Phân tích đột biến gen tARN, ND3 ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng: Luận văn Thạc sĩ Khoa học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------  -------

NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------------------

Nguyễn Thị Ngọc Tú

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN

TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội – 2012

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người

thầy đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và

thực hiện luận văn này.

Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự

giúp đỡ của TS. Đỗ Minh Hà và các anh chị, các bạn sinh viên làm việc tại Phòng

Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ

Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học tự nhiên. Tôi xin chân thành cảm ơn.

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm,

giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện

K Tam Hiệp, Hà Nội và khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức, Hà Nội. Tôi xin

chân thành cảm ơn.

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, Ban lãnh đạo và bạn bè đồng

nghiệp Bệnh viện 19-8 đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian học tập, nghiên cứu để

hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và

luôn bên tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, tháng 12 năm 2012

Học Viên

Nguyễn Thị Ngọc Tú

MỤC LỤC

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... a

DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... c

DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... d

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

Chương 1- TỔNG QUAN ....................................................................................... 3

1.1. TY THỂ ........................................................................................................ 3

1.1.1. Hệ genome ty thể ................................................................................... 3

1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể ....................................................... 5

1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thư .................................................... 7

1.2. UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ................................................................ 10

1.2.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng ...................................................... 10

1.2.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng ............................................... 11

1.2.3. Phân loại các dạng ung thư đại trực tràng theo mô học ......................... 12

1.2.4. Các phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng [20] ...................... 15

1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .. 16

1.3.1. Đột biến gen tARN của ADN ty thể ..................................................... 17

1.3.2. Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể ................................................. 19

1.3.3. Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh ... 22

1.3.4. Tình hình nghiên cứu ở trong nước ...................................................... 24

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................... 26

2.1. NGUYÊN LIỆU ......................................................................................... 26

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................... 26

2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 26

2.1.3. Thiết bị ................................................................................................ 27

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 28

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô ............................................................. 28

2.2.2. Khuếch đại đoạn gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR . 29

2.2.3. Phân tích RFLP .................................................................................... 31

2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn 32

2.2.5. Tinh sạch ADN .................................................................................... 35

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 37

3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN ĐIỂM A3243G CỦA GEN tARN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP ............................................................... 37

3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thư đại trực tràng .................. 37

3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen 3243 của ADN ty thể ....................................... 38

3.1.3. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể .......... 38

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH A10398G CỦA GEN ND3 ADN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP ............................................................... 40

3.2.1. Kết quả nhân đoạn gen 10398 của ADN ty thể ..................................... 40

3.2.2. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen mang đa hình A10398G .................. 41

3.2.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G ....................... 42

3.2.4. Phân tích mối liên quan giữa đa hình A10398G với các đặc điểm bệnh học lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng ........................................ 46

KẾT LUẬN ........................................................................................................... 59

KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 61

PHỤ LỤC................................................................................................................. i

Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân cùng đặc điểm lâm sàng ..................................... i

Phụ lục 2. Kết quả giải trình tự đoạn 10398 ........................................................ vi

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

Base pair (cặp bazơ) bp

Chronic progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt mắt cơ CPEO ngoài tiến triển mãn)

Cộng sự cs

DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography

(Sắc ký lỏng biến tính hiệu năng cao)

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EDTA

Leber hereditary optic neuropathy (Bệnh liệt thần kinh thị giác di

Kearn–Sayre syndrome (Hội chứng Kearn-Sayre) KSS

truyền Leber)

Leigh syndrome (Hội chứng Leigh)

LHON

Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke -like

episodes (Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện

tương tự đột quỵ)

Myoclonus epilepsy and ragged red fibers (Chứng động kinh co giật

MELAS

cơ và có sợi đỏ nham nhở)

MERRF

Neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa (Bệnh thần kinh, mất

mtDNA Mitochondrial DNA (ADN ty thể)

điều hòa và thoái hóa võng mạc)

NARP

NADH dehydrogenase 3 ND3

Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PCR

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

(Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn)

Reactive oxygen species (Các loại oxy phản ứng) ROS

Sodium dodecyl sulfate SDS

Single nucleotide polymorphism (Đa hình đơn nucleotide) SNP

Tris borate EDTA TBE

TNM TumorNodeMetastasis

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Hệ thống phân loại TNM đối với ung thư đại trực tràng [29] .................... 13

Bảng 2. Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác

nhau [29] ............................................................................................................... 15

Bảng 3. Thống kê mẫu sử dụng ............................................................................. 26

Bảng 4. Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 26

Bảng 5. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 27

Bảng 6. Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR ....................................... 29

Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l ......................... 30

Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI .... 32

Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6] ................. 33

Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6] ...... 34

Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thước 7cm 35

Bảng 12. Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực

tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng ........................................................... 46

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75]. ........................................................ 4

Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64] ........................................ 6

Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19] ....................... 8

Hình 4. Hình ảnh đại trực tràng [76]. ..................................................................... 11

Hình 5. Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [77]. ........................... 15

Hình 6. Một số đột biến điểm trên tARN ty thể người [59]. ................................... 17

Hình 7. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô ........................................ 37

Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243 ............................................... 38

Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 với enzyme HaeIII........................... 39

Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398 ............................................ 41

Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 với enzyme DdeI ......................... 42

Hình 12. Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến A10398G....................... 43

Hình 13. Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang đột biến với trình tự ADN

chuẩn của ty thể ..................................................................................................... 44

Hình 14. Kết quả giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G ................................. 44

Hình 15. Kết quả so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty

thể ......................................................................................................................... 45

Hình 16. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí mô. .................................. 48

Hình 17. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giới tính. ................................... 49

Hình 18. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo tuổi. .......................................... 50

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Hình 19. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí khối u. .............................. 51

Hình 20. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo kích thước u. ............................ 52

Hình 21. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo số hạch. .................................... 53

Hình 22. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giai đoạn TNM. ........................ 54

Hình 23. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo mức độ biệt hóa. ....................... 55

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

MỞ ĐẦU

Ty thể là bào quan phổ biến ở các tế bào nhân chuẩn. Ty thể được coi

là trung tâm năng lượng của tế bào, ở đây diễn ra quá trình chuyển hóa các hợp chất

hữu cơ thành năng lượng mà tế bào có thể sử dụng được là ATP. Ngoài ra, ty thể

còn đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa khác như apoptosis

(quá trình tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi

chất của tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32]. Cho đến nay, người ta

đã thống kê được trên 150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác nhau do ADN ty thể

quyết định. Các bệnh do rối loạn ADN ty thể thường được biểu hiện rất đa dạng,

chúng có thể liên quan đến rối loạn quá trình mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là

những đột biến do thay đổi các nucleotide [57].

Trong vài năm trở lại đây, những rối loạn ty thể liên quan đến các bệnh ty thể

được xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y

học. Đặc biệt, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể như một chỉ thị sinh học đang

phát triển nhanh chóng trong nhiều lĩnh vực khác nhau liên quan đến các bệnh

chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa, xác định các đặc tính di truyền quần thể sử dụng các

dấu chuẩn di truyền của mẹ… Trong số các lĩnh vực này phải kể đến ung thư – đề

tài thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học.

Ung thư đại trực tràng là một trong các loại ung thư phổ biến nhất trên thế

giới, đứng hàng thứ hai sau ung thư phế quản ở nam giới và ung thư vú ở nữ giới.

Trên thế giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh này và hàng năm có thêm

khoảng 600000 trường hợp mới được phát hiện [79]. Ở Việt Nam, ung thư đại trực

tràng cũng chiếm một tỷ lệ cao, đứng thứ hai về tỷ lệ mắc bệnh của ung thư đường

tiêu hóa, chỉ đứng sau ung thư dạ dày. Để đạt được hiệu quả điều trị tốt thì bệnh

nhân cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt. Với sự phát triển của khoa học, ngày

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

nay nghiên cứu ở mức độ phân tử, trong đó có nghiên cứu về đột biến ADN ty thể,

đang ngày càng góp phần vào công tác chẩn đoán và điều trị bệnh có hiệu quả.

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư

đại trực tràng”

với mục đích:

 Phát hiện đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân

ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật PCR-RFLP.

 Đánh giá mối liên quan giữa đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty

thể với các đặc điểm lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng ở người

Việt Nam.

Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc

Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Chương 1- TỔNG QUAN

1.1. TY THỂ

Ty thể là bào quan có chức năng chuyển hóa năng lượng trong chất dinh

dưỡng thành năng lượng trong ATP. Ty thể có trong tất cả tế bào nhân chuẩn. Ty

thể được Atman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 được Benda đặt tên là

mitochondria (theo tiếng Hy lạp- mito là sợi và chondria là hạt) vì chúng thường có

dạng sợi, hoặc dạng hạt khi quan sát dưới kính hiển vi thường [3].

Ty thể được coi là trung tâm năng lượng của tế bào vì là nơi chuyển hóa các

chất hữu cơ thành năng lượng tế bào có thể sử dụng được là ATP. Ngoài ra, ty thể

đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình chuyển hóa như: Apoptosis (quá trình

tự chết của tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển quá trình trao đổi chất của

tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32].

1.1.1. Hệ genome ty thể

Ty thể có chứa ADN, do đó nó là một hệ di truyền tự lập khác với hệ di

truyền của nhân tế bào. ADN ty thể là phân tử sợi kép, dạng vòng có kích thước

16569bp, gồm hai chuỗi khác nhau về thành phần nucleotide: chuỗi nặng có chứa

nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine. Chuỗi nặng mã hóa cho 28 gen,

chuỗi nhẹ mã cho 9 gen trong tổng số 37 gen của hệ gen ty thể. Trong 37 gen này có

13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa oxy

hóa. Số gen còn lại ghi mã cho 22 tARN, 2 rARN có vai trò trong sự dịch mã của ty

thể [10] (hình 1). Các chuỗi polypeptide còn lại cần thiết cho cấu trúc và chức năng

của ty thể đều được ghi mã bởi genome nhân và được tổng hợp trong ribosome của

tế bào chất.

Các nghiên cứu trên ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có những đặc trưng

riêng, phân biệt với hệ gen nhân. Hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng mẹ,

có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào. Các tế bào khác nhau có số

lượng bản copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu năng lượng trong mô [60]. Hệ

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

gen ty thể không có vùng intron và các gen không có, hoặc có rất ít các bazo không

mã hóa ở giữa chúng. Trong nhiều trường hợp không xuất hiện các codon kết thúc

mà chỉ có sự polyadenin hóa sau phiên mã. D- Loop là vùng duy nhất trong hệ gen

ty thể không tham gia mã hóa. Vùng D-Loop có kích thước 1,1 kb chứa các yếu tố

quan trọng cho quá trình phiên mã và dịch mã như chứa promoter phiên mã của

chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, có vùng gắn với các yếu tố phiên mã ADN ty thể…Khi

vùng D-Loop xảy ra đột biến sẽ ảnh hưởng tới tính toàn vẹn của các chuỗi

polypeptide được mã hóa trong ty thể [41].

Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75].

Các đặc điểm của hệ gen ty thể như không có intron, không có histon bảo vệ,

lại phân bố gần chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa, nơi mà các gốc tự do được tạo ra

trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, đã làm cho khả năng bị đột biến của ADN

ty thể cao hơn ở nhân (khoảng 10 lần) [51]. Bởi ADN ty thể có nhiều bản sao nên

phân tử bị đột biến có thể cùng tồn tại với dạng dại (wild type) không bị đột biến,

tạo nên hiện tượng không đồng nhất (heteroplasmy). ADN ty thể có thể ở dạng

đồng nhất (homoplasmy) khi tất cả các bản sao của genome ty thể là như nhau.

Trong nhiều trường hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây ra những biểu hiện

lâm sàng hay cả những biểu hiện hóa sinh cho tới khi nó đạt tới ngưỡng đột biến

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

[51]. Vì vậy, xác định được mức độ không đồng nhất của đột biến ADN ty thể có ý

nghĩa cao trong chẩn đoán bệnh ty thể.

1.1.2. Đột biến ADN ty thể và bệnh ty thể

Những đặc điểm của hệ gen ty thể được phát hiện từ đầu những năm 1980,

và tới năm 1988 những đột biến đầu tiên có liên quan tới các bệnh đã được tìm thấy

[68]. Bệnh ty thể là thuật ngữ được dùng để chỉ một nhóm các bệnh gây ra do các

hư hại trong quá trình tạo ATP. Khi lượng ATP được sinh ra thấp hơn nhu cầu tối

thiểu của mô thì bệnh ty thể sẽ xuất hiện do sự hư hỏng của các protein tham gia

vào chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa. Số lượng các phân tử ADN ở các mô, các cơ

quan là khác nhau do có nhu cầu năng lượng khác nhau. Bởi vậy, các mô bị ảnh

hưởng nhiều nhất của đột biến ADN ty thể là hệ thống thần kinh trung ương, cơ

xương, tim, thận, gan, tụy. Các bệnh được mô tả khá rõ dựa trên các biểu hiện lâm

sàng, hình thái và hóa sinh, tuy vậy bệnh khó nhận ra bởi biểu hiện lâm sàng của

bệnh rất biến đổi và khởi đầu bệnh diễn ra rất âm thầm, đặc biệt trong giai đoạn đứa

trẻ còn nhỏ [57]. Tuy nhiên, hiện nay, do tiến bộ của các phương pháp sinh học

phân tử, việc xác định bệnh ty thể đã có nhiều khả quan. Các nghiên cứu dịch tễ học

trong những năm gần đây cho thấy bệnh ty thể là một trong những bệnh liên quan

đến đột biến gen phổ biến ở người, ảnh hưởng tới ít nhất 1 trên 5000 người trong

quần cư dân [22] (hình 2).

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64]

Cho đến nay đã có hơn 150 đột biến ADN ty thể gây ra các bệnh ở người

được phát hiện. Các bệnh này có thể xuất hiện ở bất kỳ giai đoạn nào trong cuộc

đời, từ đứa bé mới sinh đến người trưởng thành ở mọi lứa tuổi. Ngoài ra, nhiều đột

biến được di truyền theo dòng mẹ, bởi vậy mà những chẩn đoán cho một người có

thể được dùng cho nhiều thế hệ trong gia đình [57]. Các nghiên cứu cho thấy đột

biến ADN ty thể có liên quan đến tình trạng cơ, thần kinh và tim mạch. Các đột

biến ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm và đột biến mất đoạn có liên quan tới

các bệnh ở người, hầu hết trong số đó ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương và

ngoại biên. Sau đây là một số bệnh có liên quan với đột biến ADN ty thể [57]:

Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (LHON): có tới 16 đột biến điểm

gây bệnh, tuy vậy chỉ có ba đột biến gây bệnh chính chiếm tới 90% là G3460A,

G11778A và T14484C. Cả ba đột biến này đều ở gen thuộc phức hệ I của chuỗi hô

hấp. Bệnh tiến triển cấp, bán cấp, mất thị lực trung tâm dẫn đến chức năng thị giác

chung giảm kèm chứng loạn màu sắc.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Bệnh thần kinh, sắc tố võng mạc, mất điều hòa (NARP): bệnh gây ra bởi đột

biến T8993G trên gen ATPasa 6 thuộc phức hệ V. Người bệnh có biểu hiện chậm

phát triển, sắc tố võng mạc, mất trí nhớ, mất điều hòa, yếu cơ thần kinh.

Hội chứng Leigh: Bệnh cũng gây ra bởi đột biến T8993G trên gen ATPasa 6,

giống với bệnh NARP, tuy nhiên bệnh nhân mang hơn 90% đột biến thể hiện hội

chứng Leigh. Người bệnh có biểu hiện rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển, biểu

hiện sớm trong năm đầu tiên của trẻ, có tổn thương ở một hoặc nhiều khu vực của

hệ thần kinh trung ương.

Bệnh viêm não tủy nhiễm acid lactic với các biểu hiện tương tự đột quỵ

(MELAS): bệnh gây ra bởi đột biến A3243G thuộc gen tRNA (leu). Bệnh có các

triệu chứng rối loạn thần kinh trung ương, liệt nửa người, mù và nôn mửa.

Chứng động kinh co giật cơ và có sợi đỏ nham nhở (MERRF): Bệnh gây ra

bởi đột biến A8344G, T8356C thuộc gen tRNA (lys). Người bệnh có biểu hiện tai

biến, co giật cơ, lưỡi, nhiễu loạn thính giác, suy nhược thần kinh do teo não, nhược

cơ.

1.1.3. Đột biến ADN ty thể và bệnh ung thư Mối liên quan giữa sự mất chức năng của ty thể với bệnh ung thư đã được

Otto Warburg lần đầu tiên phát hiện ra từ những năm 1930, khi ông giả thiết rằng

sự tăng tốc độ của quá trình đường phân hiếu khí trong nhiều loại mô u là do sự hư

hại chuỗi hô hấp trong những tế bào này [70]. Theo Warburg, một số biến đổi của ty

thể có liên quan đến ung thư là những đột biến của ADN ty thể, những biến đổi

trong sự biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị của chuỗi hô hấp.

Hoạt động của chuỗi hô hấp của ty thể có liên quan với sự tạo thành các loại

oxy phản ứng (Reactive oxygen species _ ROS). Trong điều kiện các electron bị

thừa quá mức (ví dụ như khi nhu cầu calo tăng lên), hoặc do sự ức chế phức hệ

enzym chuỗi hô hấp, các ROS được tạo ra rất nhiều. Sự tăng của ROS, hoặc stress

oxy hóa có thể gây đột biến ADN ty thể và nhân, làm hư hại các thành phần lipid và

protein nội bào. Hệ gen ty thể đặc biệt dễ dàng chịu tác dụng của ROS do phân bố

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

gần chuỗi hô hấp, khả năng sửa chữa sai hỏng bị giới hạn [51]. Đột biến ADN ty thể

có thể gây ra sự biểu hiện khác thường của các tiểu đơn vị thuộc chuỗi vận chuyển

điện tử được mã hóa bởi ADN ty thể, dẫn đến làm giảm độ hoạt động của chuỗi vận

chuyển điện tử, giảm khả năng phosphoryl hóa oxy hóa. Khi chuỗi vận chuyển điện

tử bị suy giảm về chức năng, nó sẽ tác động đến quá trình tạo thành ATP và ROS,

làm biến ðổi sự biểu hiện của một số gen nhân, tác động đến quá trình điều hòa

protein và quá trình tổng hợp nucleotide của tế bào. Như vậy biến đổi của hệ gen ty

thể có liên quan đến bệnh ung thư [27]. Một số đột biến ADN ty thể đã được xác

định trong nhiều loại ung thư khác nhau, như ung thư vú, đại trực tràng, buồng

trứng, ruột, gan, tụy, tuyến tiền liệt, phổi…Đột biến ADN ty thể có thể xuất hiện ở

vùng ghi mã và vùng không ghi mã [19] (hình 3). Cho đến nay nhiều dạng biến đổi

ADN ty thể đã được xác định trong ung thư. Các biến đổi này bao gồm: đột biến

điểm, thêm hoặc mất base, lặp đoạn, mất đoạn và thay đổi số lượng bản sao ADN ty

thể.

Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19]

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Đột biến điểm

Phân tích đột biến ADN ty thể ở bệnh ung thư vú, Tan và cs (2002) đã giải

trình tự genome ty thể trên 19 cặp mô ung thư và mô bình thường của cùng bệnh

nhân và đã cho thấy có 74% bệnh nhân mang đột biến soma, trong đó có 81,5% đột

biến thuộc vùng D-loop, phần còn lại (18,5%) được xác định trong các gen 16S

rRNA, ND2 và ATPase 6 [58]. Trong số các đột biến trên, đột biến thêm hoặc mất

base chiếm 42% thuộc vùng D-Loop, còn lại 52% là đột biến điểm thuộc vùng ghi

mã và không ghi mã [55].

Đột biến ADN ty thể được tìm thấy ở bệnh ung thư đại trực tràng. Polyak và

cs đã tìm thấy đột biến ADN ty thể trong các vùng ghi mã ND1, ND4, ND5,

cytochrome b, COXI, COXII và COXIII, cũng như các gen rRNA 12S và 16S [53].

Với bệnh ung thư buồng trứng, Liu và cs đã xác định được 60% đột biến

ADN ty thể, trong đó phần lớn là dạng đồng nhất (homoplasmy) và hầu hết là đột

biến điểm T→C hoặc G→A. Bốn vùng có các đột biến này là D-Loop, 12sRNA,

16S rRNA và cytochrome b, chứng tỏ các vùng này là những vùng nóng có khả

năng bị đột biến cao trong bệnh ung thư buồng trứng [45].

Phân tích ở bệnh ung thư dạ dày, Wu và cs đã xác định được 48% mang đột

biến soma ở vùng D-Loop, trong số đó có tới 67% là đột biến thêm hoặc mất base

tại vị trí nucleotide 303-309 (vị trí D310) [72].

Mất đoạn

ADN ty thể bị mất một đoạn lớn, như mất đoạn 4977 bp, đã được xác định ở

ung thư vú [14], ung thư đại trực tràng [21]. Trong một nghiên cứu khác, Burgart và

cs đã tìm thấy đột biến mất đoạn nhỏ (50bp) trong vùng D-Loop ở 4/32 (12,5%)

bệnh nhân ung thư dạ dày [17].

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Thêm đoạn

Wu và cs đã xác định được đột biến thêm đoạn nhỏ (≈260bp và ≈520bp)

trong vùng D-Loop của ADN ty thể trong mô ung thư của 1 bệnh nhân ung thư dạ

dày [72]. Hai đột biến này đặc trưng bởi có 2 hoặc 3 đoạn lặp lại kế tiếp nhau.

Thay đổi số bản sao ADN ty thể

Biến đổi về số bản sao ADN ty thể đã được phát hiện ở nhiều loại bệnh ung

thư. Số bản sao ADN ty thể tăng ở ung thư tuyến giáp [47], ung thư phổi [15], ung

thư đại trực tràng [44]. Biến đổi theo hướng giảm số bản sao ADN ty thể được xác

định thấy ở bệnh ung thư vú [63], ung thư biểu mô tế bào gan [42], ung thư buồng

trứng [69]. Như vậy biến đổi về hàm lượng ADN ty thể có liên quan với loại ung

thư.

Người ta cho rằng số lượng bản sao ADN ty thể trong bệnh ung thư có thể

phụ thuộc vị trí của đột biến trong bệnh ung thư đó. Ví dụ như các đột biến trong

vùng D-Loop, điều khiển sự nhân bản ADN ty thể sẽ làm giảm số bản copy. Mặt

khác, đột biến ADN ty thể ở các gen mã hóa cho các protein của chuỗi phosphoryl

hóa oxy hóa lại có thể làm tăng số bản copy, như là một cách để đáp ứng lại sự mất

chức năng của ty thể [38].

1.2. UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.2.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng hay còn gọi là ung thư ruột kết (colon cancer) bao gồm

ung thư đại tràng và ung thư trực tràng. Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N bao

gồm các đoạn ruột kết lên (ascending colon), đoạn ngang (transverse colon) và đoạn

xuống (descending colon). Trực tràng (rectum) là phần ruột thẳng để chứa phân, nối

giữa đại tràng và hậu môn (hình 4). Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng

và trực tràng, thường hai loại ung thư này có liên hệ với nhau và khó có thể xác

định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau vì thế thường được gọi chung

là ung thư đại trực tràng [79].

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Hình 4. Hình ảnh đại trực tràng [76].

Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế

giới hiện nay, chiếm tỉ lệ cao thứ 3 trong các trường hợp được chẩn đoán là do ung

thư. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 1 triệu ca mắc mới và trên nửa triệu ca tử

vong. Tỉ lệ mắc bệnh không giống nhau, ước tính tỉ lệ bệnh nhân ở các nước phát

triển (Mỹ, Nhật) cao gấp 4–10 lần các nước đang phát triển. Trên thực tế, số lượng

bệnh nhân ở cả hai nhóm nước đang gia tăng nhanh chóng do sự già hóa dân số và

đời sống ngày càng được nâng cao. Ung thư đại trực tràng thường được phát hiện ở

giai đoạn sau 45–50 tuổi, ở tuổi 70 là đa số (khoảng ½ số người), tuy nhiên bệnh có

xu hướng trẻ hóa do chế độ ăn uống, sinh hoạt, sử dụng nhiều rượu bia, thuốc lá

[78].

1.2.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng

Ung thư đại trực tràng bắt nguồn từ một polyp tuyến khởi sinh. Có 2 dạng polyp

phổ biến ở ung thư đại trực tràng là: polyp không phải khối u, không phát sinh ung thư

sau này và polyp ác tính, sẽ phát triển thành u tuyến nhỏ với mức độ loạn sản cao rồi

thành u tuyến lớn và dần hình thành ung thư xâm lấn. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu

lại cho rằng nguy cơ mắc ung thư trực tràng tăng lên ở một số gia đình nhiều thành

viên là do ảnh hưởng của dạng polyp không phải khối u [33]. Các nhà khoa học chỉ ra

rằng có rất nhiều nguyên nhân hình thành ung thư đại trực tràng và tất cả đều dẫn đến

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

việc biến đổi bệnh học xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thường. Thống

kê cho thấy có 2 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh này đó là:

 Yếu tố di truyền: Hoạt hóa các gen tiền ung thư, bất hoạt các gen ức chế khối

u, sai hỏng trong sửa chữa ADN và di truyền gia đình.

 Yếu tố không di truyền: các tác nhân vật lí, hóa học; quá trình lão hóa, chế

độ ăn uống ít xơ, giàu đạm hay thói quen sử dụng bia rượu, hút thuốc lá

thường xuyên có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng,

gây viêm loét đại tràng.

Ngoài 2 nhóm nguyên nhân chính trên còn có các nguyên nhân khác như tuổi,

giới tính, chủng tộc cũng góp phần làm tăng nguy cơ dẫn đến ung thư đại trực tràng

[33].

1.2.3. Phân loại các dạng ung thư đại trực tràng theo mô học

Theo phân loại mô học của Tổ chức Y tế thế giới năm 2000, các u biểu mô đại

trực tràng gồm các dạng: u tuyến, ung thư biểu mô, carcinoid (u nội tiết biệt hóa

cao), ung thư biểu mô tuyến – carcinoid kết hợp. Ngoài ra, một số dạng hiếm gặp

khác như sacom (gồm các sacom cơ trơn, sacom mạch máu, sacom mỡ với tổn

thương dạng khối lớn), u hắc tố ác tính, ung thư biểu mô tế bào hình thoi (xuất hiện

riêng lẻ hay kết hợp với ung thư biểu mô tuyến hoặc ung thư biểu mô vảy và được

gọi là ung thư biểu mô – sacom), ung thư biểu mô tế bào sáng (xuất hiện riêng lẻ hay

kết hợp với một loại khác của ung thư đại trực tràng), ung thư biểu mô vảy đơn

thuần…Trong các dạng này thì ung thư biểu mô tuyến là dạng rất hay gặp, chiếm

đến 95% trong tổng số các dạng ung thư đại trực tràng. Đây là dạng ung thư xuất

phát từ niêm mạc ruột với tổn thương ban đầu có dạng nốt nhỏ, gồ cao, khi có phát

sinh từ một u tuyến, biểu hiện của nó được xác định theo các giai đoạn phát triển và

loại cấu trúc trước đó là dạng polyp hay dạng nhú [7].

Hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng:

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Việc xác định giai đoạn của ung thư cho biết kích thước của khối u và mức độ

lan rộng của nó khỏi vị trí ban đầu có ý nghĩa rất quan trọng, giúp cho bác sĩ quyết

định liệu pháp phù hợp nhất để điều trị ung thư. Hiện nay có một số hệ thống phân

giai đoạn ung thư được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Sự khác nhau giữa các hệ

thống này phụ thuộc vào mục đích của từng người sử dụng trong việc chẩn đoán và

bệnh án của từng bệnh nhân [20]. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đề cập

đến hệ thống TNM (Tumor–Lymph Node–Metastases). Đây là hệ thống phân loại

được áp dụng đối với các mẫu chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu.

Hệ thống TNM phân giai đoạn ung thư đại trực tràng dựa vào kích thước, mức

độ lan rộng của khối u đến các hạch bạch huyết (Bảng 1). Trong đó:

T cho biết kích cỡ, mức độ lan sâu vào thành ruột của khối u.

N cho biết cho khối u đã lan đến các hạch bạch huyết chưa và số lượng hạch bạch

huyết bị lây nhiễm.

M cho biết mức độ di căn của ung thư đến các cơ quan hoặc bộ phận khác của cơ thể.

Bảng 1. Hệ thống phân loại TNM đối với ung thư đại trực tràng [29]

T – Khối u nguyên phát

Tx  U nguyên phát không được đánh giá

T0  Không có bằng chứng của u nguyên phát

Tis – Ung thư biểu mô tại chỗ: nội biểu mô hay xâm nhập lớp đệm

T1 – Ung thư biểu mô xâm nhập hạ niêm mạc

T2 – Ung thư biểu mô xâm nhập lớp đệm cơ niêm

T3 – Ung thư biểu mô xâm nhập qua lớp đệm cơ niêm tới dưới thanh mạc hoặc vào mô

quanh đại tràng và trực tràng không có phúc mạc

T4 – U xâm nhập trực tiếp các cơ quan khác hoặc cấu trúc và/ hoặc gây thủng phúc

mạc tạng

N – Hạch lympho

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Nx – Hạch bạch huyết vùng không được đánh giá

N0 – Không di căn hạch bạch huyết vùng

N1 – Di căn 1 đến 3 hạch bạch huyết vùng

N2 – Di căn 4 đến nhiều hơn hạch bạch huyết vùng

M – Di căn xa

Mx – Di căn xa không được đánh giá

M0 – Không có di căn xa

M1 – Di căn xa

Nói chung, ung thư đại trực tràng được chia làm các giai đoạn (hình 5) [29]:

 Giai đoạn 0: Trong giai đoạn 0, các tế bào bất thường được tìm thấy trong các lớp

trong cùng của đại trực tràng. Những tế bào bất thường có thể trở thành ung thư và

lây lan vào các mô bình thường gần đó. Giai đoạn 0 cũng được gọi là ung thư biểu

mô tại chỗ.

 Giai đoạn I: Ung thư đã bắt đầu lây lan, nhưng vẫn còn trong lớp lót bên trong.

 Giai đoạn II: Ung thư đã lan đến các cơ quan khác ở gần đại trực tràng hoặc trực

tràng nhưng chưa lây lan đến các hạch bạch huyết.

 Giai đoạn III: Ung thư đã lan đến hạch bạch huyết nhưng chưa lan đến những

phần xa của cơ thể.

 Giai đoạn IV: Ung thư đã lan đến các phần xa của cơ thể thông qua hệ thống bạch

huyết, được gọi là di căn. Các cơ quan mà ung thư đại trực tràng thường di căn đến

là phổi và gan.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Hình 5. Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [77].

