Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sự tăng trưởng in Vitro của cây mầm lúa Oryza Sativa L. trong điều kiện Stress nước

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Lương

"SỰ TĂNG TRƯỞNG IN VITRO CỦA CÂY MẦM LÚA ORYZA SATIVA L. TRONG ĐIỀU KIỆN STRESS NƯỚC"

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC \

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Lương

"SỰ TĂNG TRƯỞNG IN VITRO CỦA CÂY MẦM LÚA ORYZA SATIVA L. TRONG ĐIỀU KIỆN STRESS NƯỚC"

Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số:

604230

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC \

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. BÙI TRANG VIỆT

TS. LÊ THỊ TRUNG

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn, em xin tỏ lòng chân thành biết ơn sâu sắc tới:

Thầy PGS. TS. Bùi Trang Việt đã hết lòng hướng dẫn, giảng dạy và đóng

góp ý kiến cho em trong quá trình thực hiện đề tài.

Cô TS. Lê Thị Trung đã giảng dạy, hướng dẫn tận tình trong lí thuyết cũng

như trong thực hành. Đặc biệt cô luôn luôn động viên khích lệ em khi gặp khó khăn

trong công việc cũng như trong cuộc sống.

Cô TS. Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS. Nguyễn Thị Mong, thầy TS. Phạm

Văn Ngọt, thầy PGS. TS. Bùi Văn Lệ, thầy TS. Đỗ Minh Sĩ, cô TS. Trần Thanh

Hương đã giảng dạy cho em những kiến thức bổ ích.

Cô ThS. Trịnh Thị Cẩm Tú, cô Hồ Thị Mỹ Linh cùng quý thầy cô trong tập

thể khoa Sinh trường ĐHSP TP. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và tạo điều

kiện tốt cho em trong phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật để em hoàn thành được đề

tài.

Quý thầy cô, cán bộ, nhân viên phòng SĐH trường ĐHSP TP. Hồ Chí Minh

đã tạo môi trường học tập tốt để tôi hoàn thành khóa học này.

Các anh chị lớp sinh học thực nghiệm khóa 20, 21, 22 trường ĐHSP TP. Hồ

Chí Minh, cùng các em sinh viên ở bộ môn sinh lí thực vật.

BGH, quý thầy cô trong tổ Hóa –Sinh trường THPT Nguyễn Đình Chiểu tỉnh

Bình Dương đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi có thời gian hoàn thành khóa học

này.

Con xin chân thành cảm ơn bố mẹ và gia đình đã luôn động viên chia sẻ với

con trong quá trình học tập, cũng như những vui buồn trong cuộc sống.

Cuối cùng em xin được gửi lời tri ân đến thầy cô giáo đã dạy dỗ em từ những

ngày đầu cắp sách tới trường cho đến khi hoàn tất chương trình cao học này.

ii

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn ................................................................................................................... i

Mục lục ........................................................................................................................ ii

Các chữ viết tắt ............................................................................................................ v

Danh mục ảnh ............................................................................................................ vi

Danh mục hình ........................................................................................................ viii

Danh mục bảng .......................................................................................................... ix

Lời mở đầu .................................................................................................................. 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3

1.1. Khái quát về cây lúa (Oryza sativa L.) ............................................................. 3

1.1.1. Phân loại ......................................................................................... 3

1.1.2. Nguồn gốc xuất phát cây lúa trồng ................................................... 3

1.1.3. Đặc điểm hình thái và sự sinh trưởng của cây lúa ............................ 4

1.1.4. Đặc điểm sinh lí cây lúa .................................................................. 5

1.1.5. Giá trị kinh tế của lúa ...................................................................... 7

1.1.6. Mối quan hệ giữa stress nước với năng suất cây lúa ......................... 8

1.1.7. Tình hình sản xuất lúa gạo ............................................................... 9

1.2. Sự tăng trưởng in vitro của cây mầm lúa trong điều kiện stress ................... 10

1.2.1. Khái niệm nhân giống in vitro ....................................................... 10

1.2.2 Sự tăng trưởng in vitro của cây mầm lúa ......................................... 10

1.2.3. Ảnh hưởng của stress nước tới sự tăng trưởng in vitro của cây

mầm lúa ........................................................................................ 11

1.2.4. Sự đáp ứng của cây mầm lúa trong điều kiện stress nước ............... 13

1.2.5. Điều hòa sự sinh trưởng của cây mầm trong điều kiện stress nước ...... 16

1.2.6. Vai trò của saccharose và mannitol trong nuôi cấy in vitro cây

mầm lúa ........................................................................................ 21

iii

Chương 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP .......................................................... 22

2.1. Vật liệu ............................................................................................................ 22

2.2. Phương pháp ................................................................................................... 22

2.2.1. Xác định thời điểm bão hòa nước của hạt lúa ................................. 22

2.2.3. Khảo sát sự tăng trưởng cây mầm lúa in vitro ................................ 24

2.2.4. Khảo sát sự tăng trưởng của cây mầm lúa trong môi trường

MS1/2 với các nồng độ đường khác nhau ...................................... 25

2.2.4.1. Với nồng độ saccharose khác nhau .................................................. 25

2.2.4.2. Với nồng độ mannitol khác nhau .................................................... 25

2.2.4.3. Với nồng độ đường saccharose và mannitol khác nhau................... 26

2.2.5. Theo dõi sự tăng trưởng rễ nhánh cây mầm lúa trên môi trường

MS1/2 bổ sung saccharose riêng rẽ hoặc kết hợp ........................... 26

2.2.6. Xác định thời gian bị stress của cây mầm lúa ................................. 26

2.2.7. Xác định trọng lượng tươi, trọng lượng khô của cây mầm lúa trên

các môi trường cảm ứng mannitol 3% kết hợp thời gian bị stress

khác nhau ...................................................................................... 27

2.2.8. Xác định cường độ hô hấp của cây mầm lúa trên môi trường

MS1/2 và MS1/2 bổ sung mannitol 3% ở các thời gian bị stress

khác nhau ...................................................................................... 27

2.2.9. Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội

sinh của cây mầm lúa .................................................................... 28

2.2.10. Đưa cây in vitro từ hai môi trường MS1/2 và MS1/2 có bổ sung

mannitol 3% đã cảm ứng 48 giờ ra vườn ươm ................................ 32

2.2.12. Xử lý thống kê kết quả thu được .................................................. 33

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 34

3.1. Kết quả ............................................................................................................ 34

3.1.1. Thời điểm bão hòa nước của hạt lúa .............................................. 34

3.1.2. Sự tăng trưởng cây mầm lúa in vitro ............................................. 38

iv

3.1.3. Sự tăng trưởng của cây mầm lúa trong môi trường MS1/2 với các

nồng độ đường khác nhau .............................................................. 43

3.1.3.1. Với nồng độ saccharose khác nhau .................................................. 43

3.1.3.2 Với nồng độ mannitol khác nhau ...................................................... 46

3.1.3.3. Với nồng độ mannitol và saccharose khác nhau .............................. 52

3.1.4. Sự tăng trưởng rễ nhánh cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 bổ

sung saccharose riêng rẽ hoặc kết hợp ........................................... 55

3.1.5. Thời gian bị stress của cây mầm lúa .............................................. 55

3.1.6. Trọng lượng tươi, trọng lượng khô của cây mầm lúa sau 3 ngày

nuôi cấy trên các môi trường cảm ứng mannitol 3% với thời gian

khác nhau ...................................................................................... 57

3.1.7. Cường độ hô hấp của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 và

MS1/2 bổ sung mannitol 3% với các thời gian khác nhau............... 58

3.1.8. Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh của cây

mầm lúa ........................................................................................ 60

3.1.9. Đưa cây in vitro từ hai môi trường MS1/2 và MS1/2 có bổ sung

mannitol 3% trong 48 giờ ra vườn ươm ......................................... 61

3.2. Thảo luận ........................................................................................................ 66

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 72

4.1. Kết luận ........................................................................................................... 72

4.2. Đề nghị ............................................................................................................ 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 73

v

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AAB : Acid Abscisic

AIA : Acid indol acetic

ATP : Adenosine diphosphate

ĐC : Đối chứng

FAA Formadehid acol acid :

GA : Gibberellin

: Gibberellic acid GA3

Man : Mannitol

NADP : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

Sac Saccharose :

TLT : Trọng lượng tươi

vi

DANH MỤC ẢNH

Ảnh 2.1. Hạt lúa Nàng Thơm Chợ Đào .................................................................. 22

Ảnh 3.1. Hạt lúa trước khi ngâm nước ................................................................... 35

Ảnh 3.2. Cấu trúc phôi lúa cắt dọc trước khi ngâm nước....................................... 36

Ảnh 3.3. Hạt lúa sau 5 giờ, khi hạt bão hòa nước ngoài tự nhiên .......................... 36

Ảnh 3.4. Hạt lúa sau 5 giờ, khi hạt bão hòa nước trong môi trường MS1/2 .......... 37

Ảnh 3.5. Cấu trúc phôi lúa cắt dọc lúc bão hòa nước (sau 5 giờ ngoài tự nhiên) .. 37

Ảnh 3.6. Sự kéo dài của sơ khởi rễ sau khi bão hòa nước sau 5 giờ trong môi

trường MS1/2 ........................................................................................ 38

Ảnh 3.7. Hạt lúa in vitro sau 1 ngày nuôi cấy trên các môi trường........................ 40

Ảnh 3.8. Phôi lúa in vitro sau 1 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2 ................ 40

Ảnh 3.9. Cây lúa in vitro sau 3 ngày nuôi cấy trên các môi trường ....................... 41

Ảnh 3.10. Cây lúa in vitro sau 5 ngày nuôi cấy trên các môi trường ....................... 41

Ảnh 3.11. Cây lúa in vitro sau 7 ngày nuôi cấy trên các môi trường ...................... 42

Ảnh 3.12. Mô phân sinh chồi lúa in vitro 1 ngày nuôi cấy trên môi trường

MS1/2 .................................................................................................... 42

Ảnh 3.13. Cây mầm lúa in vitro sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2 có

hoặc không có bổ sung saccharose ........................................................ 44

Ảnh 3.14. Cây mầm lúa in vitro sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2 có

bổ sung saccharose với nồng độ khác nhau ........................................... 45

Ảnh 3.15. Cây mầm lúa in vitro sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2 có

hoặc không có bổ sung saccharose ........................................................ 45

Ảnh 3.16. Cây mầm lúa in vitro 3 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2 .............. 48

Ảnh 3.17. Cây mầm lúa in vitro sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2 ........ 48

Ảnh 3.18. Cây mầm lúa in vitro sau 5 ngày trên môi trường MS1/2 có bổ sung

mannitol có nồng độ tăng dần ............................................................... 49

Ảnh 3.19. Cấu trúc cắt dọc chồi cây mầm lúa in vitro trong môi trường MS1/2

sau 5 ngày nuôi cấy ............................................................................... 50

vii

Ảnh 3.20. Sơ khởi rễ nhánh kéo dài của cây mầm lúa in vitro trong môi trường

MS1/2 sau 5 ngày nuôi cấy ................................................................... 50

Ảnh 3.21. Cấu trúc cắt dọc chồi cây mầm lúa in vitro trong môi trường MS1/2

có bổ sung mannitol 3% sau 5 ngày nuôi cấy ....................................... 51

Ảnh 3.22. Cấu trúc cắt dọc chồi của cây mầm lúa in vitro trong môi trường

MS1/2 có bổ sung mannitol 3% sau 5 ngày nuôi cấy ........................... 51

Ảnh 3.23. Cây mầm lúa in vitro sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2 bổ

sung saccharose và mannitol kết hợp với nồng độ khác nhau .............. 54

Ảnh 3.24. Cây lúa in vitro được chuyển ra môi trường đất ướt sau 7 ngày ............. 63

Ảnh 3.25. Cây lúa in vitro được chuyển ra môi trường đất khô sau 7 ngày ............ 63

Ảnh 3.26. Cây lúa in vitro được chuyển ra môi trường đất ướt sau 7 ngày ............. 64

Ảnh 3.27. Cây mầm lúa in vitro được chuyển ra môi trường đất khô sau 7 ngày ... 64

Ảnh 3.28. Rễ cây lúa trồng ngoài tự nhiên trên môi trường đất khô sau 7 ngày...... 65

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Sơ đồ ly trích và xác định hoạt tính tương đương của hormon thực

vật (theo Bùi Trang Việt, 1992; Nguyễn Du Sanh và cs, 2011) ........... 31

Hình 3.1. Thời điểm bão hòa nước của hạt lúa ..................................................... 35

Hình 3.2. Cường độ hô hấp ở trên hai trường MS1/2 và MS1/2 bổ sung

mannitol 3% với các thời gian khác nhau ............................................. 59

ix

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Thời điểm bão hòa nước của hạt lúa ..................................................... 34

Bảng 3.2. Sự tăng trưởng chiều dài rễ của cây mầm lúa theo thời gian trên

các môi trường MS khác nhau ............................................................... 39

Bảng 3.3. Sự tăng trưởng chiều dài chồi của cây mầm lúa theo thời gian

trên các môi trường MS khác nhau ....................................................... 39

Bảng 3.4. Chiều dài rễ của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có nồng

độ saccharose thay đổi ........................................................................... 43

Bảng 3.5. Chiều dài chồi của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có

nồng độ saccharose thay đổi .................................................................. 44

Bảng 3.6. Chiều dài rễ của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có bổ

sung nồng độ mannitol với các nồng độ khác nhau .............................. 47

Bảng 3.7. Chiều dài chồi của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có bổ

sung nồng độ mannitol khác nhau ......................................................... 47

Bảng 3.8. Chiều dài rễ của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có sự kết

hợp saccharose và mannitol với nồng độ khác nhau ............................. 53

Bảng 3.9. Chiều dài chồi của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có sự

kết hợp saccharose và mannitol với nồng độ khác nhau ....................... 53

Bảng 3.10. Số rễ nhánh và kích thước rễ nhánh của cây mầm lúa trên các

môi trường có hoặc không có bổ sung mannitol và sacharose

với nồng độ khác nhau........................................................................... 55

Bảng 3.11. Thời gian bị stress của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 bổ

sung mannitol 3% .................................................................................. 56

Bảng 3.12. Trọng lượng tươi của cây mầm lúa sau 3 ngày nuôi cấy trên các

môi trường cảm ứng mannitol 3% với các thời gian khác nhau ........... 58

Bảng 3.13. Trọng lượng khô của cây mầm lúa sau 3 ngày nuôi cấy trên các

môi trường cảm ứng mannitol 3% với thời gian khác nhau .................. 58

x

Bảng 3.14. Cường độ hô hấp của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 và

MS1/2 bổ sung mannitol 3% với các thời gian khác nhau .................... 59

Bảng 3.15. Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh của

cây mầm lúa trong môi trường MS1/2 không hoặc có bổ sung

mannitol ở các thời gian khác nhau ....................................................... 61

Bảng 3.16. Sự phát triển của cây mầm in vitro từ hai môi trường MS1/2 và

MS1/2 có bổ sung mannitol 3% trong 48 giờ ngoài vườn ươm ........... 62

1

LỜI MỞ ĐẦU

Lúa gạo là nguồn cung cấp lương thực chính cho hơn 1/3 dân số thế giới và

là cây lương thực số một ở Việt Nam. Với diện tích gieo trồng hàng năm khoảng

7,4 triệu ha, tập trung chủ yếu ở hai vùng đồng bằng Sông Cửu Long (3,8 triệu ha)

và đồng bằng Sông Hồng (1,2 triệu ha) (Lã Tuấn Nghĩa, 2001).

Theo thống kê, khuyến cáo của Liên Hợp Quốc (LHQ), đến năm 2030, dân

số thế giới sẽ tăng lên 8,1 tỉ người và nhu cầu lương thực sẽ tăng 55% so với năm

1998. Cùng với dân số tăng lên, các quốc gia và lãnh thổ sẽ cần thêm nước để phục

vụ cho nhu cầu sinh hoạt, sản xuất nông nghiệp, hoạt động năng lượng và cung cấp

cho các đô thị ngày càng tăng. Hiện có khoảng 70% lượng nước ngọt đang được

khai thác, sử dụng để tưới cây trong nông nghiệp, chiếm một phần lớn tổng lượng

nước khiến cho việc cung cấp nước mặt và nước ngầm ngày càng trở nên căng

thẳng. Vì vậy một trong những vấn đề lớn đặt ra là cần phải tìm cách sản xuất nhiều

lương thực hơn, nhưng đồng thời sử dụng ít nước hơn (Lê Sâm, Nguyễn Đình

Vượng, 2009).

Bên cạnh đó, hiện nay sự mất cân bằng giữa vùng cao và đồng bằng, môi

trường suy thoái đang là mối đe dọa của ngành sản xuất lúa gạo và nền kinh tế của

thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. An ninh lương thực cho người dân vùng

sâu, vùng xa, miền núi vẫn là thách thức lớn. Do đó chính phủ Việt Nam ưu tiên

chương trình xóa đói, giảm nghèo nhằm đạt được các mục tiêu chiến lược Quốc gia

về công bằng xã hội, phát triển bền vững và bình ổn (Lê Quốc Doanh, 2011).

Do tình trạng ấm toàn cầu hiện nay, nên hiệu ứng của nhiệt độ, nồng độ

carbon dioxide và nhu cầu nước cho sự tăng trưởng cây lúa được đặc biệt chú ý, bao

gồm việc thiết lập và cải tiến các mô hình tăng trưởng cho cây lúa liên quan tới sự

thay đổi của các yếu tố này. Thí dụ, để đạt năng suất cao của lúa trong tương lai,

cần có các mô hình về ảnh hưởng của nhiệt độ đêm lẫn ngày đối với hô hấp, nồng

độ carbon dioxide đối với sự mở khí khẩu và quang hợp, hay stress nước do tác

động bởi các quá trình tự nhiên và con người (Cho and Oki, 2012).

2

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về lúa như nâng cao năng suất, chất

lượng, khả năng chống chịu..., sự tăng dần hàm lượng Proline khi cây lúa bị thiếu

nước, hay xác định gen ESTs liên quan đến việc kháng lại hiện tượng thiếu nước ở

vùng cao (Wang et al, 2007). Vấn đề này cũng đã được thảo luận rất kĩ trong hội

nghị Quốc tế về vấn đề “Salt & Water Stress in Plants” diễn ra vào tháng 6/2012 tại

Trung Quốc.

Với suy nghĩ trên, chúng tôi đã chọn đề tài "Sự tăng trưởng in vitro của

cây mầm lúa Oryza sativa L. trong điều kiện stress nước" nhằm tìm hiểu sự thay

đổi tăng trưởng của cây mầm lúa khi bị stress nước, từ đó, mong muốn tìm ra biện

pháp giúp cây lúa có khả năng thích nghi tốt hơn trong điều kiện khô hạn.

3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát về cây lúa (Oryza sativa L.)

1.1.1. Phân loại

Giới : Plantae

Ngành : Angyospermae

Lớp : Monocotyledones

Bộ : Poales

Họ : Poaceae

Chi : Oryza

Loài : Oryza sativa L.

Loài phụ: indica (loài phụ Ấn Độ), japonica (loài phụ Nhật Bản) và javanica

(Java – tên của một đảo ở Indonesia) (Nguyễn Văn Luật, 2009).

1.1.2. Nguồn gốc xuất phát cây lúa trồng

Chi Oryza Kuth, tổ tiên đã tồn tại từ kỉ phấn trắng, bao gồm các loại lúa dại

và lúa trồng. Vào giữa kỉ này xuất hiện một trong những loại nguyên thủy nhất

thuộc chi Oryza, đó là loại Stretochasta Shrad. Đến cuối kỷ phấn trắng xuất hiện tre

(Bambusa) và loại lúa (Oryza). Một số loại khác xuất hiện muộn hơn vào kỷ thứ ba,

thời kì phát triển mạnh của họ Hòa thảo (Gramineae) (Nguyễn Văn Luật, 2009).

