TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP HÀ NỘI HANOI UNIVERSITY OF INDUSTRY Tập san SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Số 14 2024 416
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PICEATANOL TRONG CỦ GẤU,
CHANH LEO MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CÓI (CYPERUS) Ở VIỆT NAM
RESEARCH ON PICEATANOL ANALYSIS METHOD IN CYPERACEAE,
PASSIFLORA EDULIS AND SOME SPECIES OF THE GENUS (CYPERUS)
IN VIETNAM
Trương Thị Đức Tú1, Nguyễn Văn Trường1, Trần Minh Thuý1,
Nguyễn Thị Thu Trang1, Lê Thế Hoài2,*
1Lớp KTHH 03 - K16, Khoa Công nghệ Hóa, Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội
2Khoa Công nghệ Hoá, Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội
*Email: lethehoai2002@gmail.com; hoailt@haui.edu.vn
TÓM TẮT
Trans-piceatannol và trans- resveratrol là các hợp chất stilben tồn tại trong tự nhiên với nhiều tác dụng sinh học đáng
quý như kháng khuẩn, kháng nấm, bảo vệ tim mạch, chống viêm, bảo vệ thần kinh, chống ung thư… Phương pháp định
lượng đồng thời piceatannol và resveratrol trong hạt chanh leo (Passiflora edulis) bằng sắc hỏng hiệu năng cao với đầu
UV-Vis đã được xây dựng thẩm định. Phương pháp sắc được thực hiện trên cột pha đảo Cosmosil 5C18-AR-II
(250 mm X 4.6 mm, 5 µm), hệ dung môi acetonitril – acid formic 0,1% trong nước, chế độ rửa giải gradient, tốc độ dòng
1 ml/phút và bước sóng phát hiện 327 nm. Phương pháp được thẩm định theo hướng dẫn của ICH về giới hạn phát hiện,
giới hạn định lượng, độ chọn lọc, đường chuẩn tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng.
Từ khóa: Củ gấu, chanh leo, phân tích piceatannol, chi cói, sắc ký cột.
ABSTRACT
Trans-piceatannol and trans-resveratrol are stilben compounds that exist in nature with many valuable biological effects
such as antibacterial, antifungal, cardiovascular protection, anti-inflammation, neuroprotection, anti-cancer... A method for
simultaneously quantifying piceatannol and resveratrol in passion fruit (Passiflora edulis) seeds by high-performance
chromatography with UV-Vis detector has been developed and validated. The chromatography method was performed on
a Cosmosil 5C18-AR-II reversed phase column (250 mm X 4.6 mm, 5 µm), solvent system acetonitrile formic acid 0.1%
in water, gradient elution mode, line speed 1 ml/min flow and 327 nm detection wavelength. The method was validated
according to ICH guidelines for limit of detection, limit of quantification, selectivity, linear calibration curve, repeatability
and precision.
Keywords: Cyperaceae, passion fruit, piceatanol analysis, cyperus, column chromatography.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Chanh leo (chanh y tím) tên khoa học Passiflora
edulis một loài dây leo thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae)
có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được trồng khắp vùng nhiệt đới
bán nhiệt đới trong đó rất phổ biến Việt Nam. Quả
chanh leo được sử dụng đlàm thực phẩm, chế biến đuống
với nhu cầu ngày càng gia tăng trên thế giới. Quá trình sản
xuất, chế biến đồ uống tạo ra một lượng chất thải như hạt
vỏ. Mặc dù, các công ty đã nỗ lực tái sử dụng các chất
thải trong quá trình sản xuát, nhưng một lượng lớn hạt
chanh leo vẫn chưa được sử dụng. Hạt chanh leo sử dụng
để sản xuất dầu hạt với hàm lượng acid béo không bão hòa
cao (70% acid linoleic) được ứng dụng trong thực phẩm,
dược phẩm, mỹ phẩm, hoặc pha chế làm dầu sơn. Tuy
nhiên, trong hạt chanh leo và phần sau khi sản xuất dầu
vẫn còn có các acid béo, protein và đặc biệt là các hợp chất
phenolic trong đó chiếm hàm lượng lớn là các stilben gồm
picetannol và resveratrol [1,2].
Củ gấu (hương phụ) tên khoa học là Cyperaceae, là một
loài cây sống lâu năm, mọc hoang khắp nơi trên đồn
ruộng, ven đường. Thường hay được đào vào màu xuân, sau
khi đào toàn cây, người ta phơi khô sau đó vun thành đống
để đốt, lá và rễ con cháy hết. Lấy củ còn sót lại đem đi rửa
sạch, phơi hoặc sấy khô rồi đem đi bảo quản. Củ gấu có tác
dụng ức chế tử cung, tác dụng ờng tim hạ áp, kháng
viêm, giảm đau giải nhiệt nhẹ,.. Trong tinh dầu của Củ
gấu có chứa piceatanol và resveratrol[3,4]..
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP HÀ NỘI HANOI UNIVERSITY OF INDUSTRY Tập san SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Số 14 2024 417Cói gạo có tên khoa học là Cyperus iria L. Cây mọc rựa
đường nước, ruộng bình nguyên cả vùng cao nguyên
miền Trung nước ta. Cói gạo tác dụng khử phong, trừ
thấp, điều kinh, lợi niệu. Toàn cây dùng trị phong thấp gân
cốt, tê đau, đòn ngã tổn thương, kinh nguyệt không đều, bế
kinh, sỏi niệu, [5,6].…
Piceatannol là chất chuyển hóa của resveratrol trong
thể người sinh vật. Trong tự nhiên Resveratrol
piceatannol hai hợp chất polyhydroxystilben quan trọng
tồn tại trong cốt khí củ (Polygonum cuspidatums), quả
chanh leo (Passiflora edulis), lạc (Arachis hypogaea), quả
sim (Rhodomyrtus tomentosa), củ gấu (Cyperus rotundus
L.), Vitis thunbergii, Ampelopsis brevipedunculaata
Nhiều phương pháp được phát triển để phân tích hàm lượng
piceatannol trong hạt chanh leo hay resveratrol trong cốt khí
củ, nho, rượu vang, hạt lạc tuy nhiên chưa công bố
nào về hàm lượng của hai chất này trong hạt chanh leo , củ
gấu và cói gạo ở Việt nam. Bài báo này chúng tôi tiến hành
xây dựng phương pháp phân tích đồng thời piceatannol
resveratrol trong hạt chanh leo , củ gấu và cói gạo [7,8].
Nhiều phương pháp được phát triển để phân tích hàm
lượng piceatannol trong hạt chanh leo hay resveratrol trong
cốt khí củ, nho, rượu vang, hạt lạc… tuy nhiên chưa công
bố nào về hàm lượng của hai chất này trong hạt chanh leo
Việt nam. Bài báo này chúng tôi tiến hành xây dựng phương
pháp phân tích đồng thời piceatannol resveratrol trong
hạt chanh leo.
2. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM.
2.1. Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu hạt của quả chanh leo
(passiflora edulis) thu hái ở các nơi khác nhau như Gia Lai,
Đăk lắc, Nội. Tên khoa học của các mẫu được giám định
bởi ThS. Phan Văn Trưởng, Trung tâm Tài nguyên Dược
liệu, Viện Dược liệu. Quả được bổ, lọc bỏ phần ruột thu lấy
hạt, rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín.
2.2. Nguyên vật liệu
Chất chuẩn: Piceatannol của hãng Shanghai Titan
Scientific Co., Ltd., số lô: P2499499, hàm lượng 98%
(nguyên trạng). Resveratrol của hãng Chengdu Biopurify
Phytochemicals Ltd., số lô: 14030102, hàm lượng 98%
(nguyên trạng).
Dung môi, hóa chất: Dung môi dùng cho chiết xuất đạt
yêu cầu hóa chất tinh khiết phân tích (P.A.). Các dung môi
dùng cho phân tích sắc ky HPLC (methanol, acetonitril,
formic acid) của hãng Merck, nước cất hai lần deion được
sử dụng để chuẩn bị pha động trong phân tích HPLC.
2.3. Thiết bị, dụng cụ
Hệ thống máy sắc lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Shimadzu, Nhật Bản bao gồm bơm LC-20AD, detector
SPD-20A UV, bộ phận tiêm mẫu tự động SIL-20A, ổn
nhiệt CTO-20A (Shimadzu, Japan), cột Cosmosil-C18
(Nacalai Tesque-Japan, 250 mm x 4,6 mm, 5 µm), cột
Vertical-C18 (Vertisep - Thái Lan, 250 mm x 4.6 mm, 5
µm). Cân phân tích Precisa 262SMA-FR … và các thiết bị
dụng cụ khác.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
- Điều kiện sắc
Tham khảo các nghiên cứu trên thế giới về định lượng
piceatannol resveratrol trong hạt chanh leo một số
dược liệu khác. Tiến hành khảo sát một số điều kiện sắc ký:
Pha tĩnh, pha động (dung môi, điều kiện rửa giải, tốc độ
dòng), nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu. Điều kiện sắc ký
được lựa chọn như sau: Hệ thống săc HPLC-UV
Shimadzu. Cột sắc ký Cosmosil-C18 (250 mm x 4.6 mm, 5
µm). Nhiệt độ cột 40oC. Tốc độ dòng 1 ml/phút. Pha
động: Acetonitril (A)- acid formic 0,1% trong nước (B), rửa
giải theo chương trình gradient: 0-20 phút 20% A, 35-40
phút 35% A, 45 phút 100% A, 50 phút 20% A. Thể tích tiêm
20 µl. Bước sóng phát hiện 327 nm [9,10]..
- Chuẩn bị mẫu
Quy trình chuẩn bị mẫu được nghiên cứu tối ưu hóa v
phương pháp chiết, dung môi chiết.
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 5 mg mỗi chất
chuẩn (cân bằng cân phân tích 5 chữ số), pha trong MeOH
để được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 500 µg/ml. Pha
loãng các dung dịch chuẩn gốc với MeOH để thu được các
dung dịch chuẩn làm việc nồng độ thích hợp: Piceatannol
2 – 232 µg/ml, resveratrol 0,5 70 µg/ml.
Dung dịch thử: Hạt chanh leo được sấy khô xay thành
bột, rây qua rây 0,25 mm trộn đều. Cân chính xác khoảng 1
g bột dược liệu (cân bằng cân phân tích 4 số) vào bình cầu
100 ml, chiết hồi lưu với MeOH 70oC 3 lần, mỗi lần 30
ml dung môi, thời gian chiết 60 phút. Gộp dịch chiết, dịch
rửa vào bình định mức 100 ml, thêm dung môi vừa đủ đến
vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
- Thẩm định phương pháp định lượng
Thẩm định các chỉ tiêu:nh đặc hiệu, tính thích hợp của
hệ thống, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn
phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ).
Tính đặc hiệu: tiến hành sắc các loại mẫu sau: Mẫu
trắng, mẫu dung dịch đối chiếu, mẫu dung dịch thử và mẫu
thêm chuẩn; mỗi mẫu tiêm 1 lần. Yêu cầu: Sắc đồ của
dung dịch thdung dịch thêm chuẩn cho pic thời gian
lưu tương ng với pic của chất chuẩn trên sắc đồ các mẫu
chuẩn. Trên sắc đồ dung dịch thử, nếu xuất hiện thêm
các pic khác không phải pic và đáp ứng các yêu cầu chung
của phương pháp sắc lỏng được quy định trong Dược
điển và AOAC.
Tính thích hợp của hệ thống: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần
01 dung dịch chuẩn, tiến hành sắc ký. Yêu cầu: Giá trRSD
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP HÀ NỘI HANOI UNIVERSITY OF INDUSTRY Tập san SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Số 14 2024 418của thời gian lưu 1,0%, của diện tích pic 1,0%, hệ số
đối xứng của pic T < 2,0
Độ lặp lại: Tiến hành làm lặp lại 6 lần trên cùng 1 mẫu
thử (mẫu 1). Độ lặp lại phương pháp được xác định bằng
giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng chất cần
phân tích trong mẫu.
Độ đúng: Được xác định thông qua độ thu hồi, bằng
phương pháp thêm chuẩn. Chuẩn bị các mẫu thêm chuẩn
bằng cách cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu đã biết
hàm lượng của các chất cần phân ch, thêm một lượng
chính xác chất cần phân tích. Lượng chất chuẩn thêm vào
tương ứng với 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ lặp
lại 3 lần. Tiến hành chiết như mô tả ở phần chuẩn bị mẫu.
Giới hạn phát hiện (LOD): Tiến hành pha loãng dung
dịch hỗn hợp dung dịch chuẩn và tiến hành phân ch HPLC
đến khi tín hiệu của chất định phân tích trên sắc đồ thu
được tỷ lệ S/N (tín hiệu/nhiễu) = 2H/h nằm trong khoảng
từ 2-3, trong đó H chiều cao pic định phân tích, h là chiều
cao tín hiệu nhiễu nền lớn nhất. Nồng độ xác định được là
giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp tương ứng với
từng chất định phân tích.
Giới hạn định lượng (LOQ): Được tính từ giá trị LOD
theo công thức LOQ = 3,3 x LOD. Khi đó dung dịch chuẩn
sau khi phân tích HPLC có tỷ lệ S/N nằm trong khoảng 9 –
10.
- Định lượng mẫu thử
Hàm lượng piceatannol resveratrol trong hạt chanh
leo được xác định theo quy trình đã được xây dựng. Nồng
độ của chất cần phân tích trong dung dịch thđược xác định
dựa trên công thức
C (µg/ml) = 

Trong đó: S là diện tích pic chất cần phân tích; a và b
các hệ số của phương trình đường chuẩn, H là độ tinh khiết
của chất đối chiếu (%).
Hàm lượng chất cần phân tích trong dược liệu được xác
định theo công thức:
X (%) =     
   

Trong đó: X hàm lượng chất cần phân tích trong dược
liệu (%). C nồng độ chất cần phân tích trong dung dịch
thử (µg/ml). V thể tích dung dịch thử (ml). m khối
lượng dược liệu (g). x là độ ẩm dược liệu.
Thực hiện xác định hàm lượng của mỗi mẫu 3 lần, kết
quả trung bình ± SD của các giá trị thực nghiệm.
3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng
Khảo sát các điều kiện sắc ký: Pha tĩnh, pha động (dung
i, điều kiện rửa giải, tốc đdòng), nhiệt đlò cột, thể tích
tiêm mẫu để lựa chọn điều kiện sắc cho các pic ch nhau
ràng, cân xứng … đạt điều kiện phân tích. Kết quả đã lựa
chọn được điều kiện phân tích như sau: Hệ thống săc
HPLC-UV Shimadzu. Pha nh: Cột sắc Cosmosil-C18
(250 mm x 4,6 mm, 5 µm). Nhiệt độ cột 40oC. Tốc độ dòng
1 ml/pt. Pha động: Acetonitril (A)- acid formic 0,1% trong
nước (B), rửa giải theo chương tnh gradient: 0-20 phút 20%
A, 35-40 phút 35% A, 45 phút 100% A, 50 phút 20% A. Thể
ch tiêm 20 µl. Bước sóng pt hiện 327 nm.
Khảo sát các điều kiện về phương pháp chiết (siêu âm,
soxhlet, hồi lưu với dung môi MeOH) lựa chọn phương
pháp chiết hồi lưu. Khảo sát dung môi chiết (EtOH, MeOH,
MeOH 70%, MeOH 50%, MeOH 30%), số lần chiết (2 lần,
3 lần), thời gian chiết cho 1 lần (30 phút, 60 phút, 90 phút)
để lựa chọn điều kiện chiết xuất thu được hiệu suất chiết
cao và ít tạp chất. Kết quả lựa chọn điều kiện chuẩn bị mẫu
như sau: dung môi MeOH, chiết hồi lưu, số lần chiết 3 lần,
tỷ lệ dung môi/dược liệu cho 1 lần 30/1, thời gian chiết
60 phút
3.2. Thẩm định phương pháp định lương
- Tính đặc hiệu
Hình 1. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của hệ thống
Tiến hành sắc các loại mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu
thử mẫu thêm chuẩn; mỗi mẫu phân tích 1 lần theo
phương pháp phân tích đã xây dựng. Ghi lại sắc ký đồ, xác
định thời gian lưu của pic chất chuẩn trong sắc đồ mẫu
chuẩn, mẫu thmẫu thêm chuẩn. Kết quả được trình bày
trong hình 1. Kết quả cho thấy, sắc ký đồ của dung môi pha
mẫu không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương
ứng với thời gian lưu của pic trên sắc đồ của các dung
dịch chuẩn. Sắc đồ của dung dịch thvà dung dịch thêm
chuẩn cho 1 pic thời gian lưu tương ng (sự sai lệch
không có ý nghĩa thống kê) với pic chất cần phân tích trong
sắc đồ mẫu chuẩn. Trên sắc đồ của dung dịch mẫu
thử, mẫu thêm chuẩn nếu xuất hiện các pic khác không
phải pic chất cần phân tích thì đều phải tách hoàn toàn
khỏi pic của chất cần phân tích đáp ứng các yêu cầu
chung của phương pháp sắc lỏng theo quy định của dược
điển Việt nam V. Pic của chất cần phân tích trong sắc ký đồ
dung dịch chuẩn, dung dịch thử dung dịch thêm chuẩn
tinh khiết. Hệ số tinh khiết pic chất cần phân tích trong các
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP HÀ NỘI HANOI UNIVERSITY OF INDUSTRY Tập san SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Số 14 2024 419sắc ký đồ xấp xỉ 1,0. Như vậy, điều kiện sắc ký đã khảo sát
phù hợp để phân tích piceatannol resveratrol trong hạt
chanh leo.
- Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành sắc 6 lần 01 mẫu chuẩn của piceatannol
resveratrol. Kết quả được trình bày trong bảng 1. Thời gian
lưu và diện tích pic của 6 lần đo có RSD% ≤ 2%. Hệ số kéo
đuôi pic đạt yêu cầu của phương pháp phân tích.
Bảng 1. Thời gian lưu và diện tích pic của 6 lần đo
Piceatannol Resveratrol
Thời
gian
lưu
(phút)
Diện tích
pic T
Thời
gian
lưu
(phút)
Diện tích
pic T
1 16,391
8306040 1,148
31,346
9314458 1,083
2 16,387
8266061 1,147
31,334
9272614 1,086
3 16,768
8259464 1,147
31,682
9335968 1,085
4 16,853
8151577 1,146
31,367
9324009 1,085
5 16,847
8266434 1,146
31,35 9211121 1,085
6 16,831
8270899 1,146
31,704
9335176 1,086
Trung
bình 16,680
8253412,5
1,147
31,464
9298891 1,085
SD 0,227 52558,663
0,001
0,178 48905,223
0,001
RSD
(%) 1,361 0,637 0,071
0,566 0,526 0,101
- Khoảng tuyến tính và phương trình đường chuẩn.
Khoảng tuyến tính: Piceatannol 2,784 232 µg/ml,
resveratrol là 0,6624 – 138 µg/ml.
Bảng 2. Khoảng tuyến tính của piceatanol và resveratrol
Nồng độ
piceatannol
Diện tích pic
piceatannol
Nồng độ
resveratrol
Diện tích pic
resveratrol
232 33903149 138 18964731
116 16783038 66,24 9298891
55,68 8253412,5 52,992 7375977
44,544 6556931 39,744 5552969,5
33,408 4939636,5 26,496 3664617
22,272 3232502,5 13,248 1871506
11,136 1639921,5 6,624 919885
5,568 798699 3,312 474895,5
2,784 408387 2,6496 373942,5
0,6624 92039,5
sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic nồng
độ củ các chất chuẩn trong dung dịch theo các phương trình
y = 145878 x + 18260, hệ số tương quan r2 = 1 đối với
piceatannol và y = 137769 x + 37454, hệ số tương quan r2
= 0,9999 với resveratrol
Hình 2. Phương trình đường chuẩn của piceatanol và resveratrol
- Độ lặp lại
Kết quả tiến hành đánh giá độ lặp lại được thhiện trong
Bảng 3. Độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2%, phương pháp
độ lặp lại tốt, nằm trong giới hạn theo quy định của
AOAC.
Bảng 3. Độ lặp lại của piceatanol và resveratrol
Khối lượng
cân
Hàm lượng
piceatannol
Hàm lượng
resveratrol
1003,9 0,337 0,0205
1001,6 0,340 0,0210
1002,5 0,336 0,0203
1001,2 0,332 0,0200
1004 0,339 0,0201
1003,5 0,341 0,0199
Trung bình 0,338 0,0203
SD 0,0033 0,0004
RSD 0,97 1,99
- Độ đúng
Ba mức nồng độ piceatannol resveratrol được thêm
vào mẫu thực tương ứng với 3 mức nồng độ 50%, 100%
150% trong mẫu thực. Kết quả thu được trong Bảng 3. Độ
thu hồi của piceatanol nằm trong khoảng 98,87 – 100,39%,
RSD < 2%. Độ thu hồi của resveratrol nằm trong khoảng
97,72 102,74, RSD < 3,7%. Phương pháp định lượng
piceatanol và resveratrol đã xây dựng có độ thu hồi đạt các
yêu cầu theo AOAC. (Yêu cầu về độ thu hồi theo AOAC:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP HÀ NỘI HANOI UNIVERSITY OF INDUSTRY Tập san SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Số 14 2024 420tỷ lệ độ thu hồi cho phép ở mức 0,01 - 0,1% 95 -105%,
RSD ≤ 3,7%; ở mức 0,1 -1 % 97 – 103%, RSD 3,7%)
Bảng 4. Độ thu hồi của piceatannol và resveratrol
ST
T
Lượng
piceatan
nol thêm
vào
(µg/ml)
Độ thu
hồi
piceatan
nol (%)
M±S
D
Lượng
resverat
rol thêm
vào
(µg/ml)
Độ thu
hồi
resverat
rol (%)
M±S
D
1 16,9 98,42
98,87
±
1,96
1,015 97,42 98,54
± 3,16
2 16,9 102,10 1,015 102,10
3 16,9 99,09 1,015 96,09
4 33,8 101,10 99,77
±
1,96
2,03 103,52 102,74
± 1,95
5 33,8 100,69 2,03 104,19
6 33,8 97,52 2,03 100,52
7 50,7 102,52 100,3
9 ±
1,93
3,045 95,72 97,72
± 2,08
8 50,7 98,77 3,045 97,57
9 50,7 99,88 3,045 99,88
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giá trị LOD, LOQ xác định thu được kết quả như sau:
Piceatannol LOD 8,32 ng/ml, LOQ 27,48 ng/ml;
resveratrol có LOD 6,7 ng/ml, LOQ 22,11 ng/ml. Kết
quả cho thấy phương pháp đã xây dựng giới hạn phát
hiện giới hạn định lượng thấp, phù hợp để định lượng
piceatannol và resveratrol trong hạt chanh leo.
3.3. Định lượng một số mẫu hạt chanh leo
Bảng 5. Một số mẫu chanh leo
TT
hiệu Nơi lấy
Thời gian
lấy mẫu
Piceatan
nol ± SD
(%)
Resverat
rol ± SD
(%)
1 M1 Gia Lai
9/2021 0,338 ±
0,0033
0,0203 ±
0,0004
2 M2 Hà Nội
7/2023 0,404 ±
0,0051
0,0168 ±
0,0006
3 M3 Đắk
Lắk 5/2023 0,605 ±
0,0073
0,0215 ±
0,0003
Trong 3 mẫu hạt chanh leo chúng tôi định lượng, hàm
lượng piceatannol nằm trong khoảng 0,338 ± 0,0033 đến
0,605 ± 0,0073; hàm lượng resveratrol nằm trong khoảng
0,0168 ± 0,0006 đến 0,0215 ± 0,0003.
3.4. Đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase của piceatanol,
resveratrol và mẫu cao hạt chanh leo
Chúng tôi cũng đã thử tác dụng ức chế tyrosinase của
piceatanol, resveratrol mâu cao hạt chanh leo. Kết quả
thu được như bảng 6.
Cao hạt chanh leo hàm lượng piceatannol 4,02%
hàm lượng resveratrol 0,25% khả năng ức chế enzyme
tyrosinase với IC50 = 9,73 g/ml.
Bảng 6. Kết quả tác dụng ức chế
Tên mẫu Nồng độ g/ml % Ức chế
Piceatanol
IC50 = 4,27 g/ml =
17,5 M
8,5 81,4
4,25 54,19
2,125 37,42
1,0625 21,34
0,5313 16,42
Resveratrol
IC50 = 1,40 g/ml =
6,14 M
5 97,21
2,5 74,78
1,25 43,86
0,625 14,39
Cao hạt chanh leo
IC50 = 9,73 g/ml
40 90,91
20 73,76
10 47,63
5 24,71
2,5 16,75
Tyrosinase là một đích phân tử quan trọng tham gia vào
quá trình hình thành các sắc tố melanin. Ức chế enzym
tyrosinase thể làm hạn chế việc sản sinh quá nhiều các
sắc tố melanin từ đó giúp điều trị các rối loạn liên quan đến
tăng sắc tố da. Nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất tác dụng
ức chế enzym này có ý nghĩa lớn trong khoa học y dược và
mỹ phẩm.
Với mong muốn tìm được nguồn dược liệu có sẵn trong
tự nhiên có khả năng làm giảm quá trình tổng hợp melanin,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế
enzyme tyrosinase của piceatannol, resveratrolcao chiết
từ hạt chanh. Khả năng làm giảm quá trình sinh tổng hợp
melanin thông qua hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase, cao
metanol hạt chanh leo có khả năng ức chế enzym tyrosinase
rất mạnh, với giá trị IC50 9,73 µg/mL. Đây nguồn
nguyên liệu rất đáng quan tâm để phát triển các sản phẩm
chăm sóc da theo hướng ức chế tyrosinase.
4. KẾT LUẬN
- Sử dụng phương pháp chiết hồi lưu trong methanol và
xây dựng phương pháp phân ch bằng HPLC-UV cho phép
định lượng đồng thời piceatannol resveratrol trong hạt
chanh leo.
- Phương pháp đã được thẩm định đạt yêu cầu theo
hướng dẫn của ICH và AOAC, có độ đặc hiệu phù hợp, độ
chính xác cao, độ đúng tốt, khoảng tuyến tính rộng.
- Phương pháp phù hợp để đánh giá hàm lượng hai chất
trong hạt chanh leo và áp dụng vào 3 mẫu hạt ở 3 vùng khác
nhau cho hàm lượng các chất đều phù hợp với các kết quả
trên thế giới.
- Định lượng hàm lượng piceatannol trong Củ gấu và
Cói gạo nhưng hàm lượng piceatannol vô cùng ít và không
có trong Cói gạo.