Tỷ lệ sống sót của bệnh nhân ở các giai đoạn bệnh được thể hiện trong bảng 2.

Bảng 2. Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau [29]

Giai đoạn TNM Khả năng sống sót sau 5 năm

Giai đoạn 0 100% Tis N0 M0

Giai đoạn I 8095%

Giai đoạn IIA 7275% T12N0M0 T3N0M0

Giai đoạn IIB 6566% T4N0M0

Giai đoạn IIIA 5560% T12N1M0

Giai đoạn IIIB 3542% T34N1M0

Giai đoạn IIIC 2527% T bất kỳ, N2M0

07% T bất kỳ, N bất kỳ, M1

Giai đoạn IV

1.2.4. Các phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng [20]

Ngày nay, sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là các kỹ

thuật sinh học phân tử đã góp phần chẩn đoán, phân biệt, phát hiện sớm và theo dõi

hiệu quả điều trị ung thư đại trực tràng. Các phương pháp chẩn đoán bệnh này bao

gồm:

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

 Chẩn đoán lâm sàng có thể dựa trên các triệu chứng: tiêu chảy hoặc táo bón,

có máu lẫn trong phân, phân chặt, khó chịu chung ở bụng (căng phồng hoặc co

thắt), đầy hơi thường xuyên, sụt cân không rõ lý do.

 Chẩn đoán hình ảnh: phương pháp phổ biến nhất hiện nay đó là nội soi đại

tràng sigma bằng ống soi mềm giúp nhìn rõ các khối u và làm sinh thiết.

 Chẩn đoán mô học và tế bào học: phương pháp này cho phép phân biệt giữa

các tế bào bình thường, loạn sản và ung thư biểu mô tại chỗ. Phổ biến hơn cả là kỹ

thuật chọc hút kim nhỏ.

 Chẩn đoán dựa vào xét nghiệm sinh hóa máu: Một số các xét nghiệm phổ

biến có thể kể tới là xét nghiệm sinh hóa phát hiện kháng nguyên ung thư (CEA),

xét nghiệm máu trong phân (FOBT).

1.3. ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu phát hiện đột biến ADN ty thể ở vùng mã

hóa và vùng không mã hóa (D-Loop) ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Năm

1998, Polyak và cs đã xác định được đột biến ADN ty thể ở các vùng mã hóa: ND1,

ND4L, ND5, cytochrome b, COXI, COXII và COXIII, cũng như các gen rRNA 12S

và 16S [53].

Trong một nghiên cứu khác, Mansoureh và cs khi phân tích cặp mô thường

và mô bệnh của 30 bệnh nhân ung thư đại trực tràng, đã phát hiện 15 mẫu mang đột

biến trên vùng ND1, trong đó có 7 đột biến khác nhau. Đột biến T4216C chiếm

27%, khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa mô thường và mô bệnh [49].

Alonso và cs (1997) xác định sự có mặt của đột biến ADN ty thể (23%) trên

vùng D-Loop. Những đột biến này là đột biến điểm A→T, G→C, đột biến mất 1bp,

và đột biến thêm 2 bp [9]. Skonieczna và cs (2012) khi tổng kết lại một số nghiên

cứu về đột biến điểm của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thấy rằng

88,6% đột biến là dạng transition (biến đổi giữa các purin (A, G) hoặc giữa các

pyrimidine (C, T), 11,4% còn lại là đột biến dạng transversion (biến đổi giữa một

purin với một pyrimidine). Khoảng 19% đột biến điểm nằm trên các gen rRNA.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

60% đột biến nằm trên các gen mã hóa cho protein, trong đó 85% số đột biến này

làm thay đổi acid amin [56]. Trong luận văn này chúng tôi muốn đi sâu vào đột biến ADN ty thể trên gen tARN (Leu) (tại vị trí A3243G) và gen ND3 (tại vị trí

A10398G).

1.3.1. Đột biến gen tARN của ADN ty thể

Đột biến điểm tARN ty thể là đột biến chiếm phần lớn trong các đột biến ty

thể gây ra bệnh ty thể. Hai đột biến tARN được phát hiện đầu tiên là A8344G trên tRNALys và A3243G trên tARNLeu(UUR) là phổ biến và được nghiên cứu nhiều nhất.

Đột biến A3243G có liên quan đến rất nhiều biểu hiện lâm sàng và thường gây ra

hội chứng MELAS [31]. MELAS cũng có thể bị gây ra bởi những đột biến khác trên tARNLeu(UUR). Đột biến A8344G liên quan đến chứng MERRF, cũng là bệnh về cơ thần kinh. Bệnh này còn có thể bị gây ra bởi một vài đột biến khác trên tRNALys [56]. Ngoài ra, có thể kể đến đột biến A7445G trên tARNSer(UCN) có liên quan đến bệnh mất thính giác [54], đột biến A4269G trên tRNAIle gây bệnh liệt cơ tim hoặc

liệt mắt cơ ngoài tiến triển mãn (CPEO) [59] (hình 6).

Hình 6. Một số đột biến điểm trên tARN ty thể người [59].

1.3.1.1. Đột biến A3243G và các bệnh liên quan

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Đột biến A3243G trên gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu (UUR) đã được phát

hiện ra đầu tiên như là một nguyên nhân di truyền của bệnh MELAS [31]. Đột biến

A3243G liên quan tới MELAS là một trong số những đột biến gây bệnh phổ biến

nhất của ty thể với tần số được xác định trong khoảng từ 0,95- 18,4/100000 dân số

Bắc Âu [22]. Đột biến điểm mtDNA A3243G được gây ra bởi sự thay thế Adenine ở vị trí 3243 thành Guanine trên gen mã hóa cho tRNALeu (UUR) của ADN ty thể.

Đột biến này làm thay đổi nucleotide của bộ ba đối mã dẫn đến ảnh hưởng tới quá

trình tổng hợp protein ty thể và giảm hoạt động của các phức hệ của chuỗi hô hấp

[28].

Cũng giống như nhiều đột biến ảnh hưởng tới chuỗi hô hấp, đột biến

A3243G không chỉ có ảnh hưởng tới bệnh MELAS, nó còn ảnh hưởng tới một số

bệnh khác, gồm CPEO và DMDF (đái tháo đường và điếc)…[36]. Đột biến này

thường ở dạng không đồng nhất (heteroplasmic), có nghĩa là ADN dạng dại và dạng

đột biến cùng tồn tại trong một tế bào. Các biểu hiện lâm sàng của bệnh xuất hiện

khi các phân tử ADN mang đột biến đạt đến một tỷ lệ nhất định. Tỷ lệ này ở các mô

và các bệnh khác nhau là khác nhau. Wallace và cs (2002) đã xác định được tỷ lệ

không đồng nhất ở trong máu bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường do bị đột biến

A3243G ADN ty thể là 10%, trong khi đó tỷ lệ này trong mô cơ hoặc não ở bệnh

nhân mắc bệnh MELAS có thể tới 70% [67].

1.3.1.2. Đột biến A3243 và bệnh ung thư đại trực tràng

Cho đến nay các nghiên cứu về đột biến A3243G chỉ tập trung vào một số

bệnh cơ thần kinh, tiểu đường. Chỉ có một nghiên cứu duy nhất phát hiện đột biến

A3243G trên bệnh nhân ung thư trực tràng. Lorenc và cs (năm 2003) khi nghiên

cứu các đột biến ADN ty thể gồm đột biến tRNA, rRNA và một số gen ty thể trên

một số mẫu ung thư, đã phát hiện một mẫu ung thư trực tràng có đột biến A3243G

dạng đồng nhất (homoplasmic) [46].

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

1.3.2. Đa hình trên gen ND3 của ADN ty thể

Cũng giống như genome nhân, hệ gen ty thể mang những trình tự đa hình.

Đa hình là sự khác biệt về chuỗi ADN giữa những cá thể, các nhóm, hoặc các quần

thể. Nó bao gồm đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide polymorphism - SNP),

các chuỗi lặp, thêm đoạn, mất đoạn và tái tổ hợp. Đa hình gen có thể là kết quả của

sự thay đổi quá trình, hoặc được tạo nên bởi yếu tố bên ngoài (như virus hoặc chiếu

xạ) [35]. Người ta cho rằng đa hình giúp ty thể ít nhạy cảm hơn với sự thay đổi

năng lượng, do đó tạo nhiều nhiệt và các gốc tự do, giúp con người thích ứng khi di

cư tới nơi có khí hậu lạnh hơn, như từ châu Phi sang châu Âu [52]. Ngày nay, số

lượng đa hình được biết đến đã vượt quá 1000 [22]. Một số nghiên cứu gần đây cho

thấy đa hình ở ty thể có liên quan đến một số bệnh như: đái đường [34] , bệnh

Parkinson [22], Alzheimer [24], và một số bệnh ung thư như ung thư vú [18], ung

thư tuyến tiền liệt [16], ung thư đại trực tràng [40], ung thư phổi [23]…

1.3.2.1. Đa hình A10398G và các bệnh

Vị trí nucleotide 10398 trên gen ND3 trong hệ genom ty thể người có tính đa

hình cao. Đa hình này làm biến đổi Threonine (alen A) thành Alanine (alen G) ở

đầu C của dưới đơn vị ND3 của phức hệ I của chuỗi hô hấp. Đa hình 10398A tăng

trong các bệnh thoái hóa thần kinh tuổi già như bệnh Parkinson [66], Alzheimer

[65], và bệnh teo cơ xơ cứng [48]. Ngoài ra trong một nghiên cứu của các nhà khoa

học Trung Quốc đã cho thấy alen G trong thay thế 10398AG làm tăng nguy cơ

gây hội chứng chuyển hóa [34].

A10398G là một trong những SNP thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà

khoa học bởi nó có liên quan với việc tạo thành những khối u. Canter và cs (2005)

lần đầu tiên phát hiện mối liên quan giữa đa hình 10398A với bệnh ung thư vú trên

những người phụ nữ Mỹ gốc Phi, nhưng không thấy mối liên hệ nào ở người Mỹ da

trắng. Các tác giả cho rằng sự tương tác giữa các yếu tố gen và môi trường có thể

gây ra sự khác nhau giữa các tộc người [18]. Tuy vậy, trong một số nghiên cứu khác

trên đối tượng là phụ nữ Mỹ gốc Phi không thấy vai trò của đa hình 10398A đối với

sự phát triển của ung thư vú [55]. Trong nghiên cứu này, các tác giả đã giải thích sự

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

khác nhau về kết quả của các nghiên cứu này là do sự khác nhau của các điều kiện

trong các khu vực địa lý khác nhau. Bai và cs (2007) khi nghiên cứu trên 156 người

phụ nữ Mỹ gốc Âu mắc bệnh ung thư vú và 260 mẫu đối chứng thấy rằng 10398G

có liên quan với làm tăng nguy cơ ung thư vú [12]. Một nghiên cứu độc lập khác

cũng phát hiện 10398G có liên quan với sự phát triển ung thư vú trên đối tượng là

người Ba Lan [25]. Khi nghiên cứu trên đối tượng là người Mỹ gốc Phi mắc ung thư

tiền liệt tuyến, người ta thấy rằng 10398G làm tăng tỷ lệ và mức độ ác tính của

bệnh. Trong một nghiên cứu khác, 10398G được tìm thấy ở bệnh ung thư tuyến

giáp [74]. Nghiên cứu của Choi và cs (2011) đã xác định vị trí 10398 trên gen ND3

là điểm nóng gây đột biến ở bệnh ung thư phổi [23]. Theo trình tự ADN ty thể sửa

lại của Cambridge, base kiểu dại là A, tuy vậy ở nhiều quần thể G lại là kiểu dại

[11]. Kết quả của các nghiên cứu về đa hình A10398G còn nhiều trái ngược và chưa

kết luận được alen nào có liên quan đến bệnh lý.

Để giải thích cho những kết quả dường như trái ngược này, Fang và cs

(2010) cho rằng sự kết hợp giữa đa hình nucleotide đơn của ADN ty thể với các yếu

tố khác được mã hóa bởi nhân có thể đóng vai trò trong việc hình thành khối u. Kết

quả tiếp theo có thể là sự thay đổi của tín hiệu calci hoặc tín hiệu khử [30]. Ngoài

ra, theo một số nhà nghiên cứu, sự tăng của ROS là một cơ chế mà nhờ đó các SNPs

ty thể tham gia vào quá trình phát triển khối u. Nó có thể hoạt hóa con đường hình

thành ung thư, hoặc có thể hoạt hóa phản ứng apoptosis (chết theo chương trình)

vốn đóng vai trò bảo vệ trong giai đoạn cuối của ung thư. Kết quả của sự biến đổi

A→G ở vị trí 10398 dẫn tới sự thay thế threonine bằng alanine ở vị trí 114 thuộc

dưới đơn vị ND3 của phức hệ I. Phức hệ này có tham gia vào quá trình tạo gốc tự -. Sự biến do trong ty thể, cung cấp electron cho oxy, tạo thành superoxide anion O2

đổi của gen ND3 thuộc phức hệ I có thể đã làm tăng sự thoát ra của electron và sự

tạo thành ROS. Để hiểu hơn về vai trò của alen A và G trong đa hình A10398G,

nhóm nghiên cứu của Kazuno (2006) đã xác định sự ảnh hưởng của đa hình ADN ty

thể tới giá trị pH của chất nền và sự biến đổi của calci nội bào. Kết quả nghiên cứu

cho thấy cybrid mang đa hình 10398A có pH chất nền ty thể thấp hơn cybrid mang

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

10398G. Ngoài ra, 10398A cybrid có nồng độ calci tăng và có thể đạt mức calci cao

hơn khi bị kích thích bởi histamine so với 10398G [37]. Ngoài ra, threonine có thể

tạo liên kết hidro liên kết chéo giữa các chuỗi protein và dễ dàng chịu sự biến đổi

sau dịch mã. Trong khi đó, nguyên tử carbon ở vị trí α của alanine liên kết với nhóm

methyl. Nhóm methyl này không hoạt hóa và gần như không tham gia trực tiếp vào

chức năng của protein. Tuy vậy, sự thay thế của các acid amin này vẫn chưa được

nghiên cứu ở mức độ hóa sinh in vivo.

1.3.2.2. Đa hình ADN ty thể với ung thư đại trực tràng

Nghiên cứu về SNPs trên bệnh ung thư đại trực tràng đã được Lascorz và cs

(2012) thực hiện trên 613 bệnh nhân ở khu vực miền bắc nước Đức [40]. Kết quả

cho thấy có hai SNPs thuộc vùng UQCRB (phức hệ III)là rs7836698 và rs10504961

có liên quan với khả năng sống sót. Ba SNPs có liên quan với sự tiến triển của bệnh

ung thư đại trực tràng, trong đó hai SNPs thuộc gen COX6B1 (phức hệ IV) là

rs6510502 và rs10420252 có liên quan tới sự xuất hiện của hạch lympho, rs6510502

còn liên quan tới di căn xa. Đa hình rs7971637 trên gen GAPDH có liên quan tới

khối u giai đoạn T3/T4.

Nghiên cứu về đa hình của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

trên quần thể người Anh và Scotland cho thấy có 132 SNPs ở quần thể người Anh

và 140 SNPs ở quần thể người Scotland [61, 71]. Ở quần thể người Scotland, alen G

xuất hiện cao hơn ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở vị trí 750, 1438 (trên gen 12

rRNA), 4769 (trên gen ND2). Ở quần thể người Anh không quan sát thấy mối quan

hệ này.