Chi Oryza bao gồm khoảng 20 loài hoang dã, hai loại lúa trồng chính là

Oryza sativa L. có nguồn gốc châu Á, và Oryza glaberrima có nguồn gốc châu Phi

thuộc loài nhị bội 2n = 24 có bộ gen là AA (Khush, 1997). Cây lúa trồng Oryza

sativa được thuần hóa ở châu Á, nên được gọi là lúa trồng châu Á. Cây lúa trồng

Oryza glaberrima được thuần hóa ở châu Phi nên gọi là lúa trồng châu Phi (Nguyễn

Văn Luật, 2009).

Chi Oryza có nguồn gốc trong lục địa Gondwanaland và sau quá trình phân

chia của lục địa, thì nó trở nên phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới ẩm ướt của châu

Phi, Nam Mỹ, Nam và Đông Nam Á, và Châu Đại Dương. Hai loài canh tác đã có

một tổ tiên chung trong quá khứ xa xôi, song song và độc lập trong quá trình tiến

4

hóa xảy ra ở châu Phi và châu Á. Các loài lúa dại cũng góp phần vào sự khác biệt

của lúa trồng hàng năm. Lúa trồng Oryza sativa châu Á được tiến hóa từ cây lúa dại

hàng năm Oryza nivara (Chang, 1976).

Theo Khush (1997), có 2 loài lúa trồng và 21 loài hoang dã của loài Oryza.

Trong đó loài lúa châu Á được trồng trên toàn thế giới. Ở châu Phi Oryza

glaberrima được trồng với quy mô nhỏ ở Tây Phi. Oryza có thể có nguồn gốc

khoảng 130 triệu năm trước đây trong Gondwanaland và các loài khác nhau đã phân

phối vào châu lục khác nhau. Các loài trồng có nguồn gốc từ một tổ tiên chung với

bộ gen AA. Tổ tiên lâu năm và hàng năm của Oryza sativa là Oryza rufipogon và

Oryza nivara và Oryza glaberrima Oryza longistaminata của Oryza breviligulata

và Oryza glaberrima có thể thuần hóa ở đồng bằng sông Niger. Oryza sativa được

phân thành sáu nhóm trên cơ sở di truyền. Biết đến rộng rãi là Oryza indica tương

ứng với nhóm I và Oryza japonicas nhóm VI. Người ta ước tính có khoảng 120.000

giống lúa tồn tại trong thế giới.

Ở Việt Nam nền văn minh lúa nước đã có từ hơn 4000 năm nay kể từ thời

vua Hùng, đã phát triển suốt chiều sâu của lịch sử và chiều dài của đất nước, từ cao

nguyên Đồng Văn gần biên giới Việt Trung đến bán đảo Cà Mau ở Nam Bộ

(Nguyễn Văn Luật, 2009).

1.1.3. Đặc điểm hình thái và sự sinh trưởng của cây lúa

Osyza sativa là cây sống hằng năm thẳng đứng, bò dài hay sống ngập được

trong nước, có bộ nhiễm sắc thể 2n = 24. Thân dài 0,6-1,5 m, gồm những đoạn gọi

là lóng, hình trụ rỗng. Hai lóng dính nhau tại mắt. Các lóng ở dưới thân thì ngắn,

lóng ở trên thì dài ra (Phạm Hoàng Hộ, 2003).

Cây lúa có kích thước thay đổi từ những cây đột biến thấp chỉ 0,3 đến những

cây lúa nổi cao hơn 7 m. Phần lớn các giống lúa thương mại cao từ 1-2 m. Giống

lúa cổ truyền có lá dài và rũ, đẻ chồi thấp, thân cao (120 - 150 cm) và mảnh khảnh,

12 – 15 bông/ bụi, bông to (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1995).

Lá phẳng, hình dài, nhọn, đầu ráp trên cả bề mặt lẫn mép lá dài 30-60 cm, bẹ

lã nhẵn, mép ráp, hình mũi máp chẻ đôi. Cụm hoa là chùm thưa thẳng hẹp đầu hơi

5

cong xuống, dài 15-30 cm. Cuống chung lớn, có rãnh ráp. Bông chép hình bầu dục,

thuôn có râu hay không có. Mày thuôn hình mũi mác, nhọn, nguyên hay chia răng ở

đỉnh. Mày hoa khá dài, dai, màu hồng, vàng hay hơi tím có lông mu cứng, rất dài,

thẳng, nhị 6 cánh, bao phấn hình dải. Bầu có vòi nhụy ngắn, hai đầu nhụy có lông

thò ra ngoài bông chét. Quả thuôn, hẹp, bao trong mày hoa, nhiều bột (Võ Văn Chi,

2004 ).

Lúc trưởng thành, cây lúa có một thân chính và một số lượng chồi. Mỗi gốc

lúa được tạo thành từ một loạt các mắt và lóng. Các lóng khác nhau về chiều dài tùy

thuộc vào giống và điều kiện môi trường, nhưng nói chung tăng từ thấp đến phần

trên của thân cây. Mỗi mắt trên mang một chiếc lá và chồi. Số lượng các mắt thay

đổi 13-16 mắt. Theo sự gia tăng nhanh chóng trong mực nước biển, một số giống

lúa nước sâu cũng có thể làm tăng chiều dài lóng lên tới 30 cm. Phiến lá được gắn ở

nút bởi các bẹ lá, bao quanh gốc. Chồi phát triển từ thân cây chính được gọi là chồi

chính. Đây có thể tạo ra chồi thứ cấp, mà có thể lần lượt tạo ra các chồi bên. Có

nhiều yếu tố môi trường cũng ảnh hưởng đến giai đoạn đẻ nhánh bao gồm cả

khoảng cách, ánh sáng, dinh dưỡng và nước (Bogor, 2012).

Về hình thái có thể phân chia: giai đoạn mạ, giai đoạn đẻ nhánh, giai đoạn

làm đòng, giai đoạn làm hạt. Về kĩ thuật lại có thể thêm các giai đoạn nảy mầm, giai

đoạn đẻ nhánh hữu hiệu, giai đoạn tượng đòng, giai đoạn trổ, giai đoạn thụ phấn,

giai đoạn chín sữa, giai đoạn chín hoàn toàn (Nguyễn Văn Luật, 2009).

Theo đánh giá của viện khoa học kĩ thuật nông nghiệp Việt Nam thì có

khoảng 19% giống lúa muộn, 73% lúa lỡ, 6% lúa mùa sớm, nhóm lúa nổi khoảng

gần 3% ( Nguyễn Văn Hoan, 2009).

1.1.4. Đặc điểm sinh lí cây lúa

Cây lúa phát triển mạnh trong khoảng nhiệt độ từ 20 – 300C. Nhiệt độ trên 400C hoặc dưới 170C, cây lúa tăng trưởng chậm lại. Dưới 130C cây lúa ngừng sinh

trưởng, nếu kéo dài 1 tuần cây lúa có thể chết (Nguyễn Ngọc Đệ, 2009).

6

Lúa là cây có hình thức quang hợp theo chu trình C3, sản phẩm quang hợp tạo ra

đầu tiên là hợp chất có 3 nguyên tử cacbon. Quá trình hô hấp diễn ra cả trong bóng

tối và ngoài ánh sáng ( Isi và cs, 1977).

Cường độ quang hợp thuần của lá lúa thay đổi theo vị trí, hướng lá, tình

trạng dinh dưỡng, nước và giai đoạn sinh trưởng của cây, hàm lượng CO2 trong

không khí và cấu tạo quần thể ruộng lúa. Trong điều kiện ánh sáng bão hòa cường độ quang hợp thuần vào khoảng 40 – 50 mg CO2/ dm2/ giờ. Cây lúa bắt đầu quang

hợp được ngay khi cường độ ánh sáng ở 400 lux. Quang hợp gia tăng theo cường độ

ánh sáng và đạt mức cao nhất khi cường độ ánh sáng lên đến 40000 – 60000 lux

(Nguyễn Ngọc Đệ, 2009).

Oxi cần thiết cho sự nảy mầm và tăng trưởng của cây mầm. Trong thời gian

này nếu hàm lượng oxi cao sẽ tăng cường độ hô hấp. Ở cây lúa có thể nảy mầm

trong điều kiện không có oxi, tuy nhiên cây mầm yếu và phát triển không bình

thường. Khi CO2 cao hơn 0,03% làm chậm sự nảy mầm nhưng lại tốt cho quang

hợp của cây mầm (Nguyễn Như Khanh, 2002).

Nhiệt độ ban ngày ấm, ban đêm lạnh hạn chế tiêu hao năng lượng do hô hấp,

cây lúa phát triển thuận lợi, tích lũy nhiều chất khô nuôi cây và tích lũy nhiều vật

chất trong hạt, năng suất gia tăng. Gió nhẹ tạo điều kiện khuyếch tán các chất khí

trong ruộng lúa, giúp quá trình quang hợp, hô hấp thuận lợi hơn (Nguyễn Ngọc Đệ,

2009).

Người ta phân biệt hai loại hô hấp: hô hấp sinh trưởng và hô hấp duy trì. Mac

Cri (1970) đã đề nghị công thức sau:

R = k * Pg + c * W

(Hô hấp sinh trưởng) (Hô hấp duy trì)

Trong đó:

R = Hô hấp tổng cộng của toàn cây trong 24 giờ.

K = Hệ số hô hấp sinh trưởng (# 0,25).

Pg = Quang hợp tổng số trong 12 giờ (ban ngày).

C = Hệ số hô hấp duy trì (# 0,015).

W = Trọng lượng khô toàn cây (Nguyễn Ngọc Đệ, 2009).

7

Khi cây lúa còn non, sinh trưởng mạnh thì hô hấp sinh trưởng là chủ yếu,

trong khi cây lúa càng già thì hô hấp duy trì lại càng chiếm ưu thế. Để tổng hợp ra

1g hạt lúa cần 1,20 (g) chất hữu cơ. Tổng chi phí hô hấp duy trì ước tính khoảng 15

– 25 mg glucose/ g chất khô/ ngày đối với cây lúa. Ngoài hô hấp tối, ở cây lúa còn

có thể xảy ra hiện tượng hô hấp ánh sáng khi cường độ ánh sáng và nhiệt độ môi

trường quá cao. Đây là một hạn chế và có ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của cây

lúa (Nguyễn Ngọc Đệ, 2009).

Để phát triển, cây lúa cần nhiều loại dưỡng chất. Ba loại dưỡng chất chính

cây lúa cần dùng nhiều là đạm, lân, kali. Đạm là chất tạo hình cây lúa, là thành phần

chủ yếu của protein và chất diệp lục làm cho lá xanh tốt, gia tăng chiều cao cây, số

chồi và kích thước lá. Ở giai đoạn sinh trưởng ban đầu, đạm được tích luỹ chủ yếu

trong thân lá. Lân là chất sinh năng, là thành phần của ATP, NADP... thúc đẩy việc

sử dụng và tổng hợp các chất trong cây. Từ lúc hạt lúa nảy mầm cho đến khi hình

thành lá thứ ba, lân được sử dụng chủ yếu là loại lân dự trữ trong hạt giống. Kali

giúp cho quá trình vận chuyển và tổng hợp cho các chất trong cây, duy trì sức

trương của tế bào, giúp cây cứng cáp, tăng khả năng chống sâu bệnh, chống ngã đổ,

chịu hạn, tăng số hạt chắc trên bông (Nguyễn Văn Luật, 2009).

1.1.5. Giá trị kinh tế của lúa

Lúa, gạo là thành phần quan trọng trong bữa ăn của nhân dân ta, bồi bổ trong

cơ thể và đem lại sự cân bằng cho cơ thể. Hạt thóc đã ngâm cho nảy mầm rồi phơi

khô gọi là cốc nha dùng thay cho mạch nha, giúp cho sự tiêu hóa tốt hơn và là thức

ăn có tinh bột có tác dụng rất tốt cho những người ăn uống kém tiêu, không muốn

ăn, ngoài ra còn chữa các bệnh phụ do thiếu vitamin (Võ Văn Chi, 2004 ).

Gạo là một nguồn lớn chứa carbohydrate phức tạp, chất xơ (gạo nâu), protein

và vitamin. Các lớp cám của gạo lức có chứa protein với các acid amin thiết yếu,

ngoài canxi, phốt pho, kali, chất xơ, vitamin B, vitamin E và dầu tự nhiên. Dầu gạo

chứa ba loại khác nhau chứa chất chống oxy hóa tocopherols và tocotrienols

(tocochromanols) và oryzanols (feruloylsteroltype).

8

Gạo lâu năm dùng trị đau bụng và trị lỵ. Gạo nếp dùng trị các chứng đau

bụng, nôn mửa và tiểu tiện ra chất nhờn (dưỡng trấp). Ở Campuchia, Philippin, nó

được dùng để điều chế thuốc phòng và chữa bệnh thiếu vitamin B. Dầu Cám dùng

trộn với rau để ăn. Rễ và thân rễ của lúa làm thuốc lợi tiểu. Quả thóc chưa bóc vỏ

dùng làm thuốc đắp cho dịu vết thương (Võ Văn Chi, 2004).

Sản phẩm gạo ngoài công dụng nấu cơm còn được dùng để nấu rượu( rượu

Xa kê của Nhật Bản, rượu lúa mới của Việt Nam) và để chế biến tinh bột. Gạo, bột

gạo cùng với tấm, cám, rơm, rạ còn dùng làm thức ăn chăn nuôi, làm nguyên liệu

cho các nghành công nghiệp chế biến (Nguyễn Ngọc Đệ, 2009)..

Trung bình xay một tấn lúa cho ra khoảng 70 – 100 kg tấm và khoảng 50 –

70 kg cám. Phần lớn nông dân dùng tấm để nuôi gia súc hay xay ra để làm bánh,

bún, rượu. Ngoài ra hiện nay người ta dùng tấm để nấu cơm tấm với giá trị cao.

Cám được dùng để chăn nuôi và sản xuất dầu cám. Một số dầu cám cao cấp còn

được dùng để chế tạo các mỹ phẩm. Trấu của lúa cũng có thể được dùng để sản xuất

điện vì người ta ức tính trong 1 kg trấu có ẩm độ 10% cho ra được 11 MJ so với 29

MJ từ 1 kg than bùn hay 36,3 MJ từ một lít dầu hôi (Nguyễn Văn Ngưu, 2007).

So với lúa mì, gạo có thành phần tinh bột và protein hơi thấp hơn, nhưng

năng lượng tạo ra thì cao hơn do chứa nhiều chất béo hơn. Giả sử một người trung

bình cần 3200 calo mỗi ngày thì một hecta lúa có thể nuôi 2055 người/ngày hay

5,63 người/năm (Nguyễn Ngọc Đệ, 2009).

Đối với người Việt Nam, lúa gạo không chỉ là lương thực mà còn là một

phần thiết yếu trong đời sống văn hóa, chính trị của xã hội, (Lê Quốc Doanh, 2011).

Xuất khẩu gạo của chúng ta đã đứng hàng thứ hai thế giới chỉ sau Thái Lan. Sản

lượng xuất khẩu gạo năm 2009 là 5,8 triệu tấn đạt kim ngạch 2,6 tỉ USD (Nguyễn

Văn Cường, 2011).

1.1.6. Mối quan hệ giữa stress nước với năng suất cây lúa

Một trong những vấn đề chính của trồng lúa là thiếu nguồn tài nguyên nước,

đặc biệt là trong suốt thời gian lượng mưa thấp ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng

thực vật ảnh hưởng đến số lượng và sản lượng (Mostajeran và Eichi, 2009). Nó là

9

yếu tố lớn nhất hạn chế cây trồng sản xuất và đang trở thành vấn đề ngày càng

nghiêm trọng ở nhiều khu vực trên thế giới. Theo thống kê, tỷ lệ phần trăm mà hạn

hán ảnh hưởng đến diện tích đất tăng hơn gấp đôi từ năm 1970 đến đầu những năm

2000 (Balch et al, 1996).

Thiếu nước là vấn đề căng thẳng lớn trên toàn thế giới đối với sản xuất cây

trồng, hạn chế năng suất của các loài cây trồng, đặc biệt là trong khu vực nông

nghiệp đất khô (hơn 1,2 tỷ ha) (Chaves et al, 2003). Hạn hán ảnh hưởng đến sự

phát triển của cây lúa ở các giai đoạn khác nhau, hàm lượng nước ảnh hưởng tương

đối và tiềm năng giữ nước ở lá của cây trồng. Khô hạn ở giai đoạn làm đòng và trổ

bông sẽ làm giảm đáng kể năng suất (Biswas và Choudhuri, 1984).

1.1.7. Tình hình sản xuất lúa gạo

Từ năm 2000 trở đi, diện tích trồng lúa trên thế giới có rất nhiều biến động

và có xu hướng giảm dần. Diện tích tập trung chủ yếu ở các nước châu Á. Việt Nam

đứng vào nhóm 20 nước có năng suất cao và vượt trội trong khu vực Đông Nam Á.

Các quốc gia đứng đầu về sản lượng lúa theo thứ tự là Trung Quốc, Ấn Độ,

Indonesia, Bangladesh, Việt Nam, Thái Lan và Myanmar. Trong đó Thái Lan, Việt

Nam là những nước xuất khẩu gạo đứng hàng đầu thế giới (Nguyễn Ngọc Đệ,

2009).

Việt Nam là nước có tiềm năng lớn về cây lúa. Sưu tập tại viện lúa đồng

bằng sông Cửu Long có hơn 1800 mẫu giống và hàng trăm quần thể lúa hoang

(Trần Thị Bích Trinh và cs, 2000). Năm 1982, Việt Nam đã chuyển từ nước phải

nhập khẩu hàng năm sang tự túc được lương thực và xuất khẩu hàng thứ hai thế

giới. Thị trường xuất khẩu gạo của Việt Nam là các quốc gia Đông Nam Á (khoảng

40 – 50%) và các nước châu Phi (khoảng 20 – 30%). Về giá cả, gạo Việt Nam dần

dần được nâng lên tương đương với giá gạo Thái Lan. Vào năm 2005, tổng diện tích

trồng lúa ở Việt Nam đạt 7,3 triệu ha với sản lượng 35,79 triệu tấn, năng suất trung

bình 4,89 tấn/ha. Riêng ở đồng bằng sông Cửu Long, năng suất bình quân cả năm

đã gia tăng từ 2,28 tấn /ha /vụ trong năm 1980 lên 4,8 tấn/ha/vụ năm 2004. Đồng

bằng sông Cửu Long chiếm 53,4% về diện tích trồng lúa và 50,5 về sản lượng lúa

10

gạo của cả nước. Hơn 80% sản lượng gạo xuất khẩu gạo hàng năm là từ đồng bằng

sông Cửu Long (Nguyễn Ngọc Đệ, 2009).

Thương mại gạo toàn cầu dự kiến sẽ tăng 2,9% mỗi năm từ 2012 đến 2021.

Năm 2021, gạo toàn cầu đạt 45 triệu tấn, tăng 42% so với kỷ lục năm 2007. Các yếu

tố chính cho sự tăng mạnh này là nhờ mở rộng thương mại toàn cầu, dân số tăng

nhanh. Thái Lan và Việt Nam là hai Quốc gia có lượng xuất khẩu gạo lớn nhất thế

giới, chiếm hơn 45% kim ngạch xuất khẩu thế giới và tăng trưởng hơn 50% của thế

giới trong thập kỷ tới. Xuất khẩu của Thái Lan tăng 4,1 triệu tấn, hơn 14 triệu vào

năm 2021. Diện tích trồng lúa và sản lượng dự kiến sẽ tăng ở Thái Lan. Việt Nam

tăng từ 6,5 đến 8,1 triệu tấn (USDA forecasts global rice production, 2012).

1.2. Sự tăng trưởng in vitro của cây mầm lúa trong điều kiện stress

1.2.1. Khái niệm nhân giống in vitro

Công nghệ tế bào hay nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ

mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa

môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Môi trường có các chất dinh dưỡng thích

hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường. Kỹ thuật nuôi

cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát triển cơ quan) từ các mô như:

thân, lá hoặc rễ (Dương Công Kiên, 2002).

