Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng tạo sắc tố đỏ và Monacolin K của vi nấm Monascus Purpureus

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:96

Thêm vào BST

Báo xấu

128
lượt xem 17
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng tạo sắc tố đỏ và Monacolin K của vi nấm Monascus Purpureus bao gồm những nội dung chính về tổng quan tài liệu, vật liệu và phương pháp, kết quả và biện luận. Với các bạn chuyên ngành Sinh học thì đây là tài liệu hữu ích.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng tạo sắc tố đỏ và Monacolin K của vi nấm Monascus Purpureus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Xuân Hồng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO SẮC TỐ ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM MONASCUS PURPUREUS LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Xuân Hồng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO SẮC TỐ ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM MONASCUS PURPUREUS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HỮU PHÚC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013
LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Thầy TS. Nguyễn Hữu Phúc đã tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy - Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư Phạm Tp. Hồ Chí Minh đã hết lòng chỉ bảo truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm của mình trong suốt thời gian theo học. Tôi xin gởi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Tuyến, cô Thanh, anh Vinh, anh Dân cùng các bạn trong Viện Sinh học Nhiệt đới đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi hoàn thành các thí nghiệm của đề tài. Tôi xin cảm ơn tất cả các thành viên của lớp Cao học Vi sinh vật K22 -Trường Đại học Sư Phạm TP. Hồ Chí Minh cùng những người bạn thân đã luôn ở bên để động viên, an ủi, giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Con xin cảm ơn Gia đình thân yêu đã luôn khích lệ, dành tình cảm yêu thương và chăm sóc cho con trong suốt những năm qua. 1
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi có sự hỗ trợ từ Giáo viên hướng dẫn TS. Nguyễn Hữu Phúc. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu khoa học nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra đề tài còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác và cũng được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Xuân Hồng 2
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 1 LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 2 MỤC LỤC .................................................................................................................... 3 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................... 6 MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 9 1.1. Khái quát về nấm MONASCUS .................................................................................9 1.1.1. Lịch sử sử dụng gạo men đỏ ...................................................................................9 1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Monascus .................................................................10 1.1.3. Các sản phẩm trao đổi chất của nấm Monascus sp. ..............................................12 1.2. Khái quát về sắc tố .....................................................................................................12 1.2.1. Cấu tạo phân tử......................................................................................................13 1.2.2. Đặc tính sắc tố .......................................................................................................14 1.2.3. Tình hình sử dụng màu thực phẩm ........................................................................15 1.2.4. Các phương pháp lên men tạo sắc tố .....................................................................16 1.3. Khái quát về MONACOLIN K ................................................................................23 1.3.1. Giới thiệu ...............................................................................................................23 1.3.2. Cấu tạo phân tử......................................................................................................24 1.3.3. Tính chất của Monacolin K ..................................................................................25 1.3.4. Tác dụng của Monacolin K trong chữa trị các bệnh tim mạch .............................25 1.3.5. Quá trình lên men sản xuất Monacolin K .............................................................26 1.4. Khái quát về CITRININ ...........................................................................................27 1.4.1. Cấu trúc phân tử ....................................................................................................27 1.4.2. Đặc tính sinh học ...................................................................................................27 1.4.3. Đặc tính vật lý và hóa học của citrinin ..................................................................28 1.4.4. Vấn đề an toàn sức khỏe khi sử dụng các sản phẩm từ nấm men đỏ ...................28 1.5. Khái quát về CHOLESTEROL ................................................................................29 1.5.1. Giới thiệu ...............................................................................................................29 1.5.2. Quá trình sinh tổng hợp cholesterol ......................................................................29 1.5.3. Ảnh hưởng của cholesterol đối với bệnh tim mạch .............................................30 1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước [5]. ......................................................31 1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .........................................................................31 1.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ..........................................................................32 3
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 34 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị .........................................................................................34 2.1.1. Giống vi sinh vật và nguyên liệu:..........................................................................34 2.1.2. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng ................................................................34 2.1.3. Hóa chất:...............................................................................................................34 2.1.4. Thiết bị và dụng cụ: ...............................................................................................35 2.2. Nội dung thí nghiệm ..................................................................................................35 2.3. Phương pháp thí nghiệm:..........................................................................................36 2.3.1. Quan sát hình thái nấm Monascus.........................................................................36 2.3.2. Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật. .........................................................37 2.3.3. Xác định độ ẩm ban đầu của gạo và độ ẩm gạo sau lên men ................................38 2.3.4. Phương pháp lên men thu nhận chế phẩm ............................................................38 2.3.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố và Monacolin K ......................................................................................................................................39 2.3.6. Phương pháp trích ly sắc tố ...................................................................................41 2.3.7. Xác định hàm lượng Monacolin K ........................................................................41 2.3.8. Đặc tính sinh học của chế phẩm gạo men đỏ: .......................................................42 2.3.9. Khảo sát độ bền của dịch màu ...............................................................................46 2.3.10. Phương pháp xác định độc tính aflatoxin, độ nhiễm khuẩn của bột gạo men đỏ. .........................................................................................................................................46 2.3.11. Phương pháp tách chiết citrinin..........................................................................46 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 48 3.1. Đặc điểm chủng MONASCUS PURPUREUS N.212 ...............................................48 3.1.1. Hình dạng khuẩn lạc ..............................................................................................48 3.1.2. Cấu trúc tế bào.......................................................................................................49 3.2. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố .......51 3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men .........................................................................51 3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu ..............................................................................52 3.2.3. Ảnh hưởng của số lượng giống .............................................................................54 3.2.4. Ảnh hưởng của pH ................................................................................................56 3.2.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 0,5% ..........................................................................58 3.2.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon ...............................................................................60 3.2.7. Ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol ...................................................................62 3.2.8. Ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy với Saccharomyces cerevisiae......................63 3.3. Đường chuẩn MONACOLIN K ...............................................................................64 4
3.4. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp MONACOLIN K...............................................................................................................64 3.4.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men .........................................................................64 3.4.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu ..............................................................................65 3.4.3. Ảnh hưởng của số lượng giống .............................................................................67 3.4.4. Ảnh hưởng của pH ................................................................................................68 3.4.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 0.5% ..........................................................................69 3.4.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon ...............................................................................70 3.4.7. Ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol ...................................................................71 3.4.8. Ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy với Saccharomyces cerevisiae......................73 3.5. Đặc tính sinh học của chể phẩm gạo men đỏ ..........................................................74 3.5.1. Định tính enzyme của chế phẩm ...........................................................................74 3.5.2. Định lượng hoạt tính enzyme của chế phẩm. ........................................................75 3.6. Kết quả khảo sát độ bền sắc tố với ánh sáng theo thời gian .................................77 3.7. Đánh giá chất lượng sản phẩm .................................................................................78 3.7.1. Độc tính aflatoxin [49]. .........................................................................................78 3.7.2. Tổng vi khuẩn hiếu khí..........................................................................................78 3.8. Hiệu suất của các phương pháp tách chiết CITRININ ..........................................78 3.8.1. Phần trăm Monacolin K còn lại: ...........................................................................78 3.8.2. Phần trăm citrinin còn lại: .....................................................................................79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 84 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 89 5