Cho đến nay, trên thế giới có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa đa

hình A10398G với bệnh ung thư đại trực tràng. Fang và cs (2010) khi nghiên cứu

các đa hình đặc trưng của các nhóm đơn bội (haplogroups) trên 108 bệnh nhân mắc

bệnh ung thư vú, đại trực tràng và tuyến giáp ở khu vực miền Nam Trung Quốc đã

tìm thấy mối liên quan giữa các bệnh nhân thuộc nhóm M với tăng nguy cơ mắc

ung thư vú, thuộc nhóm D4a với tăng nguy cơ ung thư tuyến giáp. Tuy nhiên, các

tác giả không phát hiện được mối liên quan nào giữa nhóm đơn bội ADN ty thể,

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

trong đó có đa hình A10398G thuộc nhóm N với sự tiến triển của bệnh ung thư đại

trực tràng [30]. Mối liên quan giữa nhóm đơn bội trong quần thể người Anh và

Scotland với bệnh ung thư đại trực tràng cũng được phân tích ở các nghiên cứu [61,

71], tuy vậy không phát hiện được sự khác biệt nào có ý nghĩa thống kê.

1.3.3. Các phương pháp phát hiện đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh

Các đột biến ADN ty thể phần lớn ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy),

các đặc điểm lâm sàng của bệnh chỉ biểu hiện khi tỷ lệ không đồng nhất này đạt đến

một mức độ nhất định tùy thuộc vào loại mô, tế bào. Bởi vậy để chẩn đoán được

bệnh chính xác và kịp thời, người ta thường sử dụng các kỹ thuật phân tích trực tiếp

ADN ty thể.

Phương pháp PCR-RFLP

Phương pháp cơ bản và được sử dụng phổ biến nhất để xác định đột biến

điểm của ADN ty thể là PCR-RFLP. Đây là sự kết hợp kỹ thuật PCR với kỹ thuật

xác định đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP). Đầu tiên, đoạn ADN ty thể

có chứa đột biến được nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau

đó được cắt bởi enzym giới hạn thích hợp. Cuối cùng, các đột biến sẽ được nhận

biết qua phổ băng điện di. Phương pháp PCR-RFLP giúp phát hiện đột biến thuận

lợi, nhanh chóng và không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền.

Phương pháp giải trình tự

Để khẳng định chính xác đột biến, người ta phải xác định trình tự nucleotide

đoạn ADN mang đột biến. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự

hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977,

được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt là phương pháp dideoxy).

Theo phương pháp này, một trình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ

thể trên chuỗi ADN bằng cách sử dụng một oligonucleotide ngắn, có trình tự bổ

sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó. Các mồi oligonucleotide được kéo dài nhờ

tác dụng của enzyme ADN polymerase. Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại

deoxynucleotide A, T, G, C trong đó có một loại là di-deoxynucleotide để ngắt phản

ứng kéo dài chuỗi. Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

trên gel polyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự

ADN. Ngày nay, phương pháp giải trình tự tự động được áp dụng rộng rãi ở các

phòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản vẫn áp dụng nguyên lý như trên.

Người ta đã tiến hành cải tiến, sử dụng chất huỳnh quang, cho phép xác định chính

xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao. Ưu điểm lớn nhất của

giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loại đột biến, vị trí,

hậu quả. Tuy nhiên nó có hạn chế là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADN phải có độ

tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền. Ngoài ra, tỷ lệ không đồng nhất

mà phương pháp này có thể xác định được khoảng 25% trở lên.

Với mục tiêu phát hiện sớm bệnh ở giai đoạn đầu để điều trị, người ta sử

dụng một số phương pháp có khả năng phát hiện mức độ không đồng nhất của ADN

ty thể ở một tỷ lệ rất thấp mà phương pháp PCR-RFLP không phân tích được. Đó là

phương pháp PCR định lượng (Realtime PCR) và sắc ký lỏng hiệu năng cao biến

tính (DHPLC).

Phương pháp Realtime PCR

Realtime PCR sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng

lượng ADN được nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu

huỳnh quang. PCR định lượng cho phép xác định số bản sao ADN ty thể ban đầu có

trong mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Có hai loại phương pháp phân tích hay

được sử dụng:

- Phương pháp sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN: Chất nhuộm này có ái

lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi ADN, làm cho sợi đôi ADN phát được

ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.

- Phương pháp sử dụng đầu dò oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh quang.

Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp

của đầu dò lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, khi đó sẽ có sự phát

huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích.

Phương pháp PCR định lượng cho phép định lượng đột biến ADN ty thể với mức

độ không đồng nhất thấp dưới 1% [73].

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính (DHPLC)

Phương pháp DHPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nước trên cơ sở sắc ký lỏng pha

đảo để phân tách ADN dị sợi kép (heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex) tại

nhiệt độ tối ưu. Các mạch ADN được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ

xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi

không chính xác. Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với

sợi kép bình thường [43]. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này để sàng

lọc toàn bộ genome ty thể, hoặc một vùng nhất định của ADN ty thể để xác định đột

biến. Để định lượng mức độ không đồng nhất của ty thể, người ta đã xác định mối

quan hệ giữa diện tích của đỉnh sắc ký có dị sợi kép và mức độ không đồng nhất của

ty thể. Phương pháp DHPLC cho phép định lượng đột biến ADN ty thể thấp tới 1%

[43].

1.3.4. Tình hình nghiên cứu ở trong nước Cho đến nay các nghiên cứu về đột biến ADN ty thể ở người Việt Nam vẫn

chưa nhiều, số liệu còn hạn chế và chưa có tính hệ thống.

Phan Văn Chi và cs (2004) khi nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc

người Việt Nam đã tìm thấy một số biến đổi của ADN ty thể ở người Việt Nam

thuộc vùng D-loop, các gen ND1, ND2, ND5, ND6, cytochrome b, rRNA 12S, rRNA

16S, COXI, COXII, COXIII, ATP6, ATP8. Ngoài ra, trong nghiên cứu này đã tìm

thấy đột biến A3243G ở bệnh nhân mắc bệnh MELAS (2/34 bệnh nhân mang đột

biến) [2].

Chu Văn Mẫn và cs (2009) đã sử dụng phương pháp PCR-RFLP kết hợp giải

trình tự ADN và đã xác định thấy đột biến A3243G có mặt ở bệnh nhân và mẹ bệnh

nhân trong một gia đình có người mắc hội chứng MELAS [4].

Phạm Hùng Vân và cs (2010) đã sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp

ADN ty thể tách chiết từ máu bệnh nhân mang bệnh LEBER, và đã xác định thấy

9/12 ca có đột biến ADN ty thể, 7 trong số 9 ca này mang đột biến G11778A là đột

biến nặng và thường gặp nhất, 2 ca còn lại mang đột biến T14484C [8].

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nghĩa đã sử dụng phương pháp giải trình

tự tách dòng, và đã xác định thấy nhiều đột biến (tại 14 vị trí) trên vùng D-Loop ở

một người lao động thường xuyên tiếp xúc với bức xạ ion hóa [5].

Liên quan đến xác định đột biến ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư người Việt

Nam, kết quả thu được còn rất ít. Cho đến nay, chúng tôi chỉ tìm thấy 1 nghiên cứu

trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú [1]. Nghiên cứu được thực hiện với số mẫu

hạn chế (2 bệnh nhân). Kết quả phân tích đã cho thấy có đột biến điểm và đột biến

mất đoạn 280 bp trong vùng D-loop của bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam.

Như vậy, như đã tổng quan ở trên, các nghiên cứu điều tra trên thế giới đã

cho thấy đột biến ADN ty thể liên quan chặt chẽ với nhiều loại bệnh, nhất là bệnh ty

thể và bệnh ung thư. Đối với bệnh ung thư đại trực tràng, để đạt được hiệu quả điều

trị tốt thì bệnh nhân cần được chẩn đoán càng sớm, càng tốt. Trong khuôn khổ luận

văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu những biến đổi của các gen tARN và ND3

của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng với mục đích tìm ra mối liên

quan giữa những biến đổi này với các đặc điểm lâm sàng của bệnh, từ đó giúp cho

việc việc chẩn đoán sớm và theo dõi sau điều trị của bệnh ung thư đại trực tràng

được tốt hơn.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được lấy tại

vị trí khối u và vị trí lân cận khối u (cách khối u khoảng 5-10 cm). Mẫu mô sử dụng

trong nghiên cứu này gồm 61 mẫu do Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh, bệnh viện K Tam

Hiệp – Hà Nội và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức – Hà Nội cung cấp trong thời

gian từ tháng 8 năm 2010 đến tháng 6 năm 2012. Mẫu sử dụng đã được thống kê ở bảng 3.

Mẫu mô được đựng trong ống eppendorf, vận chuyển từ bệnh viện về trong nitơ lỏng và bảo

quản trong tủ lạnh sâu âm 80C cho tới khi tiến hành những nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3. Thống kê mẫu sử dụng

Ung

thư

Ung thư

Ung

thư

Bệnh viện cung cấp mẫu Số mẫu

giữa đại và

đại tràng

trực tràng

K2 Tam Hiệp 31 12 17 2

Việt Đức 30 18 12 0

2.1.2. Hóa chất Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 4.

Bảng 4. Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích

Tách ADN tổng QIA amp DNA minikit QIAGEN (Đức) số

QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN (Đức) Tinh sạch ADN

Agarose Invitrogen (Mỹ) Điện di

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Pharmacia (Thụy SDS, Acrylamide, Bis-Acrylamide Điển)

Các cặp mồi 10398, 3243 IDT (Mỹ) PCR Master Mix 2X NEB (Mỹ)

Enzyme Fastdigest® HaeIII Fermentas (Đức) RFLP Enzyme Fastdigest®DdeI

Các hóa chất khác như: acid boric, Tris – base, EDTA, kali phosphate, ethanol, natri

carbonat, bạc nitrat… được sử dụng đều có độ sạch phân tích.

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị và máy móc của phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu

trúc thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Cộng nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên được sử dụng trong nghiên cứu được thống kê trong bảng 5.

Bảng 5. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất

Máy PCR (GeneAmp PCR system 9700) Applied BioSciences (Mỹ) 1

Nguồn điện di PowerPac™ HC Bio–rad (Mỹ) 2

3 Bể điện di Mini–Sub Cell GT, MiniProtean 3 cell Bio–rad (Mỹ)

Máy ly tâm lạnh 5417R Eppendorf (Đức) 3

Nuaire (Mỹ) 4 Tủ lạnh – 20C và – 80C

Bể ổn nhiệt ED5 Julabo (Đức) 5

Tủ an toàn sinh học Nuaire (Mỹ) 6

Máy làm khô chân không (Speed Vac) Thermo Electron (Mỹ) 7

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Ngoài ra, còn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như cân phân tích,

cân kỹ thuật, máy vortex, máy minispin, lò vi sóng…

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để tiến hành phân tích đột biến A3243G và A10398G, chúng tôi thực hiện

phương pháp PCR-RFLP. Trước hết ADN tổng số được tách chiết từ mô u và mô

lân cận u. Tiếp đó, đoạn ADN chứa đột biến được nhân lên bằng PCR với cặp mồi

đặc hiệu. Sự có mặt của đoạn gen chứa đột biến này được kiểm tra bằng phương

pháp điện di. Bước tiếp theo chúng tôi thực hiện cắt đoạn gen này bằng enzym giới

hạn thích hợp để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di. Để khẳng định kết quả,

đoạn gen chứa đột biến được tinh sạch và được gửi đi giải trình tự.

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô

Mẫu mô đại trực tràng bao gồm mẫu mô u và mẫu mô lân cận khối u của

cùng một bệnh nhân được lấy ra từ tủ 80C, rã đông và rửa bằng đệm Kali

phosphate 100mM, pH 8,0. Sau khi rửa, hai mẫu mô được cân với lượng tương

đương 0,03–0,05g/mẫu và cho vào hai ống eppendorf riêng biệt.

Tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ mô- QIAamp

DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.

 Bổ sung vào mỗi ống epp: 180 µl buffer ATL và 20 µl proteinase K, vortex

và ủ ở 56ºC trong khoảng 3h để mô được thủy phân hoàn toàn.

 Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Thêm 200 µl buffer AL vào mẫu, vortex trong 15s, và ủ ở 70ºC trong 10

phút. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Thêm 200 µl ethanol (96–100%) vào mẫu, vortex trong 15s. Ly tâm trong

thời gian ngắn để loại dịch còn dính trên nắp.

 Cho toàn bộ hỗn hợp vào cột QIAamp Spin Column. Đóng nắp, ly tâm 8000 rpm

trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

 Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW1. Đóng nắp, ly tâm ở 8000 rpm trong 1

phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

 Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW2. Đóng nắp, ly tâm ở tốc độ tối đa 14.000

rpm trong 3 phút. Có thể lặp lại bước này thêm 1 phút nếu chưa hết dịch trên

cột.

 Thu mẫu trên cột: Đặt cột vào ống 1.5 ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

Thêm 200 µl buffer AE hoặc nước sạch. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

và ly tâm 8000 rpm) trong 1 phút. Lặp lại bước trên 2 lần.

 Làm khô dịch thu được bằng máy Speed vac trong 2h.

 Hòa tan ADN trong 50µl buffer AE , bảo quản ở –20ºC để sử dụng cho các thí

nghiệm tiếp theo.

 Kiểm tra quá trình tách chiết ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8–1%.

2.2.2. Khuếch đại đoạn gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR

Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp là kỹ thuật cho phép nhân bản invitro các đoạn ADN (gen) lên hàng triệu lần so với ban đầu (1012–1013

bản sao). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của ADN

và khả năng tổng hợp ADN invitro của ADN polymerase. Phản ứng PCR bao gồm

nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bước cơ bản: biến tính (Denaturing), gắn mồi (Annealing)

và tổng hợp (Extending).

Các cặp mồi được chúng tôi thiết kế bằng chương trình Primer premier 5.

Trình tự các cặp mồi được trình bày ở bảng 6.

Bảng 6. Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

Kích thước sản Tên mồi Trình tự mồi phẩm (bp)

5’-CCTGCCACTAATAGTTATGTC-3’

5’-GATATGAGGTGTGAGCGATA-3’

f 246 10398 r

5’-CTGTACGAAAGGACAAGAGA-3’

5’-ACAATGAGGAGTAGGAGGTT-3’

f 218 3243 r

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

PCR được thực hiện với các thành phần của phản ứng như trong bảng 7.

Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l

Thành phần Thể tích (l) Nồng độ cuối cùng

Master Mix 2x 6,25 1X

Primer F 10µM 0,25 0,2 M

Primer R 10µM 0,25 0,2 M

ADN khuôn 2

Nước 3,75

Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 10398 như sau:

Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 3243 như sau:

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

2.2.3. Phân tích RFLP

Phương pháp RFLP sử dụng các enzyme giới hạn thích hợp phân cắt sản

phẩm PCR để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di.

+ Với đoạn gen 10398 ADN ty thể: sử dụng enzyme FastDigest® DdeI. Enzyme

này có vị trí nhận biết trên ADN như sau:

5’…C/TNAG…3’

3’…GANT/C…5’

Phân tích vị trí nhận biết các enzyme giới hạn trên đoạn gen 246 bp và nhận

thấy trong trường hợp 10398A thì enzyme DdeI sẽ cắt đoạn gen ở một vị trí và tạo

thành các đoạn oligonucleotide có kích thước 50 bp và 196 bp.

Trong trường hợp 10398 G thì enzyme DdeI sẽ cắt đoạn gen ở 2 vị trí và kết

quả cắt enzyme thu được các đoạn oligonucleotide có kích thước 38 bp, 50 bp và

158 bp.

+ Với đoạn gen 3243 ADN ty thể: sử dụng enzyme cắt FastDigest® HaeIII nhận

biết vị trí cắt trên ADN tại trình tự:

5’…GG/CC…3’

3’…CC/GG…5’

Đoạn gen 3243 được nhân lên có kích thước 218 bp. Trong trường hợp

không đột biến (3243A) thì HaeIII cắt đoạn gen này tại hai vị trí, dẫn tới sản phẩm

thu được là các đoạn có kích thước 22 bp, 27 bp và 169 bp.

Trong trường hợp có đột biến 3243G thì vị trí này sẽ trở thành vị trí cắt của

HaeIII. Kết quả là sau khi cắt bằng enzyme HaeIII sẽ xuất hiện các đoạn có kích

thước 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Sản phẩm PCR được tiến hành phản ứng cắt với enzyme thích hợp theo đúng

hướng dẫn của nhà sản xuất. Thành phần phản ứng cắt sử dụng HaeIII và DdeI

được mô tả trong bảng 8.

Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI

Thành phần Thể tích

10X FastDigest® buffer 2µl

Sản phẩm PCR (~0.2 µg) 10µl

FastDigest® enzyme 1µl

Nước Bổ sung đến đủ 30 µl

Thành phần phản ứng sau khi được trộn đều thì tiến hành ủ ở 37 0C theo

đúng khuyến cáo của nhà sản xuất. Hỗn hợp được trộn đều, ly tâm nhẹ, ủ 7–10 phút trong bể ổn nhiệt ở 370C. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm cắt enzyme trên gel

polyacrylamide 8% và nhuộm bạc để quan sát kết quả.

2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại

phân tử đặc biệt như protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước/khối lượng,

điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện

trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo

điện tích của chúng. Các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung

phosphate của chúng và vì thế chỉ dịch chuyển hướng tới cực dương. Tốc độ di

chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích thước phân tử acid nucleic,

nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau

trên gel điện di. Gel điện di thường sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

kích thước đoạn ADN muốn phân tách người ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ

khác nhau.

2.2.4.1. Điện di gel agarose

Điện di gel agarose được thực hiện với chất nền là agarose. Nồng độ agarose

dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5 – 2,5%. Giới hạn phân tách của gel được

trình bày ở bảng 9.

Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6]

Nồng độ gel (%w/v) Dãy kích thước tách hiệu quả (kb)

0,5 2–25

0,7 0,8–10

1,2 0,4–5

1,5 0,2–3

2,0 0,1–2

2,5 0,05–1,5

Việc hiển thị các băng ADN trong gel agarose sau quá trình chạy điện di được thực

hiện bằng cách nhuộm gel ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium

bromide (EtBr) (ủ gel trong dung dịch nhuộm chứa 200–300 ng EtBr/ml khoảng 30 phút)

và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (UV).

Chuẩn bị gel agarose 1,3% để kiểm tra sản phẩm PCR

 Cân 1,3 gam agarose dạng bột (Invitrogen), bổ sung 100ml đệm chạy TBE

1X pH 8,3 (Tris–base 0,09M; acid boric 0,09M; EDTA 4mM)

 Làm nóng chảy gel bằng cách đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan

hết (khoảng vài phút).

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

 Làm nguội gel đến khoảng 50–55C, đổ agarose vào khuôn điện di đã cài

lược để tạo giếng.

 Để gel đông ở nhiệt độ phòng (20–30 phút).

 Sản phẩm PCR được trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol

blue dạng vết) và nạp lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110 V trong

khoảng 30 phút.

 Bản gel sau điện di được nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia tử

ngoại (UV).

2.2.4.2. Điện di gel polyacrylamide

Điện di trên gel polyacrylamide. Gel polyacrylamide được tổng hợp ngay trước

khi dùng ở nhiệt độ phòng gồm 2 thành phần chính là acrylamide và bis–

acrylamide. Quá trình tổng hợp nhờ xúc tác của Ammonim persulfate (APS) và

TEMED. Khi trùng hợp từ hai thành phần chính trên sẽ hình thành một polymer

dạng mạng lưới. Tùy theo nồng độ của các chất thành phần mà gel tạo thành sẽ có

hệ thống lỗ nhỏ, vừa hay lớn. Tương tự, tùy hàm lượng của bis–acrylamide mà gel

có mức độ liên kết chéo cao hay thấp. Hiệu quả của sự phân tách ADN trong gel

phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (bảng 10), kích thước và điện tích của ADN.

Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6]

Nồng độ gel (%w/v) Giới hạn phân tách với ADN (bp)

5 80500

8 60400

12 50300

15 40200

20 5100

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Chuẩn bị bản gel polyacylamide 8% dùng để điện di kiểm tra sản phẩm PCR được

cắt bằng enzyme HaeIII và DdeI (bảng 11).

Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thước 7cm

Thành phần Thể tích

Monoacrylamide 30% 1,33 ml

TBE 1X 3,67 ml

APS 10% 37,5 l

TEMED 3 l

Kỹ thuật nhuộm bạc: Bản gel polyacrylamide sau khi điện di được nhuộm bạc

theo phương pháp của Bassam (1991) [13], bao gồm các bước sau:

 Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 30 phút.

 Rửa bằng nước cất ba lần, mỗi lần cách nhau 5 phút.

 Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat (1,5g/l AgNO3; 0,056% formaldehyde)

trong 30 – 40 phút, tránh ánh sáng.

 Rửa nước khoảng 30 giây–1 phút.

 Hiện băng bằng dung dịch developer (30g/l Na2CO3, 0,056% formaldehyde,

400 µg/l natri thiosulfate Na2S2O3) trong 3–5 phút.

 Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic lạnh 7,5% trong 1–3 phút.

 Bảo quản gel bằng nước cất.

 Quan sát kết quả dưới ánh sáng trắng.

2.2.5. Tinh sạch ADN Đoạn gen chứa đột biến A10398G được khuếch đại bằng phản ứng PCR và

được tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction Kit của hãng QIAGEN (Đức).

Quy trình tinh sạch được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

- Đoạn gen chứa đột biến A10398G sau khi được khuếch đại bằng PCR,

được điện di trên gel agarose 1%.

- Cắt các mảnh gel agarose chứa ADN, cho các mảnh này vào ống sạch

- Bổ sung 3 thể tích đệm QG cho một thể tích gel (100mg ≈ 100µl). - Ủ ở 50oC trong 10 phút (hoặc cho đến khi miếng gel đã hòa tan hoàn

toàn). Trong thời gian ủ, cứ 3 phút lại vortex ống.

- Sau khi gel đã hòa tan hoàn toàn, kiểm tra nếu màu sắc của hỗn hợp có

màu vàng là được. Nếu hỗn hợp có màu cam hoặc tím thì thêm 10 µl

Natri acetat 3M, pH 5,0 vào hỗn hợp và mix.

- Thêm một thể tích isopropanol vào mẫu và mix

- Đưa mẫu lên cột, ly tâm 1 phút, tốc độ 13000 rpm, nhiệt độ phòng.

- Đổ bỏ phần dịch qua cột, thêm 0,5 ml đệm QG lên cột, ly tâm ở nhiệt độ

phòng, 13000 rpm trong 1 phút

- Để rửa, bổ sung 0,75 ml đệm PE lên cột, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000

rpm trong 1 phút

- Đổ bỏ phần dịch qua cột, ly tâm cột thêm một phút ở nhiệt độ phòng,

13000 rpm.

- Để thôi ADN: thêm 50 µl đêm EB lên màng, ly tâm ở nhiệt độ phòng,

13000 rpm trong 1 phút.

- Tiếp tục thêm 50 µl đêm EB lên màng, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000

rpm trong 1 phút.

- Speed vac ống đến thể tích 20 µl, điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide

8%.

ADN sau khi tinh sạch được gửi đi giải trình tự.

2.2.6. Tính toán thống kê

Xử lý các số liệu phân tích theo các phương pháp thống kê thường dùng. So

sánh các đặc trưng thống kê mẫu bằng phép kiểm định 2 với mức ý nghĩa α = 0,05.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN ĐIỂM A3243G CỦA GEN tARN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thư đại trực tràng

Sử dụng kit tách chiết ADN QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN

(Đức), chúng tôi đã tách chiết được ADN từ 61 cặp mẫu mô (mẫu u và mẫu lân cận

u) của 61 bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ các

mẫu mô được minh họa trong hình 7.

Hình 7. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô

(điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide).

Giếng 1, 3, 5: ADN tổng số mẫu mô lân cận u

Giếng 2, 4, 6: ADN tổng số mẫu mô u

Qua hình ảnh điện di trên ta thấy các băng ADN tổng số tương đối sáng, gọn

chứng tỏ hàm lượng ADN trong mẫu khá cao và sạch, đủ điều kiện để tiến hành các

thí nghiệm tiếp theo.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen 3243 của ADN ty thể

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu 3243 với khuôn là ADN tổng số từ mô, đoạn gen

chứa vị trí 3243 ADN ty thể đã được khuếch đại bằng phản ứng PCR. Sản phẩm

PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide, quan

sát dưới tia cực tím. Kết quả điện di được thể hiện như trong hình 8.

Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243

(điện di trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide).

Giếng M100: thang chuẩn ADN 100bp

Giếng (-): Đối chứng âm

Giếng 1, 3, 5: Sản phẩm PCR mẫu mô lân cận u Giếng 2, 4, 6: Sản phẩm PCR mẫu mô u

Kết quả điện di cho thấy đã thu được sản phẩm PCR có kích thước 218bp,

các băng sáng, rõ nét và không xuất hiện băng phụ chứng tỏ không có hiện tượng

bắt cặp không đặc hiệu. Sản phẩm PCR này được tiếp tục phân tích bằng kỹ thuật

RFLP để xác định đột biến.

3.1.3. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể

Để xác định đột biến điểm A3243G, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP.

Chúng tôi đã tiến hành xử lý sản phẩm PCR đoạn gen 3243 với enzyme giới hạn

HaeIII. HaeIII là enzyme endonuclease nhận biết ADN tại trình tự:

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Trong trường hợp không có đột biến thì đoạn gen 218 bp có chứa hai vị trí

nhận biết của enzyme, và sẽ bị cắt thành ba đoạn nhỏ hơn có kích thước 22 bp, 27

bp và 169 bp. Trong trường hợp đột biến A G xảy ra thì đoạn gen 218 bp sẽ có

thêm một vị trí nhận biết nữa của enzyme giới hạn, kết quả là đoạn gen sẽ bị cắt

thành các đoạn nhỏ có kích thước là 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp. Sản phẩm của

quá trình xử lý với enzyme cắt được điện di kiểm tra cùng với sản phẩm PCR trên

polyacrylamide 6%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia UV bước sóng

245 nm (hình 9).

Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 với enzyme HaeIII.

(điện di trên gel polyacrylamide 6%, nhuộm ethidium bromide).

Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp

Giếng 2, 4: sản phẩm sau cắt bằng HaeIII từ

Giếng 3, 5: sản phẩm PCR từ mô u

mẫu mô u

Giếng 7: sản phẩm PCR từ mô lân cận u

Giếng 6: sản phẩm sau cắt bằng HaeIII từ

mẫu mô lân cận u

Từ kết quả thu được trong hình chúng tôi nhận thấy sản phẩm PCR sau khi

cắt bằng HaeIII trên bản điện di xuất hiện băng kích thước 169 bp. Hai băng kích

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

thước 22 bp, 27 bp không quan sát được do gel không phân tách được. Như vậy ở

các giếng này không xuất hiện đột biến. Chúng tôi đã tiến hành cắt enzym với 61

cặp mẫu, kết quả thu được không có đột biến.

Đột biến A3243G trên gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu (UUR) đã được phát

hiện ra đầu tiên như là một nguyên nhân di truyền của bệnh MELAS [31]. Cho đến

nay các nghiên cứu về đột biến A3243G chỉ tập trung vào một số bệnh cơ thần kinh,

tiểu đường. Chỉ có một nghiên cứu duy nhất phát hiện đột biến A3243G trên bệnh

nhân ung thư trực tràng. Lorenc và cs (năm 2003) khi nghiên cứu các đột biến ADN

ty thể gồm đột biến tRNA, rRNA và một số gen ty thể trên một số mẫu ung thư, đã

phát hiện một mẫu ung thư trực tràng có đột biến A3243G dạng đồng nhất

(homoplasmic) [46]. Như vậy có thể thấy rằng đột biến A3243G là khá hiếm gặp ở

bệnh ung thư.

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH A10398G CỦA GEN ND3 ADN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

3.2.1. Kết quả nhân đoạn gen 10398 của ADN ty thể

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu 10398 với khuôn là ADN tổng số từ mô, đoạn gen

mang đa hình A10398G đã được khuếch đại bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR

được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide, quan sát

dưới tia cực tím. Kết quả điện di được thể hiện như trong hình 10.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398

(điện di trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide).

Giếng M100: thang chuẩn ADN 100bp

Giếng (-): Đối chứng âm

Giếng 1, 3, 5: Sản phẩm PCR mẫu mô lân cận u Giếng 2, 4, 6: Sản phẩm PCR mẫu mô u

Kết quả điện di cho thấy đã thu được sản phẩm PCR có kích thước 246bp,

các băng sáng, rõ nét và không xuất hiện băng phụ chứng tỏ không có hiện tượng

bắt cặp không đặc hiệu. Sản phẩm PCR này được tiếp tục phân tích RFLP để xác

định đột biến.

3.2.2. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen mang đa hình A10398G

Chúng tôi đã tiến hành xử lý sản phẩm PCR đoạn gen 10398 với enzyme giới

hạn DdeI. DdeI là enzyme endonuclease nhận biết ADN tại trình tự:

5’…C/TNAG…3’

3’…GANT/C…5’

Trong trường hợp alen A xuất hiện ở vị trí 10398, enzyme DdeI có một vị trí nhận

biết trên đoạn gen được khuếch đại, kết quả sẽ cắt được hai băng kích thước 50 bp

và 196 bp. Trường hợp alen G xuất hiện, sẽ có thêm một vị trí nhận biết của DdeI,

kết quả sẽ thu được ba băng có kích thước lần lượt là 38 bp, 50 bp và 158 bp. Các

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

sản phẩm sau cắt được điện di cùng với sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6%,

nhuộm Ethidium bromide và quan sát dưới tia UV bước sóng 245 nm (hình 11).

Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 với enzyme DdeI

(điện di trên gel polyacrylamide 6%, nhuộm ethidium bromide).

Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp.

Giếng 2, 4: sản phẩm sau cắt bằng DdeI từ

Giếng 3, 5: sản phẩm PCR từ mẫu mang alen

mẫu mang alen G ở vị trí 10398.

G ở vị trí 10398.

Giếng 6: sản phẩm sau cắt bằng DdeI từ mẫu

Giếng 7: sản phẩm PCR từ mẫu mang alen A ở

mang alen A ở vị trí 10398.

vị trí 10398.

Từ kết quả thu được trong hình chúng tôi nhận thấy sản phẩm PCR sau khi

cắt bằng DdeI trên bản điện di ở giếng số 6 xuất hiện băng kích thước 196 bp. Như

vậy ở giếng này là 10398A. Mặt khác ở các giếng số 2, 4 sản phẩm PCR sau khi cắt

xuất hiện các băng 158bp, 50bp, 38bp. Đây là những mẫu mang alen G ở vị trí

10398. Chúng tôi đã tiến hành cắt enzym với 61 cặp mẫu và đã thu được kết quả

trong đó có 28 cặp mẫu mang alen A ở vị trí 10398 và 33 cặp mẫu mang alen G ở vị

trí này.

3.2.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G

Sử dụng kỹ thuật RFLP, chúng tôi đã xác định được đột biến A10398G ở

một số cặp mẫu. Để khẳng định kết quả, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm

PCR. Sản phẩm PCR sau tinh sạch được lấy ra kiểm tra sự hiện diện của băng

ADN. Theo tính toán, lượng ADN tinh sạch thu được nằm trong khoảng 200-400

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

ng/µl. Lượng ADN này đủ sạch và có đủ lượng để đem giải trình tự. Sử dụng phần

mềm Sequence Scanner để phân tích kết quả giải trình tự và sử dụng chương trình

BLAST để so sánh trình tự thu được với trình tự ADN chuẩn của ty thể đã được

công bố trên ngân hàng gen NCBI (NC_012920), chúng tôi đã xác định được điểm

đột biến trên hệ gen ty thể.

Với đoạn gen 10398, chúng tôi đã gửi đi giải trình tự 4 mẫu (gồm hai mẫu

không đột biến và hai mẫu đột biến) (xem phụ lục 2). Kết quả giải trình tự mẫu

không mang đột biến được biểu diễn trên hình 12.

Hình 12. Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến A10398G

So sánh trình tự thu được với trình tự ADN chuẩn của ty thể đã được công bố

trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thu được kết quả như trên hình 13.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Hình 13. Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể

Từ kết quả ở hình 13 cho thấy alen A xuất hiện ở vị trí 10398 tại mẫu không

mang đột biến (alen A được bôi xanh). Điều này cho thấy không có đột biến xuất

hiện. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích RFLP.

Kết qủa giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G được biểu diễn ở hình 14.

Hình 14. Kết quả giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

So sánh trình tự thu được với trình tự ADN chuẩn của ty thể đã được công bố

trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thu được kết quả như trên hình 15.

Hình 15. Kết quả so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể

Kết quả từ hình 15 cho thấy alen G xuất hiện ở vị trí 10398 tại mẫu mang đột

biến (alen G được bôi xanh). Điều này cho thấy có xuất hiện đột biến A→G. Kết

quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích RFLP. Như vậy bằng kỹ thuật giải

trình tự, chúng tôi đã xác định được điểm đột biến trên hệ gen ty thể tại vị trí 10398.

Kết quả giải trình tự còn cho thấy có 2 dạng biến thể khác là T10370C và

C10400T. Dựa vào các dữ liệu đã được công bố trên Mitomap (ngân hàng dữ liệu

genome ty thể) thấy rằng hai dạng biến thể này không liên quan tới đột biến gây

bệnh, mà chỉ là đa hình trong các nhóm đơn bội. Đa hình C10400T thuộc siêu nhóm

đơn bội M [62], còn biến thể T10370C thuộc dạng biến thể thường, không gây bệnh

[50].

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

3.2.4. Phân tích mối liên quan giữa đa hình A10398G với các đặc điểm bệnh

học lâm sàng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Kết quả phân tích PCR–RFLP của 122 mẫu ADN tổng số của 61 bệnh nhân

ung thư đại trực tràng (trong đó có 61 mẫu ADN tổng số của mô u và 61 mẫu ADN

tổng số của mô lân cận u) đã cho thấy có xuất hiện đột biến ADN ty thể ở vị trí

10398. Tiến hành phân tích mối liên quan giữa đột biến điểm A10398G của ADN ty

thể của 61 bệnh nhân ung thư đại trực tràng với các đặc điểm lâm sàng khác, chúng

tôi thu được kết quả trong bảng 12.

Bảng 12. Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng

Phân bố A10398G Đặc điểm Số lượng A G

50,0 50,0 30

Nam

(15) (15)

Giới tính

41,9 58,1 31

Nữ

(13) (18)

47,8 52,2 46

≥ 50

(22) (24)

Tuổi

40 60 15

< 50

(6) (9)

56,7 43,3 30

Đại tràng

(17) (13)

37,9 62,1 29

Vị trí ung thư

Trực tràng

(11) (18)

0 100 2

Giữa đại và trực tràng

(0) (2)

3 66,7 33,3

Hạch

0

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

(2) (1)

60 40 15

13

(9) (6)

37 63 27

>3

(10) (17)

35,7 64,3 28

<5cm

(10) (18)

Kích thước u

 5cm

59 41 22 (13) (9)

Giai đoạn I

37,5 62,5 16

T1-2N0M0

(6) (10)

Giai đoạn II

60 40 20

T3-4N0M0

(12) (8)

Giai đoạn III

Phân loại TNM

42,9 57,1

N1-2M0

21 (9) (12)

T bất kỳ

Giai đoạn IV

0 100 3

M1

(0) (3)

T, N bất kỳ

60 40 5

Cao

(3) (2)

52,4 47,6 20

Mức độ biệt hóa

Vừa

(11) (9)

0 100 2

Kém

(0) (2)

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực

tràng theo vị trí mô

Nhằm đánh giá mối liên hệ giữa đa hình A10398G của ADN ty thể với vị trí

của mô đại trực tràng, chúng tôi đã khảo sát sự phân bố đa hình A10398G của ADN ty

thể theo mẫu mô u và mẫu mô lân cận u. Kết quả trình bày ở hình 16.

Hình 16. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí mô

Kết quả từ hình 16 cho thấy tần xuất alen A và G giữa mô u và mô lân

cận u không có sự khác biệt, trong đó tần suất xuất hiện của alen A là 46% (28/61),

alen G là 54% (33/61). Tần suất này phù hợp với nghiên cứu của Juo và cs (2010)

trên đối tượng là người Trung Quốc mắc các bệnh thuộc hội chứng chuyển hóa với

các biểu hiện như đường máu cao, rối loạn lipid, tăng huyết áp và béo phì, với tần

suất của alen G là 57,1% trên các mẫu bệnh, và 52,7% trên các mẫu đối chứng [34].

Tần suất alen ở vị trí 10398 mang tính đa hình cao, khác nhau giữa các nhóm tộc

người phân bố ở các khu vực địa lý khác nhau, cụ thể là tần suất alen G ở nhóm

người Mỹ gốc Phi là 87% [18], Bắc Ấn Độ là 57,3% [26], người Mỹ gốc Âu là

32,1% [12]. Như vậy tần suất alen được xác định trong nghiên cứu này phù hợp với

các nghiên cứu được tiến hành trên đối tượng là người châu Á.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực

tràng theo giới tính

Ung thư đại trực tràng được coi là một trong những bệnh ung thư phổ biến

nhất ở nam giới bởi một trong những nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng là thói

quen sử dụng bia rượu, hút thuốc lá thường xuyên. Điều này có thể gây nên những

biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng, gây viêm loét đại tràng. Để tìm hiểu mối

liên quan giữa đa hình A10398G với giới tính của bệnh nhân ung thư đại trực tràng,

chúng tôi đã tiến hành phân tích thống kê và kết quả được đưa ra ở hình 17.

Hình 17. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giới tính

Kết quả từ hình 17 cho thấy tần suất xuất hiện của alen A ở nam giới là 50%,

1(0,05) = 3,84).

ở nữ là 41,9%. Tần suất xuất hiện của alen G ở nữ giới lại cao hơn ở nam giới (58,1% và 50%). Bằng phép kiểm định χ2 chúng tôi nhận thấy sự khác biệt về tần suất alen giữa hai giới không mang ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa α= 0,05 (χ2 = 0,399 < χ2

- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực

tràng theo tuổi

Ung thư đại trực tràng thường tập trung ở độ tuổi trung niên. Do đó chúng tôi

đã tiến hành phân tích mối liên quan giữa đa hình A10398G với độ tuổi của các

bệnh nhân ung thu đại trực tràng. Kết quả phân tích được trình bày trong hình 18.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Hình 18. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo tuổi

Số liệu từ hình 18 cho thấy các bệnh nhân mắc bệnh ung thư đại trực tràng

phần lớn là hơn 50 tuổi (46/61 bệnh nhân). Tần suất xuất hiện alen G cao hơn alen

A ở cả hai nhóm tuổi (nhóm <50 tuổi 10398 G chiếm 60%, nhóm >50 tuổi là

1(0,05) = 3,84, p>0,05).

52,2%). Tuy vậy sự khác biệt về tần suất alen giữa hai nhóm không có ý nghĩa thống kê (χ2 = 0,278 < χ2

- Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực

tràng theo vị trí khối u

Ung thư có thể diễn ra ở đại tràng, trực tràng hay đoạn nối giữa đại tràng và

trực tràng (ung thư đại trực tràng). Kết quả khảo sát đa hình A10398G trong ADN

ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo vị trí khối u được biểu diễn ở hình

19.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Hình 19. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo vị trí khối u.

Số liệu từ hình 19 cho thấy vị trí khối u tập trung chủ yếu ở trực tràng và đại

tràng, một phần nhỏ ở vùng giữa đại và trực tràng (2/61 bệnh nhân). Alen G xuất

hiện với tần suất cao nhất ở ung thư ở vùng giữa đại và trực tràng (100%), tiếp đó là

ung thư trực tràng (62,1%), cuối cùng là ung thư đại tràng (43,33%). Alen A không

2(0,05) = 5,991, p>0,05).

xuất hiện ở vùng giữa đại và trực tràng. Có sự khác nhau giữa tần suất các alen với vị trí khối u, tuy vậy sự khác nhau này không mang ý nghĩa thống kê (χ2 = 3,838 < χ2

- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại

trực tràng theo kích thước u

Kích thước khối u được biết đến như là một trong những yếu tố giúp tiên

lượng bệnh ung thư đại trực tràng, đặc biệt có ý nghĩa chẩn đoán trong ung thư đại

tràng. Nó có liên quan đến quá trình tiến triển và khả năng sống sót trong ung thư

đại tràng [39]. Do đó chúng tôi đã tiến hành phân tích mối liên quan giữa đa hình

A10398G với kích thước khối u. Kết quả phân tích thống kê được trình bày trong

hình 20.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Hình 20. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo kích thước u

Kết quả từ hình 20 cho thấy tần suất xuất hiện alen A trong nhóm có kích

thước u ≥ 5cm là 59%, alen G là 41%. Trong nhóm có kích thước u < 5cm tần suất

1(0,05) = 3,84,

của alen G lại gần gấp đôi alen A (64,3% và 35,7%). Sự khác biệt giữa phân bố đa hình với kích thước u không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,71 < χ2

p>0,05.

- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại

trực tràng theo số hạch lympho

Số lượng hạch lympho là một trong những yếu tố quan trọng giúp phân loại

giai đoạn bệnh và có ý nghĩa trong việc tiên lượng khả năng sống sót của bệnh

nhân. Do đó chúng tôi đã tiến hành khảo sát đa hình A10398G theo số hạch lympho

để tìm hiểu mối liên quan giữa chúng. Kết quả phân tích được biểu diễn trong hình

21.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Hình 21. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo số hạch.

Kết quả từ hình 21 cho thấy số hạch tăng lên thì tần suất xuất hiện alen G

cũng tăng lên và đạt nhiều nhất ở nhóm có số hạch >3 (63%). Tần số alen A lớn

nhất ở nhóm không xuất hiện hạch (66,67%). Như vậy người mang alen G có nguy

2(0,05) = 5,991, p>0,05.

cơ mắc bệnh ung thư đại trực tràng với mức độ nguy hiểm cao hơn người mang alen A. Sự khác biệt giữa tần suất alen và số hạch không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,559 < χ2

- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại

trực tràng theo giai đoạn phát triển khối u

Trong nghiên cứu này các giai đoạn phát triển khối u được phân loại theo hệ

thống TNM, với 4 giai đoạn. Việc phân loại giai đoạn phát triển của bệnh có ý

nghĩa rất lớn trong việc tiên lượng bệnh và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp.

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát, tìm hiểu mối liên quan giữa đa hình A10398G với

các giai đoạn phát triển khối u. Kết quả phân tích được biểu diễn ở hình 22.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

Hình 22. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo giai đoạn TNM

Số liệu ở hình 22 cho thấy tần suất alen A cao nhất ở giai đoạn II, đạt tới

60%. Ở giai đoạn IV không có bệnh nhân nào mang alen A. Giai đoạn I là giai đoạn

bệnh còn ở mức nhẹ, ung thư đã bắt đầu lây lan, nhưng vẫn còn trong lớp lót bên

trong đại trực tràng, chưa lan đến các cơ quan khác. Ở giai đoạn I này alen G có tần

suất đạt 62,5%. Tiếp đó tần suất alen G có sự giảm ở giai đoạn II (40%) và tăng trở

lại ở giai đoạn III (57,14%). Alen G có tần suất xuất hiện lớn nhất ở giai đoạn IV

(100%). Đây là giai đoạn nặng nhất của bệnh với sự di căn của khối u tới các cơ

quan xa (phổi, gan) thông qua hệ bạch huyết. Khả năng sống sót của bệnh nhân sau

5 năm ở giai đoạn này chỉ đạt từ 0-7%. Điều này lại một lần nữa khẳng định cho giả

thuyết alen G làm tăng nguy cơ đối với bệnh ung thư đại trực tràng. Sự khác biệt

3(0,05) = 7,814, p>0,05.

giữa phân bố đa hình A10398G với các giai đoạn phát triển ung thư TNM không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 4,675 < χ2

- Khảo sát đa hình A10398G trong ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo mức độ biệt hóa

Mức độ biệt hóa là một khái niệm dùng để chỉ mức độ giống các tế bào bình

thường cùng một loại mô của các tế bào u. Mức độ ác tính của ung thư có liên quan

trực tiếp đến nguồn gốc của tế bào biệt hóa. Thông thường, những khối u có tính

biệt hóa cao, tế bào ung thư thường phát triển chậm, mức độ ác tính thấp, di căn

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

chậm. Mặt khác những khối u có tính biệt hóa thấp thì độ ác tính lại cao, di căn

nhanh. Kết quả của việc khảo sát đa hình A10398G ADN ty thể theo mức độ biệt

hóa được biểu diễn trong hình 23.

Hình 23. Biểu đồ phân bố đa hình A10398G theo mức độ biệt hóa

Kết quả từ hình 23 cho thấy tần suất alen G tăng dần với sự giảm của mức độ

biệt hóa, đồng nghĩa với việc tăng dần của độ ác tính và tốc độ di căn của khối u.

Đối với alen A thì ngược lại, đạt cao nhất ở mức đô độ biệt hóa cao (60%), thấp

nhất ở mức biệt hóa kém (0%). Kết quả này cũng phù hợp với giả thuyết alen G làm

2(0,05) =

tăng mức độ nguy hiểm với bệnh ung thư đại trực tràng. Sự khác biệt giữa tần suất alen và mức độ biệt hóa không mang ý nghĩa thống kê với χ2 = 2,366 < χ2

5,991, p>0,05.

Như vậy qua việc khảo sát sự phân bố đa hình A10398G theo các đặc điểm

bệnh học lâm sàng, chúng ta thấy được một số đặc điểm sau:

- Tần suất xuất hiện của alen A ở mô u và mô lân cận u là 46%, của alen G là 54%.

Không có sự khác biệt về tần suất alen giữa mô u và mô lân cận u. Sự phân bố đa

hình này phù hợp với các nghiên cứu về đa hình A10398G trên đối tượng người

châu Á (khu vực miền Bắc Ấn Độ: 57,3%, Trung Quốc 57,1%).

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

- Alen A và G phân bố trên cả nam và nữ. Tần suất alen G ở nam là 50%, ở nữ là

58,1%. Ở nhóm có độ tuổi ≥ 50, tần suất alen G là 52,2%, ở nhóm <50 tuổi, tần suất

alen G là 60%. Alen G xuất hiện nhiều ở ung thư trực tràng và ung thư giữa đại và

trực tràng. Với nhóm có khối u kích thước nhỏ hơn 5cm, alen G chiếm 64,3%.

- Khảo sát mối liên quan giữa đa hình A10398G với các đặc điểm như số hạch

lympho, giai đoạn phát triển khối u, mức độ biệt hóa cho thấy tần suất alen G tăng

dần với sự tăng của số hạch, sự tăng của giai đoạn phát triển bệnh và sự giảm của

mức độ biệt hóa. Điều này cho thấy alen G có mối liên quan với nguy cơ mắc bệnh

ung thư đại trực tràng.

Mối liên quan giữa đa hình A10398G với sự phát triển của khối u đã thu

được nhiều mối quan tâm của các nhà nghiên cứu trong những năm gần đây. Canter

và cs (2005) lần đầu tiên phát hiện mối liên quan giữa đa hình A10398G với bệnh

ung thư vú trên những người phụ nữ Mỹ gốc Phi, trong đó alen A là yếu tố gây

nguy cơ mắc bệnh, có khả năng tham gia vào quá trình tạo gốc tự do. Tuy vậy, các

tác giả không tìm thấy mối liên hệ nào ở người Mỹ da trắng. Các tác giả cho rằng sự

tương tác giữa các yếu tố gen và môi trường có thể gây ra sự khác nhau giữa các tộc

người [18]. Tuy vậy, trong một số nghiên cứu khác trên đối tượng là phụ nữ Mỹ gốc

Phi không thấy vai trò của đa hình 10398A đối với sự phát triển của ung thư vú

[55]. Các tác giả đã giải thích sự khác nhau về kết quả của các nghiên cứu này là do

sự khác nhau của các điều kiện trong các khu vực địa lý khác nhau. Trong một số

nghiên cứu khác, alen G lại có liên quan với sự phát triển khối u. Bai và cs (2007)

khi nghiên cứu trên 156 người phụ nữ Mỹ gốc Âu mắc bệnh ung thư vú và 260 mẫu

đối chứng thấy rằng 10398G có liên quan với làm tăng nguy cơ ung thư vú [12].

Một nghiên cứu độc lập khác cũng phát hiện 10398G có liên quan với sự phát triển

ung thư vú trên đối tượng là người Ba Lan [25]. Khi nghiên cứu trên đối tượng là

người Mỹ gốc Phi mắc ung thư tiền liệt tuyến, người ta thấy rằng 10398G làm tăng

tỷ lệ và mức độ ác tính của bệnh.

Như vậy vẫn tồn tại những kết quả dường như trái ngược về việc xác định

alen nào nào thưc sự có vai trò với sự phát triển của khối u. Chúng ta biết rằng các

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

đột biến soma có thể bị gây ra bởi tác động của yếu tố ngoại cảnh, như tia cực tím,

hay một số thói quen như hút thuốc, sử dụng bia rượu. Các yếu tố này đều góp phần

làm tăng lượng gốc tự do trong cơ thể. Theo một số nghiên cứu, cùng với sự tăng

của các gốc tự do, mtSNP sẽ có vai trò trong việc phát triển ung thư, có thể hoạt hóa

con đường gây ung thư, hoặc có thể hoạt hóa phản ứng apoptosis, vốn đóng vai trò

là yếu tố bảo vệ trong giai đoạn cuối của ung thư. Như vậy phải chăng các alen A

hoặc G trong đa hình A10398G có thể cần kết hợp với một vài yếu tố nào đó để từ

đó hình thành nên mối liên hệ với sự hình thành khối u. Chúng ta có thể thấy rõ hơn

khả năng này nhờ nghiên cứu của Pezzotti và cs (2009). Khi phân tích mối liên

quan giữa việc sử dụng chất có cồn với đa hình A10398G ở bệnh nhân mắc bệnh

ung thư vú, Pezzotti và cs (2009) đã phát hiện ra rằng ở những người phụ nữ không

sử dụng rượu và mang alen G, nguy cơ mắc ung thư vú thấp hơn 21% so với những

người không uống rượu và không mang alen này [52]. Như vậy việc sử dụng cồn là

một yếu tố kết hợp với alen G trong đa hình A10398G để hình thành mối liên hệ

giữa đa hình với bệnh ung thư vú.

Tóm lại, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân tích đột biến gen

tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Kết quả phân

tích bằng kỹ thuật RFLP 61 cặp mẫu mô u và mẫu mô lân cận u của 61 bệnh nhân

ung thư đại trực tràng cho thấy không xuất hiện đột biến A3243G mã hóa cho gen tARNLeu. Khi tiến hành phân tích đa hình A10398G của gen ND3 của ADN ty thể,

chúng tôi đã xác định được tần xuất của alen A và G trên 61 cặp mẫu mô u và mẫu

mô lân cận u của 61 bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Kết quả phân tích cho thấy tỷ

lệ alen G trong nhóm bệnh nhân được nghiên cứu tương ứng với tỷ lệ alen G đã

được công bố bởi các tác giả khác khi nghiên cứu trên các nhóm người ở các nước

Châu Á. Ngoài ra, sự khác biệt giữa phân bố đa hình A10398G theo các đặc điểm

bệnh học lâm sàng của bệnh ung thư đại trực tràng như vị trí mô, tuổi, giới tính,

kích thước u, số hạch lympho, giai đoạn tiến triển bệnh, mức độ biệt hóa không

mang ý nghĩa thống kê (p>0,05). Tuy nhiên, do số lượng bệnh nhân được nghiên

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

cứu còn chưa nhiều nên việc nghiên cứu với số lượng bệnh nhân cao hơn là cần

thiết để khẳng định kết quả thu được.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu được chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

1. Đã tách được ADN tổng số từ 61 cặp mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng (bao gồm mô u và mô lân cận ở mỗi bệnh nhân). ADN thu được đạt độ sạch cần thiết, đáp ứng được các yêu cầu thí nghiệm.

2. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã khuếch đại thành công các đoạn gen chứa vị trí đột biến 3243 (kích thước 218 bp) và 10398 (kích thước 246 bp) của ADN ty thể từ mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

3. Phân tích RFLP đã xác định được tần xuất alen 10398G là 54 % mô u, 54 % mô lân cận u. Tính chung là 54%.

4. Phân bố đa hình A10398G không phụ thuộc vào các đặc điểm bệnh học lâm sàng như vị trí mô, tuổi, giới tính, kích thước u, số hạch lympho, giai đoạn tiến triển bệnh, mức độ biệt hóa (p>0,05).

5. Không tìm thấy đột biến A3243G của ADN ty thể ở các bệnh nhân ung thư đại trực tràng được nghiên cứu.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

KIẾN NGHỊ

Từ quá trình nghiên cứu thực tế chúng tôi đưa ra một số kiến nghị sau:

1. Tiếp tục phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể trên đối tượng bệnh nhân ung thư đại trực tràng với số lượng mẫu lớn hơn để có kết quả đánh giá chính xác tần xuất cũng như mối liên hệ giữa đột biến gen tARN và ND3 với bệnh ung thư đại trực tràng ở người Việt Nam.

2. Tiến hành phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể bằng các kỹ thuật PCR định lượng, dHPLC để xác định mức độ không đồng nhất của ADN ty thể ở các bệnh nhân được nghiên cứu.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Đái Duy Ban (2003), "Bước đầu nghiên cứu ung thư vú bệnh nhân Việt

Nam bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen ty

thể vùng D- Loop", Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, nghiên

cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học, pp. 825-830.

2. Phan Văn Chi (2006), "Nghiên cứu giải mã genome ty thể các tộc người Việt

Nam và định hướng ứng dụng". Báo cáo đề tài cấp nhà nước (mã số: KC-04-

25).

3. Nguyễn Như Hiền (2010), Giáo trình sinh học tế bào, Nhà xuất bản giáo dục

Việt Nam.

4. Chu Văn Mẫn (2009), "Tìm hiểu bệnh ty thể ở người bằng phương pháp sinh

học phân tử". Báo cáo đề tài ĐHQGHN (mã số: QT-08-31).

5. Nguyễn Hữu Nghĩa, Đặng Trần Trung và Tống Quang Vinh (2008), "Đột

biến hệ gen ty thể vùng D-Loop ở người lao động thường xuyên tiếp xúc với

bức xạ ion hóa", Tạp chí Y học Việt Nam, 351, pp. 29-34.

6. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất bản

giáo dục Việt Nam.

7. Lê Đình Roanh và Nguyễn Văn Chủ (2008), Bệnh học các khối u, Nhà xuất

bản y học Hà Nội.

8. Phạm Hùng Vân, Hoàng Hiếu Ngọc và Võ Quang Hồng Điểm (2010), "Các

trường hợp đầu tiên về bệnh lý thần kinh nhãn cầu LEBER xác định bằng kỹ

thuật giải trình tự DNA ty thể tách chiết từ bạch cầu của bệnh nhân để phát

hiện các đột biến gây bệnh", Kỷ yếu hội nghị Sinh học phân tử và hóa sinh y

học, pp. 285-289.

Tài liệu tiếng Anh

9. Alonso A., Martin P., and Albarran C. et al (1997), "Detection of somatic

mutations in the mitochondrial DNA control region of colorectal and gastric

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

tumors by heteroduplex and single-strand conformation analysis",

Electrophoresis, 18, pp. 682-685.

10. Anderson S., Bankier A. T., and Barrell B. G. (1981), "Sequence and

organization of the human mitochondrial genome", Nature, 290(1), pp. 457-

465.

11. Andrew R. M., Kubacka I., and Chinnery P. F. (1999), "Reanalysis and

revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial

DNA", Nature Genetics, 23(147).

12. Bai R. K., Leal S. M., and Covarrubias D. (2007), "Mitochondrial genetic

background modifies breast cancer risk", Cancer Research, 67, pp. 4687-

4694.

13. Bassam B. J., Caetano-Anollés G., and Gresshoff P. M. (1991), "Fast and

sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels", Analytical

Biochemistry, 196, pp. 80-83.

14. Bianchi M. S., Bianchi N. O., and Bailliet G. (1995), "Mitochondrial DNA

mutations in normal and tumor tissues from breast cancer patients",

Cytogenetics and Cell Genetics , 71(1), pp. 99-103.

15. Bonner M. R. et al (2009), "Mitochondrial DNA Content and Lung Cancer

Risk", Lung Cancer, 63(3), pp. 331-334.

16. Booker L. M. et al (2006), "North American white mitochondrial

haplogroups in prostate and renal cancer", Journal of Urology, 175(2), pp.

468-472.

17. Burgart L. J. et al (1995), "Somatic mitochondrial mutation in gastric

cancer", The American Journal of Pathology, 147, pp. 1105-1111.

18. Canter J. A. et al (2005), "Mitochondrial DNA G10398A polymorphism and

invasive breast cancer in African-American women", Cancer Research,

65(17), pp. 8028-8033.

19. Chatterjee A., Mambo E., and Sidransky D. (2006), "Mitochondrial DNA

mutations in human cancer", Oncogene, 25, pp. 4663-4674.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

20. Cheah P. Y. (2009), "Recent advances in colorectal cancer genetics and

diagnostics", Critical Reviews in Oncology/Hematology, 69(1), pp. 44-45.

21. Chen T. et al (2011), "The mitochondrial DNA 4,977-bp deletion and its

implication in copy number alteration in colorectal cancer", BMC Medical

Genetics, 12, pp. 8.

22. Chinnery P. F., Johnson M. A. and Wardell T. M. (2000), "Epidemiology of

pathogenic mitochondrial DNA mutations", Annals of Neurology, 48, pp.

188-193.

23. Choi S. J. et al (2011), "Mutational hotspots in the mitochondrial genome of

lung cancer", Biochemical and Biophysical Research Communications,

407(1), pp. 23-27.

24. Czarnecka A. M., Golik P., and Bartnik E. (2006), "Mitochondrial DNA

mutations in human neoplasia", Journal of Applied Genetics , 47(1), pp. 67-

78.

25. Czarnecka A. M., Krawczyk T., and Zdrozny M. (2010), "Mitochondrial

NADH-dehydrogenase subunit 3 (ND3) polymorphism (A10398G) and

sporadic breast cancer in Poland", Breast cancer Research Treatment, 121,

pp. 511-518.

26. Darvishi K., Sharma S., and Bhat A. K. (2007), "Mitochondrial DNA

G10398A polymorphism imparts maternal haplogroup N a risk for breast and

esophageal cancer", Cancer Letters, 249, pp. 249-255.

27. Desler C. et al (2011), "The importance of mitochondrial DNA in aging and

cancer", Journal of Aging Research, 9.

28. Dubeau F. et al (2000), "Oxidative phosphorylation defect in the brains of

carriers of the tRNAleu(UUR) A3243G mutation in a MELAS pedigree",

Annals of Neurology , 47(2), pp. 179-185.

29. Edge S. B. and Byrd D. R. (2002), AJCC Cancer Staging Manual, sixth ed,

Springer-Verlag New York.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

30. Fang H., Shen L., and Chen T. (2010), "Cancer type-specific modulation of

mitochondrial haplogroups in breast, colorectal and thyroid cancer", BMC

Cancer, 10(421).

31. Goto Y., Nonaka I., and Horai S. (1990), "A mutation in the

tRNA(Leu)(UUR) gene associated with the MELAS subgroup of

mitochondrial encephalomyopathies", Nature, 348(6302), pp. 651-653.

32. Green D. R. (1998), "Apoptotic pathways: the roads to ruin", Cell, 6, pp.

695-698.

33. Howe J. R. and Guillem J. G. (1997), “The genetics of colorectal cancer”,

Clinical Cancer Research, 8, pp. 450-456.

34. Juo S. H., et al (2010), "A common mitochondrial polymorphism 10398A>G

is associated metabolic syndrome in a Chinese population", Mitochondrion,

10(3), pp. 294-299.

35. Kaleigh S. (2002), "Genetic Polymorphism and SNPs. Genotyping,

Haplotype Assembly Problem, Haplotype Map, Functional Genomics and

Proteomics".

36. Karicheva O. Z. et al (2011), "Correction of the consequences of

mitochondrial 3243A>G mutation in the MT-TL1 gene causing the MELAS

syndrome by tRNA import into mitochondria", Nucleic Acids Research,

39(18), pp. 8173-8186.

37. Kazuno A., Munakata K., and Nagai T. (2006), "Identification of

Mitochondrial DNA Polymorphisms That Alter Mitochondrial Matrix pH

and Intracellular Calcium Dynamics", Public Library of Science Genetics,

2(8).

38. Kim M. M., Clinger J. D., and et al (2004), "Mitochondrial DNA quantity

increases with histopathologic grade in premalignant and malignant head and

neck lesions", Clinical Cancer Research, 10, pp. 8512-8515.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

39. Kornprat P., Pollheimer M. J., and Lindtner R. A. (2011), "Value of Tumor

Size as a Prognostic Variable in Colorectal Cancer: A Critical Reappraisal",

American Journal of Clinical Oncology, 34(1), pp. 43-49.

40. Lascorz J. et al (2012), "Polymorphisms in the mitochondrial oxidative

phosphorylation chain genes as prognostic markers for colorectal cancer",

BMC Medical Genetics, 13.

41. Lee H. C. et al (2004), "Somatic mutations in the D-Loop and decrease in the

copy number of mitochondrial DNA in human hepatocellular carcinoma",

Mutations, 547, pp. 71-78.

42. Yao D. S. (2007), “Specific molecular markers in hepatocellular carcinoma”,

Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International , 6(3), 241-247.

43. Lim K. S., Naviaux R. K., and Haas R. H. (2007), "Quantitative

Mitochondrial DNA Mutation Analysis by Denaturing HPLC", Clinical

Chemistry, 53(6), pp. 1046-1052.

44. Lin P. C. et al (2008), "Expression of β-F1-ATPase and mitochondrial

transcription factor A and the change in mitochondrial DNA content in

colorectal cancer: clinical data analysis and evidence from an in vitro study",

International Journal of Colorectal Disease, 23, pp. 1223-1232.

45. Liu V. W. et al (2001), "High incidence of somatic mitochondrial DNA

mutations in human ovarian carcinomas", Cancer Research, 61, pp. 5998-

6001.

46. Lorenc A. et al (2003), "Homoplasmic MELAS A3243G mtDNA mutation

in a colon cancer sample", Mitochondrion , 3(2), pp. 119-124.

47. Mambo E. et al (2005), "Tumor-specific changes in mtDNA content in

human cancer", International Journal Cancer, 116(6), pp. 920-924.

48. Mancuso M., Conforti F. L., and Rocchi A. (2004), "Could mitochondrial

haplogroups play a role in sporadic amyotrophic lateral sclerosis?",

Neuroscience Letters., 371, pp. 158-162.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

49. Mansoureh A. et al (2011), "Analysis of mitochondrial ND1 gene in human

colorectal cancer", Journal of Research in Medical Sciences, 16(1), pp. 50-

55.

50. Marzuki S., Noer A. S., and Lertrit P. (1991), "Normal variants of human

mitochondrial DNA and translation products: the building of a reference data

base", Human Genetics, 88(2), pp. 139-145.

51. Modica-Napolitano J. S., Kulawiec M., and Singh K. K. (2007),

"Mitochondria and Human Cancer", Current Molecular Medicine, 7, pp.

121-131.

52. Pezzotti A., Kraft P., and Hankinson S. E. (2009), "The Mitochondrial

A10398G Polymorphism, Interaction with Alcohol Consumption and Breast

Cancer Risk", PLoS ONE, 4(4).

53. Polyak K. et al (1998), "Somatic mutations of the mitochondrial genome in

human colorectal tumours", Nature Genetics, 20, pp. 291-293.

54. Reid F. M., Vernham G. A., and Jacobs H. T. (1994), "A novel

mitochondrial point mutation in a maternal pedigree with sensorineural

deafness", Human Mutations, 3(3), pp. 243-247.

55. Setiawan V. W., Chu L. H., and John E. M. (2008), "Mitochondrial DNA

G10398A variant is not associated with breast cancer in African- American

women", Cancer Genetic Cytogenetics, 181, pp. 16-19.

56. Skonieczna K., Malyarchuk B. A., and Grzybowski T. (2012), "The

landscape of mitochondrial DNA variation in human colorectal cancer on the

background of phylogenetic knowledge", Biochimica et Biophysica Acta,

1825, pp. 153-159.

57. Solano A., Playan A., and Lopez-Perez M. (2001), "Genetic diseases of

human mitochondrial DNA", Salud publica de Mexico, 43, pp. 151-161.

58. Tan D. J., Bai R. K., and Wong L. J. (2002), "Comprehensive scanning of

somatic mitochondrial DNA mutations in breast cancer", Cancer Research,

62, pp. 972-976.

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

59. Taniike M. and Yanagihara F. H. (1992), "Mitochondrial tRNA(Ile) mutation

in fatal cardiomyopathy", Biochemical and Biophysical Research

Communications, 186, pp. 47-53.

60. Taylor R. W. and Turnbull D. M. (2005), "Mitochondrial DNA mutations in

human disease", Nature Reviews Genetics, 6, pp. 389-402.

61. Theodoratou E., Din F. V. N., and Farrington S. M. (2006), "Association

between comon mtDNA variants and all-cause or colorectal cancer

mortality", Carcinogenesis, 31, pp. 296-301.

62. Torroni A., Schurr T. G., and Cabell M. F. (1993), "Asian affinities and

continental radiation of the four founding Native American mtDNAs", The

American Journal of Human Genetics, 53(3), pp. 563-590.

63. Tseng L. M. et al (2006), "Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial

DNA depletion in breast cancer", Genes, Chromosomes and Cancer, 45, pp.

629-638.

64. Tuppen H. A., Blakely E. L., and Turnbull D. M. (2010), "Mitochondrial

DNA mutations and human disease", Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -

Bioenergetics, 1797(2), pp. 113-128.

65. Van der Walt J. M. et al (2004), "Analysis of European mitochondrial

haplogroups with Alzheimer disease risk.", Neuroscience Letters., 365(1),

pp. 28-32.

66. Van der Walt J. M., Nicodemus K. K., and Martin E.

R. (2003), "Mitochondrial Polymorphisms Significantly Reduce the Risk of

Parkinson Disease", The American Journal of Human Genetics, 72(4), pp.

804-811.

67. Wallace D. C. and Lott M. T. (2002), Mitochondrial Genes in Degenerative

Diseases, Cancer, and Aging, London, Churchill Livingstone.

68. Wallace D. C. et al (1988), "Mitochondrial DNA mutation accociated with

Leber's hereditary optic neuropathy", Science, 242(1427-1430).

Luận văn Cao học Nguyễn Thị Ngọc Tú _________________________________________________________________________

69. Wang Y., et al (2006), "Association of decreased mitochondrial DNA

content with ovarian cancer progression", British Journal of Cancer, 95, pp.

1087-1091.

70. Warburg O. (1930), "The metabolism of tumors", London Constable Co. Ltđ.

71. Webb E., Broderick P., and Chandler I. (2008), "Comprehensive analysis of

common mitochondrial DNA variants and colorectal cancer risk", British

Journal of Cancer, 99, pp. 2088-2093.

72. Wu C. W. et al (2005), "Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial

DNA depletion in gastric cancer", Genes, Chromosomes and Cancer 44, pp.

19-28.

73. Ye C., Shu X., and Wen W. (2008), "Quantitative analysis of mitochondrial

DNA 4977-bp deletion in sporadic breast cancer and benign breast diseases",

Breast Cancer Research Treatment 108, pp. 427-434.

74. Yeh J. J., Lunetta K. L., and van Orsouw N. J. (2000), "Somatic

mitochondrial DNA (mtDNA) mutations in papillary thyroid carcinoma and

differential mtDNA sequence variants in case with thyroid tumour",

Oncogene, 19, pp. 2060-2066.

Tài liệu World wide web

75. http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Code4.html

76.

http://suckhoedoisong.vn/201012280936443p0c44/khong-chu-quan-voi- dau-hieu-ban-dau.htm

77. https://www.c3life.com/ostomy/ostomybasics/colorectal-cancer/

78. http://www.medicinenet.com/colon_cancer/article.htm

79. http://www.cancer.gov/cancertopics/types/colon-and-rectal

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân cùng đặc điểm lâm sàng

Bệnh viện K, Tam Hiệp

Họ và tên

Tuổi

Vị trí hạch Kiểu ung thư Ổ sùi loét

TNM

STT Mã số

Giới tính

Vị trí khối u

Số hạch

Mức độ biệt hóa

Đa hình A10398G

Kích thước u (cm)

Kích thước hạch (cm)

4x5cm

1.5

8702

Lê Văn S

Nam

T3N1M0

Trực tràng

Gần trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

10200 Dương Thị H

Nữ

T2N0M0

Trực tràng

Gần trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

Nguyễn Sỹ V

Nam

6x7cm

1-1.2

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

9802

Lê Tất L

Nam

Đại tràng

2x2.5cm

0.5-1

T1N0M0

Gần đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

9807 Nguyễn Thị V

Nữ

Đại tràng

8x10cm

T4N1M1

Gần đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

10489 Đỗ Văn C

Nam

Đại tràng

2x2cm

T1N0M0

Gần đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

8619 Nguyễn Tiến Ư

Nam

Đại tràng

4x5cm

0.5

T3N1M0

Gần đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

T1N0M0

10517 Triệu Thị T

Nữ

2x2.5cm

Trực tràng

Gần trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

T3N1M0

10597 Hoàng Thị Q

Nữ

Đại tràng

4x4.5cm

Gần đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

T2N0M0

10600 Nguyễn Thị T

Nữ

3x4cm

Trực tràng

Gần trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

T2N0M0

10608 Ninh Thị C

Nữ

2.5x4cm

Trực

Gần trực

Ung thư biểu

tràng

mô tuyến

10611 Bùi Công H

Nam

Đại tràng

3.5x4cm

0.5-1

T2N1M0

Gần đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

10626 Nguyễn Duy A

Nam

Đại tràng

2x6cm

T3N1M0

Gần đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

10731 Lê Thu P

Nữ

Đại tràng

3.5x4cm

T2N0M0

Gần đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

10740 Ngũ Thanh H

Nữ

2.5x3cm

T2N0M0

Trực tràng

Gần trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

10774

Phạm Văn T

Nam

2.5x2cm

T2N0M0

Trực tràng

Gần trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

11777 Nguyễn Thị T

Nữ

3x4cm

0.5-1

T3N0M0

Trực tràng

Gần trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

11781 Dương Văn T

Nam

2.5x3cm

0.5-0.8

T2N0M0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

11803 Cao Ngọc T

Nam

4x6cm

0.5-1.2

T3N1M0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

11812 Nguyễn Trung T

Nam

4x6cm

0.5x0.5

T3N0M0

Trực tràng

Gần trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

11822 Cao Xuân V

Nam

2.5cm

0.4

T2N0M0

Trực tràng

Gần trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

10282 Nghiêm Thị M

Nữ

Đại tràng

3x4cm

T2N0M0

Gần đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

8276 Vũ Quang N

Nam

Đại tràng

4x5cm

T2N1M0

Ung thư biểu mô tuyến

4x6

Kém

16678

Phạm Vĩnh B

Nam

T1N2M0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

16756 Nguyễn Văn T

Nam

Vừa

T2N1M0

Đại trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

3x4

16675 Đào Tiến L

Nam

T1N0M0

Đại trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

2x2.5

Vừa

16689 Trần Văn T

Nam

T1N1M0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

16890 Chu Thị C

Nữ

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

3x3.5

T2N1M0

16714 Trần Thị T

Nữ

2.5x3

Vừa

T2N0M0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

16723 Lê Đình H

Nam

Đại tràng

T1N2M0

Gần đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

8614

Lê Thị Y

Nữ

Đại tràng

2x3

0,5-1

T2N0M0

Gần đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

Bệnh viện Việt Đức

Họ và tên

STT Mã

Tuổi

Vị trí u

Kiểu ung thư

Ổ sùi loét

TNM

Mức độ phân hóa

Đa hình A10398G

Giới tính

Kích thước u

Số hạch

Vị trí hạch

Kích thước hạch

2903 Nguyễn Văn S

Nam

6x8 cm

Cao

T3N0M0

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

3035 Nguyễn Thị M

Nữ

5x4 cm

Vừa

T3N1

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

3161 Đỗ Thị H

Nữ

4 x3cm

T4NoM1

Vừa

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

3352 Nguyễn Viết Q

Nam

Cao

T3N0

4x5x3 cm

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

3372 Nguyễn Khắc Q

Nam

5x3 cm

Vừa

T3N0

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

3558 Nguyễn Hữu Đ

Nam

3x2 cm

Cao

T4N0M0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

iii

3753 Hoàng Thị T

Nữ

5x3 cm

Vừa

T2N0

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

39 X7492 Nguyễn Thị N

Nữ

8x5 cm

Vừa

T4N0M0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

40 X7488 Nguyễn Thị M

Nữ

7x6 cm

Cao

T1N1M1

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

41 X7835 Đào Công H

Nam

3x4 cm

Cao

T3N0M0

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

42 X7825 Nguyễn Thị T

Nữ

Vừa

T3N0M0

3x3.5 cm

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

3822 Đỗ Thị H

Nữ

T4N2Mo

Vừa

9x6 x6 cm

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

3825 Đinh Văn G

Nam

4x3

Vừa

T3N0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

3905 Nguyễn Thị T

Nữ

4x3

Vừa

T3N0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

3906 Nguyễn Thị T

Nữ

Vừa

T4N0

10x8x6 cm

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

4101 Nguyễn Thị X

Nữ

6x4 cm

Vừa

T4N1

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

4120 Đỗ Thị V

Nữ

3 cm

Vừa

T3N0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

10x8 cm

Vừa

4297

Phạm Văn T

Nam

T3N0

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

6x4 cm

Vừa

4374 Đoàn Thị R

Nữ

T3N0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

Vừa

4463 Nguyễn Văn M

Nam

T4N1M0

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

Kém

4475 Nguyễn Thị G

Nữ

T4N1M0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

4539 Hoàng Đình X

Nam

3x1 cm

T3N1

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

4595 Trịnh Thị N

Nữ

T4N2M0

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

4603 Trần Văn V

Nam

T3N0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

Vừa

4620 Ngô Thị H

Nữ

T4N0

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

6x5 cm

4644 Hoàng Hữu T

Nam

T4N1

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

4779 Nguyễn Văn N

Nam

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

4833 Nguyễn Thị P

Nữ

Cao

T3N0M0

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

4841 Cà Thị V

Nữ

Vừa

T3N0

Trực tràng

Ung thư biểu mô tuyến

4942 Nguyễn Thị C

Nữ

2x1

T3N1

Đại tràng

Ung thư biểu mô tuyến

Phụ lục 2. Kết quả giải trình tự đoạn 10398

vii

viii

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân tích đột biến gen tARN và ND3 của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Chủ đề:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------  -------

NGUYỄN THỊ NGỌC TÚ

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Ngọc Tú

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN tARN VÀ ND3 CỦA ADN

TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội – 2012

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... a

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU

Chương 1- TỔNG QUAN

Hình 1. Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể người [ 75].

Hình 2. Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64]

Hình 3. Genome ty thể với các đột biến trong các bệnh ung thư [19]

Bảng 1. Hệ thống phân loại TNM đối với ung thư đại trực tràng [29]

Hình 5. Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [77].

Bảng 2. Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau [29]

Hình 6. Một số đột biến điểm trên tARN ty thể người [59].

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Bảng 3. Thống kê mẫu sử dụng

Ung

thư

Ung thư

Ung

thư

Bệnh viện cung cấp mẫu Số mẫu

giữa đại và

đại tràng

trực tràng

trực tràng

Bảng 4. Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 5. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 6. Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l

Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI

Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6]

Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6]

Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thước 7cm

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 7. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô

Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243

Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 với enzyme HaeIII.

Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398

Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 với enzyme DdeI

Hình 12. Kết quả giải trình tự mẫu không mang đột biến A10398G

Hình 13. Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể

Hình 14. Kết quả giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G

Hình 15. Kết quả so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn của ty thể

Bảng 12. Phân bố đa hình A10398G ở ADN ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng

Nam

Giới tính

Nữ

≥ 50

Tuổi

< 50

Đại tràng

Vị trí ung thư

Trực tràng

Giữa đại và trực tràng

Hạch

0

13

>3

<5cm

Kích thước u

Giai đoạn I

T1-2N0M0

Giai đoạn II

T3-4N0M0