1.2.2 Sự tăng trưởng in vitro của cây mầm lúa

Sự tăng trưởng là sự gia tăng không hoàn nghịch về kích thước (chiều dài,

chiều rộng, diện tích, thể tích) hay trọng lượng (tươi hay khô). Trong cơ thể đa bào

sự tăng trưởng xảy ra nhờ sự phân chia tế bào (sự gia tăng số tế bào) và sự gia tăng

kích thước tế bào (sự kéo dài tế bào) (Bùi Trang Việt, 2000).

Ở lúa, sự tăng trưởng bắt đầu từ khi hạt nảy mầm (rễ nhú ra 1 mm), đến khi

cây lúa bắt đầu phân hoá đòng. Sự nảy mầm của hạt lúa bắt đầu khi hạt nước hút no

nước, trương phồng lên, ẩm độ trong hạt gia tăng, tinh bột trong phôi nhũ bị phân

giải thành những chất đơn giản để cung cấp cho mầm phát triển. Thời gian hút nước

nhanh hay chậm tùy theo hạt giống cũ hay mới, vỏ trấu mỏng hay dày, nhiệt độ

11

nước ngâm cao hay thấp. Hàm lượng nước trong hạt thích hợp cho nảy mầm biến thiên từ 30 – 40% và nhiệt độ thích hợp là từ 27 – 370C (Nguyễn Ngọc Đệ, 2009).

Lúa là cây đơn tử diệp. Khi hạt nảy mầm thì rễ mầm xuất hiện trước, sau đó

đến thân mầm. Rễ mầm là rễ mọc ra đầu tiên khi hạt nảy mầm. Thường mỗi hạt lúa

chỉ có một rễ mầm. Rễ mầm không ăn sâu, ít phân nhánh, chỉ có lông ngắn, thường

dài khoảng 10 - 15 cm, có nhiệm vụ chủ yếu là hút nước cho phôi phát triển và sẽ

chết sau 10 - 15 ngày, lúc cây mạ được 3 - 4 lá. Rễ phụ mọc ra từ các đốt thân, có

nhiều nhánh và lông hút. Tại mỗi mắt có hai vòng rễ, vòng rễ trên to khoẻ, vòng rễ

dưới nhỏ hơn. Rễ lúa là rễ chùm. Thân mầm được bao bởi một lá bao mầm (diệp

tiêu), dài khoảng 1 cm (Nguyễn Ngọc Đệ, 2009).

Kế đó, lá đầu tiên xuất hiện, có cấu tạo như một lá bình thường nhưng chưa

có phiến lá. Lá đầu tiên xuất hiện có cấu tạo giống như một lá bình thường nhưng

chưa có phiến lá, gọi là lá thứ nhất hay lá không hoàn toàn. Sau đó, đến lá thứ hai

có phiến lá nhỏ dài khoảng 2 - 3 cm. Tiếp tục lá thứ ba, thứ tư…Người ta đếm số lá

trên thân để tính tuổi mạ. Cây mạ có bao nhiêu lá là có bấy nhiêu tuổi. Trong giai

đoạn đầu cây lúa ra lá nhanh, trung bình 3 - 4 ngày một lá. Từ lúc nảy mầm đến khi

mạ được 3 - 4 lá, cây mạ chỉ sử dụng chất dinh dưỡng dự trữ trong hạt (Nguyễn Văn

Hoan, 2009).

1.2.3. Ảnh hưởng của stress nước tới sự tăng trưởng in vitro của cây mầm lúa

Stress (sự căng thẳng) được dùng để chỉ các yếu tố ngoại sinh gây ảnh

hưởng bất lợi cho thực vật. Stress cũng được dùng để chỉ toàn bộ các phản ứng của

thực vật (sinh lý, biến dưỡng, tập tính) đối với một tác nhân gây stress. Dưới các

điều kiện thiên nhiên và trồng trọt, thực vật không ngừng chịu các stress. Các tác

nhân gây stress có thể là: thiếu nước, lạnh và đóng băng, nhiệt độ cao, nồng độ

muối cao, thiếu oxygen trong vùng rễ, hay sự ô nhiễm không khí (Bùi Trang Việt,

2002).

Stress ở cây trồng là khái niệm dùng để chỉ sự bắt đầu với hạn chế hoặc với

nồng độ cao của chất nào đó trong quá trình trao đổi chất gây ra thương tật, bệnh

tật, hoặc rối loạn sinh lý ở cây. Stress sẽ làm thay đổi trạng thái cân bằng ở trong

12

cây. Stress biểu hiện hai mặt, có hại cho cây trồng hoặc nếu như cây trồng vượt qua

được thì nó là nhân tố cho quá trình tiến hóa thích nghi (Gaspar et al, 2002).

Stress nước sẽ gây co nguyên sinh, điều này thường xảy ra trong phòng thí

nghiệm, khi mô được ngâm trong các dung dịch ưu trương, hàm lượng nước của tế

bào giảm, tế bào chất trở nên đậm đặc, thể tích nguyên sinh chất và sức trương của

tế bào giảm dần. Khi hiện tượng tiếp diễn, các cầu liên bào gãy, nguyên sinh chất

tách khỏi vách, khoảng trống giữa màng nguyên sinh chất và vách chứa đầy dung

dịch bên ngoài (Bùi Trang Việt, 2000).

Khi bị thiếu nước, các màng tế bào bị thay đổi, chẳng hạn như gia tăng sự

thâ m va o và giảm tính bền vững. Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy các tế bào bị

mất nước thì màng sẽ bị hư hại, và có sự lắng đọng trầm tích của tế bào chất. Việc ́ ̀

ngăn ngừa sự tích tụ, điều chỉnh quá trình thẩm thấu, như proline và tổng số đường

hòa tan là phương pháp hạn chế tác hại của stress nước (Pirzad et al, 2011).

Hiện nay và trong tương lai, cây lúa sẽ phải thường xuyên tiếp xúc với việc

thâm hụt nước và căng thẳng nhiệt, đặc biệt nhạy cảm nhất ở giai đoạn làm đòng, ra

hoa, ức chế quá trình sinh sản gây ra thiệt hại về năng suất, chất lượng. Điều này là

do áp lực về nước sẽ làm giảm số lượng chất diệp lục, protein, RNA và hoạt động

của catalase, trong khi nó làm tăng sự tích lũy proline và các hoạt động của

protease, RNase và peroxidase (Biswas và Choudhuri, 1984).

Sự thiếu nước làm giảm tốc độ quang hợp, nhưng không rõ bằng sự tăng

trưởng lá, vì quang hợp ít nhạy với sức tăng trưởng so với sự tăng trưởng lá, Stress

nước làm lớp cutin trên bề mặt lá dày lên, góp phần làm giảm sự thoát hơi nước qua

lớp biểu bì. Tuy nhiên sự giảm này không quan trọng vì sự thoát hơi nước qua cutin

chỉ khoảng 5-10% sự thoát hơi nước tổng cộng của lá (Bùi Trang Việt, 2002).

Thâm hụt nước trong cây giống nhạy cảm với áp lực về nước sẽ làm giảm

khả năng thấm của màng tế bào gốc và mất kiểm soát lỗ khí trên lá, giảm dòng chảy

của nước vào lá thông qua rễ, bởi vì khí khổng đóng chậm, mang lại một sự suy

giảm nhanh chóng tiềm năng nước, dẫn đến héo. Lúa (Oryza sativa L.) được xem là

một loài cây trồng nhạy cảm với hạn hán. Tuy nhiên, trong các loài này, có sự khác

13

biệt đáng kể về sự nhạy cảm với áp lực môi trường. Ảnh hưởng của căng thẳng về

nước đến sự tăng trưởng cây mầm đã được chứng tỏ khi dùng polyethylene glycol

(PEG) gây ức chế, áp đặt cho sự thâm hụt nước. Có sự thay đổi hàm lượng protein ở

gốc cây mầm khi có sự hiện diện của PEG 10% (Balch et al, 1996).

Stress nước thường cản trở nước trong mạch mộc. Sự cản này thường do các

lông rễ bị tổn thương và bị tách khỏi các hạt đất khô, hay sự tạo các bọt khí phá vỡ

tính liên tục của các cột nước dưới sức căng. Hiệu ứng cản đặc biệt rõ khi sự thiếu

nước gần điểm héo vĩnh viễn (khi thế nước khoảng -1,5 Mpa). Khi thu nước, áp suất

trương hay áp suất thấp thủy tĩnh dương phát triển trong tế bào. Điều này cần thiết

để làm tăng tính cứng rắn cơ học cho tế bào (nhất là tế bào đang tăng trưởng với

vách chứa hóa lignin), giúp vách kéo dài và tế bào tăng trưởng. Khi mất nước áp

suất thủy tĩnh giảm rất nhanh đến âm, vì nước còn không ép vào vách. Điều này giải

thích vì sao sự tăng trưởng tế bào rất nhạy với stress nước (Bùi Trang Việt, 2002).

Điều này chúng ta có thể thấy rõ qua phương trình thế nước như sau:

Ψ = - π + P

Trong đó: π = RTCs là số dương; dấu trừ trước π cho thấy thế nước giảm khi

tăng π (nồng độ các chất hòa tan tăng, “nồng độ” nước giảm), thế nước tăng khi

giảm π. Thế nước tăng nếu áp suất thủy tĩnh dương trong tế bào phát triển, thế nước

giảm nếu áp suất thủy tĩnh âm trong tế bào phát triển (Bùi Trang Việt, 2002). Sự

thiếu nước và giảm thế nước dẫn tới nhiều thay đổi trong tăng trưởng và phát triển

thực vật, như đóng khí khẩu để giảm sự thoát hơi nước ở lá, tích tụ các chất hòa tan

và điều chỉnh sự thẩm thấu, giúp cây giữ nước và sức trương… Vai trò kiểm soát

của AHK1 (Arabidopsis Histidine Kinase1) đối với mật độ khí khổng và sao mã các

gene đáp ứng-stress (stress-responsive genes) được chứng minh khi cây chống chịu

với thế nước thấp của môi trường nước xung quanh (Kumar et al. 2013).

1.2.4. Sự đáp ứng của cây mầm lúa trong điều kiện stress nước

Khả năng sống sót và cho năng suất trong điều kiện thiếu nước của các giống

khác nhau, tuy nhiên, hiện tượng này phức tạp và có thể do nhiều nguyên nhân. Cơ

nguyên kháng hạn trong mối tương quan với khí hậu, sinh học của đất, điều kiện

14

canh tác có thể di truyền khác nhau và chuyên biệt từng vùng (Võ Tòng Xuân,

1979).

Kết quả áp lực về nước trong việc đóng cửa lỗ khí và giảm tỷ lệ thoát hơi,

giảm tiềm năng nước trong mô thực vật, giảm trong quang hợp và ức chế sự tăng

trưởng, tích lũy abscisic acid (AAB), proline, mannitol, sorbitol, hình thành các gốc

tự do của các hợp chất (ascorbate, glutathione, α-tocopherol ...), tổng hợp protein và

mRNAs. Bên cạnh những phản ứng sinh lý học thực vật cũng trải qua hình thái thay

đổi, như héo… (Yordanov et al, 2003).

Sự héo là phản ứng thông thường của thật vực đáp lại sự khô hạn trong thiên

nhiên, cũng làm giảm thể tích không bào như sự co nguyên sinh. Khi sự thiếu nước

gia tăng, tế bào ít căng phồng (giảm sức trương) và trở nên mềm yếu. Cây sẽ héo

tạm thời (cây phục hồi khi đủ nước) hay vĩnh viễn (nếu sự thiếu nước nghiêm trọng

và kéo dài). Thế nước của tế bào đang héo rất âm, áp suất âm phát triển đáng kể. Do

sức căng bề mặt lớn, nước trong các lỗ nhỏ của vách tế bào không cho khí qua vách,

nguyên sinh chất vẫn tiếp xúc với vách và kéo vách vào trong (Bùi Trang Việt,

2002).

Khi đất khô, thế nước (ψ) của dịch đất giảm mạnh (âm hơn). Thực vật chỉ

thu nước khi ψ của tế bào thấp hơn ψ của dịch đất. Do đó, trong phạm vi nào đó,

thực vật thực hiện sự điều hóa thế nước, bằng cách tích tụ các chất hòa tan trong tế

bào, tăng áp suất thẩm thấu ψ, giảm ψ của tế bào (theo phương trình thế nước) để

hướng dòng nước tế bào (Taiz và Zeiger, 2010).

Khi lá bắt đầu héo vì hạn, khí khổng đóng lại để tránh mất nước. AAB chính

là tín hiệu trong điều kiện mất nước này. Khi có tác động của hạn, tế bào thịt lá

đang bị héo dần sẽ nhanh chóng tổng hợp và tiết ra AAB. Sau đó, AAB lan tỏa sang tế bào bảo vệ có tính cảm quang của khí khổng và làm tăng nồng độ ion Ca2+ thúc đẩy quá trình giải phóng ion K+, Cl- làm giảm nồng độ các chất điều hòa áp suất

thẩm thấu, giải phóng bớt nước khỏi tế bào và khí khổng đóng lại. Trong trường

hợp này, các gen đặc hiệu được biểu hiện, một loạt các chất được tổng hợp mới

trong tế bào. Nhóm các gen phản ứng với AAB gọi chung tên là RAB.

15

Tính chịu hạn của lúa phụ thuộc vào một số cơ chế, một trong các cơ chế đó

là sự kiểm soát mức độ thoát hơi nước trên bề mặt lá. Các giống lúa nương có xu

hướng làm giảm sự mất nước bằng cách cuộn lá và đóng khí khổng ngay khi độ ẩm

đất giảm. Việc đóng khí khổng được duy trì bằng cách điều chỉnh áp suất thẩm thấu

hoặc các chất hormone rễ. Trong khi đó, ở các giống lúa đồng bằng tuy có bộ rễ

ngắn nhưng lại có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu tốt. Các giống lúa này duy

trì sức trương và chuyển hơi nước ở lá xuống tiềm năng nước trong lá thấp. Tuy

nhiên, do không phát triển bộ rễ nên khả năng chịu hạn kém.

Trong điều kiện khắc nghiệt như thế thì cây lúa có nguồn gốc từ giống địa

phương, có khả năng cao hơn trong sự tích lũy chất tan như carbohydrate, proline so

với các dòng mới khác. Do tương quan giữa khả năng chịu hạn và tích lũy chất tan,

nên có thể cho rằng sự tích tụ chất tan là một trong những cơ chế tăng khả năng chịu

hạn ở lúa (Wang et al, 2007).

Tính trạng khô hạn ở cây lúa là do đa gen quy định nên sự biến động rất

phức tạp vì thế các tính trạng này không những chịu ảnh hưởng của gen mà còn

chịu ảnh hưởng của môi trường và các gen phụ (Nguyễn Thị Lang, 2010). Trong

chương trình chọn tạo giống lúa kháng hạn thì những giống thấp lùn lai khoảng 1 m

để có thể trồng dày và chịu hạn tốt, lá ngắn và thẳng để giảm bốc hơi nước và giảm

cháy nắng. Trong điều kiện thiếu nước, cây lúa thường đâm chồi ít hơn (Võ Tòng

Xuân, 1979).

Nước là điều kiện quan trọng cho cây mạ quang hợp và hô hấp. Khi lá no

nước, cường độ quang hợp giảm. Trong điều kiện thiếu nước, khô hạn, hô hấp tăng,

đó là phản ứng tạm thời bình thường của cơ thể với kích thích. Khi giảm dần hàm

lượng nước thì điều đó lại không xảy ra. Thiếu nước kéo dài gây nên sự giảm dần

hô hấp, nhưng chậm hơn so với mức độ giảm quang hợp (Nguyễn Văn Luật, 2009).

Stress nước sẽ làm khí khổng đóng trong thời kì đầu bị hạn để giảm sự thoát hơi

nước, kéo theo sự giảm nồng độ CO2 trong gian bào từ đó giảm cường độ quang

hợp (Chaves et al., 2003).

16

1.2.5. Điều hòa sự sinh trưởng của cây mầm trong điều kiện stress nước

Trong phòng thí nghiệm, khi mô được ngâm trong các dung dịch ưu trương

thì hiện tượng co nguyên sinh thường xảy ra: hàm lượng nước của tế bào giảm, tế

bào chất trở nên đậm đặc, thể tích nguyên sinh chất và sức trương của tế bào giảm

dần. Vì lý do này, sự co nguyên sinh không làm phát sinh áp suất âm (sức căng) có

ý nghĩa trong nguyên sinh chất. Sự co nguyên sinh đôi khi xảy ra trong thiên nhiên

do stress nước hay nồng độ muối quá cao (Bùi Trang Việt, 2002).

Cải thiện khả năng chịu hạn bao gồm cả chương trình nhân giống thông

thường và tạo dòng đột biến. Kỹ thuật xử lí hóa chất và chiếu xạ được tiếp cận để

tạo ra đột biến với số lượng lớn các dòng đột biến về tính trạng chịu hạn. Thay đổi

bộ máy sinh hóa, chẳng hạn như tăng tích tụ của các chất chuyển hóa và tăng enzym

chống oxy hóa được thể hiện rõ ràng trong phản ứng của cây trồng khi thiếu nước.

Khi bị thiếu nước sẽ có sự thoái hóa sắc tố, giảm độ dẫn khí khẩu, giảm nồng độ

CO2 nội bộ và ức chế tăng trưởng (Chaum, 2010).

Nuôi cấy mô và tế bào có thể đóng góp một phần trong việc tạo chọn các

dòng chống chịu các stress môi trường. Trong nuôi cấy mô thì sự cân bằng các chất

điều hoà tăng trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong việc sinh tạo cơ quan của

cây. Kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy acid abscisic (AAB) là chất có

liên quan đến việc tổng hợp các protein mới (đặc biệt là protein với phân tử lượng

26) xuất hiện ở dòng chịu muối. Mối tương quan giữa AAB, tính chiụ muối và sự

tổng hợp các protein đặc biệt là vấn đề nghiên cứu hết sức lý thú. Các dòng chịu hạn

đã được thông báo, các tác giả đã sử dụng chất gây hạn PEG 4000 hoặc PEG 6000

đưa vào môi trường để gây khô hạn trong các nghiên cứu in vitro ở một số cây họ

đậu, nho, cà chua, dền (Huỳnh Thị Diễm Phúc et al, 2011).

Các chất điều hòa sinh trưởng và phát triển của thực vật là những chất có bản

chất hóa học khác nhau, nhưng đều có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng,

phát triển của cây từ lúc tế bào trứng thụ tinh phát triển thành phôi cho đến khi cây

ra hoa kết quả, hình thành cơ quan sinh sản, cơ quan dự trữ và kết thúc chu kỳ sống

của mình. Các hormone thực vật (phytohormone) là những chất hữu cơ có bản chất

17

hóa học rất khác nhau được tổng hợp với một lượng rất nhỏ ở các cơ quan, bộ phận

nhất định của cây và từ đó vận chuyển đến tất cả các cơ quan, các bộ phận khác của

cây để điều tiết các hoạt động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, phát triển của cây

và để đảm bảo mối quan hệ hài hòa giữa các cơ quan, bộ phận trong cơ thể (Nguyễn

Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).

• Auxin

Auxin là một chất có nhân, có công thức phân tử là C10H9O2N. Ở nồng độ

cao, auxin kích thích sự tạo mô sẹo từ các tế bào sống nhờ vào chất “histogene”,

(là chất tạo ra nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên một “mô

sẹo”). Đây là đặc tính tốt được áp dụng trong nuôi cấy tế bào (Dương Công Kiên,

2002).

Auxin và gibberellin đều kích thích sự kéo dài tế bào, tuy nhiên chỉ có auxin

tác động trên sự kéo dài diệp tiêu và tế bào vùng kéo dài dưới ngọn của thân, khúc

cắt thân cô lập, gibberellin hầu như chỉ hoạt động trên thân nguyên. Sự kéo dài tế

bào rễ cần những nồng độ thấp hơn nhiều so với tế bào thân (Bùi Trang Việt, 2000).

