Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh Phú Thọ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- - - - -  - - - - -

Nguyễn Phú Tâm

PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH

KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG

TANG TẠI TỈNH PHÚ THỌ

Chuyên ngành vi sinh vật học

Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. Phí Quyết Tiến

HÀ NỘI - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả đƣợc công bố trong luận văn

là hoàn toàn trung thực, chính xác và chƣa đƣợc công bố ở bất kỳ công trình

nào khác.

Hà Nội, ngày 9 tháng 12 năm 2016

Học viên

Nguyễn Phú Tâm

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Phí Quyết Tiến

chủ nhiệm đề tài VAST04.07/16-17 đã hết lòng giúp đỡ, động viên và tạo mọi

điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn

thành luận văn tốt nghiệp.

Tiếp theo, tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô của trường

Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật và các thầy, cô

của Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giảng dạy cho tôi trong suốt thời

gian tham gia khóa học.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn NCS. Vũ Thị Hạnh Nguyên, NCS.

Quách Ngọc Tùng và các cán bộ phòng Công nghệ lên men – Viện Công nghệ

sinh học đã chỉ bảo nhiệt tình, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện

luận văn tốt nghiệp.

Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những

người đã giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học

tập.

Hà Nội, ngày 9 tháng 12 năm 2016

Học viên

Nguyễn Phú Tâm

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................... viii

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

1.1. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu ...................................... 3

1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh .......................................................... 3

1.1.2. Các phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh ................................ 4

1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ............................... 5

1.1.3.1. Kháng ung thƣ, kháng viêm ................................................. 5

1.1.3.2. Kiểm soát sinh học ............................................................... 7

1.1.3.3. Một số dƣợc chất khác từ xạ khuẩn nội sinh ....................... 7

1.1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh ......................................... 9

1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...................................... 9

1.1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ..................................... 10

1.2. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ................................... 12

1.3. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu15

1.3.1. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh ........................................... 15

1.3.2. Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh và các hợp

chất trao đổi thứ cấp ................................................................................ 17

1.3.2.1. Gen chức năng pks-I, pks-II tham gia tạo polyketide đa

vòng thơm ....................................................................................... 17

1.3.2.2. Gen chức năng nrps ........................................................... 18

1.3.2.3. Đánh giá đa dạng gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS ....... 18

1.3.3. Chất kháng sinh và kháng sinh điều trị ung thƣ nhóm

anthracycline ........................................................................................... 20

1.4. Cây Màng tang và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng

tang .................................................................................................................. 22

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 24

2.1.1. Mẫu cây Màng tang, chủng giống vi sinh vật ............................... 24

2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu .......................................... 24

2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy ...................................................................... 24

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 25

2.2.1. Lấy mẫu cây Màng tang ................................................................ 25

2.2.2. Phƣơng pháp xử lý bề mặt mẫu .................................................... 25

2.2.4. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn ...... 26

2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28 ....... 26

2.2.5.1. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh

melanin ............................................................................................ 26

2.2.5.2. Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử .... 27

2.2.5.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ................................................. 27

2.2.6. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa trên phân tích trình tự gen

16S rDNA ................................................................................................ 28

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 30

3.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh Phú Thọ ........... 30

3.2. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang .................................. 32

3.2.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây Màng tang....... 32

3.2.2. Đa dạng xạ khuẩn trên cây Màng tang theo môi trƣờng phân lập 33

3.2.3. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty .... 34

3.3. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh ................... 35

3.3.1. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn ................... 35

3.3.2. Xác định gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và

nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp

kháng sinh ....................................................................................... 39

3.3.3. Khả năng sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline .............. 41

3.4. Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn MPT28 ................. 42

3.4.1. Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 ................................. 43

3.4.1.1. Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử ....................... 43

3.4.1.2. Đặc điểm sinh hóa .............................................................. 44

3.4.1.3. Ảnh hƣởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả năng

sinh trƣởng của xạ khuẩn ................................................................ 45

3.4.2. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA của

chủng xạ khuẩn MPT28 .......................................................................... 46

3.4.2.1. Khuếch đại gen 16S rDNA ................................................ 46

3.4.2.2. Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA ..................................... 46

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 48

4.1. Kết luận .................................................................................................... 48

4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 48

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm

anthracycline: DOX, DNR, EPI và IDA ......................................................... 21

Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập trên một

số môi trƣờng đặc hiệu sau 6 tuần nuôi cấy....................................................30

Hình 3.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân bố trên các bộ phận của cây Màng

tang .................................................................................................................. 32

Hình 3.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang đƣợc phân lập trên các

loại môi trƣờng khác nhau .............................................................................. 33

Hình 3.4. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh đƣợc phân theo nhóm màu ...... 35

Hình 3.5. Hoạt tính kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A)

Bacillus cereus ATCC 11778 (B) của các chủng xạ khuẩn nội sinh ............... 37

Hình 3. 6. Sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I, pks-II của một số chủng xạ

khuẩn nội sinh đại diện ................................................................................... 39

Hình 3. 7. Sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps của một số chủng xạ khuẩn nội

sinh đại diện .................................................................................................... 40

Hình 3. 8. Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trƣờng ISP1 và bề mặt chuỗi bào

tử (B) dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần của chủng

MPT28 ............................................................................................................. 44

Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel

agarose 1,0% ................................................................................................... 46

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội

sinh trên thực vật ............................................................................................... 9

Bảng 1.2. Xạ khuẩn mới đƣợc phân lập từ các cây dƣợc liệu ........................ 14

Bảng 1.3. Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh ...................................... 16

Bảng 1.4. Tần xuất xuất hiện gen pks-I, nrps trong các phân nhóm xạ khuẩn

khác nhau.........................................................................................................19

Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen

16S rDNA………………………………………………………………........28

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân

lập từ mẫu cây Màng tang...............................................................................31

Bảng 3.2. Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 25

chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây Màng tang ...................................... 36

Bảng 3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn .... 37

Bảng 3.4. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS và khả năng sinh

anthracycline của 14 chủng xạ khuẩn nội sinh ............................................... 41

Bảng 3.5. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của chủng MPT28 ............ 42

Bảng 3.6. Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT28 khi nuôi cấy trên các môi

trƣờng khác nhau ............................................................................................. 43

Bảng 3.7. Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nitơ của chủng xạ khuẩn MPT28

sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C ....................................................................... 44

Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng của

chủng MPT28 .................................................................................................. 45

Bảng 3.9. Trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng MPT28 ....................... 47

viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

STT Từ viết tắt Tên đầy đủ

Aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase ACCd 1

Acyl carrier protein ACP 2

Acyl transferase AT 3

Citrate acid-agar CA 4

Deacetil baceatin DAB 5

Deoxyribonucleotide acid DNA 6

Daunorubicin DNR 7

DOX1 Doxorubicin 8

Epirubicin EPI 9

Horizontal gene transfer HGT 10

Humic acid-agar HV 11

Indol-3-acetic acid IAA 12

Idarumycin IDA 13

Ketosynthase KS 14

MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus 15

NaOCl Sodium hypochlorite 16

NRPS Nonribosomal peptide synthetase 17

PKS Ppolyketide synthase 18

PKS-I Polyketide synthase I 19

PKS-II Polyketide synthase II 20

RNA Ribonucleic acid 21

RA Raffinose-histidine agar 22

SPA Sodium propionate-asparagine-salt agar 23

VSV Vi sinh vật 24

MỞ ĐẦU

Vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc kháng sinh là vấn đề

nghiêm trọng và thu hút mối quan tâm rất lớn của cộng đồng. Vì vậy, việc

nghiên cứu, lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ƣu tiên

hàng đầu của các nhà khoa học và các công ty dƣợc phẩm trên thế giới. Cho

đến nay, các nhà khoa học vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự

nhiên khác nhau để phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng nhƣ các loại

thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng

phụ tới sức khỏe của ngƣời bệnh do một số thuốc tổng hợp hóa học gây ra.

Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật là một nguồn tự nhiên quan

trọng trong điều trị các bệnh gây ra bởi vi sinh vật và hỗ trợ điều trị chống

ung thƣ. Chẳng hạn, cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) là cây bụi

thuộc họ Lauraceae, trong quả Màng tang rất giàu tinh dầu, lƣợng tinh dầu tối

đa trong quả là khoảng 5% trọng lƣợng tƣơi. Thành phần chính của tinh dầu

là citral có hoạt tính sinh học nhƣ chống viêm, chống oxy hóa, diệt côn trùng,

kháng khuẩn, chống ung thƣ. Cây quế (Cinamomum loureiri) chứa dƣợc chất

trong tinh dầu của lá, vỏ cây và quả với 90% là cinnamaldehyde có hoạt tính

kháng khuẩn cao đối với cả vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-). Ngoài

giá trị khoa học, thành phần của cây mang lại, cây dƣợc liệu còn là môi

trƣờng cho các xạ khuẩn nội sinh (sống trong các loại mô thực vật) có khả

năng sinh tổng hợp chất kháng sinh. Theo các nghiên cứu, ƣớc tính khoảng

70% các kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên đƣợc sử dụng trong y học lâm

sàng hiện nay đƣợc sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn. Gần đây, một số công bố cho

thấy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do xạ khuẩn nội sinh tạo ra trên cây

dƣợc liệu không chỉ có số lƣợng phong phú mà còn có sự đa dạng về chức

năng nhƣ tính kháng vi sinh vật, chống ôxi hóa, chống sốt rét và kiểm soát

sinh học. Tuy nhiên, số lƣợng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây

Màng tang nói riêng và cây dƣợc liệu nói chung tại Việt Nam vẫn còn rất hạn

chế. Xuất phát từ những định hƣớng trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề

tài: “Phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ

khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh Phú Thọ”.

Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ

sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm 3 nội dung

chính:

- Phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng

tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ.

- Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định các chủng xạ

khuẩn nội sinh và xác định sự có mặt của ba gen mã hóa các

enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh gồm

polyketide synthases I (PKS-I), polyketide synthases II (PKS-II)

và nonribosomal peptide synthetase (NRPS).

- Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một

chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu

1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh

Hiện nay, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới công bố về tƣơng

tác giữa thực vật và vi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò nhƣ tác

nhân ức chế sinh vật gây bệnh, tổng hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật,

phân giải phospho khó hoà tan, cố định nitơ tự do, tăng độ phì của đất... [16],

[53]. Phần lớn các VSV bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn đƣợc phân

lập từ đất, vùng rễ, bề mặt hoặc trong các mô thực vật.

Khái niệm xạ khuẩn nội sinh đƣợc đƣa ra khi Smith và cộng sự (1957)

phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế nấm

gây bệnh Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh [58].

Từ đó, đã có nhiều định nghĩa khác nhau về VSV nội sinh nhƣng định nghĩa

của Bacon và White (2000): „„VSV nội sinh là những VSV sinh trƣởng trong

mô tế bào thực vật, không gây ra những hiệu ứng xấu tới cây chủ‟‟ đã đƣợc

các nhà VSV học thừa nhận [11]. Theo tài liệu, định nghĩa này hàm chứa một

ý rất quan trọng: VSV nội sinh không những không gây ảnh hƣởng mà còn

tăng cƣờng khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trƣởng, miễn dịch cho vật

chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất... [9].

Trong số các VSV nội sinh, xạ khuẩn đƣợc chú ý bởi khả năng tổng

hợp kháng sinh ức chế VSV gây bệnh [39]. Song song với tác dụng dƣợc lý

thu nhận từ xạ khuẩn nội sinh, một số nhà sinh vật học đã nghiên cứu khả

năng kiểm soát sinh học (biocontrol) của xạ khuẩn nội sinh trong suốt hai thập

kỷ qua [61], [62]. Xạ khuẩn đã đƣợc chứng minh khả năng tăng cƣờng, thúc

đẩy tăng trƣởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cƣờng

khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau [4]. Những hiểu

biết về sinh lý và mối tƣơng tác phân tử giữa xạ khuẩn và thực vật là những

đặc tính quan trọng để khai thác những đặc tính có lợi của xạ khuẩn nội sinh

trong kích thích sinh trƣởng thực vật và lĩnh vực khác.

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai trò quan trọng của xạ

khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh

trong mô thực vật là rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất

có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực

của đời sống. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh đƣợc

chứng minh là rất đa dạng về mặt số lƣợng và hoạt tính sinh học nhƣ: các chất

kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng ung thƣ, chống oxy hóa, chống

sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trƣởng... [11], [51]. Vì vậy, nghiên

cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt tính kháng

sinh nói riêng từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu tự nhiên đang là hƣớng

nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới.

1.1.2. Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh

Xạ khuẩn cƣ trú trong mô thực vật bị ảnh hƣởng lớn bởi các yếu tố môi

trƣờng nhƣ: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất,

lƣợng mƣa, cƣờng độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ... Thêm vào đó,

mật độ xạ khuẩn nội sinh nhìn chung thấp và phụ thuộc vào loại mô khác

nhau trên thực vật [50].

Theo các công trình công bố, quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh cần

xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt. Do đó, phải

khử trùng bề mặt mẫu và cắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử

trùng trƣớc khi phân lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những

tác nhân oxy hóa phổ biến đƣợc sử dụng để khử trùng bề mặt. Mẫu thực vật

đƣợc ngâm trong ethanol 70-99% từ 1-5 phút và 1-5% NaOCl trong khoảng

3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nƣớc vô trùng nhằm loại bỏ lƣợng

NaOCl còn dƣ. Ngoài ra, hydro peroxide và clorua thủy ngân cũng đƣợc sử

dụng nhƣ chất khử trùng bề mặt hiệu quả [43]. Năm 1992, Sardi và cộng sự

công bố sử dụng hơi của propylen oxit để khử trùng bề mặt thay vì hóa chất

khử trùng dạng lỏng [62]. Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý

bề mặt chỉ với ethanol không hiệu quả với qua trình phân lập VSV nội sinh.

Nếu tăng gấp hai hoặc ba lần các bƣớc khử trùng bề mặt bằng hỗn hợp

ethanol và một số chất khử trùng khác thì không phân lập đƣợc xạ khuẩn nội

sinh. Hiệu quả khử trùng bề mặt đƣợc tăng cƣờng bằng việc sử dụng các chất

hoạt hóa bề mặt nhƣ Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của

chất khử trùng với bề mặt thực vật [13].

Phần mẫu đã khử trùng đƣợc đặt vào trên môi trƣờng thạch thích hợp,

nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C. Trong quá trình phân lập, các nhà

nghiên cứu thƣờng gặp phải là VSV phát triển mạnh trong hai tuần đầu tiên là

vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh

trƣởng của vi khuẩn và nấm không mong muốn cũng nhƣ tìm kiếm loài xạ

khuẩn mới, một số môi trƣờng chọn lọc đã đƣợc sử dụng nhƣ: môi trƣờng

thạch humic acid-vitamin, môi trƣờng thạch casein tinh bột, cao nấm men,

môi trƣờng S… [14], [35], [39]. Ngoài ra, bổ sung các hợp chất kháng sinh

nhƣ acid nalidixic và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide để ức chế vi

khuẩn, nấm nội sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì

xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm [30], [51].

