohol

1.1.2. Một số ứng dụng của Phenol

Bác sĩ Joseph Lister là người tiên phong trong việc sử dụng phenol trong

khử trùng phẫu thuật, mặc dù việc tiếp xúc phenol trong một thời gian dài gây nên

các hiện tượng phỏng da nhưng đặc tính khử trùng của phenol dẫn đến việc thay

thế các phương pháp khử trùng trong phẫu thuật. Đây là một trong những thành

phần chính của chất khử trùng TCP đã được thương mại hóa.

Phenol được dùng để điều chế nhiều sản phẩm như aspirin làm giảm đau,

hạ nhiệt, phòng và chữa huyết khối; axit salicylic làm thuốc giảm đau, hạ nhiệt,

chống viêm, metyl salicylic (làm giảm đau trong các chứng viêm thấp khớp,

đau cơ).

Phenol sử dụng để điều chế được phẩm nhuộm, chất dẻo (nhựa bakelite

là một hỗn hợp của phenol-formandehyde…), tơ tổng hợp (nylon - 6,6…),

thuốc diệt cỏ, thuốc nổ (axit picric), thuốc diệt nấm mốc ….

Phenol có thể dùng trực tiếp làm chất sát trùng, tẩy uế…(như phenol

được cho vào hồ tinh bột làm keo dán giấy để bảo quản hồ tinh bột lâu hỏng,

nhờ tính sát trùng của phenol).

1.1.3. Nguồn gốc và độc tính của Phenol

1.1.3.1. Nguồn gốc phát sinh [4], [5], [6]

Phenol có nguồn gốc cả từ tự nhiên và nhân tạo. Trong tự nhiên, phenol

tồn tại trong một số loại thực phẩm, trong chất thải của con người và động vật

và là sản phẩm của một số quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ, tuy nhiên,

lượng này không lớn.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Phenol được chiết xuất ra trong quá trình chưng cất than dầu lần đầu

tiên vào năm 1834 và có tên là axit cabolic. Đây cũng là phương pháp chính

dùng để sản xuất phenol cho tới Chiến tranh thế giới lần thứ nhất. Sau đó

phenol còn có thể được điều chế nhờ quá trình sulfonat hóa benzen và thủy

ngân sulfonate. Phenol xếp trong nhóm 50 loại hóa chất được sản xuất nhiều

tại Mỹ. Phenol và các dẫn xuất phenol có trong nước thải của một số ngành

công nghiệp như than cốc, lọc hóa dầu, sản xuất bột giấy, nhuộm… Hầu hết

các hợp chất Phenol khi được thải rửa từ cá nhà máy đều đi vào môi trường

nước. Các hợp chất loại này làm cho nước có mùi lạ, có màu, gây độc đối

với các loài động thực vật sống trong nước, có hại đối với sức khỏe con người.

1.1.3.2. Độc tính của Phenol [1],[7],[8]

a. Ảnh hưởng đến hệ sinh vật [1],[7]

Các kết quả nghiên cứu cho thấy phenol có một số độc tính như sau:

- Phenol là một độc chất với nồng độ 64mg/l được coi là ngưỡng khó có

thể tìm thấy vi khuẩn.

- Phenol rất độc đối với sinh vật nước sạch. LC50 của phenol đối với cá

nằm trong khoảng từ 7,5-56 mg/L. LC50 của phenol đối với cá rô phi là 25mg/L.

Đối với cá Zebra, LC50 là 24,9ppm sau 96 giờ (Razani và cộng sự 1986). Theo

nghiên cứu của Post (1987), tính độc của phenol là khác nhau giữa các loài cá

và các môi trường nuôi khác nhau,trong nghiên cứu này, dấu hiệu cá bị phơi

nhiễm phenol ở liều lượng 1/10 LC50(2,5mg/L) biểu hiện ở suy thoái hệ thần

kinh và hệ hô hấp. Sau 12 tuần, tỉ lệ chết là 8%. Albaster và Lioyd (1982) cho

thấy, cá bị phơi nhiễm phenol ở nồng độ thấp trong thời gian dài biểu hiện tình

trạng hoại tử tất cả các mô, có thể do sự thay đổi trong chuyển hóa protein.

Trong nghiên cứu này, sự thay đổi có thể thấy được bằng mắt thường ở

http://www.lrc.tnu.edu.vn

cá bị phơi nhiễm phenol tuần đầu tiên (liều lượng 1/10 LC50 là sự phá hủy mang 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

và màng não với sự tổn thương ở vây và đuôi. Sau 2 tuần phơi nhiễm, nước

nhầy phủ kín da và mang cá. Sau 8 tuần, cá phơi nhiễm phenol có mang, thận

và gan nhạt màu so với bình thường. Sau 12 tuần, cá giảm khối lượng và da bị

đổi màu. Các kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu cuả Waluga

(1966-a) và Mohamed và cộng sự (2002).

Tồn dư phenol trong cá có thể dẫn đến nguy cơ ung thư dạ dày đối với

người tiêu dùng (Ohshima và cộng sự 1989).

- Các dữ liệu liên quan đến ảnh hưởng của phenol đối với những sinh vật

cạn rất khó tìm thấy, EC50 trong vòng 120 giờ đối với cây kê là khoảng 120 -

170mg/l.

b. Ảnh hưởng đến hệ động vật [1],[7]

Phenol có độc tính cao đối với động vật có vú. LC50 qua đường miệng

đối với loài gặm nhấm khoảng 300 - 600mg/kg trọng lượng cơ thể, trong khi

LC50 qua da đối với chuột và thỏ khoảng 670 - 1400mg/kg trọng lượng cơ

thể, LC50 đối với chuột trong vòng 8 giờ khoảng 900mg/m3 [19]. Những triệu

chứng lâm sàng sau khi tiếp xúc trong thời gian ngắn là thần kinh rất dễ bị

kích động, hủy hoại da và màng nhầy. Ngoài ra còn ảnh hưởng đến phổi,

thận và gan.

Các nghiên cứu trên động vật trong thời gian ngắn cho thấy ảnh hưởng

độc tính của phenol đối với chuột với liều tiếp xúc qua da khoảng 40mg/kg cân

nặng mỗi ngày. Trong giới hạn 14 ngày thì liều tiếp xúc qua da khoảng 12mg/kg

cân nặng đã gây ảnh hưởng đến thận. Ngoài ra phenol còn ảnh hưởng đến hệ

thông tin gian bào.

Dung dịch phenol có tính ăn mòn đối với da và mắt, trong khi đó hơi

phenol có thể gây kích thích hệ hô hấp.

c. Ảnh hưởng đến sức khỏe con người [4],[5],[9]

http://www.lrc.tnu.edu.vn

7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Tùy thuộc vào cách thức, con đường xâm nhập vào cơ thể (xâm nhập

theo đường ăn uống, hệ hô hấp hay tiếp xúc qua da; nồng độ phenol lớn hay

nhỏ, thời gian tiếp xúc dài hay ngắn …) mà phenol thể hiện những tác động

khác nhau tới sức khỏe của con người.

Những ảnh hưởng chính của phenol đối với cơ thể con người gồm các

tác động đến tim, gây đau hệ hô hấp, gây nhiễm acid trong quá trình trao đổi

chất, hỏng thận, sự tuần hoàn máu, ảnh hưởng hệ thần kinh, gây sốc, hôn mê

và có thể gây tử vong. Liều thấp nhất có thể gây tử vong bằng đường tiêu hóa

là khoảng 4,8g và trong thời gian không quá 19 phút.

Những triệu chứng do hít phải hơi phenol như chán ăn, giảm cân, nhức

đầu, chóng mặt, chảy nước dãi, gây nhiễm acid và nước tiểu đục. Chưa có

trường hợp nào chết do hít phải hơi phenol được ghi nhận.

Ngưỡng gây mùi ở trong không khí khoảng 0,021 - 20mg/m3 , trong khi

ngưỡng gây mùi ở trong nước khoảng 7,9 mg/m3. Giá trị ngưỡng đề nghị để có

thể nếm khoảng 0,3mg/l.

Khả năng gây ung thư của phenol: hiện nay chưa có một nghiên cứu cụ

thể nào chỉ ra rằng phenol có khả năng gây ra ung thư ở người. Tuy nhiên, kết

quả nghiên cứu khi cho động vật thường xuyên ăn thức ăn có chứa phenol ở

hàm lượng cho phép chỉ ra rằng: Ở động vật đó xuất hiện các khối u hoặc các

chất gây bệnh ung thư da. EPA (Environmental Protection Agency) đã xếp

phenol vào nhóm D, nhóm có khả năng gây bệnh ung thư ở người.

Chính vì các độc tính trên mà phenol có tác động rất lớn đến môi trường.

Tình trạng ô nhiễm phenol trong không khí, nước thải và trong đất có thể gây

ảnh hưởng đến hệ sinh thái và ở hàm lượng cao có thể tiêu diệt toàn bộ hệ sinh

thái.

1.1.4. Sự tồn tại và chuyển hóa của phenol trong môi trường [6]

Với nguồn phát thải có thải lượng và tần suất nhỏ, phenol không tồn tại

được lâu trong môi trường không khí. Thông thường, chu kỳ bán hủy của

phenol trong môi trường nhỏ hơn 1 ngày. Khả năng tồn tại trong môi trường

http://www.lrc.tnu.edu.vn

8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

đất cũng không lớn (từ 2-5 ngày). Khả năng tồn tại của phenol trong môi trường

nước lớn hơn (khoảng 9 ngày). Tuy nhiên, với lượng phát thải lớn và tần suất

phát thải cao, phenol có khả năng tồn tại trong môi trường (đất, nước và không

khí) với thời gian lâu hơn.

Nồng độ của phenol trong nước mặt, không khí xung quanh, và trong đất

ở mức cao hơn mức nền thường xuất hiện gần những nơi có nguồn phát thải

phenol (các khu công nghiệp, thương mại có sử dụng hoặc sản xuất phenol).

Phenol cũng có thể tìm thấy tại những bãi chôn lấp và xử lý chất thải nguy hại,

đặc biệt là trong nước ngầm gần những bãi chôn lấp này.

Nồng độ phenol tồn tại ở môi trường không khí trong nhà chủ yếu có

nguồn gốc từ khói thuốc lá (nồng độ phenol trong nhà thường < 100 ppb). Ngoài

ra, một lượng nhỏ phenol cũng được tìm thấy trong các cơ thể sống trong môi

trường nước có nhiễm bẩn phenol ở nồng độ thấp.

1.1.4.1. Khả năng lan truyền của phenol ở trong môi trường

Trong môi trường khí:

Phenol được đưa vào môi trường không khí và nước mặt từ các quá trình

sản xuất và sử dụng, do có độ hòa tan khá cao trong nước nên một phần không

nhỏ phenol trong không khí đi theo nước mưa (quá trình lắng ướt) vào nước

mặt và đất.Trong khí quyển, phenol tham gia phản ứng quang hóa với gốc tự

do OH*, gốc peroxyl, gốc nitrat… nên nồng độ và thời gian tồn tại trong không

khí của phenol không lớn, do đó khả năng lan truyền của phenol trong không

khí không lớn.

Trong đất:

Hàm lượng phenol không lớn (6.1 ppb tính theo chất khô -EPA 1998b).

Nguyên nhân chủ yếu là do hệ số hấp phụ của phenol trong đất chỉ ở mức trung

bình (1.21 -1.96) và khả năng phân hủy sinh học của phenol trong đất nhanh.

Một phần phenol trong đất đi vào mạch nước ngầm và gây ô nhiễm mạch nước

ngầm. Hiện tượng này xảy ra phổ biến với các mạch nước ngầm gần các bãi

chôn lấp chất thải nguy hại, đặc biệt là các bãi chôn lấp cũ, không đảm bảo các

tiêu chuẩn kỹ thuật.