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHỮ VIẾT TẮT AU/g Đơn vị hấp thụ/ gam HDL High- dendity lipoprotein HDL – c High- dendity lipoprotein cholesterol HMG-CoA reductase 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase KHV Kính hiển vi KL Khuẩn lạc LDL Low- dendity lipoprotein LDL – c Low- dendity lipoprotein cholesterol M. purpureus Monascus purpureus MSG Monosodium glutamate MT Môi trường MVA Mevinolinic RYR Red Yeast Rice sp. Species WHO World Health Organization 6
MỞ ĐẦU Gạo men đỏ (Red yeast rice – Hồng khúc) - một sản phẩm truyền thống đã được sử dụng rộng rãi từ nhiều thế kỷ qua ở các nước Châu Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc…) và một số nước Đông Nam Á trong sản xuất thực phẩm nhằm làm chất bảo quản, chất tạo màu … cũng như trong y học cổ truyền [5], [13]. Nó được xem là sản phẩm không độc hại, có ích trong điều trị chứng đau bụng khó tiêu, chứng tiêu chảy, mụn nhọt, tan vết bầm, giải rượu, yếu sinh lý, làm tăng sự lưu thông máu và kích hoạt lá lách, dạ dày… Mặc dù đã được sử dụng khá lâu nhưng gạo men đỏ vẫn không gây được sự chú ý của các nước phương Tây. Mãi cho đến năm 1976, khi phát hiện của Giáo sư Akira Endo (Nhật Bản) về Monacolin K (Lovastatin, Mevinolin) một sản phẩm trao đổi chất của chủng Monascus purpureus Went, hoạt chất này có giá trị cao giúp giảm cholesterol thông qua việc ức chế enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase) trong cơ thể, góp phần vào việc ngăn chặn và đẩy lùi được các bệnh liên quan đến tim mạch [38]. Trong khi đó, bệnh tim mạch được xếp vào loại tử vong cao nhất ở hầu hết các quốc gia, các khu vực và các châu lục trên thế giới, không chỉ tập trung ở người già, ở các nước phát triển mà bệnh còn phổ biến trong giới trẻ và ngay cả những nước đang phát triển. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) hàng năm trên thế giới bệnh tim mạch vẫn gây nên 17,5 triệu cái chết trong đó các nước đang phát triển chiếm 8-9 triệu (2006). Còn tại Việt Nam, chỉ tính riêng ở Viện Tim Mạch Việt Nam và Viện Tim Mạch TP. HCM mỗi năm có hàng ngàn bệnh nhân đến khám và điều trị [37], [42]. Thông thường, để điều trị bệnh tim mạch nói trên người ta có thể dùng nhiều thuốc khác nhau bán trên thị trường, phổ biến là thuốc statin được sản xuất từ Aspergillus tereus [38]. Việc sử dụng các thuốc này mắc phải nhược điểm là giá thành khá cao bên cạnh đó còn để lại nhiều phản ứng phụ như: nhiễm độc gan do thuốc, nguy cơ gây bệnh tiểu đường, gây dị ứng… Chính vì vậy, chế phẩm Monascus rất được quan tâm sản xuất rộng rãi trên thế giới để làm nên chất tạo màu hoặc chất bảo quản thay cho nitrat gây độc hại đồng thời làm nguyên liệu sản xuất thuốc làm giảm lượng cholesterol trong máu, chất chống cao huyết áp… hạn chế và ngăn ngừa các bệnh tim mạch. 7
Trên cơ sở đó, Chúng tôi tập trung nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO SẮC TỐ ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM MONASCUS PURPUREUS” nhằm mục tiêu: Tìm hiểu một số điều kiện ảnh hưởng khả năng tạo sắc tố và hàm lượng Monacolin K của chủng Monascus purpureus N.212 và tìm cách nâng cao hàm lượng Monacolin K trong sản phẩm sau lên men. Nghiên cứu gồm các nội dung sau đây: Xác định một số đặc điểm phát triển của M. purpureus N.212 trên môi trường PGA. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến lượng sắc tố và hàm lượng Monacolin K tạo thành của chủng M. purpureus N.212 trên môi trường gạo Tài nguyên. Xác định phương pháp khử citrinin trong sản phẩm gạo men đỏ tạo thành. Xác định hoạt tính một số enzyme của chế phẩm gạo men đỏ. Đánh giá chất lượng sản phẩm về mặt sinh học và hóa lý. 8
