Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng tạo sắc tố đỏ và Monacolin K của vi nấm Monascus Purpureus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Xuân Hồng

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO SẮC TỐ

ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM

MONASCUS PURPUREUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Xuân Hồng

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO SẮC TỐ

ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM

MONASCUS PURPUREUS

Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN HỮU PHÚC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Thầy TS. Nguyễn Hữu Phúc đã tận

tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy - Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư

Phạm Tp. Hồ Chí Minh đã hết lòng chỉ bảo truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh

nghiệm của mình trong suốt thời gian theo học.

Tôi xin gởi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Tuyến, cô Thanh, anh Vinh, anh Dân

cùng các bạn trong Viện Sinh học Nhiệt đới đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi hoàn thành

các thí nghiệm của đề tài.

Tôi xin cảm ơn tất cả các thành viên của lớp Cao học Vi sinh vật K22 -Trường

Đại học Sư Phạm TP. Hồ Chí Minh cùng những người bạn thân đã luôn ở bên để động

viên, an ủi, giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Con xin cảm ơn Gia đình thân yêu đã luôn khích lệ, dành tình cảm yêu thương

và chăm sóc cho con trong suốt những năm qua.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi có sự hỗ trợ từ

Giáo viên hướng dẫn TS. Nguyễn Hữu Phúc. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề

tài này trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu khoa học nào

trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh

giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi trong phần tài liệu tham

khảo. Ngoài ra đề tài còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các

tác giả, cơ quan tổ chức khác và cũng được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Xuân Hồng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 1

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 2

MỤC LỤC .................................................................................................................... 3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................... 6

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 9

1.1. Khái quát về nấm MONASCUS ................................................................................. 9

1.1.1. Lịch sử sử dụng gạo men đỏ ................................................................................... 9

1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Monascus ................................................................. 10

1.1.3. Các sản phẩm trao đổi chất của nấm Monascus sp. .............................................. 12

1.2. Khái quát về sắc tố ..................................................................................................... 12

1.2.1. Cấu tạo phân tử ...................................................................................................... 13

1.2.2. Đặc tính sắc tố ....................................................................................................... 14

1.2.3. Tình hình sử dụng màu thực phẩm ........................................................................ 15

1.2.4. Các phương pháp lên men tạo sắc tố ..................................................................... 16

1.3. Khái quát về MONACOLIN K ................................................................................ 23

1.3.1. Giới thiệu ............................................................................................................... 23

1.3.2. Cấu tạo phân tử ...................................................................................................... 24

1.3.3. Tính chất của Monacolin K .................................................................................. 25

1.3.4. Tác dụng của Monacolin K trong chữa trị các bệnh tim mạch ............................. 25

1.3.5. Quá trình lên men sản xuất Monacolin K ............................................................. 26

1.4. Khái quát về CITRININ ........................................................................................... 27

1.4.1. Cấu trúc phân tử .................................................................................................... 27

1.4.2. Đặc tính sinh học ................................................................................................... 27

1.4.3. Đặc tính vật lý và hóa học của citrinin .................................................................. 28

1.4.4. Vấn đề an toàn sức khỏe khi sử dụng các sản phẩm từ nấm men đỏ ................... 28

1.5. Khái quát về CHOLESTEROL ................................................................................ 29

1.5.1. Giới thiệu ............................................................................................................... 29

1.5.2. Quá trình sinh tổng hợp cholesterol ...................................................................... 29

1.5.3. Ảnh hưởng của cholesterol đối với bệnh tim mạch ............................................. 30

1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước [5]. ...................................................... 31

1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ......................................................................... 31

1.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................................... 32

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 34

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ......................................................................................... 34

2.1.1. Giống vi sinh vật và nguyên liệu:.......................................................................... 34

2.1.2. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng ................................................................ 34

2.1.3. Hóa chất:............................................................................................................... 34

2.1.4. Thiết bị và dụng cụ: ............................................................................................... 35

2.2. Nội dung thí nghiệm .................................................................................................. 35

2.3. Phương pháp thí nghiệm:.......................................................................................... 36

2.3.1. Quan sát hình thái nấm Monascus......................................................................... 36

2.3.2. Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật. ......................................................... 37

2.3.3. Xác định độ ẩm ban đầu của gạo và độ ẩm gạo sau lên men ................................ 38

2.3.4. Phương pháp lên men thu nhận chế phẩm ............................................................ 38

2.3.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố và Monacolin K ...................................................................................................................................... 39

2.3.6. Phương pháp trích ly sắc tố ................................................................................... 41

2.3.7. Xác định hàm lượng Monacolin K ........................................................................ 41

2.3.8. Đặc tính sinh học của chế phẩm gạo men đỏ: ....................................................... 42

2.3.9. Khảo sát độ bền của dịch màu ............................................................................... 46

2.3.10. Phương pháp xác định độc tính aflatoxin, độ nhiễm khuẩn của bột gạo men đỏ. ......................................................................................................................................... 46

2.3.11. Phương pháp tách chiết citrinin .......................................................................... 46

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 48

3.1. Đặc điểm chủng MONASCUS PURPUREUS N.212 ............................................... 48

3.1.1. Hình dạng khuẩn lạc .............................................................................................. 48

3.1.2. Cấu trúc tế bào ....................................................................................................... 49

3.2. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố ....... 51

3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men ......................................................................... 51

3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu .............................................................................. 52

3.2.3. Ảnh hưởng của số lượng giống ............................................................................. 54

3.2.4. Ảnh hưởng của pH ................................................................................................ 56

3.2.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 0,5% .......................................................................... 58

3.2.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon ............................................................................... 60

3.2.7. Ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol ................................................................... 62

3.2.8. Ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy với Saccharomyces cerevisiae...................... 63

3.3. Đường chuẩn MONACOLIN K ............................................................................... 64

3.4. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp MONACOLIN K............................................................................................................... 64

3.4.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men ......................................................................... 64

3.4.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu .............................................................................. 65

3.4.3. Ảnh hưởng của số lượng giống ............................................................................. 67

3.4.4. Ảnh hưởng của pH ................................................................................................ 68

3.4.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 0.5% .......................................................................... 69

3.4.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon ............................................................................... 70

3.4.7. Ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol ................................................................... 71

3.4.8. Ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy với Saccharomyces cerevisiae...................... 73

3.5. Đặc tính sinh học của chể phẩm gạo men đỏ .......................................................... 74

3.5.1. Định tính enzyme của chế phẩm ........................................................................... 74

3.5.2. Định lượng hoạt tính enzyme của chế phẩm. ........................................................ 75

3.6. Kết quả khảo sát độ bền sắc tố với ánh sáng theo thời gian ................................. 77

3.7. Đánh giá chất lượng sản phẩm ................................................................................. 78

3.7.1. Độc tính aflatoxin [49]. ......................................................................................... 78

3.7.2. Tổng vi khuẩn hiếu khí .......................................................................................... 78

3.8. Hiệu suất của các phương pháp tách chiết CITRININ .......................................... 78

3.8.1. Phần trăm Monacolin K còn lại: ........................................................................... 78

3.8.2. Phần trăm citrinin còn lại: ..................................................................................... 79

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 84

PHỤ LỤC ................................................................................................................... 89

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AU/g Đơn vị hấp thụ/ gam

HDL High- dendity lipoprotein

HDL – c High- dendity lipoprotein cholesterol

HMG-CoA reductase 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase

KHV Kính hiển vi

KL Khuẩn lạc

LDL Low- dendity lipoprotein

LDL – c Low- dendity lipoprotein cholesterol

M. purpureus Monascus purpureus

MSG Monosodium glutamate

MT Môi trường

MVA Mevinolinic

RYR Red Yeast Rice

sp. Species

WHO World Health Organization

MỞ ĐẦU

Gạo men đỏ (Red yeast rice – Hồng khúc) - một sản phẩm truyền thống đã được sử

dụng rộng rãi từ nhiều thế kỷ qua ở các nước Châu Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc…)

và một số nước Đông Nam Á trong sản xuất thực phẩm nhằm làm chất bảo quản, chất tạo

màu … cũng như trong y học cổ truyền [5], [13]. Nó được xem là sản phẩm không độc hại,

có ích trong điều trị chứng đau bụng khó tiêu, chứng tiêu chảy, mụn nhọt, tan vết bầm, giải

rượu, yếu sinh lý, làm tăng sự lưu thông máu và kích hoạt lá lách, dạ dày…

Mặc dù đã được sử dụng khá lâu nhưng gạo men đỏ vẫn không gây được sự chú ý

của các nước phương Tây. Mãi cho đến năm 1976, khi phát hiện của Giáo sư Akira Endo

(Nhật Bản) về Monacolin K (Lovastatin, Mevinolin) một sản phẩm trao đổi chất của chủng

Monascus purpureus Went, hoạt chất này có giá trị cao giúp giảm cholesterol thông qua

việc ức chế enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMG-CoA

reductase) trong cơ thể, góp phần vào việc ngăn chặn và đẩy lùi được các bệnh liên quan

đến tim mạch [38].

Trong khi đó, bệnh tim mạch được xếp vào loại tử vong cao nhất ở hầu hết các

quốc gia, các khu vực và các châu lục trên thế giới, không chỉ tập trung ở người già, ở các

nước phát triển mà bệnh còn phổ biến trong giới trẻ và ngay cả những nước đang phát triển.

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) hàng năm trên thế giới bệnh tim mạch vẫn

gây nên 17,5 triệu cái chết trong đó các nước đang phát triển chiếm 8-9 triệu (2006). Còn tại

Việt Nam, chỉ tính riêng ở Viện Tim Mạch Việt Nam và Viện Tim Mạch TP. HCM mỗi

năm có hàng ngàn bệnh nhân đến khám và điều trị [37], [42].

Thông thường, để điều trị bệnh tim mạch nói trên người ta có thể dùng nhiều thuốc

khác nhau bán trên thị trường, phổ biến là thuốc statin được sản xuất từ Aspergillus tereus

[38]. Việc sử dụng các thuốc này mắc phải nhược điểm là giá thành khá cao bên cạnh đó

còn để lại nhiều phản ứng phụ như: nhiễm độc gan do thuốc, nguy cơ gây bệnh tiểu đường,

gây dị ứng… Chính vì vậy, chế phẩm Monascus rất được quan tâm sản xuất rộng rãi trên

thế giới để làm nên chất tạo màu hoặc chất bảo quản thay cho nitrat gây độc hại đồng thời

làm nguyên liệu sản xuất thuốc làm giảm lượng cholesterol trong máu, chất chống cao huyết

áp… hạn chế và ngăn ngừa các bệnh tim mạch.

Trên cơ sở đó, Chúng tôi tập trung nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG

TẠO SẮC TỐ ĐỎ VÀ MONACOLIN K CỦA VI NẤM MONASCUS PURPUREUS”

nhằm mục tiêu: Tìm hiểu một số điều kiện ảnh hưởng khả năng tạo sắc tố và hàm lượng

Monacolin K của chủng Monascus purpureus N.212 và tìm cách nâng cao hàm lượng

Monacolin K trong sản phẩm sau lên men.

Nghiên cứu gồm các nội dung sau đây:

Xác định một số đặc điểm phát triển của M. purpureus N.212 trên môi trường PGA.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến lượng sắc tố và hàm lượng Monacolin K tạo

thành của chủng M. purpureus N.212 trên môi trường gạo Tài nguyên.

Xác định phương pháp khử citrinin trong sản phẩm gạo men đỏ tạo thành.

Xác định hoạt tính một số enzyme của chế phẩm gạo men đỏ.

Đánh giá chất lượng sản phẩm về mặt sinh học và hóa lý.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát về nấm MONASCUS

1.1.1. Lịch sử sử dụng gạo men đỏ

Gạo men đỏ là loại dược thảo và thực phẩm truyền thống Trung Quốc, được lên men

từ gạo hấp với nấm Monascus, chế phẩm này được sử dụng cách đây hàng ngàn năm [9],

[40]. Hiện nay trên thế giới, Monascus có nhiều tên gọi khác nhau như Red Yeast, Red yeast

rice, Red Mould Rice, Red Mould (USA), Beni-Koji, Red-Koji, Ang-Khak (Nhật Bản),

Hung-Chu, Hong Qu, Angkak, Zhitai (Trung Quốc), Rotschimmelreis (Châu Âu)… Cách

đây 600 năm, Lý Thời Trân nhà y dược cổ đại Trung Hoa đã giới thiệu gạo men đỏ trong

Bổn Thảo Cương Mục và trong các quyển sách khác của mình. Trong những tài liệu này,

ông đã mô tả khá đầy đủ, chính xác về giá trị dược lý và chức năng của gạo men đỏ [40].

Năm 1884, Van Tieghem đã phân lập Monascus đầu tiên từ khoai tây và từ bánh hạt

lanh và xác định là Monascus rubber. Năm 1895, Went cũng phân lập được Monascus

purpureus từ gạo bị mốc đỏ lấy tại các chợ ở Java, Indonesia. Sau đó hàng loạt các chủng

Monascus đã được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới [3].

Năm 1976, Giáo sư Akira Endo (Nhật Bản) đã tìm thấy Monacolin K từ các sản

phẩm trao đổi chất của chủng Monascus purpureus Went. Hoạt chất này có thể làm giảm

cholesterol trong máu, phát hiện này đã gây sự chú ý trên toàn thế giới. Công trình của Giáo

sư Endo đã cho thấy, Monacolin K có thể ức chế sự tổng hợp của cholesterol trong cơ thể

bằng cách ức chế cạnh tranh với enzyme HMG-CoA reductase. Nhờ vậy nó được dùng để

ngăn ngừa và chữa trị các căn bệnh có liên quan đến hệ thống tim mạch và não bộ [12],

[40].

Năm 1985, Giáo sư Goldstein và Brown (Mỹ) đã khám phá ra sự chuyển hóa của

Monacolin K trong việc ức chế sự tổng hợp của cholesterol trong cơ thể. Nhờ vào công

trình, họ đã được trao giải Nobel Sinh lý và Y khoa. Và sau đó, gạo nấm men đỏ trở nên nổi

tiếng và phổ biến toàn cầu [3], [46].

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của Monacolin K [41].

1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Monascus

1.1.2.1 Phân loại học

Dựa theo khóa phân loại nấm mốc, Monascus được định danh như sau :

Ascomycota - Ngành:

Plectomycetes - Lớp:

Eurotiales - Bộ:

Monascaceae - Họ:

Monascus - Giống:

Theo Hawksworth và Pit (1983) Monascus được chia thành 3 loài gồm: M. pilosus,

M. ruber, M. purpureus. Theo Martinkova và Patakova (1999), Pattanagul và cộng sự

(2007) cho rằng Monascus được chia thành 6 loài: M. pilosus, M. ruber, M. purpureus, M.

floridanus, M. pallens, M. sanguineus. Ngoài ra, còn có một số loài mới được tìm thấy

nhưng lại không có liên quan đến thực phẩm (Canno và cộng sự, 1995) [13].

1.1.2.1. Đặc điểm sinh học

 Hình dạng khuẩn lạc

- Đường kính khuẩn lạc: 40mm (sau một tuần nuôi trên môi trường PGA).

- Hình thái: phẳng, bẹt, tỏa tròn.

- Bề mặt: Có tơ mỏng.

- Màu sắc: từ đỏ cam chuyển thành đó tía

rồi thành màu đỏ nâu

- Mặt sau: màu đỏ tía.

+ Đặc tính nổi bật: những nang nấm có vách mỏng tồn tại nhiều, dạng tròn tồn tại

- Quan sát dưới kính hiển vi (ở 300C) Hình 1.2. Khuẩn lạc M. purpureus

những bào tử đính. Chất màu được tạo thành tạo hệ sợi dưới dạng tinh thể hình chữ nhật, có

kích thước tương đối đồng đều.

+ Các nang nấm vách mỏng được sản sinh trên những sợi nấm ngắn giống cuống, các

nang nấm trưởng thành chứa đầy các bào tử nang rời rạc, không gắn chặt nhưng các nang

nấm vẫn có thể nhìn thấy rõ ràng khi còn non.

+ Bào tử mang hình cầu có kích thước 5 - 6 µm x 3,5 – 4 µm, phẳng, không màu.

1.1.2.2. Đặc tính sinh học

Theo Van Tieghem, M. purpureus và M. ruber thuộc cùng một loài. Đây là loại nấm

mốc hoại sinh phát triển trên tinh bột, thức ăn lên men trong các sản phẩm chế biến từ sữa

(Went và cộng sự, 1895; Julova và cộng sự, 1996). Chúng có khả năng tạo ra sự lên men

cellobiose, maltose, fructose và glucose nhưng không lên men đường saccharose (Ying và

cộng sự, 1987). M. purpureus là loại nấm sợi, cơ quan sinh sản của chúng là nang bào tử.

Các nang bào tử này thường có hình cầu (đường kính 5 µm) hoặc là hình trứng (đường kính

6x5 µm). Ở giai đoạn còn non hệ sợi nấm có màu trắng, tuy nhiên các hệ sợi này phát triển

nhanh thành màu hồng đậm và sau cùng là màu vàng – cam. Trong quá trình phát triển,

Monascus làm môi trường chuyển sang acid yếu và tạo ra dưới lớp môi trường một màu đỏ thẫm khi nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Monascus là top = 300C-370C, nhiệt độ tối đa tmax = 450C, nhiệt độ hấp nhất tmin = 150C-180C.

1.1.3. Các sản phẩm trao đổi chất của nấm Monascus sp.

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển Monascus tạo ra nhiều chất trao đổi sơ cấp

và thứ cấp được trình bày trong bảng 1.1 gồm có:

Bảng 1.1. Các sản phẩm trao đổi chất có giá trị của Monascus [5].

Amylase, glucoamylase… 1. Enzyme thủy phân ngoại bào

Rượu (Ethanol)

Các acid ( acid citric, sucinic, gluconic, oxalic…) 2. Sản phẩm trao đổi sơ cấp

Hỗn hợp các ester

Nhóm sắc tố (đỏ, vàng, cam)

Monacolin

γ – amino –butyric acid (GABA)

Chất chống oxi hóa tự nhiên (flavonoid,…) 3. Các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp

Citrinin

Chất làm giảm đường huyết và một số chất chưa định danh có hoạt tính sinh học.

1.2. Khái quát về sắc tố

Màu tự nhiên đang có nhu cầu rất lớn đặc biệt để sử dụng trong thực phẩm và đồ

uống. Trong năm 2007, thị trường màu thực phẩm tự nhiên được có giá trị từ 465 triệu

USD, tăng 4,6% so với năm 2004 (Mapari và cộng sự, 2010). Các chất màu tự nhiên và màu

được chiết xuất từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Sản xuất bột màu sử dụng các vi sinh

vật có lợi thế nhất định so với các nguồn khác như chúng có thể được phát triển nhanh

chóng trong điều kiện kiểm soát cao. Kết quả là năng suất cao của các sắc tố. Ngoài

Monascus nhiều vi sinh vật khác có khả năng sản xuất sắc tố như các loài của chi

Paecilomyces, Serratia, Cordyceps, Streptomyces và Penicillium (Gunasekaran và

Poorniammal, 2008). Nhưng Monascus đã thu hút sự chú ý đặc biệt khi chúng tạo được

nhiều màu sắc khác nhau đặc biệt là sắc tố đỏ và vàng là những màu thực phẩm mong muốn

[13].