Trong môi trường nước:

http://www.lrc.tnu.edu.vn

9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Phenol cũng tham gia vào các phản ứng quang hóa với một số gốc tự do

như OH*, peroxyl… với hệ số phân ly pKa = 9,686 (tại 20OC), phenol thường

tồn tại ở trạng thái phân ly trong môi trường nước và đất có độ ẩm cao. Do đó,

pH của môi trường cũng đóng một vai trò quan trọng đối với quá trình vận

chuyển của phenol.

Trong cơ thể sống:

Phenol không được xếp vào các chất có khả năng tích lũy sinh học. Tuy

nhiên, chúng ta vẫn có thể thấy một lượng rất nhỏ phenol trong cơ thể các sinh

vật thủy sinh sống tại những vùng nước bị ô nhiễm phenol.

Trong cá vàng: BCF (log bioconcentration factor) = 0,28 (Kobayashi 1979)

Hàm lượng phenol trong cá có mức cao nhất được quan sát thấy ở các

loài cá sống ở lớp đáy ở Vịnh Commencement ở Tacoma, WA, là 0,14 ppm

(Nicola 1987).

1.1.4.2. Quá trình biến đổi và phân hủy của phenol ở trong môi trường

Trong môi trường không khí

Do phenol có khả năng hấp thu các tia sáng trong vùng từ 290-330 nm

(Sadtler 1960), nên nó bị phân hủy quang học khi tồn tại trong môi trường.

Phản ứng quang hóa của phenol với các gốc OH* là một trong những cơ chế

quan trọng. hằng số bán hủy của phenol trong phản ứng này là 0,61 ngày

(Hendry và Kenley, 1979).

Ngoài ra, vào thời điểm ban đêm, phenol còn tham gia phản ứng mạnh

với các gốc nitrat tự do. Hằng số vận tốc của phản ứng k =3.8*10-2 cm3/mol.s,

nếu theo hằng số này thì thời gian bán hủy của phenol trong môi trường không

khí chỉ là 15 phút khi nồng độ các gốc tự do nitrat trong không khí là 2*108

radical/cm3 (Atkinson, 1987).

Những số liệu trên cho thấy, khả năng tồn tại của phenol trong môi

trường không khí là rất ngắn, nhỏ hơn 1 ngày.

Trong môi trường nước

http://www.lrc.tnu.edu.vn

10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Tương tự với môi trường không khí, trong nước mặt, phenol cũng có khả

năng hấp thụ các tia năng lượng nằm trong giải bước ống từ 290-330 nm, do đó

phenol cũng có khả năng bị phân hủy trực tiếp bởi các phản ứng quang hóa.

Trong điều kiện có nhiều ánh nắng, phenol tham gia phản ứng với các gốc

hydroxyl, gốc peroxyt tự do (sinh ra từ các phản ứng quang hóa). Chu kì bán

hủy của phenol nếu tham gia phản ứng này là 19,2 giờ (trong điều kiện có ánh

sáng mặt trời) (Mill và Mabey, 1985). Ngoài ra, phenol còn tham gia phản ứng

với oxy nguyên tử, oxy nguyên tử được sinh ra từ các phản ứng quang hóa.

Phenol cũng tham gia phản ứng với ozone. Mặc dù nồng độ của các thành phần

sinh ra từ các phản ứng quang hóa không lớn nhưng do đặc tính hoạt động hóa

học rất mạnh nên chúng đóng góp một phần đáng kể vào việc làm suy giảm

nồng độ phenol trong môi trường nước mặt.

Tại nồng độ không quá cao, nồng độ không làm ức chế hoạt động của

các vi sinh vật, phenol còn được phân hủy trong môi trường nước tự nhiên theo

cơ chế phân hủy sinh học. Tuy nhiên, quá trình này còn phụ thuộc nhiều vào

khu hệ sinh vật, nồng độ các chất hữu cơ và vô cơ có sẵn trong tự nhiên.

Theo các nghiên cứu của Ludzach và Ettinger (1960), phenol sẽ bị loại

bỏ hoàn toàn sau 2 ngày (nếu nhiệt độ là 20OC) và sau 4 ngày (nếu nhiệt độ là

4OC). Tuy nhiên, quá trình phân hủy của phenol lại phụ thuộc rất nhiều vào

nồng độ muối, theo các nghiên cứu của Lee và Rya (1979), thời gian bán hủy

của phenol tại các cửa sông là 9 ngày.

Tại nồng độ thấp, phenol có thể bị phân hủy và chuyển hóa nhanh chóng

trong môi trường. tuy nhiên, tại nồng độ cao, do có khả năng ức chế hoạt động

của các vi sinh vật, nên phenol sẽ bị phân hủy chậm đi và thể hiện tính độc

mạnh hơn với môi trường.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Trong môi trường đất và trầm tích 11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Những số liệu hiện có cho thấy, phenol có khả năng phân hủy sinh học

ở điều kiện yếm khí và hiếu khí trong môi trường đất. Thời gian bán hủy của

phenol thường nhỏ hơn 5 ngày (baker và Mayfield 1980, HSDB 1998). Tuy

nhiên, trong đất axit và một vài loại đất trên bề mặt, thời gian bán hủy của

phenol dài hơn, khoảng từ 20-25 ngày (HSDB 1998).

Với nồng độ thấp, thời gian bán hủy của phenol trong bùn đất phù sa chỉ

có 2,7 - 3,51 giờ (Scott 1983).

Thực vật cũng có thể chuyển hóa một phần phenol nhờ quá trình trao đổi

chất của chúng (Cataldo 1987).

Phenol ít có khả năng hấp thụ vào các cặn lắng (HSDB 1998).

1.2. Các phương pháp để xác định phenol

1.2.1. Các phương pháp sắc ký

Sắc ký là một kỹ thuật tách những hỗn hợp gồm nhiều chất thành các

thành phần đơn giản và định lượng từng chất.

Dựa vào ái lực của các cấu tử với pha động và pha tĩnh. Pha động có thể là

chất lỏng hoặc khí có tác dụng lôi kéo các chất cần tách di chuyển trong cột sắc ký

có chứa pha tĩnh. Pha tĩnh là chất được phủ trên bề mặt trong của cột mao quản hoặc

là những hạt nhỏ được nhồi vào cột có tác dụng giữ chất cần phân tích ở lại.

Để tách được các chất từ một hỗn hợp cần có sự tác động của cả pha tĩnh

và pha động. Sự tác động này đối với từng chất khác nhau do đó chất cần phân

tích có thể ra nhanh hay chậm. Ngoài ra cột sắc ký phải đủ dài để sự tiếp xúc

giữa chất cần xác định và pha tĩnh được lặp lại nhiều lần. Quá trình di chuyển

của pha động bên trong cột sắc ký gọi là quá trình rửa giải.

1.2.1.1. Phương pháp sắc ký khí

Phương pháp sắc kí khí (GC) được thực hiện trên cơ sở tương tác phân bố

các chất trên hai pha tĩnh và động. Có hai loại sắc kí khí là sắc ký khí - lỏng và sắc

ký khí - rắn. Mẫu được bơm vào buồng mẫu có nhiệt độ cao đủ để mẫu có thể hóa

hơi mà không bị phân hủy chất. Khí mang đưa các chất phân tích vào cột tách. Tại

http://www.lrc.tnu.edu.vn

12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

đây xảy ra quá trình tương tác khác nhau giữa chất phân tích với pha tĩnh dẫn đến

thời gian lưu của các chất trên pha tĩnh cũng sẽ khác nhau. Các cấu tử do đó sẽ lần

lượt ra khỏi cột và đi vào detector tại các thời điểm khác nhau và detectơ sẽ cho

tín hiệu khi có mặt một chất hoặc một nhóm chức nào đó. Tín hiệu mà detectơ ghi

nhận có cường độ tỷ lệ với nồng độ chất có trong mẫu

a. Phương pháp sắc ký dùng dectector FID [11]

Đây là detector vạn năng, nhạy với hầu hết các hợp chất hữu cơ. Việc

định danh các cấu phần trong mẫu chỉ đơn thuần dựa trên giá trị thời gian lưu

và như vậy để có thể định danh đúng cần thiết phải thực hiện nhiều lần theo các

thông số kỹ thuật thay đổi. Thông thường thống số về độ phân cực của pha tĩnh

khác nhau được chọn làm yếu tố khảo sát sự trùng lặp về mặt thời gian lưu của

cấu tử trong mẫu chuẩn và mẫu phân tích. Đôi khi việc khảo sát còn dựa trên

hệ số đáp ứng (RF) của cấu tử trên 2 loại detector khác nhau vì về mặt nguyên

tắc trong cùng điều kiện xác định thì RF của một số hợp chất sẽ không đổi trên

1/RFi

2 sẽ là hằng số (RFi

1, RFi

2 là hệ số đáp ứng

một loại detector tức là tỉ số RFi

trên detector 1 và detector 2 của cấu tử i).

Nguyên tắc: Phenol được chiết bằng dung môi methylene chloride trong

môi trường acid H2SO4 có pH bằng 1-2, sau đó chuyển phần chiết này sang

dung môi 2-propanol.

Điều kiện phân tích: Cột Supelcoport (80/100mesh) có phủ 1% SP-

1240DA, kích thước cột: 1,8m x 2mm, khí mang: N2, tốc độ: 30ml/phút,

chương trình nhiệt: Tinjection = 80oC, tăng 8oC/phút cho tới 150oC, đầu dò: FID

(ion hóa ngọn lửa).

Giới hạn phát hiện: LOD = 7,4𝜇g/l đối với phenol.

b. Phương pháp sắc ký dùng detector khối phổ (MS).

Ngoài yếu tố thời gian lưu như trong phương pháp sắc ký dùng detector

FID, việc sử dụng detector MS còn cung cấp thêm thông tin quan trọng khác

cho việc định danh là khối phổ của hợp chất phân tích, điều này giúp xác nhận

http://www.lrc.tnu.edu.vn

13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

chính xác đối tượng phân tích. Một lợi điểm quan trọng khác là trường hợp có

sự trùng lặp một phần hoặc toàn phần của hai hay nhiều peak được rửa giải ra

khỏi cột, thì việc chọn lại mảnh ion có thể giúp ta xác nhận lại hợp chất cần xác

định và đồng thời cho phép định lượng được chúng. Trên cùng một ý nghĩa như

vậy, kỹ thuật mảnh ion chọn lọc (SIM) là kỹ thuật được thiết kế sẵn trên detector

MS ngoài việc chọn lọc riêng ra đối tượng cần phân tích mà còn cho phép nâng

cao độ nhạy lên nhiều lần giúp cho việc xác định có thể thực hiện được ở hàm

lượng rất nhỏ cỡ ppb.

c. Phương pháp sắc ký dùng đầu dò cộng kết điện tử ECD [10]

Nguyên tắc: Phenol được chiết bằng dung môi methylene chloride trong

môi trường acid H2SO4 có pH bằng 1-2, sau đó chuyển phần chiết này sang

dung môi 2-propanol.

Do peak sắc ký sẽ bị kéo đuôi nên người ta phải khắc phục bằng cách tạo

dẫn xuất với pentafluorobenzyl bromide.

Điều kiện phân tích: Cột Chromosorb W-AW-DMCS (80/100 mesh)

có phủ 5% OV, kích thước cột: 1,8m x 2,5mm, khí mang: 5% methane/ 95%

Argon, tốc độ: 30ml/phút, nhiệt độ cột: giữ nhiệt độ không đổi ở 200oC, đầu

dò: ECD.

Giới hạn phát hiện: LOD = 2,2 𝜇g/l đối với phenol.

