Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương pháp sắc kí

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI

RAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

VŨ THỊ HƢƠNG QUỲNH

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU

BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. NGUYỄN XUÂN TRUNG

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến

PGS.TS. Nguyễn Xuân Trung, NCS Vũ Thị Trang đã giao đề tài, chỉ dẫn tận tình và

tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn.

Tôi in được g i lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện ki m nghiệm

An toàn vệ sinh th c ph m Quốc gia, các anh chị trong Khoa chất lượng ph gia và

chất h trợ chế biến th c ph m - Viện Ki m nghiệm an toàn vệ sinh th c ph m

Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên c u

trong môi trường hiện đại.

Tôi in bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là

các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích đã cho tôi những kiến th c quý giá trong

quá trình học tập và th c hiện đề tài này.

Cuối c ng, tôi in g i lời biết ơn sâu s c tới gia đình, bạn b đã luôn bên

cạnh chia s kh khăn, động viên và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc

sống.

Do thời gian th c hiện đề tài c hạn nên không tránh những thiếu s t, rất

mong nhận được ý kiến đ ng g p c a thầy cô và các bạn đ luận văn này được hoàn

thiện hơn.

Hà Nội, ngày 30 tháng 11 năm 2015

Học viên

Vũ Thị Hƣơng Quỳnh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu chung về anthocyanin ................................................................................ 3

1.1.1. Cấu trúc h a học c a anthocyanin ................................................................ 3

1.1.2. Tính chất c a anthocyanin ............................................................................ 5

1.1.3. Tác d ng c a anthocyanin ............................................................................ 6

1.1.4. S phân bố c a anthocyanin ......................................................................... 7

1.2. Một số phƣơng pháp xác định anthocyanin ............................................................. 8

1.2.1. Phương pháp pH vi sai .................................................................................. 8

1.2.2. Phương pháp s c ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ......................................... 9

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ............................................................................. 13

2.1. Mục tiêu ........................................................................................................................ 13

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 13

2.3. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................................. 13

2.4. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị ................................................................................... 13

2.4.1. Chất chu n .................................................................................................. 13

2.4.2. Hoá chất ...................................................................................................... 13

2.4.3. Thiết bị ........................................................................................................ 14

2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................................... 15

2.6. Thẩm định phƣơng pháp .......................................................................................... 16

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 17

3.1. Tối ƣu các điều kiện xác định anthocyanin trên hệ thống HPLC ..................... 17

3.1.1. Chọn detector .............................................................................................. 17

3.1.2. Chọn bước s ng phát hiện .......................................................................... 18

3.1.3. Chọn cột tách .............................................................................................. 19

3.1.4. Chọn th tích bơm mẫu ............................................................................... 20

3.1.5. Khảo sát thành phần pha động ................................................................... 21

3.1.6. Khảo sát nồng độ a it trong pha động ........................................................ 22

3.1.7. Khảo sát chương trình r a giải ................................................................... 23

3.1.8. Khảo sát tốc độ pha động ............................................................................ 27

3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ................................................................................. 28

3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng c a thời gian đến quá trình th y phân ....................... 30

3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng c a nhiệt độ đến quá trình th y phân ......................... 31

3.2.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu ............................................................. 33

3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ........................................................................ 34

3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc ................................................................................ 34

3.3.2. Khoảng tuyến tính ....................................................................................... 36

3.3.3. Độ lặp lại ..................................................................................................... 38

3.3.4. Độ thu hồi ................................................................................................... 40

3.4. Ứng dụng phƣơng pháp xác định anthocyanin trong một số rau củ ............... 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 46

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Cấu trúc c a 6 chất phổ biến nhất trong nh m anthocyanin ...................... 4

Bảng 1.2: Thông tin chung về 3 chất nghiên c u ....................................................... 4

Bảng 1.3: Hàm lượng Anthocyanin tổng c trong một số mẫu th c vật tại Việt Nam [7] ................................................................................................................................ 8

Bảng 3.1: Ảnh hưởng c a cột tách đến độ rộng đáy pic (W) và thời gian lưu (tR) ... 20

Bảng 3.2: Ảnh hưởng c a thành phần pha động đến độ rộng đáy pic (W), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS) c a del, cya, pel. ............................................................. 21

Bảng 3.3: R a giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng ........................................ 23

Bảng 3.4: Chương trình gradient 1 ............................................................................ 24

Bảng 3.5: Chương trình gradient 2 ............................................................................ 25

Bảng 3.6: Chương trình gradient 3 ............................................................................ 25

Bảng 3.7: Chương trình gradient 4 ............................................................................ 26

Bảng 3.8: Ảnh hưởng c a chương trình gradient đến hệ số đối ng pic ................ 27

Bảng 3.9: Ảnh hưởng c a tốc độ dòng đến thơi gian lưu và chiều cao pic .............. 27

Bảng 3.10: Hàm lượng các chất theo thời gian th y phân ........................................ 31

Bảng 3.11: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ th y phân khác nhau .................... 32

Bảng 3.12: Hàm lượng các chất tại các tỷ lệ dung môi chiết khác nhau .................. 33

Bảng 3.13: Nồng độ và diện tích pic trung bình c a các chất................................... 36

Bảng 3.14: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 c a phương trình đường chu n c a 3 anthocyanin ...................................................................................................... 38

Bảng 3.15: Độ lặp lại trên nền mẫu b p cải tím ........................................................ 39

Bảng 3.16: Độ lặp lại trên nền mẫu khoai lang tím .................................................. 39

Bảng 3.17: Độ thu hồi trên nền mẫu rau dền đỏ ...................................................... 40

Bảng 3.18: Độ thu hồi trên nền mẫu c dền ............................................................. 41

Bảng 3.19: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng c a các chất phân tích ........ 43

Bảng 3.20: Kết quả phân tích một số mẫu rau c ..................................................... 43

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon c a anthocyanin .................................................. 3

Hình 1.2: S ph thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH ................................................ 5

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC ................................................................... 14

Hình 3.1: Phổ hấp th c a delphinidin ...................................................................... 18

Hình 3.2: Phổ hấp th c a cyanidin .......................................................................... 18

Hình 3.3: Phổ hấp th c a pelargonidin .................................................................... 18

Hình 3.4: S c ký đồ c a dung dịch chu n 3 chất với cột s c kí 1 ............................. 19

Hình 3.5: S c ký đồ c a dung dịch chu n 3 chất với cột s c kí 2 ............................. 20

Hình 3.6: S c ký đồ r a giải các anthocyanin với thành phần pha động là nước và

ACN .......................................................................................................................... 21

Hình 3.7: S c ký đồ del, cya tại các nồng độ a it trifloa etic khác nhau ................. 22

Hình 3.8: S c ký đồ c a h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 1 ...... 24

Hình 3.9: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 2 ........... 25

Hình 3.10: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 3 .......... 25

Hình 3.11: S c ký đồ h n hợp dung dịch chu n với chương trình gradient 4 .......... 26

Hình 3.12: Hàm lượng các chất khi th y phân trong thời gian khác nhau (60, 90,

120, 150 phút). .......................................................................................................... 30

Hình 3.13: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ th y phân khác nhau ........................... 32

Hình 3.14: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2 N trong dung môi chiết mẫu

................................................................................................................................... 33

Hình 3.15: S c ký đồ dung dịch chu n h n hợp ....................................................... 35

Hình 3.16: S c ký đồ c a mẫu rau không ch a anthocyanin .................................... 35

Hình 3.17: S c ký đồ c a mẫu rau không ch a anthocyanin được thêm chu n h n

hợp ............................................................................................................................. 35

Hình 3.18: Đường chu n bi u thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ

delphinidin ................................................................................................................. 36

Hình 3.19: Đường chu n bi u thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ

cyanidin ..................................................................................................................... 37

Hình 3.20: Đường chu n bi u thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ

pelargonidin ............................................................................................................... 37

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

ACN Acetonitrile Acetonitril

Association of Official Analytical Hiệp hội cộng đồng phân AOAC Community tích chính th c

CYA Cyanidin Cyanidin

DEL Delphinidin Delphinidin

High performance liquid HPLC S c ký lỏng hiệu năng cao chromatography

High performance thin layer S c ký lớp mỏng hiệu năng HPTLC chromatography cao

LC- Liquid chromatography tandem mass S c ký lỏng ghép khối phổ

MS/MS spectrometry hai lần

Limit of detection Giới hạn phát hiện LOD

Limit of quantitation Giới hạn định lượng LOQ

MeOH Methanol Metanol

Photodiod array Detector mảng đi-ốt quang PDA

Pelargonidin Pelargonidin PEL

Parts per million Phần triệu ppm

Relative coefficient Hệ số tương quan R

RSD Relative standard deviation Độ lệch chu n tương đối

Standard Deviation Độ lệch chu n SD

Tỷ lệ tín hiệu chia cho Signal to noise ratio S/N nhiễu

TFA Trifloroacetic acid Axit Trifloaxetic

UV-VIS Ultraviolet-Visible T ngoại và khả kiến

MỞ ĐẦU

Ngày nay, do ảnh hưởng c a điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng

ồn, căng thẳng, lo l ng hay s d ng các th c ph m ch a nhiều chất o y h a đã tạo

điều kiện làm gia tăng gốc t do, kéo theo sau đ là s gia tăng các dạng o y hoạt

động. Các dạng o y hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ng bất lợi, tổn thương

cho cơ th và là nguyên nhân c a nhiều căn bệnh nan y. Những nghiên c u tìm hi u

về các chất c khả năng chống o y h a mang lại những tác d ng tốt, c lợi cho s c

khỏe con người đang ngày càng phát tri n.

Chất chống o y h a là những “chiến binh tốt” chống lại các chất độc hại - các

gốc t do. Chúng được hình thành một cách t nhiên như là một sản ph m ph c a

quá trình sống liên quan tới o y. Các chất chống o y h a c khả năng giải ph ng ra

những điện t , chúng vô hiệu h a khả năng oxy h a c a các gốc t do và ngăn chặn

chúng tấn công các tế bào khỏe mạnh. Đ bảo vệ chính mình, cơ th luôn t sản

sinh ra các cơ chế chống o y h a thiết yếu, nhưng với thời gian chúng dần trở nên

kém hiệu quả theo tuổi tác. Đây là lý do tại sao mà việc s d ng các chất chống o y

h a cũng như các th c ph m ch a chất chống o y h a là rất quan trọng [3], [11].

Ngày nay, th c ăn không chỉ đảm bảo đ calo, ngon, sạch, mà còn phải ch a

các hoạt chất sinh học t nhiên cần cho s c kho và s c đẹp, không chỉ điều khi n

được các ch c năng hoạt động c a từng bộ phận trong cơ th , tạo cho con người khả

năng miễn dịch cao, chống s lão hoá, tăng tuổi thọ, mà còn giúp phòng chống

được một số bệnh, k cả ung thư. Theo các nghiên c u thì các hợp chất anthocyanin

có các hoạt tính rất tốt như: chống viêm, chống ơ vữa động mạch, c chế đông t

ti u cầu, chống ung thư, thúc đ y hình thành cytokin điều hòa phản ng miễn dịch,

c hoạt tính chống o y h a rất mạnh [21], [22], [28].

Trên thế giới đã c nhiều quy trình ác định hàm lượng tổng anthocyanin hay

hoạt chất nh m anthocyanin bằng các kỹ thuật như: HPLC, UV-VIS, HPTLC, LC-

MS [17], [24], [31]. Tại Việt Nam cũng công bố một số nghiên c u ác định hàm

lượng anthocyanin trong th c vật hay th c ph m [2], [7]. Hầu hết các phương pháp

phân tích này ác định anthocyanin tổng bằng phương pháp UV-VIS c độ chính

1

ác không cao. Việc phân tích riêng l từng hợp chất trong nhóm anthocyanin trong

đối tượng mẫu th c vật là cơ sở đ đánh giá hoạt tính chống o y hoá c a từng chất

trong nhóm, đề uất nguồn nguyên liệu cho chế biến th c ph m ch c năng. Xuất

phát từ th c tiễn trên, chúng tôi đặt vấn đề nghiên c u đề tài:

“Xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số loại rau bằng phương

pháp sắc ký”

Với các m c tiêu sau đây:

1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin

trong một số loại rau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

2. Áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng phân tích một số mẫu rau trên thị

trường.

2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung về anthocyanin

Các anthocyanin thuộc một trong những nh m các chất màu t nhiên

flavonoid tan trong nước lớn nhất trong thế giới th c vật. Thuật ngữ anthocyanin

b t nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đ anthocyanin là s kết hợp giữa Anthos – nghĩa

là hoa và Kyanos – nghĩa là anh thẫm [27]. Tuy nhiên, không chỉ c màu anh,

anthocyanin còn mang đến cho th c vật nhiều màu s c r c rỡ khác như hồng, đỏ,

cam và các gam màu trung gian [30].

1.1.1. Cấu trúc hóa học của anthocyanin

Anthocyanin là những glycozit do gốc đường glucozơ, glactozơ... kết hợp với

gốc aglycon c màu (anthocyanidin). Các anthocyanin khi mất hết nh m đường

được gọi là anthocyanidin hay aglycon. M i anthocyanidin c th bị glycosyl h a

acylate bởi các loại đường và các axit khác tại các vị trí khác nhau. Aglycon c a

chúng c cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình 1.1. Các gốc đường c th được

g n vào vị trí 3,5,7; thường được g n vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít. Phân t

anthocyanin g n đường vào vị trí 3 gọi là monoglycozit, ở vị trí 5 và 7 gọi là

diglycozit. S khác biệt giữa chúng là số lượng các nh m hydro y, bản chất và số

lượng các gốc đường liên kết với cấu trúc c a chúng. Đến nay c những báo cáo

c a hơn 500 anthocyanin khác nhau và 23 anthocyanidin, tuy nhiên trong đ chỉ c

sáu chất phổ biến nhất là pelargonidin, peonidin, cyanidin, malvidin, petunidin và

delphinidin [30]. Trong đề tài này, chúng tôi ác định pelargonidin, cyanidin,

delphinidin trong rau c .

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin

3

Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin

R3’ R5’ Anthocyanidin R3 R5 Anthocyanin

H H Pelargonidin Glucozơ Pelargonidin 3-glucozit

H H Pelargonidin Glucozơ Glucozơ Pelargonidin 3,5-diglucozit

OH H Cyanidin Glucozơ Cyanidin 3-glucozit

OH H Cyanidin Glucozơ Glucozơ Cyanidin 3,5-diglucozit

OH OH Delphinidin Glucozơ Delphinidin 3-glucozit

OH OH Delphinidin Glucozơ Glucozơ Delphinidin 3,5-diglucozit

Petunidin Glucozơ Petunidin 3-glucozit

Petunidin Glucozơ Glucozơ Petunidin 3,5-diglucozit

Peonidin Glucozơ Peonidin 3-glucozit

H Peonidin Glucozơ Glucozơ Peonidin 3,5-diglucozit

Malvidin Glucozơ Malvidin 3-glucozit

Malvidin Glucozơ Glucozơ Malvidin 3,5-diglucozit OCH3 OH OCH3 OH OCH3 H OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3

Các aglycon c a anthocyanin khác nhau chính là do các nh m g n vào vị trí R1 và

R2, thường là H, OH hoặc OCH3.

Bảng 1.2: Thông tin chung về 3 chất nghiên cứu

Delphinidin Cyanidin Pelargonidin

3,5,7,3’,4’,5’- hexa 3,5,7,3’,4’- penta 3,4’,5,7-tetra Tên hóa học

hydroxy flavylium hydroxy flavylium hydroxy flavylium

+

Công thức

+

+

phân tử C15H11O7

C15H11O6 C15H11O5

Công thức

cấu tạo

Khối lƣợng

303,24 287,24 271,24 phân tử

(g/mol)

4

1.1.2. Tính chất của anthocyanin

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh th hoặc vô định hình là hợp chất khá phân

c c nên tan tốt trong dung môi phân c c.

Anthocyanin hòa tan tốt trong nước, etanol, metanol,… Trong đ khả năng tan

trong CH3OH – HCl và C2H5OH – HCl là tương đương nhau và cao nhất [6].

Màu s c anthocyanin thay đổi ph thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều

yếu tố khác,… Khi tăng số lượng nh m OH trong vòng benzen thì màu càng xanh

đậm.

M c độ metyl h a các nh m OH ở vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ.

Nếu nh m OH ở vị trí th ba kết hợp với các gốc đường thì màu s c cũng sẽ thay

đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít [30].

Các anthocyanin cũng ph thuộc rất mạnh vào pH c a môi trường:

- Khi pH > 7 các anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các anthocyanin có

màu đỏ.

- Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng muối o onium màu cam đến đỏ.

- Ở pH = 4÷5 chúng c th chuy n về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon

không màu.

- Ở pH = 7÷8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh.

Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH

Màu s c c a anthocyanin còn c th thay đổi do hấp th ở trên polysaccarit.

Khi đun n ng lâu dài các anthocyanin c th phá h y và mất màu.

5

Anthocyanin c bước s ng hấp th trong miền nhìn thấy, khả năng hấp th c c

đại tại bước s ng 510–540 nm. Độ hấp th quang là yếu tố liên quan mật thiết đến

màu s c c a các anthocyanin, ph thuộc vào pH c a dung dịch, nồng độ

anthocyanin: thường pH thuộc v ng axit mạnh c độ hấp th quang lớn. Nồng độ

anthocyanin càng lớn độ hấp th quang càng mạnh.

Như vậy, trong môi trường axit, các anthocyanin là những bazơ mạnh và c

th tạo muối bền vững với axit. Anthocyanin cũng c khả năng cho muối với bazơ.

Như vậy chúng c tính chất lưỡng tính. Muối với axit thì c màu đỏ, còn muối với

kiềm thì c màu anh.

1.1.3. Tác dụng của anthocyanin

Trong th c vật, anthocyanin c tính kháng khu n, kháng nấm, c vai trò tạo

điều kiện cho s th phấn, phát tán do hình thành nên màu s c sặc sỡ trên cành hoa

và quả. Mặt khác, anthocyanin là chất c khả năng hấp th tia UV cho phép bảo vệ

bộ gen c a th c vật trước nh m tác nhân c th gây đột biến gen này. Sinh tổng hợp

anthocyanin ở vỏ được tăng cường đ đáp ng ph hợp với môi trường: hạn hán,

ánh sáng mạnh, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phốt pho, nhiễm nấm, vi khu n, tổn

thương, côn tr ng, ô nhiễm…[20], [36].

Đối với s c khỏe c a con người, theo nghiên c u c a G. C. Cretu và cộng s

[15], các anthocyanin c th c t được cơn đau tim, giảm thi u các tổn thương não

liên quan đột quỵ và ngăn cản s tạo thành các c c máu đông trong lòng mạch máu

(nguyên nhân dẫn đến t c mạch, gây tai biến mạch máu não và những cơn nhồi máu

cơ tim đột ngột), hạn chế s suy giảm s c đề kháng. Các nhà khoa học cũng đã

ch ng minh được rằng anthocyanin c tác d ng tốt trong chống lão h a, ngăn ngừa

s phát tri n c a các khối u, bướu, hạn chế nguy cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ m c

ung thư… Khi tiêm một lượng nhỏ anthocyanin chiết uất từ khoai lang vào các tế

bào ung thư ruột già, chất này đã ch ng tỏ khả năng ngăn chặn tế bào ung thư phát

tri n. Các nhà nghiên c u cũng phát hiện trong một số trường hợp về s biến đổi

cấu trúc c a các phân t anthocyanin cũng làm tăng khả năng chống ung thư c a

chúng. Các nghiên c u còn cho thấy anthocyanin còn c tác d ng tốt trong việc

điều hòa lượng đường huyết c a những bệnh nhân đái tháo đường. Khả năng chữa

6

bệnh c a anthocyanin vẫn đang được nghiên c u đ tìm hi u cơ chế và ng d ng

trong y học. Các ng d ng trên đã mở ra một tri n vọng về việc sản uất th c ph m,

dược ph m ch c năng chữa bệnh c hiệu quả [14].

Trong lĩnh v c th c ph m, với khả năng chống o y h a cao, anthocyanin được

s d ng đ bảo quản th c ph m, kháng khu n, kháng nấm, chống o y h a cho th c

ph m [35]. Kết quả nghiên c u cho thấy, với một lượng nhỏ nguyên liệu vỏ khoai

lang (1% khối lượng), khả năng bảo quản c a các sản ph m th c ph m c ch a mỡ

được kéo dài khá lâu và c th so sánh với chất chống o y h a tổng hợp butylated

hydro yanisol là chất chống o y hoá, h n hợp hai đồng phân: 2-tert-butyl-4-

hydroxy anisole và 3-tert-butyl-4-hydroxy anisole [35]. Ngoài các tác d ng chống

oxy hóa, anthocyanin còn được s d ng như chất màu t nhiên tạo ra nhiều màu s c

hấp dẫn cho th c ph m và khá an toàn. Ví d , dịch chiết anthocyanin từ các loại rau

c c màu đỏ như vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được d ng đ làm chất

màu thay thế màu tổng hợp trong sản uất kẹo c ng [36].

Anthocyanin bên cạnh vai trò là màu thiên nhiên được s d ng trong th c

ph m, còn là hợp chất c nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng chống o y h a

cao, chống lão h a, tăng cường s c đề kháng, làm bền thành mạch, chống viêm, hạn

chế s phát tri n c a các tế bào ung thư, tác d ng chống các tia ph ng ạ [19], [20].

1.1.4. Sự phân bố của anthocyanin

Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn

nằm ở hoa và quả, ngoài ra cũng c ở lá và rễ. Trong những loại th c vật này,

anthocyanin được tìm thấy ch yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài như bi u bì.

Các hợp chất anthocyanin uất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73

loài và trong vô số giống th c vật s d ng làm th c ph m [20]. Các họ th c vật như

vitaceae (họ nho) và rosaceae (họ hoa hồng) là các nguồn anthocyanin ch yếu. Bên

cạnh đ còn c các họ th c vật khác như solanaceae (cà tím), sa ifragaceae (quả lý

đỏ và đen), ericaceae (quả việt quất) và brassicaceae (b p cải tím). Các loại

anthocyanin phổ biến nhất là các glycozit c a cyanidin, kế đến là pelargonidin,

peonidin và delphinidin, sau đ petuidin và maldivin. Số lượng các 3–glycozit nhiều

gấp 2,5 lần các 3,5–glycozit. Loại anthocyanin hay gặp nhất chính là cyanidin-3-

7

Bảng 1.3: Hàm lượng Anthocyanin tổng có trong một số mẫu thực vật tại Việt Nam [7]

glycozit [33].

Hàm lƣợng

STT Mẫu anthocyanin tổng

(%)

1 Thân c a loài ngô (Zea mays L.) 0,59

2 Lá chua, b p giấm (Hibiscus sabdariffa L.) 1,49

3 Hoa c a loài chuối tiêu (Musa pardisiaca L.) 0,34

4 Quả c a loài dâu tằm (Mosrus alba L.) 1,75

5 Lá c a loài tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt.) 1,72

6 C c a loài khoai lang tím (Ipomoea batatas (L.) Poir.) 0,46

7 Vỏ c a loài nho (Vitis vinifera L.) 1,27

8 Lá c a loài mơ leo (Paederia scandens (Lour.) 1,05

Merr.)

9 Lá c a loài rau dền tía (Amaranthucs tricolor L.) 1,74

1.2. Một số phƣơng pháp xác định anthocyanin

Ở Việt Nam và trên thế giới, việc ác định hàm lượng anthocyanin trong th c

ph m n i chung và trong rau c n i riêng là vấn đề đang rất được quan tâm. Nhiều

nhà khoa học tiến hành nghiên c u ác định hợp chất này bằng nhiều phương pháp

khác nhau. Dưới đây là một số phương pháp phổ biến đã được tiến hành th c

nghiệm.

1.2.1. Phương pháp pH vi sai

Tác giả Huỳnh Thị Kim Cúc và cộng sự [2] đã ác định hàm lượng

anthocyanin tổng trong một số nguyên liệu rau quả (quả dâu, b p cải tím, lá tía tô,

trà đỏ, vỏ quả nho, vỏ quả cà tím) bằng phương pháp pH vi sai. Hàm lượng

anthocyanin trong quả dâu là 1,188%; b p cải tím: 0,909%; lá tía tô: 0,397%; trà đỏ:

0,335%; vỏ quả nho: 0,564%; vỏ cà tím: 0,441%.

Tác giả Phạm Thị Thanh Nhàn và cộng sự [7] đã tách chiết và phân tích hàm

lượng anthocyanin trong một số loài th c vật. Tác giả đã trình bày một số dung môi

tách chiết anthocyanin và kết quả ác định hàm lượng anthocyanin trong một số

8

nguyên liệu tươi bằng phương pháp pH vi sai. Hàm lượng anthocyanin toàn phần ở

thân cây ngô non là 0,59%; lá chua 1,49%; hoa chuối 0,34%; lá cây hoa s i 0,56%;

lá huyết d 1,28%; quả dâu ta 1,75%; lá tía tô 1,72%; c khoai lang tím 0,46%; vỏ

quả nho 1,27%; lá mơ 1,05%; lá rau dền tía 1,74%.

Tác giả Nguyễn Thị Hiển và cộng sự [5] đã nghiên c u chiết uất chất màu

anthocyanin từ đài hoa b p giấm bằng phương pháp so màu và phương pháp pH vi

sai, đã ác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết chất màu là dung môi

etanol:nước = 50:50 bổ sung 1% HCl; tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 14 ml/g; thời

gian chiết 6 ngày, tiến hành ở nhiệt độ phòng. Bằng phương pháp chiết phân đoạn,

các tác giả đã tách được chất màu thô anthocyanin từ dịch chiết c a đài hoa b p

giấm và ác định được hàm lượng chất màu trong nguyên liệu khô là 15,2%, tương

ng trong nguyên liệu tươi là 1,06%.

1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hiện nay, HPLC là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được s

d ng rộng rãi và phổ biến nhất. Do phương pháp này c độ nhạy tương đối cao, c

khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất kh bay hơi hoặc dễ

bị phân h y nhiệt. Đồng thời phương pháp này cũng c phạm vi ng d ng trải rộng

trong nhiều lĩnh v c từ nghiên c u khoa học, trong các phòng thí nghiệm đến công

nghiệp và một số lĩnh v c khác.

Phương pháp này rất ph hợp cho việc ác định anthocyanin trong th c ph m

n i chung. Do đ , n được s d ng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm. Đã c rất

nhiều công trình nghiên c u ng d ng phương pháp này đ ác định anthocyanin.

Bhornchai Harakotr [12] đã ác định 4 anthocyanin, 7 hợp chất phenolic trong

ngô tím s d ng HPLC/DAD. Các anthocyanin chính được tìm thấy trong ngô tím

bao gồm: cyanidin-3-glucozit, cyanidin-3-(6’-malonyl glucozit) và cyanidin-3-

(3’,6’-dimalonyl glucozit). Hầu hết các anthocyanin được tìm thấy ở dạng acylated

anthocyanin (chiếm 46,2-88% hàm lượng tổng anthocyanin) mà được s d ng rất

hiệu quả làm chất màu th c ph m bởi tính bền màu c a chúng. Nghiên c u cũng chỉ

ra ngô tím là nguồn cung cấp các chất c hoạt tính sinh học và nguồn cung cấp hiệu

quả các chất chống o y h a t nhiên ph c v hữu ích cho một số ngành công

9

nghiệp: th c ph m ch c năng, ph gia th c ph m và mỹ ph m.

Nafiz Oncu Can và cộng sự [29] đã nghiên c u phương pháp ác định nhanh 6

anthocyanin phổ biến nhất trong th c ph m. Các dạng 3-glycozit c a pelargonidin,

cyanidin, peonidin, delphinidin, petunidin và malvidin được tách và định lượng bằng

HPLC-DAD trong 18 phút s d ng nội chu n aglycon cyanidin. Quá trình lý mẫu

đơn giản với việc hòa tan trong nước, lọc và bơm vào máy s c ký. Tác giả tập trung l a

chọn điều kiện s c ký tối ưu đ tách và định lượng các chất. Giới hạn phát hiện cho 6

anthocyanin trong khoảng 3,92-19,26 ng/ml. Hàm lượng anthocyanin trong các mẫu

rau, quả tươi và sản ph m chế biến trong khoảng 0-1837 µg/g và hàm lượng

anthocyanin trong rau quả tươi cao hơn trong các sản ph m đã qua chế biến. Phương

pháp ph hợp đ ác định nhanh anthocyanin trong các sản ph m c hàm lượng trong

khoảng 80-420 ng/ml với độ đúng 99,2 ± 0,2% và độ ch m trung bình 0,8%.

Yafang Shao [37] ác định các axit phenolic, anthocyanin và hoạt tính chống

o y h a c a chúng trong gạo (Oryza sativa). Tác giả đã ác định đồng thời 11 axit

phenolic bằng HPLC/DAD và ác nhận bằng LC/MS/MS. Hàm lượng phenolic

tổng trong các loại gạo khác nhau: gạo tr ng (14,6-33,4 mg/100 g), gạo đỏ (66,8-

422,2 mg/100 g), gạo đen (56,5-82,0 mg/100 g). Chỉ c gạo đen được phát hiện

ch a anthocyanin (26,5-174,7 mg/100 g) bao gồm 2 loại chính: cyanidin-3-glucozit

và peonidin-3-glucozit.

Antonieta Ruiz [10] đã ác định đồng thời 22 anthocyanin dạng liên kết trong

một số loại bery dại ở phía nam Patagonian bằng HPLC-DAD-ESI-MS/MS. Chiếm

hàm lượng cao nhất là delphinidin (22,91-35,99 µmol/g), petunidin (16,11-21,40

µmol/g ) và malvidin (13,70 µmol/g).

Francesca Leri [18] đã ác định đồng thời anthocyanin, coumarin và axit

phenolic trong quả, hạt và rượu c a các loài cây họ mơ mận (Prunus mahaleb L).

Tác giả s d ng các kỹ thuật HPLC/DAD, HPLC/MS và HPLC/MS/MS đ nhận

biết và ác định được ba nh m phenolic đặc trưng gồm: các dẫn uất axit phenolic

(hợp chất chính là o-coumaric axit glucozit), quercetin glycozit và anthocyanin

(cyanidin 3,5-diglucozit, cyanidin 3-sambubiozit, cyanidin 3-xylosyl-rutinozit và

cyanidin 3-rutinozit). Coumarin chiếm hàm lượng cao trong hạt (0,87 mg/g),

10

flavonoid tập trung trong vỏ và thịt quả (0,55 mg/g). Trong sản ph m truyền thống

sản uất từ P.mahaleb, anthocyanin chiếm tới 16,5%, axit phenolic chiếm 43,3%,

coumarin 36,2% và flavonoid 4% c a tổng các chất. `

Fumi Tatsuzawa và cộng sự [32] đã khảo sát một dãy liên tiếp 8 giống hoa c

màu s c khác nhau ch a anthocyanin đ ác định mối quan hệ giữa màu s c hoa và

thành phần anthocyanin trong một họ. Tác giả s d ng các điều kiện phân tích như

sau: cột C18Waters (250 x 4,6 mm, 5 µm); pha động: A (H3PO4 1,5%) B (H3PO4

1,5%, CH3COOH 20% trong h n hợp CH3CN-H2O (25-75); tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; nhiệt độ cột: 400C; detector: PDA ở bước s ng 530 nm. Mẫu được th y phân bằng HCl ở nhiệt độ 900C trong 2 giờ, lọc sau đ chạy s c ký.

Zhe Zhang và cộng sự [38] đã phát tri n phương pháp HPLC đ phân tích các

anthocyanin và anthocyanidin trong dịch chiết quả việt quất. D a trên việc kết hợp

phương pháp HPLC với detector khối phổ đã ác định được 11 anthocyanin trong

dịch chiết quả việt quất, trong đ chuy n đổi được 5 aglycon anthocyanin lớn là:

delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin và malvidin. M i một aglycon c th tách

rời hoàn toàn và phân tích định lượng chính ác với các tiêu chu n bên ngoài. Tác

giả s d ng cột Beckman Ultrasphere ODS (250 x 4,6 mm, 5 µm). Pha động A:

0,4% TFA trong nước và B: 0,4% TFA trong acetonitril. Các điều kiện gradient là:

0-6 phút, 15% B; 6 - 20 phút, 15-22% B; và 20-35 phút, 22-30% B. Các điều kiện

s c ký như sau: tốc độ dòng chảy 1 ml/phút; nhiệt độ cột 35°C; bước s ng phát hiện

525 nm; th tích tiêm mẫu 20 µl. Phương pháp cho độ chính ác cao, độ lệch chu n

tương đối (RSD) cho tổng anthocyanidin là 1,8% đối với phương pháp HPLC và

0,3% cho phương pháp th y phân.

Tác giả Veridiana Vera de Rosso và các cộng sự [31] đã tiến hành nghiên c u

các anthocyanin từ hai loại trái cây nhiệt đới nổi tiếng là quả sơ ri và quả acai bằng

phương pháp s c ký lỏng hiệu năng cao kết nối với mảng đi-ốt quang và detector

khối phổ 2 lần (HPLC–PDA–MS/MS). Cột: Shim-pack CLCODS C18 (250 × 4,6

mm, 5 µm); pha động: axit fomic 5% - MeOH (85:15); tốc độ dòng: 1ml/phút; nhiệt độ cột: 250C; th tích tiêm: 20 µL. Chiết bằng MeOH c 0,5% HCl đ qua đêm ở 500C; lọc trước khi chạy s c ký. Kết quả chỉ ra hàm lượng anthocyanin tổng

11

trong trái cây sơ ri là 6,5-7,6 mg/100 g.

Delphinidin, cyanidin, pelargonidin là 3 anthocyanin trong số 6 anthocyanin

phổ biến nhất. Trong t nhiên, chúng thường tồn tại dưới dạng glucozit, có nhiều

tác giả l a chọn phân tích dạng glucozit c a các anthocyanin này. Khi đ quá trình

x lý mẫu chỉ bao gồm giai đoạn hoà tan trong nước và phân tích tr c tiếp trên hệ

thống s c ký lỏng. Tuy nhiên, các glucozit c a các anthocyanin rất đa dạng (vài

ch c chất), đ phân tích được các dạng này khá ph c tạp. Do đ , l a chọn tối ưu

hiện nay là chuy n các dạng glucozit về dạng t do bằng quá trình thuỷ phân trong

môi trường axit. Delphinidin, cyanidin, pelargonidin trong mẫu sau khi thuỷ phân

về dạng t do thường c hàm lượng cao (khoảng mg/100 g), c bước sóng phát hiện

chọn lọc trong vùng VIS nên l a chọn phương pháp HPLC với detector PDA đ

tách và định lượng. Hệ thống HPLC-PDA phổ biến trong các phòng thí nghiệm hiện

nay nên khả năng ng d ng cao.

12

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1. Mục tiêu

- Xây d ng được quy trình phân tích 3 chất: delphinidin, cyanidin,

pelargonidin thuộc nh m anthocyanin c trong một số mẫu rau c bằng kỹ thuật s c

ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát tìm các điều kiện tối ưu phân tích delphinidin, cyanidin, pelargonidin

bằng phương pháp s c ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

- Khảo sát ây d ng quy trình lý mẫu tách chiết các chất delphinidin, cyanidin,

pelargonidin khỏi các loại rau c .

- Xác nhận giá trị s d ng c a phương pháp.

- Áp d ng quy trình phân tích các mẫu th c tế.

2.3. Đối tƣợng nghiên cứu

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên c u phương pháp ác định hàm

lượng c a delphinidin, cyanidin, pelargonidin trong một số loại rau c bằng phương

pháp HPLC.

Đối tượng mẫu nghiên c u là các rau c như: b p cải tím, khoai lang tím, rau

dền đỏ, c dền, tía tô… Các mẫu phân tích được lấy ngẫu nhiên trên địa bàn thành

phố Hà Nội.

2.4. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị

2.4.1. Chất chuẩn

- Chất chu n delphinidin clorid (Sigma - Adrich) lọ 1 mg (Số ki m soát:

43725-1MG-F; độ tinh khiết 99 % (HPLC)).

- Chất chu n cyanidin clorid (Sigma - Adrich) lọ 1 mg (Số ki m soát: 79457-

1MG-F; độ tinh khiết 99 % (HPLC)).

- Chất chu n pelargonidin clorid (Sigma - Adrich) lọ 5 mg (Số ki m soát:

P1659-5MG; độ tinh khiết 99 % (HPLC)).

2.4.2. Hoá chất

- Dung môi loại tinh khiết cho HPLC: CH3OH, CH3CN, HCl, CF3COOH

13

(TFA) (Merck).

- Nước cất 2 lần lọc qua bộ lọc màng 0,45 µm sau đ rung siêu âm.

Dung dịch chất chuẩn gốc delphinidin 100 ppm : hòa tan 1,0 mg chất chu n

delphinidin với khoảng 5 ml CH3OH, chuy n toàn bộ vào bình định m c 10 ml rồi

thêm CH3OH tới vạch định m c ở nhiệt độ phòng, l c kỹ. Bảo quản ở điều kiện

lạnh, tránh ánh sáng.

Dung dịch chuẩn gốc pelargonidin 100 ppm : Hòa tan 5,0 mg chất chu n với

khoảng 20 ml CH3OH rồi chuy n vào bình định m c 50 ml, rồi thêm CH3OH tới

vạch định m c ở nhiệt độ phòng, l c kĩ ta được dung dịch chu n nồng độ 100 ppm.

Bảo quản ở điều kiện lạnh, tránh ánh sáng.

Dung dịch chuẩn gốc cyanidin 100 ppm: Hòa tan 1,0 mg chất chu n cyanidin

với khoảng 5 ml CH3OH, chuy n toàn bộ vào bình định m c 10 ml rồi thêm

CH3OH tới vạch định m c ở nhiệt độ phòng, l c kỹ. Bảo quản ở điều kiện lạnh,

tránh ánh sáng.

- Dung dịch chu n làm việc: hút chính ác 1,0 ml từng dung dịch chu n gốc ở

trên vào bình định m c 10 ml, thêm CH3OH vừa đ .

- Các dung dịch chu n c nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chu n làm

việc.

2.4.3. Thiết bị

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

14

Bơm

Bộ phận tiêm mẫu

Hệ thống cấp dung môi

Cột s c ký

Detector

Buồng cột

Hệ thống thu nhận và lý số liệu (máy ghi, máy tính)

Hình 2.2: Sơ đồ khối của một máy HPLC

- Hệ thống s c ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (LC 20AD) trang bị

detector PDA.

- Cột s c ký XBridge® BEH C18 (100 mm 4,6 mm; 2,6 µm) và tiền cột

tương ng.

- Cân kỹ thuật XT1200 c độ chính ác 0,01g.

- Cân phân tích Mettler Toledo c độ chính ác 0,0001 g.

- Máy đo pH: pH Meter 744.

- Máy l c siêu âm Elma (Germany).

- Máy ly tâm HermLe Z383K.

- Máy l c Vorte IKA.

- Máy xay Philips 600W.

- D ng c th y tinh các loại: bình định m c 5 ml, 10 ml, 20 ml, 50 ml, cốc c

mỏ, pipet các loại: 200 μl, 1000 μl, 5000 µl.

- Ống ly tâm 25 ml, 50 ml , 100 ml, bình cầu c nút mài, lọ th y tinh c n p

kín.

- Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm; 0,2 µm.

2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu

Nhóm anthocyanin là những hợp chất rất không ổn định và dễ dàng bị ảnh

hưởng bởi pH, nhiệt độ, ánh sáng, o y, dung môi, các ion kim loại,... đ là những

yếu tố c ảnh hưởng đáng k dẫn đến s th y phân hoặc biến tính c a các hợp chất

ban đầu, và giảm độ chính ác c a thí nghiệm phân tích [18], [24]. Trước đây,

người ta thường s d ng phương pháp tách chiết nhiều bước đ ác định

anthocyanin. Tuy nhiên, các thí nghiệm này chưa được ng d ng rộng rãi do tốn

15

thời gian thí nghiệm và mẫu dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài trong quá

trình lý. Các anthocyanin trong nền mẫu thường tồn tại ở dạng liên kết với các

gốc đường. Đ phân tích tất cả các dạng này sẽ tốn nhiều thời gian và kinh phí. Việc

thuỷ phân các dạng liên kết đ đưa về dạng aglycon là cần thiết. Phương pháp

HPLC cho phép tách và định lượng riêng l từng chất. Đây là phương pháp hiện đại,

c độ tin cậy cao, c tính ng d ng rộng rãi.

2.6. Thẩm định phƣơng pháp

Phương pháp lý mẫu và điều kiện phân tích anthocyanin bằng HPLC được

th m định về các tiêu chí:

- Tính đặc hiệu, tính chọn lọc (Specifility/Selectivity)

- Khoảng tuyến tính và đường chu n (Linearity and Calibration)

- Độ đúng (Trueness)

- Độ ch m (Precision)

- Giới hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD), giới hạn định lượng (Limit

of Quatification – LOQ).

Trong phạm vi và thời gian nghiên c u, chúng tôi th c hiện ác nhận giá trị s

d ng c a phương pháp thông qua việc đánh giá các thông số: tính chọn lọc, khoảng

tuyến tính và đường chu n, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ đúng

(thông qua hiệu suất thu hồi), độ ch m (thông qua độ lặp lại).

16

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tối ƣu các điều kiện xác định anthocyanin trên hệ thống HPLC

3.1.1. Chọn detector

C nhiều detector được s d ng trong HPLC và s d ng các nguyên lý khác

nhau t y thuộc tính chất đối tượng cần nghiên c u:

- Detector hấp th UV-VIS

- Detector huỳnh quang

- Detector chỉ số khúc ạ

- Detector tán ạ bay hơi

- Detector đo dòng

- Detector độ dẫn

Anthocyanin là hợp chất c khả năng hấp th bước s ng trong v ng t ngoại

và khả kiến, c cấu trúc vòng ch a nhiều nối đôi, c khả năng hấp th UV-VIS

mạnh, đây là cơ sở đ chúng tôi th c hiện định lượng bằng phương pháp HPLC với

detector PDA.

Trong nghiên c u này, đ quy trình ây d ng được c khả năng ng d ng

rộng, chúng tôi l a chọn detector mảng đi-ốt quang (photodiode array - PDA), loại

detector phổ biến trong cấu hình tiêu chu n c a thiết bị HPLC hiện tại. Ưu đi m c a

detector này là quét được phổ UV-VIS c a các chất phân tích trong khoảng bước

s ng đã chọn, ki m tra s tinh khiết c a pic s c ký và định danh pic bằng cách so

sánh phổ tương ng c a đỉnh s c ký với phổ c a một ngân hàng dữ liệu hoặc với

phổ c a chất chu n biết trước [1], [4].

C th s d ng detector UV-VIS đ thay thế. Tuy nhiên, detector PDA c

nhiều ưu đi m hơn là c khả năng quét được một dải bước s ng và em được hình

dạng phổ c a chất phân tích. Hơn nữa, trong rau c nghiên c u c ch a rất nhiều

các chất thuộc nh m anthocyanin c khả năng hấp th tại bước s ng 520 nm, nếu

chỉ d a vào thời gian lưu đ khẳng định chất đ là anthocyanin c th dễ bị nhầm

lẫn. Vì vậy, khi kết hợp giữa thời gian lưu và hình dạng phổ hấp th c th khẳng

định chính ác chất cần phân tích. Do đ , trong nghiên c u này chúng tôi đã s

17

d ng detector PDA đ ác định chất phân tích.

3.1.2. Chọn bước sóng phát hiện

Quét phổ trong khoảng 190-800 nm, chọn c c đại hấp th cho m i chất và thu

được kết quả như sau:

Hình 3.1: Phổ hấp thụ của delphinidin

Hình 3.2: Phổ hấp thụ của cyanidin

Hình 3.3: Phổ hấp thụ của pelargonidin

Delphinidin c c c đại hấp th tại bước s ng 529 nm và một đỉnh ph tại

bước s ng 274 nm. Cyanidin c c c đại hấp th tại bước s ng 526 nm và 1 đỉnh

ph tại bước s ng 276 nm. Pelargonidin c c c đại hấp th tại bước s ng 513 nm và

2 đỉnh ph tại bước s ng 269 nm, 423 nm.

18

Chúng tôi nhận thấy 3 anthocyanin trên c bước s ng hấp th tương đối gần

nhau: 513 nm, 526 nm, 529 nm nên khi tiến hành định lượng đồng thời cả 3 chất

chúng tôi quyết định l a chọn bước s ng chung là 520 nm làm bước s ng phát hiện.

3.1.3. Chọn cột tách

Cột s c ký c vai trò quan trọng trong việc tách các chất phân tích ra khỏi nhau,

n được ví như trái tim c a hệ thống s c ký. Hiện nay s c ký pha đảo được s d ng

rộng rãi do tính phổ biến, tính kinh tế và c hiệu quả cao. Hệ này c th tách các chất

c độ phân c c đa dạng từ rất phân c c, ít phân c c đến không phân c c. Ngoài ra trên

cấu trúc c a anthocyanin còn c nhiều nhóm –OH t do, phân c c mạnh và dễ dàng tan

với dung môi phân c c khác như nước, metanol, etanol,…thích hợp cho việc tiến hành

s c ký trên cột s c ký pha đảo. Do đ chúng tôi l a chọn hệ s c ký pha đảo, ph hợp

với điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành khảo sát 1 số cột pha đảo, phổ biến

nhất là cột C18. Chúng tôi chọn khảo sát 2 loại cột C18 và tiền cột tương ng đ tiến

hành tách một số anthocyanin.

Cột 1: Loại cột C18 c chiều dài cột 150 mm; đường kính trong 4,6 mm; cỡ hạt

5 µm.

Cột 2: Loại cột C18 c chiều dài cột 100 mm; đường kính trong 4,6 mm; cỡ hạt

2,6 µm.

S d ng pha động: Kênh A: dung dịch a it trifloa etic 0,05%; kênh B:

acetonitril.

Hình 3.4: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 3 chất với cột sắc kí 1

19

Hình 3.5: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 3 chất với cột sắc kí 2

Từ kết quả ở hình 3.4 và hình 3.5 c bảng sau:

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của cột tách đến độ rộng đáy pic (W) và thời gian lưu (tR)

Số đĩa Delphinidin Cyanidin Pelargonidin

Thông số cột lý W W W

thuyết (phút) tR (phút) (phút) tR (phút) (phút) tR (phút)

C18(150x4,6x5) 13439 2,0 7,28 1,8 13,11 1,0 18,10

C18(100x4,6x2,6) 17230 1,5 8,95 1,2 13,37 0,8 17,35

D a vào bảng 3.1, hình 3.4 và hình 3.5 chúng tôi nhận thấy cả 2 cột đều tách

được chất phân tích, tuy nhiên cột s c kí 2 (100 mm x 4,6 mm; 2,6 µm) c độ rộng

đáy pic hẹp hơn, pic s c kí nhọn hơn. Do đ , chúng tôi quyết định chọn cột C18 (100 mm 4,6 mm; 2,6 µm) làm cột pha tĩnh đ tiến hành tách các anthocyanin.

3.1.4. Chọn thể tích bơm mẫu

Trên th c tế, một trong những kh khăn c a phép tách s c ký là: s doãng

chân pic dẫn đến hiện tượng chồng pic. Trong đ th tích bơm mẫu vào cột cũng là

một nguyên nhân gây ra hiện tượng này, nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu bơm

vào cột quá lớn sẽ dẫn đến hiện tượng doãng pic càng lớn, các pic càng chèn lên

nhau trong khi tách [8]. Đ là do, lượng mẫu quá lớn sẽ dẫn đến hiện tượng một

phần mẫu vào cột tách trước, một phần ra sau dẫn đến trong quá trình tách trên cột

sẽ có một phần chất phân tích ra trước và một phần ra sau gây ra hiện tượng doãng

chân pic. Nếu th tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số cũng sẽ rất lớn. Ví d nếu sai

số c a van bơm mẫu là 0,05 l, khi bơm th tích mẫu là 1 l thì sai số sẽ là 5%, còn

nếu th tích mẫu bơm là 50 l thì sai số là 0,1%. Ngày nay, van bơm mẫu 6 chiều

20

rất phổ biến, do đ , chúng tôi l a chọn loại van này và th tích mẫu bơm là 10 l.

3.1.5. Khảo sát thành phần pha động

Trong s c ký pha đảo, các dung môi được l a chọn phổ biến là nước,

acetonitril và metanol. Các pha động khác nhau c độ phân c c khác nhau dẫn đến

khả năng r a giải khác nhau. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát thành phần pha động

là nước với acetonitril hoặc metanol cho thấy ở bất kỳ tỉ lệ nào c a nước với

acetonitril hoặc metanol đều không r a giải được các anthocyanin.

Hình 3.6: Sắc ký đồ rửa giải các anthocyanin với thành phần pha động là nước và ACN

Do cấu tạo c a các anthocyanin c nhiều nh m OH nên đ r a giải các

anthocyanin ra khỏi cột C18 thì pha động phải c độ phân c c cao. Tham khảo một số tài liệu [31], [38], chúng tôi l a chọn 2 a it là axit axetic và axit trifloaxetic thêm

vào thành phần pha động cho kết quả như sau:

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến độ rộng đáy pic (W), thời gian

lưu (tR), độ phân giải (RS) của del, cya, pel.

Delphinidin

W (phút)

tR (phút)

Cyanidin tR (phút) W (phút)

Pelargonidin tR (phút) W (phút)

8,48 1,6 12,41 1,1 15,16 0,9

Thành phần pha động Axit axetic 0,05% RS

2,9 2,7

8,96 13,37 1,0 17,35 0,8 1,1

4,2 4,4

Axit trifloaxetic 0,05% RS

21

Nhận ét: Khi thành phần pha động c bổ sung axit axetic hoặc axit

trifloaxetic thì các anthocyanin được r a giải ra khỏi cột. Tuy nhiên, khi s d ng

axit trifloaxetic cho pic s c ký hẹp cân đối, độ rộng đáy pic nhỏ, độ phân giải giữa

hai pic liền kề lớn. Điều này c th do pKa c a a it trifloa etic nhỏ hơn pKa c a

axit axetic nên axit trifloaxetic c tính chất a it cao gấp 34 lần so với a it a etic. Do

đ , chúng tôi l a chọn pha động ch a axit trifloaxetic.

3.1.6. Khảo sát nồng độ axit trong pha động

Sau khi l a chọn được thành phần pha động ch a axit trifloaxetic, chúng tôi

khảo sát tỉ lệ axit trifloaxetic trong pha động với các nồng độ: 0,025%; 0,05%; 0,1%

thu được kết quả sau:

A C B

Hình 3.7: Sắc ký đồ del, cya tại các nồng độ axit trifloaxetic khác nhau

A: 0,025%; B: 0,05%; C: 0,1%

Nhận ét: Khi nồng độ a it trong pha động tăng, các anthocyanin ra muộn

hơn. Tại nồng độ a it 0,1% píc s c ký bị ch , pic t và tín hiệu giảm. Các cột s c ký

C18 hiện tại c khoảng pH hoạt động từ 2-7. Dung dịch a it trifloaxetic 0,1% có pH

= 1,8-2 là khoảng pH giới hạn c a cột, làm cho hiệu l c c a cột giảm, khả năng r a

giải và hình dạng pic kém. Mặt khác, khi hoạt động nhiều ở điều kiện pH thấp, tuổi

thọ c a cột giảm. Do đ , chúng tôi không khảo sát tại các m c nồng độ a it > 0,1%.

Đ đảm bảo độ nhạy, hình dạng pic s c ký cân đối, chúng tôi l a chọn nồng độ a it

trong pha động là 0,05%.

22

3.1.7. Khảo sát chương trình rửa giải

Cố định pha động bao gồm 2 thành phần tối ưu là acetonitril và axit

trifloaxetic, chúng tôi tiến hành khảo sát chương trình r a giải. Trong s c ký lỏng c

hai chế độ r a giải hiện nay là chế độ isocratic (đẳng dòng) và gradient. Chế độ

đẳng dòng c thành phần pha động được giữ cố định trong suốt quá trình chạy. Chế

độ gradient c thành phần pha động thay đổi theo thời gian. Ở các tỉ lệ pha động

khác nhau, l c r a giải khác nhau ph thuộc vào độ phân c c c a dung môi và

thành phần dung môi theo công th c [8]:

PI = P1V1 + P2V2

 Chế độ r a giải đẳng dòng:

S d ng chế độ r a giải đẳng dòng, thay đổi các tỉ lệ dung môi khác nhau thu

được kết quả ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Rửa giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng

Tỉ lệ PI Kết quả TFA 0,05% : ACN (đơn vị)

75/25 9,06

85/15 9,64

90/10 9,74

23

Nhận ét: Tại tỉ lệ pha động là 90/10 với độ phân c c dung môi PI = 9,74 chưa

r a giải được các anthocyanin ra khỏi cột. Tại tỉ lệ pha động 75/25 với độ phân c c

dung môi PI = 9,06 đã r a giải được các anthocyanin nhưng chưa tách được hoàn

toàn và pic s c ký bị doãng. Tỉ lệ 85/15 với độ phân c c dung môi PI = 9,64 các

anthocyanin đã tách nhau tương đối rõ ràng nhưng pic pelargonidin ra chậm (19,3

phút) gây doãng pic (độ rộng chân pic gần 4 phút) làm giảm độ nhạy c a phương

pháp. Như vậy, chế độ đẳng dòng không ph hợp đ tách các chất trong c ng nh m

do tính chất và độ phân c c c a các chất gần nhau. Đ tách được hoàn toàn các

anthocyanin trong thời gian ph hợp, chúng tôi khảo sát chương trình r a giải

gradient.

 Chế độ r a giải gradient: Chúng tôi tiến hành thay đổi chương trình r a giải

gradient với hệ pha động CF3COOH 0,05 % - CH3CN.

Bảng 3.4: Chương trình gradient 1

0,01 10,00 15,00 15,10 23,00 Thời gian (phút)

87 75 79 87 87 % (A) dd CF3COOH 0,05 %

13 25 21 13 13 % (B) CH3CN

9,61 9,06 9,27 9,61 9,61 PI (đơn vị)

Hình 3.8: Sắc ký đồ của hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 1

24

Bảng 3.5: Chương trình gradient 2

0,01 10,00 15,00 15,10 23,00 Thời gian (phút)

87 80 82 87 87 % (A) dd CF3COOH 0,05 %

13 20 18 13 13 % (B) CH3CN

9,61 9,29 9,38 9,61 9,61 PI (đơn vị)

Hình 3.9: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 2

Bảng 3.6: Chương trình gradient 3

0,01 10,00 11,00 25,00 Thời gian (phút)

90 80 75 90 % (A) dd CF3COOH 0,05 %

10 20 25 10 % (B) CH3CN

9,74 9,29 9,06 9,74 PI (đơn vị)

Hình 3.10: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 3

25

Bảng 3.7: Chương trình gradient 4

0,01 10,00 11,00 11,10 20,00 Thời gian (phút)

85 78 75 85 85 % (A) dd CF3COOH 0,05 %

15 22 25 15 15 % (B) CH3CN

9,64 9,20 9,06 9,64 9,64 PI (đơn vị)

Hình 3.11: Sắc ký đồ hỗn hợp dung dịch chuẩn với chương trình gradient 4

Nhận ét: Khi s d ng chương trình gradient, các anthocyanin đã tách nhau hoàn

toàn, tuy nhiên hình dạng pic s c ký tại các chương trình khác nhau cho kết quả

khác nhau. Đ đánh giá pic s c ký đẹp và cân đối, chúng tôi s d ng hệ số đối ng

pic theo công th c:

A: khoảng cách từ chân đường vuông g c hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía

trước tại vị trí 1/10 chiều cao pic.

B: khoảng cách từ chân đường vuông g c hạ từ đỉnh pic đến mép đưòng cong phía

sau tại vị trí 1/10 chiều cao pic.

S = 1,0 ÷ 1,05 là pic rất đẹp (lí tưởng)

S = 1,5 là chấp nhận được

S = 2 là pic ấu

S = 4 là pic rất ấu

Thu được bảng kết quả ở bảng 3.8.

26

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của chương trình gradient đến hệ số đối xứng pic

Chƣơng trình Hệ số đối xứng pic (AS)

gradient Del Cya Pel

1,75 2,00 1,50 Gradient 1

1,50 1,20 1,50 Gradient 2

1,30 1,25 0,95 Gradient 3

1,00 1,01 1,02 Gradient 4

Nhận xét: Bảng 3.8 cho thấy với chương trình gradient 4 cho kết quả pic s c

ký có hệ số đối x ng pic là đẹp nhất. Do đ chúng tôi l a chọn chương trình r a

giải gradient 4 s d ng hệ pha động là dung dịch axit trifloaxetic 0,05% - acetonitril

đ tiến hành chạy s c ký.

3.1.8. Khảo sát tốc độ pha động

Tốc độ pha động cũng g p phần ảnh hưởng tới hiệu quả tách s c ký vì nó liên

quan đến quá trình thiết lập cân bằng c a chất tan trong hai pha tĩnh và pha động.

Khi tốc độ pha động nhỏ, chất phân tích ra muộn, gây doãng pic, giảm độ nhạy và

tốn dung môi. Khi tốc độ pha động quá lớn c th làm cho chất phân tích chưa tách

ra khỏi nhau đã bị đ y ra khỏi cột dẫn đến hiện tượng chồng pic và gây áp suất lớn

trong bơm. Ph hợp với thông số cột (100 mm x 4,6 mm x 2,6 µm), chúng tôi khảo

sát khả năng tách c a các anthocyanin ở các tốc độ: 0,5 ml/phút; 0,4 ml/phút; 0,3

ml/phút thu được kết quả sau:

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thơi gian lưu và chiều cao pic

Tốc độ dòng Thời gian lƣu Chiều cao pic

(ml/phút) Del Cya Pel Del Cya Pel

8,715 10,301 12,381 90274 79019 110387 0,5 ml/phút

9,874 11,656 14,276 70037 58836 100140 0,4 ml/phút

11,541 13,405 16,676 60885 65836 99739 0,3 ml/phút

Nhận ét: Cột s c ký được s d ng là cột hạt nhỏ (2,6 µm) nên áp suất đầu cột

tương đối lớn. Đ đảm bảo độ bền c a cột và áp suất hệ thống, chúng tôi không

khảo sát ở các tốc độ cao hơn 0,5 ml/phút. Với tốc độ dòng trong khoảng 0,3–0,5

ml/phút, khi tốc độ dòng giảm, thời gian lưu c a các anthocyanin giảm gây doãng

27

pic và làm giảm tín hiệu (th hiện qua chiều cao pic). Do đ , chúng tôi l a chọn tốc

độ dòng 0,5 ml/phút đ tách các anthocyanin.

Tóm lại, các thông số tối ƣu cho quá trình chạy sắc ký là:

- Cột pha tĩnh: cột XBridge® BEH C18 (100 mm 4,6 mm; 2,6 µm) và tiền

cột tương ng.

- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút

- Th tích tiêm mẫu: 10 µL

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước s ng 190 nm đến 800 nm

- Bước s ng phát hiện: 520 nm - Nhiệt độ cột: 400C

- Pha động: Kênh A (TFA 0,05%) , kênh B (ACN) với chương trình gradient:

0,01 10,00 11,00 11,10 20,00 Thời gian (phút)

85 78 75 85 85 % (A) dd CF3COOH 0,05 %

15 22 25 15 15 % (B) CH3CN

3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu

D a vào khả năng hòa tan c a anthocyanin và tham khảo nhiều bài báo [6],

[10], [12] chúng tôi khảo sát khả năng chiết anthocyanin từ nền mẫu bằng cách th y phân mẫu ở nhiệt độ 500C, 600C, 700C, 800C với thời gian 60 phút, 90 phút, 120

phút, 150 phút, bằng h n hợp dung môi sau đây: metanol- dung dịch axit clohydric

2 M với các tỷ lệ như sau: 90:10; 85:15; 80:20; 75:25.

28

Sơ đồ 1: Qui trình xử lý mẫu dự kiến

Đồng nhất mẫu: nghiền, ay mẫu

Cân ~10 g mẫu vào ống ly tâm 50 ml

+ 30-35 ml MeOH:HCl 2 M

L c vorte

Rung siêu âm (15-30 phút ở nhiệt độ phòng)

Thuỷ phân mẫu, đ nguội

Ly tâm 6000 vòng/phút, 5 phút

Gạn dịch chiết vào bình định m c 50 ml, định m c đến vạch

Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Bơm 10 µl vào HPLC

Quy trình chiết anthocyanin cho đối tượng phân tích là rau c d kiến gồm các bước

sau:

- Đồng nhất mẫu: nghiền, ay mẫu.

- Cân chính ác khoảng 10 g mẫu sau khi đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml.

- Thêm khoảng 35 ml dung môi chiết h n hợp MeOH – dung dịch HCl 2 M

vào ống ly tâm.

- L c vorte , rung siêu âm 15-30 phút ở nhiệt độ phòng.

- Th y phân mẫu.

- Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút.

- Gạn lấy phần dịch trong, định m c 50 ml bằng c ng dung môi và lọc qua

29

màng lọc 0,45 µm.

- Bơm vào hệ s c ký HPLC (pha loãng nếu cần).

Trong quá trình th y phân, yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến kết quả c a mẫu

phân tích là nhiệt độ và thời gian th y phân. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát hai

yếu tố này.

3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân

Anthocyanin là chất chống o y hoá dễ bị chuy n dạng bởi các yếu tố môi

trường như: o y không khí, nhiệt độ, ánh sáng… Do đ , thời gian th y phân trong

quá trình lý mẫu là rất quan trọng đối với việc nghiên c u này. Vì vậy, chúng tôi

tiến hành khảo sát thời gian th y phân mẫu th c với mẫu là b p cải tím trong 60

phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút và tiến hành chạy máy trong điều kiện lý d

kiến như ở sơ đồ 1 với th tích định m c cuối c ng là 50 ml, cố định nhiệt độ thuỷ phân là 600C và tỉ lệ dung môi chiết MeOH:HCl 2 M = 85:15.

Hình 3.12: Hàm lượng các chất khi thủy phân trong thời gian khác nhau (60, 90,

120, 150 phút).

30

Bảng 3.10: Hàm lượng các chất theo thời gian thủy phân

Thể Nồng độ Lƣợng Thời tích Hệ số Diện tích chất phân Hàm lƣợng cân gian định pha pic tích trong chất phân tích mẫu (phút) mức loãng (mAU) dung dịch (mg/100 g) (g) (ml) thử (ppm)

10,6649 50 60 1 95159 2,76 1,29

10,6013 50 90 1 97173 2,82 1,33 Del 10,9061 50 120 1 100223 2,90 1,33

10,2999 50 150 1 79734 2,31 1,12

10,6649 50 60 1 2302013 54,04 25,34

10,6013 50 90 1 2506867 58,85 27,76 Cya 10,9061 50 120 1 2863425 67,22 30,82

10,2999 50 150 1 2599353 61,02 29,62

10,6649 50 60 1 296886 2,45 1,15

10,6013 50 90 1 313625 2,58 1,22 Pel 10,9061 50 120 1 326313 2,69 1,23

10,2999 50 150 1 291372 2,40 1,17

Qua đồ thị hình 3.12 và kết quả ở bảng 3.10 ta thấy: Ở thời gian 60 phút và 90

phút, chưa thuỷ phân được toàn bộ 3 chất. Ở thời gian 120 phút, hàm lượng các chất

thu được là lớn nhất (đối với cả 3 chất). Ở thời gian 150 phút, hàm lượng 3 chất

giảm c th do ảnh hưởng c a nhiệt độ, thời gian làm anthocyanin sau khi thuỷ

phân bị phân huỷ. Do đ , chúng tôi sẽ chọn điều kiện thời gian th y phân là 120

phút trong các khảo sát tiếp theo.

3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân

Khảo sát nhiệt độ th y phân theo quy trình d kiến như ở sơ đồ 1 với thời gian th y phân 120 phút tại các nhiệt độ: 500C, 600C, 700C, 800C; với th tích định m c

cuối c ng là 50 ml, cố định tỉ lệ dung môi chiết MeOH:HCl 2 M = 85:15.

31

Hình 3.13: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ thủy phân khác nhau

Bảng 3.11: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy phân khác nhau

Thể Nồng độ Lƣợng Nhiệt tích Hệ số Diện tích chất phân Hàm lƣợng cân định pha pic tích trong chất phân tích mẫu độ (0C) mức loãng (mAU) dung dịch (mg/100 g) (g) (ml) thử (ppm)

9,5522 50 50 1 22769 0,64 0,34

10,8217 60 50 1 27389 0,77 0,36 Del 9,4100 70 50 1 20602 0,58 0,31

9,8620 80 50 1 26815 0,75 0,38

9,5522 50 50 1 2302013 54,04 28,29

10,8217 60 50 1 2693681 63,24 29,22 Cya 9,4100 70 50 1 2158794 48,98 26,03

9,8620 80 50 1 2362384 55,46 28,12

9,5522 50 50 1 250674 1,98 1,03

10,8217 60 50 1 281553 2,22 1,03 Pel 9,4100 70 50 1 236790 1,87 0,99

9,8620 80 50 1 270572 2,13 1,08

Như vậy theo kết quả thu được, th y phân tại nhiệt độ 800C cho hàm lượng các chất là lớn nhất. Do đ , chúng tôi sẽ chọn điều kiện nhiệt độ th y phân là 800C

trong các khảo sát tiếp theo.

32

3.2.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu

D a trên bài báo [29] chúng tôi s d ng h n hợp dung môi MeOH:HCl 2 M

với các tỷ lệ: 90:10; 85:15; 80:20; 75:25, đ chiết mẫu b p cải tím tại nhiệt độ th y phân 800C trong 120 phút theo quy trình d kiến như ở sơ đồ 1.

Hình 3.14: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2 M trong dung môi chiết mẫu

Bảng 3.12: Hàm lượng các chất tại các tỷ lệ dung môi chiết khác nhau

Thể Nồng độ Lƣợng Tỷ lệ tích Hệ số Diện tích chất phân Hàm lƣợng cân MeOH: định pha pic tích trong chất phân tích mẫu HCl 2 N mức loãng (mAU) dung dịch (mg/100 g) (g) (ml) thử (ppm)

90:10 10,6358 50 4,42 1 165814 2,08

85:15 9,5705 50 4,82 1 180912 2,52 Del 80:20 9,8526 50 5,10 1 191276 2,59

75:25 10,2504 50 4,28 1 160533 2,09

90:10 10,6358 50 55,36 1 2506020 26,02

85:15 9,5705 50 58,55 1 2650677 30,59 Cya 80:20 9,8526 50 55,21 1 2499423 28,02

75:25 10,2504 50 49,17 1 2225993 23,98

90:10 10,6649 50 2,13 1 282766 1,00

85:15 10,6013 50 2,50 1 332637 1,18 Pel 80:20 10,9061 50 2,52 1 335158 1,16

75:25 10,2999 50 2,01 1 267340 0,98

33

Như vậy theo kết quả thu được, tỷ lệ dung môi MeOH-HCl 2 M (85:15) cho

hàm lượng các chất chiết được là lớn nhất. Do đ chúng tôi chọn tỷ lệ dung môi

chiết mẫu là MeOH–HCl 2 M với tỷ lệ 85:15.

Kết luận: Từ các kết quả ở trên chúng tôi quyết định đưa ra quy trình chiết

mẫu như sau:

Sơ đồ 2: Quy trình phân tích mẫu thực

Đồng nhất mẫu: nghiền, ay mẫu

Cân ~10 g mẫu vào ống ly tâm 50 ml

+ 30-35 ml MeOH:HCl = 85:15

L c vorte

Rung siêu âm (15-30 phút ở nhiệt độ phòng)

Thuỷ phân mẫu (800C, 90 phút), đ nguội

Ly tâm 6000 vòng/phút, 5 phút

Gạn dịch chiết vào bình định m c 50 ml, định m c đến vạch

Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Bơm 10 µl vào HPLC

3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích

3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc

Phân tích đồng thời 4 mẫu: dung dịch chu n h n hợp, mẫu th , mẫu tr ng và

mẫu tr ng thêm chu n trên hệ thống HPLC. Kết quả thu được như sau:

- S c đồ mẫu tr ng không uất hiện pic nào tại thời gian lưu c a h n hợp

34

chu n trên mẫu chu n và mẫu tr ng thêm chu n.

- Mẫu tr ng thêm chu n uất hiện pic c a h n hợp chu n. So sánh phổ đồ c a

mẫu tr ng thêm chu n và mẫu chu n cho kết quả giống nhau.

Như vậy, phương pháp c độ đặc hiệu và độ chọn lọc cao, đạt yêu cầu s

d ng đ phân tích anthocyanin trong rau c .

Hình 3.15: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp

Hình 3.16: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin

Hình 3.17: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin được thêm chuẩn hỗn hợp

35

3.3.2. Khoảng tuyến tính

Đ ác định khoảng tuyến tính, chúng tôi th c hiện đo các dung dịch chu n c

nồng độ thay đổi từ 0,10 - 200 µg/ml và khảo sát s ph thuộc c a tín hiệu vào

nồng độ. Sau đ vẽ đường bi u diễn s ph thuộc giữa diện tích pic và nồng độ.

Bảng 3.13: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất

Delphinidin Cyanidin Pelargonidin

Nồng độ

Diện tích

Nồng độ

Diện tích

Nồng độ

Diện tích

Ký hiệu

(µg/ml)

pic (mAU)

(µg/ml)

pic (mAU)

(µg/ml)

pic (mAU)

10,00 676984 200,00 3080931 12,50 1065704 C1

C2 5,00 333033 100,00 1476886 6,25 550270

C3 2,50 170209 50,00 765056 3,00 268862

C4 1,25 84743 25,00 388892 1,50 132144

C5 0,60 42533 12,00 188158 0,80 67193

C6 0,30 21138 6,00 93280 0,40 35240

C7 0,10 9860 3,00 47952 0,20 18631

C8 1,50 21963 0,10 9686

Hình 3.18: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ

delphinidin

Nhận ét: Từ kết quả ở bảng 3.13 và hình vẽ 3.18 ta thấy: S ph thuộc diện

tích pic vào nồng độ delphinidin c s tuyến tính trong khoảng từ 0,10 µg/ml đến

36

10 µg/ml. Trong khoảng nồng độ này, phương trình đường chu n c dạng y = 673x + 1195 với hệ số số tương quan R2 = 0,99995. Trong đ , y là diện tích pic (mAU), x

là nồng độ delphinidin.

Hình 3.19: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ

cyanidin

Nhận ét: Từ các kết quả ở bảng 3.13 và hình 3.19 ta thấy: S ph thuộc diện

tích pic vào nồng độ cyanidin c s tuyến tính trong khoảng từ 1,50 µg/ml đến

200,00 µg/ml. Trong khoảng nồng độ này, phương trình đường chu n c dạng y = 153x – 2375 với hệ số số tương quan R2 = 0,99979. Trong đ , y là diện tích pic (mAU), là nồng độ cyanidin.

Hình 3.20: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ pelargonidin

37

Nhận ét: Từ kết quả ở bảng 3.13 và hình 3.20 ta thấy: S ph thuộc diện tích

pic vào nồng độ pelargonidin c s tuyến tính trong khoảng từ 0,1 µg/ml đến 12,5

µg/ml. Trong khoảng nồng độ này, phương trình đường chu n c dạng y = 3802 + 855 với hệ số số tương quan R2 = 0,99984. Trong đ , y là diện tích pic (mAU), là

nồng độ pelargonidin.

* Đánh giá phương trình đường chuẩn

Trong phương trình đường chu n y = a + b , trường hợp lý tưởng ảy ra khi a

= 0. Tuy nhiên, trong th c tế các số liệu phân tích thường m c sai số ngẫu nhiên

luôn làm cho a  0. Nếu giá trị a khác không c nghĩa thống kê thì phương pháp

phân tích sẽ m c sai số hệ thống. Vì vậy, trước khi s d ng đường chu n cho phân

tích công c cần ki m tra em s khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 c ý nghĩa

thống kê không.

Nếu em a  0 thì phương trình y = a+b được viết thành phương trình y = b'x

Bảng 3.14: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường

chuẩn của 3 anthocyanin

Các anthocyanin PT đƣờng chuẩn Hệ số tƣơng quan R2 Pvalue

y = 673x +1195 0,99995 0,403 Delphinidin

y = 153x - 2375 0,99979 0,827 Cyanidin

y = 3802x + 855 0,99984 0,280 Pelargonidin

Các phương trình đường chu n c a 3 anthocyanin đều có Pvalue > 0,05 c nghĩa là hệ số a không c s khác nhau c nghĩa với giá trị 0 ở độ tin cậy 95% hay phương pháp

không m c sai số hệ thống.

3.3.3. Độ lặp lại

Với một hệ máy c độ nhạy cao thì s ổn định và lặp lại đ ng vai trò quan

trọng trong phân tích. Độ lặp tốt mới có th cho độ chính xác tốt, trong một phạm vi

cho phép. Đối với hệ máy s c ký, khi đã l a chọn được điều kiện tối ưu cho quá

trình tách, thì một yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phân tích đ là độ lặp c a

thiết bị.

Khảo sát trên 1 nền mẫu rau và 1 nền mẫu c c phát hiện anthocyanin. X lý

mẫu và bơm mẫu vào hệ thống HPLC ở các điều kiện đã chọn, tiến hành làm lặp lại

7 lần. Độ lặp lại c a phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chu n (SD) và

38

độ lệch chu n tương đối (RSD).

Độ lặp lại trên nền mẫu bắp cải tím

Bảng 3.15: Độ lặp lại trên nền mẫu bắp cải tím

Khối lƣợng cân (g)

Hàm lƣợng

Lần

Diện tích pic (mAU)

(mg/100 g)

phân tích

Del

Cya

Pel

Del

Cya

Pel

Del

Cya

Pel

0,30

32,36

1

10,5910

10,5910

10,5910

43280

2200958

425652

2,35

0,30

30,39

2

11,3751

11,3751

11,3751

47299

2220468

443711

2,28

0,30

32,18

3

10,6962

10,6962

10,6962

44368

2210305

421528

2,30

0,32

32,58

4

13,8499

13,8499

13,8499

60410

2900182

608937

2,57

0,32

33,11

5

10,8003

10,8003

10,8003

46793

2296703

439730

2,38

0,31

33,84

6

11,5466

11,5466

11,5466

48511

2510458

498252

2,52

0,33

33,90

7

11,3709

11,3709

11,3709

50580

2475941

496118

2,55

0,32

32,62

2,42

Hàm lƣợng trung bình (mg/100 g)

0,01

1,20

0,12

SD

3,1

3,7

5,1

RSD (%)

Độ lặp lại trên nền mẫu khoai lang tím

Bảng 3.16: Độ lặp lại trên nền mẫu khoai lang tím

Khối lƣợng cân Diện tích pic Hàm lƣợng Lần

(g) (mAU) (mg/100 g) phân

tích Cya Pel Cya Pel Cya Pel

11,1826 11,1826 38037 8245 0,61 0,037 1

11,7630 11,7630 41473 8807 0,62 0,038 2

10,4252 10,4252 32914 8863 0,58 0,043 3

12,3070 12,3070 42393 8715 0,61 0,036 4

11,5621 11,5621 39041 8900 0,60 0,039 5

39

6 12,0503 12,0503 36601 8886 0,55 0,037

7 11,3161 11,3161 35092 9001 0,56 0,040

Hàm lƣợng TB (mg/100 g) 0,59 0,039

SD 0,03 0,002

RSD (%) 4,9 6,4

Từ bảng số liệu ta thấy tại các cấp độ khảo sát, RSD% c a phương pháp nằm

trong khoảng 3,1–6,4. So sánh kết quả nhận được với quy định c a AOAC tại các

cấp nồng độ khác nhau 0,1-1 ppm cho phép ≤ 11-15%, 10 ppm-0,1% cho phép ≤

3,7-7,3% là ph hợp với yêu cầu c a AOAC [8]. Như vậy phương pháp c độ lặp

đạt yêu cầu c a AOAC khi phân tích anthocyanin trong mẫu rau c .

3.3.4. Độ thu hồi

Độ đúng c a phương pháp được đánh giá qua độ thu hồi. S d ng nền mẫu

rau c không phát hiện anthocyanin, thêm chu n h n hợp ở 2 m c gần với hàm

lượng thường phát hiện trong mẫu, tiến hành phân tích theo quy trình như ở sơ đồ 2.

M i mẫu phân tích lặp lại 6 lần, tính độ thu hồi theo công th c:

Độ thu hồi (H): H = (Lượng tìm lại/Lượng thêm vào) x 100%

Độ thu hồi c a phương pháp được th m định trên 1 nền mẫu rau, 1 nền mẫu

c . Kết quả phân tích th c nghiệm được tập hợp trong bảng sau:

Trên nền mẫu rau dền đỏ

Bảng 3.17: Độ thu hồi trên nền mẫu rau dền đỏ

Lƣợng cân Diện tích Lƣợng Lƣợng tìm Độ thu hồi

Tên chất pic thêm vào lại đƣợc (%) mẫu

(g) (mAU) (µg/ml) (µg/ml)

10,4895 25421 0,40 0,38 95,5

10,0813 24679 0,40 0,37 92,8

10,3986 26958 0,40 0,40 101,2

Delphinidin 55358 0,80 0,83 10,2845 103,1

10,2468 56686 0,80 0,84 105,6

10,9874 55646 0,80 0,83 103,7

40

10,4895 2,66 41436 2,88 108,3

10,0813 2,66 38570 2,70 101,6

Cyanidin 10,3986 2,66 42037 2,92 109,7

10,2845 5,32 83952 5,52 103,8

10,2468 5,32 82613 5,44 102,2

10,9874 5,32 80401 5,30 99,7

10,4895 0,50 43574 0,48 96,4

10,0813 0,50 40133 0,44 88,4

Pelargonidin 10,3986 0,50 46025 0,51 102,2

10,2845 1,00 93666 1,07 106,8

10,2468 1,00 93192 1,06 106,2

10,9874 1,00 86438 0,98 98,3

Trên nền mẫu củ dền

Bảng 3.18: Độ thu hồi trên nền mẫu củ dền

Lƣợng cân Diện tích Lƣợng Lƣợng tìm Độ thu hồi

mẫu Tên chất pic thêm vào lại đƣợc (%)

(g) (mAU) (µg/ml) (µg/ml)

10,2564 0,40 21652 0,33 81,6

10,0225 0,40 21676 0,33 81,7

10,2315 0,40 22051 0,33 83,1

Delphinidin 10,3546 0,80 21711 0,33 81,8

10,7911 0,80 48934 0,73 91,3

10,5895 0,80 50525 0,75 94,2

10,2564 2,66 37451 2,63 99,0

10,0225 2,66 35575 2,52 94,6

Cyanidin 10,2315 2,66 35334 2,50 94,0

10,3546 5,32 35627 2,52 94,7

10,7911 5,32 70965 4,72 88,6

41

10,5895 71815 5,32 4,77 89,6

10,2564 39343 0,50 0,43 86,5

10,0225 38552 0,50 0,42 84,7

Pelargonidin 10,2315 39520 0,50 0,43 87,0

10,3546 39691 1,00 0,44 87,4

10,7911 80747 1,00 0,92 91,7

10,5895 81024 1,00 0,92 92,0

Nhận ét: Theo AOAC độ thu hồi cho phép tại cấp độ 0,1-100 µg/ml là 80-

110% [8]. Từ bảng kết quả trên ta thấy hiệu suất thu hồi c a các chất đều nằm trong

giới hạn cho phép (81,6 – 109,7%). Như vậy, phương pháp c độ thu hồi đạt yêu

cầu c a AOAC khi phân tích delphinidin, cyanidin, pelargonidin trong mẫu rau c .

3.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất c a chất phân tích mà

phương pháp phân tích c th phát hiện được, c tín hiệu s c ký lớn gấp 3 lần tín

hiệu đường nền. Đây là một thông số đặc trưng cho độ nhạy c a phương pháp. Chất

nào nhạy hơn sẽ c giới hạn phát hiện nhỏ.

Giới hạn phát hiện c a thiết bị: thêm các nồng độ nhỏ dần c a h n hợp 3 chất

delphinidin, cyanidin, pelargonidin vào dịch chiết mẫu tr ng (mẫu th c không phát

hiện chất phân tích) cho đến khi thu được tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N) = 3.

Giới hạn phát hiện c a phương pháp: thêm chu n c nồng độ nhỏ dần vào nền

mẫu đã cân, phân tích theo quy trình như ở sơ đồ 2, chạy máy HPLC cho đến khi

thu được tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N) = 3.

Cũng theo phương pháp này giới hạn định lượng là nồng độ nhỏ nhất chất

phân tích mà c tín hiệu lớn gấp 10 lần tín hiệu nhiễu đường nền hay mẫu tr ng

(S/N = 10). Theo lý thuyết thống kê trong h a phân tích thì: LOQ = 10 LOD/3,3.

Chúng tôi thu được kết quả LOD, LOQ c a các chất phân tích như sau:

42

Bảng 3.19: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất phân tích

LOD của LOQ của LOD của LOQ của Chất phân phƣơng pháp phƣơng thiết bị thiết bị tích (mg/kg) pháp (µg/ml) (µg/ml) (mg/kg)

0,10 0,50 0,30 1,51 Delphinidin

0,24 1,19 0,72 3,60 Cyanidin

0,12 0,62 0,38 1,89 Pelargonidin

Nhận ét: Chúng tôi s d ng phương pháp ác định tr c tiếp LOD, LOQ d a

trên tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N). Như vậy, phương pháp đã ây d ng c giới hạn phát

hiện (LOD) delphinidin, cyanidin, pelargonidin lần lượt là 0,50 mg/kg; 1,19 mg/kg;

0,62 mg/kg. Với giới hạn phát hiện này, phương pháp c th áp d ng rất tốt đ ác

định 3 chất delphinidin, cyanidin, pelargonidin.

3.4. Ứng dụng phƣơng pháp xác định anthocyanin trong một số rau củ

Chúng tôi đã tiến hành thu thập 9 mẫu rau c trên thị trường, th c hiện phân

tích mẫu theo quy trình tối ưu như ở sơ đồ 2. M i mẫu phân tích làm lặp lại 2 lần

lấy kết quả trung bình và thu được bảng kết quả sau:

Bảng 3.20: Kết quả phân tích một số mẫu rau củ

Hàm lƣợng (mg/100 g) Mã sản STT Tên mẫu Nơi lấy mẫu phẩm Del Cya Pel

BCT01 B p cải tím Chợ Hôm 0,42 58,79 3,92 1

BCT02 B p cải tím Chợ Long Biên 0,21 27,65 1,87 2

Rau dền đỏ Chợ Hôm KPH 1,21 KPH RD01 3

Rau dền đỏ Chợ Long Biên KPH KPH KPH RD02 4

Tía tô Chợ Hôm KPH KPH KPH TT01 5

Chợ Hôm KPH 34,44 0,13 KLT01 6 Khoai lang tím

Chợ Long Biên KPH 3,05 0,11 KLT02 7 Khoai lang tím

C dền Chợ Hôm KPH KPH KPH CD01 8

C dền Chợ Long Biên KPH KPH KPH CD02 9

43

KPH: Không phát hiện

Nhận ét: Trong 9 mẫu phân tích, chỉ c b p cải tím phát hiện được cả 3 chất

với hàm lượng từ 0,42–58,79 mg/100 g. Mẫu tía tô và c dền không phát hiện chất

nào. Trong 3 chất được phân tích, cyanidin uất hiện phổ biến trong các nền với

hàm lượng cao hơn delphinidin và pelargonidin gấp nhiều lần. Th c tế, cyanidin

cũng là thành phần chính c a anthocyanin trong các nền mẫu t nhiên.

44

KẾT LUẬN

Với các m c tiêu nghiên c u đặt ra, chúng tôi đã thu được các kết quả như sau:

1. Đã khảo sát và tìm được điều kiện đ ác định hàm lượng anthocyanin

trong một số loại rau c bằng phương pháp s c ký lỏng hiệu năng cao. Tối ưu h a

các điều kiện đ ác định hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp HPLC,

detector PAD (λ = 520 nm). Các điều kiện tối ưu bao gồm: cột pha đảo XBridge®

BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,6 µm) và tiền cột tương ng. Pha động chạy theo

chương trình gradient nồng độ với kênh A: dung dịch CF3COOH 0,05 %, Kênh B:

dung dịch CH3CN.

2. Đã ây d ng quy trình x lý mẫu đơn giản, mẫu được chiết bằng MeOH :

HCl 2 M (85:15), ly tâm và lọc lấy dung dịch ác định trên hệ thống HPLC.

3. Th m định phương pháp với các thông số: phương trình đường chu n

trong khoảng nồng độ từ 0,1-200 µg/ml, đường chu n ây d ng đạt yêu cầu cho

phép có giới hạn phát hiện trong khoảng 0,50-1,19 mg/kg và giới hạn định lượng

tương ng từ 1,51-3,60 mg/kg. Độ lặp lại c a phương pháp (RSD < 7,3 % khi phân

tích 7 lần độc lập trên nền mẫu) và độ thu hồi c a phương pháp đạt yêu cầu cho

phép theo AOAC (tỷ lệ thu hồi trên 80% khi đánh giá ở m c nồng độ chu n thêm

vào  10 µg/ml).

4. Từ các kết quả thu được nhận thấy phương pháp HPLC ph hợp cho việc

ác định hàm lượng anthocyanin trong một số đối tượng th c ph m rau, c , quả. Áp

d ng quy trình phân tích ở trên đ ác định hàm lượng anthocyanin trong 9 mẫu rau

c ở một số chợ nội thành Hà Nội. Kết quả cho thấy, phát hiện được anthocyanin

trong một số mẫu rau như: b p cải tím, rau dền đỏ, khoai lang tím.

45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Trần T An (2007), Hóa phân tích - tập 2 - Phân tích dụng cụ, Nhà uất bản Y

học, Hà Nội.

2. Huỳnh Thị Kim Cúc, và cộng s (2004), "Xác định hàm lượng Anthocyanin

trong một số nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai", Tạp Chí Khoa

Học và Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 3(7), 47-54.

3. Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư (2009), "Stress o y h a và các chất chống o y

h a t nhiên", Tạp chí Khoa học và Phát triển, 7(5), 667-677.

4. Trần Từ Hiếu và cộng s (2003), Hoá học phân tích, Nhà uất bản đại học quốc

gia Hà Nội, Hà Nội.

5. Nguyễn Thị Hi n, Nguyễn Thị Thanh Th y, Nguyễn Thị Loan (2012), “Nghiên

c u chiết tách Anthocyanin từ đài hoa Hibiscus sabdariffa” - Ứng d ng đ sản

uất giấy chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong th c ph m, Tạp chí Khoa học và

phát triển 2012, 10(5), 738-746.

6. Nguyễn Thị Lan và Lê Thị Lạc Quyên (2006), "Nghiên c u ảnh hưởng c a hệ

dung môi đến khả năng chiết tách chất màu Anthocyanin c độ màu cao từ quả

dâu Hội An", Tạp Chí Khoa Học và Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 44, 71-76.

7. Phạm Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Hữu Cường và Lê Trần Bình (2011), "Tách

chiết và phân tích hàm lượng Anthocyanin trong các mẫu th c vật khác nhau",

Tạp chí Sinh Học, 33(4), 79-85.

8. Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp tách, Bài giảng Đại học Khoa học T

Nhiên – ĐHQGHN.

9. Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi

sinh vật, N b Khoa Học và Kỹ Thuật.

Tiếng Anh

10. Antonieta Ruiz. (2013), "Anthocyanin profiles in south Patagonian wild berries

by HPLC-DAD-ESI-MS/MS", Food Research International, 51, 706–713.

11. Betteridge D. J. (February, 2000), "What is oxidative stress?", Metabolism,

49(2), 3-8.

46

12. Bhornchai Harakotr., et al (2014), "Anthocyanins and antioxidant acitivity in

coloured waxy corn at different maturation stages", Journal of functional foods,

9, 109-118.

13. Bridle P. and Timberlake C.F. (1996), "Anthocyanins as natural food colors-

selected aspects", Food Chemistry, 58, 103-109.

14. Cheynier V., Gómez C. and Ageorges A. (2012), "Flavonoids: Anthocyanins",

In Fidel Toldra Leo M.L. Nollet, editor, Handbook of Analysis of Active

Compounds in Functional Foods, 379-397.

15. Cretu G.C. and Morlock G.E. (1 March 2014), "Analysis of Anthocyanins in

powdered berry extracts by planar chromatography linked with bioassay and

mass spectrometry", Food Chemistry, 146, 104-112.

16. Korte G. Dreiseitel A., Schreier P., et al (2009), "Berry Anthocyanins and their

aglycons inhibit monoamine oxidases A and B", Pharmacol Res, 59(5), 306-311.

17. Durst R.W. and Wrolstad R.E. (2001), "Separation and Characterization of

Anthocyanins by HPLC", Current Protocols in Food Analytical Chemistry,

F1.3.1-F1.3.13.

18. Francesca Leri., et al, (2012), "Simultaneous determination of Anthocyanins,

coumarins and phenolicaxits in fruits, kernels and liqueur of Prunus mahaleb

L", Food Chemistry, 135, 2157-2162.

19. Fossen T. and Andersen M. (2000), "Anthocyanins from tubers and shoots of

the purple potato, Solanum tuberosum", J. Ilort Sci. Biotech, 75, 360-363.

20. Hybertson B.M., et al (2011), "Oxidative stress in health and disease: The

therapeutic potential of Nrf2 activation", Molecular Aspects of Medicine, 32,

234–246.

21. Lakshmi S.V.V., Padmaja G. and Kutala V. K., Kuppusamy P. (December,

2009), "Oxidative Stress in Cardiovascular Disease", Indian Journal of

Biochemistry & Biophysics, 46, 421-440.

22. Lila M.A (2004), "Anthocyanins and Human Health: An In Vitro Investigative

Approach", Journal of Biomedicine and Biotechnology, 5, 306-313.

23. Longo L. and Vasapollo G. (2006), "Extraction and identification of

47

Anthocyanins from Smilax aspera L. berries", Food Chemistry, 94, 226-231.

24. Marco P.H. and Scarminio I.S. (2007), "Q-mode curve resolution of UV–vis

spectra for structural transformation studies of Anthocyanins inaxitic

solutions", Analytica Chimica Acta, 583, 138-146.

25. Meng L. Lozano Y., Bombarda I., Gaydou E. and Li B. (2006), "Anthocyanin

and flavonoid production from Perilla frutescens: Pilot plant scale processing

including cross-flow microfiltration and reverse osmosis", J. Agric. Food

Chem, 54, 4297-4303.

26. Merken H.M. and G.R. Beecher (2000), "Liquid chromatographic method for

the separation and quantification of prominent flavonoid aglycones", Journal of

Chromatography A, 897, 177-184.

27. Miguel M. G (2011), "Anthocyanins: Antioxidant and/or anti-inflammatory

activities", Journal of Applied Pharmaceutical Science, 01(06), 07-15.

28. Nantz M.P. Percival S.S., Rowe C.A. and Nieves Jr. C. (2006), "Immunity and

Antioxidant Capacity in Humans Is Enhanced by Consumption of a Dried,

Encapsulated Fruit and Vegetable Juice Concentrate", The Journal of Nutrition,

136, 2606-2610.

29. Nafiz Oncu Can., et al (2012), "Rapid determination of free Anthocyanins in

foodstuff using high performance liquid chromatography". Food Chemistry,

130, 1082-1089.

30. Ovando A.C., et al (2009), "Chemical studies of Anthocyanins: A review",

Food Chemistry, 113, 859 - 871.

31. Rosso V.V., et al (2008), "Determination of Anthocyanins from acerola

(Malpighia emarginata DC.) and acai (Euterpe oleracea Mart.) by HPLC–

PDA–MS/MS", Journal of Food Composition and Analysis, 21, 291-299.

32. Tatsuzawa F., et al (2012), "Flower Colors and their Anthocyanins in Matthiola

incana Cultivars (Brassicaceae)", J. Japan. Soc. Hort. Sci, 81(1), 91-100.

33. Timberlake C. F. and Bridle P. (1982), "Distribution of Anthocyanins in Food Plants",

In Pericles Markakis, editor, Anthocyanins as Food Colors, Academic Press.

34. Truong V.D. Deighton N., Thompson R.T., et al (2010), "Characterization of

48

Anthocyanins and Anthocyanidins in Purple-Fleshed Sweetpotatoes by HPLC-

DAD/ESI-MS/MS", J. Agric. Food Chem, 58, 404-410.

35. Wu X. (2005), "Identification and characterization of Anthocyanins by

HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States: Vegetables, nuts,

and grains", J Agric Food Chem, 53(8), 3101-3113.

36. Xu Z. and Howard L.R. (2012), "Analysis Methods of Anthocyanins", Analysis of

Antioxidant-RichPhytochemicals, 5, 945-978.

37. Yafang Shao., et al (2014), "Phenolicaxits, Anthocyanins, and antioxidant

capacity in rice (Oryzasativa L.) grains at four stages of development after

flowering", Food Chemistry, 143, 90–96.

38. Zhang Z. et al (2004), "Comparison of HPLC Methods for Determination of

Anthocyanins and Anthocyanidins in Bilberry Extracts", J. Agric. Food Chem,

52, 688 - 691.

49

PHỤ LỤC

Phụ lục A: Sắc đồ khảo sát độ lặp lại

Độ lặp lại trên nền mẫu rau bắp cải tím

Hình A1. Nền mẫu bắp cải tím lặp lần 1

Thời gian lưu (phút) 9,704 14,540 17,738

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình A2. Nền mẫu bắp cải tím lặp lần 2

Thời gian lưu (phút) 9,727 14,547 17,737

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình A3. Nền mẫu bắp cải tím lặp lần 3

Thời gian lưu (phút) 9,713 14,584 17,733

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình A4. Nền mẫu bắp cải tím lặp lần 4

Thời gian lưu (phút) 9,730 14,564 17,745

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình A5. Nền mẫu bắp cải tím lặp lần 5

Thời gian lưu (phút) 9,749 14,570 17,756

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình A6. Nền mẫu bắp cải tím lặp lần 6

Thời gian lưu (phút) 9,756 14,575 17,748

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình A7. Nền mẫu bắp cải tím lặp lần 7

Thời gian lưu (phút) 9,797 14,601 17,776

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Độ lặp lại trên nền mẫu củ khoai lang tím

Hình A8. Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần 1

Thời gian lưu (phút) 13,568 17,539

Chất phân tích cyanidin pelargonidin

Hình A9. Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần 2

Thời gian lưu (phút) 13,596 17,571

Chất phân tích cyanidin pelargonidin

Hình A10. Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần 3

Thời gian lưu (phút) 13,597 17,563

Chất phân tích cyanidin pelargonidin

Hình A11. Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần 4

Thời gian lưu (phút) 13,646 17,609

Chất phân tích cyanidin pelargonidin

Hình A12. Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần 5

Thời gian lưu (phút) 13,661 17,562

Chất phân tích cyanidin pelargonidin

Hình A13. Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần 6

Thời gian lưu (phút) 13,700 17,583

Chất phân tích cyanidin pelargonidin

Hình A14. Nền mẫu củ khoai lang tím lặp lần 7

Thời gian lưu (phút) 13,708 17,572

Chất phân tích cyanidin pelargonidin

Phụ lục B: Khảo sát độ thu hồi của phƣơng pháp

Độ thu hồi trên nền mẫu rau dền đỏ

Hình B1. Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần 1

Thời gian lưu (phút) 9,032 13,811 17,939

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình B2. Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần 2

Thời gian lưu (phút) 9,063 13,808 17,925

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình B3. Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần 3

Thời gian lưu (phút) 9,015 13,800 17,935

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình B4. Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần 4

Thời gian lưu (phút) 9,145 13,914 18,040

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình B5. Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần 5

Thời gian lưu (phút) 9,218 13,963 18,101

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình B6. Nền mẫu rau dền đỏ lặp lần 6

Thời gian lưu (phút) 9,169 13,906 18,011

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Độ thu hồi trên nền mẫu củ dền

Hình B7. Nền mẫu củ dền lặp lần 1

Thời gian lưu (phút) 8,822 13,618 17,756

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình B8. Nền mẫu củ dền lặp lần 2

Thời gian lưu (phút) 8,972 13,721 17,833

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình B9. Nền mẫu củ dền lặp lần 3

Thời gian lưu (phút) 8,909 13,709 17,833

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình B10. Nền mẫu củ dền lặp lần 4

Thời gian lưu (phút) 8,906 13,681 17,803

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình B11. Nền mẫu củ dền lặp lần 5

Thời gian lưu (phút) 8,808 13,588 17,750

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Hình B12. Nền mẫu củ dền lặp lần 6

Thời gian lưu (phút) 8,945 13,710 17,760

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

Phụ lục C: Sắc kí đồ phân tích mẫu thực

BCT01

Thời gian lưu (phút) 9,183 14,210 17,549

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

BCT02

Thời gian lưu (phút) 9,082 14,133 17,437

Chất phân tích delphinidin cyanidin pelargonidin

KLT01

Thời gian lưu (phút) 13,317 17,528

Chất phân tích cyanidin pelargonidin

KLT02

Thời gian lưu (phút) 13,072 18,049

Chất phân tích cyanidin pelargonidin

RD01

Thời gian lưu (phút) 14,194

Chất phân tích cyanidin

RD02

-Mẫu RD02 không phát hiện chất phân tích nào

CD01

-Mẫu CD01 không phát hiện chất phân tích nào

CD02

-Mẫu CD02 không phát hiện chất phân tích nào