Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu tách chiết hợp chất anthocyanin từ quả mồng tơi chín (Basella alba L.) và khảo sát hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT ANTHOCYANIN TỪ

QUẢ MỒNG TƠI CHÍN (BASELLA ALBA L.) VÀ KHẢO SÁT

HOẠT TÍNH SINH HỌC.

Ngành:

Công nghệ sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Thu Hương

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thanh Loan

MSSV: 1211100261 Lớp: 13DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 7/2017

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là trung

thực và chƣa từng đƣợc các tác giả khác công bố trong các nghiên cứu, đồ án nào.

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành đồ án đã đƣợc cảm ơn

và các thông tin trích dẫn trong đồ án đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong đồ án này.

TP. HCM, ngày tháng năm 2017

Sinh viên thực hiện

i

Nguyễn Thanh Loan

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân,

tôi đã nhận đƣợc sự động viên và giúp đỡ rất lớn từ các cá nhân và tập thể.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hƣớng dẫn ThS. Nguyễn Thị

Thu Hƣơng, giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, ngƣời

đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành

đồ án tốt nghiệp này.

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Phòng thí nghiệm Trƣờng Đại học Công

nghệ TP. HCM đã tạo mọi điều kiện cơ sở vật chất tốt cho tôi thực hiện và hoàn thành

luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các bạn trong nhóm sinh viên làm

nghiên cứu khoa học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành

luận văn này.

TP. HCM, ngày tháng năm 2017

Sinh viên thực hiện

ii

Nguyễn Thanh Loan

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC

MỤC LỤC ......................................................................................................................... i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................................ v

DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... vi

DANH MỤC SƠ ĐỒ .....................................................................................................vii

DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... viii

LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4

1.1. Tổng quan về cây mồng tơi ................................................................................ 5

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ................................................................................. 5

1.1.2. Đặc điểm và sinh thái .................................................................................... 6

1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ, kỹ thuật canh tác cây mồng tơi ở Việt Nam ………………………………………………………………………………7

1.1.3.1. Tình hình trồng trọt và tiêu thụ ................................................................ 7

1.1.3.2. Kỹ thuật canh tác ..................................................................................... 8

1.1.4. Thành phần hóa học.................................................................................... 10

1.1.5. Tính vị và công dụng ................................................................................... 11

1.2. Hợp chất Phenol, Flavonoid, Anthocyanin ..................................................... 12

1.2.1. Phenol ........................................................................................................... 12

1.2.1.1. Đại cƣơng về hợp chất phenol ................................................................ 12

1.2.1.2. Phân loại .................................................................................................. 13

1.2.1.3. Tính chất và chức năng .......................................................................... 14

1.2.2. Flavonoid ..................................................................................................... 15

1.2.2.1. Đại cƣơng về flavonoid .......................................................................... 15

1.2.2.2. Phân loại ................................................................................................. 15

1.2.2.3. Lý tính .................................................................................................... 16

i

1.2.2.4. Hóa tính .................................................................................................. 17

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.2.2.5. Hoạt tính sinh học .................................................................................. 18

1.2.3. Anthocyanin ................................................................................................. 21

1.2.3.1. Đại cương về anthocyanin ..................................................................... 21

1.2.3.2. Phân loại ................................................................................................ 23

1.2.3.3. Lý tính ..................................................................................................... 24

1.2.3.4. Hóa tính .................................................................................................. 24

1.2.3.5. Hoạt tính sinh học .................................................................................. 25

1.3. Các phƣơng pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật ..................... 26

1.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng ........................................................................... 26

1.3.2. Kỹ thuật chiết lỏng – rắn ............................................................................. 28

1.3.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt ......................................................................... 28

1.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm ........................................................................ 28

1.3.2.3. Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet ................................................... 29

1.3.2.4. Kỹ thuật chiết bằng máy Kumagawa ...................................................... 30

1.3.2.5. Phƣơng pháp chƣng cất ........................................................................... 31

1.3.2.6. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn ............................................................ 32

1.3.2.7. Kỹ thuật chiết pha rắn ............................................................................. 33

1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa ........................................................... 34

1.4.1. Quá trình và nguyên nhân gây oxy hóa ..................................................... 34

1.4.2. Khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất trong thực vật ....................... 35

1.5. Cơ sở khoa học của khả năng kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật ………………………………………………………………………………….35

1.5.1. Định nghĩa .................................................................................................... 35

1.5.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật .............................. 36

1.6. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm ..................................................................... 38

1.6.1. Salmonella .................................................................................................... 38

ii

1.6.2. Staphylococcus aureus ................................................................................. 39

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.6.3. Escherichia Coli ........................................................................................... 40

1.6.4. Bacillus cereus .............................................................................................. 42

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........... Error! Bookmark not defined.

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................... 44

2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 44

2.2.1. Nguồn mẫu ................................................................................................... 44

2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị ......................................................................................... 44

2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ....................................................................... 44

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 45

2.4.1. Phương pháp xác định độ ẩm của mẫu ...................................................... 45

2.4.2. Phương pháp xác định tỉ lệ trọng lượng của mẫu ..................................... 46

2.4.3. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao chiết .......................................... 46

2.4.4. Phương pháp định lượng polyphenol tổng số ............................................ 46

2.4.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH .... 47

2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật đục lỗ thạch ……………………………………………………………………………..48

2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................... 50

2.4.8. Phương pháp so sánh, đối chiếu ................................................................. 50

2.5. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 50

2.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm của mẫu quả mồng tơi ............................. 50

2.5.2. Thí nghiệm 2: Xác định tỉ lệ trọng lượng của mẫu ................................... 51

2.5.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng anthocyanin ............................................................................................................ 51

2.5.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng số .................................................................................................. 54

iii

2.5.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng oxy hóa ......................................................................................................... 55

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.5.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng khuẩn ........................................................................................................... 55

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................. Error! Bookmark not defined.

3.1. Kết quả xác định độ ẩm và tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín ........... 58

3.2. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến hàm lƣợng anthocyanin ... 58

3.3. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến hàm lƣợng polyphenol tổng số ………………………………………………………………………………….60

3.4. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến khả năng kháng oxy hóa ………………………………………………………………………………….63

3.5. Kết quả ảnh hƣởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng khuẩn ...... 67

3.5.1. Hoạt tính kháng Bacillus cereus của các loại cao chiết ............................ 67

3.5.2. Hoạt tính kháng Salmonella của các loại cao chiết ................................... 67

3.5.3. Hoạt tính kháng E.coli của các loại cao chiết ............................................ 68

3.5.4. Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của các loại cao chiết ............... 69

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................ Error! Bookmark not defined.

4.1. Kết luận ................................................................................................................ 71

4.2. Kiến nghị.............................................................................................................. 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 72

iv

PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AG acid gallic :

BVTV : bảo vệ thực vật

db nguyên liệu :

DMSO : Dimethyl Sulfoxide

DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

The half maximal inhibitory concentration : IC50

: NA Nutrient Agar

: NB Nutrient Broth

: OD Optical Density

v

: TN thí nghiệm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại khoa học cây mồng tơi .................................................................... 5

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của cây mồng tơi .......................................................... 10

Bảng 1.3. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (Cowan, 1990) .. 37

Bảng 1.4. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Salmonella............................................ 38

Bảng 1.5. Phân loại khoc học chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ......................... 39

Bảng 1.6. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn E.Coli ................................................... 40

Bảng 1.7. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Bacillus cereus ..................................... 42

Bảng 3.1. Tỉ lệ trọng lƣợng phần sử dụng và độ ẩm quả mồng tơi chín ....................... 58

Bảng 3.2. Kết quả đƣờng chuẩn acid gallic ................................................................... 60

Bảng 3.3. Kết quả hàm lƣợng polyphenol tổng trong 4 loại dung môi trích ly quả mồng

tơi chín ............................................................................................................................ 61

Bảng 3.4. Phần trăm ức chế của cao quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác

nhau ( các mẫu tự theo sau các giá trị trong cùng một cột khác nhau thì khác biệt có ý

nghĩa về mặt thống kê ở mức 1%). ................................................................................ 65

Bảng 3.5. Phƣơng trình đƣờng chuẩn và giá trị IC50 của nghiệm thức ......................... 65

Bảng 3.6. Kết quả kháng Bacillus cereus của 4 loại cao chiết ...................................... 67

Bảng 3.7. Kết quả kháng Salmonella của 4 loại cao chiết............................................. 67

Bảng 3.8. Kết quả kháng E.coli của 4 loại cao chiết ..................................................... 68

vi

Bảng 3.9. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của 4 loại cao chiết .......................... 69

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát .......................................................................... 50

Sơ đồ 2.2. Quy trình trích ly và thu hồi cao quả mồng tơi ............................................ 53

Sơ đồ 2.3. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết quả mồng tơi chín

........................................................................................................................................ 56

Sơ đồ 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết từ quả mồng tơi chín vối các dung môi khác

nhau ................................................................................................................................ 59

Sơ đồ 3.2. So sánh hàm lƣợng polyphenol tổng của cao chiết quả mồng tơi chín ở các

dung môi trích ly khác nhau ........................................................................................... 62

Sơ đồ 3.3. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của vitamin C và cao chiết ở các dung môi trích

ly khác nhau. .................................................................................................................. 66

Sơ đồ 3.4. Tổng quát về hoạt tính kháng khuẩn của cao quả mồng tơi chín từ các loại

vii

dung môi khác nhau trên cả 4 chủng vi khuẩn. .............................................................. 70

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây mồng tơi ................................................................................................... 6

Hình 1.2. Quả mồng tơi ................................................................................................... 6

Hình 1.3. Anthocyanin .................................................................................................. 11

Hình 1.4. Một số hợp chất phenol ................................................................................. 13

Hình 1.5. Một số Eucoflavonoid ................................................................................... 15

Hình 1.6. Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin .............................................. 21

Hình 1.7. Cấu trúc của 6 loại phổ biến trong nhóm anthocyanin .................................. 22

Hình 1.8. Cấu trúc của một số anthocyanin tự nhiên. Các anthocyanin tƣơng ứng luôn

đƣợc glycosyl hóa ở nhóm hydroxy C3 ....................................................................... 23

Hình 1.9. Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH ................................................... 25

Hình 1.10. Kỹ thuật chiết lỏng  lỏng ........................................................................... 27

Hình 1.11. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt ............................................................................. 28

Hình 1.12. Kỹ thuật chiết ngâm dầm ............................................................................. 29

Hình 1.13. Bộ chiết Soxhlet .......................................................................................... 30

Hình 1.14. Máy chiết Kumagawa .................................................................................. 31

Hình 1.15. Bộ lôi cuốn hơi nƣớc ................................................................................... 31

Hình 1.16. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn ................................................................ 32

Hình 1.17. Cột chiết pha rắn .......................................................................................... 33

Hình 1.18. Cơ chế kháng khuẩn .................................................................................... 36

Hình 1.19. Vi khuẩn Salmonella ................................................................................... 39

Hình 1.20. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ................................................................ 40

Hình 1.21. Vi khuẩn Escherichia Coli .......................................................................... 41

Hình 1.22. Vi khuẩn Bacillus cereus ............................................................................. 42

Hình 2.1. Quả mồng tơi chín ......................................................................................... 44

Hình 2.2. Kỹ thuật đục lỗ thạch có bổ sung kháng sinh đối chứng ............................... 49

viii

Hình 2.3. Hỗn hợp quả mồng tơi giã nhỏ và dung môi sau khi lắc ............................... 53

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.1. Dịch chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau ................. 58

Hình 3.2. Cao chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau .................. 59

Hình 3.3. Dung dịch đƣờng chuẩn acid gallic ............................................................... 60

Hình 3.4. Đƣờng chuẩn acid gallic ................................................................................ 61

Hình 3.5. Đƣờng chuẩn vitamin C ................................................................................ 63

Hình 3.6. Phản ứng của DPPH và chất chuẩn vitmin C ................................................ 63

Hình 3.7. Đƣờng chuẩn của cao chiết ethanol 30%, 50%, 70%, nƣớc cất (theo thứ tự từ

trên xuống dƣới, từ trái sang phải)…………………………………………………….64

ix

Hình 3.8. Phản ứng của DPPH và cao chiết………………………………………......64

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Từ rất xa xƣa, ngƣời ta đã biết sử dụng các chất màu tự nhiên từ thực vật để tạo

màu cho thực phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm, các chất nhuộm màu có nguồn gốc

tự nhiên chỉ chiếm 6% trong tổng số các chất đƣợc sử dụng để tạo màu. Ngoài việc

chiết xuất các sắc tố này trong tự nhiên, ngƣời ta có thể tổng hợp hóa học, sử dụng các

chất tạo màu nhân tạo. Tuy nhiên, nếu lạm dụng nhiều phụ gia là các chất màu tổng

hợp nhân tạo vào trong thực phẩm sẽ gây ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe con ngƣời. Vì

thế việc nghiên cứu ứng dụng chất màu tự nhiên trong chế biến thực phẩm có ý nghĩa

rất quan trọng, vừa tạo màu sắc tự nhiên, đặc trƣng của sản phẩm, vừa tăng giá trị cảm

quan và đặc biệt là an toàn cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng.

Cây mồng tơi là loại rau xanh ngắn ngày, có thể trồng nhiều vụ trong năm, quen

thuộc với ngƣời Việt Nam trong các bữa ăn hàng ngày. Và do kỹ thuật trồng cây khá

dễ, dễ chăm bón, dễ tìm mua hạt giống hay cây giống nên nhiều gia đình có thể tự

trồng rau mồng tơi tại nhà. Tuy nhiên, chúng ta chỉ thu hoạch và sử dụng lá, phần quả

đƣợc phơi khô làm giống, để rơi rụng hoặc bị cắt bỏ. Quả mồng tơi chín có chứa hợp

chất anthocyanin có nhiều hoạt tính sinh học quý nhƣ khả năng chống oxy hóa cao nên

đƣợc sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, chống

viêm, chống các tia phóng xạ, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, sự phát triển của các

tế bào ung thƣ… Dù vậy, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính của quả

mồng tơi chín có thể ứng dụng trong thực phẩm và y học nhƣng vẫn còn rất hạn chế ở

Việt Nam.

Việc nghiên cứu sản xuất và bổ sung các hợp chất màu đƣợc tách từ thiên nhiên

vào thực phẩm, hạn chế sử dụng phụ gia tổng hợp gây hại cho con ngƣời luôn đƣợc xã

hội quan tâm. Các hợp chất màu trong rau quả đƣợc chia làm bốn nhóm chính:

Chlorophylls, Carotenoids, Flavonoids, Betalains. Mỗi màu sắc đặc trƣng cho một loại

1

rau quả và chứa một vài chất có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, màu sắc này lại không

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

bền theo thời gian và dễ bị ảnh hƣởng bởi những tác động bên ngoài nhƣ: nhiệt độ, pH,

ánh sáng...

Từ những nguyên nhân trên, đề tài “Nghiên cứu tách chiết hợp chất

anthocyanin từ quả mồng tơi chín (Basella alba L.) và khảo sát hoạt tính sinh học”

đƣợc thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tạo màu thực phẩm cũng nhƣ

trong lĩnh vực y dƣợc mang lại nhiều giá trị thực tiễn.

2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc

2.1. Các nghiên cứu trong nƣớc

- Luận văn tốt nghiệp “Anthocyanin – nghiên cứu tách chiết từ cây mồng tơi

Basella ruba L. Và khảo sát khả năng chống oxy hóa, nhận diện hàn the trong

thực phẩm” Ngô Trần Hữu Nghĩa (2014). Đề tài sử dụng dịch chiết từ quả mồng

tơi.

- Luận văn thạc sĩ khoa học “Nghiên cứu tách chiết caroten từ một số loại rau

xanh và ứng dụng phối màu” Nguyễn Vũ Thái Hòa (2011). Trong đó, caroten

đƣợc tách chiết trong rau mồng tơi.

2.2. Các nghiên cứu ngoài nƣớc

- Kumar, S. Sravan, P. Manoj, and P. Giridhar. "A method for red-violet pigments

extraction from fruits of Malabar spinach (Basella rubra) with enhanced

antioxidant potential under fermentation." Journal of food science and

technology 52.5 (2015): 3037-3043. Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của quả

mồng tơi lên quá trình lên men.

- Nirmala, A., S. Saroja, and G. Gayathri Devi. "Antidiabetic Activity of Basella

rubra and its Relationship with the Antioxidant Property." (2011). Vai trò của

rau mồng tơi trong điều trị bệnh tiểu đƣờng.

3. Mục tiêu nghiên cứu

2

- Xác định độ ẩm, tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Khảo sát hàm lƣợng anthocyanin từ quả mồng tơi chín ở các nồng độ dung môi

khác nhau.

- Xác định hàm lƣợng polyphenol trong cao chiết quả mồng tơi chín.

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và khả năng kháng khuẩn của cao chiết quả

mồng tơi chín làm tiền đề cho việc nghiên cứu ứng dụng tạo màu trong thực

phẩm.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên

cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo.

- Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phƣơng pháp

xác định, khảo sát, phân tích.

- Nhiệm vụ 3: Xác định độ ẩm, tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín.

- Nhiệm vụ 4: Thu nhận dịch chiết quả mồng tơi chín bằng kỹ thuật chiết ngâm

dầm trong etanol 30%, 50%, 70% và trong nƣớc cất, đánh giá hàm lƣợng

anthocyanin từ cao chiết.

- Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số từ cao chiết quả mồng tơi

chín.

- Nhiệm vụ 6: Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH.

- Nhiệm vụ 7: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết quả mồng tơi chín.

5. Phƣơng pháp nghiên cứu

- Phƣơng pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu về cây mồng tơi, thành

phần hóa học của lá và quả mồng tơi chín, các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng

các hợp chất thứ cấp, mô hình đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, phƣơng pháp

đục lỗ thạch, sinh vật thí nghiệm.

- Phƣơng pháp làm thí nghiệm: Tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết

3

các nhiệm vụ nghiên cứu.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Phƣơng pháp xử lý số liệu bằng Excel và SAS. Các số liệu thu đƣợc sẽ đƣợc xử

lý nhằm đƣa ra kết luận cho đề tài.

6. Kết quả đạt đƣợc của đề tài

- Xác định đƣợc độ ẩm, tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín.

- Thu nhận đƣợc các loại dịch chiết quả mồng tơi chín bằng kỹ thuật chiết ngâm

dầm trong etanol 30%, 50%, 70% và trong nƣớc cất.

- Đánh giá đƣợc hàm lƣợng anthocyanin từ cao chiết cao chiết.

- Định lƣợng đƣợc polyphenol tổng của các loại cao chiết.

- Tìm ra giá trị IC50, so sánh khả năng kháng oxy hóa và khả năng kháng khuẩn

một số loài vi sinh vật của các loại cao chiết.

7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp

- Mở đầu

- Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu, cơ sở khoa học của đề tài

- Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu

- Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận

- Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị

4

- Tài liệu tham khảo

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây mồng tơi

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại

Cây mồng tơi hay mùng tơi, tầm tơi, tên tiếng anh: Red vine spinach, Creeping

spinach, Climbing spinach, Indian spinach, Asian Spinach, có tên khoa học: Basella alba L. là một cây dây leo, thuộc họ Mồng tơi (Basellaceae).[41] Loài này đƣợc tìm thấy ở Châu Á nhiệt đới và Châu Phi, và đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một loại rau ăn lá.[31]

Chi Mồng tơi (Basella) có nguồn gốc ở các nƣớc Nam Á, lan tỏa và mọc hoang

ở nhiều nƣớc Châu Á nhiệt đới và đƣợc trồng ở Châu Á, Châu Phi, Nam Mỹ và còn

phát triển đến vùng ôn đới thuộc Châu Á và Châu Âu. Phân bố phổ biến ở Châu Phi,

quần đảo Ăngti, Brazil và Châu Á (Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia

và Việt Nam). Ở Việt Nam, cây mọc hoang và đƣợc trồng khắp nơi. Thƣờng gặp ở ven

rừng, trên đất ẩm, trong các đất trồng trọt từ vùng thấp tới vùng cao. Tại Châu Phi nhiệt

đới, nó phổ biến nhất trong khu vực ấm áp, ẩm ƣớt và hiếm thấy ở các khu vực khô hoặc lạnh lẽo của châu lục này.[41]

Bảng 1.1. Phân loại khoa học cây mồng tơi

Giới (regnum) Phân loại khoa học Plantae

(không phân hạng) Angiospermae

(không phân hạng) Eudicots

Bộ (ordo) Caryophyllales

Họ (familia) Basellaceae

Chi (genus) Basella

Loài (species) Basella alba

5

Danh pháp Basella alba L.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1. Cây mồng tơi

Hình 1.2. Quả mồng tơi

1.1.2. Đặc điểm và sinh thái

Cây mồng tơi là cây thuộc loại dây leo quấn, có lá và đọt non ăn đƣợc, sống 1

năm hay 2 năm, thân dạng dây leo mập và nhớt, nhẳn bóng có màu xanh hay tím. Cây

mồng tơi mọc nhanh, dây có thể dài đến 10 m. Rễ chùm mọc sâu trong đất, thích hợp

trồng trên đất tơi xốp. Lá dày hình tim hoặc hình trứng, mọc xen, đơn, nguyên, có

6

cuống, màu xanh, mọng nƣớc. Cụm hoa hình bông mọc ở kẽ lá, màu trắng hay tím đỏ

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

nhạt. Quả mọng, nhỏ, hình cầu hoặc trứng, dài khoảng 5 – 6 mm, màu xanh, khi chín

chuyển màu tím đen. Cây đƣợc trồng ở phần lớn các vùng nhiệt đới để lấy lá và ngọn làm rau ăn và quả mọng có khi đƣợc dùng để nhuộm màu thực phẩm.[41]

Theo Read (1936), trong rau mồng tơi có vitamin A3, vitamin B3, vitamin C,

chất saponin, chất nhầy, chất sắt và canxi. Cây mồng tơi có chứa một số phenolic

phytochemicals và có tính chất chống oxy hóa. Giống nhƣ hầu hết các loại rau khác,

cây mồng tơi có nhiều vitamin A , vitamin C , sắt , và canxi, có lƣợng calo thấp nhƣng

có hàm lƣợng protein khá cao. Chất nhầy mọng nƣớc là một nguồn cung cấp giàu chất xơ hòa tan.[31], [45]

Mồng tơi phát triển tốt dƣới ánh mặt trời đầy đủ trong điều kiện khí hậu nóng

ẩm và ở các khu vực có độ cao thấp hơn 500 mét so với mực nƣớc biển. Cây có nguồn gốc ở các nƣớc châu Á nhiệt đới.[40] Cây phát triển tốt nhất ở đất cát chứa nhiều chất hữu cơ có độ pH dao động từ 5,5 đến 8,0.[31] Ở Việt Nam, mồng tơi đƣợc gieo trồng

chủ yếu trong vụ xuân và thu hoạch suốt vụ hè thu. Gieo trồng từ đầu tháng 3 đến

tháng 5, thu hoạch từ tháng 5 đến tháng 9, nhiệt độ thích hợp 25  30°C. Tuy nhiên ở các tỉnh phía Nam có thể trồng quanh năm.[32]

Có 3 loại giống mồng tơi phổ biến trong sản xuất nhƣ mồng tơi trắng có phiến lá

nhỏ, thân mảnh, thân và lá có màu xanh nhạt; mồng tơi tía có phiến lá nhỏ, thân và gân

lá có màu tím đỏ và mồng tơi lá to nhập từ Trung Quốc, lá dày, màu xanh đậm, phiến

lá to, thân mập, thƣờng đƣợc trồng dày để dễ cắt tỉa cành non, ít nhớt và cho năng suất cao.[33]

1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ, kỹ thuật canh tác cây mồng tơi ở Việt Nam

1.1.3.1. Tình hình trồng trọt và tiêu thụ

Ở Việt Nam, cây mồng tơi chủ yếu mọc hoang và đƣơc trồng khá phổ biến.

Trong chƣơng trình phát triển sản xuất rau an toàn trên địa bàn tỉnh Bà Rịa-

7

Vũng Tàu, giúp ngƣời dân nâng cao hiệu quả sản xuất, đảm bảo sản phẩm an toàn phục

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

vụ nhu cầu xã hội, rau mồng tơi đƣợc trồng phổ biến ở các vùng chuyên canh rau trên

địa bàn tỉnh, đây là loại rau dễ trồng, thời gian sinh trƣởng ngắn có thể trồng nhiều lứa

trong năm, nhu cầu tiêu dùng cao, do vậy tiêu thụ dễ dàng. Để so sánh rau mồng tơi sản

xuất theo tập quán của nông dân với sản xuất theo chuẩn VietGAP, Chi cục Trồng trọt

và Bảo vệ thực vật triển khai mô hình tại vùng chuyên canh rau ở khu phố Kim Sơn,

phƣờng Kim Dinh, thành phố Bà Rịa. Mô hình sản xuất theo VietGAP bón phân theo

quy trình: Phân hữu cơ hoai mục 20 tấn/ha kết hợp 30 kg chế phẩm Trichoderma, phân

vô cơ bón theo công thức: 55N-85P-60K/ha; Ruộng đối chứng: Phân hữu cơ hoai mục

9 tấn/ha, phân vô cơ bón theo công thức: 82N-9P-6K/ha.

Theo dõi tình hình sâu, bệnh hại ở ruộng mô hình và đối chứng đều rất thấp, sự

khác biệt thể hiện rõ nhất đó là tuyến trùng (gây bƣớu rễ) gây hại ở ruộng đối chứng

cao hơn ở giai đoạn 25 ngày sau gieo. Mặt khác, ruộng đối chứng sản xuất theo tập

quán nông dân phun 2 lần thuốc BVTV; lần 1 phun thuốc trừ sâu “Tập kỳ” giai đoạn

18 ngày sau gieo, lần 2 phun thuốc trừ bệnh “Carbenda super” giai đoạn 20 ngày sau

gieo; ngƣợc lại, ruộng mô hình không sử dụng thuốc BVTV.

Kết quả kiểm tra chất lƣợng rau (phân tích định lƣợng) ghi nhận, sản phẩm từ

mô hình và đối chứng đều đạt tiêu chuẩn VietGAP, ngoại trừ chỉ tiêu hàm lƣợng

Nitrate ở ruộng đối chứng “349 mg/kg”cao hơn so với ruộng mô hình “267 mg/kg”. Về

năng suất, mô hình đạt 23,67 tấn/ha/lứa, đối chứng đạt 22,42 tấn/ha/lứa. So sánh về chi

phí sản xuất ở mô hình thấp hơn so với đối chứng ở một số công đoạn nhƣ: công lao

động, chi phí mua thuốc BVTV…do vậy, hiệu quả sản xuất ở mô hình đạt cao hơn so đối chứng 25% (hiệu quả sản xuất mô hình đạt 21,7 triệu đồng/ha/lứa).[44]

 Giống:

1.1.3.2. Kỹ thuật canh tác

Trồng mồng tơi chủ yếu bằng hạt. Hạt mồng tơi dễ mọc nên gieo thẳng trực tiếp

trên luống. Lƣợng hạt giống gieo cho 1,000 m2 là từ 2,5  3 kg. Hạt mồng tơi trồng

8

bằng cách rạch hàng. Dùng cây que nhỏ chọc lỗ để bỏ hạt.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Gieo xong rải thuốc chống kiến, dế, mối trong đất (sử dụng Vibasu 10 H) và

phủ lên trên một lớp rơm mỏng để giúp tạo ẩm độ cho hạt nhanh nẩy mầm và không bị

mất trôi hạt. Tƣới nƣớc để giữ ẩm độ, một tuần sau là hạt nẩy mầm.

 Đất trồng:

Thời vụ: Trồng quanh năm, tốt nhất là đầu mùa mƣa.

Mồng tơi là một loại cây tƣơng đối dễ trồng, thích hợp trên nhiều chân đất khác

nhau nhƣng tốt nhất vẫn là đất, nhiều mùn, giàu dinh dƣỡng, thoát nƣớc tốt.

Trƣớc khi gieo hạt nên cày bừa làm đất thật nhỏ.

Lên luống: Lên luống nổi, chiều dài luống tuỳ theo kích thƣớc vƣờn.

Chiều rộng: 1 – 1,2 m.

Chiều cao mặt luống: 15 – 20 cm.

Các luống cách nhau 0,3 – 0,4m. Có hệ thống thoát nƣớc để có thể thoát nƣớc

 Bón phân (lƣợng phân tính cho 1,000 m2):

mỗi khi có mƣa to và kéo dài.

- Bón lót:

Phân chuồng hoai 1,5 – 2 tấn.

Phân super lân 50 kg.

- Bón thúc: Sau khi gieo hạt khoảng 2 tuần, nên bón bổ sung khoảng 2 kg Urê

và 25 kg bánh dầu kết hợp với việc tỉa cây. Bón phân bằng cách trộn phân vào trong

nƣớc rồi tƣới bằng bình hoa sen trên mặt luống rau, sau khi tƣới phân phải tƣới lại một

 Chăm sóc và tƣới nƣớc:

lần bằng nƣớc lã để rửa sạch phân bám dính trên lá rau.

Mồng tơi dễ sống, ít sâu bệnh hại nên việc chăm sóc chủ yếu là tƣới nƣớc và

bón phân.

Các loại bệnh hại trên mồng tơi chủ yếu là sâu hại, bệnh phổ biến là đốm lá. Áp

9

dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp nhƣ luân canh với cây trồng khác, làm giàn che

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

mƣa, trồng cây trong nhà lƣới, bón phân cân đối nhƣng phải đảm bảo cách ly 10 ngày.

 Thu hoạch:

Đối với bệnh đốm lá có thể sử dụng Daconil 500 SC phun trừ.

Khi cây đạt 40 ngày sau khi gieo là có thể sử dụng đƣợc.

 Giữ giống: Khi thấy cây già thì thôi thu hái, để cho cành nhánh ra quả, tháng

Sau khi thu hoạch bón thúc bằng phân đạm. Cần nhặt sạch cỏ.

10  11 hái quả phơi khô cất để giống.[37]

1.1.4. Thành phần hóa học

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của cây mồng tơi

Giá trị dinh dƣỡng trong 100g rau mồng tơi ( theo tài liệu của Bộ Nông Nghiệp Hoa Kỳ, USDA, 2002)

Năng lƣợng Carbohydrate Chất béo Protein Vitamin A Thiamine (B1) Riboflavin (B2) Niacin (B3) Vitamin B6 Acid ascorbic Folate (B9) Canxi Photpho Sắt 79 kJ (19 kcal) 3,4 % 0,3 % 1,8 % 400 g 0,05 mg 0,155 mg 0,5 mg 0,24 mg 102 mg 140 g 109 mg 52 mg 1,2 mg

10

So sánh với các loại rau ăn lá khác thì rau mồng tơi có độ ẩm cao hơn.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Ngoài ra trong lá rau mồng tơi còn có chứa các chất oligoglycosides, một số

triterpene loại oleanane, bao gồm basellasaponins, betavulgaroside I, spinacoside C và

momordins.

Trong quả mồng tơi có chứa 2 peptide kháng nấm và ribosome  khử hoạt tính

các protein, có hoạt tính kháng virus đã đƣợc phân lập.[42]

Một số hợp chất thứ cấp có mặt trong cây mồng tơi nhƣ: flavonoid

(anthocyanins và betalains) chịu trách nhiệm cho màu của lá và quả (Khan et

al., 2011 ). Hàm lƣợng chất màu của quả thay đổi trong quá trình phát triển của cây để thích ứng với điều kiện môi trƣờng (Biswall 1995 , Lichtenthaler 1996 ).[40]

Hình 1.3. Anthocyanin

1.1.5. Tính vị và công dụng

Theo đông y, rau mồng tơi có tính hàn, vị chua, tán nhiệt, mất máu, lợi tiểu, giải

độc, đẹp da, trị rôm sảy mụn nhọt hiệu quả… rất thích hợp trong mùa nóng.

Những tác dụng chữa bệnh của rau mồng tơi: giảm cholesterol, làm lành vết

thƣơng, tốt cho xƣơng khớp, chữa yếu sinh lý, trị mụn nhọt, say nắng, đẹp da, trị tiểu

khó, chữa bỏng, lợi sữa, trĩ, thanh nhiệt, giải độc, chữa táo bón…

Trong mồng tơi chứa chất nhầy pectin rất quý để phòng chữa nhiều bệnh, làm

11

cho rau mồng tơi có tác dụng nhuận tràng, thải chất béo chống béo phì, thích hợp cho

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

ngƣời có mỡ và đƣờng cao trong máu. Tác dụng trừ thấp nhiệt, làm cho ngƣời lao động

ngoài trời nắng nóng duy trì đƣợc sức khỏe, phòng chống bệnh tật nhƣ mỏi mệt háo

khát, bứt rứt (Theo BS. Phó Thuần Hƣơng  sức khỏe và đời sống).[43]

Rau mồng tơi chứa nhiều chất dinh dƣỡng, 1/2 chén rau mồng tơi nấu chín cung

cấp 90% lƣợng vitamin A và 20% chất sắt khuyến cáo cho chế độ ăn hằng ngày. Tuy

nhiên, rau mồng tơi có thể gây ra một số tác dụng phụ, gây khó chịu nếu ăn nhiều nhƣ: gây hấp thu kém, sỏi thận, tạo mảng bám rang, khó chịu trong dạ dày.[46]

Ở một số nƣớc Châu Phi và Nam Á quả chín của cây mồng tơi đã đƣợc sử dụng

để nhuộm, nƣớc ép quả màu tím đỏ có thể đƣợc sử dụng nhƣ mực in, mỹ phẩm và chất màu thực phẩm.[42]

1.2. Hợp chất Phenol, Flavonoid, Anthocyanin

1.2.1. Phenol

1.2.1.1. Đại cương về hợp chất phenol

Các hợp chất phenol là các hợp chất mà trong cấu trúc có một hoặc nhiều vòng

thơm (vòng benzen) mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxyl –OH. Trong thiên

nhiên các hợp chất phenol là flavonoid, xanthan, coumarin, quinon, các phenol đơn

vòng, các polyphenol (lignin, tannin…).

Các hợp chất phenol là một nhóm chính trong số các hợp chất có nguồn gốc thứ

cấp, chiếm một vị trí quan trọng trong đời sống thực vật với số lƣợng lớn và rất phong

phú về cấu tạo. Chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh lý và sinh hoá quan trọng, vào

các quá trình trao đổi chất dƣới nhiều hình thức khác nhau nhƣ quá trình hô hấp tế bào

(vận chuyển H+ trong quá trình photphoryl hoá, oxy hoá ...), quá trình quang hợp, điều hòa sinh trƣởng phát triển của thực vật… [4], [10] Thực vật có khả năng tổng hợp hàng

12

ngàn hợp chất monophenol, diphenol...và polyphenol, tùy theo có một, hai hay nhiều nhóm hydroxyl đính trực tiếp vào nhân benzen (Ngô Xuân Mạnh, 2006). [10]

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2.1.2. Phân loại

Dựa vào số lƣợng nhóm hydroxyl mà ngƣời ta chia thành 2 nhóm: phenol đơn

giản và phenol phức tạp (polyphenol).

Nhóm phenol đơn giản: gồm các chất đƣợc cấu tạo từ 1 vòng benzen và 1 hay

nhiều nhóm OH, đƣợc phân thành các: monophenol; diphenol (pyrocatechin,

rezoxyn...); triphenol (pyrogalon, oxy hydroquinon...).

Nhóm hợp chất phenol phức tạp (polyphenol): trong thành phần cấu tạo, ngoài

vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh, đƣợc phân thành các nhóm: monomer và

polymer.

- Monome hay polyphenol đơn giản

• Nhóm C6 – C1 (acid phenol cacbonic, acid gallic, protocachein,..): trong cấu

trúc phân tử có thêm nhóm cacbonyl, thƣờng gặp ở hạt nảy mầm.

• Nhóm C6 – C3 (acid cumaric, acid cafeic,..): có gốc cacbonyl đƣợc nối với

nhân benzen qua hai nguyên tử cacbon, thƣờng gặp ở thực vật bậc cao.

• Nhóm C6 – C3 – C6: gọi là các flavonoid và đƣợc chia thành các nhóm phụ

nhƣ flavon (quecetin, kampherol,..), flavonol (sắc tố vàng) (epicatechin,

epigallocatechin,..), anthocyanidin (sắc tố xanh, đỏ và tím) (anthocyanin),

catechin (không màu)…

• Nhóm hợp chất polyphenol polymer: đƣợc chia thành các nhóm phụ nhƣ

Tanin, Lignin, Acid Humic… [4]

13

Hình 1.4. Một số hợp chất phenol

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2.1.3. Tính chất và chức năng

Các polyphenol có chứa gốc pyrocatechic hoặc pyrogalic nên chúng có thể tham

gia phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng cộng và ngƣng tụ:

- Phản ứng oxy hóa – khử: dƣới tác dụng của enzym polyphenol oxydase, các

polyphenol bị oxy hóa tạo thành quinon.

- Phản ứng cộng: khi có mặt các acid amin thì các quinon này sẽ tiến hành phản

ứng cộng với acid amin để tạo thành các octoquinon tƣơng ứng.

- Phản ứng ngƣng tụ: các octoquinon này dễ dàng ngƣng tụ với nhau để tạo

thành các sản phẩm có màu gọi chung là flobafen.[9]

Đối với thực vật, các hợp chất polyphenol đảm nhận các chức năng sau (Ngô

Xuân Mạnh, 2006):

- Polyphenol tạo màu sắc (màu đỏ dâu tây, táo, màu tím của sim, khoai tây…)

- Tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử.

- Điều hòa sinh trƣởng thực vật:

+ Kìm hãm sự nảy mầm của hạt.

+ p-cumaric acid kích thích sự sinh trƣởng của cây.

- Quyến rũ côn trùng, chim trong việc thụ phấn và phát tán hạt.

- Chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật, nấm bệnh phá hoại cây. Ví dụ salisilic

acid do cây sồi tiết ra có tác dụng diệt khuẩn.

Đối với cơ thể con ngƣời (Massimo D’Archivio, 2007):

Polyphenol đƣợc chú ý đến bởi khả năng chống oxy hóa của chúng. Chúng có

khả năng chuyển electeron trong chuỗi hô hấp bình thƣờng định cƣ trong cơ thể. Chúng

có đƣợc khả năng đó là do chúng có khả năng tạo phức bền với các kim loại nặng, do

đó làm mất hoạt tính xúc tác của chúng, đồng thời chúng có khả năng dập tắt các quá

trình tạo ra các gốc tự do.

14

- Ngoài ra, polyphenol còn có khả năng ức chế sự phát triển của vi nấm.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

- Hiện nay nhiều tài liệu nghiên cứu polyphenol có khả năng chống và ức chế

các tế bào ung thƣ và sự hấp thụ tia tử ngoại.[9]

1.2.2. Flavonoid

1.2.2.1. Đại cương về flavonoid

Flavonoid là những hợp chất thứ cấp thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau,

quả, hoa…Phần lớn các flavonoid có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy,

một số các sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng đƣợc xếp vào nhóm này vì về

mặt hóa học, chúng có cùng khung sƣờn căn bản.

Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 – diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen A

và B nối nhau qua một dây có 3 carbon, nên thƣờng đƣợc gọi là C6 – C3 – C6. Thƣờng

các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí

3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycoside.

Các đƣờng thƣờng gặp nhất là đƣờng D  glucose, kế đó là D  galactose, L 

rhamnose, L  arabinose, D  xylose, D  apiose và acid uronic. [4]

1.2.2.2. Phân loại

Flavonoid có cấu trúc mạch C6  C3  C6, đều có 2 vòng thơm. Tùy thuộc vào

cấu tạo phần mạch C3 trong bộ khung C6  C3 C6, flavonoid đƣợc phân thành các

[27]:

nhóm sau flavon, flavonol, flavanol, flavanon, chalcon, anthocyanin,

anthocyanidin.

15

Hình 1.5. Một số Eucoflavonoid

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Flavon rất phổ biến trong thực vật: Thông, Hoàng cầm (rễ), Mè (lá), Anh thảo,

cây la apirenin và luteolin.

Chalcon có chủ yếu ở trong một số cây họ Cúc  Asteraceae tập trung nhiều

nhất ở vỏ cây, gỗ lõi (Keo, Bạch đàn, Dẻ, Đậu tƣơng, Trinh nữ hoàng cung, Dƣơng

xỉ…). Không tìm thấy ở động vật.

Isoflavonoid: Isoflavon, isoflavanon, rotenoid.

Neoflavonoid: neoflavon và calophylloid

1.2.2.3. Lý tính

Trong tự nhiên các hợp chất này thƣờng tồn tại dƣới dạng glycoside, dễ tan

trong nƣớc và dung môi phân cực, dễ bị thủy phân trong môi trƣờng axit, kiềm nhẹ

hoặc bởi enzyme β – glucosidase, emulsin.

Có mùi thơm và vị đắng chát đặc trƣng. Do các nối đôi liên hợp mà các

flavonoid thƣờng có màu, đặc biệt là màu vàng. Nếu các nối đôi bị phá vỡ thì hợp chất

16

sẽ mất màu.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Có khả năng hấp thụ tia tử ngoại do có hệ thống nối đôi liên hợp. Thƣờng thu

đƣợc 2 dải hấp thụ cực đại, dải 1 có λ max = 240 – 280 nm, dải hấp thụ 2 thƣờng cố

định dài hơn dải 1 và giữ 2 dải thƣờng có 1 vai phụ, đặc biệt là đối với flavon và

flavonol. Tùy theo pH của môi trƣờng và điều kiện tạo muối và phức với các kim loại (K, Na, Fe hoặc Al) mà các bƣớc sóng hấp thụ có thể chuyển dịch.[33]

1.2.2.4. Hóa tính

Flavonoid đa dạng về cấu trúc hóa học vì vậy khả năng phản ứng hóa học của

chúng rất lớn.

- Phản ứng oxy hóa: các flavonoid rất dễ bị oxy hóa. Quá trình này có kèm

theo sự mở vòng pyron và đó cũng là nguyên nhân gây ra tác dụng của

flavonoid đối với các enzyme oxy hóa khử (oxydoreductase). Nhiều phản

ứng oxy hóa khác nhƣ với AgNO3, KMnO4…vẫn đƣợc dùng để định tính và

định lƣợng flavonoid.

- Phản ứng với kiềm: do các nhóm OH có nhóm axit nên dễ phản ứng với các

hydroxit kiềm tạo muối tạo muối tan trong nƣớc, khi có nhóm C=O

(cacbonyl) trong phân tử thì tính axit lại càng tăng thêm và flavonoid có thể

tan trong dung dịch NaHCO3.

- Phản ứng este hóa: trong thiên nhiên ít gặp các este của phenol, nhƣng trong

thí nghiệm in vitro, các nhóm OH của phenol thƣờng dễ cho este, thƣờng

gặp là este metylic.

- Phản ứng tạo phức với kim loại: Nhóm OH thƣờng tạo phức với AlCl3,

NaOH, KOH,…cho màu vàng đặc trƣng và nhóm chức này cũng là nguyên

nhân làm cho các flavonoid tự nhiên có ái lực mạnh với các ion kim loại

nặng có hóa trị 2 nhƣ Fe, Cu, Zn,…và có thể tạo phức chất bền vững với các

nguyên tố thuộc chu kỳ 4. Những kim loại này thƣờng có trong các tế bào

sinh vật dƣới dạng các nguyên tố vi lƣợng cần thiết cho sự sinh tồn của tế

17

bào. Mặt khác, các flavonoid có thể ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do có

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

hại bằng cách kết hợp với những ion kim loại nặng (Fe, Mn) vốn là những tác

nhân xúc tác nhiều quá trình sinh hóa làm xuất hiện các gốc tự do.

- Tạo liên kết hydro: các nhóm OH tự do rất dễ nối với nhau bởi các liên kết

hydro nội phân tử hoặc giữa các phân tử. Hiện tƣợng này ảnh hƣởng nhiều

đến những tính chất hóa lý học nhƣ độ sôi, độ nóng chảy, tính hòa tan,…Khả năng phản ứng cũng có thể giảm đi đáng kể.[31]

1.2.2.5. Hoạt tính sinh học

Flavonoid là một nhóm các hợp chất đƣợc gọi là "những ngƣời thợ sửa chữa

sinh hóa của thiên nhiên" nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại các

hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung thƣ.

Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy

hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng.

Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thƣờng là các gốc tự do nhƣ OH,

ROO (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thƣ, tăng nhanh sự lão hoá…).

Một trong những nhóm flavonoids thực vật hữu ích nhất là proanthocyanidins

(còn đƣợc gọi là procyanidins). Nhóm này mang lại rất nhiều ích lợi cho sức khỏe. Mỗi

proanthocyanidins liên kết với các loại proanthocyanidins khác.

Một hỗn hợp gồm các proanthocyanidins liên kết với nhau dạng dime,

trime…polime đƣợc gọi chung là procyanidolic oligomer, gọi tắt là PCO.

Năm 1986, Jacques Masquelier là ngƣời khám phá ra các đặc tính chống oxy

hóa và thu dọn gốc tự do của PCO. Nhiều phƣơng pháp hiện đại và phức tạp đã chứng

minh hoạt động bảo vệ mạch máu của PCO và tạo cơ sở vững chắc cho việc sử dụng

PCO trong điều trị các bệnh lý mạch máu. Các phƣơng pháp này cho thấy PCO có khả

năng:

- Bắt giữ gốc tự do hydroxyl.

- Bắt giữ lipide peroxide.

18

- Làm chậm trễ đáng kể sự khởi đầu của quá trình peroxide hóa lipide.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

- Kìm giữ các phân tử sắt tự do, giúp ngăn chặn sự peroxide hóa lipide do sắt.

- Ức chế sự sản sinh ra gốc tự do bằng cách ức chế không cạnh tranh men

xanthin oxidase.

- Ức chế sự tổn thƣơng do các enzyme (hyaluronidase, elastase, collagenase...)

có thể làm thoái hóa cấu trúc mô liên kết.

Các flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng

nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá. Do đó, các chất flavonoid có

tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não, lão hoá,

thoái hoá gan, tổn thƣơng do bức xạ.

Năm 1936, Szent Gyorgy, dƣợc sĩ ngƣời Hungari tách từ ớt và quả chanh một

chất cùng với vitamin C có tác dụng chữa đƣợc chứng chảy máu mao mạch, củng cố

thành mạch, ông gọi là vitamin C2 hoặc vitamin P (P là chữ đầu của từ tiếng Pháp

perméabilité  có nghĩa là tính thấm). Về sau ngƣời ta thấy trong giới thực vật có nhiều

hợp chất thứ cấp có đặc tính tƣơng tự vitamin P và đặt cho chúng một tên chung là

Flavonoid.

Lavollay, Neumann Porrot (1941, 1942) đã chứng minh catechin có tác dụng

mạnh hơn vitamin C trong việc giữ bền thành mạch.

Thực nghiệm cho thấy các Flavonoid có các nhóm OH ở vị trí 3,4 có tác dụng

tốt đối với sự nâng cao tính bền vững của thành mạch. Rutin là chất tiêu biểu về tác

dụng này.

Hyaluronidase là enzym làm tăng tính thấm của mao mạch, khi thừa enzyme

này sẽ xảy ra hiện tƣợng xuất huyết dƣới da. Flavonoid ức chế sự hoạt động của

hyaluronidase.

Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid nhƣ quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các

catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích phút của tim....

Các flavonoid có tác dụng củng cố, nâng cao sức chống đỡ và hạ thấp tính thẩm thấu

19

các hồng huyết cầu qua thành mạch thông qua tác dụng lên các cấu trúc màng tế bào

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

của nó. Hay nói cách khác, vitamin P và flavonoid nói chung duy trì độ mềm dẻo của

thành mạch, ứng dụng vào điều trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu

tĩnh mạch.

Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thƣơng tổn gan, bảo vệ chức

năng gan.

Nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, favanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ

rệt, nhƣ là các flavonoid có trong lá Diếp cá, trong cây Râu mèo…

Các dẫn xuất của kaempferol, quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần

hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những ngƣời có biểu

hiện lão suy, rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung, hay cáu

gắt…

Quercetin là một flavonoid làm xƣơng sống cho nhiều loại flavonoid khác, gồm

rutin, quercitrin, hesperidin – các flavonoid của cam quít. Những dẫn xuất này khác với

quercetin ở chỗ chúng có các phân tử đƣờng gắn chặt vào bộ khung quercetin.

Quercetin là một flavonoid bền vững và hoạt động nhất trong các nghiên cứu, và nhiều

chế phẩm từ thảo dƣợc có tác dụng tốt là nhờ vào thành phần quercetin với hàm lƣợng

cao.

- Quercetin có khả năng chống oxy hóa và tiết kiệm lƣợng vitamin C sử dụng,

giúp tích lũy vitamin C trong các mô tổ chức.

- Quercetin có khả năng chống viêm do ức chế trực tiếp hàng loạt phản ứng

khởi phát hiện tƣợng này: ức chế sự sản xuất và phóng thích histamin và các

chất trung gian khác trong quá trình viêm và dị ứng.

- Quercetin ức chế men aldose reductase rất mạnh, men này có nhiệm vụ

chuyển glucose máu thành sorbitol  một hợp chất liên quan chặt chẽ với sự

20

tiến triển các biến chứng của đái tháo đƣờng (đục thủy tinh thể do đái tháo đƣờng, thƣơng tổn thần kinh, bệnh võng mạc,..).[34]

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2.3. Anthocyanin

1.2.3.1. Đại cương về anthocyanin

Các anthocyanin hiện thuộc nhóm các chất màu tự nhiên tan trong nƣớc lớn nhất

trong thế giới thực vật. Thuật ngữ anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó

anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos – nghĩa là hoa và Kysanesos – nghĩa là màu xanh.[15] Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh, anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rƣc rỡ khác nhƣ hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian.[6]

Anthocyanin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid, có khả năng hòa tan trong nƣớc và

chứa trong các không bào. Về bản chất, các Anthocyanin là những hợp chất glycoside

của các dẫn xuất polyhydroxy và polymethoxy của 2phenylbenzopyrylium hoặc

muối flavylium. Anthocyanin là những glycosid do gốc đƣờng glucose, galactose.. kết

hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin). Aglucon của chúng có cấu trúc cơ bản.

Các gốc đƣờng có thể đƣợc gắn vào vị trí 3,5,7; thƣờng đƣợc gắn vào vị trí 3 và 5 còn

vị trí 7 rất ít. Phân tử anthocyanin gắn đƣờng vào vị trí 3 gọi là monoglycozit, ở vị trí 3

và 5 gọi là diglycozit. Các anthocyanin khi mất hết nhóm đƣờng đƣợc gọi là

anthocyanidin hay aglucon.

Hình 1.6. Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin

Cho đến nay, ngƣời ta đã xác định đƣợc hơn 500 anthocyanin, 30

21

anthocyanidin, 18 loại aglucon khác nhau, trong đó 6 loại phổ biến nhất là

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

pelargonidin, cyanidin, delphinidin, peonidin, petunidin và maldivin.[9] Mỗi

anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylate bởi các loại đƣờng và các acid khác tại

các vị trí khác nhau. Vì thế lƣợng anthocyanin lớn hơn anthocyanidin từ 15  20 lần.

Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm

ở hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ. Trong những loại thƣc vật này, anthocyanin

đƣợc tìm thấy chủ yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài nhƣ biểu bì.

Các hợp chất anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực phẩm (Bridle và Timberlake, 1996).[19]

Các họ thực vật nhƣ vitaceae (nho) và rosaceae (cherry, dâu tây, mâm xôi, táo,…) là

các nguồn anthocyanin chủ yếu. Bên cạnh đó còn có các họ thực vật khác nhƣ

solanceae ( cà tím), saxifragaceae (quả lý đỏ và đen), ericaceae (quả việt quốc) và

brassicaceae (bắp cải tím). Các loại anthocyanin phổ biến nhất là các glucoside của

cyanidin, kế đến là pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và maldivin.

Số lƣợng các 3–glucoside nhiều gấp 2,5 lần các 3,5–glucoside. Loại anthocyanin hay

gặp nhất chính là Cyaidin3glucoside.[12]

22

Hình 1.7. Cấu trúc của 6 loại phổ biến trong nhóm anthocyanin

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2.3.2. Phân loại

Trong tự nhiên, Anthocyanin rất hiếm khi ở trạng thái tự do (không bị glycosyl

hóa). Nhóm hydroxy tự do ở vị trí C3 làm cho phân tử anthocyanidin trở nên không

ổn định và làm giảm khả năng hòa tan của nó so với anthocyanin tƣơng ứng. Vì vậy,

sự glycosyl hóa luôn diễn ra, đầu tiên ở vị trí nhóm 3hydroxy. Nếu có thêm một

phân tử đƣờng nữa, vị trí tiếp theo bị glycosyl hóa thƣờng gặp nhất là ở C5. Ngoài

ra, sự glycosyl hóa còn có thể gặp ở các vị trí C7, C3’, C5’.

Loại đƣờng phổ biến nhất là glucose, ngoài ra cũng có một vài loại

monosaccharide (nhƣ galactose, rammose, arabinose), các loại disaccharide (chủ yếu

là rutinose, sambubiose hay sophorose) hoặc trisaccharide tham gia vào quá trình

glycosyl hóa.

Sự methoxyl hóa các anthocyanin và các glucoside tƣơng ứng diễn ra thông

thƣờng nhất là ở vị trí C3’ và C5’, cũng có thể gặp ở vị trí C7 và C5. Tuy nhiên,

cho đến nay, ngƣời ta vẫn chƣa tìm thấy môt hợp chất nào bị glycosyl hóa hay bị

methoxyl hóa trên tất cả các vị trí C3, 5, 7 và 4’ do cần thiết phải còn ít nhất một

nhóm hydroxyl tự do ở C5, 7 hay 4’ để hình thành dạng cấu trúc quinonoidal base

(dạng cấu trúc của anthocyanin thƣờng tồn tại trong không bào thực vật có pH từ 2,5 –

7,5).

Hình 1.8. Cấu trúc của một số anthocyanin tự nhiên. Các anthocyanin tƣơng ứng luôn

23

đƣợc glycosyl hóa ở nhóm hydroxy C3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Sự acyl hóa cũng có thể xảy ra ở vị trí C3 của phân tử đƣờng hay ester hóa ở

nhóm hydroxy C6. Các nhóm acyl hóa chính là các phenolic acid nhƣ ρcoumeric,

caffeic, ferulic hay sinapic acid và một loạt các acid nhƣ acetic, malic, malonic, axalic

và succinic.

1.2.3.3. Lý tính

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá

phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực.[2]

Anthocyanin hòa tan tốt trong H2O, C2H5OH, CH3OH, …, trong đó khả năng tan trong CH3OH–HCl và C2H5OH–HCl là tƣơng đƣơng nhau và cao nhất.[2]

Anthocyanin có bƣớc sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực

đại tại bƣớc sóng 510 ÷ 540nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc

của các anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ anthocyanin:

thƣờng pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh.[2]

1.2.3.4. Hóa tính

Màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều

yếu tố khác,… Khi tăng số lƣợng nhóm OH trong vòng benzene thì màu càng xanh đậm.[2]

Mức độ methyl hóa các nhóm OH ở vòng benzene càng cao thì màu càng đỏ.

Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đƣờng thì màu sắc cũng sẽ thay đổi theo số lƣợng các gốc đƣờng đƣợc đính vào nhiều hay ít.[6]

Các Anthocyanin cũng phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trƣờng[2]:

 Khi pH > 7 các Anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các Anthocyanin

có màu đỏ.

 Ở pH = 1 các Anthocyanin thƣờng ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ.

 Ở pH = 4~5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ Cacbinol hay bazơ

24

Chalcon không màu.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

 Ở pH = 7~8 lại về dạng bazơ Quinoidal Anhydro màu xanh.

Hình 1.9. Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH

Màu sắc của anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ ở trên polysaccharide.

Khi đun nóng lâu dài các anthocyanin có thể phá hủy và mất màu.[2]

Tóm lại, trong môi trƣờng acid, các anthocyanin là những bazơ mạnh và có thể

tạo muối bền vững với acid. Anthocyanin cũng có khả năng cho muối với bazơ. Nhƣ

vậy chúng có tính chất amphote. Muối với acid thì có màu đỏ, còn muối với kiềm thì có màu xanh. [2]

1.2.3.5. Hoạt tính sinh học

Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm, có vai trò tạo điều

kiện cho sự thụ phấn, phát tán do hình thành nên màu sắc sặc sỡ trên cành hoa và quả.

Mặt khác, anthocyanin là chất có khả năng hấp thụ tia UV cho phép bảo vệ bộ gen của

thực vật trƣớc nhóm tác nhân có thể gây đột biến gen này. Sinh tổng hợp anthocyanin ở

vỏ đƣợc tăng cƣờng để đáp ứng phù hợp với môi trƣờng: hạn hán, ánh sáng mạnh,

nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phospho, nhiễm nấm, vi khuẩn, tổn thƣơng, côn trùng, ô nhiễm…[9]

25

Đối với sức khỏe của con ngƣời, theo nghiên cứu của David Heber, Đại học Harvard (Mỹ)[17], các anthocyanin có thể cắt đƣợc cơn đau tim, giảm thiểu các tổn

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

thƣơng não liên quan đột quỵ và ngăn cản sự tạo thành các cục máu đông trong lòng

mạch máu (nguyên nhân dẫn đến tắc mạch, gây tai biến mạch máu não và những cơn

nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế sự suy giảm sức đề kháng.

Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả năng chống oxy hóa cao, anthocyanin đƣợc

sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa cho thực phẩm.[27] Ngoài các tác dụng chống oxy hóa, anthocyanin còn đƣợc sử dụng nhƣ chất

màu tự nhiên tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm và khá an toàn. Ví dụ: Dịch

chiết anthocyanin từ các loại rau củ có màu đỏ nhƣ vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai

lang… đã đƣợc dùng để làm chất màu thay thế màu tổng hợp trong sản xuất kẹo cứng.[27]

Anthocyanin bên cạnh vai trò là màu thiên nhiên đƣợc sử dụng trong thực phẩm, còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý nhƣ [9], [25]: Khả năng chống oxy hóa

cao, chống lão hóa, tăng cƣờng sức đề kháng, điều hòa lƣợng đƣờng huyết của những

bệnh nhân đái tháo đƣờng, làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của

các tế bào ung thƣ, tác dụng chống các tia phóng xạ... Các ứng dụng trên đã mở ra một

triển vọng về việc sản xuất thực phẩm, thực phẩm chức năng chữa bệnh có hiệu quả. [16], [27]

1.3. Các phƣơng pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật

Định nghĩa:

Tách chiết là phƣơng pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô

thực vật. Sản phẩm thu đƣợc của quá trình tách chiết là một dung dịch chứa các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này đƣợc gọi là dịch chiết.[4]

1.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng

Nguyên tắc:

Sự chiết lỏng – lỏng là dung môi không phân cực (eter dầu hòa...) sẽ hòa tan tốt

các hợp chất không phân cực (các alcol béo, ester béo…), dung môi phân cực trung

26

bình (dietyl eter, chloroform…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

(các hợp chất có chứa nhóm chức eter O, aldehyde CH=O, ceton CO, ester

COO…) và dung môi phân cực mạnh (methanol…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có

tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức OH, COOH…).[4]

Kỹ thuật này còn đƣợc gọi là sự chiết bằng dung môi (Solvent extraction). Cao

alcol ban đầu hoặc dung dịch ban đầu đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân

cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập đƣợc riêng những hợp chất tinh khiết để

thực hiện các khảo sát tiếp theo. Kỹ thuật chiết lỏng  lỏng đƣợc áp dụng để phân chia

cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực

khác nhau.

Việc chiết đƣợc thực hiện lần lƣợt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung

môi phân cực ví dụ nhƣ: ete dầu hỏa hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate,

buthanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết đƣợc thực hiện nhiều lần, mỗi lần

một lƣợng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi

thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực cao hơn. Dung dịch của các lần chiết

đƣợc gom chung lại, làm khan nƣớc với các chất làm khan nhƣ Na2SO4, MgSO4,

CaSO4…, đuổi dung môi ta thu đƣợc cao chiết.

27

Hình 1.10. Kỹ thuật chiết lỏng  lỏng

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.3.2. Kỹ thuật chiết lỏng – rắn

1.3.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng khá phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém,

phức tạp.

Nguyên tắc:

Dung môi chảy rất chậm qua khối nguyên liệu đựng trong bình ngấm kiệt bằng

thủy tinh, hình trụ đứng, dƣới đáy là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch

chảy ra, một bình chứa đặt bên dƣới để hứng dung dịch chiết, phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng chứa dung môi tinh khiết.[4] Trong suốt quá trình không khuấy

trộn. Nguyên liệu luôn đƣợc tiếp xúc với dung môi, vận tốc dung môi chảy vào bình

chứa nguyên liệu bằng vận tốc dung môi chảy ra , tạo ra sự chênh lệch nồng độ hoạt chất cao nên có thể chiết kiệt đƣợc hoạt chất.[36]

Ƣu điểm: dịch chiết đƣợc chiết kiệt, dung dịch chiết đậm đặc.[36]

Hình 1.11. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

1.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm

Nguyên tắc:

Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp nguyên liệu đã

đƣợc cắt nhỏ trong thời gian nhất định để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào

28

thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên, sau đó dung dịch chiết đƣợc lọc ngang qua

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ đƣợc cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào

bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một lần nữa cho đến khi chiết kiệt

mẫu cây.

Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột

cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung

dịch chiết bị trào ra ngoài).

Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một lƣợng ít dung môi.

Dung môi sau khi đƣợc thu hồi, đƣợc làm khan nƣớc bằng các chất làm khan và

đƣợc tiếp tục sử dụng để chiết lần sau.[4]

Hình 1.12. Kỹ thuật chiết ngâm dầm

1.3.2.3. Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet

Nguyên tắc:

Nguyên liệu đƣợc cho vào một túi vải rồi đặt vào ngăn chiết. Dung môi tinh

khiết đƣợc cho vào bình cầu và đun hồi lƣu. Dung môi bốc hơi lên đƣợc ngƣng tụ

xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông xuống bình cầu bên dƣới, mang

theo các chất hòa tan từ dƣợc liệu. Ở bình cất, chất tan đƣợc giữ lại, dung môi bốc hơi

lên ngƣng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp nguyên liệu để hòa tan các chất tan còn lại. Tiếp tục cho đến khi nguyên liệu đƣợc chiết kiệt.[36]

Các hợp chất đƣợc hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh

khiết là đƣợc bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết. Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất

trong bột cây (dung môi eter dầu hỏa chỉ chiết kiệt những chất kém phân cực nào có

29

thể tan đƣợc trong eter dầu hỏa nóng).

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài,

rút lấy một giọt dung môi và thử trên mặt kiếng, nếu thấy không còn vết gì trên kiếng

là đã chiết kiệt. Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu, đuổi dung môi, thu đƣợc cao chiết.[4]

Ƣu điểm: quá trình chiết liên tục, ít tốn dung môi hơn các phƣơng pháp trên,

dịch chiết không cần phải lọc.

Nhƣợc điểm: các chất không bền với nhiệt độ sôi sẽ bị phá hủy, không thể

khuấy trộn.

Hình 1.13. Bộ chiết Soxhlet

1.3.2.4. Kỹ thuật chiết bằng máy Kumagawa

Sử dụng máy chiết Kumagawa với thiết bị, nguyên tắc giống nhƣ máy chiết

Soxhlet, chỉ khác ở túi đựng bột cây đƣợc đặt gần nguồn nhiệt hơn.

Có thể cải biến kỹ thuật này với dụng cụ thủy tinh đơn giản có thể dễ dàng tìm

thấy trong phòng thí nghiệm: bình cầu (ngâm bột cây trực tiếp trong bình này) và ống

ngƣng hơi. Sau một thời gian đun cần thiết, dung dịch chiết đƣợc rót ra và lọc ngang

30

giấy lọc. Dung môi đƣợc cho vào bình cầu và tiếp tục chiết vài lần nhƣ thế đến khi chiết kiệt.[4]

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.14. Máy chiết Kumagawa

1.3.2.5. Phương pháp chưng cất

Nguyên tắc:

Khi đun sôi một hỗn hợp lỏng, chất nào có nhiệt độ thấp hơn sẽ chuyển thành

hơi sớm hơn và nhiều hơn. Khi gặp lạnh, hơi sẽ ngành tụ thành dạng lỏng chứa chủ yếu

là chất có nhiệt độ sôi thấp hơn. Quá trình đó gọi là sự chƣng cất.

Hình 1.15. Bộ lôi cuốn hơi nƣớc

Sự lôi cuốn hơi nƣớc thƣờng đƣợc thực hiện trên cây tƣơi mới thu hái về. Mẫu

cây đƣợc cắt nhuyễn, đƣợc đặt vào bình cầu, cho nƣớc cất vào bình sao cho phần thể

tích mẫu cây và nƣớc chỉ chiếm tối đa 2/3 thể tích bình cầu. Lấp hệ thống và cắm bếp

31

điện đun nóng.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Nƣớc trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nƣớc bay lên

mang theo tinh dầu, hơi này bị ống ngƣng hơi làm lạnh, ngƣng tụ trở lại thể lỏng, rớt

xuống ống gạn. Trong ống gạn, dung dịch tách thành 2 lớp gồm lớp nƣớc và lớp tinh dầu.[4]

1.3.2.6. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn

Nguyên tắc:

Đối với một chất thông thƣờng, dƣới mỗi điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở

một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái rắn, lỏng hoặc khí. Nếu nén chất khí tới một áp

suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở đó, nếu nâng

dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một

vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical). Vật chất ở trạng

thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó mang

tính trung gian giữa khí và lỏng.

Hình 1.16. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn

Vì vậy khi CO2 đƣợc đƣa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ tới hạn (31 ),

áp suất tới hạn (73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn.

Tại trạng thái này, CO2 có khả năng hòa tan rất tốt các đối tƣợng cần tách ra

khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí. Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần

giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản

32

phẩm đƣợc tháo ra ở bình hứng.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trích ly bằng phƣơng pháp CO2 siêu tới hạn cho các sản phẩm tự nhiên có hoạt

tính sinh học cao. Kỹ thuật này sử dụng CO2 ở áp suất cao và nhiệt độ vừa phải để trích

ly nên các hợp chất có hoạt tính sinh học cao sẽ không bị phân hủy. Sự thay đổi áp suất

và nhiệt độ sẽ làm thay đổi tính chọn lọc các chất hòa tan, nhờ đó có thể phân đoạn sản

phẩm ly trích ở các nồng độ cao thấp khác nhau. CO2 sau khi trích sẽ hoàn toàn tách ra

ở dạng khí sau khi giảm áp nên sản phẩm có thể đƣợc coi là 100% sạch không dung môi độc hại, đem lại giá trị sử dụng và giá trị thƣơng mại cao cho sản phẩm trích ly.[38]

1.3.2.7. Kỹ thuật chiết pha rắn

Nguyên tắc:

Chiết pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa hai

pha lỏng và rắn. Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nƣớc hoặc dung môi hữu

cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn.

Pha rắn (còn đƣợc gọi là pha tĩnh) thƣờng là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt

oxit nhôm, silica gel trung tính đã đƣợc ankyl hoá nhóm –OH bằng các gốc

hydrocarbon mạch thẳng C2, C4, C8, C18,… hay nhân phenyl, các polyme hữu

cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính… Các hạt này đƣợc nhồi vào cột chiết nhỏ

(thƣờng là cột có kích thƣớc 5 x 1 cm) hoặc nén ở dạng đĩa dày 1 – 2 mm với đƣờng

kính 3 – 4 cm (đĩa chiết).

33

Hình 1.17. Cột chiết pha rắn

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ, dung

dịch đệm… Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tƣơng tác với

chất phân tích và giữ một nhóm (hoặc một số nhóm) của chất phân tích lại trên pha rắn,

các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa tan mẫu.

Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích đƣợc thực hiện bằng một dung môi thích hợp.[45]

1.4. Tổng quan về khả năng kháng oxy hóa

1.4.1. Quá trình và nguyên nhân gây oxy hóa

Một gốc tự do có thể đƣợc định nghĩa là một nguyên tử không trọn vẹn, có chứa

một điện tử vòng ngoài chƣa ghép đôi (số điện tử là số lẻ) nên không bền vững, phải

kết hợp với một nguyên tử khác để có số điện tử chẵn và trở nên bền vững. Sự hiện

diện của một electron không kết đôi dẫn đến các tính chất thông thƣờng nhất đƣợc chia

sẻ bởi hầu hết các gốc tự do (tạo ra một nguyên tử không trọng vẹn khác, tiếp tục kết

hợp với một nguyên tử khác rồi trở thành nguyên tử không trọn vẹn, ...). Nhiều gốc tự

do không ổn định kéo theo một điện tử của phân tử khác về phía nó và có phản ứng hóa

học rất cao. Chúng có thể cho hoặc nhận một điện tử từ phân tử khác, do đó tạo ra những phân tử bị oxy hóa.[10], [20] Các phân tử bị oxy hóa sẽ mất đi chức năng vốn có

của nó, là tác nhân oxy hóa cho các phân tử cạnh nó, tấn công các đại phân tử quan

trọng dẫn đến tổn thƣơng tế bào và phá vỡ cân bằng nội môi. Quá trình oxy hóa sẽ tạo

ra các thay đổi bất lợi tích tụ dần dần trong cơ thể, biểu hiện dƣới dạng các chứng bệnh

cụ thể ở từng độ tuổi nhất định. Ung thƣ và xơ vữa động mạch là hai nguyên nhân

chính gây tử vong do các gốc tự do, đƣợc tạo ra bên trong cơ thể trong quá trình trao

34

đổi chất hoặc đƣợc đƣa vào từ bên ngoài do ô nhiễm môi trƣờng, khói thuốc lá, tia bức xạ, virus, vi khuẩn,....[11] Các gốc tự do có hoạt tính mạnh nhƣ hydroxyl (OH), ion sắt (Fe2+O), Cu(OH)2, có hoạt tính trung bình và yếu bao gồm peroxyl (ROO), hydrogen H2O2, singlet oxy (O1), nitric oxide (NO),..[7]

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Các gốc tự do tạo ra do quá trình sinh dƣỡng sẽ đƣợc kiểm soát bởi các chất

chống oxy hóa – một phân tử ổn định cho đi một điện tử cho gốc tự do và làm chậm hoặc ngăn cản gây hại tế bào.[17] Các hợp chất chống oxy hóa tạo nhƣ glutathione,

ubiquinol, vitamin E (αtocopherol), vitamin C (ascorbic acid), βcarotene, enzyme

superoxide dismutase, ngoài ra cơ thể còn có các tế bào có khả năng chồng lại các yếu

tố oxy hóa ngoại lai nhƣ neutrophill, monocyte, Bcell...[21]

1.4.2. Khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất trong thực vật

Chất chống oxy hóa đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và y dƣợc. Nhiều

hợp chất chống oxy hóa tự nhiên trong thực vật có tiềm năng đã đƣợc nghiên cứu nhƣ

cà chua, rau bina, các loại quả mộng, cam, quýt, olive, trà,... vì chúng có chứa các hợp chất phenolic.[7], [24]

Các hydrogen phenolic (AH) thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh. Chúng tác

động trực tiếp lên các gốc tự do đƣợc sinh ra trong cơ thể, đƣa các gốc tự do về trạng

thái bền, làm cho quá trình oxy hóa bị loại bỏ thông qua các phản ứng sau:

(1) RO2* + AH  ROOH + A*

RO* + AH  ROH + A* (2)

(3) RO2* + A*  ROOA

RO* + A*  ROA (4)

Các chất A* tạo ra trong các phản ứng (1) (2) khác với các gốc RO2*, RO* vì

chúng không có khả năng lấy các ion H+ từ các acid béo không no hay các hợp chất

trong cơ thể nên không tạo ra các gốc tự do mới để tiếp tục khởi động quá trình oxy

hóa. Các sản phẩm tạo ra trong phản ứng (3) (4) là những sản phẩm khá bền và kết quả là chuỗi phản ứng của các gốc tự do sẽ kết thúc sớm hơn.[7]

1.5. Cơ sở khoa học của khả năng kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật

35

1.5.1. Định nghĩa

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật (kháng khuẩn thực vật) là tên

gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hay kìm hãm,

ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ.[11]

1.5.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất trong thực vật

Hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật (kháng khuẩn thực vật) là tên gọi

chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hay kìm hãm, ức

chế sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên

các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thƣờng rất nhỏ.

Hình 1.18. Cơ chế kháng khuẩn

Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi

khuẩn ở các mức độ khác nhau nhờ sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của

màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy

các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lƣợng tế bào, tổng hợp các thành phần

cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nói chung, cơ

chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ

màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng

điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và

36

ctv, 2008) cụ thể ở bảng 1.3.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bảng 1.3. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (Cowan, 1990)

Nhóm Phân Ví dụ Cơ chế

Phenol Catechol Phá vỡ màng sinh chất nhóm

Phá vỡ vách tế bào  Liên kết bám dính, tạo phức hợp Epicatechin Cinnamic acid

Hypericin

đơn Phenolic acid Quinone Flavonoid Chrysin

với thành tế bào, làm bất hoạt Liên kết bám dính enzyme Tạo phức hợp với thành tế bào 

Phenolic Khử hoạt tính enzyme Ức chế phiên mã ngƣợc HIV Flavone Abyssinone

Flavonol

Tannin Ellagitannin

 Bám dính Protein Bám dính Adhesin Ức chế enzyme Phá vỡ màng sinh chất Tạo phức hợp với thành tế bào Phá vỡ vách tế bào Tạo phức kim loại-ion Tƣơng tác với DNA nhân thực Coumarin Warfarin

(hoạt tính kháng vius) Phá vỡ vách tế bào Capsaicin Terpenoid 

Tinh dầu

Xen vào thành tế bào hoặc DNA  Alkaloid

Khóa sự kết hợp của virus hoặc Berberine Piperine Mannose 

Lectin

(agglutinin) Falxatin hấp phụ Hình thành cầu Disulfide Polypeptide

8s-heptadeca-  

2(Z),9(Z)-

Polyacetylen diene-4,6-

37

diyne-1,8-diol

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Các hợp chất flavonoid tổng hợp bởi cây trồng để phản ứng lại sự nhiễm khuẩn

và có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loài vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của

flavonoid là do khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào, tạo phức với thành tế

bào vi khuẩn, và ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho

thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp đƣợc. Các flavonoid càng ƣa béo

càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật.

Các phenolics là làm thay đổi màng tế bào chất, gián đoạn lực đẩy proton và làm

kết tủa các chất trong tế bào. Tầm quan trọng của sự có mặt nhóm hydroxyl trong các

hợp chất phenolic đã đƣợc chứng minh, phenolics tác động lên các enzyme nhƣ

ATPases nằm trong màng tế bào chất và đƣợc bao quanh bởi các phân tử lipid. Các

phân tử lipophilic hydrocacbon có thể tích tụ trong lớp lipid kép và làm ảnh hƣởng đến

tƣơng tác lipid – protein; ngoài ra có thể có sự tƣơng tác trực tiếp của các hợp chất lipophilic với phần kỵ nƣớc của protein (Burt’s, 2004).[12], [16]

1.6. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm

1.6.1. Salmonella

Bảng 1.4. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Salmonella

Vực (domain) Bacteria

Liên giới (superregnum) Bacteria

Giới (regnum) Bacteria

Ngành (phylum) Proteobacteria

Lớp (class) Gammaproteobacteria

Bộ (ordo) Enterobacteriales

Họ (familia) Enterobacteriaceae

38

Chi (genus) Salmonnella

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.19. Vi khuẩn Salmonella

Samonella là một ví dụ kinh điển về ngộ độc thực phẩm. Đây là một loại trực

khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, di động bằng tiên mao. Salmonella

không lên men lactose (trừ S. arizona) và sucrose nhƣng lên men đƣợc dulcitol,

mannitol và glocose. Chúng kém chịu nhiệt nhƣng chịu đƣợc một số hóa chất: brilliant

green, sodium lauryl sulfate, selenite…

Để có thể gây ngộ độc, số lƣợng Salmonella phải lên đến cả triệu tế bào trong 1

g thực phẩm. Có 3 dạng bệnh thực sự do Salmonella gây ra: sốt thƣơng hàn do S.typhi,

nhiễm trùng máu do S.cholera-suis, rối loại tiêu hóa do S.typhirium và S.enteritidis.

Các triệu chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện

sau 12 – 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella. Các triệu chứng thƣờng kéo dài 2 – 7 ngày.[3]

1.6.2. Staphylococcus aureus

Bảng 1.5. Phân loại khoc học chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus

Giới (regnum) Bacteria

Ngành (phylum) Firmicutes

Lớp (class) Bacilli

Bộ (ordo) Bacillales

Họ (familia) Staphylococcusaceae

39

Chi (genus) Staphylococcus

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.20. Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là cầu khuẩn gram dƣơng, hiếu khí, thƣờng kết dạng

chùm có mặt phổ biến ở khắp nơi thƣờng thấy trên da, xoang mũi và tóc…

Staphylococcus aureus sản sinh ra một loại độc tố đƣờng ruột enterotoxin bền

nhiệt, không bị phân huỷ ở 1000C trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố

này, sau 4 – 6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát nên các triệu chứng lâm sàng nhƣ tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ.[3]

Staphylococcus aureus cho phản ứng đông huyết tƣơng dƣơng tính do chúng tiết

ra enzyme coagulase. Đây đƣợc xem là tính chất đặc trƣng của S. aureus, là tiêu chuẩn

để phân biệt Staphylococcus aureus với các tụ cầu khác. Có hai dạng coagulase:

coagulase cố định (bound coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase tự do (free

coagulase) đƣợc phóng thích khỏi thành tế bào. Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng

DNAse, phosphatase dƣơng tính, có khả năng lên men và sinh acid từ manitol,

trehalose, sucrose. Tất cả các dòng Staphylococcus aureus đều nhạy với Novobicine,

có khả năng tăng trƣởng trong môi trƣờng chứa đến 15% muối NaCl.

1.6.3. Escherichia Coli

40

Bảng 1.6. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn E.Coli

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Vực (domain) Bacteria

Ngành (phylum) Proteobacteria

Lớp (class) Gammaproteobacteria

Bộ (ordo) Enterobacteriales

Họ (familia) Enterobacteriaceae

Chi (genus) Escherichia

Loài (species) E. Coli

Hình 1.21. Vi khuẩn Escherichia Coli

E.Coli là trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ biến

trong tự nhiên đặc biệt trong đƣờng tiêu hóa của con ngƣời và động vật. Hầu hết các

dòng E.Coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đƣờng tiêu hóa, chúng

còn đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định đƣờng tiêu hóa. Tuy nhiên, tồn tại ít

nhất 4 dòng sau đây có thể gây bệnh cho ngƣời và cho động vật:

Enteropathogenic E.Coli (EPEC) -

Enterotocigenic E.Coli (ETEC) -

Enteroinvasive E.Coli (EIEC) -

- Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) hoặc Verocytoxin E.Coli (VTEC)

41

hay E.Coli O157:H7

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Nhƣ vậy, có thể đƣợc phân lập đƣợc dễ dàng ở khắp nơi trong môi trƣờng sống,

phân hoặc nƣớc thải. Vi sinh vật này có thể tồn tại rất lâu trong môi trƣờng. Với sự

phân bố rộng rãi nhƣ vậy nên E.Coli cũng đƣợc dễ dàng phân lập từ các mẫu thực

phẩm bị nhiễm nguyên liệu hay thông qua nguồn nƣớc.

Khi các dòng E.coli gây bệnh xâm nhập vào con ngƣời qua con đƣờng tiêu hóa

gây ra các bệnh rối loạn đƣờng tiêu hóa, các biểu hiện lâm sàn có thể biểu hiện từ nhẹ

đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con ngƣời tùy thuộc vào liều lƣợng, dòng gây nhiễm và mức độ đáp ứng của từng ngƣời.[3]

1.6.4. Bacillus cereus

Bảng 1.7. Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Bacillus cereus

Giới (regnum) Bacteria

Ngành (phylum) Firmicutes

Lớp (class) Bacilli

Bộ (ordo) Bacillales

Họ (familia) Bacillaceae

Chi (genus) Bacillus

Loài (species) B. cereus

Hình 1.22. Vi khuẩn Bacillus cereus

42

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bacillus cereus là trực khuẩn gram dƣơng, sinh bào tử, là vi sinh vật hiếu khí

tuyệt đối, tăng trƣởng đƣợc trong nhiệt độ từ 5 - 50 , tối ƣu ở nhiệt độ 35 - 40 , pH

dao động từ 4,5 – 9,3, dễ sinh bào tử và bảo tử phát triển rất dễ dàng.

Bacillus cereus tiết ra 2 loại độc tố chính là diarhaea toxin gây tiêu chảy và

emetic toxin gây nôn mửa. Các triệu chứng ngộ độc do bacillus cereus gây ra là đau

43

bụng, tiêu chảy, không sốt bắt đầu khoảng 4 – 16 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm và kéo dài trong 12 – 24 giờ.[3]

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4 năm 2017 đến tháng 7 năm 2017 tại phòng thí

nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công

nghệ TP. Hồ Chí Minh.

2.2. Vật liệu nghiên cứu

2.2.1. Nguồn mẫu

Quả mồng tơi chín đƣợc hái tại số 13, đƣờng 642, ấp Phƣớc Hƣng, xã Phƣớc

Thạnh, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh.

Quả mồng tơi chín đƣợc hái lúc 9  11 giờ sáng, chọn quả chín già có lớp vỏ

ngoài căng bóng, có màu tím đen đặc trƣng.

Hình 2.23. Quả mồng tơi chín

2.2.2. Vi sinh vật chỉ thị

Vi khuẩn chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 4 chủng vi khuẩn đƣợc cung

cấp bởi Viện Sinh học Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh bao gồm:

- Vi khuẩn Salmonella

- Vi khuẩn Enterotoxigenic E. Coli

- Vi khuẩn Staphylococcus arueus

- Vi khuẩn Bacillus cereus

44

2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Dụng cụ Hóa chất

- Bể điều nhiệt - Thuốc thử DPPH (1,1-diphenyl-2-

- Bếp đun cách thủy picrylhydrazyl) (Đức)

- Bình hút ẩm - Thuốc thử Foline – Ciocalteu

- Cân phân tích (3H2O.P2O5.13WO3.5MoO3.10H2O)

- Cối giã - Acid gallic (C6H2(OH)3COOH) (Trung

- Cốc thủy tinh Quốc)

- Máy quang phổ UV – Vis - Dung dịch Na2CO3 bão hòa

2000 - Dung dịch HCl 1N

- Máy lắc - Etanol 30%, 50%, 70%, nƣớc cất

- Máy ly tâm - Methanol

- Vitamin C - Tủ ủ 37

- DMSO (dimethylsulfoxid) (Trung Quốc) - Tủ sấy 50

- Pepton

- Meat extract

- NaCl

- Môi trƣờng NA (Nutrient Agar)

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp xác định độ ẩm của mẫu

Nguyên tắc:

Dùng nhiệt làm bay hơi hết hơi nƣớc trong mẫu cho đến khi thu đƣợc khối

lƣợng không đổi. Cân trọng lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy khô, từ sự hao hụt khối

lƣợng tính ra phần trăm ẩm có trong mẫu.

Công thức xác định độ ẩm:

Độ ẩm (%) =

45

Trong đó:

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

M : khối lƣợng cốc (g)

M1 : khối lƣợng cốc và mẫu trƣớc khi sấy (g)

M2 : khối lƣợng cốc và mẫu sau khi sấy (g)

2.4.2. Phương pháp xác định tỉ lệ trọng lượng của mẫu

Nguyên tắc:

Xác định tỉ lệ trọng lƣợng phần sử dụng so với tổng trọng lƣợng mồng tơi.

Công thức xác định tỉ lệ trong lƣợng:

Phần sử dụng (%) =

Trong đó:

M1 : tổng trọng lƣợng (g)

M2 : trọng lƣợng phần sử dụng (g)

2.4.3. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao chiết

Mẫu thực vật được tách chiết bởi nhiều loại dung môi khác nhau bằng phương

pháp chiết ngâm ở nhiệt độ thường và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại

bỏ lượng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp.

Nguyên tắc phương pháp chiết ngâm:

Mẫu thực vật được ngâm trong dung môi (w/v) trong khoảng thời gian nhất định

để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi, đây là quá trình di chuyển vật chất

trong hệ hai pha rắn – lỏng gồm 3 giai đoạn: thâm nhập dung môi vào mẫu, hoà tan các

chất trong mẫu, khuếch tán các chất tan.

Tiến hành:

Ngâm một lượng bột mẫu vào dung môi (tỷ lệ 1:1 (w/v)) trong một bình kín để

ở nhiệt độ phòng. Mẫu được ngâm và lắc trong thời gian xác định, sau đó đem đi lọc,

ly tâm, ép bã lấy dịch chiết. Phần dịch chiết được cô đặc, thu hồi cao bằng phương

pháp cô cách thủy. Các loại cao thu hồi được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4C.

46

2.4.4. Phương pháp định lượng polyphenol tổng số

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Nguyên tắc:

Hàm lƣợng phenolic đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Folin  Ciocalteau. Đây

là phƣơng pháp đo màu dựa vào phản ứng oxy hóa khử giữa các hợp chất polyphenol

với thuốc thử Folin  Ciocalteau (hỗn hợp của phosphomolybdat và phosphotungstat).

Ở môi trƣờng kiềm, thuốc thử sẽ oxy hóa các hợp chất polyphenol và sinh ra các acid

heteroply có màu xanh lam có độ hấp thu ánh sáng ở bƣớc sóng  = 765 nm. Tổng hàm

lƣợng polyphenol sẽ đƣợc tính bằng cách quy về lƣợng tƣơng đƣơng với chất chuẩn

acid gallic, kết quả đƣợc biểu diễn bằng số mg acid gallic tƣơng đƣơng trên 1g mẫu khô (mg GAE/g db).[22]

Công thức tính hàm lƣợng polyphenol tổng số:

P =

Trong đó:

P : hàm lƣợng polyphenol (mg GAE/g db)

y : nồng độ polyphenol trong mẫu xác định từ đƣờng chuẩn (mg/ml)

V : thể tích dịch chiết sau khi trích ly (ml)

m : khối lƣợng mẫu sử dụng cho quá trình tách chiết (g)

2.4.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH

Khả năng kháng oxy hóa đƣợc xác định bằng phƣơng pháp ức chế gốc tự do

DPPH (Michael Antolovich, 2002).

DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là gốc tự do có màu tím giống màu của

KMnO4, không tan trong nƣớc, nhƣng tan trong ethanol, methanol. Dung dịch DPPH

có độ hấp thu cực đại tại bƣớc sóng  = 517 nm, và sản phẩm khử của nó là 2,2-

diphenyl-1-picrylhydrazin (DPPH-H).

DPPH là hợp chất có màu tím đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 517 nm. Cơ chế của

47

hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn định hơn.[4] Khi các điện tử lẻ của các

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

gốc tự do DPPH kết hợp với hydro từ chất chống oxy hóa thì sẽ hình thành nên DPPH–

H lúc này màu sắc chuyển từ màu tím sang màu vàng. Sự biến đổi màu này tƣơng ứng với lƣợng electron kết hợp với DPPH (Prakash et al., 2000).[1] Nhƣ vậy, khi có mặt của

chất chống oxy hóa nó sẽ khử gốc tự do DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm đi.[4]

Công thức xác định phần trăm ức chế:

%I =

Trong đó:

ADPPH : giá trị OD517nm của dung dịch DPPH ban đầu pha trong methanol

(ADPPH = 0,708)

ATN : giá trị OD517nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu).

Đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua giá trị IC50. IC50 là một giá trị dùng

để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 đƣợc định nghĩa là

nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do. Mẫu có hoạt tính càng cao

thì giá trị IC50 càng thấp.

Để xác định giá trị IC50, tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ

khác nhau. Đối với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính theo nồng độ, ta dựng

đƣờng thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là phần trăm ức chế, x là nồng độ).

Đối với những mẫu có hoạt tính phi tuyến tính theo nồng độ, một cách gần đúng,

chúng ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dƣới 50% và cũng tiến hành vẽ đƣờng thẳng y

= ax + b.

Sau khi dựng đƣợc đƣờng thẳng y = ax + b với 2 hệ số a và b đã biết. Thay y =

50% vào phƣơng trình ta sẽ tính đƣợc giá trị x, đó chính là giá trị IC50.

Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên đƣờng chuẩn y = ax + b theo công thức:

x =

48

2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật đục lỗ thạch

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Nguyên tắc:

Dịch cao chiết ở các lỗ sẽ khuếch tán vào môi trƣờng thạch và tác động lên các

chủng khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn thì sẽ xuất

hiện quầng trong bao quanh các lỗ thạch (vòng ức chế). Từ đó, đánh giá khả năng

kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đƣờng kính vòng ức chế (mm).

Tiến hành:

- Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa từ ống giống gốc trong môi trường lỏng NB, lắc qua đêm. Cấy trang 100 µl dịch khuẩn (mật độ tế bào tương đương 106 cfu/ml)

lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường NA đặc và tiến hành đục lỗ với đường kính d

= 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2-3 cm.

- Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lượng cao chiết trong Dimethyl

Sulfoxide (DMSO) 10% theo nồng độ yêu cầu 100 mg/ml. Bổ sung 100 µl dịch cao

chiết vào các lỗ đã đục trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để

dịch cao được khuyếch tán đều vào môi trường thạch. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm

37 trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đường kính vòng ức chế

(mm) trên đĩa thạch.

Đối chứng là dung dịch kháng sinh Amoxicillin.

49

Hình 24.2. Kỹ thuật đục lỗ thạch có bổ sung kháng sinh đối chứng

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm đƣợc xử lí thống kê theo phƣơng pháp thống kê sinh

học, sử dụng công cụ phân tích số liệu (data analysis) của Microsofl Excel 2010. Dùng

phần mềm SAS để đánh giá kết quả, so sánh giá trị trung bình giữa các thí nghiệm.

2.4.8. Phương pháp so sánh, đối chiếu

Từ kết quả thực nghiệm đạt đƣợc, tiến hành so sánh với cơ sở khoa học liên

quan cũng nhƣ đối chiếu với kết quả của các công trình nghiên cứu khác nhằm đƣa ra

kết luận của đề tài.

2.5. Bố trí thí nghiệm

Mẫu quả mồng tơi

Xử lý mẫu

Xác định độ ẩm Xác định tỉ lệ trọng lƣợng

Trích ly và thu nhận cao chiết

Cao chiết quả mồng tơi của các loại dung môi khác nhau

Định lƣợng polyphenol tổng số Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

2.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm của mẫu quả mồng tơi

Sấy chén sứ sạch ở 105 cho đến khối lƣợng không đổi. Để nguội trong bình

50

hút ẩm và cân khối lƣợng chính xác đến 0,0001g.

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Cho vào cốc khoảng 5g mẫu. Cân cốc chứa mẫu bằng cân phân tích với độ

chính xác nhƣ trên.

Cho cốc chứa mẫu vào tủ sấy ở 105 , dùng nhiệt độ cao để tách ẩm ra khỏi

nguyên liệu mẫu, sấy cho đến khi khối lƣợng không đổi, thƣờng tối thiểu là 6 giờ.

Sau khi sấy, làm nguội trong bình hút ẩm 15 phút và đem cân ở cân phân tích

với độ chính xác nhƣ trên.

Khảo sát đƣợc tiến hành với 3 lần lặp lại.

Kết quả đƣợc tính dựa trên công thức đƣợc nêu ở trên.

2.5.2. Thí nghiệm 2: Xác định tỉ lệ trọng lượng của mẫu

Lấy khoảng 40g cọng mồng tơi có chứa quả chín.

Dùng tay tách phần sử dụng (quả mồng tơi chín) ra khỏi cọng cây mồng tơi.

Cân tổng trọng lƣợng cọng mồng tơi có chứa quả chín chính xác đến 0,0001g,

ghi nhận kết quả.

Cân phần quả chín sau khi đã tách ra cũng với độ chính xác nhƣ trên và ghi nhận

kết quả.

Khảo sát đƣợc tiến hành ngẫu nhiên với 2 lần lặp.

Kết quả đƣợc tính dựa trên công thức đƣợc nêu ở trên.

2.5.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng

51

anthocyanin

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Quả mồng tơi

Giã nhỏ

Ngâm với dung môi (1:1) (w/v), HCl 1N

Ethanol Nƣớc

30% 50% 70%

Lắc 1 tiếng

Lọc thô

Ly tâm 4000v/phút

Thu dịch chiết

Cô cách thủy 50

Cao chiết

Đánh giá hiệu suất thu hồi

52

Bảo quản lạnh 4

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Sơ đồ 2.2. Quy trình trích ly và thu hồi cao quả mồng tơi

Thuyết minh quy trình:

 Nguyên liệu

Quả mồng tơi chín đƣợc thu hái vào khoảng 9 – 11 giờ sáng, là khoảng

thời gian thực vật hô hấp mạnh mẽ nhất, giúp thu nhận lƣợng hợp chất tối

đa. Lựa chọn những quả chín có màu tím đen, loại bỏ những quả héo, rửa

sạch, để ráo. Sử dụng 100g quả chín cho quá trình tách chiết.

 Giã nhỏ

Sử dụng cối sứ giã nhỏ quả mồng tơi chín. Quá trình giã sẽ phá vỡ cấu

trúc tế bào quả, giải phóng các dịch tế bào, tăng bề mặt tiếp xúc giữa nguyên

liệu và dung môi, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất.

 Tách chiết

Chiết hợp chất có trong quả mồng tơi chín nhờ dung môi ethanol 30%,

50%, 70% và nƣớc cất sử dụng phƣơng pháp ngâm dầm để khảo sát mức độ

ảnh hƣởng của dung môi đến quá trình trích ly.

Cân 100g quả mồng tơi chín, giã nhỏ và thêm dung môi ethanol (30%,

50%, 70%) theo tỷ lệ 1:1 (w/v) trong erlen thủy tinh đậy kín để tránh hiện

tượng bay hơi. Quá trình chiết đƣợc diễn ra trong khoảng 24 giờ, trên máy

lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng.

53

Hình 2.25. Hỗn hợp quả mồng tơi giã nhỏ và dung môi sau khi lắc

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

 Lọc

Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn hạt lẫn trong

dịch chiết, sử dụng giấy lọc vả máy hút chân không để lọc nhanh dịch chiết,

ly tâm 4000 vòng/phút thu dịch trong để chuẩn bị cho quá trình cô cách thủy

loại dung môi.

 Cô dịch chiết

Thu tất cả dịch lọc đem cô cách thủy ở nhiệt độ 500C cho đến khi bay hết

dung môi và thu cao chiết.

Đánh giá hàm lƣợng anthocyanin từ cao chiết ở mỗi nghiệm thức bằng công

thức:

Hàm lƣợng (%) =

Trong đó:

: khối lƣợng cốc sau khi cô mẫu (g) M1

: khối lƣợng cốc trƣớc khi cô mẫu (g) M2

M : khối lƣợng mẫu ban đầu (g)

Cao chiết đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 4 trong tủ lạnh nhằm phục vụ cho các thí

nghiệm tiếp theo.

2.5.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng

polyphenol tổng số

Đƣờng chuẩn acid gallic:

- Chuẩn bị các dung dịch acid gallic có các nồng độ khác nhau: 0; 0,1; 0,15;

0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4 mg/ml

- Cho 60 𝜇𝑙 mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch đã có 4,74 ml nƣớc cất, sau đó

cho 300 𝜇𝑙 thuốc thử Folin - Ciocateau vào và trộn đều. Sau khoảng 30 giây

đến 8 phút cho vào 900 𝜇𝑙 dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều. Hỗn hợp phản

54

ứng đƣợc giữ ở 40 trong 30 phút. So màu ở bƣớc sóng  = 765nm.

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên

cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn) rồi làm thí

nghiệm nhƣ trên.

Mẫu và chất chuẩn đƣợc phân tích 3 lần.

Hàm lƣợng polyphenol đƣợc tính toán dựa theo đƣờng chuẩn acid gallic.

Kết quả đƣợc tính dựa trên công thức đƣợc nêu ở trên.

2.5.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến khả năng

kháng oxy hóa

Đƣờng chuẩn vitamin C:

- Pha dung dịch vitamin C theo các nộng độ sau: 0; 0,0125; 0,025; 0,05; 0,075;

0,125 (mg/ml)

- Dùng micropipette hút 100l mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn

2ml dung dịch DPPH.

- Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phòng. So màu ở bƣớc sóng  = 517nm.

Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên

cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn) rồi làm thí

nghiệm nhƣ trên. Kết quả đƣợc đánh giá thông qua giá trị IC50 (Inhibitory

concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do

DPPH trong khoảng thời gian xác định.

Mẫu và chất chuẩn đƣợc phân tích 3 lần.

Kết quả đƣợc tính dựa trên công thức đƣợc nêu ở trên.

2.5.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly đến khả năng

55

kháng khuẩn

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Giống vi khuẩn

Tăng sinh trong môi trƣờng NB

Pha loãng về 106 cfu/ml

Cấy trang trên môi trƣờng NA

Đục lỗ thạch (d=6mm)

Nhỏ cao chiết và kháng sinh đối chứng

Ủ 37 trong 24 giờ

Đo kích thƣớc vòng kháng khuẩn và ghi nhận kết quả

Sơ đồ 2.3. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết quả mồng tơi chín

Thuyết minh quy trình:

Đầu tiên đối với vi sinh vật chỉ thị tiến hành quy trình tăng sinh. Sử dụng que

cấy vòng lấy sinh khối của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, E.coli,

Salmonella, Bacillus cereus từ các eppendoff giữ giống sang các erlen chứa 10 ml môi

trƣờng NB, sau đó lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tiến hành đo OD

dịch tăng sinh ở bƣớc sóng 600 nm để xác định mật độ vi khuẩn và dịch vi khuẩn đƣợc pha loãng để đạt mật độ 106 cfu/ml.

Chuẩn bị nƣớc muối sinh lý 0,9%, hấp khử trùng 121 , 1 atm, 20 phút để pha

56

loãng mẫu.

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Thạch nền: sử dụng môi trƣờng NA. Hấp khử trùng môi trƣờng 121 , 1 atm, 15

phút. Để nguội đến khoảng 50 đến 60 sau đó đổ vào các đĩa petri đã tiệt trùng. Để

nguội sau đó úp ngƣợc đĩa petri lại.

Kháng sinh đối chứng: pha dung dịch thuốc kháng sinh Amoxicillin 1%, nếu

thuốc không tan trong nƣớc thì hòa tan với DMSO. Dung dịch để bảo quản trong tủ

lạnh.

Hút 100 µl dịch đã pha loãng cho vào đĩa NA trang đều đĩa cho đến khi dịch

khô, dùng ống trụ kim loại (que đục thạch) có đƣờng kính 6 mm tiến hành đục 6 lỗ trên

đĩa.

Đối với cao chiết cần khảo sát tiến hành pha trong DMSO 1% để đạt nồng độ

100 mg/ml. Sử dụng micropipette hút 100 µl dịch cao chiết cho vào 3 giếng và cao

chiết khác vào 3 giếng còn lại, mẫu đối chứng sẽ thay thế cao chiết bằng kháng sinh,

giữ yên trong vòng 1 giờ để cao chiết và kháng sinh có thể khuếch tán vào môi trƣờng thạch tiến hành ủ ở 370C trong 24 giờ.

Tiến hành đọc kết quả thông qua việc đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm).

Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch chiết đƣợc phân loại dựa theo đƣờng

kính vòng kháng khuẩn:

- Đƣờng kính vòng kháng khuẩn < 8 mm: không tốt

- Đƣờng kính vòng kháng khuẩn từ 9 - 14 mm: tốt

- Đƣờng kính vòng kháng khuẩn 15 - 19 mm: rất tốt

- Đƣờng kính vòng kháng khuẩn >20 mm: cực tốt (theo Celikel và Kavas,

57

2008)

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả xác định độ ẩm và tỉ lệ trọng lƣợng của quả mồng tơi chín

Bảng 3.8. Tỉ lệ trọng lƣợng phần sử dụng và độ ẩm quả mồng tơi chín

Kết quả (%)

Tỉ lệ trọng lƣợng 40,30 ± 0,53

Độ ẩm 86,15 ± 0,29

Thí nghiệm sử dụng những phần quả mồng tơi chín có màu tím đen chiếm 40,30

± 0,53%, phần bỏ đi (gồm quả mồng tơi còn xanh và cọng mồng tơi) tƣơng đối nhiều

do quả mồng tơi chín không đều, đồng thời thời gian làm đề tài rơi vào những tháng

mƣa nên quả mồng tơi lâu chín, gây khó khăn cho quá trình thu mẫu.

Bên cạnh đó, độ ẩm của mẫu quả mồng tơi chín đạt khá cao 86,15 ± 0,29% do

cây mồng tơi là một loại rau quả dùng trong thực phẩm sinh hoạt ăn uống hằng ngày

nên đạt đƣợc độ ẩm nhƣ trên là hoàn toàn hợp lí.

3.2. Kết quả đánh giá hàm lƣợng anthocyanin từ cao chiết quả mồng tơi chín từ

các loại dung môi trích ly khác nhau

Mẫu quả mồng tơi chín sau khi được tiến hành tách chiết và thu hồi cao với các

loại dung môi ethanol 30%, ethanol 50%, ethanol 70% và nƣớc cất.

58

Hình 3.26. Dịch chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hình 3.27. Cao chiết quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác nhau

Để khảo sát sự ảnh hưởng của các loại dung môi tách chiết đến hàm lƣợng

anthocyanin từ quả mồng tơi chín thì hàm lƣợng thu hồi cao là chỉ tiêu quan trọng cần

xác định. Kết quả đánh giá hàm lƣợng cao chiết từ quả mồng tơi chín được trình bày ở

sơ đồ 3.1.

Sơ đồ 3.4. Hiệu suất thu hồi cao chiết từ quả mồng tơi chín với các dung môi khác

nhau

Dựa vào sơ đồ 3.1 nhận thấy rằng hàm lƣợng cao chiết quả mồng tơi chín của

59

các dung môi khác nhau không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê (p  0,05).

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả tách chiết cao cho thấy hàm lƣợng cao của các dung môi nƣớc cất,

ethanol 50%, ethanol 30% không có sự khác nhau một cách có ý nghĩa về mặt thống

kê. Trong đó, hàm lƣợng tách chiết của dung môi ethanol 70% lớn nhất với giá trị

trung bình là 2,4995%. Kế đến là dung môi nƣớc cất, ethanol 30%, ethanol 50% có

hàm lƣợng trung bình lần lƣợt là 2,3670%, 2,3235%, 2,3115%.

Theo Đinh Phƣơng Liên, “Nghiên cứu chiết xuất citroflavonoid và đánh giá

hoạt tính sinh học của chế phẩm chiết xuất” (2012), cũng nhƣ một số nghiên cứu liên

quan đến việc sử dụng dung môi để tách chiết hợp chất từ thực vật thì phần lớn các tác

giả đều sử dụng dung môi ethanol 70% để tiến hành tách chiết vì ethanol 70% đƣợc

biết nhƣ một dung môi vạn năng có độ phân cực phù hợp, có khả năng tách chiết rất

nhiều hoạt tính sinh học ra khỏi thực vật. Tuy nhiên, để đánh giá dung môi nào phù

hợp tách chiết các hoạt tính sinh học có trong quả chín Basella alba L. ngoài đánh giá

hàm lƣợng cao cần phải tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cũng nhƣ các hoạt

tính sinh học khác của cao chiết từ các dung môi này.

3.3. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến hàm lƣợng polyphenol tổng

số

Hình 3.28. Dung dịch đƣờng chuẩn acid gallic

Bảng 3.9. Kết quả đƣờng chuẩn acid gallic

60

0,1 0,117 0,15 0,181 0,2 0,240 0,25 0,296 0,3 0,349 0,35 0,413 0,4 0,472 Nồng độ AG (mg/ml) OD  = 765nm

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Acid gallic là chất chuẩn đƣợc sử dụng để định lƣợng polyphenol tổng số. Sau

khi ủ ở 40 , dung dịch có màu xanh lam nhƣ hình 3.3 và đƣợc đo độ hấp thu ánh sáng

ở bƣớc sóng  = 765nm, thu đƣợc kết quả các giá trị OD nhƣ bảng 3.2. Từ đó, ta dựng

đƣợc đƣờng chuẩn acid gallic để tính hàm lƣợng polyphenol tổng số theo công thức đã

nêu ở trên.

Hình 3.29. Đƣờng chuẩn acid gallic

Bảng 3.10. Kết quả hàm lƣợng polyphenol tổng trong 4 loại dung môi trích ly quả

mồng tơi chín

0,1 Nồng độ mẫu (mg/ml)

Ethanol 30% Ethanol 50% Ethanol 70% Nƣớc cất Loại dung môi trích ly

114,197a ± 7,87 82,133b ± 3,51 88,230b ± 2,89 92,797ab ± 0,79

61

Hàm lƣợng polyphenol tổng (mg GAE/ g db)

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sơ đồ 3.5. So sánh hàm lƣợng polyphenol tổng của cao chiết quả mồng tơi chín ở các

dung môi trích ly khác nhau

Từ các kết quả ở sơ đồ 3.2 cho thấy hàm lƣợng polhyphenol tổng số (mg GAE/g

db) của dung môi ethanol 30% là 114,20 mg GAE/g db cao hơn hẳn so với hàm lƣợng

polyphenol của dung môi ethanol 50% là 82,133 mg GAE/g db, có sự khác biệt về ý

nghĩa thống kê (p < 0,01), có thể lý giải rằng do ethanol 30% có độ phân cực khác so

với ethanol 50%, độ phân cực của dung môi ảnh hƣởng đến quá trình trích ly, điều này

có thể tác động đến việc định lƣợng polyphenol tổng số. Kế đến là dung môi nƣớc cất,

ethanol 70% có hàm lƣợng polyphenol trung bình lần lƣợt là 92,797 mg GAE/g db và

88,230 mg GAE/g db. Qua số liệu thu đƣợc, có thể kết luận rằng dung môi ethanol

30% là dung môi phù hợp nhất cho việc định lƣợng polyphenol tổng số trong cao chiết

quả mồng tơi chín.

So sánh với một số kết quả nghiên cứu hàm lƣợng polyphenol tổng có trong một

số loài thực vật khác. Kết quả hàm lƣợng polyphenol tổng số cao nhất trong quả mồng

tơi chín là 114,20 mg GAE/g db. Kết quả này so sánh với hàm lƣợng polyphenol trong

62

lá Trầu đƣợc công bố trên Tạp chí khoa học và phát triển 2013, tập số 11, số 3:412-

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

421/J.ci. & Devel. Vol 12, No. 3:412-421, chêch lệch không đáng kể. Trong tạp chí

này, hàm lƣợng polyphenol tổng số cao nhất trong là lá Trầu không với 188,19 mg

GAE/g db, theo sau là lá ổi và lá trà xanh với hàm lƣợng tƣơng ứng là 146,5 mg

GAE/g db. Lá nhàu, lá lốt, lá khoai lang có hàm lƣợng polyphenol thấp nhất 11,7, 39,3

và 60,7 mg GAE/g db so với kết quả hàm lƣợng polyphenol trong lá củ đậu đều thấp hơn.[7]

Polyphenol là một trong những thành phần quan trọng nhất và chiếm tỉ lệ lớn

trong thực vật nói chung. Đây là chất chống oxy hóa mạnh, và có khả năng kháng

khuẩn cao. Vì vậy, chỉ tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu đánh giá khả năng

kháng khuẩn của cao chiết.

3.4. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi đến khả năng kháng oxy hóa

Hình 3.30. Đƣờng chuẩn vitamin C

63

Hình 3.31. Phản ứng của DPPH và chất chuẩn vitmin C

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Vitamin C là chất chống oxy hóa chuẩn thƣờng đƣợc sử dụng để so sánh khả

năng làm sạch gốc tự do của các chất cần đƣợc khảo sát. Đƣờng chuẩn DPPH đƣợc tính theo µg/ml vitamin C theo phƣơng trình đƣờng chuẩn là y = 0,7057x + 8,9894 (R2

= 0,9941).

Hình 3.7. Đƣờng chuẩn của cao chiết ethanol 30%, 50%, 70%, nƣớc cất (theo thứ tự từ

trên xuống dƣới, từ trái sang phải)

64

Hình 3.8. Phản ứng của DPPH và cao chiết.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Bảng 3.11. Phần trăm ức chế của cao quả mồng tơi chín ở các dung môi trích ly khác

nhau ( các mẫu tự theo sau các giá trị trong cùng một cột khác nhau thì khác biệt có ý

nghĩa về mặt thống kê ở mức 1%).

Ethanol 30% Ethanol 50% Ethanol 70% Nƣớc cất Vitamin C

35,200d ± 0,99

Nồng độ (g/ml) 12,5 25 50 75 125 28,810e ± 0,99 25,845c ± 0,57 36,350d ± 1,17 37,920d ± 0,07 52,330c ± 1,06 48,870b ± 4,38 58,685cb ± 0,64 52,755c ± 2,90 63,845b ± 0,43 64,620b ± 3,04 59,900b ± 0,72 70,910b ± 1,33 79,945a ± 2,69 87,78a ± 2,33 83,475a ± 0,29 78,390a ± 2,97 15,393f ± 0,43 34,040c ±0,85 45,860cd ± 1,99 43,625cd ± 0,13 26,550d ± 1,79 45,923c ± 1,01 65,067b ± 0,88 94,917a ± 0,53

Bảng 3.12. Phƣơng trình đƣờng chuẩn và giá trị IC50 của nghiệm thức

Phƣơng trình đƣờng chuẩn IC50 (g/ml)

Vitamin C 58,30

Y = 0,7057x + 8,9894 R2 = 0,9941

Ethanol 30% 50,37

Y = 0,4803x + 25,809 R2 = 0,9846

Ethanol 50% 56,63

Y = 0,4629x + 22,791 R2 = 0,9845

Ethanol 70% 34,29

Y = 0,4509x + 33,786 R2 = 0,9828

Nƣớc cất 46,48

65

Y = 0,3895x + 32,679 R2 = 0,9892

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sơ đồ 3.6. Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của vitamin C và cao chiết ở các dung môi trích

ly khác nhau.

Khả năng loại 50% các gốc tự do IC50 (Inhibitory concentration of 50%) đƣợc

tính toán dựa vào đồ thị và kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.11. Trong đó cao chiết

quả mồng tơi chín sử dụng dung môi là ethanol 70% có khả năng làm loại tự do cao

nhất (IC50 = 34,29) sau đó là nƣớc cất (IC50 = 46,48), ethanol 30% (IC50 = 50,37) và

cuối cùng là ethanol 50% (IC50 = 56,63). Cao chiết quả mồng tơi có khả năng bắt các

gốc tự do đặc biệt tốt, cao hơn cả vitamin C trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Hiệu quả loại gốc tự do của cao chiết ethanol 30%, 50%, 70% và nƣớc cất của

quả mồng tơi chín trong thử nghiệm loại gốc DPPH đƣợc trình bày ở bảng 3.4. Kết quả

cho thấy hoạt tính loại gốc tự do ở nồng độ 0,125 mg/ml của cao chiết ethanol 70% của

quả mồng tơi chín khá mạnh, có khả năng loại gốc tự do trên 87%.

Theo kết quả nghiên cứu của Trần Thị Kim Ngân (2015), “Nghiên cứu thành

phần alkaloid, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa của lá sen nelumbo nucifera”, giá

trị IC50 của dịch chiết ethanol 70% lá sen non là 13,59 g/ml và của dịch chiết ethanol

96% lá sen trƣởng thành là 2,907 g/ml. So sánh các giá trị IC50 ta có thể thấy quả

66

mồng tơi chín có hoạt tính kháng oxy mạnh hơn dịch chiết từ lá sen.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.5. Kết quả ảnh hƣởng của dung môi trích ly đến khả năng kháng khuẩn

3.5.1. Hoạt tính kháng Bacillus cereus của các loại cao chiết

Bảng 3.13. Kết quả kháng Bacillus cereus của 4 loại cao chiết

Nồng độ vi khuẩn (cfu/ml) Các loại cao chiết

106

Đƣởng kính vòng kháng khuẩn (mm) 0 0 13b ± 0,289 0 22a ± 1,732 Ethanol 30% Ethanol 50% Ethanol 70% Nƣớc cất Amoxicillin

Dựa vào kết quả đƣa ra trong bảng 3.4, cho thấy cao chiết quả mồng tơi chín sử

dụng dung môi ethanol 70% có khả năng kháng Bacillus cereus tốt, trong khi 3 loại cao

chiết còn lại dung môi lần lƣợt là ethanol 30%, ethanol 50% và nƣớc cất thì có hiện

tƣơng ức chế khá tốt. Đƣờng kính vòng kháng khuẩn Bacillus cereus của cao chiết

ethanol 70% nồng độ 100mg/ml là 13 mm, so với vòng kháng khuẩn của kháng sinh

đối chứng nồng độ 10mg/ml là 22 mm thì nhỏ hơn.

Kết quả vòng kháng Bacillus cao nhất của cao chiết quả mồng tơi chín là 13

mm, kết quả này so với kết quả của cao chiết từ cây lá đắng kháng Bacillus đƣợc thực

hiện bởi Từ Công Tính (2017), “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và đề xuất ứng dụng

từ cây lá đắng”, có vòng ức chế chung bình là 11,7 mm thì kháng tốt hơn rất nhiều.

3.5.2. Hoạt tính kháng Salmonella của các loại cao chiết

Bảng 3.14. Kết quả kháng Salmonella của 4 loại cao chiết

Nồng độ vi khuẩn (cfu/ml) Các loại cao chiết

106

67

Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm) 0 9,667b ± 0,333 12,167b ± 1,072 0 16,667a ± 0,882 Ethanol 30% Ethanol 50% Ethanol 70% Nƣớc cất Amoxicillin

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Dựa vào kết quả đƣa ra trong bảng 3.5, cho thấy cao chiết quả mồng tơi chín sử

dụng dung môi ethanol 50% và ethanol 70% có khả năng kháng Salmonella tƣơng đối

tốt, 2 loại cao chiết ethanol 30% và nƣớc cất không có hiện tƣợng kháng. Đƣờng kính

vòng kháng khuần Salmonella của cao chiết ethanol 70% nồng độ 100mg/ml cao nhất

là 12,167 mm, sau đó là ethanol 50% đạt 9,667 mm, so với vòng kháng khuẩn của

kháng sinh đối chứng nồng độ 10mg/ml là 16,667 mm thì đều nhỏ hơn.

Kết quả vòng kháng Salmonella cao nhất của cao chiết quả mồng tơi chín là 13

mm, kết quả này so với kết quả của cao chiết lá củ đậu kháng Salmonella đƣợc công bố

trên bởi Huỳnh Kim Khánh (2016), “Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ

đậu và thử nghiệm độc tính trên mô hình invitro”, Đồ án tốt nghiệp, trƣờng Đại học

Công nghệ TP.HCM, là không kháng chứng tỏ cao chiết quả mồng tơi chín có khả

năng kháng Salmonella rất mạnh.

3.5.3. Hoạt tính kháng E.coli của các loại cao chiết

Bảng 3.15. Kết quả kháng E.coli của 4 loại cao chiết

Nồng độ vi khuẩn (cfu/ml) Các loại cao chiết

106

Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm) 11b ± 0,00 10b ± 0,00 12,33b ± 0,333 0 22a ± 1,528 Ethanol 30% Ethanol 50% Ethanol 70% Nƣớc cất Amoxicillin

Dựa vào kết quả đƣa ra trong bảng 3.6, cho thấy cao chiết quả mồng tơi chín sử

dụng dung môi ethanol 30%, 50%, 70% có khả năng kháng E.coli tốt. Cao chiết sử

dụng dung môi là nƣớc cất không có hiện tƣợng kháng E.coli. Đƣờng kính vòng kháng

khuẩn của cao chiết ethanol 70% nồng độ 100mg/ml lớn nhất là 12,33 mm, kế đến là

ethanol 30% 11 mm và ethanol 50% 10 mm, so với đƣờng kính vòng kháng sinh đối

68

chứng nồng độ 10mg/ml là 22 mm thì đều thấp hơn.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả vòng kháng E.coli cao nhất của cao chiết quả mồng tơi chín là 12,33

mm, kết quả này so với kết quả của dịch chiết bắp cải tím kháng E.coli đƣợc công bố

bởi Phạm Ngọc Khôi (2016), “Khảo sát các điều kiện thu hồi dịch chiết và hoạt tính

kháng khuẩn, kháng oxy hóa của dịch chiết bắp cải tím Brassica Oleracea”, Tạp chí khoa học Yersin là 14,5 mm thì nhỏ hơn. [6]

3.5.4. Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của các loại cao chiết

Bảng 3.16. Kết quả kháng Staphylococcus aureus của 4 loại cao chiết

Nồng độ vi khuẩn (cfu/ml) Các loại cao chiết

106

Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm) 12,833b ± 0,441 11,667b ± 0,333 13,667b ± 0,333 12,333b ± 0,333 23a ± 1,528 Ethanol 30% Ethanol 50% Ethanol 70% Nƣớc cất Amoxicillin

Dựa vào kết quả đƣa ra trong bảng 3.7, cho thấy cả 4 loại cao chiết đều kháng

tốt khuẩn Staphylococcus aureus. Đƣờng kính vòng kháng của cao ethanol 70% nồng

độ 100mg/ml là lớn nhất đạt 13,667 mm, kế đến là cao ethanol 30%, nƣớc cất và

ethanol 50% lần lƣợt có đƣờng kính vòng kháng là 12,833 mm, 12,333 mm và 11,667

mm, so với đƣờng kính vòng kháng của kháng sinh đối chứng là 23 mm đều nhỏ hơn.

Kết quả vòng kháng Staphylococcus aureus cao nhất của cao chiết quả mồng tơi

chín là 13,667 mm, kết quả này so với kết quả của dịch chiết bắp cải tím kháng

Staphylococcus aureus đƣợc công bố bởi Phạm Ngọc Khôi (2016), “Khảo sát các điều

kiện thu hồi dịch chiết và hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa của dịch chiết bắp cải

69

tím Brassica Oleracea”, Tạp chí khoa học Yersin là 13,3 mm lớn hơn rất nhiều.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sơ đồ 3.7. Tổng quát về hoạt tính kháng khuẩn của cao quả mồng tơi chín từ các loại

dung môi khác nhau trên cả 4 chủng vi khuẩn.

Từ kết quả thí nghiệm được biểu diễn ở hình 3.12 nhận thấy rằng cao chiết quả

mồng tơi chín từ các loại dung môi (nồng độ 100 mg/ml) đều thể hiện hoạt tính kháng

khuẩn khác nhau trên chủng vi khuẩn Staphylococcus areus một cách có ý nghĩa về

mặt thống kê (p < 0,01). Cao chiết ethanol 30% kháng tốt 2/4 chủng là E.coli và

Staphylococcus aureus với đƣờng kính vòng kháng lần lƣợt là 11 mm và 12,833 mm.

Cao chiết ethanol 50% kháng tốt 3/4 chủng lần lƣợt là Salmonella, E.coli và

Staphylococcus areus với đƣờng kính là 9,667 mm, 10 mm và 11,667 mm. Cao chiết

ethanol 70% kháng tốt 4/4 chủng và có đƣờng kính vòng kháng lần lƣợt là 13 mm,

12,167 mm, 12,33 mm và 13,667 mm. Riêng cao chiết sử dụng dung môi nƣớc cất chỉ

kháng chủng Staphylococcus areus với đƣờng kính 12,333 mm nhƣng lại kháng rất tốt.

Tất cả các loại cao chiết đều kháng tốt cả vi khuẩn gram () (Salmonella, trực

khuẩn đƣờng ruột E.coli) và vi khuẩn gram () (cầu khuẩn Staphylococcus aureus, trực

70

khuẩn Bacillus cereus).

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Từ kết quả nghiên cứu quả mồng tơi chín, ta rút ra đƣợc một số kết luận nhƣ

sau:

Độ ẩm quả mồng tơi là 86,15%, tỷ lệ trọng lƣợng phần sử dụng là 40,30%.

Hàm lƣợng polyphenol trong cao chiết ethanol 30% là cao nhất (114,20 mg

GAE/g db). Nếu muốn tách chiết hợp chất polyphenol từ quả mồng tơi chín cao nên sử

dụng dung môi ethanol 30%.

Hàm lƣợng cao thu đƣợc trong ethanol 70% cao nhất (2,4995%).

Khả năng bắt gốc tự do DPPH trong cao chiết ethanol 70% là cao nhất (phần

trăm ức chế hơn 87%), giá trị IC50 là 34,29, cao chiết ethanol có hoạt tính kháng oxy

hóa mạnh nhất.

Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% mạnh nhất, có khả năng kháng

đƣợc 4/4 chủng vi sinh vật khảo sát (Bacillus cereus, E.coli, Salmonella, Staphyloccus

aureus) và có đƣờng kính vòng kháng dao động từ 12 – 13 mm. Khả năng kháng khuẩn

của cao chiết đều tốt đối với cả vi khuẩn gram () và gram ().

4.2. Kiến nghị

Do giới hạn về mặt thời gian và kinh tế cũng nhƣ điều kiện về trang thiết bị còn

hạn chế, để góp phần hoàn thiện cho các đề tài nghiên cứu sau, có một số kiến nghị

nhƣ sau:

Khảo sát cao chiết ở các loại dung môi khác (nhƣ ethanol 90%, ethanol 96%,

methanol…) nhằm đánh giá chính xác hơn về hiệu suất thu hồi cũng nhƣ các hoạt tính

sinh học của cao chiết.

Nghiên cứu quy trình tinh sạch và định danh các hợp chất trong quả mồng tơi

chín nhƣ anthocyanin và một số các hợp chất khác.

71

Nghiên cứu khả năng kháng nấm từ quả mồng tơi chín.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TÀI LIỆU THAM KHẢO

 Tài liệu Tiếng Việt

[1] Đái Thị Xuân Trang và cộng sự (2012) – Khảo sát hiệu quả hạ đường huyết và

chống oxy hóa của cao chiết cây nhàu (Morinda Citrifolia L.) ở chuột bệnh tiểu

đường. Tạp chí Khoa học 2012:23b 115-124.

[2] Huỳnh Thị Kim Cúc, Phạm Châu Quỳnh, Nguyễn Thị Lan, và cộng sự (2004),

“Xác định hàm lượng anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả bằng phương

pháp pH vi sai”, Tạp Chí Khoa Học và Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 3 (7), 47-

54.

[3] Phạm Minh Nhựt (2014). Các phương pháp phân tích vi sinh, Trƣờng Đại học

Công nghệ TP. HCM, TP Hồ Chí Minh.

[4] Nguyễn Phi Kim Phụng (2007). Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại

học Quốc gia TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh.

[5] Nguyễn Tiến Toàn, Nguyễn Xuân Duy (2014) – Hoạt tính chống oxy hóa và ức chế

enzyme polyphenoloxydase của một số loài thực vật ăn được ở Việt Nam. Tạp chí

khoa học và phát triển 2013, tập số 11, số 3:364-372.

[6] Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuật, Lê Danh Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc

Duyên (2015) – Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Tía tô. Tạp chí khoa học và

phát triển 2015, tập số 13, số 2:245-240.

[7] Trần Thị Kim Ngân (2015). “Nghiên cứu thành phần alkaloid, flavonoid và hoạt

tính chống oxy hóa của lá sen nelumbo nucifera”, Đồ án tốt nghiệp, Trƣờng Đại

học Công nghệ TP. HCM, TP. Hồ Chí Minh.

[8] Trần Tiến Trung (2015). “Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của gạo mần từ gạo

nương đỏ Tây Nguyên ở hai điều kiện ủ khác nhau”, Đồ án tốt nghiệp, Trƣờng Đại

học Công nghệ TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh.

72

 Tài liệu Tiếng Anh

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

[9] A. C. Ovando, M. L. Pacheco-Hernández, M. E. Páez-Hernández, et al.

(2009),“Chemical studies of anthocyanins: A review”, Food Chemistry, 113,859-

871.

[10] A. Dreiseitel, P. S. G. Korte, A. Oehme, et al. (2009), “Berry anthocyanins and

their aglycons inhibit monoamine oxidases A and B”, Pharmacol Res, 59 (5), 306-

311.

[11] Asolini FC, Tedesco AM, Ferraz C, Alencar SM, Carpes ST (2006). Antioxidant

and antibacterial activities of phenolic compounds in extracts of plants used as

tea. Braz J Food Technol. 2006;9(6):209-15.

[12] Brown JE, Rice-Evan CA. Luteolin-rich Artichoke extract protects low density

lipoprotein from oxidation in vitro. Free Radic Res. 1998;29:247–255.

[13] C. F. Timberlake, P. Bridle (1982), “Distribution of Anthocyanins in Food

Plants”, In Pericles Markakis, editor, Anthocyanins as Food Colors, Academic

Press.

[14] Cheeseman KH, Slater TF. An introduction to free radicals chemistry. Br Med

Bull. 1993;49:481–93.

[15] Ebadi M. Antioxidants and free radicals in health and disease: An introduction to

reactive oxygen species, oxidative injury, neuronal cell death and therapy in

neurodegenerative diseases. Arizona: Prominent Press; 2001.

[16] Essential oils: their antibacterial properties and potential applications foods a

review, Int. J. Food Microbiol. 94, p.223-253.

[17] Furuta S, Nishiba Y, Suda I. Fluorometric assay for screening antioxidative

activities of vegetables. J Food Sci. 1997;62:526–8.

[18] G. C. Cretu, G. E. Morlock (1 March 2014), “Analysis of anthocyanins in

powdered berry extracts by planar chromatography linked with bioassay and mass

73

spectrometry”, Food Chemistry, 146,104-112.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

[19] Ghosh, Dilip, and Tetsuya Konishi. "Anthocyanins and anthocyanin-rich extracts:

role in diabetes and eye function." Asia Pacific journal of clinical nutrition 16.2

(2007): 200-208.

[20] Griffin Shane G s. Grant ie, Julie L Markham and David The role N. (1999), of

structure and molecular properties of terpenoids in determining their antimicrobial

activity, Flavour Fragr, J., 14.322-332

[21] Halliwell B. How to characterize an antioxidant- An update. Biochem Soc Symp.

1995;61:73–101.

[22] Lin JK, Lin CH, Ling YC, Lin-Shian SY, Juan IM. Survey of catechins, gallic acid

and methylxantines in green, oolong, puerh and black teas. J Agric Food Chem.

1998;46:3635–42.

[23] P. Bridle, C. F. Timberlake (1996), “Anthocyanins as natural food colors-selected

aspects”, Food Chemistry, 58,103-109.

[24] Rock CL, Jacob RA, Bowen PE. Update o biological characteristics of the

antioxidant micronutrients- Vitamin C, Vitamin E and the carotenoids. J Am Diet

Assoc. 1996;96:693–702.

[25] Shi HL, Noguchi N, Niki N. Comparative study on dynamics of antioxidative

action of α- tocopheryl hydroquinone, ubiquinol and α- tocopherol, against lipid

peroxidation. Free Radic Biol Med. 1999;27:334–46.

[26] Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM. (1999) Analysis of total phenol

and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu

reagent. Method Enzymol 299: 152-78.

[27] T. Fossen, M. Andersen (2000), “Anthocyanins from tubers and shoots of the

purple potato, Solanum tuberosum”, J. Ilort Sci. Biotech, 75,360-363.

[28] Wang H, Cao G, Prior RL. Total antioxidant capacity of fruits. J Agric Food

74

Chem. 1996;44:701–5.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

[29] X. Wu (2005), “Identification and characterization of anthocyanins by HPLCƢ

ESI-MS/MS in common foods in the United States: Vegetables, nuts, and grains”,

J Agric Food Chem, 53 (8), 3101-3113.

[30] Z. Xu, L. R. Howard (2012), “Analysis Methods of Anthocvanins”, Analysis of

Antioxidant-RichPhytochemicals, 5,945-978.

 Tài liệu Internet

[31] http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/240816

[32] https://en.wikipedia.org/wiki/Basella_alba

[33] http://kythuatnuoitrong.edu.vn/cay-luong-thuc/cach-trong-rau-mong-toi-trong-

thung-xop.html

[34] http://nongnghiep.vn/ky-thuat-trong-rau-mong-toi-an-toan-post60316.html

[35] http://123doc.org/document/2699012-nhom-hop-chat-flavonoid-tong-quan- hoat-

tinh-sinh-hoc-cac-phuong-phap-chiet-suat-va-ung-dung.htm?page=7

[36] https://vi.scribd.com/document/329935999/T%E1%BB%95ng-Quan-

V%E1%BB%81-Chi%E1%BA%BFt-Xu%E1%BA%A5t-

D%C6%B0%E1%BB%A3c-Li%E1%BB%87u

[37] https://www.2lua.vn/article/cach-trong-rau-mong-toi-hieu-qua-2198.html

[38] http://www.cesti.gov.vn/khong-gian-cong-nghe/cong-nghe-trich-ly-su-dung- co2-

sieu-toi-han-nang-gia-tri-qua-gac.html

[39] http://www.duoclieu.org/2011/11/vai-tro-va-hoat-tinh-sinh-hoc-cua.html

[40] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4519477/

[41] http://www.worldcrops.org

[42] https://sites.google.com/site/raurungvietnam/rau-day-leo/rau-mong-toi

[43] http://soha.vn/song-khoe/tac-dung-va-tac-hai-cua-rau-mong-toi-

75

20141124153524856.htm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

[44] http://sonnptnt.baria-vungtau.gov.vn/web/guest/khoa-hoc-cong-nghe/-

/brvt/extAssetPublisher/content/1558018/san-xuat-rau-mong-toi-theo-chuan-

vietgap-can-khuyen-cao-mo-rong

[45] http://tai-lieu.com/tai-lieu/dai-cuong-chiet-pha-ran-va-ung-dung-cua-chiet-pha-

ran-566/

76

[46] http://yduochoaviet.com/rau-mong-toi.html

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM VÀ PHẦN QUẢ MỒNG TƠI SỬ

DỤNG.

A.1. Kết quả

M (g) M1 (g) M2 (g) Độ ẩm (%) Độ lệch chuẩn

1 19,2250 24,2370 19,9009 86,51

0,29 2 34,2040 39,2160 34,9048 86,02

3 20,3600 25,4260 21,0740 85,91

M1 (g) M2 (g) Độ lệch chuẩn Tỉ lệ trong lƣợng (%)

40,2770 16,0180 39,77 1 0,53

39,7260 16,2218 40,83 2

1

A.2. Hình ảnh

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HIỆU SUẤT THU HỒI CAO CHIẾT QUẢ

MỒNG TƠI CHÍN BASELLA ALBA L. TỪ CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU.

B.1. Kết quả đánh giá

Hiệu suất (%) Ethanol 30% Ethanol 50% Ethanol 70%

2,486 2,161 2,423 2,200 2,679 2,320 Nƣớc cất 2,588 2,146 1 2

HIEU SUAT THU HOI DICH CHIET 01:15 Friday, July 7, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values dungmoi 4 m30 m50 m70 mnuoc Number of Observations Read 8 Number of Observations Used 8 HIEU SUAT THU HOI DICH CHIET 01:15 Friday, July 7, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: HS Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 0.04449637 0.01483212 0.26 0.8499 Error 4 0.22623950 0.05655988 Corrected Total 7 0.27073587 R-Square Coeff Var Root MSE HS Mean 0.164353 10.01203 0.237823 2.375375

2

B.2. Kết quả xử lý số liệu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F dungmoi 3 0.04449637 0.01483212 0.26 0.8499 HIEU SUAT THU HOI DICH CHIET 01:15 Friday, July 7, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for HS NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.05656 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.6603 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N dungmoi A 2.4995 2 m70 A A 2.3670 2 mnuoc A A 2.3235 2 m30 A A 2.3115 2 m50 HIEU SUAT THU HOI DICH CHIET 01:15 Friday, July 7, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for HS NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

3

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 0.05656 Critical Value of t 4.60409 Least Significant Difference 1.095 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N dungmoi A 2.4995 2 m70 A A 2.3670 2 mnuoc A A 2.3235 2 m30 A A 2.3115 2 m50 PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA DUNG MÔI ĐẾN

HÀM LƢỢNG POLYPHENOL TỔNG

C.1. Hàm lƣơng polyphenol tổng

OD Độ lệch chuẩn

Loại cao chiết Ethanol 30% 7,87

Ethanol 50% 3,51

Ethanol 70% 2,89

Nƣớc cất

0,79

0,310 0,302 0,360 0,292 0,261 0,284 0,284 0,301 0,276 0,302 0,299 0,295 P mg GAE/ gdb 108,11 104,63 129,85 87,04 75,34 84,02 87,06 93,71 83,92 94,10 92,93 91,36

HAM LUONG POLYPHENOL TONG SO 1 21:46 Thursday, July 6, 2017

4

C.2. Kết quả xử lý số liệu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values dungmoi 4 m30 m50 m70 mnuoc Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 HAM LUONG POLYPHENOL TONG SO 2 21:46 Thursday, July 6, 2017 The ANOVA Procedure Dependent Variable: PP Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 1749.011692 583.003897 9.31 0.0055 Error 8 501.135600 62.641950 Corrected Total 11 2250.147292 R-Square Coeff Var Root MSE PP Mean 0.777288 8.389587 7.914667 94.33917 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F dungmoi 3 1749.011692 583.003897 9.31 0.0055 HAM LUONG POLYPHENOL TONG SO 3 21:46 Thursday, July 6, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for PP

5

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 62.64195 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 14.902 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N dungmoi A 114.197 3 m30 B 92.797 3 mnuoc B B 88.230 3 m70 B B 82.133 3 m50 HAM LUONG POLYPHENOL TONG SO 4 21:46 Thursday, July 6, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for PP NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 62.64195 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 21.684 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N dungmoi

6

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A 114.197 3 m30 A B A 92.797 3 mnuoc B B 88.230 3 m70 B B 82.133 3 m50

PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA DUNG MÔI ĐẾN

KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA

D.1. Khả năng kháng oxy hóa

OD % I

Ethanol 30%

Ethanol 50%

Ethanol 70%

Nƣớc cất

Vitamin C

7

0,119 0,115 83,19 83,76 0,272 0,229 61,68 67,66 0,330 0,345 53,39 51,27 0,440 0,439 37,85 37,99 0,497 0,511 29,80 27,82 0,132 0,174 81,36 75,42 0,236 0,261 61,14 58,66 0,393 0,331 44,49 53,25 0,473 0,461 33,19 34,89 0,521 0,529 26,41 25,28 0,103 0,07 85,45 90,11 0,151 0,138 68,67 73,15 0,288 0,297 59,32 58,05 0,365 0,352 42,44 49,28 0,483 0,472 38,37 34,33 0,161 0,123 77,26 82,63 0,253 0,259 64,27 63,42 0,314 0,355 55,65 49,86 0,399 0,40 43,75 43,50 0,471 0,489 33,47 36,93 0,03 0,043 95,76 93,93 0,253 0,235 64,27 66,81 0,393 0,369 44,49 47,88 0,495 0,536 30,08 24,29 0,603 0,591 14,89 16,57 Độ lệch chuẩn 0,29 3,04 1,06 0,07 0,99 2,97 0,72 4,38 0,85 0,57 2,33 1,33 0,64 1,99 1,17 2,69 0,43 2,90 0,13 0,99 0,53 0,88 1,01 1,79 0,43

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

VITAMIN C 01:18 Friday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values nongdo 5 12.5 125 25 50 75 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 VITAMIN C 01:18 Friday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: II Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 12023.18993 3005.79748 891.80 <.0001 Error 10 33.70487 3.37049 Corrected Total 14 12056.89480 R-Square Coeff Var Root MSE II Mean 0.997205 3.703628 1.835889 49.57000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 4 12023.18993 3005.79748 891.80 <.0001 VITAMIN C 01:18 Friday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II

8

D.2. Kết quả xử lý xố liệu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 3.370487 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 3.34 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 94.917 3 125 B 65.067 3 75 C 45.923 3 50 D 26.550 3 25 E 15.393 3 12.5 VITAMIN C 01:18 Friday, July 9, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 3.370487 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 4.7507 Means with the same letter are not significantly different.

9

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

t Grouping Mean N nongdo A 94.917 3 125 B 65.067 3 75 C 45.923 3 50 D 26.550 3 25 E 15.393 3 12.5

DUNG MOI ETHANOL 30 01:59 Friday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values nongdo 5 12.5 125 25 50 75 Number of Observations Read 10 Number of Observations Used 10 DUNG MOI ETHANOL 30 01:59 Friday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: II Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 3751.665240 937.916310 205.12 <.0001 Error 5 22.862850 4.572570 Corrected Total 9 3774.528090 R-Square Coeff Var Root MSE II Mean 0.993943 4.002090 2.138357 53.43100

10

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 4 3751.665240 937.916310 205.12 <.0001 DUNG MOI ETHANOL 30 01:59 Friday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 4.57257 Critical Value of t 2.57058 Least Significant Difference 5.4968 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 83.475 2 125 B 64.620 2 75 C 52.330 2 50 D 37.920 2 25 E 28.810 2 12.5 DUNG MOI ETHANOL 30 01:59 Friday, July 9, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

11

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 4.57257 Critical Value of t 4.03214 Least Significant Difference 8.6222 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 83.475 2 125 B 64.620 2 75 C 52.330 2 50 D 37.920 2 25 E 28.810 2 12.5 DUNG MOI ETHANOL 50 01:51 Friday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values nongdo 5 12.5 125 25 50 75 Number of Observations Read 10 Number of Observations Used 10 DUNG MOI ETHANOL 50 01:51 Friday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: II Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 3483.436440 870.859110 71.18 0.0001 Error 5 61.169250 12.233850

12

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Corrected Total 9 3544.605690 R-Square Coeff Var Root MSE II Mean 0.982743 7.079059 3.497692 49.40900 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 4 3483.436440 870.859110 71.18 0.0001 DUNG MOI ETHANOL 50 01:51 Friday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 12.23385 Critical Value of t 2.57058 Least Significant Difference 8.9911 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 78.390 2 125 B 59.900 2 75 C 48.870 2 50 D 34.040 2 25 D D 25.845 2 12.5 DUNG MOI ETHANOL 50 01:51 Friday, July 9, 2017 4

13

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 12.23385 Critical Value of t 4.03214 Least Significant Difference 14.103 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 78.390 2 125 B 59.900 2 75 B B 48.870 2 50 C 34.040 2 25 C C 25.845 2 12.5 DUNG MOI ETHANOL 70 01:37 Friday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values nongdo 5 12.5 125 25 50 75 Number of Observations Read 10 Number of Observations Used 10 DUNG MOI ETHANOL 70 01:37 Friday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: II

14

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 3303.426760 825.856690 77.54 0.0001 Error 5 53.253050 10.650610 Corrected Total 9 3356.679810 R-Square Coeff Var Root MSE II Mean 0.984135 5.446747 3.263527 59.91700 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 4 3303.426760 825.856690 77.54 0.0001 DUNG MOI ETHANOL 70 01:37 Friday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 10.65061 Critical Value of t 2.57058 Least Significant Difference 8.3892 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 87.780 2 125 B 70.910 2 75

15

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

C 58.685 2 50 D 45.860 2 25 E 36.350 2 12.5 DUNG MOI ETHANOL 70 01:37 Friday, July 9, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 10.65061 Critical Value of t 4.03214 Least Significant Difference 13.159 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 87.780 2 125 B 70.910 2 75 B C B 58.685 2 50 C C D 45.860 2 25 D D 36.350 2 12.5 DUNG MOI NUOC CAT 02:07 Friday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values nongdo 5 12.5 125 25 50 75

16

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Number of Observations Read 10 Number of Observations Used 10 DUNG MOI NUOC CAT 02:07 Friday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: II Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 2453.860640 613.465160 81.67 <.0001 Error 5 37.558800 7.511760 Corrected Total 9 2491.419440 R-Square Coeff Var Root MSE II Mean 0.984925 4.976503 2.740759 55.07400 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F nongdo 4 2453.860640 613.465160 81.67 <.0001 DUNG MOI NUOC CAT 02:07 Friday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 7.51176 Critical Value of t 2.57058 Least Significant Difference 7.0453

17

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 79.945 2 125 B 63.845 2 75 C 52.755 2 50 D 43.625 2 25 E 35.200 2 12.5 DUNG MOI NUOC CAT 02:07 Friday, July 9, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 5 Error Mean Square 7.51176 Critical Value of t 4.03214 Least Significant Difference 11.051 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N nongdo A 79.945 2 125 B 63.845 2 75 C 52.755 2 50 C D C 43.625 2 25 D D 35.200 2 12.5

18

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA DUNG MÔI ĐẾN

KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN

E.1. Môi trƣờng

NA 3 g meat extract NB 3 g meat extract

5 g pepton 5 g pepton

5 g NaCl 5 g NaCl

1000 ml nƣớc cất 15 g agar

1000 ml nƣớc cất pH 7,4 ± 0,2

pH 7,4 ± 0,2

E.2. Bacillus cereus

19

Ethanol 30% 0 0 0 0 Ethanol 50% 0 0 0 0 Ethanol 70% 13 13,5 12,5 0,289 Nƣớc cất 0 0 0 0 Kháng sinh 22 25 19 1,732 Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm) 1 2 3 Độ lệch chuẩn

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HOAT TINH KHANG BACILLUS CEREUS 1 11:31 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values BACILLUS 2 70 khangsin Number of Observations Read 6 Number of Observations Used 6 HOAT TINH KHANG BACILLUS CEREUS 2 11:31 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DK Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 121.5000000 121.5000000 26.27 0.0069 Error 4 18.5000000 4.6250000 Corrected Total 5 140.0000000 R-Square Coeff Var Root MSE DK Mean 0.867857 12.28904 2.150581 17.50000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F BACILLUS 1 121.5000000 121.5000000 26.27 0.0069 HOAT TINH KHANG BACILLUS CEREUS 3 11:31 Thursday, July 9, 2017

20

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 4.625 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 4.8753 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N BACILLUS A 22.000 3 khangsin B 13.000 3 70 HOAT TINH KHANG BACILLUS CEREUS 4 11:31 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 4 Error Mean Square 4.625 Critical Value of t 4.60409 Least Significant Difference 8.0845 Means with the same letter are not significantly different.

21

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

t Grouping Mean N BACILLUS A 22.000 3 khangsin B 13.000 3 70 E.3. Salmonella

Đƣờng kính vòng kháng Ethanol Ethanol Ethanol Nƣớc Kháng

khuẩn (mm) 30% 50% cất sinh 70%

11,5 9 0 15 0 1

11 10 0 17 0 2

14 10 0 18 0 3

HOAT TINH KHANG SALMONELLA 1 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Class Level Information

22

0 0 0,333 1,072 0,882 Độ lệch chuẩn

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Class Levels Values SAL 3 50 70 khangsin Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 HOAT TINH KHANG SALMONELLA 2 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DK Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 75.50000000 37.75000000 21.57 0.0018 Error 6 10.50000000 1.75000000 Corrected Total 8 86.00000000 R-Square Coeff Var Root MSE DK Mean 0.877907 10.30812 1.322876 12.83333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F SAL 2 75.50000000 37.75000000 21.57 0.0018 HOAT TINH KHANG SALMONELLA 3 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

23

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 1.75 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 2.643 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SAL A 16.667 3 khangsin B 12.167 3 70 B B 9.667 3 50 HOAT TINH KHANG SALMONELLA 4 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 1.75 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 4.0045 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SAL A 16.667 3 khangsin B 12.167 3 70 B B 9.667 3 50

24

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

E.4. E.coli

Đƣờng kính vòng kháng Ethanol Ethanol Ethanol Nƣớc Kháng

khuẩn (mm) 30% 50% 70% cất sinh

11 10 13 0 21 1

11 10 12 0 20 2

11 10 12 0 25 3

HOAT TINH KHANG ECOLI 11:53 Thursday, July 9, 2017 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values E 4 30 50 70 khangsin Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12

25

0 0 0 0,333 1,528 Độ lệch chuẩn

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

HOAT TINH KHANG ECOLI 11:53 Thursday, July 9, 2017 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DK Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 275.0000000 91.6666667 50.00 <.0001 Error 8 14.6666667 1.8333333 Corrected Total 11 289.6666667 R-Square Coeff Var Root MSE DK Mean 0.949367 9.787998 1.354006 13.83333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F E 3 275.0000000 91.6666667 50.00 <.0001 HOAT TINH KHANG ECOLI 11:53 Thursday, July 9, 2017 3 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 1.833333 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 2.5494 Means with the same letter are not significantly different.

26

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

t Grouping Mean N E A 22.000 3 khangsin B 12.333 3 70 B B 11.000 3 30 B B 10.000 3 50 HOAT TINH KHANG ECOLI 11:53 Thursday, July 9, 2017 4 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 1.833333 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 3.7095 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N E A 22.000 3 khangsin B 12.333 3 70 B B 11.000 3 30 B B 10.000 3 50 E.5. Staphylococcus aureus

Đƣờng kính vòng kháng Ethanol Ethanol Ethanol Nƣớc Kháng

khuẩn (mm) 30% 50% 70% cất sinh

27

12 12 13 12 20 1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

13 12 14 13 24 2

13,5 11 14 12 25 3

HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1 11:59 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values SA 5 30 50 70 khangsin nc Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREUS 2 11:59 Thursday, July 9, 2017

28

0,441 0,333 0,333 0,333 1,528 Độ lệch chuẩn

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

The ANOVA Procedure Dependent Variable: DK Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4 264.7333333 66.1833333 38.55 <.0001 Error 10 17.1666667 1.7166667 Corrected Total 14 281.9000000 R-Square Coeff Var Root MSE DK Mean 0.939104 8.913036 1.310216 14.70000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F SA 4 264.7333333 66.1833333 38.55 <.0001 HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREUS 3 11:59 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.716667 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 2.3836 Means with the same letter are not significantly different.

29

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

t Grouping Mean N SA A 23.000 3 khangsin B 13.667 3 70 B B 12.833 3 30 B B 12.333 3 nc B B 11.667 3 50 HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREUS 4 11:59 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.716667 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 3.3904 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N SA A 23.000 3 khangsin B 13.667 3 70 B B 12.833 3 30 B B 12.333 3 nc B B 11.667 3 50

30