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát về nấm MONASCUS 1.1.1. Lịch sử sử dụng gạo men đỏ Gạo men đỏ là loại dược thảo và thực phẩm truyền thống Trung Quốc, được lên men từ gạo hấp với nấm Monascus, chế phẩm này được sử dụng cách đây hàng ngàn năm [9], [40]. Hiện nay trên thế giới, Monascus có nhiều tên gọi khác nhau như Red Yeast, Red yeast rice, Red Mould Rice, Red Mould (USA), Beni-Koji, Red-Koji, Ang-Khak (Nhật Bản), Hung-Chu, Hong Qu, Angkak, Zhitai (Trung Quốc), Rotschimmelreis (Châu Âu)… Cách đây 600 năm, Lý Thời Trân nhà y dược cổ đại Trung Hoa đã giới thiệu gạo men đỏ trong Bổn Thảo Cương Mục và trong các quyển sách khác của mình. Trong những tài liệu này, ông đã mô tả khá đầy đủ, chính xác về giá trị dược lý và chức năng của gạo men đỏ [40]. Năm 1884, Van Tieghem đã phân lập Monascus đầu tiên từ khoai tây và từ bánh hạt lanh và xác định là Monascus rubber. Năm 1895, Went cũng phân lập được Monascus purpureus từ gạo bị mốc đỏ lấy tại các chợ ở Java, Indonesia. Sau đó hàng loạt các chủng Monascus đã được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới [3]. Năm 1976, Giáo sư Akira Endo (Nhật Bản) đã tìm thấy Monacolin K từ các sản phẩm trao đổi chất của chủng Monascus purpureus Went. Hoạt chất này có thể làm giảm cholesterol trong máu, phát hiện này đã gây sự chú ý trên toàn thế giới. Công trình của Giáo sư Endo đã cho thấy, Monacolin K có thể ức chế sự tổng hợp của cholesterol trong cơ thể bằng cách ức chế cạnh tranh với enzyme HMG-CoA reductase. Nhờ vậy nó được dùng để ngăn ngừa và chữa trị các căn bệnh có liên quan đến hệ thống tim mạch và não bộ [12], [40]. Năm 1985, Giáo sư Goldstein và Brown (Mỹ) đã khám phá ra sự chuyển hóa của Monacolin K trong việc ức chế sự tổng hợp của cholesterol trong cơ thể. Nhờ vào công trình, họ đã được trao giải Nobel Sinh lý và Y khoa. Và sau đó, gạo nấm men đỏ trở nên nổi tiếng và phổ biến toàn cầu [3], [46]. 9
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của Monacolin K [41]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Monascus 1.1.2.1 Phân loại học Dựa theo khóa phân loại nấm mốc, Monascus được định danh như sau : - Ngành: Ascomycota - Lớp: Plectomycetes - Bộ: Eurotiales - Họ: Monascaceae - Giống: Monascus Theo Hawksworth và Pit (1983) Monascus được chia thành 3 loài gồm: M. pilosus, M. ruber, M. purpureus. Theo Martinkova và Patakova (1999), Pattanagul và cộng sự (2007) cho rằng Monascus được chia thành 6 loài: M. pilosus, M. ruber, M. purpureus, M. floridanus, M. pallens, M. sanguineus. Ngoài ra, còn có một số loài mới được tìm thấy nhưng lại không có liên quan đến thực phẩm (Canno và cộng sự, 1995) [13]. 1.1.2.1. Đặc điểm sinh học  Hình dạng khuẩn lạc - Đường kính khuẩn lạc: 40mm (sau một tuần nuôi trên môi trường PGA). 10
- Hình thái: phẳng, bẹt, tỏa tròn. - Bề mặt: Có tơ mỏng. - Màu sắc: từ đỏ cam chuyển thành đó tía rồi thành màu đỏ nâu - Mặt sau: màu đỏ tía. - Quan sát dưới kính hiển vi (ở 300C) Hình 1.2. Khuẩn lạc M. purpureus + Đặc tính nổi bật: những nang nấm có vách mỏng tồn tại nhiều, dạng tròn tồn tại những bào tử đính. Chất màu được tạo thành tạo hệ sợi dưới dạng tinh thể hình chữ nhật, có kích thước tương đối đồng đều. + Các nang nấm vách mỏng được sản sinh trên những sợi nấm ngắn giống cuống, các nang nấm trưởng thành chứa đầy các bào tử nang rời rạc, không gắn chặt nhưng các nang nấm vẫn có thể nhìn thấy rõ ràng khi còn non. + Bào tử mang hình cầu có kích thước 5 - 6 µm x 3,5 – 4 µm, phẳng, không màu. 1.1.2.2. Đặc tính sinh học Theo Van Tieghem, M. purpureus và M. ruber thuộc cùng một loài. Đây là loại nấm mốc hoại sinh phát triển trên tinh bột, thức ăn lên men trong các sản phẩm chế biến từ sữa (Went và cộng sự, 1895; Julova và cộng sự, 1996). Chúng có khả năng tạo ra sự lên men cellobiose, maltose, fructose và glucose nhưng không lên men đường saccharose (Ying và cộng sự, 1987). M. purpureus là loại nấm sợi, cơ quan sinh sản của chúng là nang bào tử. Các nang bào tử này thường có hình cầu (đường kính 5 µm) hoặc là hình trứng (đường kính 6x5 µm). Ở giai đoạn còn non hệ sợi nấm có màu trắng, tuy nhiên các hệ sợi này phát triển nhanh thành màu hồng đậm và sau cùng là màu vàng – cam. Trong quá trình phát triển, Monascus làm môi trường chuyển sang acid yếu và tạo ra dưới lớp môi trường một màu đỏ thẫm khi nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Monascus là top = 300C-370C, nhiệt độ tối đa tmax = 450C, nhiệt độ hấp nhất tmin = 150C-180C. 11