1.2.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng HPLC

a. Phương pháp sắc kí lỏng với đầu dò khối phổ

Các hợp chất Phenol thường được xác định bằng phương pháp sắc kí

lỏng hiệu năng cao theo cơ chế sắc kí phân bố pha đảo. 15 hợp chất họ Phenol

trong nước và bùn được xác định bằng phương pháp LC-MS ở chế độ ion hóa

tại áp suất thường (APCI) dưới dạng ion âm. Với chương trình gradient dòng

thích hợp cho pha động gồm methanol, acetonitrin. Acid acetic 0,005%, việc

tách và định lượng đồng thời 15 hợp chất Phenol được tiến hành ở chế độ quét

http://www.lrc.tnu.edu.vn

chọn lọc ion (SIM). Phương pháp này có ưu điểm là cho phép nhận danh chính 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

xác hợp chất Phenol nhờ đầu dò khối phổ, giới hạn phát hiện thấp trong khoảng

từ 10-50mg/l.

Tuy nhiên thiết bị phân tích lại đắt tiền.

b. Phương pháp sắc kí lỏng với đầu dò UV [11]

Theo phương pháp này, clo tự do trong mẫu được loại bỏ bằng Na2SO3,

sau đó acid hóa mẫu bằng HNO3 đến pH = 2 và làm giàu mẫu bằng quy trình

chiết rắn - lỏng, sử dụng cột C18 pha đảo.

Điều kiện phân tích: Cột C18 (5-𝜇m Spherisorb ODS-2), kích thước cột:

250x4mm; nhiệt độ cột 40oC; tốc độ: 0,8ml/phút; Gradient: 0 phút 35%

methanol, 10 phút 40% methanol, 25 phút 80% methanol; pha động: nước -

methanol; đầu dò: UV; bước song 280nm.

Ngưỡng phát hiện: đặc tính của đầu dò UV có độ nhạy khá cao và không phá

hủy mẫu nên ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 5𝜇g/l đối với phenol.

c. Phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò điện hóa[12]

Đầu dò điện hóa là một trong những đầu dò rất chọn lọc do mỗi chất có khả

năng oxi hóa hoặc khử tại mỗi thế khác nhau. Đầu dò điện hóa được ứng dụng rộng

rãi vì chúng đơn giản, không đắt tiền. Tuy nhiên chúng có khuyết điểm là khó sử

dụng, thời gian cân bằng rất dài, nhạy đối với tốc độ dòng và pH. Bề mặt điện cực dễ

bị nhiễm bẩn nên cần hoạt hóa lại điện cực sau một thời gian ngắn sử dụng.

Nguyên tắc hoạt động của đầu dò điện hóa là tại một giá trị thế áp thích

hợp, quá trình oxi hóa hay khử của chất điện hoạt tại bề mặt điện cực làm việc

sẽ sinh ra dòng điện. Dòng điện đó được sử dụng như tín hiệu phân tích và tín

hiệu tỷ lệ trực tiếp với nồng độ chất điện hoạt đi qua đầu dò. Dòng điện sinh ra

trong pin điện hóa được tính theo định luật Faraday: Q = nFN

Q: Số Coulomb

N: Số điện tử bị mất đi hoặc nhận được

F: 96500C/ 1 mol electron

Đầu dò điện hóa gồm ba điện cực: điện cực chỉ thị, điện cực so sánh, điện

http://www.lrc.tnu.edu.vn

15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

cực hỗ trợ. Thế làm việc được đo giữa điện cực chỉ thị và điện cực so sánh.

Điều kiện chạy trên HPLC/EC tương tự như trên HPLC/UV, các thông

số liên quan đến đầu dò EC như sau: điện thế đầu dò: 1000mV, pha động nghịch

đảo: nước - methanol = 3 : 1, đầu dò: EC, điện cực so sánh: Ag/AgCl, điện cực

chỉ thị: carbon thủy tinh.

Ngưỡng phát hiện: đầu dò EC có độ nhạy cao nên ngưỡng phá hiện của

phương pháp là 0,05𝜇g/l đối với phenol.

1.2.2. Phương pháp trắc quang 1.2.2.1. Phương pháp trắc quang sử dụng thuốc thử 4-amionantipyrin [10],[13],[14]

Nguyên tắc: Tách hợp chất Phenol ra khỏi tạp chất và chất bảo quản mẫu

bằng chưng cất. Cho các hợp chất phenol sau khi chưng cất được phản ứng với

4-amionantipyrin ở pH = 10 khi có mặt kali hexacyanoferat (III) để tạo phẩm

màu với antipyrin.

- Đo độ hấp thu của dung dịch phẩm màu trực tiếp trong pha nước ở

bước song 510nm [13]

- Dùng chloroform chiết rồi đo độ hấp thu trong lớp dung môi ở bước

song 460nm [13]

- Tách phẩm màu bằng cách cho qua cột trao đổi ion [10]

Giới hạn phát hiện: Nếu đó trực tiếp trong pha nước thì giới hạn phát

hiện của phương pháp LOD = 0,1mg/l và LOD = 0,002mg/l khi chiết phần mẫu

thử bằng chloroform.

1.2.2.2. Phương pháp trắc quang sử dụng thuốc thử natri nitroprusside [15]

Nguyên tắc: Trong môi trường pH = 12, các hợp chất phenol phản ứng với

natri nitroprusside {Na2[Fe(CN)5NO].2H2O} và hydroxylamine hydrochloride tạo

thành phẩm màu có bước sóng hấp thu cực đại tại 700nm. Khoảng nồng độ

tuyến tính tuân theo định luật Lambert - Beer là 0,05 - 5,0mg/l với hệ số hấp

thu phân tử là 1,23x104 mol.l-1.cm-1.

Phương pháp này tương đối nhanh và nhạy nhưng nồng độ thiểu có thể

phát hiện được của phương pháp này là 0,005mg/l, do đó không thể áp dụng

http://www.lrc.tnu.edu.vn

16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

phương pháp này để xác định phenol trong các mẫu có hàm lượng phenol nhỏ

hơn 0,001mg/l.

1.2.2.3. Phương pháp tiêm dòng chảy (FIA) sử dụng thuốc thử 4-aminophenol

(PAP) [12],[16],[17]

Nguyên tắc chung: Trong môi trường kiềm với sự có mặt chất oxi hóa

mạnh KIO4, phenol sẽ phản ứng với p-aminophenol tạo thành phẩm màu theo

phản ứng sau:

Phẩm màu tạo thành giữa phenol với PAP được đo cường độ hấp thu quang

tại 626nm sau 45 phút cho phenol theo kỹ thuật tiêm dòng chảy gián đoạn.

Khoảng nồng độ tuân theo định luật Beer của phenol là 0,6 - 20mg/l với

giá trị LOD = 64ng/ml [16].

1.2.3. Phương pháp phát quang hóa học [18]

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng của các hợp chất phenol có thể làm tắt sự

phát quang hóa học của p-chlorobenzendiazonium fluoroborat (p-CBDA) trong

môi trường H2O2 - kiềm.

Cơ chế của phản ứng tắt phát quang hóa học:

http://www.lrc.tnu.edu.vn

17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Phản ứng của hệ phenol-p-CBDA-H2O2 được biểu diễn ở phương trình

(1) và (2). Phản ứng (1) là một phản ứng phát quang hóa học mới nên cơ chế

của nó không được nghiên cứu trước đây. Phản ứng giữa p-CBDA và H2O2

tạo ra sự phát quang mạnh trong môi trường kiềm. Phản ứng (2) là một phản

ứng ghép cặp giữa p-CBDA và các hợp chất phenol để tạo ra các hợp chất azo

không phát quang và dập tắt sự phát quang hóa học của phản ứng (1). Khi

nồng độ các hợp chất phenol tang lên thì cường độ phát quang hóa học của p-

CBDA cũng giảm theo mối quan hệ tuyến tính. Đây chính là cơ sở để định

lượng phenol.

Phương pháp này được sủ dụng để xác định phenol dễ bay hơi trong nước

thải. Giới hạn phát hiện đối với phenol là 0,015𝜇g/ml. Sai số tương đối của

phương pháp này là 3% cho 1𝜇g/ml phenol.

1.2.4. Phương pháp huỳnh quang [4],[19]

Huỳnh quang là một dạng phát quang của phân tử trong đó sự phát xạ

khi chuyển từ trạng thái kích thích về trạng thái cơ bản xảy ra trong thời gian

khoảng 1 nano giây đến 1 micro giây kể từ khi được kích thích bằng một tia

nhất cấp. Giới hạn phát hiện đạt cỡ 𝜇g/l và thấp hơn.

Qua tham khảo một số tài liệu [1], [10] cho thấy người ta đã ứng dụng

phương pháp huỳnh quang phân tử để xác định rất nhiều hợp chất hữu cơ trong

đó phenol có giới hạn phát hiện đạt được là LOD = 0,220𝜇g/l.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

1.3. Phương pháp phân tích xác định Phenol trong luận văn

Như đã đề cập ở trên, có nhiều phương pháp được sử dụng để phân tích

xác định phenol. Trong luận văn này tôi sử dụng phương pháp sắc ký khí đầu

dò khối phổ (GC-MS), phương pháp này có độ chọn lọc và độ nhạy cao, cho

phép xác định được chất cần phân tích ở hàm lượng rất nhỏ.

1.3.1. Hệ thống máy sắc ký khí (GC) [2],[3],[8],[25]

1.3.1.1. Cơ sở lý thuyết

Sắc ký khí là phương pháp phân tách trong đó pha động là khí trơ (còn

gọi là khí mang) và pha tĩnh là chất rắn (hoặc một lớp phim mỏng được phủ lên

chất mang rắn) được phủ lên bề mặt trong của cột sắc ký. Phương pháp sắc kí

khí dùng để phân tích các chất có khả năng bay hơi.

Dung dịch mẫu thử sau khi tiêm vào máy sẽ được hóa hơi. Đám hơi này

được thu hồi vào dòng khí mang và chuyển tới lò cột. Sự tương tác hấp phụ

giữa các thành phần hóa học trong lòng khí (cả khí mang lẫn đám hơi mẫu thử)

với pha tĩnh sẽ quyết định sự phân tách các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp.

Những chất có sự tương tác khác nhau sẽ có thời gian lưu trong cột khác nhau,

đây là một trong các yếu tố giúp nhận danh chất phân tích (kết hợp so sánh thời

gian lưu với đường chuẩn của cùng chất phân tích). Sau khi ra khỏi cột, chất

phân tích sẽ được đưa tới đầu dò.

Tại đây, bộ phận xử lý tín hiệu sẽ ghi nhận nồng độ chất phân tích dưới

dạng các tín hiệu (tùy vào từng loại đầu dò mà phương pháp ghi nhận tín hiệu

sẽ khác nhau).

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.3. Minh họa sơ đồ hệ thống máy GC Model 6980N, HP 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

1.3.1.2. Thành phần

- Nguồn khí (bình chứa dung môi pha động): nơi chứa hơi pha động (khí

trơ, không tương tác với chất phân tích trong mẫu).

- Thiết bị đầu vào: bộ phận bơm mẫu (auto sampler) sẽ đưa mẫu vào thiết

bị hóa hơi. Tại đây, dung dịch mẫu sẽ được hóa hơi và chuyển vào dòng hơi

pha động (khí trơ) để đưa đến cột.

- Lò cột: tại đây, các chất phân tích khác nhau có trong mẫu được phân

tách dựa trên sự khác biệt về sự tương tác đối với pha tĩnh (dạng lỏng, được

phủ lên bề mặt chất mang rắn)

- Đầu dò: xác định và đo lường nồng độ chất phân tích dựa trên tín hiệu

của nó (loại tín hiệu tùy thuộc vào loại đầu dò và phương pháp phân tích).

Hình 1.4. Sơ đồ hệ thống máy sắc ký khí

1.3.2. Đầu dò khối phổ (MS)

1.3.2.1. Nguyên tắc hoạt động

Sử dụng sự khác biệt trong tỉ lệ m/z của các ion nguyên tử hoặc phân tử

để phân tách chúng. Vì thế, phương pháp khối phổ cho phép định lượng các

nguyên tử hoặc phân tử và cung cấp thông tin cấu trúc bằng cách nhận dạng

các phân mảnh đặc trưng.