Auxin đóng một vai trò chủ đạo trong sự phát sinh phôi, có vai trò điều hoà

sự nảy mầm của hạt ở mức phân tử. Trong điều kiện thiếu nước, Auxin càng có vai

trò quan trọng trong việc hấp thụ nước của tế bào. Khi nồng độ muối cao Auxin kích thích sự hấp thụ ion K+ trên thành tế bào. Trong suốt quá trình nảy mầm AIA ở

dạng tự do giảm còn AIA mới được tổng hợp tăng lên để kéo dài rễ mầm và giảm

nhanh khi rễ mầm chui ra khỏi vỏ hạt. Khi cây mạ non phát triển, Auxin lưu thông

từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng (Nguyễn Đức

Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).

• Gibberellin

Gibberellin kích thích sự nảy mầm, nảy chồi của các mầm ngủ, của hạt và

củ, do đó nó có tác dụng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ. Hàm lượng

gibberellin thường tăng lên lúc chồi cây, củ, căn hành hết thời kỳ nghỉ, lúc hạt nảy

mầm (Vũ Văn Vụ et al, 2000). GA nội sinh kích thích hạt nảy mầm kể cả sự phá

ngủ của chồi, động viên chất dự trữ của nội nhũ (Nguyễn Như Khanh, 2002). Trong

18

thời kì nảy mầm, gibberellin kích thích sự tổng hợp của các enzyme amylase và các

enzyme thuỷ phân khác như protease, photphatase... và làm tăng hoạt tính của các

enzyme này, vì vậy mà xúc tiến quá trình phân hủy tinh bột thành đường cũng như

phân hủy các polyme thành monome khác, tạo điều kiện về nguyên liệu và năng

lượng cho quá trình nảy mầm. Trên cơ sở đó, nếu xử lý gibberellin ngoại sinh thì có

thể phá bỏ trạng thái ngủ, nghỉ của hạt, củ, căn hành kể cả trạng thái nghỉ sâu (Vũ

Văn Vụ et al, 2000).

Trong điều kiện hiếu khí gibberellin có vai trò quan trọng trong sự nảy mầm

của hạt lúa. Dưới điều kiện hiếu khí -amylase sản xuất được tăng cường để đáp

ứng gibberellin sản xuất phôi. Nhưng trong điều kiện kị khí thì gibberellin không

cần thiết cho nảy mầm của hạt lúa mà việc sản xuất -amylase trong quá trình nảy

mầm của hạt gạo được cho là đóng một vai trò quan trọng đối với khả năng chịu

thiếu oxy của các loại hạt ngũ cốc (Loreti et al, 2003).

GA khởi động sự nảy mầm của hạt bằng cách tác động đến một trong các

bước: hoạt hóa sinh dưỡng của phôi, làm yếu các lớp nội nhũ cản trở sinh trưởng

bao quanh phôi và động viên chất dự trữ trong nội nhũ. GA hoạt hóa sự hình thành

nhiều enzyme thủy phân, đáng chú ý nhất là α-amylase trong lớp tế bào alơron bao

quanh nội nhũ của hạt ngũ cốc đang nảy mầm (Nguyễn Như Khanh, 2002). Các tế

bào alơron là những tế bào sống không phân chia, có chức năng đặc trưng là hình

thành và giải phóng các enzyme tiêu hóa khối nội nhũ của hạt. Ở đây GA có vai trò

như là chất cảm ứng mở gen của hệ thống tổng hợp protein enzyme thủy phân hoạt

động (Vũ Văn Vụ et al, 2000). Bổ sung GA3 ngoại sinh gây ra một kết quả là tăng

tỷ lệ nảy mầm và sự tăng trưởng cây mầm bằng cách tăng cường sự sẵn có của GA3

nội sinh (Kim et al, 2006). Gibberellin kích thích sự biệt hóa tế bào của mô phân

sinh ngọn chồi. Tuy nhiên nếu ở nồng độ cao sẽ cản sự phân chia tế bào bằng cách

giảm hoạt tính kích thích phân chia tế bào của cytokinin ở mô phân sinh ngọn chồi.

Gibberellin kích thích kéo dài tế bào, cùng với auxin sẽ giúp phân chia tế bào (Pua

và Davey, 2009).

19

• Cytokinin

Tính chất đặc trưng của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ.

Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên

nhân là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp acid nucleic và protein

dẫn đến kích thích sự phân chia tế bào (Vũ Văn Vụ et al, 2000).

Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực

vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỷ

lệ auxin (phân hóa rễ) và cytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa rất quyết định trong

quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn

(Vũ Văn Vụ et al, 2000). Nếu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ,

còn tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin thì kích thích ra chồi; sự cân bằng giữa hai kiểu

hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển (Bùi Trang Việt,

2000).

• Acid abscisic

Một trong những hậu quả đầu tiên của sự thiếu nước trong đất là sự đóng các

khí khổng và sự cản quang hợp. Trong điều kiện này, AAB được vận chuyển theo

hướng ngược với hướng được thấy trong điều kiện quang hợp mạnh. Trong điều

kiện quang hợp bình thường, AAB tích lũy trong diệp lạp (khổng mở); nhưng khi tế

bào thịt lá bắt đầu mất nước, một phần AAB trong tế bào thịt lá được phóng thích

vào apoplast và theo dòng thoát hơi nước tới các tế bào khí khổng để khởi phát sự

đóng khẩu. Sự gia tăng tổng hợp AAB chỉ xảy ra khi khổng đóng, có lẽ để thúc

nhanh hay kéo dài hiệu ứng đóng khổng của AAB (Bùi Trang Việt, 2002).

Ở lúa người ta đã xác định gen RAB 21, được gây ra khi cây lúa bị stress

nước. Gen này mã hóa một protein glycine chỉ có trong các phần phân đoạn của tế

bào chất. Protein này tích lũy trong phôi gạo, lá, rễ và các tế bào mô sẹo có nguồn

gốc từ việc bổ sung NaCl (200 mM) hoặc hormone thực vật acid abscisic (10

microM AAB). Cảm ứng của RAB tích tụ mRNA 21 của AAB là nhanh chóng (ít

hơn 15 phút trong các tế bào bị gây stress) và tổng hợp protein, để đáp ứng với

hormone này.

20

Acid abscisic (10-7 M) làm đóng khí khổng sau vài phút. Khi cây thiếu nước,

hàm lượng acid abscisic trong lá tăng mạnh. Nếu lá tái hấp thu nước, hàm lượng

acid abscisic sẽ trở lại giá trị ban đầu. Nhiều người cho rằng AAB là dấu hiệu của

sự “khô hạn” kích thích sự đóng khí khẩu. Nó được xem như là hormone của

“stress” vì nó được hình thành mạnh để phản ứng với các “stress” hoặc các điều

kiện bất lợi của môi trường như hạn hán, nồng độ muối cao…và làm cho cây biến

đổi để thích ứng với môi trường (Vũ Văn Vụ et al, 2000).

GA và AAB hoạt động cùng lúc với giai đoạn ngủ và giai đoạn nảy mầm.

GA cao làm thúc đẩy nảy mầm khi đã ức chế tổng hợp AAB. Do đó, gỡ ngủ được

đặc trưng bởi sự suy giảm AAB và tăng sinh tổng hợp GA (Finch- savage, 2003).

Trong các cơ quan đang ngủ nghỉ, hàm lượng acid abscisic tăng gấp 10 lần so với

thời kỳ sinh trưởng. Sự ngủ nghỉ kéo dài cho đến khi nào hàm lượng acid abscisic

trong cơ quan ngủ nghỉ giảm đến mức tối thiểu. Do vậy từ trạng thái ngủ nghỉ

chuyển sang trạng thái nảy mầm có sự biến đổi tỷ lệ giữa acid abscisic và

gibberellin ở trong các cơ quan (Jain et al, 1996).

• Ethylene và một số chất làm chậm sinh trưởng

Ethylene kích thích sự kéo dài thân cây mầm, ngược với hiệu ứng cản thông

thường. Khi cây mầm lúa bị ngập nước, sự tăng trưởng lóng gia tăng đột ngột. Điều

này là do khi bị ngập nước cây lúa bị thiếu oxygen, sự tổng hợp ethylene giảm,

nhưng cây lúa chìm trong nước có hàm lượng ethylene cao vì ethylene khuếch tán

rất chậm trong đất ngập nước. Sự rụng lá do stress khô hạn nghiêm trọng là cách

thực vật đáp ứng với ethylene để giảm bề mặt thoát hơi nước (Bùi Trang Việt,

2000).

Các chất làm chậm sinh trưởng là một nhóm chất tổng hợp nhân tạo có bản

chất hoá học khác nhau, được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong nông nghiệp.

Chúng có những hoạt tính sinh lí tương tự như ức chế sự sinh trưởng kéo dài, làm

cây thấp, mở rộng phiến lá, xúc tiến sự ra hoa, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của rễ

(Vũ Văn Vụ et al, 2000).

21

Trong quá trình nuôi cấy thì quá trình nảy mầm, sự hình thành rễ, thân, lá…

đều được điều chỉnh bởi hai hay một vài hormone đặc hiệu. Nếu tỉ lệ này nghiêng

về auxin thì rễ hình thành mạnh hơn, ngược lại, chồi hình thành mạnh hơn. Đây là

cơ sở để hình thành cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro. Sự ngủ và nảy mầm

được điều chỉnh bằng tỉ lệ giữa AAB/GA. Tỉ lệ này nghiêng về AAB thì hạt ở trạng

thái ngủ và ngược lại thì sự nảy mầm xảy ra (Vũ Văn Vụ et al, 2000).

1.2.6. Vai trò của saccharose và mannitol trong nuôi cấy in vitro cây mầm lúa

Trong nuôi cấy in vitro, sự sinh trưởng của cây chủ yếu được xác định bởi

các thành phần của môi trường dinh dưỡng. Đường trong môi trường nuôi cấy đã

được coi là nguồn carbon duy nhất cho sự phát triển của tế bào, chồi, cành, và thậm

chí cả cây con. Đường có vai trò trong các con đường trao đổi chất và chuyển đổi

năng lượng cho sự tăng trưởng của tế bào. Trong nuôi cấy mô thực vật, đường như

một nguồn cung cấp carbohydrate để cung cấp một điều kiện nuôi tối ưu cho các tế

bào (Gauchan, 2012).

Nồng độ đường được lựa chọn phụ thuộc vào loại và tuổi của mô cấy. Phôi

non yêu cầu một lượng đường tương đối cao. Đường phổ biến nhất được sử dụng là

saccharose ở nồng độ 2 - 5%. Saccharose được coi như một nguồn carbon chủ yếu

trong nuôi cấy in vitro vì chúng hiển diện phổ biến nhất trong nhựa vỏ cây của

nhiều carbohydrate thực vật (Gauchan, 2012).

Mannitol là một đường 6 cacbon mạch hở, một trong những polyols phổ

biến nhất trong tự nhiên. Một trong những chức năng sinh lý quan trọng của

mannitol là kiểm soát tế bào ở thế nước thấp, hoạt động như trong điều kiện ưu

trương (Iwamoto và Shiraiwa, 2005). Mannitol cũng có thể hoạt động giống một

enzyme chống oxy hóa như superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) và

peroxidase (POX), có hiệu quả tái sinh và bảo tồn nguồn gen (Tenuifolius và

Dianthus, 2009). Mannitol được sử dụng trong phòng thí nghiệm như một phương

tiện để gây khô hạn trong nuôi cấy mô thực vật (Jain et al, 1996).

22

Chương 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

* Hạt Lúa Nàng Thơm Chợ Đào (Oryza sativa L.) được cung cấp từ Viện Khoa Học

Kĩ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam.

Ảnh 2.1. Hạt lúa Nàng Thơm Chợ Đào

* Vật liệu sinh trắc nghiệm

- Khúc cắt diệp tiêu cây mạ lúa (Oryza sativa L.)72 giờ tuổi

- Trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.) 72 giờ tuổi

- Tử diệp cây mầm dưa leo (Cucumis sativa L.) 48 giờ tuổi

2.2. Phương pháp

2.2.1. Xác định thời điểm bão hòa nước của hạt lúa

Mục đích thí nghiệm: Xác định thời điểm bão hòa nước của hạt lúa để từ đó

tiến hành cảm ứng stress nước trên cây mầm lúa.

Phương pháp thí nghiệm: Cân 5 (g) hạt lúa và ngâm nước, cứ sau 1 giờ thì

cân lại khối lượng đến khi nào trọng lượng tươi của hạt lúa không đổi, đó chính là

điểm bão hòa nước.

23

2.2.2. Quan sát giải phẫu hình thái

Các hạt lúa in vitro trong các môi trường nuôi cấy ở điều kiện bình thường

hay xử lí stress được chụp hình mẫu cắt dọc, cắt ngang bằng tay hay máy cắt

microtome, sau đó được nhuộm bằng đỏ carmine – xanh iod và quan sát dưới kính

hiển vi quang học.

• Mẩu được cắt bằng tay

Phương pháp giải phẫu lần lượt qua các bước:

- Mẫu được cắt ngang hay cắt dọc thành từng lát nhỏ 0,5 – 1 mm.

- Tẩy mẫu bằng javel trong 30 phút, sau đó rửa sach mẫu nhiều lần bằng nước

cất, chậm giấy thấm cho hết nước.

- Ngâm mẫu trong acid acetic 20% trong 5 phút, rửa sạch bằng nước cất.

- Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmine-xanh iot trong

15 phút, rửa sạch bằng nước cất.

- Quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học.

• Mẫu được cắt bằng máy cắt microtome có kích thước 7 µm

1. Cố định mẫu

Mẫu được cố định ngay trong môi trường FAA (formadehid acol acid) sau 24 giờ, chuyển mẫu vào etanol 700

2. Đúc mẫu

Loại nước bằng cách đặt mẫu lần lượt trong:

- Etanol 700: 3 lần, mỗi lần 20 phút. - Etanol 950: 3 lần, mỗi lần 20 phút - Etanol 1000: 3 lần, mỗi lần 20 phút

Loại etanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong :

- Butanol 1: 30 phút. - Butanol 2: 30 phút. - Butanol 3: 30 phút. - Butanol 4: 10 giờ hoặc qua đêm.

Loại butanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong paraffin tan ở 560 – 600 c:

24

- Paraffin 1: 1 giờ.

- Paraffin 2: 1 giờ.

- Paraffin 3: 1 giờ.

Đổ paraffin nóng chảy vào khuôn, đặt mẫu vào và đổ đầy paraffin.

3. Cắt và dán mẫu

Mẫu được cắt dọc thành từng lát mỏng 7µm nhờ máy vi phẫu (microtome).

Băng paraffin có chứa mẫu được cắt thành từng đoạn ngắn và được dán lên lam chứa dung dịch gelatin 1%. Đặt mẫu trên bếp ở nhiệt độ khoảng 350C. Mẫu dãn ra dán chặt vào lam. Giữ mẫu trong tủ ấm ở 300C trong hai ngày để

cho mẫu thật khô.

4. Nhuộm mẫu

Loại paraffin bằng cách đặt mẫu lần lượt trong:

- Methylcyclohexan 1: 10 phút.

- Methylcyclohexan 2: 10 phút.

Rửa mẫu bằng etanol 1000. Sau đó, đặt mẫu lần lượt trong:

- Etanol 1000: 5 phút. - Etanol 950: 5 phút. - Etanol 700: 5 phút. - Nước cất: 5 phút.

Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ carmine-xanh iod và quan sát

dưới kính hiển vi quang học (Lê Thị Trung, 2003).

2.2.3. Khảo sát sự tăng trưởng cây mầm lúa in vitro

Mục đích thí nghiệm: Tìm môi trường thích hợp với sự phát triển của cây

mầm lúa in vitro.

Phương pháp thí nghiệm: 4 môi trường được sử dụng:

MS, MS1/2 (hàm lượng khoáng đa lượng giảm 1/2), MS1/5 (khoáng đa

lượng giảm 1/5) và MS1/10 (khoáng đa lượng giảm 1/10). Mỗi nghiệm thức gồm 5

ống nghiệm, mỗi ống nghiệm gồm 3 hạt với 3 lần lặp lại.

1 nghiệm thức = 3*5*3 = 45 mẫu.

Lúa được bóc vỏ ở bên ngoài, khử trùng bằng NaOCl 4% trong vòng

25

30 phút, sau đó đưa vào phòng nuôi cấy và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 5 – 7

lần.

Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 2 0C, ánh sáng 2000 ± 200 lux.

Hạt được xem là nảy mầm khi có rễ lú ra khoảng 1 mm. Các chỉ tiêu sinh

trưởng được theo dõi sau 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày từ khi cấy mẫu.

- Chiều dài rễ được xác định từ phần gốc rễ cho tới đỉnh rễ.

- Chiều dài chồi được xác định từ phần ngang gốc lên hết đỉnh chồi.

Môi trường số cây mầm tăng trưởng tốt sẽ được chọn để thực hiện các

nghiệm thức tiếp theo.

Tuổi cây mầm được tính từ ngày bắt đấu cấy hạt (ngày 0).

2.2.4. Khảo sát sự tăng trưởng của cây mầm lúa trong môi trường MS1/2 với

các nồng độ đường khác nhau

Trong sự tăng trưởng của cây mầm đường saccharose có vai trò cung cấp

năng lượng trong khi đường mannitol không cung cấp nguồn năng lượng mà sẽ gây

khô hạn trong môi trường nuôi cấy.

2.2.4.1. Với nồng độ saccharose khác nhau

Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ đường saccharose phù hợp với sự

phát triển của cây mầm lúa in vitro.

Phương pháp thí nghiệm: Từ kết quả ở mục 2.2.3, hạt lúa được cấy trên môi

trường MS1/2 có sự thay đổi nồng độ saccharose lần lượt là 0%, 0,5%, 1%, 1,5%,

2%, 2,5%, 3,0% (MS1/2, đối chứng).

Theo dõi chiều dài rễ và chiều dài chồi (như mục 2.2.3) sau 3 ngày, 5 ngày, 7

ngày nuôi cấy.

2.2.4.2. Với nồng độ mannitol khác nhau

Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ mannitol thích hợp để cảm ứng

stress trong sự phát triển của cây mầm lúa in vitro.

Phương pháp thí nghiệm: Thay đường saccharose bằng đường mannitol với

các nồng độ lần lượt là 0%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% trên môi trường MS1/2

(đối chứng).

26

Theo dõi chiều dài rễ và chiều dài chồi (như mục 2.2.3) sau 3 ngày, 5 ngày, 7

ngày nuôi cấy.

2.2.4.3. Với nồng độ đường saccharose và mannitol khác nhau

Mục đích thí nghiệm: Xác định sự tác động đồng thời của hai loại đường lên

sự phát triển của cây mầm lúa in vitro.

Phương pháp thí nghiệm: Mẫu được cấy trên môi trường MS1/2 có bổ sung

cả hai loại đường để kiểm tra ảnh hưởng của đường đến sự tăng trưởng của cây

mầm lúa. Nồng độ đường trong môi trường MS1/2 là 3%, các nghiệm thức được bố

trí sao cho tổng lượng đường trong môi trường là 3%:

Nghiệm thức Các loại đường

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Saccharose (%)

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Mannitol (%)

Theo dõi chiều dài rễ và chiều dài chồi (như mục 2.2.3) sau 3 ngày, 5 ngày, 7

ngày nuôi cấy.

2.2.5. Theo dõi sự tăng trưởng rễ nhánh cây mầm lúa trên môi trường MS1/2

bổ sung saccharose riêng rẽ hoặc kết hợp

Mục đích thí nghiệm: Xác định khả năng tạo và phát triển của rễ nhánh trên

môi trường bình thường (MS1/2) và môi trường không có đường cũng như trên môi

trường bị stress.

Phương pháp thí nghiệm: 3 môi trường được chọn

- MS1/2 (saccharose 3%, đối chứng)

- MS1/2 loại saccharose + mannitol 3%

- MS1/2 + mannitol 3%

Theo dõi sự phát triển rễ nhánh (số lượng, chiều dài) sau 3 ngày, 5 ngày, 7

ngày nuôi cấy.

Rễ nhánh được tính là những rễ không sinh ra từ vị trí của rễ mầm.

2.2.6. Xác định thời gian bị stress của cây mầm lúa

27

Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian bị stress nước trong sự phát triển

của cây mầm lúa để khi đưa ra môi trường tự nhiên. Sau khi bị stress cây lúa có khả

năng sinh trưởng bình thường, chống chịu tốt hơn.

Phương pháp thí nghiệm:

Các nghiệm thức được bố trí như sau:

MS1/2 (đối chứng)

Mannitol 3% (24 giờ) → MS1/2 : 24 + ĐC

Mannitol 3% (48 giờ) → MS1/2 : 48 + ĐC

Mannitol 3% (72 giờ) → MS1/2 : 72 + ĐC

MS1/2 (24 giờ) → Mannitol 3% : ĐC 24 + Man 3%

MS1/2 (48 giờ) → Mannitol 3% : ĐC 48 + Man 3%

MS1/2 (72 giờ) → Mannitol 3% : ĐC 72 + Man 3%

Chỉ tiêu theo dõi: chiều dài rễ và chiều dài chồi sau 3 ngày từ khi nuôi cấy.

2.2.7. Xác định trọng lượng tươi, trọng lượng khô của cây mầm lúa trên các

môi trường cảm ứng mannitol 3% kết hợp thời gian bị stress khác nhau

Mục đích thí nghiệm: Từ các nghiệm thức của mục 2.2.6, trọng lượng tươi,

trọng lượng khô của cây mầm lúa được theo dõi để thấy được sự tăng trưởng của

cây mầm.

Phương pháp thí nghiệm: Cân khối lượng 30 hạt cho từng nghiệm thức. Sau

3 ngày nuôi cấy, mẫu được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch, thấm khô và cân để

xác định trọng lượng tươi. Trọng lượng khô được xác định bằng cách sấy khô ở 800C sau 24 giờ, cân lại. Tiếp tục sấy ở 600C và cân đến khi trọng lượng không đổi. 2.2.8. Xác định cường độ hô hấp của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 và

MS1/2 bổ sung mannitol 3% ở các thời gian bị stress khác nhau

Mục đích thí nghiệm: Xem sự thay đổi cường độ hô hấp của cây mầm lúa khi

bị stress nước với các thời gian khác nhau so với cây không xử lý.

Phương pháp thí nghiệm: Đo cường độ hô hấp của cây mầm lúa ở trên hai

môi trường MS1/2 và MS1/2 bổ sung mannitol 3% theo thời gian: 5 giờ (kết quả 2.2.1 đối chứng), 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ bằng máy Warburg ở 250 C ± 20C, trong tối.

28

Cân chính xác trọng lượng tươi cây mầm lúa, rửa sạch mẫu nhẹ nhàng và

đựng trong nước cất. Cho vào thân bình Warburg 2 ml nước cất, dùng kẹp cho

mẫu vật vào thân bình. Cho vào trụ giữa 0,5 ml dung dich KOH 20%.

Dùng kẹp cho mảnh giấy lọc đã xếp vào trụ giữa. Thực hiện một bình nhiệt khí áp

kế với 2,5 ml nước cất (không có mẫu vật), thoa vaselin vào mặt trong cổ bình (kể

cả ống nhánh). Gắn bình Warburg vào áp kế, xoay nhẹ nút và bình để chỗ ráp thật

kín. Cột thun quanh các móc để giữ bình không rớt .

Gắn áp kế vào thành máy Warburg, thân bình ngập trong nước, mở khóa chia

ba để áp kế thông với khí quyển.

Cho máy lắc 10 phút (thời gian này cho nhiệt độ không khí trong bình ổn định với nhiệt độ nước là 250C. Sau 10 phút, tắt máy lắc, điều chỉnh mực chất lỏng

trong áp kế đến vạch mười. Đóng khóa áp kế để hệ thống bình Warburg và nhánh áp

kế kín, mở máy lắc, ghi thời điểm t1 đồng thời tắt đèn: thí nghiệm đo bắt đầu.

Khi đọc số đo (sau 15 phút): ngưng máy lắc, điều chỉnh chất lỏng trong

nhánh kín của áp kế về vạch 10, đọc mực chất lỏng bên nhánh mở của áp kế. Tính

trị số ∆p bằng số mm chất lỏng chênh lệch giữa 2 áp kế. Tính trị số ∆v ở bình (thể

tích oxy bị mô hấp thụ) qua hệ thức ∆v=k. ∆p, từ đó tính ra cường độ hô hấp của

mỗi thí nghiệm (µl oxygen hấp thu/ g TLT / giờ).

2.2.9. Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh của

cây mầm lúa

Mục đích thí nghiệm: Xác định được hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng

thực vật nội sinh trong cây mầm lúa in vitro ở các thời điểm khác nhau để từ đó có

phương pháp tác động đến cây trong điều kiện stress.

Phương pháp thí nghiệm: Cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 và MS1/2 có

bổ sung mannitol 3% được dùng để đo các chất điều hòa tăng trưởng thực vật sau 5

giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ nuôi cấy.

* Li trích và phân đoạn

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được li trích và phân đoạn

theo Bùi Trang Việt (1992).

29

Nghiền 1 (g) mẫu trong 50 ml methanol 80%, để trong tối, thỉnh thoảng lắc.

Sau 24 giờ, lọc hỗn hợp và thu lấy dịch lọc I. Thêm vào bã 20 ml methanol 80%, lắc

20 phút, lọc thu dịch lọc II. Lặp lại như trên một lần nữa và thu dịch lọc III. Hòa

chung 3 dịch lọc I, II, III, đem cô cạn dưới quạt còn khoảng 1 ml.

Thêm nước cất vào cho đủ 10 ml, dịch nước được chỉnh pH = 2,5 với

dung dịch HCl 1%. Cho hỗn hợp vào bình lóng, thêm 15 ml eter, lắc bình

lóng khoảng 20 phút, để yên và chờ dịch lọc trong bình lóng phân lớp.

Tách riêng dịch nước (lớp dưới) vào và dịch eter (lớp trên). Từ dịch nước thu được,

lặp lại sự lóng tương tự hai lần nữa. Sau quá trình này, thu được dịch eter 1 (chuẩn

bị cho sự sắc ký và sinh trắc nghiệm nhóm chất acid: AIA, AAB và GA3) và dịch

nước.

Dịch nước được chỉnh pH = 7 và tiếp tục lóng eter theo cách tương tự như

trên, sau đó thu dịch eter 2 (dịch để sắc ký và sinh trắc nghiệm zeatin) và nước (bỏ).

Dịch eter 1 và 2 thu từ những lần lóng được cho vào bình lóng (riêng cho

từng phần) thêm 3 ml dung dịch NaHCO3 8%, lắc khoảng 5 phút, để yên hỗn hợp

trong bình lóng sẽ phân thành hai lớp, loại bỏ lớp bên dưới. Tiếp tục lặp lại như vậy

một lần nữa với 3 ml NaHCO3 8%. Mỗi dịch eter thu được từ quá trình này được

cho vào một becher và quạt cạn đến 0,5 ml.

* Sắc ký lớp mỏng:

Dịch trích của các mẫu được chấm trên bản mỏng silicagel 60 F254 (mã số 1.05554, Merck), ở nhiệt độ 30 ± 10C. Dung môi di chuyển là chloroform: metanol :

acid acetic (tỉ lệ 80 : 15 : 5 theo thể tích). Vị trí hormon tăng trưởng thực vật trên

bản sắc ký được phát hiện nhờ quan sát dưới tia UV ở bước sóng 254 nm.

* Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng các sinh trắc

nghiệm:

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được trích từ mẫu ở các thời điểm

khác nhau được xác định tương ứng với các băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf

30

của mỗi chất chuẩn. Chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh được cô lập riêng,

cạo lấy các hạt silicagel trên bản sắc ký, ngâm với nước cất 24 giờ để chuẩn bị sinh

trắc nghiệm xác định hoạt tính.

Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic

Hoạt tính auxin và acid abscisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp

tiêu lúa (Bùi Trang Việt, 1992). Hạt lúa được cho nẩy mầm trong tối, sau 72 giờ

diệp tiêu (chưa bị xé) được cắt thành đoạn dài 2 mm để dùng trong sinh trắc

nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc diệp tiêu. Sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ, trong tối, nhiệt độ 30 ± 10C. Hoạt tính của auxin và acid

abscisic lần lượt tỉ lệ thuận và nghịch với sự sai biệt chiều dài diệp tiêu so với đối

chứng và được tính bằng cách so sánh sai biệt chiều dài của diệp tiêu trong các dịch

trích và các dung dịch AIA 1 mg/l và AAB 1 mg/l.

Sinh trắc nghiệm cytokinin

Hoạt tính cytokinin được đo bằng dịch trích trắc nghiệm tử diệp dưa leo. Hột

dưa leo được ngâm 2 giờ, cho nảy mầm sau 24 giờ và khi rễ mầm nhú ra khoảng

2mm thì tử diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm

5 tử diệp. Hoạt tính cytokinin tỉ lệ thuận với sai biệt trọng lượng tươi của tử diệp so

với đối chứng và được tính bằng cách so sánh với dung dịch zeatin 1 mg/l sau 48 giờ chiếu sáng (2000 ± 200 lux), ở nhiệt độ 30 ± 10C, ẩm độ 65 ± 5%.

Sinh trắc nghiệm gibberellin

Hoạt tính gibberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà lách sau 24 giờ cho nảy mầm ở 2000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 10C, ẩm độ 65 ± 5%.

Các hột với rễ mầm nhú ra 1 mm được chọn để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi

nghiệm thức gồm 10 cây mầm. Hoạt tính gibberellin tỉ lệ thuận với sự sai biệt chiều

dài trụ hạ diệp so với đối chứng sau 72 giờ xử lý và được tính bằng cách so sánh với

dung dịch GA3 10 mg/l.

Sự ly trích, phân đoạn và sinh trắc nghiệm các chất điều hòa tăng trưởng

thực vật được thực hiện trong ba lần riêng biệt. Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng

thực vật là giá trị trung bình của ba lần lặp lại.

31

Hình 2.1. Sơ đồ ly trích và xác định hoạt tính tương đương của hormone thực vật

(theo Bùi Trang Việt, 1992; Nguyễn Du Sanh và cs, 2011)

32

2.2.10. Đưa cây in vitro từ hai môi trường MS1/2 và MS1/2 có bổ sung mannitol

3% đã cảm ứng 48 giờ ra vườn ươm

Mục đích thí nghiệm: Từ các kết quả đạt được, cây được gây stress trên môi

trường có mannitol 3% với thời gian xử lý 48 giờ được đưa ra trồng ở vườn ươm

nhằm tìm hiểu khả năng thích nghi của cây mầm lúa đã được cảm ứng stress trước

khi đưa ra ngoài tự nhiên.

Phương pháp thí nghiệm: Tiến hành đưa cây in vitro 7 ngày tuổi từ khi cấy ra

khỏi môi trường MS1/2 và MS1/2 có bổ sung mannitol 3% được cảm ứng trong 48

giờ trồng ngoài môi trường tự nhiên tại vườn thí nghiệm thực vật trường Đại học Sư

Phạm Thành phố Hồ Chí Minh.

Tỉ lệ đất như sau:

1 kg đất + 1 kg mùn + 0,5 kg xơ dừa + 0,3 kg phân bò

Đất được phân thành 2 loại: đất được cung cấp đầy đủ nước mỗi ngày và đất

được tưới nước gián đoạn.

- Đất ngập nước được xác định khi trong đất bão hòa nước (đất ướt).

- Đất được tưới nước gián đoạn được xác định sau khi để đất khô 3 ngày, đo

độ ẩm rồi tưới nước trở lại để đất đạt được độ ẩm ban đầu (đất khô).

Độ ẩm đất được xác định bằng % lượng nước có trong đất:

Wt(%) = a/b × 100

Trong đó:

Wt - độ ẩm đất tính theo % trọng lượng a - lượng nước mất khi sấy ở 1050C (g)

b - trọng lượng đất khô tuyệt đối (g)

Cách trồng: khoảng cách rộng = dài = 15 cm, mỗi bụi trồng 3 cây

Các chỉ tiêu theo dõi:

- số rễ, chiều dài rễ

- số lá, chiều dài lá

- chiều dài thân

- màu sắc lá

33

2.2.12. Xử lý thống kê kết quả thu được

Số liệu thu được từ các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm SPSS phiên

bản 16.5 cho Window. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác xuất 0,05 với các giá trị

được thể hiện bởi các chứ cái khác nhau kèm theo.

- Số lần lặp lại của mỗi nghiệm thức: 3

- Thời gian thực hiện đề tài: 3/2012 -3/2013.

- Địa điểm thực hiện đề tài: Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật trường Đại học

Sư phạm Thành Phố Hồ Chí Minh, phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật trường

Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.

34

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả

3.1.1. Thời điểm bão hòa nước của hạt lúa

4 giờ đầu sau khi ngâm, trọng lượng tăng nhanh, sau đó tăng ít dần cho đến

khi trọng lượng không đổi sau 5 giờ. Đó chính là thời điểm bão hòa nước (bảng 3.1,

hình 3.1).

Quan sát hình thái bên ngoài của hạt trước khi ngâm hạt cho thấy phôi và

phôi nhũ nhỏ, hạt cứng (ảnh 3.1). Lát cắt ngang cho thấy có sự hiển diện của sơ

khởi rễ và sơ khởi chồi (ảnh 3.2). Hạt lúa ở thời điểm bão hòa nước ngoài tự nhiên

cũng như trong in vitro đều trương phồng lên, phôi và phôi nhũ lớn hơn (ảnh 3.3,

3.4).

Khi giải phẫu lát cắt ngang cho thấy có sự kéo dài sơ khởi rễ và sơ khởi chồi

(ảnh 3.5), đặc biệt là sự phân chia mạnh của nhóm tế bào sơ khởi rễ ở đầu chóp rễ

(ảnh 3.6).

Bảng 3.1: Thời điểm bão hòa nước của hạt lúa

Thời gian 0 1 2 3 4 5 6 7 Khối lượng (g) 5,00 ± 0,000a 5,14 ± 0,007b 5,28 ± 0,012c 5,39 ± 0,010d 5,46 ± 0,009e 5,55 ± 0,003f 5,57 ± 0,003f 5,57 ± 0,005f

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

35

Hình 3.1. Thời điểm bão hòa nước của hạt lúa

Ảnh 3.1. Hạt lúa trước khi ngâm nước

36

Ảnh 3.2. Cấu trúc phôi lúa cắt dọc trước khi ngâm nước

1: sơ khởi rễ, 2: sơ khởi chồi

Ảnh 3.3. Hạt lúa sau 5 giờ, khi hạt bão hòa nước ngoài tự nhiên

37

Ảnh 3.4. Hạt lúa sau 5 giờ, khi hạt bão hòa nước trong môi trường MS1/2

Ảnh 3.5. Cấu trúc phôi lúa cắt dọc lúc bão hòa nước (sau 5 giờ ngoài tự nhiên)

1: sơ khởi rễ, 2: sơ khởi chồi, 3: nhóm tế bào sơ khởi rễ phân chia mạnh

38

Ảnh 3.6. Sự kéo dài của sơ khởi rễ sau khi bão hòa nước sau 5 giờ trong môi trường

MS1/2

Mũi tên chỉ nhóm tế bào sơ khởi rễ đang phân chia mạnh

3.1.2. Sự tăng trưởng cây mầm lúa in vitro

Trong bốn môi trường MS1/2, MS1/5, MS1/10, MS (đối chứng) cho thấy hạt

lúa nảy mầm với tỉ lệ cao hơn trên môi trường MS1/2, chiều dài rễ và chiều dài chồi

phát triển tốt hơn trong các môi trường còn lại (bảng 3.2, 3.3).

Khi quan sát hình thái bên ngoài hạt lúa một ngày tuổi cho thấy hạt lúa trên

môi trường MS1/2 đã có mầm lú ra dài hơn (ảnh 3.7, 3.8). Cây mầm lúa trên môi

trường MS1/2 3 ngày tuổi, 5 ngày và 7 ngày tuổi đều phát triển tốt nhất trên cả hai

chỉ tiêu chiều dài rễ và chiều dài chồi. Môi trường MS cây mầm phát triển chậm

nhất (ảnh 3.9, 3.10, 3.11). Quan sát hình thái giải phẫu ở trên mô phân sinh chồi đã

thấy xuất hiện các sơ khởi lá (ảnh 3.12).

Môi trường MS1/2 được chọn để thực hiện các nghiệm thức tiếp theo.

39

Bảng 3.2. Sự tăng trưởng chiều dài rễ của cây mầm lúa theo thời gian trên các

môi trường MS khác nhau

Chiều dài rễ (cm) theo thời gian Nghiệm thức

MS1/2

MS1/5

MS1/10

3 ngày 2,70 ± 0,12c 2,27 ± 0,07b 2,13 ± 0,09a 1,97 ± 0,09a 5 ngày 6,58 ± 0,01c 6,05 ± 0,03b 5,80 ± 0,06a 5,67 ± 0,09a 7 ngày 7,35 ± 0,08d 6,89 ± 0,05c 6,58 ± 0,04b 6,25 ± 0,08a MS (đối chứng)

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

Bảng 3.3. Sự tăng trưởng chiều dài chồi của cây mầm lúa theo thời gian trên

các môi trường MS khác nhau

Chiều dài chồi (cm) theo thời gian Nghiệm thức

MS1/2

MS1/5

MS1/10

MS (đối chứng) 3 ngày 0,93 ± 0,01c 0,87 ± 0,02b 0,81 ± 0,01a 0,73 ± 0,02a 5 ngày 5,71 ± 0,05c 5,47 ± 0,03b 5,93 ± 0,06b 5,20 ± 0,06a 7 ngày 14,67 ± 0,14d 12,70 ± 0,08bc 12,48± 0,04ab 12,23 ± 0,04a

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

40

Ảnh 3.7. Hạt lúa in vitro sau 1 ngày nuôi cấy trên các môi trường

A: MS1/2, B: MS1/5, C: MS1/10, D: MS

Ảnh 3.8. Phôi lúa in vitro sau 1 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2

41

Ảnh 3.9. Cây lúa in vitro sau 3 ngày nuôi cấy trên các môi trường

A: MS1/2, B: MS1/5, C: MS1/10, D: MS

Ảnh 3.10. Cây lúa in vitro sau 5 ngày nuôi cấy trên các môi trường

A: MS1/2, B: MS1/5, C: MS1/10, D: MS

42

Ảnh 3.11. Cây lúa in vitro sau 7 ngày nuôi cấy trên các môi trường

A: MS1/2, B: MS1/5, C: MS1/10, D: MS

Ảnh 3.12. Mô phân sinh chồi lúa in vitro 1 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2

43

3.1.3. Sự tăng trưởng của cây mầm lúa trong môi trường MS1/2 với các nồng

độ đường khác nhau

3.1.3.1. Với nồng độ saccharose khác nhau

Sau 3 ngày nuôi cấy đã có sự khác biệt cơ bản giữa các môi trường có nồng

độ saccharose cao (từ 1% tới 3%) so với nồng độ saccharose thấp (< 1% ), chiều dài

rễ cây mầm lúa phát triển mạnh, nhanh hơn chồi (ảnh 3.13). Chiều dài rễ có sự khác

biệt rõ ở môi trường MS1/2 với nồng độ đường thấp dưới 1,5% so với đối chứng

(bảng 3.4). Cây mầm lúa đạt 7 ngày có sự khác biệt rõ ràng từ môi trường có nồng

độ saccharose (< 2%) so với đối chứng (bảng 3.5). Chiều dài chồi tăng nhanh ở

ngày thứ 5 và ngày thứ 7, trong khi đó tốc độ tăng trưởng của rễ từ ngày thứ 5 đến

ngày thứ 7 không đáng kể.

Trên môi trường MS1/2 bổ sung nồng độ saccharose 3% cây mầm phát triển

tốt nhất, môi trường MS1/2 không có sacccharose cây mầm phát triển chậm nhất

(ảnh 3.14, 3.15).

Môi trường MS1/2 có bổ sung saccharose 3% được lựa chọn để thực hiện

các nghiệm thức tiếp theo.

Bảng 3.4. Chiều dài rễ của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có nồng độ

saccharose thay đổi

Chiều dài rễ (cm) theo thời gian Nồng độ

saccharose (%)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3 (ĐC) 3 ngày 2,43 ± 0,02d 2,47 ± 0,01c 2,53 ± 0,02b 2,56 ± 0,02ab 2,64 ± 0,01a 2,68 ± 0,01a 2,70 ± 0,01a 5 ngày 5,03 ± 0,03d 5,30 ± 0,15c 5,60 ± 0,09b 5,83 ± 0,09ab 6,37 ± 0,06a 6,52 ± 0,02a 6,58 ± 0,01a 7 ngày 5,77 ± 0,01d 5,87 ± 0,15d 6,33 ± 0,09c 6,65 ± 0,09b 7,20 ± 0,03a 7,28 ± 0,02a 7,36 ± 0,02a

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

44

Bảng 3.5. Chiều dài chồi của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có nồng độ

saccharose thay đổi

Chiều dài chồi (cm) theo thời gian Nồng độ

saccharose (%)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3 (ĐC) 3 ngày 0,81 ± 0,01e 0,82 ± 0,01d 0,86 ± 0,03c 0,87 ± 0,02b 0,90 ± 0,01a 0,92 ± 0,01a 0,93 ± 0,01a 5 ngày 4,80 ± 0,06e 4,90 ± 0,03d 5,02 ± 0,02cd 5,10 ± 0,06c 5,27 ± 0,03b 5,59 ± 0,05a 5,71 ± 0,01a 7 ngày 10,23 ± 0,15f 11,57 ± 0,03e 12,67 ± 0,17d 13,40 ± 0,10c 13,97 ± 0,02b 14,53 ± 0,03a 14,67 ± 0,03a

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

Ảnh 3.13. Cây mầm lúa in vitro sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2 có hoặc

không có bổ sung saccharose

A. saccharose 3%, B. saccharose 0%

45

Ảnh 3.14. Cây mầm lúa in vitro sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2 có bổ

sung saccharose với nồng độ khác nhau

Từ trái qua phải: A: Sac 3%, B: Sac 2,5%, C: Sac 2%, D: Sac 1,5%, E: Sac

1%, F: Sac 0,5%, G: Sac 0% (loại Sac ra khỏi môi trường)

Ảnh 3.15. Cây mầm lúa in vitro sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2 có hoặc

không có bổ sung saccharose

A. saccharose 3%, B. saccharose 0%

46

3.1.3.2 Với nồng độ mannitol khác nhau

Sau 3 ngày nuôi cấy, chiều dài rễ có sự khác biệt giữa các môi trường MS1/2

có bổ sung mannitol (1% đến 3%) so với đối chứng (ảnh 3.16, 3.17). Môi trường

MS 1/2 có bổ sung mannitol ( < 1%) không có sự khác biệt so với đối chứng. Khi

bổ sung mannitol 1% đã có sự tác động khác biệt trên chiều dài rễ (bảng 3.6), trong

khi phải bổ sung mannitol cao hơn 1,5%, chiều dài chồi mới có sự tăng trưởng

khác biệt (bảng 3.7).

Sau 5 ngày, 7 ngày nuôi cấy sự tăng trưởng của cây mầm rõ ràng hơn. Ở môi

trường MS1/2 có bổ sung mannitol 1% không còn thấy sự khác biệt gì so với đối

chứng mà phải dùng từ 1,5% đến 2% trở lên mới thấy tác dụng (ảnh 3.18).

Quan sát hình thái giải phẫu mô phân sinh chồi 5 ngày tuổi trên môi trường

MS1/2 (đối chứng) đã hình thành các sơ khởi rễ nhánh ở vòng rễ thứ hai và kéo dài

rễ nhánh (ảnh 3.19, 3.20). Trên môi trường MS1/2 có bổ sung mannitol 3% các sơ

khởi rễ bên ở vòng rễ thứ hai chưa có hoặc mới hình thành , sự kéo dài rễ bên chậm

hơn (ảnh 3.21, 3.22)

Môi trường MS1/2 bổ sung mannitol 3% cho thấy sự tác động rõ nhất, dễ

quan sát nhất.

47

Bảng 3.6. Chiều dài rễ của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có bổ sung

nồng độ mannitol với các nồng độ khác nhau

Chiều dài rễ (cm) theo thời gian Nồng độ

mannitol (%)

0 (ĐC)

0,5

1

1,5

2

2,5

3 3 ngày 2,70 ± 0,00a 2,69 ± 0,01a 2,61 ± 0,01b 2,60 ± 0,02bc 2,59 ± 0,02bc 2,55 ± 0,03c 2,45 ± 0,03d 5 ngày 6,58 ± 0,01a 6,41 ± 0,31a 6,19 ± 0,01ab 5,80 ± 0,01bc 5,43 ± 0,03c 4,73 ± 0,03d 4,43 ± 0,03d 7 ngày 7,36 ± 0,01a 7,34 ± 0,01a 7,31 ± 0,01a 7,13 ± 0,07b 6,80 ± 0,01c 6,50 ± 0,01d 6,20 ± 0,10e

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

Bảng 3.7. Chiều dài chồi của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có bổ sung

nồng độ mannitol khác nhau

Chiều dài rễ (cm) theo thời gian Nồng độ

mannitol (%)

0 (ĐC)

0,5

1

1,5

2

2,5

3 3 ngày 0,93 ± 0,01a 0,92 ± 0,01a 0,90 ± 0,00ab 0,88 ± 0,01b 0,83 ± 0,01c 0,78 ± 002d 0,76 ± 0,01d 5 ngày 5,71 ± 0,01a 5,63 ± 0,02a 5,47 ± 0,49ab 5,23 ± 0,12b 4,90 ± 0,10b 4,63 ± 0,09c 4,47 ± 0,09d 7 ngày 14,67 ± 0,01a 14,43 ± 0,04a 14,07 ± 0,07a 13,57 ± 0,14b 12,91 ± 0,09c 12,40 ± 0,10d 11,67 ± 0,17d

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

48

Ảnh 3.16. Cây mầm lúa in vitro 3 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2

Ảnh 3.17. Cây mầm lúa in vitro sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2

có bổ sung mannitol 3%

49

Ảnh 3.18. Cây mầm lúa in vitro sau 5 ngày trên môi trường MS1/2 có bổ sung

mannitol có nồng độ tăng dần

Từ trái qua A: Man 0%, B: Man 0,5%, C: Man 1%, D: Man 1,5%, E: Man 2%, F:

Man 2,5%, G: Man 3%

50

Ảnh 3.19. Cấu trúc cắt dọc chồi cây mầm lúa in vitro trong môi trường MS1/2 sau 5

ngày nuôi cấy

1, 2 sơ khởi rễ nhánh

Ảnh 3.20. Sơ khởi rễ nhánh kéo dài của cây mầm lúa in vitro trong môi trường

MS1/2 sau 5 ngày nuôi cấy

Mũi tên chỉ các sơ khởi rễ nhánh đang kéo dài

51

Ảnh 3.21. Cấu trúc cắt dọc chồi cây mầm lúa in vitro trong môi trường MS1/2 có bổ

sung mannitol 3% sau 5 ngày nuôi cấy

Ảnh 3.22.Cấu trúc cắt dọc chồi của cây mầm lúa in vitro trong môi trường MS1/2

có bổ sung mannitol 3% sau 5 ngày nuôi cấy

Mũi tên chỉ sơ khởi rễ nhánh

52

3.1.3.3. Với nồng độ mannitol và saccharose khác nhau

Ở các môi trường giảm nồng độ saccharose, tăng nồng độ mannitol, sự tăng

trưởng của cây mầm lúa giảm dần và giảm mạnh khi xử lí hoàn toàn bằng mannitol

3% mà không có saccharose (bảng 3.8, 3.9).

Sau 3 ngày nuôi cấy ở trên chiều dài rễ có sự khác biệt giữa các môi trường

MS1/2 có bổ sung saccharose (< 1,5%) kết hợp với mannitol (<1,5%) so với đối

chứng (bảng 3.8). Trên chiều dài chồi, nếu tác dụng riêng rẽ thì phải bổ sung

mannitol cao hơn 1,5% mới có sự khác biệt, nhưng nếu kết hợp với saccharose chỉ

cần dùng mannitol 1% đã có sự khác biệt (bảng 3.8, 3.9). Cây mầm lúa 5 ngày tuổi,

7 ngày tuổi trên môi trường MS1/2 bổ sung saccharose 2%, mannitol 1% có sự

khác biệt so với đối chứng (ảnh 3.23).

Môi trường MS1/2 (saccharose 3%) kết hợp mannitol 3% có sự tác động lên

sự tăng trưởng cây mầm lúa đồng thời đảm bảo nguồn năng lượng cho cây phát

triển. Môi trường MS1/2 (saccharose 3%) kết hợp mannitol 3% được dùng để thực

hiện các nghiệm thức tiếp theo.

53

Bảng 3.8. Chiều dài rễ của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có sự kết hợp

saccharose và mannitol với nồng độ khác nhau

Nghiệm thức Chiều dài rễ (cm) theo thời gian

Nồng độ Nồng độ 3 ngày 5 ngày 7 ngày saccharose (%) mannitol (%)

0 3

0,5 2,5

1 2

1,5 1,5

2 1

2,5 0,5

2,70 ± 0,02a 2,69 ± 0,01a 2,67 ± 0,01ab 2,57 ± 0,03bc 2,53 ± 0,01c 2,46 ± 0,02d 2,42 ± 0,02d 6,58 ± 0,01a 6,45 ± 0,03a 6,19 ± 0,02b 5,67 ± 0,09c 5,27 ± 0,03d 4,70 ± 0,06e 4,20 ± 0,06f 7,36 ± 0,03a 7,28 ± 0,01ab 7,16 ± 0,02b 6,63 ± 0,09c 6,33 ± 0,09d 5,76 ± 0,07e 5,57 ± 0,03f 3 0

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

Bảng 3.9. Chiều dài chồi của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 có sự kết

hợp saccharose và mannitol với nồng độ khác nhau

Nghiệm thức Chiều dài chồi (cm) theo thời gian

Nồng độ Nồng độ 3 ngày 5 ngày 7 ngày saccharose (%) mannitol (%)

0 3

0,5 2,5

1 2

1,5 1,5

2 1

2,5 0,5

0,93 ± 0,01a 0,91 ± 0,01a 0,89 ± 0,01b 0,86 ± 0,05c 0,84 ± 0,04d 0,80 ± 0,03e 0,75 ± 0,02f 14,61 ± 0,17a 5,71 ± 0,02a 14,50 ± 0,04a 5,65 ± 0,01a 5,26 ± 0,04b 13,85 ± 0,03b 13,13 ± 0,07c 5,05 ± 0,03c 4,79 ± 0,06d 12,50 ± 0,02d 11,23 ± 0,15e 4,36 ± 0,03e 10,69 ± 0,11f 4,12 ± 0,04f 3 0

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

54

Ảnh 3.23. Cây mầm lúa in vitro sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MS1/2 bổ

sung saccharose và mannitol kết hợp với nồng độ khác nhau

Từ trái qua A: Sac 3% (ĐC); B: Sac 2,5%; C: Sac 2%; D: Sac 1,5%; E: Sac 1%; F:

Sac 0,5%; G: Sac 0% (mannitol 3%)

55

3.1.4. Sự tăng trưởng rễ nhánh cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 bổ sung

saccharose riêng rẽ hoặc kết hợp

Sau 3 ngày nuôi cấy, cây mầm lúa trên cả 3 môi trường đều chưa xuất hiện rễ

nhánh. Sau 5 ngày, 7 ngày, cây mầm lúa trên cả ba môi trường đều xuất hiện rễ

nhánh (bảng 3.10).

Quan sát số rễ nhánh, ở ngày 5 và ngày ngày 7 hạt lúa trên môi trường

MS1/2 có bổ sung mannitol 3% cho nhiều rễ nhánh hơn so với hai môi trường còn

lại. Trên môi trường MS1/2 không có saccharose và có bổ sung mannitol 3% không

có sự khác biệt so với đối chứng.

Quan sát chiều dài rễ nhánh, ở ngày 5, cây mầm lúa trên môi trường MS1/2

(đối chứng) có rễ dài hơn rễ cây mầm lúa của hai môi trường còn lại. Ở ngày thứ 7,

chiều dài rễ nhánh của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 (loại saccharose) bổ

sung mannitol 3% ngắn nhất.

Bảng 3.10. Số rễ nhánh và kích thước rễ nhánh của cây mầm lúa trên các môi

trường có hoặc không có bổ sung mannitol và sacharose với nồng độ khác

nhau

Thời gian Nghiệm thức

5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày

Số rễ nhánh Chiều dài rễ nhánh (cm) Nồng độ saccharose (%) Nồng độ mannitol (%)

3 (ĐC) 0 4,03 ± 0,15c

0 3

3 3 2,56 ± 0,11a 4,62 ± 0,16a 0,86 ± 0,02c 2,64 ± 0,16ab 5,05 ± 0,1ab 0,66 ± 0,05b 5,56 ± 0,39b 0,74 ± 0,02a 3,05 ± 0,13b 3,37 ± 0,10b 3,57 ± 0,15a

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

3.1.5. Thời gian bị stress của cây mầm lúa

Xử lí với mannitol 3% trong 24 giờ rồi đưa ra môi trường MS1/2. Kết quả

sau 3 ngày cho thấy, cây mầm lúa phát triển bình thường thể hiện qua sự tăng

trưởng chiều dài rễ và chiều dài chồi không có sự khác biệt so với đối chứng. Xử lí

56

hạt lúa với mannitol 3% trong 48 giờ, mới chuyển qua môi trường MS1/2, cây mầm

lúa phát triển chậm hơn, chiều dài rễ và chiều dài chồi ngắn hơn cây đối chứng. Xử

lí hạt lúa với mannitol 3% trong 72 giờ rồi đưa ra môi trường MS1/2, cây mầm lúa

phát triển chậm nhất thể hiện qua chiều dài rễ và chiều dài chồi ngắn nhất.

Hạt lúa nuôi cấy trong môi trường MS1/2 sau 24 giờ chuyển qua mannitol

3%, kết quả cho thấy cây mầm lúa phát triển chậm nhất. Chiều dài rễ và chiều dài

chồi của cây mầm lúa đều thấp hơn cây đối chứng. Hạt lúa nuôi cấy trong môi

trường MS1/2 sau 48 giờ chuyển qua mannitol 3% và hạt lúa nuôi cấy trong môi

trường MS1/2 sau 72 giờ chuyển qua mannitol 3% không thấy sự thay đổi rõ rệt của

cây mầm lúa so với cây đối chứng (bảng 3.11).

Bảng 3.11. Thời gian bị stress của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 bổ sung

mannitol 3%

Nghiệm thức MS1/2 (ĐC) 24 + ĐC 48 + ĐC 72 + ĐC ĐC (24) + Man3% ĐC (48) + Man% ĐC (72) + Man% Chiều dài rễ (cm) 3,08 ± 0,06a 2,99 ± 0,01a 2,78 ± 0,04b 2,58 ± 0,04c 2,65 ± 0,03b 2,88 ± 0,03a 3,05 ± 0,12a Chiều dài chồi (cm) 1,48 ± 0,04a 1,42 ± 0,04a 1,21 ± 0,03b 1,14 ± 0,02c 1,25 ± 0,06b 1,43 ± 0,03a 1,47 ± 0,07a

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

57

3.1.6. Trọng lượng tươi, trọng lượng khô của cây mầm lúa sau 3 ngày nuôi cấy

trên các môi trường cảm ứng mannitol 3% với thời gian khác nhau

Trọng lượng tươi cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 (đối chứng) cao nhất.

Trọng lượng tươi của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 bổ sung mannitol 3%

trong 24 giờ chuyển qua môi trường MS1/2 và cây mầm trồng trên môi trường

MS1/2 trong 48 giờ và 72 giờ chuyển qua môi trường MS1/2 bổ sung mannitol 3%

không có sự khác biệt so với đối chứng (bảng 3.12).

Khi xử lí mannitol 3% trong 48 giờ sau đó chuyển qua MS1/2, trọng lượng

tươi cây mầm giảm. Xử lí cây mầm lúa với mannitol 3% trong 72 giờ sau đó chuyển

qua MS1/2, trọng lượng tươi cây mầm thấp nhất.

Trọng lượng khô cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 (đối chứng) cao nhất.

Cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 bổ sung mannitol 3% trong 24 giờ hoặc 48

giờ sau đó đưa qua môi trường MS1/2, trọng lượng khô không có sự khác biệt so

với đối chứng (bảng 3.13).

Khi xử lí cây mầm lúa với mannitol 3% trong 72 giờ mới chuyển qua MS1/2

và cây mầm lúa trồng trên môi trường MS1/2 sau đó chuyển qua môi trường MS1/2

bổ sung mannitol 3% cho thấy trọng lượng khô thấp cây mầm thấp nhất.

58

Bảng 3.12. Trọng lượng tươi của cây mầm lúa sau 3 ngày nuôi cấy trên các môi

trường cảm ứng mannitol 3% với các thời gian khác nhau

Nghiệm thức MS1/2 (ĐC) 24 + ĐC 48 + ĐC 72 + ĐC ĐC (24) ĐC (48) ĐC (72) Trọng lượng tươi (g) 0,375 ± 0,02a 0,363 ± 0,02a 0,350 ± 0,01b 0,335 ± 0,01c 0,340 ± 0,025c 0,358 ± 0,03ab 0,370 ± 0,01a

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

Bảng 3.13. Trọng lượng khô của cây mầm lúa sau 3 ngày nuôi cấy trên các môi

trường cảm ứng mannitol 3% với thời gian khác nhau

Nghiệm thức MS1/2 (ĐC) 24 + ĐC 48 + ĐC 72 + ĐC ĐC (24) ĐC (48) ĐC (72) Trọng lượng khô (g) 0,215 ± 0,012a 0,212± 0,015a 0,209 ± 0,013b 0,204 ± 0,016b 0,203 ± 0,021b 0,210 ± 0,030a 0,214 ± 0,010a

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

3.1.7. Cường độ hô hấp của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 và MS1/2 bổ

sung mannitol 3% với các thời gian khác nhau

Cường độ hô hấp của cây mầm lúa trên hai môi trường MS1/2 và MS1/2 bổ

sung mannitol 3% tăng dần theo thời gian. Sau 5 giờ trên môi trường MS1/2, hạt đạt

trạng thái bão hòa nước (bảng 3.1). Tại thời điểm này cường đồ hô hấp thấp nhất so

với các môi trường xử lý khác nhau. Ở trên cả hai môi trường MS1/2 và MS1/2 bổ

sung mannitol 3% trong 5 giờ, 24 giờ không có gì khác nhau (bảng 3.14).

59

Cường độ hô hấp của cây mầm lúa khi xử lí mannitol 3% trong 48 giờ cao

hơn đối chứng nhưng thấp hơn cây trên môi trường MS1/2 nuôi cấy cùng thời gian.

Cây mầm lúa xử lí 72 giờ trên cả hai môi trường đếu cao hơn các môi trường xử lý

còn lại tuy nhiên trên môi trường MS1/2 bổ sung mannitol 3% có cường độ hô hấp

thấp hơn nhiều so với cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 cùng thời gian (hình

3.2).