1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật

Phần lớn xạ khuẩn nội sinh có thể sống trong các mô thực vật và không

gây bệnh hoặc tác động bất lợi tới quá trình phát triển bình thƣờng của cây.

Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh còn đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu về khả

năng sinh kháng sinh, chất kháng ung thƣ, enzyme, chất kích thích sinh

trƣởng thực vật, ức chế và kiểm soát bệnh thực vật...

1.1.3.1. Kháng ung thư, kháng viêm

Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng,

ức chế tế bào ung thƣ từ xạ khuẩn nội sinh đang là hƣớng nghiên cứu mới của

các nhà khoa học trên thế giới. Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội sinh

có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ. Một số giả thuyết nhận định

rằng gen liên quan tới tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc tiếp

nhận từ quá trình trao đổi chất giữa VSV và thực vật thông qua hệ thống

chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Nhờ đó các nhà VSV học

đã mở ra triển vọng sản xuất các hợp chất sinh học có nguồn gốc từ thực vật

nhờ quá trình nuôi cấy VSV, ví dụ nhƣ chất kháng tế bào ung thƣ paclitaxel

phổ biến trên cây thông đỏ (Taxus sp.) đƣợc tách chiết từ xạ khuẩn

Kitasatospora sp. và một số nấm cộng sinh khác [39].

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh

mới trên xạ khuẩn nội sinh có tỷ lệ khá cao so với xạ khuẩn phân lập từ đất

hoặc bề mặt thực vật. Chẳng hạn kháng sinh mới có tên naphthomycin K (dẫn

xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) đƣợc phát

hiện lần đầu tiên từ Streptomyces sp. CS nội sinh trong cây mỹ đăng mộc

(Maytenus hookeri) - loại cây thuốc có tác dụng điều trị ung thƣ, hoạt huyết...

Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính

gây độc ức chế dòng tế bào P388 và A-549 ở nồng độ ức chế lần lƣợt là 0,07

và 3,17 µM, nhƣng không có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và vi

khuẩn lao [40], [72].

Ngoài ra, năm chất mới thuộc phân lớp 16 của nhóm macrolide đƣợc

tách chiết và cho kết quả ức chế mạnh dòng tế bào MDA-MB-435 trong điều

kiện in vitro [72]; hai chất mới thuộc nhóm macrolide thu nhận từ

Streptomyces sp. ls9131 gần đây đƣợc phân lập trên cây mỹ đăng mộc (M.

hookeri), trong đó hợp chất dimeric dinactin có tác động kháng ung thƣ mạnh

và hoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cao [40].

Trƣớc đây, hai hợp chất 5, 7-dimetoxy-4-phenylcoumarin và 5, 7-

dimetoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ

mạnh, thƣờng thu nhận từ nhiều loài thực vật khác nhau. Nhƣng gần đây,

nhiều công trình công bố rằng hai hợp chất này cũng đƣợc tìm thấy trong S.

aureofaciens CMUAc130 nội sinh [63], [64]. Hoạt tính kháng ung thƣ của hai

chất trên không chỉ hình thành nhóm nitric oxide, prostaglandin E2 và tác

nhân hoại tử khối u (TNF-α), mà còn cảm ứng nitric oxide synthase và

cyclooxygenase-2 trong lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào RAW

264,7. Tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ chất và ức chế sự hình thành

TNF-α [63].

Do vậy, hiện nay xạ khuẩn nội sinh là nguồn tiềm năng cần đƣợc quan

tâm nhằm khai thác các chất có hoạt tính sinh học mới và thúc đẩy tìm kiếm

các loại thuốc mới.

1.1.3.2. Kiểm soát sinh học

Trong những năm gần đây, xạ khuẩn nội sinh đã thu hút sự chú ý của

các nhà VSV bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với mầm bệnh do đặc tính

nội sinh và tổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng VSV gây bệnh. Nhiều

nghiên cứu chứng minh đặc tính bảo vệ cây chủ của xạ khuẩn nội sinh chống

lại các VSV gây bệnh từ đất nhƣ Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae,

Plectosporium tabacinum, Gaeumannomyces graminis var. tritici, F.

oxysporum, Pythium aphanidermatum và Colletotrichum orbiculare [13],

[18], [23], [24].

Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm trao đổi

chất nhƣ chất kháng sinh, enzyme thủy phân, phytohormone... Ngoài ra, các

chủng xạ khuẩn giúp tăng cƣờng hệ thống miễn dịch đối với thực vật nhờ kích

thích các thụ thể tế bào. Ví dụ nhƣ chủng S. galbus R-5 không chỉ sinh

cellulase, pectinase mà còn sản xuất actinomycin X2 và fungichromin giúp

tăng cƣờng sức đề kháng trong cây đỗ quyên, tăng cƣờng sản sinh jasmonate

kích thích hệ thống miễn dịch [57].

Conn và cộng sự (2008) công bố kết quả nghiên cứu gây nhiễm

Streptomyces sp. EN27 và Micromonospora sp. EN43 trên hạt giống cây

Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh

Erwinia carotovora và F. oxysporum; kích hoạt biểu hiện gen tổng hợp acid

jasmonic, acid salicilic và etylen [17]. Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với

các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học đƣợc sinh ra bởi

xạ khuẩn nội sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng ứng dụng

trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng.

1.1.3.3. Một số dược chất khác từ xạ khuẩn nội sinh

Ngoài đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất thông

qua các enzyme thủy phân ngoại bào và khả năng sinh chất kháng sinh đã

đƣợc khoa học biết đến từ lâu. Gần đây, các nghiên cứu trên xạ khuẩn còn

phát hiện ra nhiều sản phẩm trao đổi chất của nhóm VSV này có ý nghĩa rất

quan trọng đối với sức khỏe con ngƣời.

Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất phá hủy tế bào hồng cầu

của động vật (nhƣ haemolysin ở Rhodococcus equi). Các nhà khoa học đã

phát hiện tiềm năng rất lớn của các hợp chất này trong xạ khuẩn có tác dụng

làm tan những phần máu đông tụ ở những ngƣời bị bệnh tim mạch. Trong

phòng thí nghiệm, việc sàng lọc các chất có hoạt tính chống đông máu (phá

hủy hồng cầu) từ xạ khuẩn đƣợc tiến hành trên mẫu máu động vật nhƣ máu

ngựa, máu thỏ [53].

Một ví dụ khác là việc tạo ra các hợp chất có khả năng chống lại các tác

nhân gây oxy hóa, làm tăng tuổi thọ của tế bào. Nguyên lý hoạt động của các

chất chống ôxy hóa tìm thấy ở xạ khuẩn cũng tƣơng tự nhƣ axit ascorbic

(vitamin C) hay tocopherol (vitamin E), tức là trung hòa thể oxy hóa rất cao

của các hợp chất oxy hóa (đƣợc tạo ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào

hay dƣới tác dụng của tia cực tím) và làm giảm tác dụng oxy hóa của chúng

[61].

Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Sri đã phân lập 65 xạ khuẩn nội sinh

trên 13 cây dƣợc liệu chữa bệnh tiểu đƣờng nhƣ cây lô hội (Alloe vera), dây

ký ninh (Tinospora crispa), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), nghệ

xanh (Curcuma aeruginosa), rau má (Centela asiatica)... Trong đó, các chủng

thể hiện hoạt tính alpha glucosidase ức chế quá trình thủy phân tinh bột thành

glucose thẩm thấu vào ruột non. Kết quả nghiên cứu trên đã tuyển chọn đƣợc

chủng BWA65 có hoạt tính ức chế alpha glucosidase gấp hơn hai lần so với

chất có hoạt tính tƣơng tự thu đƣợc từ dịch chiết cây dây ký ninh [60].

Mặc dù ý nghĩa khoa học của các hợp chất trao đổi chất kể trên đối với

sự sinh trƣởng và cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trƣờng tự nhiên còn

chƣa rõ ràng nhƣng tác dụng mà chúng mang lại trong lĩnh vực y dƣợc, dƣợc

phẩm, nông nghiệp đã đƣợc chứng minh. Chính vì lý do này, các nhà khoa

học hiện nay rất quan tâm tới việc sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học

cao từ xạ khuẩn nói chung và xạ khuẩn nội sinh nói riêng.

1.1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh

1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong vài thập kỷ qua đã chứng kiến nhiều thành tựu trong tìm kiếm

các loài xạ khuẩn và các hợp chất mới có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn trong

mô tế bào thực vật. Do tiềm năng ứng dụng lớn của xạ khuẩn nội sinh nên đối

tƣợng VSV này đang đƣợc quan tâm và nghiên cứu ở nhiều nƣớc trên thế giới

nhƣ: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản… Sơ lƣợc về tình

hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật trong hơn 10 năm gần đây

đƣợc thể hiện trong bảng 1.1 [51].

Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội

sinh trên thực vật

Loài thực vật

Chi xạ khuẩn

Tài liệu tham

khảo

Cây trồng

Lúa mì

Streptomyces, Microbispora,

[18]

(Triticum aestivum)

Micromonospora, Nocardioides

Dƣa leo

Streptomyces

[57]

(Cucumis sativus)

Ngô

Microbispora, Streptomyces,

[10]

(Zea mays)

Streptosporangium

Cây dƣợc liệu

Cơm cháy

Glycomyces

[51]

(Sambucus adnata)

Riềng nếp

Streptomyces, Nocardia, Microbispora,

[64]

(Alpinia galangal)

Micromonospora

Mộc lan

Streptomyces

[14]

(Kennedia nigricans)

Sầu đâu

Streptomyces, Streptosporangium,

[31]

(Azadirachta indica)

Microbispora, Streptoverticillium,

Saccharomonospora, Nocardia

Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật rất phong phú hứa

hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ

khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực đời sống. Tuy nhiên, so với sự đa dạng

của giới thực vật, số lƣợng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật

vẫn còn rất hạn chế.

Trong hơn 10 năm gần đây (2001-2012), các nhà khoa học thuộc Viện

VSV học Vân Nam, Trung Quốc đã không ngừng nghiên cứu, cải tiến, tối ƣu

hóa các điều kiện phân lập và đƣa vào bảo tàng giống hơn 5.000 chủng xạ

khuẩn nội sinh phân lập từ hơn 100 loài thực vật [50]. Các hợp chất chuyển

hóa thứ cấp do các chủng xạ khuẩn này sinh ra cũng đƣợc chứng minh là rất

đa dạng về mặt số lƣợng và hoạt tính sinh học nhƣ các chất kiểm soát sinh

học, chất kháng VSV, kháng tế bào ung thƣ, chống oxy hóa, chống sốt rét,

chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trƣởng… Khi nghiên cứu về đa dạng sinh

học xạ khuẩn nội sinh, nhóm nghiên cứu của Chen và cộng sự thuộc Viện

VSV học Vân Nam, Trung Quốc đã khẳng định xạ khuẩn nội sinh trên cây

dƣợc liệu tại rừng nhiệt đới vô cùng phong phú. Theo đó, Chen và cộng sự đã

thu nhận 2174 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng khác nhau từ 90 loại cây

dƣợc liệu tại rừng nhiệt đới Xishuangbanna và xác định đƣợc có 19 loài xạ

khuẩn mới [15].

Cũng từ những chủng xạ khuẩn đƣợc phân lập trên các cây dƣợc liệu

tại vùng Vân Nam, Trung Quốc nói trên, rất nhiều hợp chất mới đã đƣợc phát

hiện nhƣ: 9-hydroxybaﬁlomycin D, 29-hydroxybaﬁlomycin D, baﬁlomycin D,

baﬁlomycin E, baﬁlomycin A1, baﬁlomycin B1, baﬁlomycin B2, baﬁlomycin

C1, baﬁlomycin C2, baﬁlomycin C1 amide, baﬁlomycin C2 amide; caryolane-

1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene-1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8-

(hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, Tripstretine … [12].

1.1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu về VSV nội sinh nói chung và

xạ khuẩn nói riêng. Một số nghiên cứu khác về vi khuẩn, nấm nội sinh có thể

đƣợc tóm tắt nhƣ sau:

Nhóm nghiên cứu của Lê Mai Hƣơng tại Viện Hóa hợp chất thiên nhiên

đã thăm dò khả năng tạo chất taxol từ cây thông đỏ (Taxus sp.) ở Việt Nam và

tách chiết một chất gần giống 10-deacetil baceatin III (10-DAB)-chất chuyển

hóa thành taxol. Từ thân cây, nhóm nghiên cứu đã phân lập đƣợc 6 chủng

nấm, trong đó một chủng thuộc loài Mucor circinolloides var. tieghem. Chất

tách chiết từ dịch lên men của chủng nấm nội sinh có đặc điểm gần giống với

10-DAB từ cây thông đỏ. Từ kết quả đó, có thể khẳng định những sản phẩm

trao đổi chất có hoạt tính sinh học không chỉ đƣợc tạo ra từ cây chủ mà còn có

thể tạo ra bởi VSV nội sinh [3].

Từ 54 mẫu cây lúa (Oryza sativa L.) trồng ở 7 huyện và thành phố Tuy

Hòa, Phú Yên, nhóm nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp đã phân lập 191 chủng

vi khuẩn nội sinh, trong đó 27 chủng thuộc các chi Burkholderia,

Enterobacter, Bacillus có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp

indol-3-acetic acid (IAA) tốt [7].

Năm 2013, Hoàng Hoa Long và cộng sự đã phân lập chủng vi khuẩn

Bacillus sp. B55 trên cây thuốc lá (Nicotiana attenuata) làm tăng khả năng

sống sót và kích thích sinh trƣởng của cây chủ trong điều kiện tự nhiên có thể

thông qua một số cơ chế nhƣ tổng hợp IAA, 1-aminocyclopropane-1-

carboxylic acid deaminase (ACCd) và hòa tan phosphat vô cơ. Ngoài ra, đặc

tính kích thích sinh trƣởng cây chủ của chủng vi khuẩn này có quan hệ mật

thiết đối với mật độ chúng bên trong mô cây chủ [5].

Năm 2014, Quách Ngọc Tùng và cộng sự đã phân lập đƣợc 78 chủng

xạ khuẩn nội sinh trên các mẫu cây quế thu thập tại xã Thung Nai, huyện Cao

Phong, tỉnh Hòa Bình. Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của 78 chủng xạ

khuẩn nội sinh cho thấy 16 chủng có khả năng sinh kháng sinh [8].

Năm 2015, Khieu Thi Nhan và cộng sự đã phân lập đƣợc 98 chủng xạ

khuẩn nội sinh trên mẫu cây Long huyết thu thập tại Cúc Phƣơng, Ninh Bình

và 33 chủng xạ khuẩn nội sinh trên mẫu cây Long huyết thu thập tại Bạch Mã,

Thừa Thiên Huế [33].

Theo thống kê của Viện Dƣợc liệu, Việt Nam đã phát hiện 4.000 loài

cây thuốc, trong đó có nhiều loại dƣợc liệu quý đƣợc thế giới công nhận nhƣ

cây hồi, quế, atiso, sâm Ngọc Linh... Cho đến nay, trên thế giới và Việt Nam

các công trình nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh, cũng nhƣ về đánh giá đa dạng

xạ khuẩn trên cây Màng tang vẫn còn rất hạn chế.

1.2. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật

Xạ khuẩn sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và

hạt) của cây chủ và chủ yếu cƣ trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội

bào. Đáng chú ý, thực vật có khoảng 300.000 loài trên trái đất, mỗi loài thực

vật là nơi cƣ trú của rất nhiều loài xạ khuẩn nội sinh tạo nên sự đa dạng sinh

học [61]. Tuy nhiên, chỉ có một phần nhỏ thực vật liên quan đến xạ khuẩn nội

sinh đã đƣợc nghiên cứu nên cơ hội để tìm ra các loài mới và sản phẩm có

hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ tự nhiên là rất lớn. Những nghiên cứu gần

đây đã khẳng định sự đa dạng và phong phú của xạ khuẩn nội sinh và các hợp

chất có hoạt tính sinh học [13]. Xạ khuẩn nội sinh đã và đang đƣợc các nhà

khoa học trên thế giới nghiên cứu về tiềm năng ứng và ứng dụng trong lĩnh

vực y học, nông nghiệp và công nghiệp [41].

Hiện nay, xạ khuẩn nội sinh đƣợc phân lập từ nhiều loài cây trồng nhƣ

lúa mì, gạo, khoai tây, cà rốt, cà chua, cây gỗ, nho, rêu và dƣơng xỉ... [32],

[51], [52]. Cũng nhƣ xạ khuẩn phân lập từ đất, tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh thuộc

chi Streptomyces chiếm hơn 50%, tiếp theo là các chi Microbispora,

Micromonospora, Nocardioide, Nocardia và Streptosporangium [51].

Các nghiên cứu về đa dạng xạ khuẩn nội sinh đƣợc công bố bởi các

nhóm nghiên cứu khác nhau từ Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ... Tan và cộng

sự (2006) đã phân lập đƣợc 619 chủng xạ khuẩn từ các loại cây cà chua khác

nhau và tất cả các chủng đó đều thuộc chi Streptomyces [66]. Từ 36 cây dƣợc

liệu ở Thái Lan, nhóm nghiên cứu của Taechowisan đã phân lập đƣợc 330

chủng xạ khuẩn thuộc 4 chi khác nhau (Streptomyces, Microbispora,

Nocardia, Micromonospora) [65]. Inderiati và Muliani (2008) đã phân lập

đƣợc các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces từ cây thuốc lá [61]. Hơn

nữa, Verma và cộng sự (2009) cho thấy Streptomyces sp. chiếm khoảng 50%

trong tổng số 55 chủng thu nhận từ cây sầu đâu (Azadirachta indica A. Juss)

tại Ấn Độ [32]. Tổng hợp các nghiên cứu trên cho thấy Streptomyces sp. có

khả năng thích ứng, phát triển mạnh hơn so với các xạ khuẩn thuộc chi khác.

Trái với kết quả trên, nhóm nghiên cứu của giáo sƣ Li thuộc Viện VSV

học Vân Nam, Trung Quốc đã kết luận Microbispora chiếm 67% trên tổng số

81 chủng xạ khuẩn từ rễ cây bắp cải Trung Quốc (Brassica rapa), tiếp theo là

Streptomyces spp. (12,0%) và Micromonospora spp. (11,0%). Takahashi và

Omura (2003) phân lập 33 chủng Microbispora, 32 chủng Streptomyces và 10

xạ khuẩn hiếm khác từ lá rụng thuộc chín chi của thực vật bậc cao [51]. Theo

Kizuka và cộng sự (1998), tỷ lệ phân lập Microbispora từ thực vật cao hơn

đất nhiều lần [34]. Nhƣ vậy, chi Streptomyces và Microbispora dƣờng nhƣ

sinh trƣởng trên môi trƣờng đất và nội sinh mặc dù chỉ có một số lƣợng hạn

chế các loài có thể tồn tại theo cả hai phƣơng thức này.

Phần lớn tỷ lệ phân lập xạ khuẩn nội sinh từ rễ cao hơn các bộ phận

khác trong cây. El-Tarabily và cộng sự (2006) ƣớc tính mật độ xạ khuẩn nuôi

cấy đƣợc trong dƣa chuột (Cucummis sativus) và rễ của cây họ đậu (Glycine max) đạt 105 CFU/g khối lƣợng củ/rễ tƣơi [24]. Tian và cộng sự (2007) đã

phân tích 45 gen 16S rDNA và 33 mẫu gen tách dòng từ xạ khuẩn phân lập

trên rễ và thân cây, thu đƣợc 9 chi xạ khuẩn khác nhau từ rễ và 4 chi xạ khuẩn

từ thân [51]. So với thân và lá, tập hợp các chủng xạ khuẩn phân loại từ rễ

nhìn chung đa dạng hơn.

Cho đến nay, hơn 40 loài xạ khuẩn mới đã đƣợc tìm thấy bằng nhiều

phƣơng pháp phân lập và phân loại khác nhau, bao gồm 4 chi mới thuộc

nhóm Plantactinospora, Actinophytocola, Phytohabitans và Jishengella. Tình

hình phân lập các chủng xạ khuẩn mới trên cây dƣợc liệu thể hiện ở bảng 1.2

[51].

Bảng 1.2. Xạ khuẩn mới đƣợc phân lập từ các cây dƣợc liệu

Mã số của gen

Trình tự gen

16S rDNA

Xạ khuẩn

Cây dƣợc liệu

16S rDNA

trên GenBank

đƣợc so sánh

(%)

AJ784008

Micromonospora

Mã tang

M. endolithica

coriariae

(Coriaria myrtifolia)

(98,94%)

DQ343154

Pseudonocardia

Núc nác

P. halophobica

oroxyli

(Oroxylum indicum)

(97,8%)

GU227146

Pseudonocardia

Thanh hao hoa vàng

P. saturnea

artemisiae

(Artemisia annua L.)

(96,6%)

DQ460469

Glycomyces

Cơm cháy

G. lechevalierae

sambucus

(Sambucus adnata Wal)

(97,2%)

EU200682

Glycomyces

Cam thảo nam

G. algeriensis

scopariae

(Scoparia dulcis)

(97,4%)

EU814511

Streptomyces

Dó bầu

G. algeriensis

mayteni

(Maytenus

(97,1%)

austroyunnanensis)

EU429322

Actinoallomurus

Keo lá tràm

A. caesius

acaciae

(Acacia Auriculiformis)

(99,3%)

FJ805428

Nocardia

Thông đỏ

N. nova

callitridis

(Callitris preissii)

(97,4%)

DQ473536

Leifsonia

Nhân sâm

L. poae

ginsengi

(Ginseng)

(97.6%)

Những hiểu biết về đa dạng của xạ khuẩn nội sinh không chỉ giúp sàng

lọc những chủng có lợi mà còn giúp các nhà khoa học hiểu rõ vai trò chúng

trong hệ sinh thái. Strobel và Daisy (2003) cho rằng sự đa dạng lớn nhất của

xạ khuẩn nội sinh diễn ra ở khu vực nhiệt đới và khu vực có nhiệt độ ấm [62].

Janso và Carter (2010) công bố kết quả phân lập 123 xạ khuẩn nội sinh từ các

loài cây nhiệt đới thu từ một số địa điểm ở Papua New Guinea và Đảo

Mborokua, quần đảo Solomon. Nhóm nghiên cứu đã tìm thấy 17 chi xạ

khuẩn khác nhau khi phân tích trình tự gen 16S rDNA và phát hiện chi mới

nhƣ Sphaerisporangium và Planotetraspora. Phân tích cây phát sinh loài cho

thấy, nhiều chủng xạ khuẩn mới thuộc chi Thermomonosporaceae và

Micromonosporaceae [51].

Tổng hợp các nghiên cứu cho thấy rừng nhiệt đới sở hữu sự đa dạng

sinh học lớn nhất trên thế giới về tài nguyên thiên nhiên và VSV nội sinh. Tại

rừng nhiệt đới Xishuangbanna của Trung Quốc đã có 2174 xạ khuẩn nội sinh

đƣợc phân lập từ những cây thuốc với các phƣơng pháp phân lập khác nhau

dựa trên quá trình tiền xử lý mẫu, môi trƣờng phân lập. Các chủng này đại

diện cho 10 Bộ phụ khác nhau và 32 chi, phát hiện ít nhất 19 loài mới [29],

[51]. Trong đó, một chi mới và hai loài mới đƣợc phân lập trên cây dó bầu

(Maytenus austroyunnanensis). Rõ ràng, tại rừng nhiệt đới có nguồn xạ khuẩn

phong phú và đa dạng hơn nhiều so với các khu vực khác và hứa hẹn là nguồn

phát hiện các chủng xạ khuẩn mới. Xạ khuẩn nội sinh rất đa dạng và mức độ

đa dạng có thể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu và các loài thực vật khác nhau.

Sự đa dạng về chi và số lƣợng xạ khuẩn nội sinh phần lớn phụ thuộc vào

phƣơng pháp phân lập.

1.3. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc

liệu

1.3.1. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh

Chất kháng sinh đã đƣợc phát hiện và ứng dụng để chữa bệnh cho con

ngƣời. Nhờ kháng sinh mà chúng ta đã đẩy lùi đƣợc nhiều bệnh và dịch bệnh

nguy hiểm nhƣ: tả, đậu mùa, thƣơng hàn… Phần lớn các chất kháng sinh

đƣợc sử dụng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Trong số 8.000 chất

kháng sinh đã đƣợc biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn sinh ra.

Nhiều loài xạ khuẩn nội sinh, đặc biệt là những loài đƣợc phân lập từ

cây dƣợc liệu có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh nhƣ

vi khuẩn, nấm và virus. Nhƣ vậy, xạ khuẩn nội sinh có tiềm năng để phát triển

các loại thuốc kháng sinh mới (Bảng 1.3).

Bảng 1.3. Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh

Xạ khuẩn

Cây dƣợc liệu

Kháng sinh

Hoạt tính

Hoa mộc lan

Munumbicins A-D

Kháng sinh

Streptomyces sp. NRRL 30562

(Kenndia nigriscans)

Cơm vàng

Kakadumycins

Kháng sinh

Streptomyces sp. NRRL 30566

(Grevillea pteridifolia)

Mỹ đăng mộc

Kháng sinh,

Streptomyces sp. CS

24-demethyl- bafilomycin A2

(Maytenus hookeri)

Kháng ung thƣ

Streptomyces

Vẹt dù

Antimycin A18

Kháng nấm

albidoflavus

(Bruguiera Gymnorrhiza)

Thanh mộc

Demethylnovobiocin Kháng

Streptomyces sp. TP-A0556

VSV

(Aucuba japonica)

Hẹ

6-Prenylindole

Kháng nấm

Streptomyces sp. TP-A0595

(Allium tuberosum)

Đậu lupin

Lupinacidins A, B

Micromonospora lupini

Kháng ung thƣ

(Lupinu Angustifolius)

Liễu sam

Cedarmycins A, B

Kháng nấm

Streptomyces sp. TP-A0456

(Cryptomeria japonica)

Cho đến nay, rất nhiều loại thuốc kháng sinh mới đã đƣợc phát hiện

nhƣ munumbicin AD [14], lansai A–D [68], celastramycin AB [50],

kakadumycin và demethylnovobiocin [14], [32]. Chất 6-Prenylindole đƣợc

tách chiết từ dịch lên men chủng Streptomyces sp. TP-A0595 có hoạt tính

kháng nấm gây bệnh thối cổ rễ gây ra bởi nấm Fusarium oxysporum. Những

nghiên cứu trƣớc đó, chất 6-Prenylindole đƣợc biết đến khi đƣợc thu nhận chủ

yếu từ lá và thân cây rêu tản (Hepatopsidae sp.) [51]. Đây là một ví dụ điển

hình về khả năng thu nhận các hợp chất hoặc các dẫn xuất tƣơng tự trong thực

vật nhờ xạ khuẩn nội sinh. Streptomyces sp. Tc022 đƣợc phân lập từ rễ cây

riềng nếp (Alpinia galanga) có hoạt tính ức chế mạnh Colletotrichum musae

và Candida albicans. Khi tách chiết từ môi trƣờng nuôi cấy chủng

Streptomyces sp. Tc022, thu đƣợc hợp chất có thành phần chính là

actinomycin D-chất có hoạt tính kháng nấm rất mạnh [64]. Năm 2006,

Castillo và cộng sự đã phân lập hai kháng sinh mới có tên là munumbicins E-

4 và E-5 từ Streptomyces sp. NRRL 30562 có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram

(+) và Gram (-) [14]. Gần đây, hợp chất saadamycin có khả năng kháng nấm

gây bệnh hắc lào và một số nấm gây bệnh khác đƣợc tìm thấy trong

Streptomyces sp. Hedaya48 [22].

1.3.2. Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh và các hợp chất

trao đổi thứ cấp

Polyketides là nhóm đại diện cho các sản phẩm tự nhiên (sản phẩm trao

đổi chất bậc hai) đƣợc sản xuất bởi nhƣ vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn và thực vật

[54]. Các kháng sinh dạng polyketide đƣợc sử dụng nhiều trong sản xuất

thuốc điều trị các bệnh lâm sàng nhƣ tetracycline, daunorubicin,

erythromycin, rapamycin và lovastatin... Nhóm polyketide đƣợc tổng hợp nhờ

quá trình ngƣng kết lặp lại nhiều lần các carbon mạch ngắn hoặc các nhóm

acetate hay acyl propionate đặc trƣng là dẫn xuất từ malonyl hay

methylmalonyl coenzyme A thioester. Mặt khác, polyketide có thể định nghĩa

là các liên kết dạng polyme đƣợc cấu thành từ các đơn vị ketide, các hợp chất

này đƣợc chia thành 2 loại gồm: polyketide synthase (PKS) và nonribosomal

peptide synthetase (NRPS) [40].

1.3.2.1. Gen chức năng pks-I, pks-II tham gia tạo polyketide đa vòng thơm

Các polyketide đa vòng thơm đƣợc hình thành chủ yếu từ quá trình

ngƣng kết acyl acetate và nhóm β−carbonyl. Sau khi tổng hợp, chuỗi

polyketide đƣợc sắp xếp lại thành các hợp chất đa vòng thơm.

Oxytetracycline, actinorhodin và anthracycline là các nhóm hợp chất kháng

sinh, kháng ung thƣ đa vòng thơm đƣợc tạo thành từ quá trình trên [28]. Gen

mã hóa enzyme chịu trách nhiệm sinh tổng hợp polyketide đa vòng thơm chủ

yếu là polyketide synthase II (PKS-II). Hỗn hợp polyketide đƣợc hình thành

dựa trên quá trình ngƣng kết từ các đơn vị acetate, propionate, acyl butyrate

và khử nhóm β−carbonyl. Trong tổng hợp polyketide, các polyketide khác

nhau đƣợc hình thành từ một hoặc nhiều quá trình ngƣng tụ. Các chuỗi

polyketide tiếp tục phát triển, kéo dài và đóng vòng tạo thành sản phẩm cuối

cùng thông qua 3 quá trình khác nhờ sự hỗ trợ của ketosynthase (KS), acyl

transferase (AT) và acyl carrier protein (ACP). Các gen mã hóa enzyme chịu

trách nhiệm sinh tổng hợp tạo sản phẩm cuối cùng gọi là polyketide synthase

I (PKS-I) [42].

1.3.2.2. Gen chức năng nrps

NRPS là nhóm enzyme có khối lƣợng phân tử lớn, cấu tạo chia làm 4

phần, bao gồm vùng A (adenyl hóa), vùng ngƣng tụ hoặc kéo dài (C), vùng E

(epime hóa) và TE (thioesterase), tham gia sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi

chất bậc hai không thông qua ribosom tạo dạng peptide. Hỗn hợp oligopeptide

đƣợc tạo thành bởi NRPS nhờ quá trình ngƣng tụ các protein và acid amin phi

protein. Trong quá trình tổng hợp, NRPS chịu trách nhiệm phát hiện, loại bỏ

các acid amin có những sai khác nhờ sự tƣơng tác với vùng epime hóa nhờ

methyltransferase và oxidase [42].

Nhóm enzyme NRPS đƣợc tìm thấy phổ biến trong nấm, xạ khuẩn, vi

khuẩn, trong đó NRPS tham gia tổng hợp peptide không thông qua ribosom,

bao gồm: kháng sinh (penicillin và cephalosporin), chất độc, siderophore, chất

kháng viêm, chất ức chế miễn dịch (cyclosporine A) [28].

Do vậy, nhằm dự đoán cấu trúc của chất kháng sinh, trình tự amino acid

của PKS-I, PKS-II, NRPS đƣợc phân lập và so sánh với enzyme có trình tự

tƣơng tự tham gia vào tổng hợp các hợp chất polyketide khác. Để khuếch đại

các gen trên, mồi suy biến (degenerate primers) đƣợc thiết kế, khuếch đại

vùng KS và A nhằm sàng lọc gen tham gia tổng hợp chất kháng sinh, kháng

viêm cũng nhƣ nghiên cứu đa dạng của gen pks-I, pks-II, nrps trong xạ khuẩn

[28].

1.3.2.3. Đánh giá đa dạng gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS

Nhằm đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp của các nhóm xạ khuẩn khác

nhau, oligonucleotide primer đƣợc thiết kế, khuếch đại vùng KS và A nhằm

sàng lọc gen kháng sinh về mặt di truyền và nghiên cứu đa dạng của gen pks-

I, pks-II, nrps. Sacido và Genilloud (2003) đã nghiên cứu đa dạng của gen

pks-I, pks-II, nrps trong 210 chủng đại diện thuộc 33 chi xạ khuẩn (Bảng 1.4).

Bảng 1.4. Tần xuất xuất hiện gen pks-I, nrps trong các phân nhóm xạ khuẩn

khác nhau

Gen nrps

Gen pks-I

Tổng số

Phân nhóm

Số lƣợng

Tỷ lệ

Số lƣợng

Tỷ lệ

chủng

(chủng)

(%)

(chủng)

(%)

Actinomycetales

210

167 79,5

119 56,7

Streptomycetaceae

33 97,0

26 78,8

32 Micromonosporaceae

65 76,9

31 47,7

50 Nocardiaceae

22 90,9

13 59,0

20 Pseudonocardiaceae

37 76,3

20 52,6

29 Nocardiopsaceae

6 66,7

3 27,3

4 Actinosynnemataceae

13

100

8 61,5

13 Thermomonosporaceae

8 62,5

3 37,5

5 Streptosporangiaceae

20 65,0

4 20,0

13 Glycomycetaceae

3 66,7

0

2 Geothermatophilaceae

3

0

1 33,3

0

Theo đó, trình tự gen nrps phân bố rộng rãi và chiếm tỷ lệ cao nhất, đạt

79,5%; trình tự pks-I chiếm tỷ lệ thấp hơn (56,7%). Trình tự pks-I, pks-II, nrps

đƣợc phát hiện ở hầu hết các chủng thuộc chi Streptomyces (khoảng 97% và

79%), nhƣng sự phân bố của nhóm gen này biến động mạnh trong các chi còn

lại [55].

Gen nrps xuất hiện hầu hết trong các chủng thuộc nhóm

Micromonosporaceae (50-100%) nhƣng đối với các chủng thuộc chi

Micromonospora và Catenuloplanes thì gen pks-I lần lƣợt đạt 68% và 60%.

Hơn nữa, gen pks-I không đƣợc tìm thấy trong chi Catellatospora. Ngƣợc lại,

gen pks-I, pks-II, nrps đƣợc phát hiện trong họ Pseudonocardiaceae (chiếm

76,3% và 52,6%) với tỷ lệ cao trong các chi nhƣ: Amycolatopsis,

Saccharopolyspora và Saccharomonospora. Ngoài ra, pks-I và nrps ít xuất

hiện trong chi Pseudonocardia mặc dù tỷ lệ các chủng đƣợc phân tích cao

[55].

Trong các chủng thuộc họ Actinosynnemataceae, tỷ lệ pks-I, nrps đƣợc

phát hiện lần lƣợt đạt 100% và 61,5% trên tổng số các chủng đƣợc kiểm tra,

mặc dù chỉ có một số đại diện là các chi Actinokineospora, Lechevalieria,

Saccharothrix, Lentzea, và Actinosynnema. Đặc biệt, pks-I và nrps phân bố

với tỷ lệ thấp trong các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae (khoảng 65%

và 20%) và không xuất hiện ở các họ Nocardiopsaceae,

Thermomonosporaceae, Glycomycetaceae, và Geodermatophilaceae.

Cả hai trình tự này xuất hiện chủ yếu trong những chủng thuộc các chi

nhƣ Streptomyces hoặc các họ Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae và

Actinosynnemataceae. Các chi trên có gen mã hóa NRPS có khả năng sinh

tổng hợp vancomycin hoặc các hợp chất polyketide nhƣ erythromycin hoặc

spinosin. Tuy nhiên, những trình tự này cũng đƣợc phát hiện trong một số

chủng không sản xuất kháng sinh cũng nhƣ các chủng xạ khuẩn hiếm.

1.3.3. Chất kháng sinh và kháng sinh điều trị ung thư nhóm anthracycline

Hiện nay, anthracycline là nhóm kháng sinh đƣợc sử dụng rộng rãi

trong điều trị ung thƣ. Vào những năm 1960, anthracycline đƣợc phát hiện từ

chất màu của chủng xạ khuẩn S. peucetius, gồm 2 phân nhóm doxorubicin

(DOX1) và daunorubicin (DNR) [27].

Hình 1.1. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm

anthracycline: DOX, DNR, EPI và IDA

Về công thức cấu tạo, DOX và DNR có cấu trúc gồm các aglyconic và

các gốc đƣờng khác nhau (Hình 1.1). Các aglyconic bao gồm vòng tetracyclic

liên kết với các nhóm quinone-hydroquinone trong vòng ký hiệu C và B,

trong đó gốc methoxy thay thế C-4 trong vòng D và một gốc carbonyl đƣợc

gắn vào vị trí C-9, C-13. Các gốc đƣờng khi gắn nhóm glycosyl và 3-amino-

2,3,6-trideoxy-L-fucosyl ở vị trí C-7 nằm trên vòng A đƣợc gọi là

daunosamine. Sự khác nhau chính giữa DOX và DNR là chuỗi của DOX bị

kết thúc ở gốc alcohol, còn DNR kết thúc ở gốc methyl. Chính sự khác biệt

này tạo nên sự khác nhau về phổ hoạt động của DOX và DNR. DOX là thành

phần thiết yếu trong điều trị ung thƣ vú, hình thành các khối u, ung thƣ hạch

bạch huyết. Trong khi đó, DNR có tác dụng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp

tính. Tuy nhiên, DOX và DNR gây tác dụng phụ nhƣ gây ra bệnh đau cơ tim

mãn tính hay suy tim [27].

Việc tìm kiếm chất anthracycline mới có ứng dụng trong thử nghiệm

lâm sàng đã thôi thúc các nhà khoa học biến đổi cấu trúc hóa học hoặc thay

đổi vòng tetracyclic, aminosugar. Kết quả đã tạo ra hai loại chất kháng ung

thƣ tổng hợp mới là Epirubicin (EPI) và Idarubicin (IDA). EPI là doxorubicin

đƣợc epimer hóa tại vị trí C-4 hydroxyl trên phân tử đƣờng. EPI đƣợc sử dụng

trong điều trị ung thƣ dạ dày, ung thƣ vú, nội mạc tử cung, phổi, buồng trứng

và ung thƣ tuyến tiền liệt…

IDA là dẫn xuất của daunorubicin, bị khuyết thiếu nhóm methoxy tại vị

trí C-4 dẫn đến làm tăng khả năng hòa tan trong chất béo, dung môi cũng nhƣ

hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ. So với DNR, IDA có nhiều ƣu điểm hơn

DNR trong điều trị bệnh bạch cầu nguyên bào tủy cấp tính. Hiện tại, cơ chế

mà nhóm anthracycline ức chế tế bào ung thƣ vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ

[27].

1.4. Cây Màng tang và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh trên cây

Màng tang

Cây Màng tang (Litsea cubeba) mọc hoang ở các vùng núi cao của Hà

Giang, Yên Bái, Điện Biên, Gia Lai, Kon Tum, Đà Lạt. Màng tang có vị cay

thơm, tính ẩm, tán trong hàn, ôn trung hạ khí chữa cảm lạnh, nhức đầu, tê

thấp, nhức xƣơng tay chân tê dại. Quả Màng tang dùng làm thuốc bổ dạ dày,

thông tiêu hóa và chữa bệnh đau đầu. Rễ và lá Màng tang còn dùng để chữa

rắn cắn, trị nhọt, viêm mủ trên da, tinh dầu có tính kháng khuẩn, kháng nấm,

kháng vi sinh vật kiểm định và kháng tế bào ung thƣ [6].

Cây Màng tang đƣợc biết đến nhƣ một vị thuốc dùng chữa những

trƣờng hợp nhƣ nhức đầu, đau dạ dày, khó tiêu, phong thấp đau nhức xƣơng,

quáng gà... Tinh dầu Màng tang đƣợc chứng minh có khả năng kháng khuẩn

(Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia

coli); kháng nấm (Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris,

Colletotrichum gloeosporioides); chống ôxi hóa, kháng tế bào ung thƣ (gan,

phổi, miệng)... [31], [38]. Năm 2010, Ho và cộng sự có công bố đầu tiên xác

định 50 hợp chất từ quả Màng tang thu thập tại Đài Loan, chất citral chiếm

68,9% tinh dầu chiết xuất từ quả và ức chế các dòng tế bào ung thƣ OEC-M1,

J5, A549 với giá trị IC50 đạt lần lƣợt 50, 50 và 100ppm. [31]. Nối tiếp nghiên

cứu trên Zhang và cộng sự (2012) đã tách chiết 5 hợp chất mới có khả năng

kháng khuẩn thuộc nhóm isoquinoline alkaloid có độ tinh sạch > 90% từ thân

cây Màng tang thu thập tại Quý Châu, Trung Quốc. Ngoài khả năng kháng vi

khuẩn và nấm gây bệnh, chất (+)-N-(methoxylcarbonyl)-N-norbulbodione,

(+)-N-(methoxylcarbonyl)-N norisocorydione có hoạt tính ức chế 6 dòng tế

bào ung thƣ với giá trị IC50 đạt lần lƣợt 9,54-12,22µM và 9,83-11,96µM. [71].

Các hợp chất chiết xuất từ quả Màng tang đƣợc chứng minh hoạt tính kháng

vi khuẩn Streptococcus mutans, S. sobrinus gây sâu răng và kìm hãm quá

trình hỏng của thực phẩm, hạn chế sự tăng sinh một số dòng tế bào ung thƣ

gan, phổi, vú [70].

Cho đến nay, chƣa có nhiều công trình nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh

trên cây Màng tang đƣợc công bố trên thế giới cũng nhƣ Việt Nam. Do vậy,

nghiên cứu về VSV nói chung và xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại

Việt Nam giúp cung cấp các số liệu tham khảo cho các nhà khoa học trong và

ngoài nƣớc.

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Mẫu cây Màng tang, chủng giống vi sinh vật

Ba mẫu (rễ, thân, lá) cây Màng tang đƣợc thu thập tại xã Cấp Dẫn, huyện Cẩm Khê, tỉnh Phú Thọ, Việt Nam (21o24‟25‟‟N;105o04‟05‟‟E) vào

tháng 1 năm 2016.

Các chủng vi sinh vật kiểm định: Salmonella enterica ATCC 14028,

Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea CNLM, Bacillus cereus ATCC

11778, Proteus vulgaris CNLM, Pseudomonas aeruginosa CNLM,

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterobacter aerogenes ATCC

13048 nhận từ Bộ sƣu tập giống VSV của Phòng Công nghệ lên men, Viện

Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu

Hóa chất: Cao malt (Himedia-Ấn Độ); Cao nấm men (Himedia-Ấn

Độ); Raffinose (Chameleon, Nhật Bản) Trehalose (Chameleon, Nhật Bản);

Sodium dodecyl sulfate (SDS); Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)

(BioLabs, Mỹ); Phenol, Methanol, Isoamylalcohol, EtBr, Glycerol, Ethanol,

Chloroform, Ampicillin, Acrylamide, (Merck, Đức); Agar (Fluka, Đức); d-

NTP (Fermentas, Mỹ), bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose của Thermo

scientific (Mỹ)...

Enzyme: RNAase; Taq DNA polymerase (Thermo scientific, Mỹ).

Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR (GeneAmp® PCR System 9700,

Applied Biosystems, Mỹ), máy ly tâm lạnh (Biofuge fresco, Kendro, Đức);

máy điện di DNA (Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy UV (PowerPac

Basic, Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (BSI-25R CPT, Mỹ) và một số thiết bị

nghiên cứu khác.

2.1.3. Môi trường nuôi cấy

Các môi trƣờng đƣợc sử dụng trong lƣu giữ giống, phân lập và xác định

đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh đƣợc trình bày trong Phụ lục 1.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Lấy mẫu cây Màng tang

Mẫu cây Màng tang đƣợc lấy bằng dao đã khử trùng và lƣu giữ trong

các túi nilon. Mẫu cây Màng tang đƣợc chia thành 3 phần riêng: rễ, thân, lá

đựng trong túi nilon sạch có ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lí và phân tích trong vòng 20 ngày.

2.2.2. Phương pháp xử lý bề mặt mẫu

Mẫu cây Màng tang đƣợc rửa sạch dƣới vòi nƣớc để loại bỏ đất, tạp

chất và làm khô mẫu tại nhiệt độ phòng trong 20 phút. Các mẫu đƣợc khử

trùng bề mặt bằng cách ngâm trong NaClO 5,0% (v/v) từ trong 5 phút. Rửa

mẫu một lần bằng Na2S2O3 2,0% (w/v) trong 1 phút để loại bỏ NaClO dƣ.

Tiếp tục xử lý mẫu bằng Ethanol 70% trong 10 phút, rửa lại bằng nƣớc cất

khử trùng để loại bỏ Ethanol. Tiến hành nghiền mẫu trong tủ cấy vô trùng

[63].

Bổ sung các hợp chất kháng sinh nhƣ acid nalidixic (15 mg/mL) và

nystatin (15 mg/mL) vào 8 loại môi trƣờng phân lập để nâng cao tính chọn lọc

xạ khuẩn và ức chế phát triển của vi khuẩn và nấm nội sinh.

Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội sinh

2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn

đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch kết hợp hiệu chỉnh theo

phƣơng pháp đã đƣợc mô tả trƣớc đây [2], [21]. Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng YIM38 ở nhiệt độ 30oC trên máy lắc tốc độ 200

vòng/phút trong 5 ngày. Môi trƣờng thạch LB sau khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt độ 30-37oC, hút dịch vi sinh vật kiểm định có mật độ tế bào

đạt 5.108 CFU/ml lên trên bề mặt đĩa Petri hoặc các khay. Khi thạch đông

dùng dụng cụ đục lỗ thạch vô trùng đục lỗ và lấy các thỏi thạch ra. Sau 5 ngày

nuôi cấy, thu hồi và ly tâm dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn với tốc độ 6.000-8.000 vòng/phút ở 4oC. Bổ sung 100 μL dịch vào các giếng thạch trên

đĩa Petri và đặt các đĩa trong tủ lạnh khoảng 5-6 giờ để dịch từ các giếng

khuếch tán ra môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. Sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 28-30oC trong 14-18 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn.

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc xác định theo kích thƣớc

vòng kháng khuẩn (Vkk) theo công thức:

Vkk = D - d (mm),

Trong đó: D: Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm)

d: Đƣờng kính lỗ thạch (mm)

2.2.4. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn

Các chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YIM 61, sau 72 giờ

nuôi cấy, ly tâm thu tế bào ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút. DNA tổng số

đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell [56]. Gen mã hóa

các enzyme đóng vai trò chính trong sản phẩm trao đổi chất thứ cấp đƣợc

khuếch đại bắng phản ứng PCR đựa trên 3 cặp mồi đặc hiệu cho pks-I (K1F/M6R); pks-II (KsaF/KsaR); nrps (A3F/A7R) theo chu trình nhiệt: 95oC trong 5 phút, 30 chu trình: 94oC trong 60 giây, 57oC (K1F⁄M6R, A3F⁄A7R) hay 58oC (KSaF⁄KSaR) trong 90 giây, 72oC trong 60 giây, 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC [36]. Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di

trên gel agarose 1,0%.

2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28

2.2.5.1. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh melanin

Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn đƣợc quan sát, so sánh trên các môi trƣờng ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 ở nhiệt độ 28-30oC

[1]. Sau 7, 14 và 21 ngày lấy mẫu quan sát màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn

ty cơ chất và sắc tố tan trên môi trƣờng theo phƣơng pháp của Shirling và

Gottlieb (1966) và trên bảng màu của Tresner và Danga (1958) [58], [68].

- Màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS): Màu sắc của khuẩn ty khí sinh

đƣợc so với 7 nhóm màu: xanh da trời, sẫm, xám, đỏ, tím, trắng, vàng [68].

- Màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC): Chia vào 5 nhóm vàng-nâu

(gồm cả các loại không tiết sắc tố); xanh da trời; xanh lá; đỏ-da cam; tím.

- Khả năng sinh sắc tố tan: đƣợc xác định trên môi trƣờng ISP2, ISP5.

Sắc tố tan đƣợc xếp vào 5 nhóm: vàng nâu; xanh da trời; xanh lá; đỏ da cam;

tím.

- Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin

xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ thích

hợp. Quan sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi

trƣờng sẽ chuyển từ vàng nhạt sang nâu, đen.

2.2.5.2. Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử

Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP3 và ISP4 có đặt lamen trên mặt đĩa. Sau 7, 14 và 21 ngày nuôi ở nhiệt độ 28-30oC xạ khuẩn phát

triển tốt lấy ra quan sát hình dạng chuỗi bào tử dƣới kính hiển vi quang học và

kính hiển vi quét.

- Hình dạng chuỗi bào tử đƣợc ký hiệu: RF (thẳng hay hơi lƣợn sóng);

RA (hình móc câu hay xoắn không hoàn toàn); S (dạng xoắn lò xo hay xoắn

hoàn toàn); SRF (dạng xoắn lƣợn sóng); SRA (dạng xoắn có móc câu) [49].

- Bề mặt bào tử: các mẫu đƣợc đông khô, sau đó đƣợc mạ vàng bằng

máy JFC-1200, quan sát và chụp trên kính hiển vị điện tử quét (JSM-5410;

JEOL, Tokyo) với điện áp là 15 kv để xác định đặc điểm bề mặt bào tử: Sm

(trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru (nếp nhăn), ha (tóc).

2.2.5.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

- Khả năng sử dụng nguồn carbon: Xạ khuẩn đƣợc nuôi ở nhiệt độ 28- 30oC trên môi trƣờng ISP9 có bổ sung các nguồn đƣờng (1,0%, w/v): D-

Glucose, D-Glactose, D-Mantose, L-Arabinose, α-Lactose, myo-Inositol, D-

Manitol... Sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trƣởng và so sánh với môi trƣờng

có nguồn cacbon là D-Glucose (đối chứng dƣơng) và không có nguồn cacbon

(đối chứng âm) [26].

- Khả năng sử dụng nguồn nitơ: Xạ khuẩn đƣợc nuôi ở nhiệt độ 28-30oC

trên môi trƣờng ISP8 có bổ sung các nguồn nitơ (1,0%, w/v): L-Histidine

monohydrat, L- Phenylalanin, L-Arginin, L-Lysin, L-Threonin, L-Cystein...

Sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trƣởng, so sánh với ống đối chứng âm (môi

trƣờng ISP9) và đối chứng dƣơng (môi trƣờng có L-Asparagin monohydrat).

- Xác định nhiệt độ, pH nuôi cấy thích hợp: Chủng MPT28 đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch Bennett ở các nhiệt độ khác nhau (15oC; 30oC; 37oC; 45oC) và pH 3,0-12,0. Sau 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trƣởng của xạ

khuẩn.

- Xác định nồng độ NaCl thích hợp: chủng MPT28 đƣợc nuôi cấy trên

môi trƣờng Bennett thạch có bổ sung NaCl với nồng độ tăng dần từ 1,0-10,0% (w/v) ở 30oC, sau 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trƣởng của xạ khuẩn.

2.2.6. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa trên phân tích trình tự gen

16S rDNA

Trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn đƣợc khuếch đại bằng phản ứng

PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1429R có trình tự nhƣ trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại

gen 16S rDNA

Tên đoạn mồi

Trình tự mồi

27F

5‟-TAACACATGCAAGTCGAACG-3‟

1429R

5‟-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3‟

Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel

agarose 1,0%. Kích thƣớc của các đoạn DNA thu đƣợc sau phản ứng PCR

đƣợc so sánh với thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ). Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen, Mỹ) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic

Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) tại Viện Công nghệ sinh

học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trình tự gen 16S

rDNA đƣợc so sánh với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank (NCBI) nhờ

công cụ BLAST.

2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả nghiên cứu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học

trên phần mềm excel. Phần mềm sử dụng các hàm tính toán dựa trên những

công thức cơ bản của thống kê trong đó có công thức:

Giá trị trung bình ( ):

Độ lệch chuẩn (  ):

Sai số m:

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh Phú Thọ

Quan sát các mẫu phân lập từ 6-8 tuần cho thấy, các chủng xạ khuẩn

phát triển khá chậm trên 8 loại môi trƣờng thạch, số lƣợng xạ khuẩn đa dạng,

đạt từ 2-3 chủng/mẫu. Từ các bộ phận khác nhau của cây Màng tang (rễ, thân,

lá) đã phân lập đƣợc 25 chủng xạ khuẩn nội sinh có màu sắc hệ khuẩn ty đa

dạng. Trong một số nghiên cứu trƣớc đây, nhƣ của Gangwar và cộng sự

(2011) đã phân lập đƣợc 40 chủng xạ khuẩn nội sinh từ các mẫu rễ, thân, lá

trên cây lô hội (Aloe vera), bạc hà (Metha sp.) và hƣơng nhu tía (Ocimum

santum) [25], [37]. Năm 2012, với 4 mẫu cây thanh hao hoa vàng (Artemisia

annua L.) thu thập tại Xishuangbanna, tỉnh Vân Nam, Trung Quốc, nhóm

nghiên cứu của Li tại Viện vi sinh vật học Vân Nam đã phân lập đƣợc 228

chủng xạ khuẩn nội sinh [37]. So sánh với hai nghiên cứu trên thì số lƣợng xạ

khuẩn nội sinh phân lập đƣợc trên cây Màng tang trong nghiên cứu chƣa cao.

Số lƣợng xạ khuẩn chƣa cao có thể do trong cây Màng tang có tinh dầu thể

STA

ISP5

hiện hoạt tính ức chế phát triển đối với nhiều loại vi sinh vật [44].

Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập trên một

số môi trƣờng đặc hiệu sau 6 tuần nuôi cấy

Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập và cấy thuần khiết, đƣợc nuôi cấy

trên môi trƣờng thạch YIM38 để quan sát các đặc điểm hình thái, màu sắc

khuẩn lạc, sắc tố sinh ra trong môi trƣờng và để phân nhóm xạ khuẩn theo

màu sắc khuẩn lạc (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân

lập từ mẫu cây Màng tang

STT Ký hiệu

Môi

Bộ

Đặc điểm khuẩn lạc

Hình

ảnh

chủng

trƣờng

phận

khuẩn lạc

1 MPT14 CA

Lá

Khuẩn

lạc nhỏ,

tròn

không đều, mép răng

cƣa, khô, màu trắng,

sinh sắc tố.

2 MPT37

ISP5

Thân Khuẩn lạc to, lồi, khô,

không đều, tạo nhú ở

trung tâm, màu trắng,

sinh sắc tố.

3 MPT21

SPA

Lá

Khuẩn lạc không đều,

màu xám, khô, lồi, răng

cƣa, có vòng vết nứt ở

tâm, không sinh sắc tố.

4 MPT26

SA

Rễ

Khuẩn lạc tròn, không

đều, khô, vòng

tròn

đồng tâm, màu vàng ,

sinh sắc tố

5 MPT28

SA

Rễ

Khuẩn

lạc khô,

lồi,

không đều, tạo nhú ở

trung tâm, màu xám,

phát phóng xạ, dang

phấn, không sinh sắc tố

3.2. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang

3.2.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây Màng tang

Trên cơ sở 25 chủng xạ khuẩn nội sinh đã thu nhận đƣợc, tiến hành

phân tích, đánh giá mức độ đa dạng sinh học theo tỉ lệ xạ khuẩn trên bộ phận

cây Màng tang (Hình 3.2).

Hình 3.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân bố trên các bộ phận của cây Màng

tang

Kết quả hình 3.2 cho thấy, xạ khuẩn có mặt ở tất cả các bộ phận của

cây, trong đó số chủng xạ khuẩn phân lập từ rễ là cao nhất (đạt 40%); tiếp

theo là thân (32%) và thấp nhất là lá (28%). Kết quả trên có chút khác biệt so

với nghiên cứu của Zhao và cộng sự đã phân lập đƣợc 560 chủng xạ khuẩn từ

26 cây dƣợc liệu khác nhau tại vùng cao nguyên Panxi, Trung Quốc. Tỷ lệ

phân lập các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh cao nhất ở rễ (58,2%), thân

(27,8%) và lá (14,0%) [73]. Tƣơng tự, nhóm nghiên cứu của Madhuarama

(2014) đã công bố công trình nghiên cứu đánh giá đa dạng và tiềm năng của

xạ khuẩn nội sinh trong ba cây dƣợc liệu (cây lô hội, bạc hà, hƣơng nhu tía) ở

Ấn Độ, trong đó tỷ lệ xạ khuẩn phân lập từ rễ, thân, lá đạt lần lƣợt: 70,0%;

17,5% ; 12,5% [41]. Đa số các nghiên cứu trên thế giới đã nhận định rằng xạ

khuẩn phân lập từ mẫu lá luôn thấp hơn so với rễ và thân và mật độ xạ khuẩn

phần lớn phụ thuộc vào đặc điểm sinh học của cây.

3.2.2. Đa dạng xạ khuẩn trên cây Màng tang theo môi trường phân lập

Theo các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh, phƣơng pháp xử lý mẫu và

thành phần môi trƣờng là yếu tố chính quyết định đến kết quả phân lập, đánh

giá sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh và tìm ra các loài xạ khuẩn mới [47].

Kết quả đánh giá đa dạng các chủng xạ khuẩn phân lập dựa trên 8 loại môi

trƣờng đặc hiệu đƣợc thể hiện trên hình 3.3.

Hình 3.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang đƣợc phân lập trên các

loại môi trƣờng khác nhau

Kết quả cho thấy, tỷ lệ xạ khuẩn phân lập cao nhất trên môi trƣờng HV,

SPA, SA ( 4-5 chủng) đạt từ 16% đến 20 % tổng số chủng xạ khuẩn, tỷ lệ các

chủng xạ khuẩn phân lập trên các môi trƣờng nhƣ TWYE, CA, ISP5 thấp (2

chủng), dƣới 10% (Hình 3.3). Trên đối tƣợng cây sồi (Callitris preissii), cây

bạch đàn đỏ (Eucalyptus camaldulensis), cây bạch đàn trắng (Eucalyptus

microcarpa), cây son (Pittosporum phylliraeoides), Onuma và cộng sự đã

phân lập 574 chủng xạ khuẩn từ 10 loại môi trƣờng có tỷ lệ phân lập xạ khuẩn

lần lƣợt: MMY (5,5%), YECG (5,9%), HVA (9,4%), Xyl (10,1%), CMC

(14,4%), GGXA (11,8%), Pec (8,5%), GGAG (11,8%), AA (11,6%), HVG

(11,0%). Kết quả phân tích trình tự gen 16s rDNA định danh 17 chi khác

nhau, trong đó chi Streptomyces chiếm tỷ lệ cao nhất (71,7%), tiếp đó là các

chị xạ khuẩn hiếm nhƣ: Promicromonospora (8,9%), Pseudonocardia (6,3%),

Kribbella (4,3%), Nocardioides (1,9%), Nocardia (1,7%), Amycolatopsis

(1,0%), Micromonospora (1,0%), Actinomycetospora (1,0%),

Actinopolymorpha (0,4%), Actinomadura (0,3%), Polymorphospora (0,3%),

Williamsia (0,3%), Gordonia (0,2%), Nocardiopsis (0,2%), Nonomuraea

(0,2%) Flindersiella (0,2%) [48].

Cũng tƣơng tự nghiên cứu trên, Li và cộng sự (2012) đã phân loại 228

chủng xạ khuẩn thuộc 19 chi nhƣ: Promicromonospora (11,4%),

Pseudonocardia (6,6%), Nocardia (4,8%), Nonomuraea (4,4%), Rhodococcus

(3,5%), Kribbella (3,1%), Micromonospora (3,1%), Actinomadura (2,6%),

Streptosporangium (1,3%), Amycolatopsis (1,3%), Dactylosporangium

(0,9%), Blastococcus (0,4%), Glycomyces (0,4%), Kocuria (0,4%),

Micrococcus (0,4%), Gordonia (0,4%), Microbispora (0,4%),

Phytomonospora (0,4%) và Streptomyces chiếm 53,9% trên sáu loại môi

trƣờng đặc hiệu [37].

Nhìn chung, tỷ lệ phân lập xạ khuẩn nội sinh thuộc chi Streptomyces

luôn chiếm tỷ lệ cao (>50%) nên các nhóm nghiên cứu trên thế giới luôn ƣu

tiên sử dụng các phƣơng pháp, lựa chọn các loại môi trƣờng đặc hiệu nhằm

phân lập các chủng xạ khuẩn hiếm không thuộc chi Streptomyces.

3.2.3. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty

Sự khác biệt về màu sắc hệ khuẩn ty xạ khuẩn đƣợc hình thành do

nhiều nguyên nhân khác nhau nhƣ: khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, chất dinh dƣỡng,

pH... Chính vì vậy, mầu sắc khuẩn ty đƣợc coi là tiêu chí cơ bản để chọn lọc

các chủng xạ khuẩn trên môi trƣờng phân lập, tránh chọn lọc các chủng có

cùng đặc điểm hình thái, màu sắc giống nhau… Kết quả phân nhóm xạ khuẩn

nội sinh phân lập đƣợc trên các mẫu Màng tang trong nghiên cứu đƣợc thể

hiện trên hình 3.4.

Hình 3.4. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh đƣợc phân theo nhóm màu

Trên cơ sở 25 chủng xạ khuẩn đã đƣợc phân lập và thuần khiết, các

chủng có màu sắc hệ khuẩn ty thuộc 4/7 nhóm màu xuất hiện với tỷ lệ khác

nhau (Hình 4). Theo đó, xạ khuẩn thuộc nhóm màu vàng là 10 chủng đạt

(40%), và trắng là 10 chủng đạt (40%) chiếm ƣu thế, tiếp theo xám là 3 chủng

đạt (12%), và thấp nhất là xanh 2 chủng đạt (8%) và không phát hiện xạ

khuẩn thuộc nhóm màu đỏ, nâu hay tím. Kết quả trên cũng gần giống với kết

quả nghiên cứu của một số tác giả khi phân lập xạ khuẩn từ đất và biển cũng

nhận thấy nhóm màu trắng thƣờng chiếm tỷ lệ cao hơn [4], [20].

Tuy nhiên, màu sắc của khuẩn ty khí sinh hay khuẩn ty cơ chất là đặc

điểm dễ thay đổi, phụ thuộc vào thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng, tuổi của

chủng và các điều kiện vật lý. Kết quả phân lập và đánh giá đa dạng của xạ

khuẩn nội sinh chứng tỏ Màng tang là cây chủ có nhiều loài xạ khuẩn nội sinh

tồn tại và phát triển và kết quả cũng chỉ ra đây là những khảo sát đầu tiên về

xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại Việt Nam.

3.3. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh

3.3.1. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn

Theo các nghiên cứu công bố trên thế giới, xạ khuẩn nội sinh phân lập

từ các cây dƣợc liệu (đặc biệt là loại chứa tinh dầu hoặc chất kháng vi sinh

vật) có tỷ lệ kháng vi sinh vật cao. Ngoài ra, các chủng xạ khuẩn này có khả

năng kháng các chất kháng sinh, chất ức chế vi sinh vật nội tại trong các cây

dƣợc liệu [23]. Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của

25 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây Màng tang đƣợc tổng hợp trong

bảng 3.2 và bảng 3.3.

Bảng 3.2. Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 25

chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây Màng tang

Xạ khuẩn kháng vi sinh

vật kiểm định

Chủng vi sinh vật kiểm định

Số lƣợng Tỷ lệ (%)

Gram (-)

2 8,0

Escherichia coli ATCC 11105

10 40,0

Proteus vulgaris CNLM

5 20,0

Salmonella enterica ATCC 14028

12 48,0

Pseudomonas aeruginosa CNLM

2 8,0

Enterobacter aerogenes ATCC 13048

Gram (+)

2 8,0

Sarcina lutea CNLM

11 44,0

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

12 48,0

Bacillus cereus ATCC 11778

Kiểm tra phổ kháng khuẩn của 25 chủng xạ khuẩn trên 8 chủng VSV

kiểm định (vi khuẩn Gram -, Gram +) cho thấy, các chủng ức chế sự phát triển

của vi sinh vật kiểm định ở mức độ khác nhau (Bảng 1, Hình 5). Trong số 25

chủng xạ khuẩn, 14 chủng (56%) có khả năng kháng ít nhất 1 chủng VSV

kiểm định. Trong đó, 2 chủng kháng Escherichia coli ATCC 11105 (chiếm 8,0

%); 10 chủng kháng Proteus vulgaris CNLM (chiếm 40,0 %); 5 chủng kháng

Salmonella enterica ATCC 14028 (chiếm 20,0%) ; 12 chủng kháng

Pseudomonas aeruginosa CNLM (chiếm 48,0%); 2 chủng kháng

Enterobacter aerogenes ATCC 13048 (chiếm 8,0%); 2 chủng kháng Sarcina

lutea CNLM (chiếm 8,0%); 11 chủng kháng Staphylococcus epidermidis

ATCC 12228 (chiếm 44,0%); 12 chủng kháng Bacillus cereus ATCC 11778

(chiếm 48,0%). Sáu chủng thể hiện phổ kháng khuẩn rộng cùng kháng ít nhất

4 loại vi sinh vật kiểm định. Các kết quả trên cho thấy tính đa dạng trong khả

năng kháng vi sinh vật gây bệnh của các xạ khuẩn nội sinh phân lập trên cây

Màng tang.

Hình 3.5. Hoạt tính kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A)

Bacillus cereus ATCC 11778 (B) của các chủng xạ khuẩn nội sinh

Bảng 3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn

STT Kí hiệu

Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm)*

chủng

1

2

3

4

5

6

7

8

MPT08

12,53

17,43

13,06

21,0

7,06 ±

12,53

23,60

16,93

± 0,25

± 0,57

± 0,4

± 0,1

0,5

±0,25

± 0,1

±0,05

MPT14

14,96

16,06

19,16

14,33±

± 0,11

± 0,30

± 0,57

0,20

MPT21

14,30

14,36

18,83

13,46

± 0,26

± 0,47

±0,57

±0,05

MPT22

13,86

14,66

12,70

± 0,58

± 0,11

± 0,26

MPT25

15,03

12,93

18,20

22,23

15,73

± 0,20

± 0,45

± 0,30

± 0,63

± 0,46

MPT26

9,16

±0,11

MPT28

7,96 ±

10,13

16,0 ±

23,60

12,43

7,96 ±

32,50

0,11

± 0,25

0,36

± 0,65

± 0,11

0,11

± 0,10

MPT29

6,20 ±

12,26

14,43

8,53 ±

0,30

± 0,30

± 0,55

0,25

MPT30

13,73

7,63 ±

± 0,25

0,47

MPT33

18,93

20,00

20,30

17,13

± 0,15

± 0,34

± 0,20

MPT34

9,93

12,66

5,90 ±

0,15±

± 0,15

0,10

MPT35

18,70±

10,96

9,83 ±

0,15

± 0,05

0,15

MPT37

16,06

14,03

19,60

17,73

± 0,15

± 0,11

± 0,43

± 0,05

MPT45

15,03

20,60

14,90

10,53

± 0,23

± 0,55

± 0,26

± 0,55

Ghi chú: 1. Escherichia coli ATCC 11105, 2. Proteus vulgaris CNLM, 3.

Salmonella enterica ATCC 14028, 4. Pseudomonas aeruginosa CNLM, 5.

Enterobacter aerogenes ATCC 13048, 6. Sarcina lutea CNLM, 7. Staphylococcus

epidermidis ATCC 12228, 8. Bacillus cereus ATCC 11778.

* Số liệu thể hiện đường kính vòng kháng khuẩn của ba thí nghiệm độc lập

Nhiều kết quả nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh khả năng kháng

vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn nội sinh. Theo Zhao và đồng tác giả

(2005), khi phân lập 560 chủng xạ khuẩn từ 26 cây dƣợc liệu tại cao nguyên

Panxi, Trung Quốc có 60 chủng thuộc chi Streptomyces thể hiện hoạt tính

kháng ít nhất một loại vi sinh vật kiểm định (chiếm 10,7%) [73]. Năm 2008,

Li và cộng sự đã công bố phân lập đƣợc 41 chủng xạ khuẩn nội sinh thuộc chi

Streptomyces trên một số cây dƣợc liệu thu thập từ rừng nhiệt đới

Xishuangbanna, tỉnh Vân Nam, Trung Quốc. Đã thu nhận 65,9% chủng xạ

khuẩn có hoạt tính kháng E. coli; 24,4% kháng lại Staphylococcus aureus;

31,7% kháng S. epidermidis, 12,2% kháng C. albicans và các chủng không

thể hiện hoạt tính kháng Klebsiella pneumoniae [36]. Tại Việt Nam, rất ít

nghiên cứu về khả năng kháng vi sinh vật của xạ khuẩn nội sinh trên cây

Màng tang đƣợc công bố. Kết quả thu đƣợc trong công trình nghiên cứu này

đã chỉ ra rằng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang là nguồn kháng sinh có

tiềm năng ứng dụng trong điều trị nhiễm khuẩn gây bệnh.

3.3.2. Xác định gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và

nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng

sinh

Theo nhiều tài liệu trên thế giới công bố, một số sản phẩm trao đổi chất

bậc hai có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thƣ…của xạ khuẩn đƣợc tổng hợp

bởi 3 nhóm enzyme chính là PKS-I, PKS-II và NRPS. Do đó, đánh giá các

gen liên quan đến quá trình tổng hợp kháng sinh và phân tích trình tự gen có

thể dự đoán cấu trúc nhóm kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra [29]. DNA tổng số

của 14 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng ít nhất một loại vi sinh vật kiểm

định sau khi xử lý với RNase đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose

1,0% đƣợc trình bày trong Phụ lục 2, và sử dụng làm khuôn cho phản ứng

PCR khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS. Kết quả thể hiện trên hình

3.6 và hình 3.7.

B

A

Hình 3. 6. Sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I, pks-II của một số chủng xạ

khuẩn nội sinh đại diện

Băng M (A, B) thang DNA chuẩn 1(kb), băng 1-2 (A) sản phẩm PCR khuếch đại

gen pks-I lần lượt của các chủng MPT33, MPT08; Băng 1-7 (B): Sản phẩm PCR

khuếch đại gen pks-II lần lượt của các chủng MPT28, MPT08, MPT30, MPT34,

MPT35, MPT14, MPT26

Hình 3. 7. Sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps của một số chủng xạ khuẩn

nội sinh đại diện

Băng M: thang DNA chuẩn 1(kb), băng 1-7: Sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps

lần lượt của các chủng MPT26, MPT33, MPT21, MPT22, MPT30, MPT25, MPT28.

Kết quả trình bày ở (3.6 và 3.7) cho thấy sản phẩm PCR khuếch đại gen

liên quan đến tổng hợp kháng sinh của 14 chủng xạ khuẩn cho băng DNA có

kích thƣớc khoảng 1400 bp đối với gen (pks-I), 600 bp (pks-II), 750 bp (nrps).

Điều đó cho thấy 3 cặp mồi (K1F/M6R; A3F/A7R; KSαF/KSαR) đƣợc thiết

kế trong thí nghiệm là phù hợp.

Xác định đƣợc 8 chủng mang gen pks-I (chiếm 57,1%), 11 chủng mang

gen pks-II (chiếm 78,6%), và 11 chủng mang gen nrps (chiếm 78,6%) trên

tổng số 14 chủng thí nghiệm. Trong đó, các chủng MPT08, MPT33, MPT35,

MPT25, MPT26, MPT30 có mặt cả ba loại gen trên và 2 chủng MPT29,

MPT37 không thể khuếch đại đƣợc một số các gen trên mặc dù thể hiện hoạt

tính kháng VSV kiểm định (Bảng 3.4).

Kết quả mà nghiên cứu này thu đƣợc khác với công bố của Zhao và

cộng sự (2011), gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS đã đƣợc phát hiện với tỷ lệ

cao, đạt lần lƣợt 53,0%, 82,0%, 53,0% trên tổng số 60 mẫu DNA từ xạ khuẩn.

Trong đó, chủng SAUK6023 chứa cả ba loại gen trên và bốn chủng

SAUK6113, SAUK6114, SAUK6013, SAUK6033 không có gen mã hóa

PKS-I, PKS-II,, NRPS mặc dù có hoạt tính kháng khuẩn [72]. Các nghiên cứu

sử dụng ba cặp mồi trên nhằm đánh giá đa dạng gen liên quan đến khả năng

tổng hợp chất kháng sinh, kháng ung thƣ của xạ khuẩn nội sinh. Một số chủng

chƣa khuếch đại đƣợc gen liên quan có thể các cặp mồi suy biến sử dụng

trong nghiên chƣa phù hợp hoặc đã có những đột biến tại điểm bắt cặp của

các mồi.

Bảng 3.4. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS và khả năng sinh

anthracycline của 14 chủng xạ khuẩn nội sinh

STT Kí hiệu chủng

PKS-I

PKS-II

NRPS

Anthracycline

1 MPT08

+

2 MPT14

+

-

3 MPT21

-

+

4 MPT22

-

+

-

5 MPT25

+

6 MPT26

+

-

7 MPT28

-

+

8 MPT29

-

9 MPT30

+

10 MPT33

+

11 MPT34

-

+

-

12 MPT35

+

-

13 MPT37

-

+

14 MPT45

+

-

+

Ghi chú: +: dương tính; -: âm tính

3.3.3. Khả năng sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline

Một trong những nhóm kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn (S.

olivaceus, S. glaucescens, S. peusetius) hiện đang đƣợc sử dụng để điều trị

nhiều loại ung thƣ thuộc nhóm anthracycline. Để đánh giá liệu 14 chủng

tuyển chọn có khả năng sinh anthracycline hay không, các phép thử đặc hiệu

với nhóm hợp chất này dựa trên thử nghiệm biến đổi màu tại điều kiện pH

acid và kèm theo phƣơng pháp của Trease và Evans (1996) [67]. Quan sát

màu sắc quanh hai bề mặt khuẩn lạc có nhỏ dung dịch acid và kiềm trên đĩa

thạch cho thấy trong 14 chủng nghiên cứu có 8 chủng thể hiện phản ứng

chuyển màu da cam khi có pH acid và màu tím khi có pH kiềm. Nhƣ vậy rất

có thể hợp chất do 8 chủng xạ khuẩn này sinh ra thuộc nhóm kháng sinh

anthracycline

3.4. Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn MPT28

Với mục tiêu tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật

cao ứng dụng trong công nghệ y dƣợc học, chủng MPT28 thể hiện phổ kháng

mạnh, rộng với các chủng vi sinh vật kiểm định (Bảng 3.5). Đồng thời, chủng

MPT28 mang gen mã hóa PKS-II, NRPS dƣơng tính với phản ứng nhận biết

nhóm kháng sinh anthracycline nên đƣợc tuyển chọn cho những nghiên cứu

sâu hơn.

Bảng 3.5. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của chủng MPT28

Đƣờng kính vòng kháng

Chủng vi sinh vật kiểm định

khuẩn (D-d,mm)*

Gram (-)

Escherichia coli ATCC 11105

7,96

Proteus vulgaris CNLM

10,13

Salmonella enterica ATCC 14028

16,0

Pseudomonas aeruginosa CNLM

23,60

Enterobacter aerogenes ATCC 13048

12,43

Gram (+)

Sarcina lutea CNLM

7,96

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

32,50

Bacillus cereus ATCC 11778

0

Ghi chú: * số liệu thể hiện đường kính vòng kháng khuẩn trung bình của ba

thí nghiệm độc lập

3.4.1. Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28

3.4.1.1. Đặc điểm hình thái và bề mặt chuỗi bào tử

Xạ khuẩn đƣợc phân thành 7 nhóm theo màu sắc khuẩn ty khí sinh

gồm: trắng, vàng, đỏ, tím, xám, xanh, xanh da trời... Màu sắc của KTKS,

KTCC và đặc điểm chuỗi bào tử đƣợc sử dụng tiêu chuẩn cơ bản để nghiên

cứu đặc điểm của xạ khuẩn MPT28 (Bảng 3.6; Hình 3.8).

Bảng 3.6. Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT28 khi nuôi cấy trên các môi

trƣờng khác nhau

Khuẩn ty

Sắc tố

Môi trƣờng

KTKS

KTCC

Sắc tố tan Melanin

ISP1

Xám 2 fe

Vàng 1 fb

-

ISP2

Xám 2 fe

Vàng 1 fb

-

ISP3

Xám dc

Vàng 1 db

-

ISP4

Xám dc

Vàng 1 ba

-

ISP5

Xám 5 ih

Vàng 1 ba

-

ISP6

Xám 5 ih

Vàng 1 db

-

ISP7

Vàng 1 cb Vàng 2 db

-

B A

Hình 3. 8. Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trƣờng ISP1 và bề mặt chuỗi bào

tử (B) dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần của chủng

MPT28

Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.8 cho thấy chủng MPT28 thuộc nhóm xạ

khuẩn màu xám, không sinh melanin và sắc tố tan, chuỗi gồm 12-20 bào tử,

cấu trúc cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử hình trụ, gai (sp).

3.4.1.2. Đặc điểm sinh hóa

Việc nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon, nitơ nhằm đánh giá

đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn, bên cạnh đó giúp định hƣớng tìm

nguồn dinh dƣỡng thích hợp cho quá trình lên men. Kết quả nghiên cứu khả

năng sử dụng nguồn carbon, nitơ của chủng xạ khuẩn MPT28 trình bày trong

bảng 3.7.

Bảng 3.7. Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nitơ của chủng xạ khuẩn MPT28

sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C

Nguồn carbon

Khả năng

Nguồn nitơ

Khả năng

(1,0%, w/v)

sinh trƣởng

(1,0%, w/v)

sinh trƣởng

D-Glucose

+

L-Asparagin monohydrat +

D-Glactose

+

L-Histidine monohydrat

-

D-Mantose

+

L- Phenylalanin

+

α-Lactose

+

L-Leucin

+

L-Arabinose

+

L-Tryptophan

-

D-Glucosamine

-

L-Arginine

+

Myo-Inositol

+

L-Isoleucin

+

D-Manitol

+

L-Valine

+

D-Fructose

+

L-Methionin

+

L-Rhamnose

+

L-Lysin

-

D-Saccharnose

+

L-Threonine

+

D-Sorbitol

+

L-Cystein

+

D-Trehalose

2 amino 2 hydroxy-

-

+

methyl 1,3 promo

Đối chứng âm

-

Đối chứng âm

-

Ghi chú :(+) Sinh trưởng tốt; (-) Không sinh trưởng

Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh hóa cho thấy, chủng MPT28 có khả

năng đồng hóa đƣợc nhiều nguồn carbon nhƣ D-Glucose, D-Glactose, Myo-

Inositol, D-Manitol, D-Fructose, D-Saccharnose, D-Sorbitol... và nitơ nhƣ L-

Leucin, L-Arginine, L-Valine, L-Threonine... (Bảng 3.7).

3.4.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng

của xạ khuẩn

Nhiệt độ, pH, nồng độ muối là đặc điểm có ý nghĩa quan trọng đối với

việc ứng dụng xạ khuẩn trong lên men thu nhận các hợp chất có hoạt tính

kháng sinh, kháng ung thƣ. Sinh trƣởng của chủng MPT28 trong môi trƣờng

Bennett ở các điều kiện thí nghiệm thay đổi về nồng độ muối, pH và nhiệt độ

đƣợc thể hiện trong bảng 3.8.

Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng của

chủng MPT28

Điều kiện

Dải sinh trƣởng

Nhiệt độ (oC)

30-37

Nồng độ muối (%)

0-3

pH ban đầu

6-11

Kết quả bảng 3.8 cho thấy chủng xạ khuẩn trong nghiên cứu thuộc nhóm ƣa ấm; sinh trƣởng tốt ở dải nhiệt từ 30-37 oC và pH từ 6-11. Khi nồng

độ muối ≥ 3,0%, chủng MPT28 sinh trƣởng yếu hoặc không sinh trƣởng. Kết

quả trên cũng phù hợp với tính chất và điều kiện khí hậu của mẫu thu thập tại

tỉnh Phú Thọ.

3.4.2. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA của

chủng xạ khuẩn MPT28

3.4.2.1. Khuếch đại gen 16S rDNA

Kết quả DNA tổng số của chủng xạ khuẩn MPT28 (Phụ lục 2) đƣợc sử

dụng làm vật liệu di truyền cho nghiên cứu khuếch đại gen 16S rDNA, kết

quả thể hiện ở hình 3.9.

Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel

agarose 1,0%

Băng M: Thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); Băng 1: Sản phẩm PCR

khuếch đại gen 16S rDNA của chủng MPT28.

Kết quả khuếch đại gen 16S rDNA của chủng MPT28 cho thấy, sản

phẩm DNA của phản ứng PCR cho một băng rõ nét và duy nhất có kích thƣớc

khoảng 1400 bp (Hình 3.9). Nhƣ vậy, sản phẩm của PCR thu đƣợc trong thí

nghiệm là đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh sạch và giải trình tự gen 16S

rDNA.

3.4.2.2. Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA

Kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA của chủng xạ khuẩn đƣợc

trình bày trong bảng 3.9.

Bảng 3.9. Trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng MPT28

Trình tự gen 16S rDNA của chủng

Mã số truy cập

Độ tƣơng

MPT28 sau khi blast trên NCBI

trên GenBank

đồng (%)

Streptomyces albogriseolus 71.1

97%

KX454152.1

Streptomyces albogriseolus T8

97%

KU324449.1

Streptomyces griseorubens AU2

97%

KX156364.1

Streptomyces sp. DB21

97%

KX443347.1

Streptomyces sp. NCD21

KU382328.1

97%

Kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA và so sánh với các trình tự

gen đã công bố trên GenBank bằng công cụ BLAST (NCBI) cho thấy gen mã

hóa 16S rDNA của chủng MPT28 có độ tƣơng đồng chƣa cao so với gen

tƣơng ứng của chủng Streptomyces albogriseolus 71.1 (Bảng 3.9). Dựa vào

kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý – sinh hóa và phân tích trình

tự gen 16S rDNA, chủng xạ khuẩn MPT28 đƣợc định danh là Streptomyces

albogriseolus MPT28.

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

1. Từ 03 mẫu (rễ, thân, lá) cây Màng tang tại tỉnh Phú Thọ, đã phân lập

đƣợc 25 chủng xạ khuẩn nội sinh. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn dựa trên

tỷ lệ phân lập từ các bộ phận cây (rễ, 40%; thân, 32%; lá, 28%); môi

trƣờng phân lập (cao nhất trên môi trƣờng HV, SPA đạt từ 16% đến 20

%); nhóm màu của xạ khuẩn (nhóm màu vàng, trắng (10 chủng, 40%)

chiếm ƣu thế).

2. Sàng lọc đƣợc 14 chủng xạ khuẩn có khả năng kháng ít nhất một loại

VSV kiểm định, trong đó 8 chủng mang gen pks-I (chiếm 57,1%), 11

chủng mang gen pks-II, nrps (chiếm 78,6%), 8 chủng sinh kháng sinh

thuộc nhóm anthracycline.

3. Chủng MPT28 có khả năng sinh kháng sinh phổ rộng, hoạt tính cao.

Dựa trên phân tích đặc điểm sinh học và trình tự gen 16S rDNA, chủng

MPT28 đƣợc định danh là Streptomyces albogriseolus MPT28.

4.2. Kiến nghị

1. Tách dòng và xác định trình tự gen PKS-II, NRPS của chủng S.

albogriseolus MPT28.

2. Nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm hệ gen và khả năng ứng dụng của

chủng S. albogriseolus MPT28.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức

Trạch, Phạm Văn Ty (1972). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh

vật học, NXB Khoa học và Kĩ Thuật, Hà Nội.

2. Egorov NX (1976), Thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản Khoa học và

Kỹ thuật, Hà Nội.

3. Lê Mai Hƣơng, Trần Thị Nhƣ Hằng, Trần Huy Thái, Dƣơng Đức

Huyến (2005), “Phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn

của các chủng nấm nội ký sinh thực vật phân lập từ một số vƣờn thuốc

phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Hóa Học, tr. 352, 20-23.

4. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh

chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở

Việt Nam, Hà Nội.

5. Hoàng Hoa Long, Dorothea M, Ian TB (2013), “Vi khuẩn nội sinh

Bacillus sp. B55 phân lập từ Nicotiana attenuata kích thích sinh trƣởng

và tăng khả năng thích nghi của cây chủ trong điều kiện tự nhiên”, Hội

nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, 2, tr. 329-333.

6. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y

học, Hà Nội.

7. Văn Thị Phƣơng Nhƣ, Cao Ngọc Điệp (2013), “Phân lập và đặc tính vi

khuẩn nội sinh cây lúa (Oryza sativa L.) trồng trên đất của tỉnh Phú

Yên, Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc, 2

tr.450 – 454.

8. Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kì Sơn, Vũ Thị Hạnh

Nguyên, Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), “Đánh giá và sàng lọc

xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế có khả năng kháng vi sinh vật gây

bệnh”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 12(2), tr.1 – 7.

Tiếng Anh

9. Adhikari A, Basnyat R (1999), “Phenotypic characteristics

of Xanthomonas campestris pv. campestris from Nepal”, EJPP, 105(3),

pp.303 - 305.

10. Araujo WL, Marcon J, WJr M, Van Elsas JD, JWVan V, Azevedo JL

(2002), “Diversity of endophytic bacterial populations and their

interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants”, Appl. Environ.

Microbiol., 68, pp.4906 – 4914.

11. Bacon CW, White JF (2000), Microbial endophytes, New York, Marcel

Dekker.

12. Berdy J (2005), “Bioactive microbial metabolites”, J. Antibiot., 58, pp.1

– 26.

13. Cao LX, Qiu ZQ, You JL, Tan HM, Zhou S (2005), “Isolation and

characterization of endophytic Streptomycete antagonists of fusarium

wilt pathogen from surface-sterilized banana roots”, FEMS Microbiol.

Lett., 247, pp.147-152.

14. Castillo U, Harper JK, Strobel GA, Sears J, Alesi K, Ford E, Lin J,

Hunter M, Maranta M, Ge H, Yaver D, Jensen JB, Porter H, Robison R,

Miller D, Hess WM, Condron M, Teplow D (2003), “Kakadumycins,

novel antibiotics from Streptomyces sp. NRRL 30566, an endophyte of

Grevillea pteridifolia”, FEMS Microbiol. Lett., 234, pp.183–190.

15. Chen HH, Qin S, Lee JC, Kim CJ, Xu LH, Jiang CL, Li WJ (2009a),

“Streptomyces mayteni sp. nov., a novel endophytic actinomycete

isolated from Chinese medicinal plant”, Antonie Leeuwenhoek, 95,

pp.47–53.

16. Compant S, Duffy B, Nowak J, Clément C, Barka EA (2005), “Use of

plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases:

principles, mechanisms of action, and future prospects”, Appl. Environ.

Microbiol., 71, pp.4951–4959.

17. Conn VM, Walker AR, Franco CMM (2008), “Endophytic

actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana”, Mol.

Plant. Microbe. Interact., 21, pp.208–218.

18. Coombs JT, Michelsen PP, Franco CMM (2004), “Evaluation of

endophytic actinobacteria as antagonists of Gaeumannomyces graminis

var. tritici in wheat”, Biol. Control., 29, pp.359–366.

19. Coppen JJW (1995), Non-Wood Forest Products 1: Flavours and

Fragrances of Plant Origin, Food and Agriculture Organization of the

United Nations, Rome.

20. Davis KE, Joseph SJ, Janssen PH (2005), “Effects of growth medium,

inoculum size, and incubation time on culturability and isolation of soil

bacteria”, Appl. Environ. Microbiol., 71, pp.826–834.

21. Denmain A, Davies J (1999), Manual of industrial microbiology and

biotechnology, ASM, Washington DC.

22. El-Bondkly AM, El-Gendy MM (2010), “Keratinolytic activity from

new recombinant fusant AYA2000, derived from endophytic

Micromonospora strains”, Can J. Microbiol., 56, pp.748 – 760.

23. El-Tarabily KA (2003), “An endophytic chitinase-producing isolate of

Actinoplanes missouriensis, with potential for biological control of root

rot of lupine caused by Plectosporium tabacinum”, Aust. J. Bot., 51,

pp.257–266.

24. El-Tarabily KA, Sivasithamparam K (2006), “Non-streptomycete

actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens

and as plant growth promoters”, Soil. Biol. Biochem., 38, pp.1505–

1520.

25. Gangwar M, Dogra S and Sharma N (2011), “Antagonistic bioactivity

of endophytic actinomycetes isolated from medicinal plants”, JALRP,

2(4), pp.154-157.

26. Garrity GM, Holt JG (2001), The road map to the manual. In Bergey’s

manual of systematic bacteriology, Springer, pp.119-166.

27. Giorgio M, Pierantonio M, Emanuela S, Gaetano C, Luca G (2004),

“Anthracyclines: Molecular Advances and pharmacologic

developments in antitumor activity and cardiotoxicity”, Pharmacol.

Rew., 56, pp.185 – 229.

28. Gontang EA, Gaudencio SP, Fenical W, Jense PR (2010), “Sequence-

based analysis of secondary-metabolite biosynthesis in marine

actinobacteria”, Appl. Environ. Microbiol, 76(8), pp.2487 – 2499.

29. Gonzalez I, Ayuso-Sacido A, Anderson A, Genilloud O (2005),

“Actinomycetes isolated from lichens: evaluation of their diversity and

detection of biosynthetic gene sequences”, FEMS Microbiol. Ecol., 54,

pp.401 – 415.

30. Hasegawa S, Meguro A, Shimizu M, Nishimura T, Kunoh H (2006),

“Endophytic actinomycetes and their interactions with host plants”,

Actinomycetologica, 20, pp.72–81.

31. Ho C, Jie-Pinge O, Liu Y, Hung C, Tsai M, Liao P, Wang E, Chen Y,

Su Y (2010), “Compositions and in vitro anticancer activities of the leaf

and fruit oils of Litsea cubeba from Taiwan”, Nat. Prod. Commun., 5,

pp.617–620

32. Igarashi Y (2004), “Screening of novel bioactive compounds from

plant-associated actinomycetes”, Actinomycetologica, 18, pp.63–66.

33. Khieu Thi Nhan (2015). Exploring diversity and antimicrobial,

antitumor activities of culturable endophytic actinomycetes associated

with Dracaena cochinchinensis Lour, China.

34. Kizuka M, Enokita R, Takanashi K, Okamoto Y, Otsuka T, Shigematsu

Y, Inoue Y, Okazaki T (1998), “Studies on actinomycetes isolated

from plant leaves”, Actinomycetologica, 12, pp.89–91.

35. Küster E, Williams ST (1964), “Media for the isolation of

Streptomycetes: starch casein medium”, Nature, 202, pp.928–929.

36. Li J, Zhao GZ, Chen HH, Wang HB, Qin S, Zhu WY, Xu LH, Jiang

CL, Li WJ (2008), “Antitumour and antimicrobial activities of

endophytic Streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest”,

Lett Appl Microbiol, 47, pp.574 – 580.

37. Li J, Zhao GZ, Huang HY, Qin S, Zhu WY, Zhao LX, Xu LH, Zhang

S, Li WJ, Strobel G (2012), “Isolation and characterization of

culturable endophytic actinobacteria associated with Artemisia annua

L. Antonie van Leeuwenhoek, 101, pp.515-527.

38. Li WR, Shi QS, Liang Q, Xie XB, Huang XM, Chen YB (2014),

“Antibacterial activity and kinetics of Litsea cubeba oil on Escherichia

coli”, PLOS one, 9(11), pp.1 – 6.

39. Loria R, Bukhalid RA, Fry BA, King RR (1997), “Plant pathogenecity

in the genus Streptomyces”, Plant. Dis., 81, pp.836 – 846.

40. Lu CH, Shen YM (2004), “Two new macrolides produced by

Streptomyces sp. CS”, J. Antibiot., 57, pp.597–600.

41. Madhurama G, Sonam D, Urmil PG, Ravindra NK (2014), “Diversity

and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal

plants in India”, Afr. J. Microbiol. Res., 8(2), pp.184 – 191.

42. Mahera MS, Sulaiman AA, Ismet A, Milton W (2013), “Evaluation of

antibiotic producing genes in Streptomyces isolated from a desert environment of Saudi Arabia”, Life Sci. J., 10(4), pp.974 – 980.

43. Merzaeva và Shirokikh (2010), “The production of auxins by the

endophytic bacteria of Winter Rye”, Appl. Biochem. and Microbiol., 3,

pp.44 - 50.

44. Nguyen Hai Van, Vu Thi Hanh Nguyen, Vu Thu Trang, Phi Quyet

Tien, Khieu Thi Nhan, Samira Sarter, Chu Ky Son (2016),

“Antimicrobial activities and interaction effects of vietnamese Litsea

cubeba (Lour.) Pers essential oil and its endophytic actinobacteria”,

Journal of Science and Technology, 54(4A), pp.234 – 241.

45. Noosidum N, Prabaripai A, Charoenviriyaphap T, Chandrapatya A

(2008), “Excito-repellency properties of essential oils from Melaleuca

leucadendron L., Litsea cubeba (Lour.) Persoon, and Litsea salicifolia

(Nees) on Aedes aegypti (L.) mosquitoes”, J. Vector. Ecol., 33,

pp.305–312.

46. Nor Azah MA, Susiarti S (1999), Litsea cubeba (Lour.) Persoon. In

Plant Resources of South-East Asia, Backhuys Publishers, Leiden, pp

47. Okazaki T (2003), Studies on actinomycetes isolated from plant leave,

Queensland Complete Printing Service, Nambour.

48. Onuma Kaewkla, Christopher MMF (2013), “Rational approaches to

improving the isolation of endophytic actinobacteria from Australian

native trees”, Microb. Ecol., 65, pp.384-393.

49. Priham TG and Tenser HD (1974), “Streptomyces. Waksman and first

and second studies”, Int. J. Syst. Bacteriol., 18, pp.279.

50. Pullen C, Schmitz P, Meurer K, Bamberg DD, Lohmann S, Franc SDC,

Groth I, Schlegel B, Möllmann U, Gollmick F, Gräfe U, Leistner E

(2002), “New and bioactive compounds from Streptomyces strains

residing in the wood of Celastraceae”, Planta, 216, pp.162–167.

51. Qin S, Xing K, Jiang JH, Xu LH, Li WJ (2011), “Biodiversity,

bioactive natural products and biotechnological potential of plant-

associated endophytic actinobacteria”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 89,

pp.457 – 473.

52. Qin S, Zhao GZ, Klenk HP, Li J, Xu LH, Li WJ (2009d), “Nonomuraea

antimicrobica sp. nov., an endophytic actinomycete isolated from

leaves of Maytenus austroyunnanensis”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,

59, pp.2453–2457.

53. Quadt-Hallmann A, Benhamou N, Kloepper JW (1997), “Bacterial

endophytes in cotton: mechanisms of entering the plant”, Can. J.

Microbiol., 43, pp.577-582.

54. Rojas DJ, Sette LD, Araujo WL, Lopes MSG, Silva LF, Furlan RLA,

Padilla G (2012), “The diversity of polyketide synthase genes from

sugarcane-derived fungi”, Microb. Ecol., 63, pp.565 – 577.

55. Sacido-Ayuso A and Genilloud O (2004), “New PCR primer for the

screening of NRPS and PKS-I systems in actinomycetes: Detection and

distribution of these biosynthetic gene sequence in major taxonomic

groups”, Microbial Ecology, 38, pp.10 – 14.

56. Sambrook J, Russell DW (2001), Molecular cloning. A laboratory

manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NewYork.

57. Shimizu M, Suzuki T, Mogami O, Kunoh H (2005), “Disease resistance

of plants induced by endophytic actinomycetes. In: Tsuyumu S, Leach

JE, Shiraishi T, Wolpert T (eds) Genomic and genetic analysis of plant

parasitism and defense”, APS, St. Paul, (3), pp.292–293.

58. Shirling EG and Gottlieb D (1966), “Methods for characterization of

Streptomyces species”, Int. J. Syst. Bacteriol., 16, pp.313 – 340.

59. Smith GE (1957), “Inhibition of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

by a species of Micromonospora isolated from tomato”,

Phytopathology, 47, pp.429–432.

60. Sri P, Yulin L, Antonius Su, Sri B, Latifah KD (2012), “Alpha-

glucosidase inhibitor activity and characterization of endophytic

actinomycetes isolated from some Indonesian diabetic medicinal,

plants”, IJPSR, 4(1), pp.327 – 334.

61. Strobel G, Daisy B (2003), “Endophytes as sources of bioactive

products”, Microbes. Infect., 5, pp.535–544.

62. Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J (2004),” Natural products

from endophytic microorganisms”, J. Nat. Prod., 67, pp.257–268.

63. Taechowisan T, Lu C, Shen Y, Lumyong S (2005), “Secondary

metabolites from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130

and their antifungal activity”, Microbiology, 151, pp.1691–1695.

64. Taechowisan T, Lu CH, Shen YM, Lumyong S (2007a), “4-

arylcoumarin inhibits immediate-type allergy”, Food Agric. Immunol.,

18, pp.203–211.

65. Taechowisan T, Lu CH, Shen YM, Lumyong S (2007b), “Antitumor

activity of 4-arylcoumarins from endophytic Streptomyces aureofaciens

CMUAc130”, J. Cancer. ResTrer., 30, pp.86–91.

66. Tan HM, Cao LX, He ZF, Su GJ, Lin B, Zhou SN (2006), “Isolation of

endophytic actinobacteria from different cultivars of tomato and their

activities against Ralstonia solanaceraum in vitro”, World. J.

Microbiol. Biotechnol., 22, pp.1275 – 1280.

67. Trease GE, Evans WC (1996), A textbook of Pharmacognosy, London.

68. Trenser HD and Danga F (1958), “Hydrogen sulfide production by

Streptomyces as criteria for species differentiation”, J. Bacteriol, 76,

pp.239.

69. Tuntiwachwuttikul P, Taechowisan T, Wanbanjob A, Thadaniti S,

Taylor WC (2008), “Lansai A–D, secondary metabolites from

Streptomyces sp. SUC”, Tetrahedron, 64, pp.7583–7586.

70. Yang TS, Liou ML, Hu TF, Peng CW, Liu TT (2013), “Antimicrobial

activity of the essential oil of Litsea cubeba on cariogenic bacteria”,

The Journal of Essential Oil Research, 25(2), pp.120 – 128.

71. Zhang W, Hu JF, Zhao QC, Shi GB (2012), “Antibacterial, antifungal

and cytotoxic isoquinoline alkaloids from Litsea cubeba”, Molecules,

17, pp.12950 – 12960.

72. Zhao K, Penttinen P, Guan T, Xiao J, Chen Q, Xu J, Lindstro K, Zhang

L, Zhang X, Strobel GA (2011), “The Diversity and Anti-Microbial

Activity of endophytic actinomycetes Isolated from Medicinal Plants in

73. Zhao PJ, Fan LM, Li GH, Zhu N, Shen YM (2005), “Antibacterial and

Panxi Plateau, China”, Curr. Microbiol., 62, pp.182–190.

antitumor macrolides from Streptomyces sp. ls9131”, Arch. Pharm.

Res., 28, pp.1228–1232.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi cấy

- Môi trƣờng TWYE (g/L): Cao thịt 0,25; K2HP04 0,5; agar 15,0;

H2O 1000mL; pH 7,2.

- Môi trƣờng STA (g/L): Tinh bột 15,0; K2HP04 0,5; MgSO4.7H2O

0,05; FeSO4.7H2O 0,01; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2.

- Môi trƣờng HV (g/L): Humic acid 8,0; Na2HPO4 0,5; FeSO4.7H2O

0,01; CaCO3 0,02; NaNO2 0,9; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2.

- Môi trƣờng TA (g/L): Trehalose 18,0; CaCl2 0,3; Na2HPO4 0,3;

CaCO3 0,02; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2.

- Môi trƣờng SA (g/L): Sodium succinate 15,0; K2HPO4 0,6;

FeSO4.7H2O 0,001; CaCl2.2H2O 0,2; KCl 0,3; agar 15,0; H2O

1000 mL; pH 7,2.

- Môi trƣờng CA (g/L): Citrate acid 12,0; K2HPO4.3H2O 0,4;

CaCl2.H2O 0,05; agar 15,0; H2O 1000 mL; pH 7,2.

- Môi trƣờng SPA (g/L): peptone 12,0; K2HPO4 1,0; MgSO4.7H2O

0,1; agar 15,0; H2O 1000 mL, pH 7,2.

- Môi trƣờng LBA (Luria-Bertani) (g/L): Cao nấm men 5,0;

Tryptone 10,0; NaCl 10,0; agar 15,0; Nƣớc cất 1000 mL; pH= 6,5-

7,0.

- Môi trƣờng ISP1 (g/l): Tryptone 5,0, cao nấm men 3,0; agar 18,0;

H2O 1000 mL; pH 7,0.

- Môi trƣờng ISP2 (g/L): cao nấm men 3,0; cao malt 10,0; dextrose

4,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2.

- Môi trƣờng ISP3 (g/L): Bột kiều mạch 20,0; agar 20,0; H2O 1000

mL; pH-7,2.

- Môi trƣờng ISP4 (g/l): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1,0;

MgSO4.7H2O 1,0; NaCl 1,0; (NH4)2SO4 2,0; CaCO3 2,0; agar

18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2

- Môi trƣờng ISP5 (g/l): L-Asparagin monohydrate 1,0; glycerol

10,0; K2HPO4 1,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 7,0-7,4.

- Môi trƣờng ISP6 (g/L): Peptone 10,0; cao nấm men 1,0; xitrat sắt

0,5; agar 18,0; H2O 1000 mL; pH 7-7,2.

- Môi trƣờng ISP7 (g/L): Glycerol 15,0; L-tyrosine 0,5; L-

Asparagin monohydrate 1,0; FeSO4.7H2O 0,01; K2HPO4 0,5;

MgSO4. 7H2O 0,5; Nacl 0,5; agar 20; H2O 1000 mL; pH 7,2-7,4.

- Môi trƣờng ISP9 (g/L): (NH4)2SO4 2,64; KH2PO4 2,38; K2HPO4

5,65; MgSO4 1,0; agar 20,0; H2O 1000 mL; pH 6,8-7,0

Phụ lục 2: DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên cứu

PCR