1.3.2.2. Thành phần, thiết bị

- Bơm chân không: giúp giảm áp suất dòng khí sau khi ra khỏi cột qua 2

http://www.lrc.tnu.edu.vn

giai đoạn. 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

- Giao diện và nguồn ion: chuyển mẫu từ hệ thống sắc kí khí qua đầu dò

khối phổ mà không trộn lẫn các chất phân tích (riêng biệt với nhau). Ngoài ra

nó còn giúp cô đặc, tăng nồng độ các chất phân tích và giảm áp suất bằng cách

hóa hơi dung môi (hoặc đuổi khí mang). Sau đó, nguồn ion sẽ ion hóa chất phân

tích và chuyển các ion đó đến bộ phận phân tích khối lượng.

- Thiết bị phân tích khối lượng: tác dụng của bộ phận này là phân tách

các mảnh ion có m/z khác nhau trong môi trường chân không để đưa đến thiết

bị xử lý tín hiệu.

- Thiết bị xử lý tín hiệu: thiết bị này ghi nhận cường độ các mảnh ion

cũng như tỉ lệ m/z của các ion riêng biệt.

1.3.2.3. Cơ chế hoạt động

Sau khi ra khỏi cột phân tách sắc kí, chất phân tích sẽ ion hóa và chuyển

thành dạng những mảnh ion hóa với khối lượng nhỏ hơn khối lượng phân tử

ban đầu. Sau đó, những mảnh ion này sẽ được đưa qua thiết bị phân tích khối

lượng (mass analyzer), việc phân tách các mảnh ion khác nhau tùy thuộc vào tỉ

lệ m/z của chúng. Cuối cùng, những mảnh ion này sẽ đưa tới đầu dò và tín hiệu

chất phân tích sẽ được hệ thống máy xử lý.

Theo mô tả cơ chế hoạt động nêu trên, bước quan trọng nhất là bước ion

hóa và phân tích khối.

Các kỹ thuật ion hóa cơ bản ứng dụng phù hợp với GC bao gồm:

- Kỹ thuật ion hóa bằng va chạm electron (Electron Impact/Ionization - EI)

Kỹ thuật va chạm bằng electron (EI) là phương pháp ion hóa căn bản

trong phổ khối lượng và được sử dụng rộng rãi nhất trong tất cả các kỹ thuật

ion hóa. Trong kỹ thuật này, mẫu được đưa vào nguồn ion được bơm ở áp suất

10-5 - 10-7 mmHg. Năng lượng e bắn phá nằm trong khoảng 10 - 100eV (thông

thường năng lượng dòng e- khoảng 70eV). Khi có sự va chạm của 1 phân tử

trung hoà M và 1 e bắn phá thì thông thường có 2 quá trình xảy ra:

http://www.lrc.tnu.edu.vn

21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

- Một e- sẽ bị bật khỏi hợp chất và tạo nên cation.

M + e  [M]+ + 2e

- Một e- bị phân tử trung hòa thu lấy tạo ra một anion.

M + e  [M]-

Trong khối phổ EI thế áp đặt là 70eV không những đủ để ion hóa (đánh

bật một e- ra khỏi phân tử) mà còn có đủ năng lượng cho sự phân mảnh tiếp tục

các ion phân tử tạo nên các ion có khối lượng bé hơn.

[M]+  A+ + B

[M]+  A+ + D

A+ là cation electron chẵn

B là gốc

A+ là gốc cation

D là phân tử trung hòa.

Các phân mảnh cũng được chia làm hai kiểu là phân mảnh đơn và chuyển

vị, chuyển vị thường xảy ra là chuyển vị McLafferty.

Quá trình phân mảnh bằng kỹ thuật EI phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ và

năng lượng của nguồn ion hóa. Năng lượng ion hóa dao động từ 0 đến hơn

100eV, thực nghiệm trên các thiết bị cho thấy phổ chuẩn thu được số mảnh ion

tối đa thường đạt ở 70eV [7].

- Kỹ thuật ion hóa bằng va chạm hóa học (Chemical Ionization - CI)

Trong kỹ thuật này, phân tử mẫu va chạm với dòng các ion dương hoặc

dòng ion âm để thực hiện quá trình ion hóa và phân mảnh ion. So với phương

http://www.lrc.tnu.edu.vn

22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

pháp EI, phương pháp CI thường phân mảnh ít hơn, nhất là các phản ứng bẻ

gãy liên kết cacbon - cacbon, nên thông tin về khung phân tử bị hạn chế.Tuy

nhiên sự phân mảnh ít lại dẫn đến tăng cường độ tín hiệu ion phân tử, phổ ít

vạch nhưng là các vạch có cường độ lớn.

- Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (Electron Spray Ionization - ESI)

Khi ion hóa bằng ESI, dòng phân tử trung hòa trộn trong dung môi được

phun ra qua một kim phun dưới dạng “mũi nhọn” đặc biệt, thường có dạng

dây dẫn mảnh (2,5𝜇m) hay các lưỡi mảnh (lưỡi dao cạo). Các “mũi nhọn” này

được tích điện áp thích hợp, tạo nên một trường điện tử có gradient 107 - 1010

V/cm, do vậy tạo ra hiệu ứng tích điện bề mặt cho các giọt mẫu phun từ mũi

nhọn ra. Dung môi trong các giọt nhỏ bay hơi dần trong dòng khí trơ làm các

phân tử tích điện bên trong các giọt gần nhau hơn. Khi các phân tử đủ gần,

chúng sẽ đẩy nhau và các giọt bị phân chia nhỏ hơn. Quá trình này lặp đi lặp

lại cho đến khi dung môi bốc hơi hoàn toàn và các giọt chia thành các phân tử

tích điện riêng rẽ. Với nguyên lý ion hóa như vậy, các phân tử được giữ

nguyên vẹn, ít bị phân mảnh và kỹ thuật này có thể chủ động điều khiển quá

trình phân mảnh nên ESI được xem là phương pháp ion hóa mềm (soft

ionization).

Tiếp theo quá trình ion hóa, khối lượng các ion tạo thành sẽ được xác

định bằng các bộ tách khối hay còn gọi là bộ phân tích khối. Có nhiều loại tách

khối khác nhau, hoạt động theo các nguyên lý vật lý khác nhau. Người ta thường

phân tích khối thành 5 loại: 1. Tứ cực - 2. Bẫy ion - 3. Thời gian bay - 4. Cung

từ - 5. Biến đổi Fourier. Ở đây, luận văn chỉ giới thiệu các kỹ thuật phân tích

khối thường được sử dụng trong nghiên cứu [20].

- Kỹ thuật tách khối cực

Bộ tách khối tứ cực gồm các ống trụ dài, trên đó có áp điện thế thích hợp.

Bằng cách thay đổi thế áp trên các thanh cực này, dòng ion sẽ bị bộ tứ cực “bắt”,

http://www.lrc.tnu.edu.vn

chỉ để lại những ion có giá trị m/z thỏa mãn điều kiện nhất định có thể bay đến bộ 23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

thu ion. Theo nguyên lý trên, tư cực đóng vai trò một bộ lọc khối, cho phép lần

lượt quét tìm các ion theo giá trị m/z. Tách khối tư cực là kỹ thuật phân tích khối

thông dụng, ổn định, không có từ trường, quét phổ nhanh và đơn giản nhất.

- Kỹ thuật bẫy ion

Trong kỹ thuật bẫy ion (Ion Trap - IT), dòng ion được dẫn theo điện từ

trường vào vùng “bẫy”, tại đây các ion được lưu giữ ổn định nhờ các điện cực

có thiết kế đặc biệt, cho đến khi có một điện áp RF thích hợp tác động lên các

cực để giải thoát các ion có giá trị m/z nhất định chuyển động đến detector. So

với kỹ thuật tách khối tứ cực, nói chung thiết kế của thiết bị IT phức tạp hơn,

nhưng IT cũng cho các tính năng cơ bản cao hơn hẳn so với tứ cực. Trong thiết

kế thực, phần lớn IT được thiết kế kèm với tứ cực phía trước, đóng vai trò bộ

lọc khối sơ bộ.

- Kỹ thuật tách khối theo thời gian bay

Nguyên tắc của phương pháp này là khi các ion chuyển động để đạt đến cùng

một động năng, các ion có số khối khác nhau sẽ có tốc độ chuyển động khác nhau

phụ thuộc vào tỷ lệ m/z. Các ion có tỷ lệ m/z thấp sẽ chuyển động với tốc độ cao và

đi đến detector trước, ngược lại các ion có số khối lớn sẽ đến chậm hơn.

Mặc dù có rất nhiều phương pháp phân tích khác nhau đã được ứng dụng

để phân tích xác định phenol nhưng sắc ký khí - khối phổ (GC - MS) là một

trong những công cụ hữu hiệu cho phép phân tích định lượng phenol lên đến

giới hạn phần tỷ (ppt) và trong phương pháp GC - MS, kỹ thuật ion hóa được

sử dụng rộng rãi là va chạm electron (EI), do phương pháp ion hóa này có thể

tạo ra các ion phân mảnh đặc trưng của chất gốc, giúp định danh được chính

xác chất cần phân tích.

1.3.3. Các kỹ thuật xử lý mẫu trước khi phân tích

Nguyên tắc chung khi phân tích các loại mẫu gồm hai giai đoạn:

http://www.lrc.tnu.edu.vn

24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

- Giai đoạn 1: Xử lý mẫu để đưa nguyên tố cần xác định về trạng thái

dung dịch theo một kỹ thuật phù hợp để chuyển được hoàn toàn nguyên tố đó

vào dung dịch

- Giai đoạn 2: Phân tích các nguyên tố dựa trên sắc ký đồ và phổ khối lượng

của nó, trong những điều kiện thích hợp đã được nghiên cứu và lựa chọn.

Trong đó giai đoạn 1 cực kỳ quan trọng không những đối với phương

pháp GC - MS mà còn đối với các phương pháp khác khi phân tích. Nếu xử lý

mẫu không tốt có thể dẫn đến mất nguyên tố phân tích (gây sai số âm) hoặc

nhiễm bẩn mẫu (sai số dương), làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

 Để lấy được tốt các chất phân tích, trước hết phải chuyển mẫu thành

dạng bột, hay huyền phù, hay dung dịch đồng nhất trong một dung môi thích

hợp, nước hay dung môi hữu cơ, tuỳ cách xử lý, loại mẫu, và chất phân tích.

 Sau đó lấy một lượng nhất định và xử lý bằng một kỹ thuật thích hợp,

ví dụ như chưng cất, hay chiết, hay kết tinh, để lấy chất phân tích ra khỏi mẫu

ban đầu và chuyển nó vào một dung môi chiết thích hợp. Sau đó xác định chúng

trong dung môi đó.

Tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đối tượng mẫu, điều kiện

trang bị kỹ thuật…có các kỹ thuật chiết tách sau đây để xử lý mẫu hữu cơ:

1.3.3.1. Kỹ thuật chiết thông thường (lỏng-lỏng) [21],[22]

Nguyên tắc: Dùng một dung môi thích hợp để chiết lấy chất cần phân

tích từ dung môi hoà tan mẫu vào dung môi khác và xác định chúng trong dung

môi chiết đó. Yếu tố quyết định ở đây là sự phân bố của chất giữa hai pha không

trộn lẫn vào nhau. Chất phân tích phải được phân bố trên 95% vào một pha lỏng

mà ta mong muốn. Nghĩa là hệ số phân bố phải lớn (tỷ số Kfb phải trong vùng

1/9-0,5/9). Đây là một kỹ thuật được dùng nhiều để chiết tách các chất hữu cơ

ra khỏi matrix mẫu ban đầu, sau đó xác định các chất hữu cơ trong dung môi

http://www.lrc.tnu.edu.vn

25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

chiết theo một phương pháp thích hợp, hoặc làm bay hơi dung môi chiết, rồi

hoà tan bã còn lại vào một dung môi khác thích hợp hơn, rồi mới xác định

chúng theo phương pháp đã chọn.

1.3.3.2. Kỹ thuật chiết dòng liên tục [21],[22]

Nguyên tắc: Quá trình chiết ở đây chỉ khác cách chiết thông thường là

khi chiết một trong hai pha là chuyển động liên tục, hay có thể cả hai pha cùng

chuyển động ngược chiều nhau. Trong đó, nếu pha chiết (dung môi chiết) có tỷ

khối lớn hơn dung môi (pha) chứa mẫu nhiều, thì sự chiết càng thuận lợi hơn.

Vì thế quá trình chiết xẩy ra nhanh và hiệu quả cao hơn chiết thông thường.

Trong thực tế, người ta thường giữ yên pha chứa mẫu trong bình chiết, còn pha

động chiết (dung môi chiết) thì được được bơm liên tục tuần hoàn sục vào bình

chiết, mà không phải lắc chiết. Kỹ thuật chiết này hay được dùng trong chiết

sản xuất, quy trình chiết công nghệ.

1.3.3.3. Kỹ thuật chiết Soxhlet [20],[21],[22]

Nguyên tắc: Về nguyên tắc thì đây cũng là quá trình chiết dựa theo sự

phân bố của chất trong hai dung môi (hai pha) không trộn lẫn vào nhau, như

cách chiết thông thường, song có điều khác là được thực hiện trong một kiểu

trang bị riêng và pha chiết chuyển động liên tục qua mẫu, với mục đích thu

được kết quả chiết tốt, chọn lọc và nhanh. Kiểu chiết này áp dụng được cho cả

mẫu rắn và mẫu lỏng.

1.3.3.4. Kỹ thuật chiết trong siêu âm [23],[24]

Nguyên tắc chung: Phương pháp sử dụng sóng siêu âm để khuấy các

mẫu ngâm trong dung môi hữu cơ. Thông thường người ta dùng một đầu dò

phát sóng siêu âm nhúng vào dung môi chứa mẫu hoặc đặt hỗn hợp mẫu và

dung môi vào một bể siêu âm. Mẫu được đặt trong các ống chứa mẫu phù hợp,

dung môi chiết phải ngập mẫu và siêu âm trong thời gian ngắn. Sau khi chiết,

chất nghiên cứu được tách bằng phương pháp ly tâm.

1.3.3.5. Kỹ thuật chiết chất phân tích dạng khí-rắn [21],[22]

http://www.lrc.tnu.edu.vn

26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Nguyên tắc: Nguyên tắc của cách chiết này là các chất phân tích cần

chiết phải ở trạng thái khí, hoặc là mẫu ở dạng khí, hay nhờ một cách thích

hợp, tại một nhiệt độ thích hợp để chuyển chất mẫu thành khí, còn pha tĩnh

để chiết là chất rắn xốp. Pha tĩnh (chất chiết) để trong cột chiết (extraction

cartridge), hay là dạng đĩa (empore extraction dísk). Pha tĩnh chiết ở đây là

các Silica Gel xốp loại trung tính hay pha ngược, có khả năng hấp phụ tốt chất

phân tích. Vì thế gọi là kỹ thuật chiết rắn-khí. Trong quá trình chiết, mẫu được

hoá khí và được dòng khí mang trơ N2 hay Ar sạch (>99,9%) dẫn chất mẫu

vào cột chiết. Các chất có trong mẫu sẽ bị pha tĩnh (chất chiết ) giữ lại trong

cột chiết theo tính chất hấp phụ của nó, còn các chất khác thì đi qua. Sau đó

dùng một dung môi thích hợp, như acetonitril, hay diclo-methylen để rửa giải

chất phân tích ra khỏi cột chiết, để phân tích chúng trong dung dịch này. Nếu

các chất phân tích dễ bay hơi, người ta cũng có thể giải hấp chất phân tích ra

khỏi cột chiết bằng cách tăng nhiệt độ cột chiết làm các chất bay hơi và nhờ

dòng khí trơ sạch mang các chất phân tích trực tiếp vào máy GC để xác định

nó.

1.3.3.6. Kỹ thuật chiết pha rắn (rắn-lỏng ) [21],[22]

Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) ra đời vào giữa những năm 1970, vừa mới

ra đời kỹ thuật này đã bộc lộ những tính năng ưu việt hơn. Tuy nhiên, mãi đến

năm 1998 thuật ngữ khoa học “Chiết pha rắn” mới được công nhận trên toàn

thế giới. Từ đó đến nay, kỹ thuật chiết pha rắn được phát triển mạnh mẽ trong

lĩnh vực phân tích, đặc biệt là phân tích lượng vết các chất.

Chiết pha rắn (hay chiết rắn-lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa

hai pha lỏng và rắn. Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc

dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn dạng hạt nhỏ và xốp

đường kính 25 - 70 μm, gọi là pha rắn

Chất chiết được gọi là pha tĩnh, và được nhồi vào một cột chiết nhỏ, cột

chiết kích thước: 6 x 1 cm, hay dung lượng chiết 100-600 mg, hoặc dạng đĩa

chiết có kích thước dầy 1-2 mm và đường kính 3-4 cm. Chất chiết là các hạt

http://www.lrc.tnu.edu.vn

Silica trung tính, các hạt ôxit nhôm, hay các Silicagen trung tính đã bị alkyl 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

hoá nhóm -OH bằng nhóm mạch carbon thẳng -C2, -C4, -C8, -C18,.. , hay

nhân phenyl. Nó được chế tạo trong điều kiện giống như pha tĩnh của sắc ký

HPLC, và các hạt này có độ xốp lớn, với diện tích bề mặt xốp thường từ 50 -

300 m2/gam.

Khi xử lý mẫu, dung dịch chất mẫu được dội lên cột chiết. Lúc này pha

tĩnh sẽ tương tác với các chất và giữ một nhóm chất phân tích lại trên cột (trên

pha tĩnh), còn các nhóm chất khác sẽ đi ra khỏi cột cùng với dung môi hoà tan

mẫu. Như thế là chúng ta thu được nhóm chất cần phân tích ở trên pha tĩnh

(chất chiết rắn).

Sau đó dùng một dung môi thích hợp hoà tan tốt các chất phân tích để

rửa giải chúng ra khỏi pha tĩnh (cột chiết), và chúng ta thu được dung dịch có

chất phân tích để xác định chúng theo một cách đã chọn.

Trong luận văn, phương pháp chiết pha rắn đã được lựa chọn cho quá

trình làm sạch mẫu và làm giàu mẫu.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

28 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Chương 2

THỰC NGHIỆM

2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng phenol trong

mẫu cá biển bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ.

- Ứng dụng quy trình phân tích vừa xây dựng xác định và đánh giá hàm

lượng phenol trong các mẫu cá biển thu được tại Quảng Ninh và Hà Tĩnh.

2.1.2. Nội dung nghiên cứu

- Lựa chọn các điều kiện phân tích phenol bằng thiết bị sắc ký khí

khối phổ.

- Xây dựng quy trình xử lý mẫu, làm sạch, tạo dẫn xuất axetyl hóa và

phân tích phenol trong mẫu cá biển.

- Đánh giá phương pháp phân tích:

+ Xây dựng đường chuẩn xác định phenol,

+ Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp,

+ Đánh giá độ lặp lại và độ chính xác của phương pháp.

- Phân tích định lượng hàm lượng phenol trong mẫu cá biển bằng phương

pháp đã xây dựng được.

- Xử lý và đánh giá kết quả theo các phương pháp phân tích thống kê.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp tổng hợp tài liệu

- Tìm và nghiên cứu các tài liệu liên quan đến các phenol trong các và

môi trường

- Phân tích và tổng hợp tài liệu về các quy trình phân tích hàm lượng phenol.

2.2.2. Phương pháp thực nghiệm

- Thu thập mẫu tại các địa điểm đã chọn.

- Phương pháp chiết siêu âm

http://www.lrc.tnu.edu.vn

29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

- Phương pháp chiết pha rắn

- Phương pháp chiết lỏng lỏng

- Phương pháp sắc ký khí khối phổ

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu

- Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.

- Tính nồng độ trung bình

Nồng độ chất cần phân tích trong một mẫu là nồng độ trung bình của N

lần phân tích lặp lại mẫu đó. Nồng độ trung bình ( ) được xác định dựa vào

công thức sau:

=

Trong đó:

xi - Nồng độ chất phân tích ở thí nghiệm thứ i

N - Số lần lặp lại của thí nghiệm

 Tính độ lệch chuẩn

Độ lệch chuẩn của phương pháp (s) được xác định theo công thức:

Trong đó:

xi - Nồng độ chất phân tích ở thí nghiệm thứ i

- Nồng độ trung bình của mẫu với N lần lặp lại

N - Số lần lặp lại

- Tính hệ số biến thiên

Hệ số biến thiên (CV) của một phép phân tích cho biết độ đúng của

phương pháp. Giá trị CV càng nhỏ thì phương pháp phân tích càng có độ tin

http://www.lrc.tnu.edu.vn

cậy cao. Hệ số biến thiên được xác định theo công thức sau: 30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

- Tính kết quả hàm lượng mẫu khô

Hàm lượng mẫu khô (A) được tính như sau:

A(%) = 100 - A0

Trong đó:

A: Phần trăm trọng lượng mẫu khô (%)

A0: Độ ẩm của mẫu (%)

mc: Trọng lượng cốc (g)

mm: Trọng lượng mẫu (g)

ms: Trọng lượng mẫu và cốc sau khi sấy (g)

- Tính nồng độ phenol bằng phương pháp GC-MS

Nồng độ phenol (C) trong mẫu sau khi phân tích trên GC-MS được tính

kết quả theo công thức sau:

Trong đó:

C0: Nồng độ phenol tính từ đường chuẩn dựng trên GC-MS (mg/l)

V1: Thể tích dung môi (n-Hexan) dùng để chiết dẫn xuất phenol từ mẫu

phân tích (mL)

m: Trọng lượng mẫu lấy để phân tích (g)

2.3. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích

2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ

thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu của mẫu

trắng hay tín hiệu của đường nền. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất

http://www.lrc.tnu.edu.vn

31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

của chất phân tích mà phương pháp định lượng được với tín hiệu phân tích có ý

nghĩa định lượng so với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu của đường nền, có độ

chính xác và độ đúng chấp nhận được trong điều kiện thử nghiệm.

Sau khi xây dựng đường chuẩn, tín hiệu phân tích (y) được coi là tuyến tính

với nồng độ dung dịch chuẩn (x) trong khoảng tuyến tính. Phương trình đường

chuẩn có dạng:

(2.3.1) 𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝑥

Trong đó:

y là tín hiệu phân tích.

x là nồng độ chất phân tích.

b là hệ số góc của phương trình đường chuẩn.

Mô hình này được áp dụng để tính hệ số góc b và giới hạn phát hiện (LOD)

và giới hạn định lượng (LOQ) như sau [28, 29]:

3𝑆𝑏 𝑏

(2.3.2) 𝐿𝑂𝐷 =

10𝑆𝑏 𝑏

(2.3.3) 𝐿𝑂𝑄 =

Trong đó:

Sb là độ lệch chuẩn của tín hiệu đường nền (hay mẫu trắng) thu được

sau nb thí nghiệm lặp lại (thường là từ 7-10 thí nghiệm).

2.3.2. Độ chụm (độ lặp lại) của phương pháp

Độ lặp lại đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi khi tiến

hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, được tiến hành bằng một phương pháp phân

tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (người phân tích, trang thiết bị, phòng thí

nghiệm) trong các khoảng thời gian ngắn [26].

2.3.3. Độ đúng (độ thu hồi) của thiết bị, của phương pháp

Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết

quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, thước đo độ

đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay bằng phương pháp xác định độ

thu hồi [26, 27].

http://www.lrc.tnu.edu.vn

32 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Độ thu hồi (H):

Ctt×100 Clt

H = (2.3.4)

Trong đó:

H: Độ thu hồi (%)

Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích thu được (tính theo đường

chuẩn)

Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính toán từ lượng chuẩn

thêm vào. Ngoài ra, độ đúng của phương pháp còn được khẳng định qua việc

so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả đo của một phương pháp đối chứng

tiêu chuẩn khác.

2.4. Thực nghiệm

2.4.1. Lấy mẫu

Các mẫu cá biển của 8 loài được lấy tại các địa điểm khác nhau: Vùng

biển Vũng Áng và thành phố Hạ Long. Các mẫu sau khi lấy được ghi kèm theo

các thông tin về vị trí lấy mẫu, thời gian và loại mẫu (Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Vị trí và thời gian lấy mẫu

Vị trí lấy mẫu Đặc điểm

Sống ở tầng đáy

Vũng Áng

Sống ở tầng mặt

Sống ở tầng đáy

Hạ Long

Sống ở tầng mặt Tên mẫu Cá Chẽm Cá Đuối Cá Đục Cá Hồng Cá Mú Cá Khế Cá Cơm Cá Trích Cá Chẽm Cá Đuối Cá Đục Cá Hồng Cá Mú Cá Khế Cá Cơm Thời gian 3/5/2016 3/5/2016 3/5/2016 3/5/2016 3/5/2016 3/5/2016 3/5/2016 3/5/2016 10/7/2016 10/7/2016 10/7/2016 10/7/2016 10/7/2016 10/7/2016 10/7/2016

http://www.lrc.tnu.edu.vn

33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Cá Trích 10/7/2016

2.4.2. Xử lý mẫu

2.4.2.1. Tiền xử lý mẫu

Mẫu cá biển sau khi được thu thập tại hiện trường được bảo quản lạnh,

sau đó mổ lấy phần thịt, đồng nhất mẫu bằng máy xay và đưa vào thiết bị

đông khô. Bảo quản mẫu trong túi nilon chuyên dụng có khóa, ở nhiệt độ -

16°C.

2.4.2.2. Quy trình xử lý mẫu

http://www.lrc.tnu.edu.vn

34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Hình 3.1. Quy trình phân tích phenol trong mẫu cá

Quy trình chiết:

Cân 10 g mẫu cá biển sau khi tiền xử lý mẫu theo 2.4.2.1 vào ống ly tâm

50ml, thêm 30 mL metanol và chiết bằng siêu âm trong thời gian 30 phút, sau

đó ly tâm và thu lấy dịch chiết. Quá trình chiết được lặp lạ một lần nữa với 30

mL metanol. Dịch chiết được cất quay đến thể tích 10 mL, sau đó làm lạnh ở

-24C trong 24 giờ để tách loại lipit.

Dịch chiết sau khi đã lọc và loại bỏ lipit tiếp tục được làm khô bằng khí

Nitơ đến gần khô kiệt. 2 mL metanol được thêm vào để hòa tan phần cặn khô.

Làm sạch dịch chiết:

Dịch chiết được làm sạch bằng cột Isolute ENV (Styrene divinylbenzene

copolymer). Trước khi cho mẫu chảy qua cột, cột được hoạt hóa bằng 8 mL

metanol và 4 mL nước cất ở tốc độ 1 mL/phút. 8 mL nước cất được thêm vào

2 mL dịch chiết mẫu cá trong metanol, sau đó hỗn hợp được cho chảy qua cột.

Phenol được giữ lại trên cột sẽ được rửa giải 2 lần với 5 mL axetonitril mỗi lần.

Dịch chiết tiếp tục được làm khô bằng khí Nitơ đến gần khô kiệt, sau đó hòa

tan với 2 mL metanol.

Dẫn xuất hóa phenol trong dịch chiết

Dịch chiết mẫu cá trong metanol (2 mL) được chuyển vào ống thủy tinh

có nắp xoáy. 3 mL dung dịch K2CO3 0,2M và 2 mL n-hexan có chứa 200 µL

axetic anhydrit được thêm vào mỗi ống trên, sau đó hỗn hợp được lắc vortex

trong 2 phút, để 30 phút để quá trình tách pha xảy ra hoàn toàn và thu lấy pha

n-hexan có chứa dẫn xuất của phenol. Hàm lượng phenol trong dịch chiết được

xác định trên hệ thiết bị GC-MS.

2.4.3. Xây dựng đường chuẩn của phenol

- Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ 10 µg/mL. Dung dịch có nồng độ

10 µg/mL được chuẩn bị bằng cách lấy chính xác 2 mL dung dịch chuẩn gốc 500

http://www.lrc.tnu.edu.vn

35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

µg/mL cho vào bình định mức màu nâu 100 mL, định mức đến vạch bằng metanol,

lắc đều. Dung dịch chuẩn trung gian được bảo quản ở nhiệt độ 40C.

- Xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn của phenol được xây dựng trên mối quan hệ giữa nồng độ

chất (biểu diễn trên trục hoành) và diện tích pic của chất phân tích trên GC-MS

(biểu diễn trên trục tung). Phương trình định lượng nhận được từ đường ngoại

chuẩn có dạng sau: y = a.x + b; trong đó x là nồng độ của chất phân tích, y là

số đếm diện tích pic chất phân tích.

Đường chuẩn của phenol được xây dựng dựa vào các dung dịch chuẩn

có nồng độ 0,10 µg/mL ; 0,20 µg/mL ; 1,00 µg/mL ; 2,00 µg/mL ; 5,00 µg/mL

trong metanol.

Sử dụng dung dịch chuẩn ở năm mức nồng độ như nêu trong bảng 2.1

được tiến hành tạo dẫn xuất axetyl hóa, sau đó bơm vào máy GC-MS, mỗi nồng

độ bơm 3 lần để xác định diện tích píc của chất phân tích; lấy kết quả số đếm

diện tích píc trung bình của 3 lần bơm để xây dựng đường ngoại chuẩn.

Bảng 2.2. Pha dung dịch chuẩn phenol

Dung dịch chuẩn lấy pha Dung dịch chuẩn đã pha loãng

Nồng độ Thể tích lấy Dung môi V định Nồng độ chất chuẩn

(µg/ml) pha (ml) lấy pha mức (ml) cần pha (µg/ml)

0,5 0,10

2,5 0,50

10 Metanol 50 5,0 1,00

10,0 2,00

25,0 5,00

2.4.3. Trang thiết bị và hóa chất phục vụ nghiên cứu

2.4.3.1. Trang thiết bị

- Máy sắc ký khí khối phổ GCMS- QP 2010 của hãng Shimadzu.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

- Cân phân tích chính xác đến 10-5 g của hãng Satorius.

- Máy đồng hóa mẫu, hãng KIA;

- Máy lắc đứng, Yamato Nhật Bản;

- Máy ly tâm lạnh, Hitech Đức;

- Phễu chiết loại 100ml, 300ml Yamato Nhật Bản;

- Bình cầu cổ nhám loại 300ml và 100ml;

- Ống đong 100ml, 200ml;

- Phễu thủy tinh;

- Giấy lọc 5C;

- Các loại pipet thể tích 0,5ml, 1ml, 2ml, 3ml, 10ml, 20ml và 50ml, pipet

Pasteur: loại thủy tinh dài;

- Các bình định mức 10ml, 20ml, 50ml, 100ml;

- Ống nghiệm;

- Lọ thủy tinh (Vial) đựng mẫu loại 1,5 đến 2ml, dùng cho hệ bơm mẫu

tự động của hệ thống sắc ký khí.

2.4.3.2. Hóa chất

Do yêu cầu nghiêm ngặt của phép đo nên nước cất, hóa chất phải có

độ tinh khiết cao, trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã dùng các hóa chất:

- Dung dịch chuẩn gốc phenol (C6H5OH) 500 µg/ml trong metanol của

hãng Sigma-Aldrich;

- Metanol: Độ tinh khiết dùng cho phân tích sắc ký, Merck;

- n-Hexan: Độ tinh khiết dùng cho phân tích sắc ký, Merck;

- Anhydrit axetic (CH3CO)2O: Độ tinh khiết dùng cho phân tích sắc

ký, Merck;

- Natri Chlorid (NaCl): Độ tinh khiết dùng cho phân tích hóa học,

Merck;

- Natri sulfat khan (Na2SO4): Độ tinh khiết dùng cho phân tích hóa học,

Merck;

- Kali cacbonat (K2CO3): Độ tinh khiết dùng cho phân tích hóa học,

http://www.lrc.tnu.edu.vn

37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Merck;

- Khí helium: Độ tinh khiết > 99,999%;

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Điều kiện phân tích xác định phenol trên thiết bị GC/MS

Trên cơ sở tham khảo tài liệu, quá trình thực nghiệm và điều kiện hiện

có của phòng thí nghiệm đã lựa chọn chế độ phân tích xác định phenol trên thiết

bị GC/MS như sau:

- Cột tách: DB5-MS Column

- 60 m x 0,25 mm x 0,25µm

- Nhiệt độ nguồn Ion: 200°C

- Nhiệt độ Interface giữa GC và MS: 220°C

- Kiểu bơm mẫu: Không chia dòng

- Khí mang: Heli (99,999%)

- Tốc độ dòng: 1,7 ml/phút

- Thể tích bơm mẫu: 1 microlit

- Nhiệt độ lò cột phân tích: + Nhiệt độ ban đầu 60oC, giữ trong 1 phút; ● Từ 60oC đến 180oC, mỗi phút tăng 20oC; ● Từ 180oC đến 190oC, mỗi phút tăng 10oC; ● Từ 190oC đến 240oC, mỗi phút tăng 3oC; ● Từ 240oC đến 300oC, mỗi phút tăng 10oC và giữ ở 300oC trong 5 phút

- Chế độ Scan, m/z bắt đầu từ 50, m/z kết thúc là 450

- Chế độ SIM với phenol, m/z = 94 cho định lượng.

3.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp GC/MS

Giới hạn phát hiện (LOD) được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân

tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín

hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Trong sắc ký, LOD là nồng độ chất phân

tích mà cho tín hiệu sắc ký gấp 3 lần tín hiệu nhiễu đường nền. Phân tích loạt

http://www.lrc.tnu.edu.vn

mẫu đã thêm chuẩn phenol có nồng độ nhỏ dần, tạo dẫn suất và tiến hành phân 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

tích trên GC/MS đến khi xác định được dung dịch có nồng độ phenol cho tín

hiệu pic lớn gấp 3 lần tín hiệu nhiễu đường nền.

Với sắc ký đồ hình 3.1 cho thấy, nồng độ 0,01 µg/ml, tương ứng với nồng

độ 0,002 µg/g cho tín hiệu của chất phân tích lớn gấp 3 lần tín hiệu đường nền

(S/N=3), do vậy, giới hạn phát hiện của phương pháp GC-MS là 0,01 µg/g.

Thời gian lưu của phenol từ 9,6 đến 10,0 phút.

Giới hạn định lượng (LOQ) được xem là nồng độ thấp nhất của chất

phân tích mà phép phân tích vẫn định lượng được chính xác độ tin cậy 95%.

Trong phân tích sắc ký thường lấy LOQ ứng với nồng độ chất phân tích cho

tín hiệu cao gấp 10 lần so với tín hiệu nhiễu đường nền (S/N=10); với

phenol xác định trong nghiên cứu này có giới hạn định lượng là 0,0066

µg/g. Với giá trị LOD=0,002 µg/g và LOQ= 0,0066 µg/g, phương pháp

GC/MS đáp ứng yêu cầu định tính và định lượng vết phenol trong các mẫu

nghiên cứu.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Hình 3.2. Sắc đồ phân tích phenol trong mẫu cá

có thêm chuẩn nồng độ 0,01 µg/g trên GC/MS

3.3. Đường chuẩn định lượng phenol trên GC/MS

Đường chuẩn định lượng phenol trên GC/MS được xây dựng từ các dung

dịch chuẩn nêu ở bảng 2.2, mỗi nồng độ phân tích lặp lại 3 lần ở cùng điều kiện

làm việc của hệ GC/MS nêu ở mục 3.1. Kết quả xác định sự phụ thuộc diện tích

pic vào nồng độ phenol được chỉ ra ở bảng 3.1 và hình 3.2.

Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào hàm lượng phenol

Nồng độ (µg/mL) 0,10 0,20 1,00 2,00 5,00

Diện tích Pic 2768 27312 120541 213107 518108

Hình 3.3. Đường chuẩn phenol xác định trên GC/MS

Từ kết quả nhận được trong bảng 3.1 cho thấy, detectơ có khoảng tuyến

tính làm việc đối với phenol trong khoảng nồng độ từ 0,10 µg/mL - 5,0 µg/mL,

ứng với hệ số tương quan R2=0,9976. Với khoảng tuyến tính này, phương pháp

http://www.lrc.tnu.edu.vn

40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

GC-MS đáp ứng yêu cầu phân tích xác định lượng vết phenol trong các mẫu cá

biển.

3.4. Kết quả xác định điều kiện chiết tách, làm sạch và và tạo dẫn xuất chất

phân tích

3.4.1. Kết quả lựa chọn dung môi tách chiết

Trên cơ sở tài liệu tham khảo để tách, chiết phenol trong mẫu cá, những

dung môi thường được sử dụng gồm: metanol, dichlorometan/Metanol (1:1),

dichlorometan. Mẫu cá được chiết bằng siêu âm và sử dụng các loại dung môi

trên, sau đó, tiến hành loại mỡ và làm sạch theo quy trình đưa ra ở hình 2.2.

Hiệu suất thu hồi phenol được đưa ra ở bảng và hình sau:

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát và lựa chọn dung môi chiết

TT Loại dung môi Độ thu hồi trung bình, n=3 (%)

1 Dichlorometan 40,1

2 Dichlorometan/Metanol (1:1) 70,4

100

80

3 Metanol 91,1

)

60

%

40

20

0

Dichloromethane

Methanol

( i ồ h u h t t ấ u s u ệ i H

Dichloromethane/Methanol (1:1) Loại dung môi

Hình 3.4. Hiệu suất thu hồi phenol khi sử dụng các loại dung môi chiết

khác nhau

Kết quả bảng 3.2 và hình 3.3 cho thấy, khi sử dụng dichlorometan một

loại dung môi có độ phân cực thấp, hiệu suất thu hồi chỉ đạt 40,1%, khi tăng

dần độ phân cực và sử dụng hỗn hợp dichlorometan:metanol 1:1 thì hiệu suất

http://www.lrc.tnu.edu.vn

41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

thu hồi tăng và đạt 70,4% và khi sử dụng metanol thì hiệu suất thu hồi đạt 91%.

Do vậy trong các nghiên cứu tiếp theo, metanol được lựa chọn làm dung môi

để chiết phenol trong mẫu cá.

3.4.2. Kết quả khảo sát thể tích dung môi chiết

Sau khi lựa chọn được metanol là dung môi chiết phenol từ các mẫu

nghiên cứu, tiến hành khảo sát lựa chọn thể tích dung môi metanol ở các mức:

50 ml (tương ứng với 25 mL qua mỗi lần chiết), 60 ml (tương ứng 30 mL qua

mỗi lần chiết) và 70 mL (tương ứng với 35 mL qua mỗi lần chiết) trên nền mẫu

cá có thêm chất chuẩn phenol ở mức 0,10 mg/kg mẫu. Kết quả khảo sát được

chỉ ra trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát thể tích dung môi dùng để chiết mẫu

Độ thu hồi trung bình, n=3 (%) Mức thêm Mẫu chuẩn (mg/kg) 50 mL 60 mL 70 mL

Cá 1 0,10 65,00 91,50 90,50

Cá 2 0,10 67,00 90,00 92,00

Từ kết quả nêu ở bảng 3.3 cho thấy, đối với thể tích dung môi chiết là 50

mL, độ thu hồi phenol trong các mẫu cá đạt giá trị trung bình là 65,00 - 67,00%.

Với mức nồng độ chất nghiên cứu 0,10 mg/kg, độ thu hồi chất cho phép nằm

trong khoảng từ 80% đến 120%. Như vậy với thể tích dung môi chiết là 50 ml,

độ thu hồi dưới mức 70% là không phù hợp.

Đối với mức thể tích dung môi chiết là 60 mL, độ thu hồi phenol từ cá

đạt giá trị trung bình từ 90,00 - 91,50%; với mức thể tích chiết 70 mL, độ thu

hồi trung bình đạt từ 90,50 - 92,00%. Cả hai thể tích này, độ thu hồi phenol

nằm trong khoảng cho phép 80 - 120%.

Như vậy với thể tích chiết là 60 mL và 70 mL, độ thu hồi phenol hoàn

toàn phù hợp với yêu cầu phân tích lượng vết. Tuy nhiên không thấy có sự khác

biệt ở mức có ý nghĩa về độ thu hồi khi sử dụng thể tích dung môi chiết ở 60

http://www.lrc.tnu.edu.vn

42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

mL và 70 mL. Do vậy chúng tôi lựa chọn thể tích dung môi chiết là 60 ml. Với

lượng dung môi này vừa đảm bảo được tính khoa học, vừa tối giảm được lượng

dung môi sử dụng.

3.4.3. Kết quả khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất

Để tối ưu hóa quá trình tạo dẫn xuất axetyl hóa, thể tích anhydrit axetic

và nồng độ K2CO3 được tiến hành khảo sát.

3.4.3.1. Ảnh hưởng của anhydrit axetic

Các điều kiện tạo dẫn xuất như sau: 2ml dung dịch chuẩn phenol có nồng

độ 0,20 µg/ml trong methanol, thêm 3ml K2CO3 nồng độ 0,2M, sau đó thêm 2 ml

n-hexan có chứa anhydrit axetic ở các mức thể tích khác nhau. Sau đó lắc vortex

2 phút và để thời gian 30 phút cho quá trình tạo dẫn xuất kết thúc.

Kết quả khảo sát lựa chọn thể tích dung dịch anhydrit axetic ở 6 mức thể

tích là 50, 100, 150, 200, 250 và 300 µL được đưa ra trong bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thể tích anhydrit axetic

để tạo dẫn xuất đến hiệu suất thu hồi phenol

TT Thể tích anhydrite axetic (µL)

Độ thu hồi trung bình Rtb (%) 50 1 50

2 100 62

3 150 75

4 200 90

5 250 91

6 300 89

http://www.lrc.tnu.edu.vn

43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

100

90

)

%

80

70

60

50

40

9 i ồ h u h t t ấ u s u ệ i H

30

0

50

100

150

250

300

200 Thể tích anhydrit axetic (µL)

Hình 3.5. Ảnh hưởng của hóa chất tạo dẫn xuất anhydrit axetic

đến hiệu suất thu hồi phenol

Dựa vào bảng kết quả cho thấy khi thể tích của hóa chất tạo dẫn xuất

anhydrit axetic tăng thì hiệu suất thu hồi tăng, khi thể tích của anhydrit axetic

đạt 200 µL thì quá trình tạo dẫn xuất đạt hiệu suất cao nhất và độ thu hồi của

phenol đạt 90%, khi tiếp tục tăng thể tích thuốc thử thì hiệu suất thu hồi không

tăng. Do vậy trong các nghiên cứu tiếp theo, thể tích anhydrit axetic được sử

dụng là 200 µL.

3.4.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ K2CO3

Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ K2CO3 đến điều kiện tạo dẫn xuất và độ

thu hồi của phenol, các điều kiện thí nghiệm được tiến hành như sau: 2ml dung dịch

chuẩn phenol có nồng độ 0,20 µg/ml trong metanol, thêm 3ml K2CO3 có 5 mức nồng

độ từ 0,1 đến 0,5M, sau đó thêm 2 ml n-hexan có chứa 200 µL anhydrit axetic. Sau

đó lắc vortex 2 phút và để thời gian 30 phút cho quá trình tạo dẫn xuất kết thúc. Kết

quả khảo sát lựa chọn nồng độ K2CO3 được đưa ra trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ K2CO3 đến hiệu suất thu hồi phenol

TT

1 2 3 4 Nồng độ dung dịch K2CO3 (µL) 0 0,05 0,1 0,2 Hiệu suất thu hồi Phenol (%) 42 68 80 91

http://www.lrc.tnu.edu.vn

44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

100

0,4 0,5 90 88 5 6

)

90

%

80

70

60

50

40

( i ồ h u h t t ấ u s u ệ i H

30

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Nồng độ dung dịch K2CO3 (M)

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ K2CO3 đến hiệu suất thu hồi phenol

Kết quả khảo sát đưa ra ở bảng 3.5 cho thấy, khi nồng độ K2CO3 tăng thì

hiệu suất thu hồi tăng và hiệu suất thu hồi phenol đạt giá trị lớn nhất đạt 91%

khi nồng độ K2CO3 là 0,2M. Do vậy trong các nghiên cứu tiếp theo, nồng độ

nồng độ K2CO3 0,2M được sử dụnglàm môi trường để tạo dẫn xuất.

3.4.4. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp chuẩn bị mẫu

Với các điều kiện thực nghiệm và kết quả nêu trong các mục 3.4.1, 3.4.2,

3.4.3, chúng tôi đã tiến hành xác định độ lặp lại và độ thu hồi phenol trên nền

mẫu cá. Các thông số thực nghiệm và kết quả xác định độ lặp lại và độ thu hồi

phenol của phương pháp chuẩn bị mẫu được nêu trong bảng 3.6.

Từ kết quả nêu ở bảng 3.6 cho thấy, độ thu hồi của phương pháp chuẩn

bị mẫu ở mức nồng độ 0,050 mg/kg và 0,100 mg/kg đều đạt trên 80% và nằm

trong giới hạn cho phép của tiêu chuẩn phân tích hóa thực phẩm AOAC. Trong

hình 3.6 là sắc đồ xác định phenol trong mẫu cá có nồng độ 0,10 mg/kg.

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ thu hồi mẫu và độ lặp lại

Mẫu

Nồng độ chất thu Hệ số biến thiên Độ thu hồi R (%) Độ thu hồi trung Mức thêm chuẩn (mg/kg) Nồng độ chất thu được trung Độ lệch chuẩn S

http://www.lrc.tnu.edu.vn

45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

CV (%) bình (mg/kg) bình Rtb (%)

89,33 0,100 3,42 0,045 0,002

C1

94,59 1,000 0,098 0,003 3,27

92,00 0,050 4,35 0,046 0,002

C2

được (mg/kg) 0,090 0,092 0,086 0,920 0,970 0,950 0,048 0,044 0,046 0,093 0,091 90,00 92,00 86,00 92,23 97,00 94,55 96,00 88,00 92,00 93,20 90,86 90,91 0,100 3,30 0,098 0,003 0,089 88,67

Theo AOAC, hệ số biến thiên của phương pháp (CV,%) ở mức nồng 1 ppm

là 8%, 10 ppm 6%, 100 ppm là 4%. Kết quả ở bảng 3.6 có giá trị hệ số biến thiên

CV dao động từ 3,30 - 4,35%, nằm trong giới hạn cho phép của AOAC.

Do phương pháp chuẩn bị mẫu đã xây dựng có độ thu hồi phenol đạt trên

80%, độ biến thiên từ 3,30 - 4,35% chứng tỏ các điều kiện lựa chọn để chuẩn

bị mẫu có đủ độ tin cậy để phân tích xác định lượng vết phenol trong các mẫu

cá nghiên cứu.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Hình 3.7. Sắc đồ phân tích phenol trong cá có thêm chuẩn

nồng độ 0,10 mg/kg

3.5. Kết quả xác định phenol trong các mẫu cá biển

* Kết quả phân tích xác định phenol trong cá

Sau khi xác lập điều kiện chuẩn bị mẫu và điều kiện làm việc của phương

pháp GC-MS chúng tôi đã áp dụng phương pháp đã xác lập để phân tích xác

định phenol trong các mẫu cá biển.

Các mẫu cá biển được lấy tại hai khu vực Hạ Long thuộc tỉnh Quảng

Ninh và Vũng Áng thuộc tỉnh Hà Tĩnh. Các mẫu cá nghiên cứu được lấy ở cả

tầng mặt và tầng đáy. Các mẫu cá sống ở tầng mặt bao gồm cá Cơm, cá Trích,

cá Khế, các mẫu cá sống ở tầng đáy bao gồm cá Chẽm, cá Đuối, cá Đục, cá

Hồng, cá Mú. Kết quả phân tích được đưa ra ở bảng sau:

Bảng 3.7. Kết quả phân tích hàm lượng phenol trong mẫu cá biển

tại Hà Tĩnh

Hàm lượng phenol Vị trí lấy mẫu Tên mẫu Đặc điểm (µg/g)

Cá Chẽm 36,78

Cá Đuối 39,21 Sống ở Cá Đục 87,11 tầng đáy Cá Hồng 26,33 Vũng Áng Cá Mú 31,11

Cá Khế 0,20 Sống ở Cá Cơm KPH tầng mặt Cá Trích 0,31

Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng phenol trong mẫu cá biển

tại Hạ Long

Hàm lượng phenol Vị trí lấy mẫu Tên mẫu Đặc điểm (µg/g)

http://www.lrc.tnu.edu.vn

47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Cá Chẽm KPH

Cá Đuối 0,07 Sống ở Cá Đục 0,09 tầng đáy Cá Hồng 0,05 Hạ Long Cá Mú KPH

Cá Khế KPH Sống ở Cá Cơm KPH tầng mặt Cá Trích KPH

Hàm lượng Phenol trong các mẫu cá tầng đáy lấy ở khu vực Vũng Áng

có giá trị từ 26,33 đến 87,11 µg/g. Mẫu cá tầng mặt có hàm lượng nhỏ hơn đáng

kể so với mẫu tầng đáy (0 - 0,31 µg/g).

Với các mẫu ở Hạ Long chỉ có 3 trong tổng số 5 loài cá tầng mặt có phát

hiện thấy Phenol với hàm lượng nhỏ 0,05 - 0,09 µg/g. Không phát hiện thấy

Phenol trong cả 3 mẫu cá tầng mặt lấy ở khu vực này.

Khi so sánh giữa các loài ở hai khu vực trên có thể thấy rằng tất cả các

loài cá ở vùng biển Vũng Áng có hàm lượng Phenol lớn hơn rất nhiều so với

loài tương đương ở vùng biển Hạ Long, đặc biệt là các loại cá tầng đáy (Cá

0.35

0.3

0.25

0.2

Vũng Áng

0.15

Hạ Long

0.1

Đuối: gấp 560 lần, Cá Đục: 968 lần, Cá Hồng: 527 lần).

) g / g µ ( l o n e h P g n ợ ư

0.05

l

0

m à H

Cá Chích

Cá Khế

Cá Cơm Loại cá

http://www.lrc.tnu.edu.vn

48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

100

90

80

70

60

50

Vũng Áng

Hạ Long

40

Hình 3.8. Hàm lượng Phenol trong các loài cá sống ở tầng mặt

) g / g µ ( l o n e h P g n ợ ư

l

30

20

m à H

10

0

Loại cá

Cá Chẽm

Cá Đuối

Cá Đục

Cá Hồng

Cá Mú

Hình 3.9. Hàm lượng Phenol trong các loài cá sống ở tầng đáy

Từ các kết quả trên có thể đưa ra kết luận là đã có sự tích lũy Phenol với

hàm lượng tương đối lớn trong các loại cá ở Vũng Áng, đặc biệt là cá tầng đáy.

Ở Hạ Long chưa thấy có hiện tượng trên. Nguyên nhân của hiện tượng trên có

thể luận giải là do sự cố môi trường biển xảy ra vào tháng 4 năm 2016 gây ra

hiện tượng hải sản chết bất thường tại một số tỉnh ven biển miền Trung. Theo

đó, nước thải chưa qua xử lý có chứa lượng lớn độc tố Phenol đã được thải trực

tiếp vào vùng biển Vũng Áng và vịnh Sơn Dương gây độc cấp tính và tích lũy

trong các loại hải sản ở vùng biển này.

Mặt khác, các độc tố Phenol bị hấp phụ vào hệ keo sắt và lắng xuống đáy

là nguyên nhân của xu hướng tích lũy chủ yếu của Phenol trong các loài cá tầng

đáy.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu được của đề tài “Nghiên cứu xác định hàm lượng

phenol trong cá biển” chúng tôi rút ra kết luận sau:

1. Luận văn đã nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu và điều kiện

phân tích xác định phenol trong cá biển. Với điều kiện thực nghiệm đã lựa chọn,

phương pháp chuẩn bị mẫu và phân tích GC-MS có độ tin cậy, độ ổn định cao,

hệ số biến thiên thấp (3,30 - 4,35%), độ thu hồi trên 90% đối với với mẫu cá

biển, giới hạn phát hiện phenol là 0,0020 mg/kg và giới hạn định lượng =

0,0066 mg/kg. Với các kết quả trên, phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu

kiểm tra tồn lưu phenol trong cá biển nói riêng và mẫu hải sản nói chung ở nồng

độ thấp.

2. Sử dụng phương pháp đã xây dựng để tiến hành phân tích hàm lượng

phenol trong cá biển ở hai khu vực biển Vũng Áng thuộc tỉnh Hà Tĩnh và Hạ

Long thuộc tỉnh Quảng Ninh. Kết quả phân tích các mẫu cá cho thấy hàm lượng

phenol trong cá biển tại khu vực Vũng Áng cao hơn so với Khu vực Hạ Long.

Đặc biệt hàm lượng phenol trong các mẫu cá sống ở tầng đáy cao hơn so với

mẫu cá sống ở tầng mặt.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đỗ Đình Rãng, Đặng Đình Bạch, Nguyễn Thị Thanh Phong, Hóa học hữu

cơ 2, NXB Giáo dục, Hà Nội, 2009

2. W.McFadden, Techniques of Combined Gas Chromatography/ Mas

Spectrometry: Applications in Organic Analysis, Wiley - Interscience.

3. Phenol, http:/en.wikipedia.org/phenol, 1973.

4. Nguyễn Thị Thịnh, Nghiên cứu xác định phenol và các dẫn xuất

chlorophenol trong nước bằng phương pháp huỳnh quang phân tử, Luận

án Thạc sĩ Hóa phân tích, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 2004.

5. http://www.epa.gov/ttnatw01/hlthef/phenol.html

6. Độc học môi trường của phenol, http:hoangkimeci.com.vn

7. Hans-sJurgen Stan, Comprehensive Analytical Chemistry XLIII (Fernindez-

Alba (Ed.)) - Chapter 6 GC - MS. I: Basic principles and technical aspects of

GC - MS for pesticide residue analysis, Elsevier B.V., 2005.

8. Marvin McMaster and Christopher McMaster, GC/MS A Practical User’s

Guide, Wiley – VCH, 1998.

9. World Helth Organization (Geneva 1994), “Phenol Health and Safety

Guide”, UNEP and ILO.

10. APHA, “Standard Methods for the Examination of watere and waste

water”, 1995.

11. J. Ruana and I. Urbe, “Determination of phenols at the ng/l level in drinking

and river water by liquid chromatography with UV and electrochemical

detection”, Journal of Chromatography A, 1993.

12. J. Ruana and I. Urbe, “Determination of phenols at the ng/l level in drinking

and river waters by liquid chromatography with UV and electrochemical

detection”, Journal of Chromatography A, 1993.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

13. Bộ khoa học Công nghệ và môi trường, “TCVN 6216 :1996 (ISO

6439:1990)”, Xác định chỉ số phenol - Phương pháp trắc phổ dùng 4-

aminoantipyrin sau khi chưng cất, 1998.

14. ASTM D 1783 - 01, Standard Test Methods for Phenolnic Compounds in

water”.

15. Chunli Kang, Yong Wang, Runbo Li, Yaoguo Du, Jun Li, Bowen Zhang,

Ling Zhou, Yuzhong Du, “A modified spectrophotometric method for the

determination of trace amounts of phenol in water”, Michrochemical

Journal, 2000.

16. Karim D. Khalaf, Berwwen A. Hasan, Angel Morales Rubio and Miguel

de la Guardia, “Spectrophotometric determination of phenol and reaction

with p-aminophenol”, Talanta, 1994.

17. M. de la Guardia, K.D. Khalaf, B.A. Hasan, A. Morales - Rubio, J.J. Arias,

J.M. Garcia - Fraga, A.I. Jimenez and F. Jimenez, “Simultaneous kinetic

spectrophotometric determination of five phenolnic compounds by

reaction with p-aminophenol, Using Partial Least Squares Data

Treatment”, Analyst, 1996.

18. Hui - sheng Zhuang, Fan Zhang and Qiong - e Wang, “Determination of

volatile phenols by a flow injection chemiluminescent quench method”,

Analyst, 1995.

19. ASTM D 4763 - 88 (Reapproved 2001), “Standard Practice for

Identification of Chemicals in water by Fluorescence Spectroscopy”.

20. Nguyễn Đức Huệ, Các phương pháp phân tích hữu cơ, NXB Đại học Quốc

gia Hà Nội, Hà Nội, 2005.

21. Phạm Luận, Giáo trình hướng dẫn về những vấn đề cơ sở của các kỹ thuật

xử lý mẫu phân tích, Hà Nội, 1999.

22. JOHN WILEY, Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry,

Departmentof Chemistry and Environmental Science New Jersey of

Technology.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

23. John R. Dean, Extraction Methods for Environmental Analysis, John

Wiley & Sons, 1998

24. Greg LeBlanc, Ronald E. Majors, A Review of EPA Sample Preparation

Techniques for Organic Compound Analysis of Liquid and Solid Samples,

LCGC, www.chromatographyonline.com, 2001.

25. Nguyễn Đình Triệu. Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa học, NXB

Đạ học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội, 2006.

26. K.-H. Grobecker, A. Detcheva, "Validation of mercury determination by

solid sampling Zeeman atomic absorption spectrometry and a specially

designed furnace", Talanta, 2006.

27. W.R.L. Cairns, M. Ranaldo, R. Hennebelle, C. Turetta, G. Capodaglio,

C.F. Ferrari, A. Dommergue, P. Cescon, C. Barbante, "Speciation analysis

of mercury in seawater from the lagoon of Venice by on-line pre-

concentration HPLC-ICP-MS", Analytica Chimica Acta, 2008.

28. A. Shrivastava, V. Gupta, "Methods for the determination of limit of

detection and limit of quantitation of the analytical methods", Chronicles

of Young Scientists, 2011.

29. V.A. Lemos, L.O. dos Santos, "A new method for preconcentration and

determination of mercury in fish, shellfish and saliva by cold vapour

atomic absorption spectrometry", Food Chemistry, 2014.

http://www.lrc.tnu.edu.vn

53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

PHỤ LỤC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình ảnh Cá Khế

Hình ảnh Cá Đuối

http://www.lrc.tnu.edu.vn

1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Hình ảnh Cá Đục

Hình ảnh Cá Hồng

http://www.lrc.tnu.edu.vn

2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Hình ảnh Cá Mú

Hình ảnh Cá Cơm

http://www.lrc.tnu.edu.vn

3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Hình ảnh Cá Trích

Hình ảnh Cá Chẽm

http://www.lrc.tnu.edu.vn

4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN