Đề tài: PHƯƠNG PHÁP PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA THỦY SẢN

GVHD : LÊ TH PH

NG H NG

Ị ƯƠ

Ồ

1 1

Thành viên nhóm

 Nguyễn Thị Huỳnh Nga  Phan Thị Bích Tuyền  Nguyễn Minh Quân  Mai Thị Nga

08141029 08141063 08141123 08141105

Mục lục

ớ

ề

ả ứ ả ứ

ế ắ

ạ ạ ạ

ứ

ụ

i thi u I. Gi ệ II. Nguyên t c PCR ắ III. Đi u ki n ph n ng PCR ệ IV. Quy trình ph n ng PCR 1.Giai đo n bi n tính 2.Giai đo n b t m i ồ 3.Giai đo n kéo dài V. Ý nghĩa và các ng d ng PCR VII. Các h n chạ ế Tài li u tham kh o

ệ

ả

I. GI

I THI U

Ớ

Ệ

ỗ

PCR ( Polymerase Chain Reaction ) là ph n ng chu i ợ ả ứ ạ ả ứ ọ ế

trùng h p hay còn g i là "ph n ng khu ch đ i gen“.

ụ ệ

ố ầ

Trong ngành th y s n vi c áp d ng k thu t PCR đ ậ ỹ ủ ả ể phát hi n ra các m m b nh do virus gây ra nh b nh đ m ư ệ ệ ệ tr ng,b nh đ u vàng, h i ch ng Taura… trên tôm. ứ ộ ệ ầ ắ

ắ

II. Nguyên t c PCR

 PCR là ph

ể ổ ươ ợ

ộ ạ ợ ơ ủ ồ ắ ặ ạ

ng pháp in vitro đ t ng h p m t đo n DNA đ c thù nh công hi u c a 2 m i g n vào 2 s i đ n c a đo n ệ ủ DNA đích v i s tham gia c a DNA polymerase. ờ ớ ự ủ

c n i dài ra nh ho t đ ng

 Đo n m i này sau đó s đ ồ

ẽ ượ ố ạ

ộ ể ạ ờ ạ ộ ớ

c a DNA polymerase đ hình thành m t m ch m i hoàn ủ ch nh. ỉ

ắ

II. Nguyên t c PCR

M t ph n ng PCR là m t chu i nhi u chu kỳ n i ộ

ả ứ

ố

ộ

ề

 ti p nhau, m i chu kỳ g m ba giai đo n:

ỗ ạ

ỗ

ồ

ế

1 chu kỳ

GĐ Kéo dài

GĐ Bi n tính ế

GĐ B t m i ồ ắ

III. Điều kiện phản ứng

PCR

ể ạ ượ ầ c, c n ph i có đ y ả ầ

Hình : Thực nghiệm PCR

Ð th nghi m PCR có th ch y đ ệ đ các thành ph n sau : ầ ể ử ủ

1. Nước

ả ậ

N c s d ng cho ph n ng PCR ph i th t tinh ả ứ t, không ch a ion nào, không ch a DNAase, RNAase, ế ứ

ướ ử ụ ứ i h n …. khi enzyme c t gi ắ ớ ạ

2. Dung dịch đệm cho phản ứng PCR:

ị

ng ph thu c vào lo i ộ

ườ

ụ

ạ

Thành ph n dung d ch đ m th ầ

ị

ng ch a mu i đ m Tris HCl 10 mM, KCl 50 mM

ố ệ

ệ enzyme DNA polymerase s d ng trong PCR, dung d ch ử ụ đ m th ứ ườ ệ và MgCl2 1.5 mM

ừ

ộ

ể

2 có th dao đ ng t

0.5-5 mM. ả

ớ

N ng đ MgCl Chính ion ộ ồ Mg2+ g n k t dNTP v i DNA polymerase, tăng kh năng bám ắ ế n i c a m i. ồ

ố ủ

3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs):

Deoxyadenosine 5’ triphosphate

3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs):

N ng đ kho ng ch ng 100 mM cho m i nucleotide: ỗ ồ ả

ừ ộ dATP, dCTP, dGTP, dTTP .

N ng đ th p kho ng 10 – 100 mM thì Taq polymerase có ộ ấ ồ ả

đ chính xác cao h n. ơ ộ

4. M i (primer)

ồ

t cho ợ ơ ữ ồ ắ ầ ế

M i là nh ng đo n DNA s i đ n ng n và c n thi vi c xúc ti n ph n ng dây chuy n t ng h p DNA. ạ ả ứ ề ổ ợ ệ

Các m i này có chi u ng c nhau, bao g m: ề ượ ồ ế ồ

Mồi xuôi (forward primer)

c (reverse primer). M i ng ồ ượ

5.Enzyme DNA polymerase (Taq)

Là enzyme xúc tác cho quá trình l p ráp các nucleotide A,

ắ T, G, C vào m ch DNA m i t ng h p . ạ ợ

ớ ổ Enzyme s d ng đ u tiên là đo n Klenow c a DNA ủ ạ

ầ ử ụ ị

nhi ủ ở ố

ể ị ề

ổ ử ụ polymerase I v sau s d ng Taq polymerase vì nó không b phá ề đ u đ n cu i t đ bi n tính và xúc tác t ng h p t h y ệ ộ ế ổ ợ ừ ầ ế i nhi u oC l p l t đ 90 quá trình ph n ng,có th ch u nhi ặ ạ ệ ộ ả ứ l n mà không m t kh năng t ng h p DNA ợ ả ấ ầ

6. DNA m u (DNA template)

ẫ

ơ ặ

t t ế ừ ng nghiên c u. DNA m u có đ nguyên v n cao ẫ c tách chi ẹ ượ ộ

Có th là DNA kép, đ n, ho c RNA đ ể các đ i t ố ượ ứ tránh l n t p ch t. ẫ ạ ấ

L ng DNA đ c s d ng cũng có khuynh h ượ ượ ử ụ

ng gi m ả ướ i ta s d ng polymerase 1mg xu ng còn 100µg) vì th ng ử ụ ế ườ ừ

(t cho hi u qu cao . ố ả ệ

III. Quy trình phản ứng

PCR.

 Trong ph n ng PCR nhi ả ứ tr ng và kèm theo là y u t

t đ là vô cùng quan th i gian.

ệ ộ ế ố ờ

ọ

c th c hi n qua 3 giai đo n

ả ứ

ượ

ự

ệ

ạ

 Ph n ng PCR đ trong m t chu kỳ: ộ

:

1. Giai đo n bi n tính ạ

ế

ị ế

ạ t đ 94

nhi

 S i DNA m ch khuôn b bi n tính tách thành 2 s i ợ ệ ộ 0C trong vòng 30 giây đ n 1 phút .

ợ đ n ơ ở

ế

 S bi n tính DNA di n ra v i s có m t c a hai đo n

ặ ủ

ớ ự

ễ

ạ

m i và các dNTP.

ự ế ồ

2.Giai đo n b t c p: ạ

ắ ặ

 Nhi

t đ đ

0C t

t nh t

ệ ộ ượ ạ ấ

ừ

ố

ấ

50 – 65 là 55oC trong kho ng th i gian 1 – 2 phút .

c h th p xu ng t ờ

ả

 Th i gian kéo dài ph thu c ho t đ enzyme DNA

ụ

ờ

polymerase và chi u dài s n ph m. ề

ộ ả

ạ ộ ẩ

: 3. Giai đo n kéo dài ạ

 Nhi

c nâng lên 72

0C trong vòng 30

ượ

giây đ n 1 phút .

t đ lúc này đ ệ ộ ế

ờ

ụ

ủ ệ

ồ

ố

ắ

 Nh tác d ng c a men Taq polymerase các Nu có s n ẵ trong ng nghi m g n vào các m i theo nguyên t c b ắ ổ sung

ộ ả

ớ

ượ

=> M t b n sao DNA m i đã đ

. c hình thành

3. Giai đo n kéo dài ạ

S đ ph n ng PCR qua nhi u chu kỳ

ả ứ

ơ ồ

ề

t đ c a các chu kỳ ph n ng

ệ ộ ủ

ả ứ

Hình: Nhi PCR

V. Ý nghĩa và các ứng dụng

ng pháp này có ý nghĩa l n vì nhi u lý

ươ

ớ

ề

a. Ph do:

ẫ ủ ầ

ệ

ự ắ

 Đ tinh sach c a m u không c n cao ộ  D th c hi n ễ ự  R ti n và th i gian th c hi n ng n ệ ờ ẽ ề  Đ chính xác cao đáng tin c y ậ ộ

b. Các ng d ng ch y u c a PCR g m:

ủ ế ủ

ụ

ứ

ồ

ế

ệ ộ

ồ ạ

ệ

ụ ồ ố ọ

ồ

đ ng v t th y s n nh b nh tôm:

 Phát hi n đ t bi n  Ph c h i các gen đã t n t i hàng tri u năm  Ch n gi ng v t nuôi, cây tr ng ậ  Xác đ nh huy t th ng, truy tìm d u v t t ấ ế ộ ố ế  Xác đ nh m m b nh t ủ ả

ị ị

ệ

ầ

i ph m ạ ư ệ ừ ộ MBV, WSSV, YHV, TSV…và b nh trên cá: VNN…

ậ ệ

VI. Các hạn chế

Do ph ế ạ

ng pháp có đ nh y cao và khu ch đ i nucleic i trong thao tác và đòi ộ ạ ng d n đ n l

acid nên d b nh h ưở h i s th n tr ng trong quá trình th c hi n. ỏ ự ậ ẫ ế ỗ ự ệ

ấ ề ớ

c và trình t

i h n

ớ ạ

ễ

ươ ễ ị ả ọ Ba v n đ l n khi dùng PCR:  Kích th c n gi ự ầ ướ  S ngo i nhi m ạ ự  Các sai sót gây ra do Taq polymerase

VII. Kết luận

ụ

ộ

c áp d ng r ng rãi ọ

ượ ể ủ

ầ

góp ph n không nh cho s phát tri n c a y h c nói ự chung,cho ngành th y s n nói riêng.

Ngày nay kĩ thu t PCR đang đ ậ ỏ ủ ả

ạ

ể

ả

ầ

ụ

ạ

ơ

ẩ

ả

ủ ỹ ế ể ả ệ ự ậ

ộ

ạ

Tuy nhiên bên c nh nh ng u đi m c a k thu t này ậ ữ ư thì c n ph i kh c ph c nh ng h n ch đ gi m giá ắ ữ i k t qu cao h n trong vi c chu n đoán thành, mang l ạ ế các m m b nh m i gây h i cho đ ng – th c v t và con ớ ệ ầ i.ườ ng

Tài liệu tham khảo

ng H

 Bùi Trang Việt – Lê Thi ̣ Ph

ươ

ồng. 2006. Sinh học

di truyền va ̀ phân tử, phần II. Sinh học phân tử.

 Đ Hi u Liêm, 2007 . Sinh hóa đ i c

Đề tài: PHƯƠNG PHÁP PCR

Chủ đề:

Tiểu luận bảo vệ thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA THỦY SẢN

GVHD : LÊ TH PH

NG H NG

Ị ƯƠ

Ồ

Thành viên nhóm

Mục lục

ớ

ề

ả ứ ả ứ

ứ

ụ

i thi u I. Gi ệ II. Nguyên t c PCR ắ III. Đi u ki n ph n ng PCR ệ IV. Quy trình ph n ng PCR 1.Giai đo n bi n tính 2.Giai đo n b t m i ồ 3.Giai đo n kéo dài V. Ý nghĩa và các ng d ng PCR VII. Các h n chạ ế Tài li u tham kh o

ệ

ả

I. GI

I THI U

Ớ

Ệ

trùng h p hay còn g i là "ph n ng khu ch đ i gen“.

ắ

II. Nguyên t c PCR

 Đo n m i này sau đó s đ ồ

ắ

II. Nguyên t c PCR

M t ph n ng PCR là m t chu i nhi u chu kỳ n i ộ

ả ứ

ố

ộ

ề

 ti p nhau, m i chu kỳ g m ba giai đo n:

ỗ ạ

ỗ

ồ

ế

III. Điều kiện phản ứng

PCR

1. Nước

2. Dung dịch đệm cho phản ứng PCR:

ị

ng ph thu c vào lo i ộ

ườ

ụ

ạ

Thành ph n dung d ch đ m th ầ

ị

ng ch a mu i đ m Tris HCl 10 mM, KCl 50 mM

ố ệ

ệ enzyme DNA polymerase s d ng trong PCR, dung d ch ử ụ đ m th ứ ườ ệ và MgCl2 1.5 mM

ừ

ộ

ể

2 có th dao đ ng t

0.5-5 mM. ả

ớ

N ng đ MgCl Chính ion ộ ồ Mg2+ g n k t dNTP v i DNA polymerase, tăng kh năng bám ắ ế n i c a m i. ồ

ố ủ

3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs):

3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs):

ồ

5.Enzyme DNA polymerase (Taq)

6. DNA m u (DNA template)

ẫ

III. Quy trình phản ứng

PCR.

 Trong ph n ng PCR nhi ả ứ tr ng và kèm theo là y u t

t đ là vô cùng quan th i gian.

ệ ộ ế ố ờ

ọ

c th c hi n qua 3 giai đo n

ả ứ

ượ

ự

ệ

ạ

 Ph n ng PCR đ trong m t chu kỳ: ộ

: