Phn I
Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề
Mối (isoptera) là loài côn trùng có phm vi phân bố rộng, ưa nhiệt chúng
sống ở vùng có điều kiện khí hậu nhiệt đới và cn nhiệt đới. Chúng sống trong tn
đê, thân đập, trong rừng, đồi, các thân cây gỗ, đồ dùng bng gỗ..., khác với nhiều
loi côn trùng đơn sinh mỗi tổ mối là một “đơn vị sống” hoặc được coi là một “x•
hội” riêng biệt, trong mỗi tổ mối tuỳ theo từng loài có tvài trăm đến chục triệu
con, chúng sinh sn rất nhanh và có phm vi phân bố rộng. Trên thế giới đgiám
định được trên 2700 loài, nước ta đ• giám định được 106 loài. Thức ăn chủ yếu
của mối là xenllulo cho nên người ta đ• km phá được vai trò của mối như
giúp cho sphân huỷ thảm thực vật nhanh chóng, chúng góp phần cải tạo tính chất
vật lí của đất thông qua việc đào bới thường xuyên. Ngoài ý nghĩa về mt tự nhiên
mối còn cung cấp nguyên liệu cho ngành y tế như làm thuốc chữa bệnh thấp khớp
và tmối được các nhà kiến trúc sư áp dụng trong các công trình kiến trúc....
Nhưng xét về tổng thể thì mối vẫn là loài gây hi. Do mối là côn trùng chuyên dinh
dưỡng trên các ngun thức ăn có chứa xenlullo nên mi gây hại nhà cửa, ng
trình xây dựng bằng gỗ, đê điều nhưng đặc biệt nguy hiểmn mối được xem là
ẩn hoạ thân đê”, đe doạ nghiêm trng đến cuộc sống của con người. Theo nghiên
cứu sơ bộ nước ta thì sức phá hoại của chúng thật ghê gớm. Ngoài ra, mối còn phá
hại cây công nghiệp và cây hoa màu như: cao su, cà fê, chè, bông, cây lạc, sắn...
làm cho cây chết hoặc sinh trưởng kém, còi cọc từ đó ảnh hưởng đến năng suất,
chất lượng cây trng. Trong các loài mối gây hại phải kể đến các loài mối nhà
Coptotermes, chúng phá hic trang thiết bị đồ dùng bng gỗ, đặc biệt hơn là các
di tích lịch sử. ng năm mối làm cho hàng chục ngôi nhà và các di tích lch sử có
nguy cơ bị sụp . Chính vì vậy chúng ta cần phòng và trmối.
Hin nay có nhiều phương pháp phòng và diệt mối như pơng pháp hoá học,
vật lý, thủ công… Tuy nhiên các phương pháp trên còn tồn tại những hạn chế.
Phương pháp hoá học do thuốc kng thể tác dụng trực tiếp đến tổ mối được, khó
tìm tmối chính, mùi vị bị mối phát hiện nhanh chóng, chi phí cho mỗi ln như thế
tốn kém, đồng thời dẫn đến tính kháng thuốc và nguy him hơn là phương pháp
này nh hưởng trực tiếp tới sức khỏe con người và môi trường nếu lượng thuốc sau
x thừa hoặc phân huỷ không hết còn tồn dư lại. Phương pháp vật lí gặp k
khăn trong việc xác định tổ mối vì trên các con đê đập tổ mối thường nằm u
trong lòng đất. Hin nay, một hướng phòng trmối mi đang được mở ra đó là
biện pháp phòng trsinh học, hiện nay phương pháp này đ• và đang có rất nhiều
công trình khoa học ngiên cu đ• chỉ ra rằng mối cũng bị kí sinh và gây bệnh do
nấm (Metarhizium, Beauveria) và vi khun Bacillus,...gây ra. Trong các chủng vi
sinh vật kể trên thì Metarhizium là chủng nấm hiệu lực diệt mối mạnh nhất. Mặt
khác bào tnấm có kích tớc bé (trung bình vài ) chúng li không có mùi vị nên
mối khó phát hiện. Cơ chế gây hại của bào tnấm Metarhizium như sau: Khi bào
tnấm m dính trên cơ thể mối, gặp điều kiện thích hợp sau 24 giờ sẽ nảy mầm
thành ống đâm xuyên qua lớp vỏ kitin hút dinh dưỡng đồng thời tiết chất độc giết
chết mối. Đây là cơ sở khả năng diệt mối một cách lâu dài, hiệu quả và rất an toàn
đối với môi trường và con người. Đây là một phương pháp diệt trừ mối rất hay và
đang là một hướng đi mới rất khả thi, tuy nhiên các công trình nghiên cứu trước
chỉ mới giải quyết ở mức độ hoàn thành một khâu trong cả quá trình. Do vậy để
khẳng định và đánh giá hiệu lực diệt mối của chế phẩm Metarhizium. Vì vậy chúng
tôi quyết định thực hiện đề tài.
Nghiên cu quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium và
khả năng diệt mối của bào tnấm qua lây nhiễm”
1.2. Mục đích và yêu cu
1.2.1. Mục đích:
- Hoàn thành quy trình n men kết hợp để sản xuất bào tnấm Metarhizium (m4;
m5) trong phòng trmối.
- Đánh giá khả ng diệt mối bằng trực tiếp và lây nhim của chế phẩm
Metarhizium (m4; m5) sau lên men kết hợp.
1.2.2. Yêu cầu:
- Xác định được đặc điểm hình thái của nấm Metarhizium (M4; M5).
- Quan sát sự phát triển của bào tnấm Metarhizium tn môi trường nuôi cấy kết
hợp khác nhau.
- Xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố: Lượng mẫu, thời gian lên men kết hợp
đến sự hình thành bào tử nấm Metarhizium.
- Thử khả năng diệt mối của bào tử chủng Metarhizium (M4; M5) sau khi lên men
kết hợp bằng phương pháp lây nhiễm và trực tiếp.
Phn II
Tổng quan tài liệu
2.1. Giới thiệu về Metarhizium anisopliae Sorok.
2.1.1. Sơ lược về lịch sử ra đời của Metarhizium.
Từ những năm 70 của thế kỷ xix, các nhà khoa học trên thế giới đ• nghiên cu và
nhận thấy nhiều loại côn trìng bnhiễm bệnh và chết bởi các chủng vi nấm thuộc
lớp nấm bất toàn (Deutermyceter).
m 1878, nhà bác học người Nga Metschnhikov trong khi nghiên cứu bệnh của
bọ cứng hại lúa mì để tìm phương pháp phòng trừ đ• phát hiện bệnh “nấm xanh”
(nm Entomophthora, nay đổi tên là Metarhizium anisopliae). ông đ• cùng người
học trò của mình là Isac Craxinstic nghiên cu môi trường nuôi cấy loài nấm này
cho việc thử nghiệm hàng nghìn kilogram nm để tách bào tthuần khiết và đem
thnghim u non bọ đầu dài (Boxthinoderes punctriventric) hại củ cải đường.
Kết quả là sau khi dùng bào tử và chất bột nền để tung ra đồng ruộng diệt sâu non
đ• cho hiệu quả y chết 55-80% sau 10-14 ngày. Kể từ đó nhiu công trình nghiên
cứu lớn, nhỏ về khả năng ng dụng Metarhizium cho phòng trnhiều đối tượng
gây hi khác nhau đ• được tiến hành. Cho đến nay đ• xác định được n 200 loài
côn trùng là đối tượng tấn công của loại nm này trong đó có cloài mối là loi
côn trùng đặc biệt nguy hại đối với chúng ta.
2.2.2. Đặc điểm hình thái của Metarhizium anisopliae
Metarhizium anisopliae thuộc họ moniliaceae, bộ nấmng moniliales, lớp nấm
bất toàn Deuteromycetes (Fungi imperfecty), có kiu phát sinh bào tử trần của
nhóm Hyphomycetes [4]. Trong chi Metarhizium hai loại nấm được xác định
nhiều trong việc kí sinh gây bệnh cho côn trùng đó là Metarhizium anisopliae
Metarhizium flavoviride.
Nm Metarhizium có màu lục hoặc xanh lục nên người ta gọi là nm lục cương.
Đặc điểm hình thái: Si nấm phát triển trên b mặt côn trùng có u từ trắng đến
hồng, cuống sinh bào tngắn, mọc tỏa tròn trên đầu sợi nấm dày đặc. Bào tử trần
hình que 3,5 x 6, 4 x 7,2 . Màu tlục xám đến oliu đến lục. Bào tử xếp thành hình
chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bng mắt thường người ta có thể thấy bào tử được tạo
ra trên bmặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục [14].
Nm Metarhizium anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, khuẩn lạc có
màu xanh hoặc hồng. Cng phát triển nhanh trên môi trường Czapek- Dox khi
nuôi nhiệt độ 28oC (nuôi trong tủ định ôn) sau 8 – 10 ngày nuôi cy thì khun
lạc có đường kính 7 - 8,5 cm. Loại nấm Metarhizium anisopliae có hai loài là dng
bào tử nhỏ và lớn. Tuy nhiên Metarhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất
trên côn trùng thuộc bộ cánh cứng Coleoptera.
2.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hoá của Metarhizium anisopliae.
Nm Metarhizium anisopliae sinh trưởng rất tốt trên nn cơ chất có kitin, chúng
sống được nhiệt độ thấp 80C,biên độ về độ m rộng ở nơi tích lũy nhiều
CO2và thiếu O2 chúng có thể sống tới 445 ngày. nhiệt độ nhỏ hơn 100C lớn
hơn 450C thì nấm không thể hình thành bào tử. Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy
mm của bào tlà 280C và pH = 6,8 - 70 hoc dao động từ 3,3 8,5. Nmkhả
năng phân giải xenlulose và kitin (lông và lp vỏ ngoài của côn trùng) [14].
Độc tố diệt côn trùng của nấm: Gồm một số độc tố có tên là DestruxinA, B, C, hay
D. Các ngoi độc tố này là sn phẩm thứ cấp vòng peptit, L-prolyn, L –leucine,
anhydrie, L-prolyn, L-valine anhydride và Desmethyl Destruxin B [12].
2.1.4. Cơ chế gây bệnh của Metarhizium
Bào tnấm phát tán trong gió hoặc lây nhim qua tiếp xúc giữa các thể mang
mm bệnh. sau khi bám vào cơ thể côn trùng, gp ẩm độ nhiệt độ thích hợp (m
nhập qua đường hô hấp) bào tnấm nảy mầm tiết ra độc tố Destruxin làmliệt hệ
thần kinh côn trùng và sử dụng dinh dưỡng của côn trùng từ đó m cho các cơ hệ
quan côn trùng suy yếu dần đi và chết sau 2-5 ngày phụ thuộc vào kích c của
côn trùng. Xác côn trùng chết thường khô, không có mùi thối. Sau vài ngày si
nấm sẻ đâm qua lớp vỏ kitin lại phát tán bào tử ra ngoài và tiếp tục một chu trình
gây bnh mới với côn trùng kế tiếp.
2.2. Tình hình nghiên cứu sử dụng Mertarhizium trong phòng trmối
2.2.1. Tình hình nghiên cu sử dụng Metarhizium trên thế giới
Những năm cuối của thế kỷ xx, rất nhiều công trình nghiên cu đ• khẳng định
trong điều kin tự nhiên vi nm là một nhân tố gây chết quan trọng đối với nhiều
li côn trùng. Mỗi nhóm côn trùng có thể bị ảnh hưởng bởi mt số vi nấm nhất
định. Người ta đ• xác định hơn 700 loài vi nấm là mầm bệnh cho các loàin
trùng. Tuy nhiên, căn cứ vào mức độ gây chết, điều kiện nuôi cấy, điều kiện sản
xuất và phổ tác dụng, người ta chỉ tập trung nghiên cứu vào 4 nhóm vi nm:
Metarhizium, Beauveria, Verticilum và Paecilomyces [14], [15].
Metarhizium được xác định là mầm bệnh nguy hiểm của hơn 200 loài côn trùng.
Tuy Metarhizium chỉ có 3 loài nhưng lại có rất nhiều chủng khác nhau và mỗi
chủng thích nghi cao đối vi nhóm n trùng xác định. Trong nghiên cứu ứng
dụng, vấn đề quan trọng hàng đầu là phải tuyển chọn được các chủng thích nghi,
có hiu lực cao đối với một nhóm côn trùng xác định (Hanel 1982, Tanada và Kaya
1993) theo Milner và cng sự [15].
Những năm gần đây, xuất hiện ngày càng nhiu các công trình nghiên cu sử dụng
vi nấm để diệt trừ côn trùng, nhất là nghiên cứu sử dụng Metarhizium để phòng tr
mối. và kết quả là 11 chế phẩm vi nấm diệt côn trùng đ• được đưa vào sử dụng,
trong đó có 3 chế phẩm Metarhizium: chế phẩm BioBlast của Mỹ dùng để diệt mối
đất Đài Loan (Coptotermes formosanus); chế phẩm GreenMuscle của Nam Phi để
diệt châu chấu (Locusts); chế phẩm BioGreen của úc để diệt bọ ngô đầu đỏ (Red-
headed cokchafer).
ở úc, nhóm nghiên cu thuộc viện nghiên cu côn trùng của thành phố Canbera, do
tiến sỹ Milner (1998) chủ trì đ• nghiên cứu tuyển chọn từ 97 chủng Metarhizium,
phân lập từ các nguồn khác nhau, nhưng chỉ có 2 chủng FI-1186 FI- 610 là có
hiệu lực mạnh và ổn định đối với 2 loài mối Nasutitermes exitosus và Coptotermes
lacteus. Họ đ• tiến hành hàng loạt thí nghiệm và cho thy rằng nấm không lây
nhim vào các vật chủ bằng con đường tiêu hóa, mà nó trực tiếp xâm nhập qua vỏ
thể, cho nên cấu trùng còn non cũng có thể bị tiêu dit. Xác mối bị chết do
nấm sẽ khô cứng, đầy sợi nấm trắng, sau đó tạo thành thế hệ bào tmi màu xanh
đậm.c bào tử chỉ nảy mầm khi gặp độ ẩm cao và thời tiết thích hợp. Tuy nhiên
các th nghiệm này mới chỉ được thực hiện trong phòng thí nghimquy mô nhỏ.
Tại Canada, nhóm nghiên cứu do tiến sỹ Bary H.Track (1999) đứng đầu thuộc
phòng thí nghim côn trùng học, trường đại học tổng hợp Toronto đang thử
nghim một số chủng nấm Metarhizium để diệt các loài kiến và loài mối
Reticulitermes flavipes (loài mối gây hại nghiêm trọng cho công trình kiến trúc ở
thành phToronto). Họ đ• phân lập được một số chủng vi nấm của loài
Metarhizium anisopliae có hoạt lực cao với mi Reticulitermes flavipes. Họ quan
sát thấy bào tvi nấm m lên vỏ cơ thể của mi, mọc xuyên vào các mô và h
tuần hoàn, rồi giết chết mối trong vòng 24-48 giờ, tùy thuộc vào liều ng và tác
dụng. Bào tvi nấmthể lây truyền từ cá thể này sang cá thể khác thông qua
hàng loạt các hoạt động tiếp xúc trực tiếp với nhau giữa các thể trong quần thể
như việc trao đổi thức ăn, sự tiêu thụ chất tiết, việc làm vệ sinh cho nhau... Vấn đề
đang được họ quan tâm là nghiên cu khả năng phát hiện và ngăn chặn các con
mối đ• bnhiễm bào tvi nấm của quần thể mi.
ở Mỹ, tại trung tâm của hiệp hội nghiên cu mối ngầm Đài Loan, M. Guadalupe
Rojas và cộng sự (2000), đ• chứng minh các bào tử của các loài vi nấm này có th
m vào vỏ kitin của cơ thể mối Coptotermes formosanus để nảy mầm, sau đó sợi
nấm phát triển đâm xuyên vào cơ thể mối và diệt mối rất tốt. Họ khẳng định bào t
nấm không độc với người, động vật và môi trường. ng nghiên cứu của họ là s
dụng bào tvi nấm trộn với diflubensuzon trong các vị trí đặt bả hỗn hợp.
m 2002, Tiến sỹ Haimanot Abebe đ• tiến hành thử nghiệm bào tử Metarhizium
trên mối Macrotermes subhyalinus ở vùng Lenkemt Zuria (Ethiopia). Ông đ• thử
nghim bào tử ở ba nồng độ là 4,6; 9,3 và 20 gram bào t/ tổ, các tổ Macrotermes
thnghim có tuổi từ 2 đến 3 m. Sau 60 ngày thnghiệm tỷ lệ mối chết đạt
61%, 64% và 74% các nồng độ tương ứng. Sau 75 ngày tác giả còn quan sát thấy
nấm Xylaria mọc trên các tmi đ• t nghiệm.
Tại hội nghị hoá học của mỹ tháng 4/2002 người ta đ• đưa ra và nhất trí là phải
thay thế các phương pháp phòng trmối và côn trùng, hiện nay bằng b• mối và các
chế phẩm sinh học như vi nấm Metarhizium, beauveria và vi khuẩn bacillus. Chế
phm Bio Blast của mỹ do Ecoscience sản xuất bán ra thị trường dựa vào kết quả
thnghim trên mối Coptotemes fomosanus1000 điểm khắp 11 bang bị mối hại
ở nước mỹ, chế phm này được sản xuất theo phương pháp lên men xốp và được
sử dụng ở hai dạng bột mịn và huyn phù, hin nay người ta đang tiến hành nghiên
cứu cho thêm chất phụ gia để ng tính dínhm làm sao đưa được lượng bào t
Metarhizium vào ít nhất là 10% s thể của quần thể mối.
2.2.2. Nghiên cu ở trong nước
Việc nghiên cứu nấm gây bệnh trên côn trùng đ• đượcc cán bộ khoa học kỹ
thuật ở một số trường đại học và viện nghiên cu bắt đầu tìm hiểu và đi sâu nghiên