Bảng 3. 14. Cường độ hô hấp của cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 và

MS1/2 bổ sung mannitol 3% với các thời gian khác nhau

Thời gian (giờ) Cường độ hô hấp µlO2/g TLT/giờ

5 24 48 72 MS1/2 5,25 ± 0,19a (ĐC) 11,67 ± 0,19b 14,63 ± 0,02d 19,27 ± 0,20f MS1/2 bổ sung mannitol 3% 5,12 ± 0,06a 11,38 ± 0,17b 13,02 ± 0,19c 15,39 ± 0,32e

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

Hình 3.2. Cường độ hô hấp ở trên hai trường MS1/2 và MS1/2 bổ sung mannitol

3% với các thời gian khác nhau

60

3.1.8. Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh của cây mầm

lúa

Ở trong môi trường MS1/2 không hoặc có bổ sung mannitol 3% sau 5 giờ

cho thấy hàm lượng của các chất kích thích tăng trưởng thấp nhất ngược với hàm

lượng AAB tăng cao. Hàm lượng các chất kích thích trưởng nội sinh của cây mầm

lúa tăng dần ở trên các môi trường qua thời gian đồng thời AAB giảm dần (bảng

3.15).

Khi xử lí cây mầm lúa 48 giờ với mannitol 3%, hàm lượng các chất kích

thích tăng trưởng không tăng so với cây mầm 24 giờ không xử lí mannitol, hàm

lượng AAB giảm không đáng kể. Trong khi cây mầm lúa 48 giờ, 72 giờ trên môi

trường MS1/2, hàm lượng các chất kích thích tăng trưởng tăng mạnh, AAB giảm

nhanh (bảng 3.15). AAB trong cây mầm lúa bị xử lí 72 giờ với mannitol 3% không

có xu hướng giảm so với cây xử lí 48 giờ, đồng thời hàm lượng các chất AIA, GA3

không tăng.

Cây mầm lúa xử lý mannitol 48 giờ sau đó chuyển qua môi trường MS1/2

được dùng để trồng ngoài vườn ươm.

61

Bảng 3.15. Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh của cây

mầm lúa trong môi trường MS1/2 không hoặc có bổ sung mannitol ở các thời

gian khác nhau

Nghiệm thức Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật (mg/l)

MS1/2 bổ Thời sung gian AIA ZEA AAB GA3 mannitol (giờ) (%)

0(ĐC) 5 0,12 ± 0,02a 0,07 ± 0,03a 1,05 ± 0,10a 0,53 ± 0,01a

0 24 0,17 ± 0,02b 0,22 ± 0,05b 1,32 ± 0,09ab 0,22 ± 0,02bc

3 48 0,21 ± 0,03b 0,24 ± 0,02b 1,58 ± 0,16b 0,26 ± 0,01b

0 48 0,32 ± 0,01cd 0,54 ± 0,02d 3,71 ± 0,12c 0,13 ± 0,01cd

3 72 0.20 ± 0,01b 0.48 ± 0,02c 1,60 ± 0,06b 0,25 ± 0,01b

0 72 0,36 ± 0,02d 0,62 ± 0,03e 4,20 ± 0,15c 0.09 ± 0,00d

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

3.1.9. Đưa cây in vitro từ hai môi trường MS1/2 và MS1/2 có bổ sung mannitol

3% trong 48 giờ ra vườn ươm

Sau 7 ngày nuôi cấy cây được đưa ra vườn ươm và được theo dõi sau 7 ngày

cho thấy, khi chuyển ra đất ướt cây trong môi trường MS1/2 phát triển tốt nhất

(bảng 3.16). Cây trồng trên đất ướt (ảnh 3.24) phát triển nhanh hơn cây trồng trên

đất khô (ảnh 3.25). Khi trồng trên đất ướt, cây lúa trên môi trường MS1/2 có số rễ,

số lá nhiều hơn; chiều dài rễ, chiều dài lá dài hơn cây xử lí mannitol 3% trong 48

giờ (ảnh 3.26).

62

Khi trồng trên đất khô cây lúa trong môi trường MS1/2 phát triển chậm hơn

cây đã cảm ứng với mannitol 3% trong 48 giờ, có kích thước lá và thân dài hơn cây

không cảm ứng trước (ảnh 3.27), có bộ rễ phát triển dài hơn (ảnh 3.28).

Bảng 3.16. Sự phát triển của cây mầm in vitro từ hai môi trường MS1/2 và

MS1/2 có bổ sung mannitol 3% trong 48 giờ ngoài vườn ươm

Chỉ tiêu theo dõi Nghiệm thức

MS1/2 bổ

Loại sung Chiều dài Chiều dài Chiều dài Số rễ Số lá đất mannitol rễ (cm) lá (cm) thân (cm)

(%)

0 6,15 ± 0,02a 3,35 ± 0,43a 2,33 ± 0,00a 12,75 ± 0,38a 12,65 ± 0,21a I

3 5,85 ± 0,05b 3,03 ± 0,25b 2,00 ± 0,00b 11,25 ± 0,07b 10,86 ± 0,35b

0 4,25 ± 0,15d 2,57 ± 0,09d 1,33 ± 0,05d 6,67 ± 0,05d 7,45 ± 0,17d II

3 4,85 ± 0,25c 2,86 ± 0,15c 1,67 ± 0,07c 7,42 ± 0,12c 8,64 ± 0,46c

Các giá trị trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý

nghĩa ở mức p = 0,05

Ghi chú:

I: Đất ướt

II: Đất khô

63

Ảnh 3.24. Cây lúa in vitro được chuyển ra môi trường đất ướt sau 7 ngày

Ảnh 3.25. Cây lúa in vitro được chuyển ra môi trường đất khô sau 7 ngày

64

Ảnh 3.26. Cây lúa in vitro được chuyển ra môi trường đất ướt sau 7 ngày

A: Cây lúa trên MS1/2 được chuyển ra môi trường đất ướt

B: Cây lúa trên MS1/2 bổ sung mannitol 3% được chuyển ra môi trường đất ướt

Ảnh 3.27. Cây mầm lúa in vitro được chuyển ra môi trường đất khô sau 7 ngày

A: Cây lúa trên MS1/2 bổ sung mannitol 3% được chuyển ra môi trường đất khô

B: Cây lúa trên MS1/2 được chuyển ra môi trường đất khô

65

Ảnh 3.28. Rễ cây lúa trồng ngoài tự nhiên trên môi trường đất khô sau 7 ngày

A: Rễ cây lúa trên MS1/2 bổ sung mannitol 3% được chuyển ra môi trường đất khô

B: Rễ cây lúa trên MS1/2 được chuyển ra môi trường đất khô

66

3.2. Thảo luận

Sự tăng trưởng in vitro của cây mầm lúa

Trong giai đoạn đầu của quá trình nảy mầm, hạt lúa hút nước mạnh để đạt

đến điểm bão hòa nước (từ 0 đến 5 giờ). Trong giai đoạn này, hạt chưa có sự biến

đổi nhiều về hình thái tuy nhiên hạt phồng lên do hút nước nhanh và tăng trọng

lượng tươi (bảng 3.1, ảnh 3.4). Sự thu nước xảy ra trước hết nhờ thế nước của hạt

thấp, sau đó nhờ lực thẩm thấu khi các không bào phát triển (Bùi Trang Việt, 2002).

Sự thu nước kèm theo sự phục hồi ty thể đẫn đến gia tăng hô hấp và các biểu hiện

của sự tái lập hoạt động biến dưỡng (Bewley, 1997). Ở giai đoạn bão hòa nước, hạt

không thu thêm nước, trọng lượng tươi không thay đổi (bảng 3.1), nhưng cường độ

hô hấp tăng mạnh (bảng 3.14), các phản ứng biến dưỡng bắt đầu, các chất dự trữ bị

thủy giải, bắt đầu có sự kéo dài sơ khởi rễ và sơ khởi chồi (ảnh 3.5, 3.6). Giai đoạn

hạt 1 đến 3 ngày tuổi là giai đoạn tăng trưởng mạnh, thể hiện qua sự tăng nhanh

chiều dài, chiều rộng, trọng lượng tươi, trọng lượng khô và cường độ hô hấp của

hạt, đồng thời phôi cũng gia tăng kích thước và hình thành cơ quan mới (ảnh 3.1,

hình 3.1). Mô phân sinh ngọn chồi tăng rộng và nhô cao (ảnh 3.12) thể hiện ở các

cơ quan phôi đang tăng trưởng mạnh. Trong quá trình nảy mầm của hạt, gibberellin

tăng lên đáng kể (bảng 3.15). Hai chức năng chính của gibberellin trong sự nảy

mầm của hạt là tăng khả năng tăng trưởng phôi và cảm ứng các hydrolase phân hủy

vách tế bào, làm suy giảm nội nhũ, phá vỡ các mô xung quanh rễ mầm (Kucera và

cộng sự, 2005). Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào ở mô phân sinh ngọn chồi

(Pirzad et al, 2011).

Cây mầm lúa trên môi trường MS1/2 sinh trưởng tốt hơn và có sự khác biệt

rõ rệt so với các môi trường còn lại (bảng 3.2, 3.3). Môi trường MS có hàm lượng

khoáng đa lượng quá cao, trong khi môi trường MS1/5 và MS1/10 lại quá thấp

không đủ cho sự sinh trưởng và phát triển của cây mầm lúa. Đối với hạt lúa giai

đoạn đầu nảy mầm, không cần quá nhiều khoáng mà cần nhiều đường, vitamin, và

đặc biệt là một lượng khoáng chất phù hợp cho sự phát triển của cây mầm lúa

(Nguyễn Văn Luật, 2009). Môi trường MS1/2 phù hợp với sự tăng trưởng in vitro

67

của cây mầm lúa (Bùi Văn Lệ và Quách Diễm Phương, 2007). Ở ngày 5, Chiều dài

rễ khác biệt rõ ràng ở môi trường MS1/2 với nồng độ đường thấp dưới 1 % (bảng

3.4). Đặc biệt khi cây mầm lúa đạt 7 ngày, có sự khác biệt rõ ràng khi nuôi cấy cây

trên môi trường MS1/2 có nồng độ saccharose dưới 2% (bảng 3.5). Các sơ khởi rễ ở

vòng rễ thứ hai xuất hiện và kéo dài (ảnh 3.19, 3.20). Đường có chức năng cung cấp

nguồn năng lượng quan trọng cho cây mầm.

Sự tăng trưởng theo chiều dài của rễ được thực hiện nhờ mô phân sinh ngọn

rễ. Trong vùng kéo dài, các tế bào dẫn xuất từ mô phân sinh ngọn rễ vừa kéo dài

vừa phân hóa. Sau khi rễ mầm lú ra ngoài, cytokinin giúp sự tích lũy enzyme

amylase, và đóng vai trò chủ đạo trong việc phân chia tế bào và kéo dài rễ mầm nên

hàm lượng tăng nhanh (bảng 3.15). Sự sinh tổng hợp của auxin ở mô phân sinh

ngọn chồi cảm ứng sự khởi phát các sơ khởi và quyết định sự tăng trưởng của các

sơ khởi cơ quan. Auxin tăng nhanh từ khi hạt bão hòa nước (bảng 3.15), kích thích

sự nảy mầm diễn ra nhanh chóng, giúp rễ mầm kéo dài ra trước (ảnh 3.5, 3.6). Điều

này do auxin có tính hữu cực (Bùi Trang Việt, 2000), kích thích mạnh sự kéo dài

của chồi ngọn nên trong quá trình nảy mầm, hàm lượng auxin tăng lên nhanh

chóng. Sự hiện diện của auxin ở nồng độ cao giúp tế bào vùng mô phân sinh phân

chia mạnh để cung cấp một lượng lớn tế bào cho sự hình thành nhu mô vỏ, nhu mô

lõi, các bó mạch về sau, và sự di chuyển hữu cực của auxin sẽ giúp các tế bào vùng

mô phân sinh ngọn biệt hóa, hình thành sơ khởi lá, hình thành mô mạch (Jenik và

Barton, 2005).

Sự tăng trưởng in vitro của cây mầm lúa trong điều kiện stress nước

Sau 3 ngày nuôi cấy, chiều dài rễ có sự khác biệt giữa các môi trường MS1/2

có bổ sung mannitol (> 1%), tuy nhiên ở môi trường MS1/2 có bổ sung mannitol (<

1%) không có sự khác biệt. Bổ sung mannitol cao hơn 1,5% mới có sự khác biệt về

chiều dài chồi của cây mầm lúa, trong khi chỉ cần 1% đã có sự tác động lên rễ. Như

vậy, khi bị stress nước, rễ bị tác động trước. Điều này sẽ ảnh hưởng đến khả năng

vận chuyển các chất từ môi trường vào cây thông qua rễ và lá cũng bị ảnh hưởng

(Neuman, 1993).

68

Khi bị stress nước, khả năng hình thành các sơ khởi rễ nhánh, cũng như sự

kéo dài rễ nhánh chậm hơn (ảnh 3.21, 3.22). Trên môi trường bổ sung mannitol, sự

ức chế kéo dài rễ bên một phần do hoạt động của AAB (Xiong et al, 2006). Khi xử

lí stress thì trọng lượng tươi giảm thấp, sự tăng trưởng chồi và kéo dài rễ đều chậm

hơn bình thường do thay đổi áp lực thẩm thấu nước (Bahaji et al, 2002). Ở 5 và 7

ngày sau khi nuôi cấy, phải dùng mannitol 1,5% mới có tác dụng ở cả rễ và chồi

(bảng 3.6 và 3.7). Điều này cho thấy một sự thích ứng của thực vật, vì khi cây quen

dần với stress nước do xử lý mannitol (để hạ thấp thế nước của môi trường), nếu

muốn gây ức chế sau đó, ta phải tăng nồng độ mannitol (Chaum et al, 2010). Nồng

độ đường tổng số trong môi trường là 6% (3% saccharose và 3% mannitol) đảm bảo

cho việc nghiên cứu stress, vừa đảm bảo cung cấp đủ nguồn năng lượng cho cây

mầm phát triển. Saccharose không chỉ là nguồn cung cấp hydrat cacbon dồi dào mà

còn là yếu tố gây stress thẩm thấu (Bùi Văn Lệ và Nguyễn Ngọc Hồng, 2006).

Trehalose (disaccharide) là một đường không khử (nonreducing sugar) liên kết hai

đơn vị glucose, liên quan trong sự điều hòa thẩm thấu, giúp nhiều vi khuẩn và nấm

kháng stress. AtTRE1 mã hóa trehalase, enzyme thủy giải trehalose thành glucose ở

Arabidopsis. Sự biểu hiện AtTRE1 làm giảm hàm lượng trehalose, cải tiến sự chống

chịu stress khô hạn (Van Houtte et al, 2013).

Khi bị thiếu nước, các màng tế bào bị thay đổi và giảm tính bền vững, có sự

lắng đọng tế bào chất. Để hạn chế tác hại của stress nước, cần ngăn ngừa sự tích tụ

này, điều chỉnh quá trình thẩm thấu bằng cách tăng nồng độ proline và tổng số

đường hòa tan (Pirzad và Shakiba, 2011).

Khi bị stress nước, cây tích lũy protein LEA (Cuming, 1999). Protein LED

chống lại sự mất nước bằng việc tham gia bảo vệ màng tế bào, cô lập ion và ổn định

pH tế bào (Trần Thị Phương Liên, 2010). Protein LEA của lúa nước được chia

thành 7 nhóm: dehydrin, LEA1, LEA2, LEA3, LEA4, LEA5 và protein hạt tiềm

sinh (Trần Thị Phương Liên, 2010). Cùng với các protein LEA, các kênh protein

aquaporin góp phần quan trọng giúp sự vận chuyển nước qua màng theo gradient

thế nước (Maurel và Chrispeels, 2001).

69

Sự thay đổi cường độ hô hấp và hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật

của cây mầm lúa trong điều kiện stress nước

Khi xử lí mannitol 3%, cây mầm tăng trưởng chậm hơn, các tế bào phân hóa

chậm hơn nên khả năng hô hấp thấp hơn (bảng 3.6). Hô hấp có vai trò phóng thích

năng lượng chứa trong các chất biến dưỡng và cung cấp vật liệu cần thiết cho các

phản ứng tổng hợp (Bùi Trang Việt, 2002). Do đó trong cơ thể thực vật cấp cao,

vùng sinh mô hô hấp rất mạnh và rất nhiều hydrate cacbon được oxy hóa, cường độ

hô hấp của tế bào đang phân chia cao hơn ở tế bào đã phân hóa rất nhiều lần (Mai

Trần Ngọc Tiếng, 2001).

Trong sự nảy mầm của hạt có tương quan giữa hoạt động catalase và

peroxidase với hô hấp. Hoạt động của các enzyme này có thể được sử dụng như chỉ

số về sự trao đổi chất, và do đó có thể được coi như là một phần của cơ chế hô hấp

của cây lúa (Paul và Mukherji, 1972). Sinh hóa thay đổi, chẳng hạn như giảm hoạt

động RuBisCO (ribulose-1,5-bisphosphatase carboxyase / oxygenase), giảm quang

hiệu quả, tăng cường tích tụ các chất làm giảm stress (proline, glycinebetaine,

polyamine, glutathione, đường, rượu đường và α-tocolpherol), tăng enzyme chống

oxy hóa (superoxide dismutase, catalase, peroxidase và glutathione reductase) nói

chung là các phản ứng với tình trạng thiếu nước (Chaum et al, 2010).

Khi bị khô hạn, cường độ hô hấp của cây mầm giảm, nhất là khi xử lí quá 72

giờ, và cây mầm tăng trưởng chậm, trọng lượng tươi và trọng lượng khô đều giảm

(bảng 3.12 và 3.13), nồng độ auxin, gibberellin và cytokinin giảm, trong khi acid

abscicic và ethylene tăng (bảng 3.15). AAB thường được tổng hợp khi cây gặp điều

kiện không thuận lợi như bị thương, thiếu nước… nhằm chống lại những điều kiện

bất lợi của môi trường. Hàm lượng AAB tăng kéo theo sự đóng lỗ khí, làm giảm

cường độ thoát hơi nước, giúp sự tổng hợp các protein và acid amin có tác dụng

tăng khả năng giữ nước của tế bào trong điều kiện khô hạn. Proline là một nhân tố

thẩm thấu (osmotic factor), và stress nước nhẹ làm tăng hàm lượng proline trong

cây. Có sự liên hệ chặt chẽ giữa sự tích lũy proline và acid abscisic trong stress khô

hạn (drought stress). Sự tích tụ các protein mới và sự biểu hiện các gene mã hóa các

70

enzyme liên quan trong các phản ứng tổng hợp giúp tránh stress thẩm thấu (osmotic

stress) đã được nghiên cứu. Số lượng kênh dẫn nước aquaporin trong màng tế bào

điều hòa chức năng thấm nước của màng và làm tăng tính thấm nước dưới các điều

kiện môi trường như hàm lượng nước thấp. Ở cây cà chua, proline và acid ascorbic

(chất kháng oxid hóa) gia tăng để kháng stress khô hạn (Ghorbanli et al, 2013).

Acid abscisic và ethylene liên quan tới nhiều quá trình sống của thực vật,

bao gồm điều hòa sự biểu hiện gene trong các đáp ứng thích nghi với các điều kiện

stress, không sinh học cũng như sinh học (De Vleesschauwer et al, 2010)

Khả năng “huấn luyện” làm tăng tính chống chịu của cây mầm lúa trong vườn

ươm

Cây mầm lúa chưa qua cảm ứng khi trồng trên môi trường khô hạn xuất hiện

lá héo sớm hơn có màu sắc lá nhạt hơn so cới cây đã được cảm ứng (ảnh 3.27). Các

stress sinh học và không sinh học giới hạn nghiêm trọng năng suất cây trồng. Một

kiểu stress được áp dụng trước hay đồng thời với các kiểu stress khác thường ảnh

hưởng tới sự đáp ứng của thực vật với các kiểu stress này. Điều này chứng tỏ sự xen

lẫn (overlap and crosstalk) giữa các con đường truyền tín hiệu đáp ứng với stress

sinh học và không sinh học. Sự xen lẫn này cho phép sự kháng chéo, và có thể liên

quan tới các tương tác hỗ trợ hay đối kháng giữa các hormone liên quan tới stress

như acid salicylic, ethylene, acid jasmonic và acid abscisic như được nghiên cứu ở

lúa (Sharma et al, 2013).

Cây được huấn luyện (cảm ứng) trước trong môi trường stress 48 giờ, sau đó

được trồng trong vườn ươm. Cây được cảm ứng trước, khi đưa ra vườn ươm có khả

năng tăng trưởng tốt hơn, số lá phát triển mạnh hơn và có kích thước dài hơn (bảng

3.16), số rễ nhiều hơn, có kích thước rễ dài hơn so với cây không cảm ứng khi trồng

trên môi trường khô, tưới nước gián đoạn. Khi môi trường bị thiếu nước cây lúa

phát triển bộ rễ dài và có khả năng đâm sâu vào lòng đất (bảng 3.16, ảnh 3.28), rễ

dày và dài cùng với xylem lớn (Fukai, 1995). Sự thích nghi này liên quan đến gene

di truyền ở thực vật. Mọi sinh vật đều sản xuất các HSP (heat-shock proteins) đáp

lại sự tăng nhiệt độ và vài stress khác. Do HSP xuất hiện do các stress khác nhau,

71

nên sự kháng chéo (sự kháng một stress nhờ thực vật thích nghi với một stress khác)

có thể được giải thích qua hoạt động của các protein này. Các HSP thực vật có vai

trò bảo vệ thực vật tránh tổn hại do stress, được phân chia thành các HSP có trọng

lượng phân tử cao và các HSP có trọng lượng phân tử thấp. Chính các HSP có kích

thước nhỏ (sHSPs, small HSPs) được cảm ứng bởi tress nhiệt ở thực vật. Đặt các cây mạ lúa Oryza sativa L. ở nhiệt độ cao (420C) trong 24 giờ làm tăng đáng kể sự

kháng UV-B. Sau xử lý nhiệt, tốc độ sống còn của các tế bào biểu hiện gene

sHSP17.7 cao gấp hai lần tốc độ sống còn của các tế bào đối chứng. Tương tự, các

cây lúa chuyển gene biểu hiện sHSP17.7 mạnh nhất (tăng mạnh sự sản xuất protein

sHSP17.7 ) được chứng minh có tính kháng mạnh với stress UV-B (Murakami et al.

2004).

Khi thiếu nước thực vật sẽ giảm số lá và giảm diện tích lá, làm đóng khí

khẩu. Đáp ứng của khí khẩu với sự mất nước ở lá thay đổi tùy loài, thậm chí giữa

các thứ trong loài. Kích thích sự rụng lá, vì kích thích sự tổng hợp ethylene và tính

nhạy cảm của lá với ethylene. Ở một số loài sự thoát hơi nước giảm tới mức thế

nước của lá được giữ gần như không thay đổi trong khi khô hạn. Khi bị thiếu nước,

hệ thống rễ phát triển và thường có khuynh hướng phát triển sâu hơn vào trong đất

để thu nước (Bùi Trang Việt, 2002). Sự kháng hạn liên quan đến sự phát triển bộ rễ

sâu để lấy nguồn nước và chất dinh dưỡng sâu trong lòng đất (Amelia et al ,2011).

Bộ rễ phát triển rộng ra, đâm sâu xuống (ảnh 3.28), lá cong hơn để hạn chế thoát hơi

nước (Zhang et al, 2009). Như vậy cây được xử lý trước bởi các điều kiện stress

nước thì có thể trở nên chịu hạn so với cây cùng loài. Tập tính này cho thấy các cơ

chế của sự kháng đối với vài stress có những đặc tính chung; mặt khác, sự thích

nghi với stress khô hạn như vậy rất đáng chú ý trong nông nghiệp (Bùi Trang Việt,

2002).

72

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Từ các kết quả ở trên chúng tôi rút ra một số kết luận:

1. Môi trường MS1/2 phù hợp cho việc khảo sát sự tăng trưởng của cây mầm lúa in

vitro.

2. Mannitol 3% gây các biểu hiện stress nước rõ nhất.

3. Trong điều kiện stress nước, cây mầm tăng trưởng chậm hơn, chiều dài rễ và

chiều dài chồi đều thấp hơn so với cây không bị stress.

4. Cường độ hô hấp giảm, nồng độ auxin, gibberellin, cytokinin thấp hơn, trong khi

acid abscisic cao hơn nhiều trong cây mầm bị stress nước.

5. Cây lúa được cảm ứng stress trong thời gian 48 giờ là phù hợp, giúp cây mầm lúa

có khả năng chịu hạn tốt hơn so với những cây chưa được cảm ứng khi đưa ra trồng

ở tự nhiên.

4.2. Đề nghị

Tiếp tục nghiên cứu thêm tác động của các chất gây stress ở lúa với nồng độ

và thời gian xử lí khác nhau để giúp cho cây mầm lúa thích ứng khi đưa ra đồng

ruộng trong điều kiện khắc nghiệt.

73

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu trong nước

1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1995, Ứng dụng công nghệ sinh học trong

cải tiến giống lúa, NXB Nông nghiệp.

2. Võ Văn Chi, 2004, Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học và Kỹ thuật

Hà Nội, t2.

3. Nguyễn Văn Cường, 2011, Nghiên cứu về đa hình AND của một số dòng lúa

tám đột biến bằng kĩ thuật RAPD, NXB Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn,

28-34.

4. Lê Quốc Doanh, Nguyễn Thanh Tuyền, Nguyễn văn Niên, Lê Khải Hoàn, 2011,

Tăng cường năng lực cải tiến nguồn hạt giống và sản xuất lúa để đảm bảo an

toàn lương thực ở vùng đồi núi cao Việt Nam, NXB Nông nghiệp và Phát triển

Nông thôn, 2-10.

5. Nguyễn Ngọc Đệ, 2009, Giáo trình cây lúa, NXB Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí

Minh.

6. Nguyễn Văn Hoan, 2009, Cẩm nang cây lúa, NXB Lao Động Hà Nội.

7. Nguyễn Văn Hoan, 2009, Kỹ thuật thâm canh lúa ở hộ nông dân, NXB Nông

Nghiệp.

8. Phạm Hoàng Hộ, 2003, Cây cỏ Việt Nam, quyển 3. NXB Trẻ.

9. Nguyễn Như Khanh, 2002, Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục.

10. Nguyễn Như Khanh, Cao Phi Bằng, 2008, Sinh lí học thực vật, NXB Giáo Dục.

11. Dương Công Kiên, 2002, Nuôi cấy mô thực vật, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ

Chí Minh.

12. Nguyễn Thị Lang, Phạm Thị Thu Hà, Nguyễn Hữu Hiền, Huỳnh Văn Nghiệp,

Bùi Chí Bửu, 2010, Kết quả phân tích kiểu gen và kiểu hình trên bộ giống lúa

kháng khô hạn tại đồng bằng sông Cửu Long, NXB Bộ Nông nghiệp và Phát

triển Nông thôn, 3-9.

13. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng, 2006, Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng

trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa

74

cạn catharanthus roseus, Tạp chí phát triển KH&CN, Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, ĐHQG-HCM, 59.

14. Nguyễn Văn Luật, 2002, Cây lúa Việt Nam thế kỉ 20, NXB Nông Nghiệp.

15. Nguyễn Văn Luật, 2009, Cây lúa Việt Nam T1, T2, NXB Nông Nghiệp.

16. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006, Công nghệ tế bào, NXB ĐHQG

TP Hồ Chí Minh.

17. Lã Tuấn Nghĩa, 2011, Ứng dụng phương pháp chỉ thị phân tử trong chọn tạo

giống lúa kháng đạo ôn, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, 11-16.

18. Nguyễn Văn Ngưu, 2007, Ngành sản xuất lúa Việt Nam nhìn qua lịch sử, văn

hóa và kỹ thuật, NXB Nông Nghiệp TP.HCM.

19. Huỳnh Thị Diễm Phúc, Trịnh Cẩm Tú, Phan Ngô Hoang, 2011, Sự ra hoa in

vitro của cây dền xanh (Amaranthus viridis L.) trong điều kiện khô hạn do

PEG), Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, ĐH Quốc Gia TP. Hồ Chí

Minh, Số 14: 38-45.

20. Quách Diễm Phương, Bùi Văn Lệ, 2007, Nhân giống in vitro cây bắt ruồi

drosera burmanni vahl để thu nhận một hợp chất quinone có hoạt tính sinh học,

Tạp chí phát triển KH&CN, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM,

T10, 4.

21. Mai Văn Quyền, 2009, Những điều cần biết về trồng lúa xuất khẩu, NXB Nông

Nghiệp.

22. Nguyễn Du Sanh, 2011, Thực tập chuyên ngành Sinh lí thực vật, NXB ĐHQG

TP.Hồ Chí Minh, Trường ĐH Khoc Học Tự Nhiên.

23. Lê Sâm, Nguyễn Đình Vượng, 2009, Thủy nông ở vùng khô hạn, NXB Nông

nghiệp TP.HCM.

24. Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu và ứng

dụng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.

25. Trần Thị Bích Trinh, Phan Ngô Hoang và Bùi Trang Việt, 2000, Nuôi cấy tế

bào lúa (Oryza sativa L.) dòng Bằng Ngọc, tạp chí Phát triển Khoa học và Công

nghệ Đại học Quốc gia TP.HCM, 92-97.

75

26. Lê Thị Trung, 2003, Tìm hiểu và áp dụng chất điều hòa tăng trưởng thực vật để

kiểm soát hiện tượng rụng trái non xoài (Mangisra Indica L.), Trường Đại học

Khoa họcTự Nhiên TP. Hồ Chí Minh.

27. Bùi Trang Việt, 1992, Tìm hiểu hoạt động của các chất điều hòa tăng trưởng

thực vật thiên nhiên trong hiện tượng rụng “bông” và “trái non” tiêu (Piper

nigrum L.), Tập san Khoa học trường Đại học Tổng hợp TP. HCM, phần B,

khoa học tự nhiên, 155 – 165.

28. Bùi Trang Việt, 2000, Sinh Lý Thực Vật Đại Cương, phần II, NXB ĐHQG TP

Hồ Chí Minh.

29. Bùi Trang Việt, 2002, Sinh Lý Thực Vật Đại Cương, phần I, NXB ĐHQG TP

Hồ Chí Minh.

30. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, 2000, Sinh lí học thực vật, NXB

Giáo Dục.

31. Võ Tòng Xuân, 1979, Cải tiến giống lúa, NXB trường Đại học Cần Thơ.

Tài liệu nước ngoài

32. Agric J. & Environ, 2009, Effects of Drought Stress on Growth and Yield of

Rice (Oryza sativa L.) Cultivars, Department of Biology, 264-272.

33. Amelia H., Veeresh R. G., Rolando O. T., Kenneth L. M., Rachid S., 2011,

Variation in root system architecture and drought response in rice (Oryza

sativa): phenotyping of the Oryza SNP panel in rainfed lowland fields, Field

Crops Research, 205–214.

34. Bahaji A., Mateu I., Sanz A., Cornejo M. J., 2002, Common and distinctive

responses of rice seedlings to saline- and osmotically-generated stress, Plant

Growth Regulation, V38, 83 – 94.

35. Balch E., Gidekel M., Nieto M., Estrella L. H. and Alejo N., 1996, Effects of

water stress on plant graw and root proteins in three cultivars of rice (Oryza

sativa) with different levels of drought tolerance, Physiologia Plantarum, V96,

284-290.

76

36. Bewley J. D., 1997, Seed germination and dormancy, The Plant Cell, V19,

1055-1066.

37. Biswas A. K., Choudhuri M. A., 1984, Effect of water stress at different

developmental stages of field-grown rice, Biologia Plantarum, V26, 263-266.

38. Bogor, 2012, Expert Meeting on PGA Indicators set, UNDP.

39. Chaum S., Yongwech S. Y., Watana K. S., 2010, Water deficit stress in the

reproductive stage of four indica rice (Oryza sativa L.) genotypes, Pak. J. Bot,

3387-3398.

40. Chang T. T., 1976, The origin, evolution, cultivation, dissemination, and

diversification of Asian and African rices, Biomedical and Life Sciences

Euphytica, 425-441.

41. Chaves M., Maroco P., Pereira S., 2003, Understanding plant responses to

drought from the whole plant, Plant Biology, 239-264.

42. Cho J. and Oki T., 2012, Application of temperature, water stress, carbon

dioxide in rice growth models. Rice, 5, 1-8.

43. Cooper M., Polich D. W., and Fukai S., 1999, Combining information from

multi-enviroment trials and molecular markers to select adaptive traits for yield

improvement of rice in water-limited environments, IRRI, 13-35.

44. De Vleesschauwer D., Yang Y., Cruz C.V.and Hofte M. 2010, Abscisic acid-

Induced resistance against the brown spot pathogen Cochliobolus

miyabeanus in rice involves MAP Kinase-Mediated Repression of Ethylene

Signaling, Plant Physiology 152 (4): 2036-2052.

45. Finch- savage W. E, Bergervoet J. H. W, Bino R. J, CLAY H. A and Groot S. P.

C, 2003, Nuclear Replication Activity During Seed Development, Dormancy

Breakage and Germination in Three Tree Species: Norway Maple (Acer

platanoidesL.), Sycamore (Acer pseudoplatanusL.) and Cherry (Prunus

aviumL.), Life Sciences Annals of Botany V 81, I 4, 519-526.

77

46. Gaspar T., Bisbis B., Kevers C., Jouve L., Hausman J. F. and Dommes J., 2002,

Concepts in plant stress physiology, application to plant tissue cultures,

Biomedical And Life Sciences Plant Growth Regulation, 263-285.

47. Gauchan P. D, 2012, Effect of different sugars on shoot regeneration of maize

(zea mays L.), Kathmandu university journal of science, Engineering and

Technology , V8, 119 – 124.

48. Ghorbanli M., Gafaraabd M., Amirkian T. and Allahverdi-Mamaghani B., 2013,

Investigation of proline, total protein, chlorophyll, ascorbate and dehydro

ascorbate changes under drought stress in Akria and Mobil tomato cultivars.

Iranian Journal of Plant Physiology 3 (2), 651-658.

49. Huang. Y, Hu. Y, Liu. Y, 2010, Combined effects of chromium and arsenic on

rice seedlings (Oryza sativa L.) growth in a solution culture supplied with or

without P fertilizer, Science China Life Sciences, 1459-1466.

50. Iwamoto K., Shiraiwa Y, 2005, Salt-regulated mannitol metabolism in an algae,

Functional Biosciencesi, 305-8572.

51. Jain K. R., Sunita J., Wu R., 1996, Stimulatory effect of water stress on plant

regeneration in aromatic Indica rice varieties, Plant Cell Reports, V15, 449 –

454.

52. Jenik D. P. and Barton N. K., 2005, Surge and destroy: The role of auxin in

plant 1 embryogenesis, Development, 132, 3577-3585.

53. Kaufman M. R. and Eckard A. N., 1971, Evaluation of Water Stress Control

with Polyethylene Glycols by Analysis of Guttation, Plant Physiol; 47(4), 453 –

456.

54. Khush. G. S, 1997, Origin, dispersal, cultivation and variation of rice,

Biomedical And Life Sciences plant molecular biology, 25-34.

55. Kim. S.K, Son. T.K, Park.S.Y, Lee. I. J, Lee. B. H, Kim. H.Y and Lee. S. C,

2006, Influences of gibberellin and auxin on endogenous plant hormone and

starch mobilization during rice seed germination under salt stress, Journal of

Environmental Biology, 181-186.

78

56. Kumar M.N., JaneW.-N., and Verslues P.E. 2013. Role of the putative

osmosensor Arabidopsis Histidine Kinase1 in dehydration avoidance and low-

water-potential response. Plant Physiology, 161: 942–953.

57. Loreti. E, Yamaguchi. J, Alpi. A and Perata. P., 2003, Gibberellins are not

required for rice germination under anoxia, Plant and Soil, 137-143.

58. Mostajeran A. and Eichi R. V., 2009, Effects of drought stress on growth and

yield of rice (oryza sativa L.) cultivars and accumulati, on of proline and

soluble sugars in sheath and blades of their different ages leaves, American-

Eurasian, Agric J & Environ, V5, 164-272.

59. Neuman, 1993, Shoot responses to root stress-a resource gathering point of

view, Journal of Arboriculture, V2, 118 -122.

60. Paul A.K., Mukherji S., 1972, Change in respiration rate of rice seedlings as

affected by storage and viability, and its possible relation with catalase and

peroxidase activities during germination, Biologia Plantarum, 414-419.

61. Pirzad A., Shakiba M. S., Salmasi S. Z., 2011, Effect of water stress on leaf

relative water content, chlorophyll, proline and soluble carbohydrates in

Matricaria chamomilla L., Journal of Medicinal Plants Research, 2483-2488.

62. Perretti M. & Flower RJ, 2003, Is FPR mediating the protective action of

annexin 1 in experimental cardiovascular pathologies, British Heart Foundation

368- 382.

63. Sharma R., De Vleesschauwer D., Sharma M.K., and P.C. 2013. Recent

advances in dissecting stress-regulatory crosstalk in rice. Molecular Plant 6 (2),

250–260.

64. Taiz And Zeiger E., 2010, Plant Physiology 5thed, Sinaue Associates.

65. Tenuifolius and Dianthus, 2009, The effect of mannitol on antioxidative

enzymes in vitro long term cultures of dianthus, Plant Biol, V54,25-33.

66. USDA, 2011, forecasts global rice production, Department of Agriculture, 29 -

33.

79

67. Van Houtte H., Vandesteene L., López-Galvis L., Lemmens L., Kissel E.,

Carpentier S., Feil R., Avonce N., Beeckman T., Lunn J.E., and Van Dijck P.,

2013, Overexpression of the trehalase gene AtTRE1 leads to increased drought

stress tolerance in Arabidopsis and is involved in abscisic acid-induced stomatal

closure. Plant Physiology, 161, 1158–1171.

68. Wang H., Zhang H. and Li Z., 2007, Analysis of Gene Expression Profile

Induced by Water Stress in Upland Rice (Oryza sativa L. var. IRAT109)

Seedlings using Subtractive Expressed Sequence Tags Library, Journal of

Integrative Plant Biology, 1455-1463.

69. Xiong L., Wang R. G., Mao G., Koczan M., 2006, Identification of drought

tolerance determinants by genetic analysis of root response to drought stress

and abscisic acid, Plant Physiol, V3, 1065–1074.

70. Yordanov I., Velikova V., Tsonev T., 2003, Plant responses to drought and

stress tolerance, Plant Physiol, 187-206.

71. Zhang W., 2012, Salt & Water Stress in Plants, The Chinese University of Hong

Kong, China, 24-29.

72. Zhang W., Li C., Qian C. & Cao L., 2009, Studies on the responses of root,

shoot and drought resistance in the seedlings of forage triticale to water stress,

Journal of Agricultuval Science, V1, 50 – 57.

80

PHỤ LỤC

Bảng: Thành phần nuôi cấy MS (Murashige và Skoog, 1962)

Khoáng đa lượng Nồng độ (mg/l)

1650 NH4NO3

1900 KNO3

440 CaCl2.2H2O

370 MgSO4.7H2O

170 KH2PO4

Khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l)

6,2 H3BO4

22,3 MnSO4.2H2O

8,6 ZnSO4.4H2O

0,83 KI

0,25 Na2MoO4.2H2O

0,025 CuSO4.5H2O

0,025 CoCl2.6H2O

Dung dịch Fe-EDTA Nồng độ (mg/l)

27,8 FeSO4.7H2O

37,3 Na2EDTA

Vitamin MS Nồng độ (mg/l)

Glycine 2

Acid nicotinic 0,5

Pyrydoxin HCl 0,5

Thiamin HCl 1

Đường 30

Agar 8

pH 5,7 ± 0,1

81

 Dung dịch cố định mẫu FAA

 8 lần thể tích cồn 700 : 40 ml  1 lần thể tích formaldehid : 37%

 1 lần thể tích acid acetic : 5 ml

Dung dịch có thể giữ mẫu lâu được ở 100C.