1.1.3. Các sản phẩm trao đổi chất của nấm Monascus sp. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển Monascus tạo ra nhiều chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp được trình bày trong bảng 1.1 gồm có: Bảng 1.1. Các sản phẩm trao đổi chất có giá trị của Monascus [5]. 1. Enzyme thủy phân Amylase, glucoamylase… ngoại bào Rượu (Ethanol) 2. Sản phẩm trao đổi Các acid ( acid citric, sucinic, gluconic, oxalic…) sơ cấp Hỗn hợp các ester Nhóm sắc tố (đỏ, vàng, cam) Monacolin γ – amino –butyric acid (GABA) 3. Các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Chất chống oxi hóa tự nhiên (flavonoid,…) Citrinin Chất làm giảm đường huyết và một số chất chưa định danh có hoạt tính sinh học. 1.2. Khái quát về sắc tố Màu tự nhiên đang có nhu cầu rất lớn đặc biệt để sử dụng trong thực phẩm và đồ uống. Trong năm 2007, thị trường màu thực phẩm tự nhiên được có giá trị từ 465 triệu USD, tăng 4,6% so với năm 2004 (Mapari và cộng sự, 2010). Các chất màu tự nhiên và màu được chiết xuất từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Sản xuất bột màu sử dụng các vi sinh vật có lợi thế nhất định so với các nguồn khác như chúng có thể được phát triển nhanh chóng trong điều kiện kiểm soát cao. Kết quả là năng suất cao của các sắc tố. Ngoài Monascus nhiều vi sinh vật khác có khả năng sản xuất sắc tố như các loài của chi Paecilomyces, Serratia, Cordyceps, Streptomyces và Penicillium (Gunasekaran và Poorniammal, 2008). Nhưng Monascus đã thu hút sự chú ý đặc biệt khi chúng tạo được nhiều màu sắc khác nhau đặc biệt là sắc tố đỏ và vàng là những màu thực phẩm mong muốn [13]. 12
Màu của Monascus được tách chiết bằng ethanol từ gạo lên men với nấm Monascus sau đó được thu nhận và tinh sạch để sử dụng phổ biến trong việc nhuộm màu thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Theo nhiều tác giả, có hơn 10 sắc tố tạo ra từ Monascus nhưng vẫn chưa có sự giải thích rõ ràng về chúng (Shin và cộng sự, 1998) [48]. Trong nhiều năm các nhà khoa học đã chứng minh sắc tố của Monascus phân thành 3 nhóm sắc tố: vàng - da cam - đỏ, trong đó sắc tố đỏ là quan trọng nhất do nó được sử dụng như chất màu thực phẩm và là chất thay thế nitrate trong bảo quản. 1.2.1. Cấu tạo phân tử Sắc tố của Monascus được tạo ra từ nhiều thành phần liên kết với nhau và được chia làm 3 nhóm sắc tố chính: - Rubropunctanin (C21H22O5) và Monascorubrin (C23H26O5) cho màu cam. - Ankaflavin (C23H30O5) và Monascin (C21H26O5) cho màu vàng. - Rubropunctamine (C21H23NO4) và Monoscorubramine (C23H27NO4) cho màu đỏ thẫm. Một màu có 2 cấu trúc phân tử khác nhau bởi chiều dài mạch của hợp chất béo. Các sắc tố có thể được sinh ra trong cả môi trường chìm hay bán rắn và lượng sắc tố tạo ra phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy chúng. 1.2.1.1. Màu cam:  Rubropunctatin (C21H22O5)  Monascotubrine (C23H26O5) R= C5H11 R= C7H15 1.2.1.2. Màu vàng 13
 Ankaflavin (C23H30O5) – R= C7H15  Monascin (C21H26O5) - R= C5H11 1.2.1.3. Màu đỏ  Rubropunctamine(C21H23NO4)  Monascorubramine (C23H27NO4) R= C7H15 R= C5H11 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của các sắc tố Monascus sp. (theo Sweeny (1993). Sự ổn định của màu ảnh hưởng bởi các điều kiện: acid, nhiệt độ, ánh sáng, oxygen, độ ẩm và thời gian. Các sắc tố này được thêm vào trong xúc xích, bánh nướng được giữ ổn định 92-95% trong suốt 3 tháng với nhiệt độ 40C (Fabre và cộng sự, 1993) [21]. Mặt khác có hai cách để giữ cho màu được ổn định là: màu được hòa tan trong cồn, màu được hòa tan trong dầu [13]. 1.2.2. Đặc tính sắc tố Ứng dụng Monascus trong mục đích nhuộm màu đã có từ lâu đời tại Trung Quốc. Monascus an toàn và không gây độc tố, nó ảnh hưởng đáng kể đến việc gia tăng tuần hoàn máu, giúp cải thiện chức năng lá lách và giảm mức độ mỡ trong cơ thể. Màu của Monascus được thu nhận từ quá trình lên men gạo, đậu nành thông qua quá trình tách chiết. Đó là màu thực phẩm tự nhiên và có chất lượng tốt với các đặc tính cụ thể: - Màu của Monascus có nguồn gốc tự nhiên, tốt cho sức khỏe. 14
- Dãy pH rộng từ 2 - 11. - Màu bền dưới ánh sáng thường, chống lại được nhiệt độ cao, tan được trong nước hoặc tan hoàn toàn trong cồn, các chất béo. - Không bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại như: Ca2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+ không bị ảnh hưởng bởi oxy hóa hoặc sự khử. - Màu thích hợp với các sản phẩm thịt, sữa, kem, nước trái cây, thức ăn biển… 1.2.3. Tình hình sử dụng màu thực phẩm 1.2.3.1. Các nước phát triển Ở các nước phát triển việc sử dụng các chất màu vào thực phẩm được quy định khá chặt chẽ. Người ta sớm nhận biết được các nhược điểm khi sử dụng màu tổng hợp nên việc sử dụng hạn chế và những quy định những chất màu rõ rệt nằm trong danh mục các chất màu cho phép, bên cạnh đó họ đầu tư cho việc nghiên cứu phát triển các chất màu có nguồn gốc tự nhiên: thực vật, vi sinh vật… 1.2.3.1. Ở Việt Nam Nước ta hiện nay đang đầu tư rất mạnh vào việc phát triển công nghiệp thực phẩm, danh sách các mặt hàng thực phẩm ngày càng nhiều, phong phú và đa dạng hơn về mẫu mã và đặc biệt màu sắc đẹp và phù hợp, dễ dàng gây sự chú ý ở người tiêu dùng bên cạnh đó cũng đồng thời nâng cao chất lượng và giá trị sản phẩm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho người tiêu dùng. Tuy vậy, tình hình sử dụng màu thực phẩm trong nước chưa được kiểm soát chặt chẽ mặc dù đã có những danh mục và chỉ tiêu quy định màu dùng cho thực phẩm, điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người cũng như kinh tế nhà nước. Ngày 04/4/1998 Bộ Y tế đã ban hành quyết định QĐ 867/1998/QĐ-BYT “Danh mục phẩm màu được phép sử dụng trong thực phẩm” trong đó có mười một chất tự nhiên và mười chất màu tổng hợp được phép sử dụng cũng như giới hạn tối đa cho phép trong thực phẩm. Tuy nhiên, nhiều nhà sản xuất sử dụng màu không nằm trong danh mục như quy định, thậm chí biết độc hại nhưng vì lợi nhuận họ vẫn coi thường sức khỏe của người tiêu dùng. Theo điều tra của Viện dinh dưỡng thì phẩm màu không đạt tiêu chuẩn rất cao. Hiện nay các doanh nghiệp, xí nghiệp nhỏ lẻ, cá thể, thủ công đặc biệt các quán hàng rong tỷ lệ 15
sử dụng màu ngoài danh mục rất cao. Chính vì điều đó nên hàng năm vẫn tồn tại nhiều vụ ngộ độc thực phẩm và hàng ngàn người phải điều trị những căn bệnh do chúng gây nên. 1.2.4. Các phương pháp lên men tạo sắc tố 1.2.4.1. Sản xuất sắc tố đỏ của Monascus bằng phương pháp lên men bán rắn Lên men bán rắn là phương pháp lên men truyền thống, dùng trong những thực phẩm cổ truyền của phương Đông từ nhiều thế kỷ qua (Pandey, 1992; Pandey và cộng sự, 2001). Tuy nhiên có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng lên men bán rắn tạo sắc tố của nấm Monascus purpureus sp [4]. a. Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp thay đổi từ 25 - 370C (Lin, 1991). Trong trường hợp M. purpureus CBS 109.7, nhiệt độ tối thích, cao nhất và thấp nhất cho sự phát triển lần lượt là: 340C, 460C và 180C (Rasheva,1998). Trong sự hình thành sắc tố nhiệt độ cao có thể thích hợp hơn so với nhiệt độ thấp [26], [28]. b. Độ ẩm: [13], [28]. Độ ẩm là thông số rất quan trọng, Lotong và Suwanarit (1990) đã sản xuất gạo đỏ chứa trong các túi nhựa plastic, sắc tố chỉ được tạo ra khi độ ẩm ban đầu thấp 26-32%. Nếu lượng độ ẩm ban đầu cao sẽ làm tăng hoạt tính của enzyme glucoamylase và glucose nhanh chóng được tạo ra, nếu nồng độ glucose cao đến 120g/l thì quá trình tạo sắc tố sẽ bị ức chế. Từ đây quá trình lên men rượu từ đường sẽ xảy ra. Năm 1991, khi nuôi cấy trên môi trường gạo hấp, Johns và Stuart (1993) nhận thấy rằng lượng độ ẩm ban đầu tốt nhất cho quá trình tạo sắc tố là 56%. Theo báo cáo của Aporn Wongwicharn tại hội nghị Kỹ Thuật Sinh học lần thứ 13 ở Thái Lan (2000) cho rằng khi nuôi cấy Monascus trên môi trường bã khoai mì thì độ ẩm ban đầu tốt nhất cho quá trình tạo sắc tố là 60%. Một nghiên cứu mới nhất của Vũ Thanh Thảo và cộng sự (2012) cũng cho rằng nhiệt độ thích hợp nhất là 65% [4]. c. Nhu cầu Oxy [13]. 16
Năm 1992, Han và Mudgett nhận thấy rằng mức cân bằng của khí oxy (O2) và khí carbonic (CO2) trong không khí có ý nghĩa rất lớn đến sự tạo thành sắc tố và cũng ít nhiều ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nấm khi lên men bán rắn. Giống Monascus không thể sống trong điều kiện kỵ khí khi sử dụng glucose như cơ chất, tuy nhiên có thể sống trong điều kiện O2 thấp. Trong điều kiện thiếu O2, có sự tạo thành nhiều ethanol, khí CO2 và hàm lượng sắc tố tạo ra ít hơn. Với Monascus purpureus nuôi trên gạo thì sắc tố thu được cao nhất khi áp suất riêng của O2 là 0,5atm. Tuy nhiên, áp suất riêng của CO2 cao sẽ ức chế quá trình tạo sắc tố và sẽ ức chế hoàn toàn tại 1atm. Trong hệ thống bình lên men kín, nuôi cấy hiếu khí thì áp suất riêng của CO2 là 0,02atm, còn áp suất riêng của O2 phải nằm trong khoảng 0,05 – 0,5atm. Như vậy, khi áp suất riêng của O2 là 0,5atm là áp suất riêng của CO2 là 0,02 atm thì sắc tố tạo ra là cao nhất. Lượng O2 được hấp thu cao nhất từ 70-90 giờ lên men, ngược lại còn lượng CO2 được thải ra cao nhất từ 60-80 giờ. Tùy thuộc vào môi trường không khí, giới hạn hệ số hô hấp là 1, ngoại trừ áp suất của O2 là 0,05atm và áp suất của CO2 là 0,02atm. d. Độ pH ban đầu [13], [30]. Monascus sinh trưởng ở pH từ 2,5-8 và thích hợp từ 4-7 (Yongsmith, 1993). Trong khoảng pH này ít có sự biến đổi trong sinh trưởng nhưng Monascus phát triển tốt hơn ở pH 4 so với các pH khác (Lin, 1991; Chen, 1993). Dẫu rằng sự sinh trưởng tốt hơn ở pH 4, nhưng lượng sinh khối tạo ra nhiều hơn ở pH 6,5 (Chen, 1993). Theo Lin (1992), thì sự tạo thành sinh khối tế bào cao nhất đạt được với pH 6 nhưng các sắc tố sẽ tích lũy trong sợi nấm, khó hòa tan vào môi trường. Sự hình thành sắc tố bị ảnh hưởng theo nhiều giá trị khác nhau, tại pH thấp sắc tố vàng chiếm ưu thế và pH cao hơn sắc tố đỏ chiếm ưu thế. Tại pH 2,5 tạo ra phần lớn là màu đỏ sáng (Yongsmith, 1993), tại pH 4 có sự kích thích tổng hợp ankaflavin (sắc tố vàng) và tổng lượng sắc tố hình thành tăng dần khi gia tăng pH đến 5,5. Vượt quá giá trị này, sắc tố tạo ra sẽ giảm (Lin, 1991). Trái lại với các ý kiến trên, báo cáo tại Aporn Wongwicharn (Hội nghị Kỹ thuật Sinh học lần thứ 13 của Thái Lan) ghi nhận rằng môi trường lên men bán rắn sử dụng bã khoai mì là cơ chất thì độ pH thích hợp cho sự hình thành sắc tố là 6. Ở tại giá trị pH 7, sắc tố vàng không còn hình thành (Yongsmith, 1993). 17
e. Thành phần môi trường: Theo Wong và cộng sự (1981), thì tỷ lệ C/N rất quan trọng, để phát triển thì tỷ lệ C/N là 50g/g, còn để tạo sắc tố thì tỷ lệ C/N là 7-9g/g. Theo Aporn Wongwicharn (Hội nghị Kỹ Thuật Sinh Học lần thứ 13 ở Thái Lan) thì tỷ lệ C/N cho lượng sắc tố cao nhất khi sử dụng bã khoai mì làm cơ chất chính là 150 – 200g/l còn Kayuma Mutuwong, Sivawan Phoolphundh, Aporn Wongwicharn kết luận rằng tỷ lệ C/N thích hợp là 150 – 300g/l. Nguồn carbon [13]. Vài hydrat carbon đã được dùng như nguồn carbon và năng lượng cho sự hình thành sắc tố ở Monascus, nồng độ Carbon được sử dụng trong môi trường lên men bán rắn là 0,1- 4,0%, hydrat carbon này có thể là tinh bột, disaccharide như lactose hoặc sucrose, monosaccharide như glucose hoặc fructose. Năm 1982, Lin và Lizuka đã nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường khác nhau đến lượng sắc tố tạo thành (bảng 1.2). Kết quả cho thấy môi trường sử dụng bột mì đã lên men nấm men cho sắc tố nhiều nhất. Bảng 1.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sản lượng sắc tố. Lượng sắc tố Môi trường ngũ cốc 400 nm 500 nm Gạo trắng 1500 1700 Gạo lức 1570 1850 Bánh mì 3500 4000 Cám 2300 2900 Bắp 2300 2700 Mantou() 5100 5430 Lúa mì 3100 3600 Nguồn: Lin và Lizuka (1982) - Ghi chú: Mantou: bột mì đã lên men nấm men Khi nuôi trên môi trường bán rắn là gạo, Rosenblit và cộng sự (2000), thấy rằng vào giai đoạn cuối của 240 giờ lên men cân bằng carbon như sau: 23% carbon chuyển thành sinh khối, 35% thành CO2, 15% thành ethanol, 1% thành acid acetic và 17% giữ lại chưa 18