Màu của Monascus được tách chiết bằng ethanol từ gạo lên men với nấm Monascus

sau đó được thu nhận và tinh sạch để sử dụng phổ biến trong việc nhuộm màu thực phẩm,

dược phẩm và mỹ phẩm. Theo nhiều tác giả, có hơn 10 sắc tố tạo ra từ Monascus nhưng vẫn

chưa có sự giải thích rõ ràng về chúng (Shin và cộng sự, 1998) [48]. Trong nhiều năm các

nhà khoa học đã chứng minh sắc tố của Monascus phân thành 3 nhóm sắc tố: vàng - da cam

- đỏ, trong đó sắc tố đỏ là quan trọng nhất do nó được sử dụng như chất màu thực phẩm và

là chất thay thế nitrate trong bảo quản.

1.2.1. Cấu tạo phân tử

Sắc tố của Monascus được tạo ra từ nhiều thành phần liên kết với nhau và được chia

làm 3 nhóm sắc tố chính:

- Rubropunctanin (C21H22O5) và Monascorubrin (C23H26O5) cho màu cam.

- Ankaflavin (C23H30O5) và Monascin (C21H26O5) cho màu vàng.

- Rubropunctamine (C21H23NO4) và Monoscorubramine (C23H27NO4) cho màu đỏ

thẫm.

Một màu có 2 cấu trúc phân tử khác nhau bởi chiều dài mạch của hợp chất béo. Các

sắc tố có thể được sinh ra trong cả môi trường chìm hay bán rắn và lượng sắc tố tạo ra phụ

thuộc vào thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy chúng.

1.2.1.1. Màu cam:

 Rubropunctatin (C21H22O5)  Monascotubrine (C23H26O5) R= C5H11 R= C7H15

1.2.1.2. Màu vàng

 Monascin (C21H26O5) - R= C5H11  Ankaflavin (C23H30O5) – R= C7H15

1.2.1.3. Màu đỏ

 Rubropunctamine(C21H23NO4)  Monascorubramine (C23H27NO4) R= C7H15 R= C5H11

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của các sắc tố Monascus sp. (theo Sweeny (1993).

Sự ổn định của màu ảnh hưởng bởi các điều kiện: acid, nhiệt độ, ánh sáng, oxygen,

độ ẩm và thời gian. Các sắc tố này được thêm vào trong xúc xích, bánh nướng được giữ ổn định 92-95% trong suốt 3 tháng với nhiệt độ 40C (Fabre và cộng sự, 1993) [21].

Mặt khác có hai cách để giữ cho màu được ổn định là: màu được hòa tan trong cồn,

màu được hòa tan trong dầu [13].

1.2.2. Đặc tính sắc tố

Ứng dụng Monascus trong mục đích nhuộm màu đã có từ lâu đời tại Trung Quốc.

Monascus an toàn và không gây độc tố, nó ảnh hưởng đáng kể đến việc gia tăng tuần hoàn

máu, giúp cải thiện chức năng lá lách và giảm mức độ mỡ trong cơ thể. Màu của Monascus

được thu nhận từ quá trình lên men gạo, đậu nành thông qua quá trình tách chiết. Đó là màu

thực phẩm tự nhiên và có chất lượng tốt với các đặc tính cụ thể:

- Màu của Monascus có nguồn gốc tự nhiên, tốt cho sức khỏe.

- Dãy pH rộng từ 2 - 11.

- Màu bền dưới ánh sáng thường, chống lại được nhiệt độ cao, tan được trong nước

hoặc tan hoàn toàn trong cồn, các chất béo.

- Không bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại như: Ca2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+ không bị ảnh

hưởng bởi oxy hóa hoặc sự khử.

- Màu thích hợp với các sản phẩm thịt, sữa, kem, nước trái cây, thức ăn biển…

1.2.3. Tình hình sử dụng màu thực phẩm

1.2.3.1. Các nước phát triển

Ở các nước phát triển việc sử dụng các chất màu vào thực phẩm được quy định khá

chặt chẽ. Người ta sớm nhận biết được các nhược điểm khi sử dụng màu tổng hợp nên việc

sử dụng hạn chế và những quy định những chất màu rõ rệt nằm trong danh mục các chất

màu cho phép, bên cạnh đó họ đầu tư cho việc nghiên cứu phát triển các chất màu có nguồn

gốc tự nhiên: thực vật, vi sinh vật…

1.2.3.1. Ở Việt Nam

Nước ta hiện nay đang đầu tư rất mạnh vào việc phát triển công nghiệp thực phẩm,

danh sách các mặt hàng thực phẩm ngày càng nhiều, phong phú và đa dạng hơn về mẫu mã

và đặc biệt màu sắc đẹp và phù hợp, dễ dàng gây sự chú ý ở người tiêu dùng bên cạnh đó

cũng đồng thời nâng cao chất lượng và giá trị sản phẩm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho

người tiêu dùng. Tuy vậy, tình hình sử dụng màu thực phẩm trong nước chưa được kiểm

soát chặt chẽ mặc dù đã có những danh mục và chỉ tiêu quy định màu dùng cho thực phẩm,

điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người cũng như kinh tế nhà nước. Ngày

04/4/1998 Bộ Y tế đã ban hành quyết định QĐ 867/1998/QĐ-BYT “Danh mục phẩm màu

được phép sử dụng trong thực phẩm” trong đó có mười một chất tự nhiên và mười chất màu

tổng hợp được phép sử dụng cũng như giới hạn tối đa cho phép trong thực phẩm. Tuy nhiên,

nhiều nhà sản xuất sử dụng màu không nằm trong danh mục như quy định, thậm chí biết

độc hại nhưng vì lợi nhuận họ vẫn coi thường sức khỏe của người tiêu dùng.

Theo điều tra của Viện dinh dưỡng thì phẩm màu không đạt tiêu chuẩn rất cao. Hiện

nay các doanh nghiệp, xí nghiệp nhỏ lẻ, cá thể, thủ công đặc biệt các quán hàng rong tỷ lệ

sử dụng màu ngoài danh mục rất cao. Chính vì điều đó nên hàng năm vẫn tồn tại nhiều vụ

ngộ độc thực phẩm và hàng ngàn người phải điều trị những căn bệnh do chúng gây nên.

1.2.4. Các phương pháp lên men tạo sắc tố

1.2.4.1. Sản xuất sắc tố đỏ của Monascus bằng phương pháp lên men bán rắn

Lên men bán rắn là phương pháp lên men truyền thống, dùng trong những thực phẩm

cổ truyền của phương Đông từ nhiều thế kỷ qua (Pandey, 1992; Pandey và cộng sự, 2001).

Tuy nhiên có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng lên men bán rắn tạo sắc tố của nấm

Monascus purpureus sp [4].

a. Nhiệt độ:

Nhiệt độ thích hợp thay đổi từ 25 - 370C (Lin, 1991). Trong trường hợp M. purpureus CBS 109.7, nhiệt độ tối thích, cao nhất và thấp nhất cho sự phát triển lần lượt là: 340C, 460C và 180C (Rasheva,1998). Trong sự hình thành sắc tố nhiệt độ cao có thể thích hợp hơn so

với nhiệt độ thấp [26], [28].

b. Độ ẩm: [13], [28].

Độ ẩm là thông số rất quan trọng, Lotong và Suwanarit (1990) đã sản xuất gạo đỏ

chứa trong các túi nhựa plastic, sắc tố chỉ được tạo ra khi độ ẩm ban đầu thấp 26-32%. Nếu

lượng độ ẩm ban đầu cao sẽ làm tăng hoạt tính của enzyme glucoamylase và glucose nhanh

chóng được tạo ra, nếu nồng độ glucose cao đến 120g/l thì quá trình tạo sắc tố sẽ bị ức chế.

Từ đây quá trình lên men rượu từ đường sẽ xảy ra.

Năm 1991, khi nuôi cấy trên môi trường gạo hấp, Johns và Stuart (1993) nhận thấy

rằng lượng độ ẩm ban đầu tốt nhất cho quá trình tạo sắc tố là 56%. Theo báo cáo của Aporn

Wongwicharn tại hội nghị Kỹ Thuật Sinh học lần thứ 13 ở Thái Lan (2000) cho rằng khi

nuôi cấy Monascus trên môi trường bã khoai mì thì độ ẩm ban đầu tốt nhất cho quá trình tạo

sắc tố là 60%. Một nghiên cứu mới nhất của Vũ Thanh Thảo và cộng sự (2012) cũng cho

rằng nhiệt độ thích hợp nhất là 65% [4].

c. Nhu cầu Oxy [13].

Năm 1992, Han và Mudgett nhận thấy rằng mức cân bằng của khí oxy (O2) và khí

carbonic (CO2) trong không khí có ý nghĩa rất lớn đến sự tạo thành sắc tố và cũng ít nhiều

ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của nấm khi lên men bán rắn.

Giống Monascus không thể sống trong điều kiện kỵ khí khi sử dụng glucose như cơ

chất, tuy nhiên có thể sống trong điều kiện O2 thấp. Trong điều kiện thiếu O2, có sự tạo

thành nhiều ethanol, khí CO2 và hàm lượng sắc tố tạo ra ít hơn.

Với Monascus purpureus nuôi trên gạo thì sắc tố thu được cao nhất khi áp suất riêng

của O2 là 0,5atm. Tuy nhiên, áp suất riêng của CO2 cao sẽ ức chế quá trình tạo sắc tố và sẽ

ức chế hoàn toàn tại 1atm. Trong hệ thống bình lên men kín, nuôi cấy hiếu khí thì áp suất

riêng của CO2 là 0,02atm, còn áp suất riêng của O2 phải nằm trong khoảng 0,05 – 0,5atm.

Như vậy, khi áp suất riêng của O2 là 0,5atm là áp suất riêng của CO2 là 0,02 atm thì sắc tố

tạo ra là cao nhất.

Lượng O2 được hấp thu cao nhất từ 70-90 giờ lên men, ngược lại còn lượng CO2

được thải ra cao nhất từ 60-80 giờ. Tùy thuộc vào môi trường không khí, giới hạn hệ số hô

hấp là 1, ngoại trừ áp suất của O2 là 0,05atm và áp suất của CO2 là 0,02atm.

d. Độ pH ban đầu [13], [30].

Monascus sinh trưởng ở pH từ 2,5-8 và thích hợp từ 4-7 (Yongsmith, 1993). Trong

khoảng pH này ít có sự biến đổi trong sinh trưởng nhưng Monascus phát triển tốt hơn ở pH

4 so với các pH khác (Lin, 1991; Chen, 1993). Dẫu rằng sự sinh trưởng tốt hơn ở pH 4,

nhưng lượng sinh khối tạo ra nhiều hơn ở pH 6,5 (Chen, 1993). Theo Lin (1992), thì sự tạo

thành sinh khối tế bào cao nhất đạt được với pH 6 nhưng các sắc tố sẽ tích lũy trong sợi

nấm, khó hòa tan vào môi trường.

Sự hình thành sắc tố bị ảnh hưởng theo nhiều giá trị khác nhau, tại pH thấp sắc tố

vàng chiếm ưu thế và pH cao hơn sắc tố đỏ chiếm ưu thế. Tại pH 2,5 tạo ra phần lớn là màu

đỏ sáng (Yongsmith, 1993), tại pH 4 có sự kích thích tổng hợp ankaflavin (sắc tố vàng) và

tổng lượng sắc tố hình thành tăng dần khi gia tăng pH đến 5,5. Vượt quá giá trị này, sắc tố

tạo ra sẽ giảm (Lin, 1991). Trái lại với các ý kiến trên, báo cáo tại Aporn Wongwicharn

(Hội nghị Kỹ thuật Sinh học lần thứ 13 của Thái Lan) ghi nhận rằng môi trường lên men

bán rắn sử dụng bã khoai mì là cơ chất thì độ pH thích hợp cho sự hình thành sắc tố là 6. Ở

tại giá trị pH 7, sắc tố vàng không còn hình thành (Yongsmith, 1993).

e. Thành phần môi trường:

Theo Wong và cộng sự (1981), thì tỷ lệ C/N rất quan trọng, để phát triển thì tỷ lệ C/N

là 50g/g, còn để tạo sắc tố thì tỷ lệ C/N là 7-9g/g. Theo Aporn Wongwicharn (Hội nghị Kỹ

Thuật Sinh Học lần thứ 13 ở Thái Lan) thì tỷ lệ C/N cho lượng sắc tố cao nhất khi sử dụng

bã khoai mì làm cơ chất chính là 150 – 200g/l còn Kayuma Mutuwong, Sivawan

Phoolphundh, Aporn Wongwicharn kết luận rằng tỷ lệ C/N thích hợp là 150 – 300g/l.

Nguồn carbon [13].

Vài hydrat carbon đã được dùng như nguồn carbon và năng lượng cho sự hình thành

sắc tố ở Monascus, nồng độ Carbon được sử dụng trong môi trường lên men bán rắn là 0,1-

4,0%, hydrat carbon này có thể là tinh bột, disaccharide như lactose hoặc sucrose,

monosaccharide như glucose hoặc fructose.

Năm 1982, Lin và Lizuka đã nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường khác nhau

đến lượng sắc tố tạo thành (bảng 1.2). Kết quả cho thấy môi trường sử dụng bột mì đã lên

men nấm men cho sắc tố nhiều nhất.

Bảng 1.2. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến sản lượng sắc tố.

Lượng sắc tố Môi trường ngũ cốc 400 nm 500 nm

Gạo trắng 1700 1500

Gạo lức 1850 1570

Bánh mì 4000 3500

Cám 2900 2300

Bắp 2700 2300

Mantou() 5430 5100

Lúa mì 3600 3100

Nguồn: Lin và Lizuka (1982) - Ghi chú: Mantou: bột mì đã lên men nấm men

Khi nuôi trên môi trường bán rắn là gạo, Rosenblit và cộng sự (2000), thấy rằng vào

giai đoạn cuối của 240 giờ lên men cân bằng carbon như sau: 23% carbon chuyển thành

sinh khối, 35% thành CO2, 15% thành ethanol, 1% thành acid acetic và 17% giữ lại chưa

được dùng. Kết quả này coi như là 91% nguồn carbon. Sự thay đổi 100% có thể do sự thay

đổi tốc độ thông khí và lượng ethanol tạo thành.

Nguồn Nitrogen .

Nguồn đạm khác nhau sử dụng cho sự sinh trưởng của Monascus thay đổi từ nguồn

đạm vô cơ (ammonium và nitrat) sang nguồn đạm hữu cơ (pepton, acid amin…). Trong sản

phẩm angkak truyền thống thì không cần bổ sung nguồn đạm bởi vì gạo có từ 5-8% protein

trọng lượng khô (Franco, 1992). Khi dùng những cơ chất khác, việc thêm nguồn đạm kích

thích sắc tố tạo thành, điển hình như polypepton thích hợp cho sự hình thành sắc tố vàng

(Jùzlová, 1996), pepton vừa thích hợp cho hình thành sắc tố đỏ, phát triển tế bào vừa thích

hợp cho sắc tố tiết ra ở pH 6,5 (Chen,1993).

Theo Jun-Sung Kim, Kee-Hyun Choi, Jang-Youn Choi (1993), nguồn đạm hữu cơ

thích hợp cho sự tăng trưởng và hình thành sắc tố hơn nguồn đạm vô cơ và lượng đạm hữu

cơ được bổ sung vào môi trường lên men bán rắn là 0,1 – 1%. Việc dùng nguồn đạm vô cơ

(nitrat, ammonium thì tốt hơn so với nitrat và muối của chúng) kích thích tế bào phát triển

(Lin, 1991), ammonium thì tốt hơn so với nitrat (Chen, 1993). Thí nghiệm của Jùzlová

(1996) đã chứng minh việc dùng ammonium như nguồn đạm có thể hình thành sắc tố cam.

Loại sắc tố và lượng sắc tố Monascus tiết ra khỏi tế bào cũng liên quan đến nguồn

đạm: đạm hữu cơ như acid amin, thích hợp cho sự hình thành sắc tố đỏ (Yongsmith, 1993;

Jùzlová, 1996). Theo Lin (1991), Sasitorn Baipong và Renu Pinthong (1995), khi dùng

Monosodium Glutamate (MSG) như nguồn đạm sẽ kích thích sắc tố tạo thành và điều này

cũng được nhiều nhà khoa học chứng minh. Bên cạnh đó, theo các tác giả Juanita

A.R.Ladyman và Toshio Miyake, Soichi Ohno, Shuzo Sakai các acid amin như lysine,

histidine, arginine, asparagine, threonine, acid glutamic, prolin, glycine, alanine, valine,

tyrosine, phenylalanine và các acid amin tự do khác khi hiện diện trong môi trường nuôi cấy

Monascus sp. đều làm tăng lượng sắc tố tạo thành [3], [13].

Vài acid amin có ảnh hưởng mạnh, tiêu cực lên việc hình thành sắc tố. Nguồn gốc

của leucin là tan trong nước và leucin sẽ ức chế sự hình thành sắc tố [3].

So sánh với số lượng và chất lượng sắc tố được tạo ra khi dùng vài acid amin cho

thấy rằng sắc tố vàng và cam thì không bị ảnh hưởng bởi nguồn đạm, trong khi sắc tố đỏ thì

thay đổi về lượng và tính tan.

Bảng 1.3. Khả năng của các acid amin lên lượng sắc tố tạo thành của Monascus sp.

(theo Heeyoung Jung, Chulyoung Kim, Kum Kim, Chul Soo Shin, 2003).

Thứ tự Sắc tố vàng Sắc tố cam Sắc tố đỏ

1 Phenylalanine Glycine Lysine

Histidine 2 Tyrosin Arginine

Serine 3 Leucin Valine

Cystein 4 Valine Tryptophan

Alanine 5 Glutamine Isoleucine

Threonine 6 Isoleucine Tyrosine

Methionine 7 Acid Glutamic Leucine

Asparagine 8 Proline Proline

Acid Aspartic Acid Glutamic 9 Asparagine

Tryptophan Acid Aspartic Methionine 10

Acid Aspartic Threonine và Methionine Cystein 11

Proline 12 Lysine Glutamine

Glutamine 13 Serine Asparagine

Acid Glutamic Phenylalanine 14 Arginine

Arginine 15 Alanine Alanine

Isoleucin 16 Tryptophan Threonine

Leucin 17 Cystein Histidine

Lysine 18 Glycine Serine

Valine 19 Histidine Glycine

20 Phenylalanine Tyrosine

f. Các nhân tố khác

Theo Lin (1991) nồng độ photphat và magnesium sunphat cao ức chế sắc tố hình

thành và sự tăng trưởng khi gia tăng nồng độ MgSO4 từ 0,5-16mM, việc tăng dầu ngũ cốc

kích thích sắc tố hình thành lên gấp đôi, trong khi việc thêm 0,4% Tween 80 không làm tăng

lượng glucose tiêu thụ, làm chậm tốc độ phát triển nhưng tăng sắc tố hình thành 6-8 lần

[19].

Hiện nay phương pháp lên men bán rắn và phương pháp chủ yếu sản xuất sắc tố

Monascus cung cấp cho thị trường thế giới.

1.2.4.2. Sản xuất sắc tố đỏ của Monascus bằng phương pháp lên men chìm

Trong những năm gần đây, nhiều phương pháp khác nhau để thu nhận sắc tố của

Monascus làm màu thực phẩm đã được tiến hành. Theo Lee và cộng sự (1994-1995); Lin

(1973), Yoshimura và cộng sự (1975), Monascus có thể nuôi bằng phương pháp lên men

chìm, phương pháp lên men chìm trong sản xuất sắc tố khắc phục được nhược điểm là năng

suất thấp và nhu cầu diện tích lớn của phương pháp lên men bán rắn (Lin 1973; Mark và

cộng sự, 1990). Môi trường lên men chìm được dùng để tổng hợp sắc tố đỏ của nhiều chủng

M. purpureus môi trường này ảnh hưởng lên sản phẩm tạo thành nhờ vào thành phần môi

trường, độ pH và sự thông khí [3], [5], [34].

a. Độ pH:

Ảnh hưởng của độ pH lên sự sinh trưởng phát triển và tạo thành sắc tố của Monascus

sp. Trong môi trường lên men chìm cũng tương tự như lên men bán rắn, với ngưỡng pH tập

trung tốt nhất là 4-7.

b. Sự thông khí

Lượng oxy hòa tan trong bể lên men thấp làm tích lũy ethanol trong giai đoạn đầu

quá trình lên men. Khi fructose và glucose được sử dụng hết, sự thông khí làm tăng sự lên

men và sau đó hình thành sắc tố đỏ từ ethanol. Trọng lượng khô và lượng sắc tố cao nhất đạt

được khi khuấy ở tốc độ 700 rpm và thông khí ở tốc độ 1200l/ phút. Ở 600 rpm, tốc độ

khuấy chậm lại, lượng oxy thấp làm tăng độ nhớt dẫn đến làm giảm sự tạo thành sắc tố.

Nồng độ sắc tố tăng cùng với sự tăng của oxy hòa tan, sinh khối đạt được 380 đơn vị/ml

môi trường. Oxy là yếu tố cần thiết cho sự tổng hợp các sắc tố của Monascus [19].

c. Thành phần môi trường

Nguồn carbon được xem là điều kiện tối cần cho sự tạo sắc tố đỏ. Thông thường,

Monascus được nuôi cấy trên môi trường có nguồn gốc tinh bột như bột bánh mì và men

gạo tẻ, có nghĩa chúng sinh trưởng tốt trên mọi cơ chất có nguồn gốc tinh bột. Theo Lin và

Demain (1991), Monascus tăng trưởng trên môi trường có chứa: tinh bột, dextrin, glucose,

maltose và fructose. Chen, Mh và Johns (1994) cũng cho rằng nếu sử dụng cacrbon từ

glucose và maltose sẽ hình thành hàm lượng sắc tố rất cao.

Trong số hai nguồn: nitơ và carbon, thì nitơ lại quan trọng hơn nguồn carbon. Theo

Chen, Mh và Johns (1994) trong số các nguồn đạm như: nitrat, muối amonium, pepton thì

các muối ammonium và pepton thích hợp cho sự phát triển và tổng hợp sắc tố hơn là muối

nitrat. Bảng 1.4 trình bày nồng độ sắc tố thu được khi lên men với các nguồn carbon khác

nhau.

Bảng 1.4. Sản lượng và lượng sắc tố đỏ của Monascus tạo ra trên các nguồn cơ chất

khác nhau. (Nguồn: Santere và cộng sự,1995).

Nguồn carbon Nguồn nitơ Điều kiện nuôi Sản lượng (g/l) Năng suất (mg/1h)

MSG 1,4 11 Mẻ

Glucose Soyapepton 1,05 12 Mẻ

MSG 1,2 7 Mẻ

MSG 1,25 15 Mẻ

Soyapepton 0,9 11 Mẻ

MSG 2,0 11 Mẻ

Ethanol MSG 5,25 9,5 *

MSG 35 (OUD) **

MSG 9,0 20 **

MSG 60 (OUD) **

Ghi chú: Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường tối thiểu.

MSG: Monosodium Glutamate

*: Đưa cơ chất theo phương pháp cho từ từ bằng tay

**: Đưa cơ chất theo phương pháp tự động cho vào hằng ngày.

Các kết quả tốt nhất đạt được khi sử dụng ethanol và glutamate làm cơ chất và cho cơ

chất vào bằng phương pháp cho từ từ trong quá trình lên men. MSG có kết quả tổng hợp tốt

đến quá trình sinh tổng hợp của sắc tố vàng và sắc tố đỏ [19].

Trong quá trình lên men, tỷ lệ giữa nguồn carbon và nguồn nitơ khác nhau trong

những điều kiện nuôi cấy khác nhau là một thông số rất quan trọng. Tỷ lệ này ảnh hưởng rất

lớn đến nồng độ sắc tố được tạo ra trong quá trình lên men.

Lin và Demain (1991) cũng cho rằng amino acid thích hợp cho Monascus. Juzlova và

cộng sự (1994) thấy rằng để sản xuất sắc tố thì sử dụng ethanol là nguồn carbon ở nồng độ

20g/l cho kết quả tốt hơn việc sử dụng maltose. Aminoacid kích thích sự tạo thành sắc tố

vàng và đỏ. Họ cũng thấy rằng khi nuôi cấy theo kiểu hai giai đoạn thì việc sử dụng maltose

và ethanol ở giai đoạn đầu và giai đoạn hai làm tăng hiệu quả sản xuất sắc tố. Theo Wong

(1981) thì tỷ lệ C/N rất quan trọng, để phát triển thì tỷ lệ C/N là 50g/g, còn để tạo sắc tố thì

tỷ lệ C/N là 7-9g/g.

Theo nghiên cứu của Fabre, Gama và Blance (1989) khi lên men thí nghiệm

Monascus trên môi trường của Wong (1981) gồm có ethanol 20g/l, MSG 5g, KH2PO4 5g,

K2HPO4 5g, MgSO4 0,5g, CaCl2 0,1g, MnSO4 0,03g, ZnSO4 0,01g, FeSO4 0,01g trong mỗi

lít nước, pH ban đầu là 6,5 và không điều chỉnh trong quá trình lên men, môi trường được thanh trùng 120oC trong 20 phút, để nguội và cấy giống Monascus ruber đã nuôi trước đó trên môi trường nấm men – malt và agar. Nhiệt độ lên men là 28oC, thời gian là 80 giờ. Kết

quả cho thấy ethanol cho sắc tố cũng như sinh khối cao nhất. Sắc tố thu được sau lên men được tinh chế và đưa vào chế biến xúc xích, pate sau 3 tháng lưu giữ ở nhiệt độ 4oC cho

thấy độ ổn định nhiệt đạt đến 92-98%.

Lee và cộng sự (1994, 1995); Lin (1973); Yoshimura (1975) đã thông báo rằng

Monascus có thể được nuôi cấy trong các hệ thống lên men chìm. Phương pháp lên men

chìm khắc phục được năng suất thấp và yêu cầu diện tích lớn trong lên men bán rắn. Tuy

nhiên các khuyến cáo cho rằng việc sản xuất sắc tố trong lên men chìm cũng chỉ đạt 1/10

sản lượng so với phương pháp lên men bán rắn (Lin, 1973; Mark và cộng sự, 1990) [19].

1.3. Khái quát về MONACOLIN K

1.3.1. Giới thiệu

Bệnh tắc nghẽn mạch máu não là một bệnh nguy hiểm đối với người trung niên cao

tuổi, hàm lượng lipid và cholesterol cao là nguyên nhân chính dẫn đến triệu chứng này.

Mevastatin được tìm thấy là một loại chất ức chế của enzyme 3-hydroxyl-3-methylglutaryl

coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase). Enzym HMG-CoA reductase xúc tác cho

bước thứ 3 trong 21 bước của quá trình sinh tổng hợp cholesterol. Vì thế, sự phát hiện ra

loại chất ức chế này tạo ra một hướng đi mới cho việc điều khiển sự cân bằng cholesterol

trong huyết thanh và tạo thành các tác nhân có hiệu quả trong việc thay đổi cholesterol

(Wang. 1997).

1.3.2. Cấu tạo phân tử

- Monacolin K là một polyketide dạng I.

- Tên khoa học của Monacolin K: [1S-[1 alpha(R*), 3 alpha, 7 Beta, 8Beta(2S*,

4S*), 8 aB]]-1, 2, 3, 7, 8a- hexahydro-3, 7- dimethyl-8-[2-(tetrahydro-4-hydroxy -6-oxo-2H-

pyran-2-yl) ethyl]-1-naphthalenyl 2- methylbutanotate.

- Công thức hóa học: C24H36O5. Trọng lượng phân tử: 404,5 đvC.

Dựa trên những kết quả của phương pháp phân tích thành phần nguyên tố, đo sinh khối, UV (bằng ethanol), IR, phổ 1HNMR và 13CNMR bằng quang phổ kế người ta đã xác

định được có hai dạng Monacolin K trong sinh khối của Monascus, đó là: Mevinolin

(Monacolin K) và dạng dehydrat hóa của nó (dạng khử nước).

Hình 1.4. Cấu trúc Monacolin K: (1) dạng lacton; (2) dạng dehydrat hóa; (3) cấu trúc không gian [3].

(3)

Dạng dehydrat hóa của Monacolin K chỉ được tìm thấy trong những mẫu có nguồn

gốc từ gạo đỏ được xử lý qua nhiệt độ, còn đối với dạng sinh khối tươi thu nhận, các nhà

nghiên cứu không thấy sự có mặt của nó. Điều này chứng tỏ dạng dehydat hóa chỉ được

hình thành từ Monacolin K thông qua sự khử nước [3].

1.3.3. Tính chất của Monacolin K

Monacolin K nóng chảy ở nhiệt độ 157–159oC, tan trong methanol, ethanol, aceton,

chloroform và n- benzene, không tan trong n- hexan và petroleum ether.

Một số nghiên cứu cho thấy Monacolin K trong bột gạo đỏ nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt độ. Nó bị phân hủy dưới những điều kiện độ ẩm và nhiệt độ cao (75% RH, 60oC)

và dưới ánh sáng mặt trời. Monacolin K và dạng hydroxyl acid của nó có thể bị khử nước chuyển thành dehydromonacolin K ở nhiệt độ cao (80oC). Phổ hấp thu UV trong methanol

thể hiện 3 đỉnh hấp thu là 229 nm, 237 nm và 246 nm. Phổ hấp thu IR (KBr) thể hiện dải hấp thu ở 3550cm-1, 2970cm-1, 1696cm-1 và 1220cm-1. Giá trị Rf trong sắc ký lớp mỏng

TLC là 0,47 trong hệ dung môi dichioromethane – acetone (4:1). Giá trị LD50 của

Monacolin K trên chuột nhắt (bằng đường uống) khoảng trên 1,000mg/kg [4], [5].

1.3.4. Tác dụng của Monacolin K trong chữa trị các bệnh tim mạch

1.3.4.1. Vai trò của Monacolin K

- Làm chậm quá trình tổng hợp cholesterol.

- Làm giảm hàm lượng cholesterol trong tế bào.

- Tăng cường sự tổng hợp của HDL, tăng cường hoạt động và số lượng của chúng, làm

giảm mật độ LDL trong máu.

+ LDL là yếu tố quan trọng nhất dẫn đến chứng xơ vữa động mạch, bởi vì Monacolin

K làm giảm rất hiệu quả hàm lượng LDL nên có thể ngăn ngừa được chứng bệnh này.

+ HDL là một trong những phức chất rất hữu ích trong cơ thể. Nó mang những

cholesterol không cần thiết về gan và bài tiết ở đó, điều này ngăn ngừa sự tích tụ của

cholesterol. Quá trình này được gọi là “sự vận chuyển đảo ngược cholesterol”. Càng nhiều

HDL vận chuyển, càng có nhiều cholesterol được thải ra ngoài.

- Điều khiển sự tổng hợp triglyceride, các acid béo làm tăng quá trình chuyển hóa

chúng.

1.3.4.2. Cơ chế hoạt động

Monacolin K là tiền thuốc (prodrug) (dạng mevinolin) mà có ít hoặc gần như không

có tác động nào, nhưng khi bị thủy phân trong cơ thể nó sẽ chuyển thành mevinolinic acid là

dạng hoạt hóa.

Acid này có cấu trúc tương tự với HMG-CoA (hydroxymethyl glutaryl CoA). Khi bị

thủy phân, Monacolin K ức chế hoạt động của enzyme HMG-CoA reductase là một enzyme

ở gan. Sự can thiệp vào hoạt động của enzyme này sẽ làm giảm lượng acid mevalonic là tiền

chất của cholesterol. Kết quả làm giảm cholesterol trong cơ thể [10].

Monacolin K ảnh hưởng trực tiếp đến tổng lượng cholesterol và LDL-c mà không

ảnh hưởng đến HDL-c và triglyceride.

Hình 1.5. Monacolin K ngăn chặn sự sản sinh HMG-CoA [3]

1.3.5. Quá trình lên men sản xuất Monacolin K

1.3.5.1. Những ảnh hưởng làm tăng lượng Monacolin K trong lên men [5]

Thông thường, quá trình sản xuất Monacolin K có thể chịu ảnh hưởng của thành

phần môi trường và các yếu tố tự nhiên bao gồm: nhiệt độ, pH, độ ẩm, hàm lượng succrose,

nguồn nitrogen, nguồn carbon, các yếu tố vi lượng và thời gian lên men…

a. Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu cho quá trình tạo thành Monacolin K từ 24-26oC. Tuy

nhiên, để sản xuất lượng sắc tố thì cần nhiệt độ nuôi cấy cao hơn.

b. pH: được điều chỉnh ở mức 4.0 (bằng acd acetic), ở mức pH này có thể ngăn ngừa

sự xâm nhiễm của các loại vi khuẩn, đồng thời giúp nấm mốc phát triển tốt nhất. Kết quả

này cũng tương tự như sự sản sinh sắc tố từ mốc Monascus.

c. Thành phần môi trường [18].

Nguồn nitơ: Bột đậu nành là một cơ chất rất quan trọng và cần thiết cho quá trình tạo

Monacolin K.

Nguồn carbon: Sắc tố được kích hoạt tạo thành vào ngày thứ 2, sau đó Monacolin K

được kích hoạt vào ngày thứ 6. Khi đó, việc bổ sung glycerol vào đã làm tăng lượng

Monacolin K gấp 2,7 lần so với nhóm không bổ sung glycerol.

Khi bổ sung đồng thời glycerol và pepton với tỷ lệ G/P là 33, Monacolin K tăng gấp

3,5 lần so với nhóm đối chứng.

Khi bổ sung ethanol vào môi trường nuôi cấy nhận thấy: [18]

- Citrinin giảm từ 813 ppb xuống còn 561 ppb.

- Monacolin K tăng từ 1060 mg/kg lên 7453 g/kg.

Ngoài ra, khi kết hợp nấm men đỏ với một số vi sinh vật khác như: Asp. oryzae,

S.cerevisiae, hàm lượng Monacolin K tạo thành cũng tăng lên rất nhiều lần so với đối

chứng.

1.4. Khái quát về CITRININ

1.4.1. Cấu trúc phân tử

Tên khoa học: (3R-trans)-4,6- Dihydro-8 hydroxy-3,4,5 – trimethyl-6-oxo-3H-2-

benzopyran-7-carboxylic acid. [2], [9].

Hình 1.6. Cấu trúc phân tử và không gian của citrinin.

1.4.2. Đặc tính sinh học

Citrinin được tách chiết lần đầu tiên từ môi trường nuôi chủng Penicillium citrinum

vào năm 1931. Nó được xếp vào loại mycotoxin, sự xuất hiện của nó thường đi kèm với sự

hiện diện của một độc tố nấm khác là orcharotoxin A. Ngoài ra citrinin còn được tìm thấy

trong Aspergillus các loại ngũ cốc, trái cây và các loại đậu.

Năm 1977, Wong và Bau phát hiện trong Monascus purpureus có citrinin được gọi

tên là Monascidin A có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn như: Bacillus,

Streptococcus, Pseudomonas, Staphylococcus aureus [3], [13]. Nhưng không phải các

chủng Monascus đều tạo ra citrinin, Monascus tạo ra citrinin còn tùy thuộc vào điều kiện

môi trường và điều kiện nuôi cấy [53].

Năm 1994, Dresel cho rằng vi khuẩn gram dương thường bị ức chế nhiều hơn là vi

khuẩn gram âm, thời gian đầu người ta cho rằng nó là chất kháng sinh có tiềm năng to lớn,

nhưng những thử nghiệm trên động vật sau đó đã bác bỏ ý kiến trên do nó gây ảnh hưởng

lên gan, thận. Tuy nhiên riêng Lactobacilus thì không bị ảnh hưởng [53].

Liều gây chết 50% của citrinin (LD50) là 50mg/kg trên chuột và 19mg/ kg trên thỏ.

1.4.3. Đặc tính vật lý và hóa học của citrinin

Citrinin là phân tử có cấu tạo đơn giản và trọng lượng phân tử thấp, dạng kết tinh citrinin có màu vỏ chanh hình dạng sắc nhọn, tan chảy 1720C. Ít tan trong nước, tan trong

NaOH, CaCO3, CH3COONa tan nhiều trong methanol, acetonitrile, ethanol và các dung môi

phân cực. Citrinin bị phân hủy bởi ánh sáng và phát sáng dưới đèn huỳnh quang cả khi ở

dạng rắn hay dung dịch, nó có thể bị mất hoạt tính bởi dung dịch kiềm hay acid và kém bền

nhiệt.

1.4.4. Vấn đề an toàn sức khỏe khi sử dụng các sản phẩm từ nấm men đỏ

Mặc dù một số chủng Monascus có khả năng tổng hợp citrinin. Nhưng các sản phẩm

từ nấm men đỏ được cho là an toàn do lượng độc tố rất thấp, không có khả năng ảnh hưởng

lên cơ thể. Đã có những thí nghiệm chứng minh rằng nguy cơ bị ảnh hưởng nhỏ hơn 0,2%.

Bằng chứng là trên thị trường hiện nay có rất nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ bột gạo men

đỏ như: chao đỏ (Trung Quốc), rượu vang đỏ, pate, xúc xích, dăm bông (Pháp), các loại

thuốc dùng để điều trị cao huyết áp…[15].

Tuy nhiên một số khuyến cáo khi sử dụng sản phẩm từ Monascus là không nên sử

dụng các sản phẩm trên nước ép cam chanh hoặc bưởi do nó làm tích tụ Lovastain trong cơ

thể nên rất nguy hiểm. Ngoài ra cũng không nên sử dụng chung với niacin (vitamin B3) với

liều lượng lớn hơn 1g/ ngày [3].

1.5. Khái quát về CHOLESTEROL

1.5.1. Giới thiệu

Cholesterol là một chất mềm dẻo, sáp giống như chất béo được tìm thấy trong máu

và trong tất cả các tế bào. Cholesterol cần thiết cho sự sống, nó vừa được dùng để xây dựng,

sửa chữa tế bào, sản sinh ra các hormone giới tính giống như estrogen và testosterone, nó

được chuyển hóa thành dạng acid mật giúp cho cơ thể tiêu hóa thức ăn, được dùng để sản

sinh ra lớp màng tế bào, một số hormone và cung cấp các nhu cầu cần thiết khác cho cơ thể,

được tìm thấy với số lượng trong não và mô thần kinh.

1.5.2. Quá trình sinh tổng hợp cholesterol

Cholesterol có 2 nguồn gốc [49]:

- Do gan tạo ra chiếm 80%. Gan có thể tổng hợp cholesterol từ các chất khác nhau

như đường đạm.

- Từ nguồn thực phẩm có nguồn gốc động vật như: thịt, cá, trứng, gia cầm, bơ, sữa,

phô mai… chiếm 20%.

Thực phẩm từ thực vật như trái cây, rau, củ, quả, ngũ cốc thì không có cholesterol.

Cholesterol là một phân tử sinh học rất quan trọng, đóng vai trò trong cấu trúc màng cũng

như tiền chất trong sự tổng hợp các hormone steroid và acid mật. Cả cholesterol trong thức

ăn và cholesterol được tổng hợp sau đó đều được vận chuyển nhờ các phân tử lipoprotein.

Cholesterol thường được tích tụ trong tế bào dưới dạng cholesteryl ester.

Quá trình tổng hợp cholesterol thường diễn ra trong tế bào chất và microsomes từ

nhóm acetate 2C của acetyl CoA. Quá trình gồm 5 bước chính: [52]

Acety-CoA chuyển thành 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA). 1.

HMG-CoA chuyển thành mevalonate. 2.

Mevalonate chuyển thành isopentenyl pyrophosphate (IPP), đi kèm với sự mất 3.

CO2.

IPP chuyển thành squalene. 4.

Squalene chuyển thành cholesterol. 5.

Hình 1.7. Sơ đồ sinh tổng hợp cholesterol [52].

1.5.3. Ảnh hưởng của cholesterol đối với bệnh tim mạch

- Tại tim: làm hẹp động mạch đến nuôi tim, gây ra đau thắt ngực mà nặng hơn là nhồi

máu cơ tim.

- Tại não: Làm giảm lượng máu đến nuôi não, gây ra hiện tượng chóng mặt, tê người,

yếu liệt thậm chí là té xỉu, nặng nhất là tai biến mạch máu não.

- Nếu động mạch đế nuôi chân bị ảnh hưởng: người bệnh có cảm giác đau ở chân khi

đi nhiều, ngồi nghỉ một lát thì đỡ đau nhưng nếu tiếp tục đi thì lại đau trong y học gọi là đau

cách hồi.

- Nếu động mạch đến nuôi thận bị hẹp gây tổn thương thận.

- Tác hại khác là sự hình thành cục máu đông kết hợp với xơ vữa động mạch gây nên

hậu quả nghiêm trọng dễ dẫn đến đột quỵ, tai biến và tử vong.

- Ngoài ra, việc tăng lipit huyết cũng kích hoạt một số căn bệnh khác như tiểu đường,

gan nhiễm mỡ, cao huyết áp và béo phì.

Hình 1.8. Ảnh hưởng của cholesterol đối với bệnh tim mạch.

1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước [5].

1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng chất màu đỏ-vàng và Monacolin K trong

công nghiệp thực phẩm và y tế đã được phát triển mạnh mẽ ở nhiều nước trên thế giới từ

những năm 1980 cho đến nay.

Nghiên cứu nâng cao hiệu suất tổng hợp sắc tố màu đỏ và Monacolin K bằng các

biện pháp công nghệ như tối ưu điều kiện nuôi cấy: nguồn dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm,

pH…cùng với kỹ thuật gây đột biến để tạo ra các chủng Monascus cho khả năng tổng hợp

sắc tố và Monacolin K cao. Hiện nay việc sản xuất gạo men đỏ chủ yếu bằng phương pháp

lên men bán rắn, nguyên liệu sản xuất là gạo tẻ. Gạo sau khi hấp chỉ cấy giống sau thời gian

lên men thu hoạch, sấy khô, nghiền mịn. Các sản phẩm bán ra thị trường có hàm lượng

Monacolin K thấp, hình thức phổ biến là dưới dạng viên nén hay con nhộng.

Có 3 nhóm chế phẩm chính từ gạo nấm men đỏ:

- Zhitai: Được sản xuất bằng cách lên men với hỗn hợp các chủng M. purpureus khác

nhau trên cùng một loại gạo.

- Cholestin hoặc Hypocol: Được sản xuất bằng lên men chủng M. purpureus có chọn

lựa, sử dụng một quy trình độc quyền để sản sinh ra một lượng xác định Monacolin K.

- Xuezhikang: được sản xuất bằng cách pha trộn giữa gạo, nấm men đỏ với cồn sau

đó trải qua một quá trình xử lý để loại tất cả các gluten của gạo. Xuezhikang chứa lượng

Monacolin K nhiều hơn Cholestin (hơn 40%).

- Tại Mỹ, gạo nấm men đỏ được bán dưới dạng sản phẩm bổ trợ tiêu hóa gọi là

Cholestin TM (Pharmanes, Inc).

- Tại Singapore, gạo nấm men đỏ được bán với tên gọi là: HypocolTM (Nalture

WiseTM, Wearnes Biotech & Medicals, 1998).

Cả hai sản phẩm này đều có thành phần tương tự nhau.

- Tại Trung Quốc, Xuezhikang được bán dưới tên gọi cũng chính là Xuezhikang

(Beijing WBL Peking University Biotech., Itd).

1.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chất màu đặc biệt là các chất

có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật còn hạn chế. Từ những năm 70 các nhà nghiên cứu Viện

công nghệ thực phẩm đã tiến hành nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất chao đỏ bằng

nấm sợi M. purpureus. Sản phẩm đạt chất lượng và không có độc tố. Công nghệ này được

phổ biến và cung cấp cho một số cơ sở ở miền Bắc.

Năm 2000-2002, các đề tài cấp bộ nông nghiệp “Nghiên cứu công nghệ khai thác

chất màu thực phẩm từ thực vật và vi sinh vật” và “nghiên cứu dạng chế phẩm màu từ vi

sinh vật và ứng dụng vào một số thực phẩm” đã tạo ra được màu đỏ của xúc xích, rượu

vang (Phan Thị Sửu và Phan Tố Nga, 2000; Phan Tố Nga và Vũ Nguyên Thành, 2003).

Năm 2007, Nguyễn Minh Nguyệt và cộng sự đã nghiên cứu và chọn lọc giống nấm

Rhodotorula có khả năng phát triển cùng M. purpureus để tạo sản phẩm giàu dinh dưỡng.

Trong nghiên cứu này, chủ yếu sử dụng Monascus như là vi sinh vật phân giải tinh bột giúp

cho sự phát triển của Rhodotorula.

Ngoài ra, Lê Đức Mạnh và cộng sự cũng đã nghiên cứu về khả năng tạo sắc tố,

Lovastatin và độc tố citrinin trên 2 chủng M. purpureus cho thấy chỉ 1 chủng M. purpureus

3403 tạo Lovastatin rất thấp (60µg/g sản phẩm khô). Mới đây, 2012 Vũ Thanh Thảo và

cộng sự cũng nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy M. purpureus trên chất nền là gạo

để thu sinh khối giàu Monacolin K cũng đạt được những thành công nhất định – xác định

được điều kiện tối ưu để cho hàm lượng Monacolin K cao nhất. Như vậy, các nghiên cứu

hiện nay còn ít và chưa được phổ biến trong khi lợi ích thu được từ kết quả nghiên cứu đem

lại tìm năng ứng dụng rất to lớn.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1. Giống vi sinh vật và nguyên liệu:

- Chủng nấm Monascus purpureus N.212 do TS. Nguyễn Hữu Phúc cung cấp.

- Chủng nấm Saccharomyces cerevisiae từ Viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp dùng

trong khảo sát đồng nuôi cấy.

- Gạo tài nguyên loại I, mua tại chợ Thủ Đức - TP. Hồ Chí Minh.

2.1.2. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng

- Môi trường PGA (potato glucose agar) dùng nuôi cấy nấm mốc [6].

+ Khoai tây 200g, glucose 20g, agar 20g, nước cất vừa đủ: 1000ml, pH 6,5-7.

- Môi trường lên men

+ Gạo tấm tài nguyên Việt Nam loại I, kích thước 2mm, pH được chỉnh về 4 bằng

acid acetic (CH3COOH).

- Môi trường Hasen nuôi cấy nấm men [6].

+ Glucose 50g, pepton 10g, KH2PO4 3g, MgSO4 3g, agar 20g, nước vừa đủ

1000ml, pH 6.

- Môi trường gelatin [6].

+ K2HPO4 1,5g, KH2PO4 1,5g, gelatin 10g, agar 16g, nước cất 1000ml.

- Môi trường Capeck [6].

+ NaNO3 3g, K2HPO4 1g, tinh bột tan 15g, KCl 0,5g, MgSO4.7H2O 0,5g, FeSO4

0,01g (vết), agar 20g, nước cất cho đủ 1000ml, pH 7±0,2.

2.1.3. Hóa chất:

- Dùng trong tạo môi trường nuôi cấy: Glucose, pepton, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4,

FeSO4, NaCl, acid acetic, cao nấm men, gelatin, tinh bột tan (Trung Quốc), agar, nước cất…

- Ethanol 96%, NaOH, CH3COOH, HCl (Trung Quốc)…

- Thuốc nhuộm Fuchsin, xanh methylen, lugol (Trung Quốc), HgCl2 (Merck).

- Chất chuẩn Statin: Thuốc Lovastatin của xí nghiệp Domesco – Đồng Tháp (hàm

lượng Monacolin K 20mg/ viên).

- Hóa chất trong xác định hoạt tính ezyme [1]:

+ Amylase: Tinh bột 1%, NaCl 3%, đệm photphat 1/15M, lugol 1%, HCl 1N

+ Protease: Tyrosin chuẩn (Merck), casein 1%, acid tricloacetic (TCA) 5%, folin (tỷ lệ

với nước 1:4), NaOH 0,5N, Na2CO3 6%, HCl 0,2N.

2.1.4. Thiết bị và dụng cụ:

- Thiết bị nuôi cấy: Tủ cấy, đèn cồn, que cấy, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp vô trùng, tủ lạnh,

bếp điện ,…

- Thiết bị phân tích: Kính hiển vi (Nikon – Nhật), lame, cân kỹ thuật, cân phân tích,

máy đo pH (Thermo Orion), máy ly tâm (Hermle Labortechnik – Đức), máy đo quang phổ

(Agilent – USA), bể ổn nhiệt (Memmert - Đức), máy cô quay (Heidolph - Đức),…Tất cả

thiết bị trên đều có tại Viện Sinh học Nhiệt đới.

- Dụng cụ thủy tinh: Ống đong, đĩa Petri, bình tam giác 250ml, pipet, phễu, pipetman,

ống nghiệm, bình định mức (100ml, 250ml)…

2.2. Nội dung thí nghiệm

Giống Monascus purpureus N.212

Lên men gạo

- Thời gian - Độ ẩm pH - - Số lượng giống - Nguồn Carbon, nitơ - Đồng nuôi cấy

Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy

Sấy, nghiền

- Ethanol 70o

Xử lý mẫu sau lên men

- Định lượng sắc tố - Định lượng monacolin K - Định lượng sắc tố - Độ bền dịch chất - Định lượng Monacolin K - Độ bền dịch chiết

Trích ly

Dịch mẫu thô và phân tích

2.3. Phương pháp thí nghiệm:

2.3.1. Quan sát hình thái nấm Monascus

2.3.1.1. Quan sát đại thể

- Để quan sát hình dạng khuẩn lạc của nấm M. purpureus N.212 tiến hành cấy chấm

điểm trên đĩa Petri chứa MT PGA nuôi ở nhiệt độ phòng.

- Thời gian quan sát hằng ngày bằng mắt thường cấy đến 17 ngày. Đo đường kính

khuẩn lạc, quan sát màu sắc, đặc điểm khuẩn lạc theo từng thời gian [7].

2.3.1.2. Quan sát vi thể

- Để dễ quan sát hình thái cấu trúc sợi nấm và các cơ quan sinh sản của nấm M.

purpureus N.212 ở trạng thái tự nhiên chúng tôi dùng phương pháp nuôi cấy phòng ẩm [7].

. Nuôi cấy phòng ẩm:

Đặt vào đáy đĩa Petri một tờ giấy thấm sau đó là một phiến kính. Đậy nắp đĩa Petri

lại, gói giấy và hấp khử trùng. Lấy từ đĩa Petri có chứa môi trường PGA đã vô trùng để vào

tủ cấy gần đèn cồn, dùng que mũi mác cắt lấy một miếng thạch nhỏ, rồi mở hé nắp đĩa Petri

đặt miếng thạch lên phiến kính. Bổ sung một ít nước cất vô trùng, đủ thấm ướt giấy thấm để

giữ độ ẩm.

Dùng que cấy móc thu lấy khuẩn ty bằng cách khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm, chấm

đầu que cấy lên phần thạch của phiến kính trong phòng ẩm. Gói cả hộp lại và ủ ở nhiệt độ

thích hợp 2-3 ngày.

Lấy phiến ra khỏi đĩa Petri, dùng giấy thấm lau mặt đáy phiến kính, đậy một lá kính

lên chỗ có khuẩn lạc mọc và đặt dưới KHV quan sát với vật kính x10, x40, x100.

2.3.2. Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật.

- Để xác định số lượng bào tử và số lượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu, sử dụng

phương pháp xác định gián tiếp bằng cách đếm khuẩn lạc trên môi trường PGA chọn lọc.

- Nguyên tắc: Pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, sao cho có

độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ trên bề mặt

thạch với số lượng đủ lớn, để hạn chế sai số và tính toán, số lượng khuẩn lạc tối ưu là 25 -

250 khuẩn lạc/đĩa [6].

- Thực hiện:

+ Đổ 15ml MT PGA vào đĩa Petri vô trùng để thạch đông.

+ Pha loãng mẫu thành nhiều mật độ pha loãng thích hợp.

+ Dùng pipet và đầu típ vô trùng chuyển 100µl mẫu pha loãng trên mặt thạch dùng

que gạt khử trùng trãi đều dịch giống.

+ Ủ đĩa trong tủ ấm ở 280C-300C trong 2-3 ngày. Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc.

- Tính kết quả: Mật độ tế bào trong mẫu được tính như sau:

Mi = Ai x Di/V (CFU/ml)

Trong đó: Ai: số khuẩn lạc trung bình/ đĩa; Di: độ pha loãng; V: thể tích dịch mẫu cho

vào đĩa (0,1ml).

2.3.3. Xác định độ ẩm ban đầu của gạo và độ ẩm gạo sau lên men

2.3.3.1. Độ ẩm ban đầu của gạo: Sau khi ngâm cơ chất gạo qua một đêm, vớt ra để

ráo nước, lấy 10g gạo cho vào đĩa Petri. Cân Petri có mẫu và ghi nhận số liệu. Đem petri đi

sấy đến khối lượng không đổi, ghi nhận số liệu sau khi sấy. Kết quả tính theo công thức:

W(%) = (trọng lượng mẫu trước sấy – trọng lượng mẫu sau sấy)/10*100

2.3.3.2. Độ ẩm gạo sau lên men: Cân chính xác 1g mẫu thu được sấy khô đến khối

lượng không đổi cân lại trọng lượng khô. Kết quả được tính theo công thức:

W(%) = (trọng lượng ướt – trọng lượng khô)/ trọng lượng ướt *100

2.3.4. Phương pháp lên men thu nhận chế phẩm

- Chuẩn bị môi trường lên men (môi trường rắn trên cơ chất gạo)

+ Gạo nguyên hạt được vo sơ để rửa nhằm loại bỏ bụi bẩn, ngâm qua đêm, pH = 4,

sau đó vớt ra để ráo nước.

+ Cho vào erlen 250ml với lượng 20g, đậy nút bông hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C,

thời gian 20 phút, lấy ra để ở nhiệt độ phòng, cấy giống từ ống thạch nghiêng đã nuôi trước

đó 7- 10 ngày.

- Chuẩn bị giống cho lên men:

+ Hút 10ml nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng cho vào mỗi ống giống, dùng

que cấy đánh đều bào tử trên mặt thạch hòa tan vào nước.

+ Dùng pipet hút 2ml (23x106 CFU/ml) cho vào môi trường lên men nói trên.

Sau khi cấy xong để các bình môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 20 ngày nuôi cấy, sấy khô mẫu sau lên men ở 50oC trong 24 giờ ta thu được sản phẩm bảo quản ở

nhiệt độ thường để tiến hành định lượng sắc tố và Monacolin K.

2.3.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố và

Monacolin K

2.3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

- Để xác định thời gian cho lượng sắc tố và Monacolin K sinh ra cao nhất trong quá

trình lên men, chúng tôi tiến hành như sau:

+ Chuẩn bị môi trường lên men giống như ở mục 2.3.4, bổ sung thêm nước để có độ

ẩm 30% tiến hành lên men.

+ Phân tích mẫu theo từng thời gian, bắt đầu từ lúc màu môi trường chuyển sang màu

đỏ (ngày thứ 5), lấy mẫu vào các ngày 5, 7, 10, 12, 14, 17, 20, 22. Định lượng sắc tố và

Monacolin K có trong mẫu.

+ Vẽ biểu đồ đường biến thiên theo thời gian. Rút ra kết luận.

2.3.5.2. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu

- Để xác định độ ẩm cần thiết cho môi trường lên men ở chủng M. purpureus N.212

chúng tôi làm như sau:

- Môi trường gạo bổ sung nước với thể tích lần lượt là: 5,03, 10,04, 17,55, 30,06ml

(độ ẩm tương ứng lần lượt là: 40%, 50%, 60% và 70%). Môi trường tiệt trùng và lên men

theo cách trên. Sau 17 ngày thu nhận sản phẩm, đem tiến hành định lượng sắc tố và

MonacolinK có trong mẫu.

2.3.5.3. Ảnh hưởng của số lượng giống

- Để xác định số lượng giống cần thiết cho môi trường lên men của chủng M.

purpureus N.212 chúng tôi tiến hành như sau:

+ Môi trường được chuẩn bị như mục 2.3.4, hấp khử trùng và lên men ở các nồng độ khác nhau chúng tôi chọn các nồng độ 104,105, 106(CFU/ml). Thu lấy mẫu vào các ngày 5,

8, 11, 14, 17, 20.Tiến hành định lượng sắc tố và Monacolin K có trong mẫu.

2.3.5.4. Ảnh hưởng pH ban đầu

- Để xác định ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sắc tố và Monacolin K của M.

purpreus N.212 chúng tôi tiến hành như sau:

+ Ngâm gạo trong nước có pH 4, 5,5 và 7 điều chỉnh bằng CH3COOH và NaOH.

Tiến hành tiệt trùng, lên men như trên, trích mẫu vào các ngày 5, 7, 10, 13, 15, 18. Định

lượng sắc tố cũng như hàm lượng Monacolin K có trong mẫu.

2.3.5.5. Ảnh hưởng nguồn nitơ 0.5%

- Để xác định ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sinh tổng hợp sắc tố và Monacolin K

của M. purpureus N.212. Chúng tôi tiến hành như sau:

+ Bổ sung pepton, NaNO3, (NH4)2SO4 và cao nấm men 0,1g tương ứng với nồng độ

0,5%. Tiến hành lên men trong 17ngày thu nhận mẫu, phân tích định lượng sắc tố và

Monacolin K có trong mẫu

2.3.5.6. Ảnh hưởng nguồn carbon

- Để xác định ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh tổng hợp sắc tố và Monacolin K

của M. purpureus N.212, chuẩn bị môi trường bổ sung thêm:

+ Thành phần glucose theo 3 nghiệm thức: 0,1g, 0,2g, 0,4g tương ứng với nồng độ

0,5%, 1% và 2%. Lên men trong 17ngày thu nhận mẫu, phân tích định lượng sắc tố và

Monacolin K có trong mẫu.

+ Thành phần ethanol 70% theo 3 nghiệm thức 0,3%, 0,5%, 0,7% được bổ sung vào

sau khi môi trường hấp tiệt trùng. Sau 17ngày lên men tiến hành thu mẫu, phân tích, định

lượng sắc tố và Monacolin K có trong mẫu.

2.3.5.7. Ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol

- Để xác định ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol vào môi trường tác động đến sự

tống hợp sắc tố và Monacolin K, chúng tôi tiến hành như sau:

+ Bổ sung vào môi trường lên men lượng glycerol với nồng độ lần lượt là: 0,8%,

2,4%, 4% (V/m). Tiến hành khử trùng và lên men trong 17 ngày thu nhận mẫu, phân tích,

định lượng sắc tố và Monacolin K có trong mẫu.

2.3.5.8. Ảnh hưởng của việc nuôi cấy kết hợp với S.cerevisiae

- Để khảo sát ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy nấm M. purpureus N.212 với giống

vi sinh vật khác đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố và Monacolin K, chúng tôi tiến hành như

+ Môi trường khử trùng để nguội, cấy giống M. purpureus N.212 đồng thời bổ sung 1ml nấm men S.cerevisiae (12x104 CFU/ml) vào môi trường. Tiến hành lên men, sau 17

ngày thu mẫu,phân tích, định lượng sắc tố và Monacolin K có trong mẫu.

2.3.6. Phương pháp trích ly sắc tố

 Cách tiến hành: - Gạo sau khi lên men được sấy khô 500C trong 24 giờ, nghiền

mịn.

- Cân 0,5gam bột mịn cho vào 10 ml ethanol 70%, lắc 120 vòng/ phút trong 2giờ ở

nhiệt độ phòng.

- Ly tâm 5000 vòng/ phút trong 10 phút để loại bỏ chất lơ lửng. Hút dịch nổi cho vào

ống nghiệm, pha loãng với ethanol 700 đến mức có thể đo được, lắc đều.

- Dung dịch nổi được phân tích bằng máy đo quang phổ với mẫu đối chứng ethanol

70%.

- Đơn vị sắc tố đỏ là một sắc tố được trích ly ra bằng ethanol 70% và đo ở bước sóng

410nm (sắc tố vàng) và 505nm (sắc tố đỏ) trong cuvette 1cm.

- Mẫu được pha loãng đến mức độ cần thiết, kết quả tính bằng đơn vị hấp thu (AU)

trên gram sản phẩm thô.

- Tổng số sắc tố hấp thu (AU/g) = Abs x (10/0,5) x df

Trong đó: Abs: độ hấp thu mẫu; df: hệ số pha loãng

2.3.7. Xác định hàm lượng Monacolin K

Nguyên tắc: Monacolin K có độ hấp thu cao nhất tại bước sóng 238nm. Dịch trong

thu nhận được pha loãng đến nồng độ có thể đo được. Đo mật độ quang ở bước sóng

238nm, từ đường chuẩn suy ra nồng độ Monacolin K có trong mẫu.

2.3.7.1. Phân tích Monacolin K từ gạo nấm men đỏ

- Cân 0,5gam mẫu bột gạo sau lên men, cho vào bình tam giác 10ml ethanol 70%, lắc

120 vòng/ phút trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó ly tâm 5000 vòng/ phút, thời gian 10

phút ở nhiệt độ phòng. Thu dịch trong, pha loãng mẫu nếu cần thiết rồi đem đo ở bước sóng

238nm. Dựa vào đường chuẩn xác định lượng Monacolin K tạo thành trong mẫu đo.

- Tính kết quả:

Tổng lượng Monacolin K tạo thành (mg/g) = C x (10/0,5) x df

C: nồng độ Monacolin K có trong mẫu đo

df: hệ số pha loãng

2.3.7.2. Xây dựng đường chuẩn Monacolin K

Vì không có Monacolin chuẩn, chúng tôi sử dụng gián tiếp theo hàm lượng của viên

thuốc Lovastatin có bán trên thị trường TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. Trong đó mỗi viên

chứa 20mg Monacolin K.

- Pha dung dịch Monacolin K chuẩn (1mg/ml).

+ Nghiền mịn 1viên thuốc Lovastatin. Thêm vào 20ml ethanol 700.

+ Lắc trong 1giờ ở nhiệt độ phòng.

+ Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10phút.

+ Bỏ bã và thu dịch Monacolin K chuẩn.

- Dựng đường chuẩn:

+ Pha theo bảng 2.1.

Ống số 1 2 3 4 5

Dung dịch Monacolin K (ml) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Ethanol 700 (ml) 9,95 9,9 9,85 9,8 9,75

5 10 15 20 25 Nồng độ Monacolin K (µg/ml)

- Đem đo ở bước sóng 238nm ghi nhận kết quả, xây dựng đường chuẩn Monacolin K

dựa vào kết quả ghi nhận.

2.3.8. Đặc tính sinh học của chế phẩm gạo men đỏ:

Chuẩn bị dung dịch chế phẩm enzyme:

- Cân 1gam chế phẩm gạo đỏ cho vào cốc thủy tinh 25ml, thêm vào 20ml dung dịch

đệm photphat, trộn đều, để yên 20phút. Tiến hành thu lấy dịch trong (Với Amylase sử dụng

đệm có pH 5,5, protease đệm có pH 7,6).

2.3.8.1. Phương pháp định tính amylase và protease căn cứ vào vòng phân giải cơ

chất của dịch chiết enzyme [1].

Nguyên tắc: Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch chứa môi trường cần

thử hoạt tính. (Môi trường Zapeck đối vối amylase, môi trường Gelatin đối với protease).

- Các enzyme đặc trưng được chúng tiết ra môi trường xung quanh dưới dạng vòng

trong suốt bao quanh lỗ thạch, gọi là vòng thủy phân. Dựa vào đường kính vòng phân giải

và đường kính khuẩn lạc đánh giá khả năng hình thành enzyme chế phẩm.

Tiến hành: Để định tính enzyme của chế phẩm gạo men đỏ chúng tôi tiến hành như

- Đổ vào đĩa Petri môi trường tương ứng với từng enzyme: Môi trường Zapeck đối

vớii amylase và môi trường Gelatin đối với protease.

+ Dùng ống nghiệm nhỏ (d = 12mm) khử trùng đục lỗ thạch, sau đó nhỏ 100µl dung dịch enzyme đã trích ly như trên vào lỗ thạch. Bao gói ủ ở 35oC trong 18h. Sau đó cho chất

thử (lugol 1% đối với amylase và dung dịch HgCl2 đối với protease) lên bề mặt môi trường

quan sát, ghi nhận lại kết quả.

2.3.8.2. Định lượng hoạt tính enzyme của gạo men đỏ

Amylase:

Nguyên tắc: Amylase có khả năng thủy phân tinh bột tạo các dextrin, có phân tử

lượng khác nhau. Khi cho tác dụng với iot chúng sẽ tạo màu. Đo cường độ màu tạo thành sẽ

tính được hoạt độ amylase. Đó chính là lượng enzyme xúc tác thủy phân được 1mg tinh bột tạo thành dextrin ở nhiệt độ 300C trong 30 phút.

Thực hiện: Lấy 2 ống nghiệm (ống chuẩn và ống thử).

+ Ống chuẩn: 1ml nước cất, 1ml đệm photphat 1/15M, lml hồ tinh bột, 0,5ml NaCl

3%.

+ Ống thử: 1ml dịch enzyme, 1ml đệm photphat 1/15M, lml hồ tinh bột, 0,5ml NaCl

3%.

Ủ 400C trong 30 phút, sau đó lần lượt cho vào ống nghiệm 1ml HCl 1N. Thêm nước

cất cho đủ mỗi ống, cho vào mỗi ống 1 giọt lugol 1%. Đo mật độ quang ở bước sóng

600nm.

Đơn vị hoạt tính: UI =

Trong đó: Eo: Mật độ quang ống chuẩn; Ek: mật độ quang ống thử

C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng

L: hệ số pha loãng (20)

t: thời gian phản ứng (30phút)

Protease: Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Anson cải tiến [1].

Nguyên tắc: Cho protease tác dụng với casein hoặc hemoglobin, sau đó kết tủa

protein dư thừa bằng TCA, xác định bằng phản ứng màu với thuốc thử folin.

Biểu diễn hoạt tính bằng đơn vị hoạt độ. Một đơn vị hoạt độ lượng enzyme trong

1nphút ở 30oC phân giải được lượng protein tương ứng với 1µmol tyrosin.

 Xây dựng đường chuẩn tyrosin:

- Chuẩn bị 6 ống nghiệm (đánh dấu 1, 2, 3, 4, 5, 6) và bổ sung các dung dịch theo

hàm lượng như sau:

+ Dung dịch tyrosine chuẩn (ml): 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5

+ Lượng tyrosine tương ứng (µmol/l): 0,0; 0,1; 0.2; 0,3; 0,4; 0,5

+ Dung dịch HCl 0.2N (ml): 2,5; 2,4; 2,3; 2,2; 2,1; 2,0

+ Dung dịch NaOH 0.5N (ml): 5,0; 5,0; 5,0; 5,0; 5,0; 5,0

+ Dung dịch Folin (1:3) (ml): 1,5; 1,5; 1.5; 1,5; 1,5; 1,5

Lắc mạnh sau 5-10phút, đo OD ở bước sóng λ = 660nm. Tính hiệu số mật độ quang

giữa các ống với ống số 1.

+ Dựng đồ thị biểu hiện sự tương quan giữa ∆OD (ΔOD = ODTN - ODKC ) với nồng

độ protein của các ống.

- Tiến hành thí nghiệm: Lấy 2 ống nghiệm sạch, khô (ống chuẩn và ống thử).

Ống nghiệm Dung dịch hóa chất

Ống chuẩn

Dung dịch casein 1% (ml) Dung dịch TCA 5% (ml) Dung dịch enzyme mẫu (ml) Ống thử 1 2,5 0,5 1 2,5 0,5ml nước cất

Lắc đều và giữ ở 35.5oC trong 10 phút Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới

+ Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 0,5ml dịch lọc của ống chuẩn và

cho vào ống thứ hai 0,5ml dịch lọc của ống thử.

+ Thêm vào mỗi ống 2ml Na2CO3 6% và 0,5ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 30

phút đo OD ở bước sóng 660 nm. ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn tính

được µM tyrosine.

- Tính kết quả:

Hoạt độ cuả 1ml dung dịch enzyme chế phẩm: UI =

Trong đó: V là toàn bộ thể tích hỗn hợp phản ứng (1ml casein + 0,5ml dịch chế phẩm

+ 2,5 dd TCA)

t: thời gian phản ứng (10 phút)

a: lượng chế phẩm lấy đi xác định (1g)

C: hệ số pha loãng (20)

2.3.9. Khảo sát độ bền của dịch màu

- Để có thêm thông tin về sự lưu trữ độ bền dịch màu, phần này sẽ tiến hành khảo sát

dịch màu trong môi trường dưới tác động của ánh sáng, nhiệt độ theo thời gian.

- Độ bền của dịch trích và bột màu được đánh giá bởi đặc tính màu: phần trăm màu

còn lại sau 60 ngày quan sát.

- Công thức xác định % màu còn lại:

% A còn lại = At/A0 x 100%

Trong đó:

At: độ hấp thu của mẫu tại thời điểm t đo xác định. (t = 0:60)

A0: độ hấp thu của mẫu tại bước sóng cực đại ban đầu với mỗi mẫu nghiên

cứu. (t =0)

- Mẫu được lưu trữ ngoài ánh sáng tự nhiên ở nhiệt độ phòng.

Cân lượng chính xác bột gạo đỏ sau lên men hòa tan trong ethanol 70% làm giống

như trích ly đo sắc tố. Thu dịch nổi sau ly tâm, cho vào chai bịt kín bằng giấy bạc để hạn

chế sự bay hơi dung môi. Tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 410nm và 505nm định kỳ

10 ngày 1 lần trong 60 ngày.

2.3.10. Phương pháp xác định độc tính aflatoxin, độ nhiễm khuẩn của bột gạo men

đỏ.

Sau khi sấy khô chế phẩm chúng tôi đem xác định độc tính aflatoxin theo phương

pháp phân tích AOAC 2011-991.31 (*) và độ nhiễm khuẩn theo phương pháp phân tích

TCVN 4884-2005 (*) tại Công ty cổ phần giám định và khử trùng FCC - 45 Đinh Tiên

Hoàng, Phường Bến Nghé, Quận I, Tp. Hồ Chí Minh.

2.3.11. Phương pháp tách chiết citrinin

Trong chế phẩm gạo men đỏ ngoài các sắc tố, Monacolin K có ý nghĩa rất lớn trong

đời sống nói chung và sức khỏe con người nói riêng thì còn tồn tại một sản phẩm trao đổi

chất thứ cấp cần quan tâm là citrinin, đây là một loại độc tố được sinh ra bởi nấm M.

purpureus N.212. Citrinin gây tổn hại đến gan, thận, xương, tủy và ảnh hưởng đến các quá

trình trao đổi chất. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành thử nghiệm, đánh giá các phương pháp

tách chiết loại bỏ hàm lượng citrinin cao nhất mà lượng Monacolin K mất đi thấp nhất.

Chúng tôi tiến hành bằng các phương pháp sau:

+ NaHCO3 0,25M: Cho 1g bột gạo men đỏ vào bình tam giác 50ml, tiếp tục cho vào 10ml NaHCO3 0,25M, trích ly trong vòng 30 phút ở 40oC, rửa lại gạo men đỏ bằng 10ml

nước cất. Loại bỏ dịch chiết, gạo men đỏ còn lại đem sấy khô sau đó tiến hành tách chiết để

định lượng Monacolin K và citrinin. So sánh với kết quả trước chiết ta tính được % các chất

còn lại.

+ Tiến hành tương tự chúng tôi sử dụng thêm các dung môi trích ly khác như: ethanol

30%, dung dịch photphat – ethanol gồm có: KH2P04 1,5% - E45%, NaH2P04 1,5% - E45%, KH2PO4 1% - E30 trích ly trong 1giờ ở 40oC. Sau đó loại bỏ dịch chiết, sấy khô tiến hành

định lượng so sánh.

- Citrinin được hấp thu ở bước sóng 331nm, do không có chất chuẩn citrinin và căn

cứ trên cách định lượng Monacolin K chúng tôi hoàn toàn nhận thấy sự tương quan tỷ lệ

thuận giữa hệ số hấp thu (OD) với hàm lượng citrinin. Nên chúng tôi tiến hành tính % lượng

citrinin còn lại dựa trên hệ số OD (331nm) sau so với OD (331nm) trước khi đem chiết. So

sánh 2 hệ số OD (331nm) trước và sau tách chiết này ta thu nhận kết quả.

 Cách tính kết quả:

Hiệu suất (%) = Hàm lượng sau chiết/ Hàm lượng trước chiết *100% [9]

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Đặc điểm chủng MONASCUS PURPUREUS N.212

3.1.1. Hình dạng khuẩn lạc

Khi theo dõi sự phát triển đường kính khuẩn lạc của chủng M. purpureus N.212 trên

môi trường PGA, nhiệt độ phòng trong thời gian 17ngày chúng tôi thu được kết quả như

bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả đường kính khuẩn lạc M. purpureus sau 17ngày quan sát

Thời gian (ngày) Đường kính (mm)

4 19

7 39

10 65

13 75

17 82

Khuẩn lạc M. purpureus N.212 có tốc độ mọc khá chậm, ở giai đoạn 4 ngày đầu nuôi

cấy khuẩn lạc có bề mặt phẳng, mỏng, các sợi nấm màu trắng mịn, ngắn phát triển ngay trên

sát bề mặt thạch. Sau 72 giờ nuôi cấy đường kính khuẩn lạc tăng từ 19 lên 39mm tăng mạnh

vào ngày thứ 10 và đạt 82mm vào ngày ngày thứ 17. Lúc này khuẩn lạc tỏa tròn, có màu đỏ,

viền khuẩn lạc các tơ mọc ra màu đỏ cam, các tơ mỏng mọc cao lên khỏi mặt thạch bào tử

tỏa ra xung quanh ngoài môi trường. Mặt sau khuẩn lạc nhận thấy có 2 vòng đồng tâm vòng

ngoài đỏ cam, vòng trong đỏ đậm hơn. Đồng thời môi trường cũng có sự thay đổi, màu môi

trường PGA từ không màu chuyển sang đỏ thẩm, màu đỏ đậm tập trung ở gần tâm nấm. Do

quá trình phát triển của sợi nấm đã acid hóa môi trường làm môi trường có màu đỏ nâu.

Mặt trước

4 ngày 7 ngày 17 ngày

Mặt sau

Hình 3.1. Hình dạng mặt trước và mặt sau của khuẩn lạc M. purpureus N.212

Kết quả chúng tôi thu được về màu sắc và hình dạng khuẩn lạc tương tự như Julio C.

Carvalho (2005) [3], Vũ Thanh Thảo và cộng sự (2012), Nguyễn Thị Oanh (2012) đã trình

bày khi quan sát hình dạng của chủng Monascus. Kết quả nghiên cứu Carvalho (2005) cho

rằng đường kính khuẩn lạc đạt 55mm sau 7 ngày, tác giả còn nhận định thêm đường kính

khuẩn lạc tăng thêm 2,9mm/ngày.

3.1.2. Cấu trúc tế bào

Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400x, chúng tôi nhận thấy cấu trúc của tế

bào M. purpureus N.212 có các đặc điểm sau:

- Sợi khuẩn ty dài, phân nhánh, không màu, có vách ngăn. Hệ sợi dài và mảnh, khi

còn non có màu trắng ngà, khi già chuyển sang màu đỏ. Nang bào tử sinh ra từ một cuống

nhỏ bên cạnh sợi khuẩn ty.

- Các nang bào tử có hình cầu được tạo thành theo dạng chuỗi và số nang trong chuỗi

thường nhỏ không quá 8. Khi các nang chín các bào tử trong nang sẽ được phóng thích.

Hình 3.2. Hệ sợi M. purpureus N.212 quan sát dưới KHV (phóng đại 400x)

Hình 3.3. Bào tử M.purpureus N.212 (không nhuộm màu – độ phóng đại 400X)

Hình 3.4. Cuống sinh bào tử và nang bào tử của M. purpureus N.212

(nhuộm bởi fuchsin – độ phóng đại 1000X)

3.2. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố

3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men

Để theo dõi ảnh hưởng của thời gian lên men đến sự tổng hợp các sắc tố, chúng tôi

tiến hành thực hiện và lấy mẫu phân tích khi môi trường xuất hiện màu đỏ (ngày thứ 5) và

kết thúc vào ngày thứ 22. Chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.2.

(1) (2)

Hình 3.5. Mẫu gạo đối chứng và mẫu gạo lên men vào ngày thứ 17(1) và sự khác nhau về sắc tố tạo thành theo thời gian (2).

Thời gian (ngày)

Sắc tố vàng (AU/g)

Sắc tố đỏ (AU/g)

220,20 ± 1,79

Bảng 3.2. Lượng sắc tố tạo thành theo thời gian

326,21 ± 14,49

172,32 ± 1,09

253,05 ± 0,57

1091,24 ± 9,42

1260,85 ± 28,40

947,55 ± 12,58

1404,64 ± 27,43

1175,95 ± 56,42

1306,93 ± 40,18

1429,65 ± 47,55

1408,32 ± 20,93

1639,23 ± 60,32

1340,34 ± 28,87

1561,24 ±25,84

1492,78 ± 23,66

Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến lượng sắc tố tạo thành

Nhận xét: Kết quả trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.6 cho thấy cả lượng sắc tố đỏ và

vàng đều tăng dần theo thời gian, tăng đáng kể trong 17ngày đầu. Trong đó sắc tố đỏ đạt

1639,23AU/g cao hơn lượng sắc tố vàng chỉ ở mức thấp 1429,65AU/g. Sau đó ổn định và

giảm dần cho đến cuối thời gian khảo sát (ngày thứ 22). Kết quả này của chúng tôi phù hợp

với kết quả nghiên cứu của Raimbault (1998), Nguyễn Thị Oanh (2012).

3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu

Độ ẩm là một thông số quan trong trong quá trình sinh trưởng cũng như tạo sắc tố của

M. purpureus. Năm 1990, Lotong và Suwanarit đã sản xuất các sắc tố trên gạo trong các túi

nhựa plastic. Sắc tố chỉ tạo ra khi độ ẩm ban đầu thấp (26-32%). John và Stuart (1991),

Raimbault (1998) cho rằng độ ẩm ban đầu tốt nhất cho quá trình tạo sắc tố là 55-56%, Chisti

(1999); Mitchell và cộng sự (2006) thì cho rằng độ ẩm ban đầu 45-55% cho lượng sắc tố

cao nhất, đặc biệt là sắc tố đỏ.

Trên cơ sở đó chúng tôi khảo sát ở 4 nghiệm thức khác nhau với độ ẩm ban đầu lần

lượt là: 24,91% (ĐC) bổ sung một lượng nước lần lượt là: 5,03, 10,04, 17,55, và 30,06 ml

để đạt độ ẩm tương ứng là: 40%, 50%, 60% và 70%. Và thu được kết quả ở bảng 3.3.

Độ ẩm

Sắc tố vàng (AU/g)

Sắc tố đỏ (AU/g)

Đối chứng

1472,87 ± 23,42

1364,79 ± 12,19

40%

Bảng 3.3. Lượng sắc tố tạo thành ở các độ ẩm ban đầu khác nhau

1789,78 ± 55,34

1985,59 ± 62,25

50%

1229,75 ± 32,17

1409,25 ± 49,53

60%

173,45 ± 0,32

198,39 ± 0,32

70%

147,08 ± 0,28

154,59 ± 0,28

Hình 3.7. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến lượng sắc tố vàng tạo thành

Hình 3.8. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến lượng sắc tố đỏ tạo thành

Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.3, hình 3.7, 3.8 cho thấy độ ẩm để cho M. purpureus

N.212 phát triển tạo sắc tố tốt nhất là 40%, ở độ ẩm này sắc tố vàng thu được là

1789,78AU/g và sắc tố đỏ là 1985,59AU/g. Trong khi đó ở độ ẩm 60% và 70% lượng sắc tố

tạo ra rất thấp. Thấp nhất là độ ẩm 70% sắc tố vàng tạo thành là 147,08AU/g và sắc tố đỏ là

154,09AU/g. Kết quả này khác hoàn toàn với nghiên cứu của tác giả John và Stuart (1991),

Raimbault (1998). Có thể do độ ẩm quá cao, làm cho các hạt cơm bị dính lại với nhau ảnh

hưởng đến sự trao đổi O2 và CO2 làm tăng hoạt tính của enzyme glucoamylase và glucose sẽ

nhanh chóng tạo ra, ức chế quá trình tạo sắc tố. Từ đây quá trình lên men rượu từ đường

glucose đã xảy ra chính vì vậy mà chúng tôi ngửi thấy mùi rượu từ sản phẩm thu được.

3.2.3. Ảnh hưởng của số lượng giống

Số lượng giống là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến thời gian lên men cũng như lượng

sắc tố tạo thành. Ở đề tài này chúng tôi sử dụng 3 nghiệm thức với 3 số lượng giống khác nhau: 104, 105, 106 (CFU/ml). Và thu được kết quả như bảng 3.4.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của số lượng giống đến lượng sắc tố tạo thành

Ngày

Sắc tố vàng (AU/g)

285,02

901,07

1246,66

1334,59

96,15

1445,68

104

± 4,92

± 14,54

± 77,90

± 70,00

± 5,26

± 62,10

776,10

1088,21

1405,15

1548,63

157,28

1616,85

105

± 36,53

± 8,12

± 18,89

± 45,80

± 5,07

± 47,54

805,27

1230,47

1476,46

1499,17

241,10

1584,27

106

± 20,49

± 35,88

± 31,21

± 24,37

± 29,72

± 13,81

Sắc tố đỏ (AU/g)

246,05

998,93

1209,95

1410,06

70,91

1513,65

104

±5,34

± 6,18

± 6,15

± 49,43

± 0,75

± 54,25

671.03

1035,51

1338,07

1542,64

119,99

1557,35

105

± 23,33

± 5,14

± 48,42

± 14,57

± 6,25

± 39,10

194,80

1013,83

1425,63

1515,50

1623,73

1770,37

106

± 6,52

± 14,51

± 49,73

± 49,07

± 50,57

± 26,30

Hình 3.9. Ảnh hưởng của số lượng giống đến sự tạo thành sắc tố vàng

Hình 3.10. Ảnh hưởng của số lượng giống đến sự tạo thành sắc tố đỏ

Nhận xét: Kết quả bảng 3.4 và hình 3.9, 3.10 cho thấy lượng sắc tố vàng tạo ra cao nhất ở số lượng giống 105(CFU/ml) vào ngày thứ 17 đạt 1616,86AU/g, 106(CFU/ml) tạo ra

thấp hơn đạt 1584,17AU/g, nhận thấy rằng lượng sắc tố vàng tạo ra vào ngày thứ 17 của nồng độ giống trên không khác nhau nhiều ở số lượng giống 104(CFU/ml) thì sắc tố vàng

tạo ra cao nhất vào ngày thứ 20 nhưng lượng sắc tố tạo ra vẫn thấp hơn so với hai nghiệm

thức còn lại và đạt 1445,68AU/g. Còn đối với lượng sắc tố đỏ tạo thành cao nhất khi số lượng giống ở mức 106 đạt được 1770,37AU/g vào ngày thứ 17. Với kết quả này chúng tôi

kết luận với một số lượng giống đủ lớn thì quá trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp tạo sắc tố diễn ra mạnh tạo ra lượng sắc tố cao nhất và trong nghiên cứu này 106(CFU/ml) phù

hợp khi thu nhận chế phẩm vào ngày thứ 17.

3.2.4. Ảnh hưởng của pH

Sự phát triển của vi sinh vật có thể rất nghiêm ngặt ở axit hay kiềm, sự thay đổi pH

môi trưởng có thể dẫn đến sự thay đổi kiểu lên men hay đặc tính lên men. pH phù hợp sẽ

thúc đẩy hay ức chế sự phát triển nấm mốc. Đề tài này chúng tôi chọn 3 mức pH khác nhau

để khảo sát và thu được kết quả như bảng 3.5.

Ngày

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH đến lượng sắc tố tạo thành

Sắc tố vàng (AU/g)

pH4

pH5.5

pH7

395,80 ± 6,36 243,53 ± 6,59 170,43 ± 6,56

835,53 ± 19,94 802,20 ± 42,89 719,20 ± 17,70

1301,80 ± 66,74 1216,96 ± 66,74 1198,81 ± 51,21

1476,46 ± 20,16 1420,11 ± 20,16 1380,83 ± 38,79

1688,01 ± 61,25 1592,54 ± 61,25 1519,06 ± 43,49

1184,70 ± 64,55 1020,87 ± 84,82 994,47 ± 13,55 Sắc tố đỏ (AU/g)

pH4

pH5.5

pH7

201,43 ± 11,48 144,20 ± 6,97 123,10 ± 5,95

573,40 ± 18,52 635,58 ± 46,10 546,26 ± 8,33

1076,52 ± 24,30 1138,30 ± 34,85 1014,23 ± 15,47

1307,30 ± 16,16 1330,10 ± 25,70 1148,20 ± 18,28

1417,81 ± 45,28 1699,90 ± 22,58 1487,83 ± 47,02

1504,01 ± 64,30 1743,57 ± 54,16 1524,86 ± 45,09

Hình 3.11. Ảnh hưởng của các pH khác nhau đến lượng sắc tố vàng tạo thành

Hình 3.12. Ảnh hưởng của các pH khác nhau đến lượng sắc tố đỏ tạo thành

Nhận xét: Kết quả trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.11, 3.12 cho thấy: pH 4 là tốt nhất

cho lên men tạo sắc tố vàng. Lượng sắc tố vàng thu được ở pH này đạt 1688,01AU/g vào

ngày thứ 18, trong khi đó cũng vào ngày thứ 18 ở pH 5,5 lại cho sắc tố đỏ cao nhất và đạt

1743,57AU/g, pH 7 cho lượng sắc tố vàng và đỏ thấp hơn tuy nhiên sự chênh lệch không

nhiều. Như vậy pH 4 thích hợp cho M. purpureus N.212 tạo sắc tố vàng và pH 5,5 phù hợp

hơn cho phát triển tổng hợp sắc tố đỏ. Với kết quả này phù hợp với các kết quả nghiên cứu

của các tác giả Yongsmith và cộng sự (1993), Mark và cộng sự (1990), Stuart (1991). Còn

với Chen và John (1993) cũng cho rằng sắc tố vàng cao nhất khi pH 4 nhưng sắc tố đỏ tạo ra

cao nhất ở pH 6,5. Ở pH 7 sắc tố vàng chúng tôi thu được với lượng cũng khá lớn, kết quả

này trái với kết luận của Yongsmith (1991) cho rằng ở pH 7 sắc tố vàng không hình thành.

3.2.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 0,5%

Theo Chen (1993) sử dụng pepton như nguồn đạm hữu cơ trong môi trường lên men

sẽ kích thích sinh khối và lượng sắc tố đỏ tạo thành. Theo Jun-Sung Kim và cộng sự (1993)

cũng cho rằng nguồn đạm hữu cơ thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo thành sắc tố hơn đạm

vô cơ. Chúng tôi tiến hành bổ sung nguồn nitơ 0,5%, sau 17ngày lên men theo dõi, lấy mẫu

phân tích và đạt kết quả như bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng các nguồn nitơ khác nhau đến sự tạo thành sắc tố

Yếu tố

AU/g (410 nm)

AU/g (505 nm)

Đối chứng

1262,59 ± 23,04

1314,92 ± 39,42

NaNO3

1657,03 ± 65,87

1380,05 ± 21,83

(NH4)2SO4

931,85 ± 32,60

740,77 ± 36,51

Pepton

2009,10 ± 41,82

1829,36 ± 58,80

Cao nấm

1542,99 ± 58,66

1502,12 ± 61,24

NH4 NaNO

Hình 3 13. Sự khác nhau về màu sắc

khi bổ sung các nguồn nitơ khác

nhau

Pepton

Cao

Hình 3.14. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến lượng sắc tố tạo thành

Nhận xét: Kết quả trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.14 cho thấy, việc bổ sung vào môi

trường lên men nguồn nitơ có ý nghĩa rất lớn trong việc làm tăng lượng sắc tố đỏ cũng như

sắc tố vàng tạo thành ngoại trừ (NH4)2SO4. Trong đó, pepton cho lượng sắc tố cao nhất tạo

ra lượng sắc tố vàng và sắc tố đỏ cao nhất và đạt 2009,10AU/g và 1829,36AU/g, chứng tỏ

nguồn nitơ có ảnh hưởng tích cực đến lượng sắc tố sinh ra. Với kết quả này chúng tôi phù

hợp với các kết quả nghiên cứu của các tác giả Chen và Johns (1993, 1994), Cho và cộng sự

(2002). Gunasekaran và Poorniammal (2008), Juzlova và cộng sự (1996), Lin (1991),

Yongsmith và cộng sự (1993), Silviera và cộng sự (2008). Ngoài ra các tác giả Jiang và

cộng sự (2005), Lee và cộng sự (2001), Lin and Demain (1991) sử dụng các nguồn nitơ 1%

khác là: MSG, NH4Cl cũng làm tăng đáng kể lượng sắc tố với lượng sắc tố thu được gấp 2,5

lần so với đối chứng. Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng sử dụng nguồn nitơ vô cơ là:

(NH4)2SO4 thì lượng sắc tố thu được rất thấp với lượng sắc tố vàng và đỏ tương ứng là:

931,85AU/g và 740,77AU/g.

3.2.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon

Hydrat carbon đã được dùng như nguồn carbon và năng lượng cho sự hình thành sắc

tố ở nấm Monascus. Ở thí nghiệm này chúng tôi sử dụng 2 nguồn carbon chính là ethanol và

glucose để khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon đến dự tạo thành sắc tố ở nấm này. Với

các nồng độ khác nhau chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.7.

Yếu tố

Cấp độ

Sắc tố vàng (AU/g)

Sắc tố đỏ (AU/g)

0,3% (V/m)

1831,79 ± 25,33

1451,17 ± 22,87

Ethanol 700

0,5% (V/m)

Bảng 3.7. Ảnh hưởng nguồn carbon đến sự tạo thành sắc tố

1919,55 ± 36,19

1533,30 ± 42,05

0,7% (V/m)

1679,82 ± 28,32

1373,3 ± 18,98

1252,62 ± 29,96

1013,71 ± 35,53

0,5%

Glucose

1223,48 ± 33,41

937,60 ± 49,98

1,0%

1221,31 ± 41,73

752,99 ± 34,41

2,0%

Đối chứng

1262,59 ± 23,04

1314,92 ± 39,42

Hình 3.15. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến lượng sắc tố tạo thành

Nhận xét: Qua bảng 3.7 và hình 3.15 cho thấy khi bổ sung 2 nguồn carbon thì

ethanol làm tăng đáng kể lượng sắc tố tạo thành và cho lượng sắc tố vàng cao hơn. Đặc biệt

ở nghiệm thức 2 khi bổ sung nồng độ ethanol 0,5% cho lượng sắc tố cao nhất với sắc tố

vàng và đỏ lần lượt là 1919,55AU/g và 1533,30AU/g trong khi đối chứng chỉ đạt

1262,59AU/g và 1314,92AU/g. Ngoài ra, việc bổ sung glucose không có ý nghĩa trong việc

làm tăng lượng sắc tố tạo thành. Với kết quả của việc bổ sung nguồn carbon là ethanol,

chúng tôi thu nhận kết quả phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả: (Juzlova và cộng sự

(1996), Santerre và cộng sự (1995). Các tác giả khác: Broder và Koehler (1980), Lin và

Demain (1991), Martin và Edward (1990), Yoshimura và cộng sự (1975) sử dụng nguồn

carbon là glucose, maltose và tinh bột có ý nghĩa trong sinh tổng hợp sắc tố nhưng các tác

giả cũng nhận định ethanol và sucrose có thể vượt trội so với đường trên nhưng chúng làm

giảm tốc độ tăng trưởng của Monascus.

Với kết quả chúng tôi khi bổ sung nguồn carbon là glucose trái ngược với báo cáo

của các tác giả trên. Nhưng theo kết quả báo cáo của Carvalho và cộng (2003), Chen và

Johns (1994) thừa nhận rằng nồng độ glucose trong môi trường lên men sẽ thay đổi quá

trình chuyển hóa hiếu khí sang kỵ khí một phần làm giảm tốc độ tăng trưởng và chất màu

tổng hợp và nó cũng có thể dẫn đến sản xuất ethanol.

3.2.7. Ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol

Để khảo sát ảnh hưởng của glycerol đến khả năng sinh tổng hợp sắc tố của chủng M.

purpureus N.212 chúng tôi tiến hành bổ sung vào môi trường lên men một lượng glycerol

theo tỷ lệ: 0,8% , 2,4% và 4% (V/m). Tiến hành lên men theo dõi sau 17ngày lấy mẫu phân

tích ta thu được kết quả như bảng 3.8.

Yếu tố

AU/g (410 nm)

AU/g (505 nm)

Đối chứng

1262,59 ± 23,04

1314,92 ± 39,42

Glycerol 0,8%

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các nồng độ glycerol đến sự tạo thành sắc tố

1883,84 ± 43,22

1683,68 ± 31,67

Glycerol 2,4%

1725,17 ± 57,65

1576,58 ± 22,64

Glycerol 4%

1652,32 ± 49,42

1592,58 ± 45,71

Hình 3.16. Ảnh hưởng của tỷ lệ glycerol bổ sung đến lượng sắc tố tạo thành

Nhận xét: Qua bảng 3.8 và hình 3.16 cho thấy việc bổ sung glycerol có ý nghĩa là

một nhân tố kích hoạt khá mạnh làm gia tăng lượng sắc tố của chủng M. purpureus N.212,

tỷ lệ glycerol bổ sung vào gạo 0,8% cho lượng sắc tố cao nhất, ở hàm lượng này sắc tố vàng

đạt 1883,84AU/g so với đối chứng là 1262,59AU/g, tăng 150% so với đối chứng và lượng

sắc tố đỏ đạt 1683,68AU/g so với đối chứng là 1314,92AU/g.

3.2.8. Ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy với Saccharomyces cerevisiae

Theo Chul Soo Shin, Jae-Young Ju và Jung-Hae Suh (2000) chủng Monascus nuôi

cấy chung với S.cerevisiae trên đĩa Petri với môi trường succrose agar thì có sự thay đổi

hình thái tế bào của nấm mốc và tăng lượng sắc tố. Theo tác giả chitinase là một trong

những enzyme thủy phân chitin được tạo ra bởi S.revisiae làm thay đổi hình thái tế bào và

tăng lượng sắc tố. Từ đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của việc nuôi cấy chung M. purpureus N.212 với S.cerevisiae với lượng tế bào khoảng 12x104(CFU/ml). Lên men

trong 17ngày theo dõi thu nhận chế phẩm, phân tích thu được kết quả như bảng 3.9.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của việc nuôi cấy chung với S.cerevisiae đến lượng sắc tố tạo

thành

Kết quả AU/g (410 nm) AU/g (505 nm)

Đối chứng 1448,27 ± 43,08 1366,54 ± 22,08

Kết hợp với S.cerevisiae 1770,43 ± 57,89 1675,84 ± 32,41

Hình 3.17. Ảnh hưởng của việc nuôi cấy kết hợp với S.cerevisiae đến lượng sắc tố

tạo thành

Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.9 và hình 3.17 của thí nghiệm nuôi cấy kết hợp M.

purpureus N.212 và S.cerevisiae lượng sắc tố vàng thu được là 1770,43AU/g so với khi

nuôi chỉ có M. purpureus N.212 là 1448,27AU/g, lượng sắc tố đỏ thu được 1675,84AU/g so

với đối chứng là 1366,54AU/g. Như vậy khi nuôi cấy có bổ sung với nấm men S.cerevisiae

cũng góp phần vào việc gia tăng lượng sắc tố tạo thành ở chủng M. purpureus N.212.

3.3. Đường chuẩn MONACOLIN K

Bảng 3.10. Bảng số liệu đường chuẩn Monacolin K

Ống số

Nồng độ Monacolin K (µg/ml)

0,39532

0,74922 1,02630 1,40340 1,64750

OD 238 nm

Kết quả lập đồ thị đường chuẩn Monacolin K

Hình 3.18. Đường chuẩn Monacolin K

3.4. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp

MONACOLIN K.

3.4.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men

Để theo dõi ảnh hưởng của thời gian lên men đến sự tạo thành Monacolin K của M

.purpureus N.212 chúng tôi tiến hành lên men lấy mẫu phân tích bắt đầu từ ngày thứ 5 và

kết thúc ngày thứ 22 như phân tích sắc tố. Chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.11.

Bảng 3.11. Khả năng sinh tổng hợp Monacolin K của M. purpureus N.212 theo thời

gian

2,53 ± 0,01

4,68 ± 0,04

10,23 ± 0,18

12,37 ± 0,39

14,33 ± 0,17

15,31 ± 0,19

14,72 ± 0,28

5 7 10 12 14 20 22 17 16,28

±0,20

Ngày Monacolin K (mg/g)

Hình 3.19. Khả năng sinh tổng hợp Monacolin K của M. purpureus N.212 theo thời gian

Nhận xét: Kết quả trình bày ở bảng 3.11 và hình 3.19 cho thấy: lượng Monacolin K

được tạo thành ở chủng M. purpureus N.212 tăng dần theo thời gian, tăng đáng kể trong giai

đoạn 7-10 ngày và đạt giá trị cao nhất vào ngày thứ 17 là 16,28mg/g, sau đó có khuynh

hướng giảm xuống vào giai đoạn cuối (ngày 20-22) là 14,72mg/g.

Điều này chứng tỏ Monacolin K là chất trao đổi thứ cấp được tích lũy dần trong môi

trường lên men ở pha cuối.

3.4.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu

Để xác định độ ẩm cần thiết cho môi trường lên men, chúng tôi tiến hành lên men

tương tự trên, điều chỉnh độ ẩm ban đầu theo các độ ẩm khác nhau như sắc tố là: 24,91%

(ĐC), 40%, 50%, 60%, 70%. Sau 17 ngày theo dõi, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.12.

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp Monacolin K của

Độ ẩm

Monacolin K (mg/g)

Đối chứng 24,91%

15,10 ± 0,05

40%

chủng M. purpureus N.212.

16,64 ± 0,09

50%

9,23 ± 0,04

60%

4,19 ± 0,05

70%

2,87 ± 0,02

Hình 3.20. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp Monacolin K của M. pupureus N.212.

Nhận xét: Kết quả trình bày ở bảng 3.12 và hình 3.20 cho thấy: độ ẩm 40% là tốt

nhất cho quá trình lên men sinh tổng hợp Monacolin K. Hàm lượng Monacolin K thu được

ở độ ẩm này là 16,64 mg/g. Cao hơn các độ ẩm còn lại, trong đó, hàm lượng Monacolin K

thấp nhất thu nhận ở độ ẩm 70% chỉ đạt 2,87mg/g.

Với kết quả này của chúng tôi khác với các kết quả của Xu Ganrong, Chen Yue

(1992), Vũ Thanh Thảo và cộng sự (2012) thì độ ẩm thích hợp cho hàm lượng Monacolin K

cao nhất là 60% - 65%, và kết quả này phù hợp hơn với kết quả nghiên cứu của Slugen và

cộng sự (1993) là 37,5%. Như vậy, ở độ ẩm 40% chủng M. pupureus N.212 cho Monacolin

K cao nhất.

3.4.3. Ảnh hưởng của số lượng giống

Tương tự như khảo sát sắc tố, môi trường lên men được tiến hành tương tự với việc lên men sử dụng các nồng độ giống khác nhau: 104; 105;106(CFU/ml) và lên men trong thời

gian 20 ngày thu được kết quả như bảng 3.13

Thời gian (Ngày)

104

105

106

1,53 ± 0,04 1,94 ± 0,16 2,97 ± 0,30

3,76 ± 0,11 6,88 ± 0,89 7,31 ± 0,39

12,35 ± 0,50 14,49 ± 0,06 14,37 ± 0,53

Bảng 3.13. Ảnh hưởng số lượng giống đến sự sinh tổng hợp Monacolin K

14,58 ± 0,23 12,09 ± 0,31 14,30 ± 0,44

14,25 ± 0,53 15,19 ± 0,14 15,86 ± 0,39

10,84 ± 0,07 11,06 ± 0,58 13,26 ± 0,42

Hình 3.21. Ảnh hưởng của số lượng giống đến sự sinh tổng hợp Monacolin K của M.

purpureus N.212

Nhận xét: Qua bảng 3.13 và hình 3.21 chúng tôi nhận thấy: với số lượng giống 106(CFU/ml) cho hàm lượng Monacolin K cao nhất vào ngày thứ 17 là: 15,86mg/g. Các số lượng còn lại là 104, 105(CFU/ml) cho hàm lượng thấp hơn với số lượng giồng 104(CFU/ml)

thì hàm lượng Monacolin K cao nhất vào ngày thứ 20, tuy nhiên hàm lượng Monacolin K

thu được khi các số lượng giống khác nhau vào ngày thứ 17 chênh lệch là không đáng kể.

3.4.4. Ảnh hưởng của pH

Tiến hành tương tự như khảo sát sắc tố, chúng tôi khảo sát khi môi trường lên men ở

các mức độ pH khác nhau. Ở đây chúng tôi chọn 3 mốc pH chính: 4; 5,5 và 7. Thời gian

nuôi cấy 18 ngày theo dõi phân tích ta được kết quả như bảng 3.14.

Ngày

2,97

4,45

9,08

14,10

15,07

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp Monacolin K của M. purpureus N.212.

15,42

pH4

± 0,28

± 0,27

± 0,31

± 0,09

± 0,18

± 0,20

2,52

4,58

11,57

14,02

15,22

15,46

pH5.5

± 0,08

± 0,29

± 0,13

± 0,64

± 0,10

± 0,39

2,17

3,94

11,46

12,71

14,05

14,76

pH7

± 0.,4

± 0,31

± 0,23

± 0,54

± 0,13

± 0,18

Hình 3.22. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp Monacolin K của M. purpureus N.212.

Nhận xét: Kết quả trình bày ở bảng 3.14 và hình 3.22 cho thấy: ở pH 5,5 hàm lượng

Monacolin K được tổng hợp cao nhất và đạt 15,46mg/g vào ngày thứ 15. Cao hơn so với

lượng Monacolin K tổng hợp ở 2 pH còn lại (pH 4 và pH 7) chỉ đạt: 15,42 và 14,76mg/g

vào ngày thứ 18. Như vậy ở pH 5,5 lượng Monacolin K được tổng hợp cao nhất và thời gian

ngắn nhất.

Kết quả này tương đối phù hợp với Chun-Lin Lee và cộng sự (2007) tác giả khảo sát

chủng M. purpureus NTU568 ở 3 ngưỡng pH khác nhau: acid (pH 3), trung tính (pH 7),

kiềm (pH 9), theo tác giả M. purpureus NTU568 phát triển tốt và tổng hợp được sản phẩm

trao đổi chất thứ cấp ở pH acid yếu, cho hàm lượng Monacolin K cao nhất khi giá trị pH đạt

5.7.

3.4.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 0.5%

Nhằm khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp Monacolin K,

chúng tôi sử dụng các nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ khác nhau tương tự như trong khảo sát

sắc tố. Tiến hành nuôi cấy, theo dõi, lấy mẫu phân tích ta được kết qua như bảng 3.15.

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp Monacolin K

của M. purpureus N.212.

Yếu tố Monacolin K (mg/g)

Đối chứng 14,56 ± 0,19

13,40 ± 0,28 NaNO3

5,99 ± 0,45 (NH4)2SO4

Pepton 15,85 ± 0,30

Cao nấm 11,54 ± 0,23

Hình 3.23. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng ổ

Hình 3.23. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp Monacolin K của M. purpureus N.212. Nhận xét: Kết quả từ bảng 3.15 và hình 3.23 cho thấy: Các nguồn nitơ bổ sung đều

cho lượng Monacolin K thấp hơn so với đối chứng ngoại trừ pepton. Hàm lượng Monacolin

K khi bổ sung pepton 0,5% đạt: 15,85mg/g trong khí đó đối chứng là 14,56mg/g và thấp

nhất là (NH4)2SO4 chỉ đạt 5,99mg/g. Như vậy, chỉ có pepton mới có ý nghĩa trong việc tăng

hàm lượng Monacolin K, do đó cần nghiên cứu và thử nghiệm thêm nhiều nguồn nitơ khác

nữa. Theo nghiên cứu của Lee và cộng sự (2002) việc sử dụng pepton (10,8g/l) cũng có ý

nghĩa trong việc gia tăng Lovastatin ở loài M. rubber. Kết quả của chúng tôi phù hợp với

kết quả nghiên cứu của tác giả Vũ Thanh Thảo và cộng sự (2012), ngoài ra tác giả sử dụng

NH4Cl (0,5%) là nguồn nitơ có tác động lớn nhất đối với Monacolin K.

3.4.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon

Hydrate carbon đã được dùng như nguồn carbon và năng lượng cho sinh trưởng và

tổng hợp Monacolin K ở Monascus. Chính vì vậy trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng 2

nguồn carbon chính là ethanol và glucose làm yếu tố bổ sung. Với các nồng độ khác chúng

tôi thu được kết quả như bảng 3.16.

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp tạo Monacolin

Yếu tố

Cấp độ

Monacolin K (mg/g)

0,3% (V/m)

17,34 ± 0,39

Ethanol 700

0,5% (V/m)

K của M. purpureus N.212.

19,72 ± 0,41

0,7% (V/m)

18,09 ± 0,28

0,5%

13,00 ± 0,34

Glucose

1,0%

13,28 ± 0,06

2,0%

12,44 ± 0,63

Đối chứng

14,56 ± 0,19

Hình 3.24. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự sinh tổng hợp Monacolin K của M.

purpureus N.212.

Nhận xét: Kết quả trình bày từ bảng 3.16 và hình 3.24 cho thấy khi bổ sung ethanol

vào môi trường lên men, lượng Monacolin K có gia tăng. Với lượng 0,5% ethanol (V/m)

cho hiệu quả cao nhất với hàm lượng Monacolin K đạt 19,72mg/g trong khi đối chứng là

14,56mg/g. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Wang JJ, Lee CL (1993).

Khi bổ sung ethanol vào môi trường lên men hàm lượng Monacolin K tăng đáng kể (60%),

tuy nhiên tác giả không đưa ra chính thức về nồng độ hay thể tích ethanol bổ sung vào.

Kết quả này cũng phù hợp với tác giả Vũ Thanh Thảo và cộng sự (2012) thì ethanol

gây ảnh hưởng đến hàm lượng Monacolin K tạo thành tuy nhiên kết quả của tác giả là

ethanol 0,3% cho hàm lượng Monacolin K cao nhất.

Khi bổ sung glucose cho lượng Monacolin K thấp hơn đối chứng, điều này có thể

chủng M. purpureus N.212 có hệ enzyme phân giải tinh bột tạo ra glucose tương đối tốt nên

không cần glucose nữa, glucose dư thừa có thể dẫn tới quá trình lên men rượu và ảnh hưởng

không tốt đến quá trình tổng hợp Monacolin K.

3.4.7. Ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol

Để khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol vào môi trường lên men đến sinh

tổng hợp Monacolin K, chúng tôi tiến hành lên men bổ sung glycerol với nồng độ lần lượt

là: 0,8%, 2,4%, 4% như khảo sát sắc tố. Sau 17 ngày theo dõi thu mẫu, phân tích và ghi

nhận chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.17.

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của glycerol đến khả năng sinh tổng hợp Monacolin K của M.

purpureus N.212.

Glycerol 0,8%

Glycerol 2,4%

Glycerol 4,0%

Yếu tố Đối chứng

14,56 ± 0,19

19,03 ±0,29

17,28 ± 0,09

Monacolin

20,58 ± 0,24

K (mg/g)

Hình 3.25. Ảnh hưởng của glycerol trong môi trường lên men đến hàm lượng

Monacolin K

Nhận xét: Kết quả trình bày từ bảng 3.17 và hình 3.25 cho thấy: việc bổ sung

glycerol vào môi trường lên men đã là tăng đáng kể Monacolin K của chủng M. purpureus

N.212.

Lượng Monacolin K cao nhất là 20,58mg/g ở nồng độ glycerol 0,8% (V/m) trong khi

đối chứng là 14,56mg/g. Mặt khác hàm lượng Monacolin K thay đổi tỷ lệ

thuận với nồng độ glycerol bổ sung vào môi trường lên men. Với kết quả này của chúng tôi

phù hợp với kết quả của Hsin- Yi Tsai (2002) vì ông cũng cho rằng việc bổ sung glycerol

vào đã làm tăng lượng Monacolin K. Tuy nhiên kết quả này khác hoàn toàn với kết quả

nghiên cứu của Vũ Thanh Thảo và cộng sự (2012) ở đây tác giả sử dụng 3 chất béo 0,5%

khác nhau: glycerol, dầu đậu nành, dầu oliu và kết luận của tác giả là không ảnh hưởng

đáng kể đến việc tạo Monacolin K.

3.4.8. Ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy với Saccharomyces cerevisiae

Chúng tôi tiến hành lên men đồng thời hai chủng vi sinh vật trên cùng một môi

trường và sử dụng môi trường lên men bình thường không bổ sung S.cerevisiae làm đối

chứng. Sau 17 ngày lên men thu nhận kết quả phân tích ta được bảng 3.18.

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy với S.cerevisiae đến khả năng sinh

tổng hợp Monacolin K của M. purpureus N.212.

Monacolin K (mg/g)

Đối chứng 14,61 ± 0,41

Kết hợp với S.cerevisiae 18,56 ± 0,26

Hình 3.26. Ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy với S.cerevisiae đến khả năng sinh

tổng hợp Monacolin K của M. purpureus N.212

Nhận xét: Kết quả trình bày ở bảng 3.18 và hình 3.26 cho thấy: khi nuôi cấy kết hợp

cùng với S.cerevisiae hàm lượng Monacolin K tăng rất đáng kể.

Lượng Monacolin K trong thí nghiệm này chúng tôi thu được: 18,56mg/g so với mẫu

đối chứng cùng thời điểm này là 14,61mg/g. Trong nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy việc

nuôi chủng với S.cerevisiae đã tác động tích cực đối với quá trình tổng hợp Monacolin K

của chủng M. purpureus N.212. Điều này được lý giải trong quá trình lên men một phức

chất được tổng hợp từ S.cerevisiae đã kích hoạt chủng M. purpureus N.212, dẫn đến việc

gia tăng hàm lượng Monacolin K của chủng.

3.5. Đặc tính sinh học của chể phẩm gạo men đỏ

3.5.1. Định tính enzyme của chế phẩm

a. Enzyme amylase:

Kết quả

Đường kính lỗ thạch d (mm)

Hoạt tính (D-d)

Đường kính vòng phân giải D (mm)

12,0

9,43 ± 0,28 (Yếu)

9,0 9,5 9,8

21,0 21,5 21,8

Bảng 3.19. Định tính amyalase của gạo men đỏ

Hình 3.27. Khả năng phân giải tinh

bột của chế phẩm gạo men đỏ.

b, Enzyme protease:

Bảng 3.20. Định tính protease của gạo men đỏ

Đường kính

Hoạt tính

Kết quả

lỗ thạch d (mm)

(D-d)

vòng phân giải D (mm)

15 ± 0,67

(Trung bình)

Hình 3.28. Khả năng phân giải gelatin của chế phẩm gạo men đỏ

Nhận xét: Dựa vào kết quả từ bảng 3.19 và hình 3.27 nhận thấy chế phẩm có khả

năng phân giải tinh bột xuất hiện vòng tan là 9,43mm <10mm nên hoạt tính enzyme

amylase yếu.

Từ bảng 3.20 và hình 3.28 cho thấy chế phẩm có khả năng phân giải gelatin tạo vòng

tan 15mm nên hoạt tính protease được xếp loại trung bình.

3.5.2. Định lượng hoạt tính enzyme của chế phẩm.

Mẫu

Ống nghiệm

Đối chứng

Mật độ quang (600 nm)

0,218

0,225

0,222

0,501

Giá trị trung bình

0,222

0,501

Đơn vị hoạt tính:

UI = 3,72 đơn vị hoạt tính/g

a, Enzyme amylase:

b, Enzyme protease:

Ống số

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,06485 0,12657 0,21044 0,26454 0,33164

Nồng độ Tyrosin (µmol/ml) ∆OD = ODTN-0DKC (660 nm)

Bảng 3.21. Kết quả lập đồ thị đường chuẩn tyrosin

Mẫu

Ống nghiệm

∆OD=ODTN-ODKC (600 nm)

0,408

0,399

0,402

Giá trị OD trung bình

0,403

Nồng độ Tyrosin (µmol/ml)

0,60

Đơn vị hoạt tính:

UI = 4,84 đơn vị hoạt tính/g

Hình 3.29. Đồ thị đường chuẩn tyrosin

Nhận xét: Qua các bảng kết quả trên cho thấy, trong chế phẩm gạo men đỏ của

chúng tôi ngoài sắc tố, Monacolin K còn có hoạt chất sinh học khác là enzyme: amylase,

protease. Mặt dù hoạt tính rất thấp, hoạt tính amylase và protease lần lượt là: 3,37UI/g và

4,48UI/g.

3.6. Kết quả khảo sát độ bền sắc tố với ánh sáng theo thời gian

Sắc tố vàng (410 nm)

Sắc tố đỏ (505 nm)

Ngày

AU/g còn lại

% còn lại

AU/g còn lại

% còn lại

100

Bảng 3.22. Độ bền sắc tố với ánh sáng theo thời gian

1213,15

1335,04

1191,31

98,20

1305,54

97,79

1166,32

96,14

1215,15

91,02

1130,05

93,15

1161,89

87,03

1065,51

87,83

1044,54

78,24

986,53

81,32

886,33

66,39

945,56

77,94

738,14

55,29

Hình 3.30. % các sắc tố còn lại trong thời gian 60 ngày

Nhận xét: Từ bảng 3.22 và hình 3.30 cho thấy trong thời gian khảo sát 60 ngày sắc tố

vàng còn lại 77,94%, còn sắc tố đỏ còn lại 55,29%. Chứng tỏ sắc tố vàng bền với ánh sáng

theo thời gian hơn so với sắc tố đỏ. Kết quả này tương tự nhận xét của Gerard Goma và

Philipp J. Blanc (2003).

3.7. Đánh giá chất lượng sản phẩm

Hình 3.31. Chế phẩm gạo men đỏ thu nhận được.

3.7.1. Độc tính aflatoxin [49].

Aflatoxin là một sản phẩm thứ cấp được sinh ra bởi các loại nấm gây ung thư, ngộ

độc cho người và động vật. Đặc biệt rất bền với nhiệt và có khả năng liên kết với DNA,

RNA gây rối loạn sinh tổng hợp protein của tế bào, nó có thể là tác nhân gây đột biến. Do

tính chất nguy hiểm trên, chế phẩm chúng tôi đem định lượng aflatoxin tại Công ty Giám

Định và Khử Trùng FCC bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (AOAC). Kết quả là không

phát hiện aflatoxin trong chế phẩm. Như vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với

ghi nhận của Tadao Hiroi (1993) là Monascus không tạo aflatoxin và chế phẩm an toàn khi

sử dụng trong thực phẩm.

3.7.2. Tổng vi khuẩn hiếu khí

Theo kết quả phân tích của Công ty Giám Định và Khử Trùng FCC có tổng vi khuẩn hiếu khí là 5,2x103 CFU/g nằm trong mức cho phép của Bộ y tế. Có thể trong khâu khử

trùng chưa thật sự hiệu quả nên vẫn còn nhiều vi khuẩn nhiễm vào chế phẩm.

3.8. Hiệu suất của các phương pháp tách chiết CITRININ

Bảng 3.23. % hàm lượng Monacolin K còn lại qua các phương pháp tách chiết khác nhau

Phương pháp

HL Monacolin K sau chiết (mg/g)

% Monacolin K còn lại

3,53

81,13

3.8.1. Phần trăm Monacolin K còn lại:

H/lượng Monacolin K(mg/g) - (Đối chứng) 4,35

NaHCO3 0,25M

(100%)

3,81

87,72

3,56

81.83

3,74

86,03

3,39

77,98

KH2P04 1,5%-E45 NaH2P04 1,5% -E45 KH2PO4 1%-E30 Ethanol 30%

Hình 3.32. Hàm lượng Monacolin K còn lại qua các p. pháp tách chiết khác nhau

Nhận xét: Kết quả dựa trên bảng 3.23 và hình 3.32 cho ta thấy việc sử dụng nhiều

phương pháp khác nhau trong việc tách chiết nhằm mục đích không làm hao tổn hàm lượng

Monacolin K. Trong đó, việc sử dụng KH2P04 1.5%-E45 làm dung môi tách chiết đem lại

hiệu quả cao nhất, giữ lại 87,72% lượng Monacolin K và thấp nhất là dung môi ethanol 30%

chỉ giữ lại được 77,98%.

3.8.2. Phần trăm citrinin còn lại:

Bảng 3.24. % citrinin còn lại qua các phương pháp tách chiết khác nhau.

Phương pháp OD (331nm) đối Hệ số OD sau chiết % citrinin còn lại

chứng

0,224 49,09

0,240 52,68

0,267 58,60

0,456 (100%)

0,281 61,73

0,255 56,06 NaHCO3 0,25M KH2P04 1,5%-E45 NaH2P04 1,5% -E45 KH2PO4 1%-E30 Ethanol 30%

Hình 3.33. % citrinin còn lại qua các phương pháp tách chiết khác nhau

Nhận xét: Dựa vào bảng 3.24 và hình 3.33 cho ta thấy trong các dung môi chọn trích

ly nhằm loại bỏ hàm lượng citrinin tối đa. Việc sử dụng NaHCO3 0,25M sẽ loại bỏ được

hàm lượng citrinin cao nhất, để hàm lượng citrinin còn lại ở mức thấp nhất và còn lại

49,09% trong khi đó dung môi KH2PO4 1%-E30 cho hiệu quả thấp nhất lượng citrinin còn

lại 61,73%.

Hình 3.34. % Monacolin K – citrinin còn lại qua các phương pháp tách chiết khác

nhau.

Từ 2 kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận thấy rằng việc lựa chọn dung môi trích

ly cần phải đảm bảo đồng thời 2 điều kiện sao cho hàm lượng Monacolin K còn lại cao nhất

mà lượng citrinin còn lại ở mức thấp nhất. Và kết quả từ hình 3.35 chúng tôi quyết định

chọn KH2P04 1.5%-E45 làm dung môi trích ly vì đảm bảo điều kiện trên. Với hàm lượng

Monacolin K còn lại đạt 87,72% và citrinin còn tồn đọng là 52,68%. Và đây cũng là phương

pháp tối ưu nhất của Lee và cộng sự (2007) [9], theo phương pháp trích ly bằng 45%

ethanol-1.5% photphate thời gian trích ly 70 phút tác giả đã loại bỏ được 91,6% citrinin và

còn lại 79,5% Monacolin K.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Chủng M. purpureus N.212 phát triển tốt, tạo sắc tố trên môi trường PGA. Khuẩn ty

có vách ngăn, nang bào tử hình cầu, kết thành chuỗi

2. Xác định được điều kiện nuôi cấy phù hợp nhất của chủng M. purpureus N.212 lên

men gạo thu nhận sắc tố:

- Thời gian lên men 17 ngày.

- Độ ẩm ban đầu 40%.

- pH môi trường: pH 4 cho sắc tố vàng cao nhất, pH 5.5 cho sắc tố đỏ cao nhất.

- Số lượng giống 106.

- Nguồn nitơ: pepton 0.5%.

- Nguồn carbon: Ethanol 0.5%

- Glycerol bổ sung: 0.8%

- Nuôi cấy kết hợp cùng S.cerevisiae đem lại hiệu quả cao.

3. Xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp của chủng M. purpureus N.212 lên men gạo

thu nhận Monacolin K:

- Thời gian lên men 17 ngày.

- Độ ẩm ban đầu 40%

- pH môi trường: pH 5.5

- Số lượng giống 106

- Nguồn nitơ: pepton 0.5%

- Nguồn carbon: Ethanol 0.5%

- Glycerol bổ sung: 0.8%

- Nuôi cấy kết hợp cùng S.cerevisiae cũng đem lại hiệu quả cao.

4. Ngoài sắc tố, Monacolin K, chế phẩm gạo men đỏ tạo ra enzyme amylase, protease

có hoạt độ lần lượt là: 3.37UI/g và 4.48UI/g.

5. Các sắc tố của M. purpureus N.212 khá bền với ánh sáng khi hòa tan trong dung môi

là ethanol 70%, sau thời gian 60 ngày sắc tố đỏ còn lại 55.29%, sắc tố vàng duy trì đến

77.94%.

6. Sử dụng KH2PO41,5% - E45% là dung môi tốt nhất tách chiết còn lại 52.68% hàm

lượng citrinin và hàm lượng Monacolin K còn lại 87.72%.

7. Bột gạo men đỏ không có độc tố aflatoxin.

KIẾN NGHỊ

Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn, nên chúng tôi đề nghị các vấn đề sau cần

được nghiên cứu tiếp:

1. Nghiên cứu các biện pháp di truyền để nâng cao chất lượng về giống M. pupureus

N.212 cho lượng sắc tố, Monacolin K cao và không tạo citrinin.

2. Khảo sát thêm các phương pháp tách chiết khác nhằm loại bỏ nhiều hàm lượng

citrinin.

3. Nghiên cứu thêm ứng dụng của bột gạo đỏ vào thực phẩm, thức uống cũng như

làm nguyên liệu sản xuất thuốc trị bệnh tim mạch ở Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ thuật sinh hóa, Nxb Đại học Quốc gia TP. HCM, tr.

102-104, 201- 215.

2. Lê Đức Mạnh (2007), “Khảo sát khả năng tạo sắc tố, Lovastatin và độc tố citrinin

của hai chủng nấm mốc đỏ Monascus purpureus”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN,

Khoa học tự nhiên và công nghệ, 23, tr. 238-244.

3. Nguyễn Thị Oanh (2012), Nghiên cứu sản xuất bột men đỏ (Monascus) giàu

Monacolin K, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường ĐH Bách khoa – ĐH Quốc gia TP.

HCM.

4. Vũ Thanh Thảo, Huỳnh Bái Nhi, Cao Thị Hồng Gấm, Trần Cát Đông (2011), “Khảo

sát điều kiện nuôi cấy vi nấm Monascus purpureus để thu sinh khối giàu Monacolin

K”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 15(1), tr. 195-202.

5. Vũ Thanh Thảo, Huỳnh Bái Nhi, Trần Cát Đông (2012), “Tối ưu hóa điều kiện nuôi

cấy chìm để thu sinh khối Monascus purpureus giàu Monacolin K theo phương pháp

đáp ứng bề mặt”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, 16(1), tr. 265-271.

6. Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục,

tr.163-171.

7. Trần Linh Thước (2000), Thực tập công nghệ sinh học vi sinh vật, Nxb ĐH Khoa học

Tự nhiên – TP. HCM.

Tiếng Anh

8. Bing-Ying Ho anh Tzu-Ming Pan (2009), “The Monascus Metabolite Monacolin K

Reduce tumor progression and Metastasis of lewis lung carcinoma cells”, J. Agric.

Food Chem , 57, pp. 8258-8265.

9. Chun-Lin Lee, Wen-Pei Chen, Jyh-Jye Wang and Tzu-Ming-Pan (2007), “ A Simple

and Rapid Approach for Removing Citrinin while Retaining Monacolin K in Red

Mold Rice”, J. Agric. Food Chem, 55, pp. 11101- 11108.

10. D. J. Becker, R. Y. Gordon, S. C. Halbert, B. French, P. B. Morris, and D. J. Rader

(2009), “Red yeast rice for dyslipidemia in statin-intolerant patients: a randomized

trial,” Annals of Internal Medicine, 150(12), pp. 830–839.

11. Endo.A (1979), “Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent produced by a

Monascus species”, Journal of Antibiotics (Tokyo), 32(8) pp. 852–854.

12. Endo.A (1980),“Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent that specifically

inhibits 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,” Journal of Antibiotics,

33(3), pp. 334–336.

13. Farhan Binti Mohd Said (2010), “Monascus ruber ICMP 15220 fermentation for the

production of pigments”, Ph.D. Thesis, at Massey University, New Zealand, pp. 11-

78.

14. Hawksworth, D.L. and Pitt, J.I. (1983), “A new taxonomy for Monascus species

based on cultural and microscopical characters”, Australian Journal of Botany, 31,

pp. 51-61.

15. M. Klimek, S. Wang, and A. Ogunkanmi (2009), “Safety and efficacy ored yeast rice

(Monascus purpureus) as an alternative therapy for hyperlipidemia,” P and T, 34(6),

pp. 313–327.

16. Y. Kohama, S. Matsumoto, and T. Mimura (1987), “Isolation and identification of

hypotensive principles in red-mold rice,” Chemical and Pharmaceutical Bulletin,

35(6), pp. 2484–2489.

17. Makoto Fujimoto, Koichi Tsuneyama, Shao-Yuan Chen, Takeshi Nishida, Jiun –

Liang Chen, Yen-Chen Chen, Takado Fujimoto,Johji Imura and Jutaka Shimada

(2012), “Study of the Effects of Monacolin K and Other Constituents of Red Yeast

Rice on Obesity, Insulin-Resistance, Hyperlipidemia, and Nonalcoholic

Steatohepatitis Using a Mouse Model of Metabolic Syndrome”, Evidence-Based

Complementary and Alternative Medicine Volume 2012, Article ID 892697, 11 pages

18. J. J. Wang, C. L. Lee, and T. M. Pan (2003), “Improvement of monacolin K, γ-

aminobutyric acid and citrinin production ratio as a function of environmental

conditions of Monascus purpureus NTU 601”, Journal of Industrial Microbiology

19. Johns, M.R. and Stuart, D.M. (1991), “Production of pigments by Monascus

and Biotechnology, 30(11), pp. 669–676.

purpureus in solid culture”, Journal of Industrial Microbiology, 8, pp. 23-28.

20. M. Fujimoto, K. Tsuneyama, H. Kinoshita et al ., “The traditional Japanese formula

keishibukuryogan reduces liver injury and inflammation in patients with

nonalcoholic fatty liver disease,” Annals of the New York Academy of Sciences, 1190,

21. Pastrana, L., Blanc, P.J., Santerre, A.L., Loret, M.O. and Goma, G. (1995),

pp. 151–158.

“Production of red pigments by Monascus ruber in synthetic media with a strictly

controlled nitrogen source”. Process Biochemistry, 30, pp. 333-341.

22. Raimbault, M. and Alazard, D. (1980), “Culture method to study fungal growth in

solid fermentation”, European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology,

9, pp. 199-209.

23. Raimbault, M.(1998), “General and microbiological aspects of solid state

fermentation”, Electronic Journal of Biotechnology, 1, pp.174-188.

24. Roopesh, K., Ramachandran, S., Nampoothiri, K.M., Szakacs, G. and Pandey, A.

(2006), “ Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in solid state

fermentation by Mucor racemosus, Bioresource Technology, 97, pp. 506-511.

25. Sakurai, Y., Lee, T.H. and Shiota, H. (1977), “On the convenient method for

glucosamine estimation in koji”, Agricultural and Biological Chemistry, 41, pp. 619-

624.

26. Slugen, D., Menta, SeSe, Roseberg.M, “Role of pH and aw for solid state pigment

cultivation of Monascus purpureus CCM 8112”, Depart of Biochemical technology,

CHTFSTU. Radlinskeho 9, 81237 Bratislava Slovak republic.

27. Shepherd, D. (1977), “The relationship between pigment production and sporulation

on Monascus.” In Biotechnology and Fungal Differentiation, FEMS Symposium No.

4, J. Meyrath and J.D. Bullock (eds), Academic Press, London. pp. 103-118.

28. Su, Y.C. and Huang, J.H. (1980), “Fermentation production of anka pigment.

Proceedings National Science Council”, R. China, 4, pp. 201-215

29. Yang, S., Zhang, H., Li, Y., Qian, J. and Wang, W. (2005), “The ultrasonic effect on

biological characteristics of Monascus sp.”, Enzyme and Microbial Technology, 37,

pp. 139-144.

30. Yongsmith, B., Tabloka, W., Yongmanitchai, W. and Bavavoda, R. (1993), “Culture

conditions for yellow pigment formation by Monascus sp. KB 10 grown on cassava

medium”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 9, pp. 85-90.

31. Yongsmith, B., Krairak, S. and Bavavoda, R. (1994), “Production of yellow pigments

in submerged culture of a mutant of Monascus sp.”, Journal of Fermentation and

Bioengineering, 78, pp. 223-228.

32. Wong, H.C. and Bau, Y.S. (1977), “Pigmentation and antibacterial activity of fast

neutron- and xray-induced strains of Monascus purpureus Went”. Plant Physiology,

60, pp. 578-581.

33. Wong, H.C., Lin, Y.C. and Koehler, P.E. (1981), “Regulation of growth and

pigmentation of Monascus purpureus by carbon and nitrogen concentrations”,

Mycologia, 73, pp. 649-654.

34. Wong, H.C. (1982), “Antibiotic and pigment production by Monascus purpureus”.

Ph.D. Thesis, University of Georgia, G.A., USA.

35. Wu, W.T., Wang, P.M., Chang, Y.Y., Huang, T.K. and Chien, Y.H. (2000),

“Suspended rice particles for cultivation of Monascus purpureus in a tower-type

bioreactor”, Applied Microbiology and Biotechnology, 53, 542-544.

Internet

36. http://www.ykhoa.net/binhluan/nguyenvantuan/100512_nguyenvantuan_mo_huyetap

_tieuduong.htm

37. http://www.nhandan.com.vn/mobile/_mobile_suckhoe/_mobile_suckhoe/item/99180

2.html

38. http://benhhoc.vn/3146/tim-mach/Men-gao-do-co-it-tac-dung-phu-hon-thuoc-dieu-

tri-mo-mau-Statins.aspx

39. http://naturalproducts.org

40. www.dotcomtech.co.uk

41. http://linux1.nii.res.in/~pksdb/polyketide.html

42. http://www.medicinenet.com/red_yeast_rice_and_cholesterol/article.htm

43. http://www.webmd.com/cholesterol-management/red-yeast-rice

44. http://www.mayoclinic.com/health/red-yeast-rice/NS_patient-redyeast

45. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2697909/

46. http://www.redyeastrice-china.com

47. http://www.hindawi.com/journals/ecam/2012/892697/

48. http://yiwu-monascus.com/en/cpzs1.asp

49. http://www.xmarks.com/site/www.americanheart.org/presenter.jhtml%3Fidentifier=5

50. http://vietbao.vn/Xa-hoi/Bao-dong-ve-viec-su-dung-pham-mau-trong-thuc-

pham/10721196/157/

51. http://behrbonn.org/monascub.htm