Đồ án tốt nghiệp: Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT NẤM PAECILOMYCES SP. ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MEILODOGYNE SP. GÂY HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HAI

Sinh viên thực hiện : PHAN ÁNH NGÂN

MSSV: 1211100132

Lớp: 12DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2016.

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu

thực sự của cá nhân em dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai – giảng viên

Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công

Nghệ Tp. HCM. Đề tài được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến

hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa

Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp.

HCM. Tất cả các số liệu, hình ảnh, các kết quả là nghiên cứu hoàn toàn trung thực.

Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian

lận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Tp. HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Phan Ánh Ngân

i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhận

được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng

biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh học –

Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM đã cùng với tri

thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em

trong suốt thời gian học tập tại trường. Và đặc biệt, trong học kỳ này. Nếu không có

những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em

rất khó có thể hoàn thiện được. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Bài

báo cáo đồ án tốt nghiệp thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng. Bước đầu đi vào

thực tế của em còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những

thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu

của quý Thầy Cô và các bạn học cùng lớp để kiến thức của em trong lĩnh vực này

được hoàn thiện hơn.

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của

trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM, đặc biệt là TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên

khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường đã tạo điều kiện

cho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng

xin chân thành cám ơn các thầy cô ở phòng thí nghiệm, các anh chị, các bạn đã

nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp.

Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, cũng như là trong quá trình làm

bài báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh

nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót,

em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô để em học thêm được nhiều

kinh nghiệm và áp dụng vào công việc sắp tới.

Em xin chân thành cảm ơn !

ii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. ii

MỤC LỤC .................................................................................................................. iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vi

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vii

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. viii

ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................. 1

MỤC ĐÍCH .................................................................................................................. 2

NỘI DUNG................................................................................................................... 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3

Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp. ..................................................................... 3

1.1.1. Phân loại khoa học ............................................................................................. 3

1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................. 4

1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces .......................................................... 5

1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến

trùng .............................................................................................................................. 6

1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. ................. 7

Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh bướu rễ trên cây hồ tiêu 11

1.2.1. Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật ..................................................... 11

1.2.2. Phân loại khoa học ........................................................................................... 14

Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp.

trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng................................................................... 19

Các nghiên cứu trong nước về nhân nuôi và sử dụng Paecilomyces sp. trong

phòng trừ tuyến trùng hại cây .................................................................................... 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................. 24

Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................................... 24

iii

Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất ............................................................ 24

2.2.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 24

2.2.2. Thiết bị .............................................................................................................. 24

2.2.3. Các loại môi trường sử dụng ............................................................................ 25

Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 26

2.3.1. Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp. ........................................................... 27

2.3.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng ..................................................... 28

2.3.3. Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật ................................... 28

2.3.4. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) 29

2.3.5. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các loại môi trường

nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009) ............................................................... 30

2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm

Paecilomyces sp.......................................................................................................... 30

2.3.7. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces

sp. ................................................................................................................................ 31

2.3.8. Khảo sát khả năng kí sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm

Paecilomyces sp.......................................................................................................... 35

2.3.9. Đánh giá tác động của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. trong việc phòng trừ

tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây hồ tiêu ............................................................ 36

2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 38

Kết quả hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp. .................................................. 38

Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến sự phát triển của

Paecilomyces sp.......................................................................................................... 39

iv

3.2.1. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp.

..................................................................................................................................... 39

3.2.2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của Paecilomyces sp.

..................................................................................................................................... 41

3.2.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Trichoderma sp. và

Paecilomyces sp.......................................................................................................... 43

Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và

phát triển của nấm Pacilomyces sp. (môi trường lỏng) ............................................. 44

3.3.1. Khảo sát môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm

Paecilomyces sp.......................................................................................................... 44

3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành

và phát triển của nấm Paecilomyces sp. (môi trường rắn) ........................................ 49

Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm

Paecilomyces sp.......................................................................................................... 52

3.4.1. Trong điều kiện phòng thí nghiệm ................................................................... 52

3.4.2. Trên đồng ruộng ............................................................................................... 55

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 58

Kết luận................................................................................................................ 58

Kiến nghị ............................................................................................................. 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 59

Tài liệu tiếng việt ........................................................................................................ 59

Tài liệu tiếng anh ........................................................................................................ 59

Tài liệu từ internet ...................................................................................................... 61

PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 1

v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CDB: Czapeck – Dox.

CMB: Complete Media

NSC: ngày sau cấy.

NT: nghiệm thức.

PDA: Potato D – Glucose Agar

SDAY1: Sabourand dextrose Yeast

SDAY3: Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng.

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm ....................................................................................... 31

Bảng 2. 2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu ....................................... 32

Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm ............................................. 33

Bảng 2. 4. Bố trí thí nghiệm khả năng đồng sinh trưởng của Trichoderma sp. và

Paecilomyces sp.......................................................................................................... 35

Bảng 2. 5. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces sp. ..... 37

Bảng 3. 1. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường trừ nấm. . 40

Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm

Paecilomyces sp.......................................................................................................... 40

Bảng 3. 3. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. .................................................... 41

Bảng 3. 4. Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế .......................................................................... 41

Bảng 3. 5. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. .................................................... 43

Bảng 3. 6. Đường kính tản nấm Trichoderma sp. khi cấy đồng thời với nấm

Paecilomyces sp.......................................................................................................... 43

Bảng 3. 7. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. sau thời gian nuôi cấy trên môi

trường lỏng lắc. ........................................................................................................... 44

Bảng 3. 8. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. tính theo logarit ............................ 46

Bảng 3. 9. Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy .................................................... 51

Bảng 3. 10. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay ngô mảnh và

gạo tấm........................................................................................................................ 52

Bảng 3. 11. Tỷ lệ phần trăm số tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị nấm

Paecilomyces sp. ký sinh. ........................................................................................... 53

Bảng 3. 12. Đánh giá cấp hại của tuyến trùng trên cây hồ tiêu. ................................ 55

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường PDA. ........ 4

Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi .................................. 5

Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin) ........................................................ 6

Hình 1.4. Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật ......................................................... 15

Hình 1.5. Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp. ..................................................... 17

Hình 1.6. Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. phòng trừ tuyến trùng. ......... 22

Hình 3.1. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA. ........................................... 38

Hình 3.2. Tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại

thuốc hóa học. (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Plutel 1,8 EC; D: Oshin

20WP; E: đối chứng) .................................................................................................. 39

Hình 3.3. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc

hóa học.. (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin

50WP; E: đối chứng) .................................................................................................. 42

Hình 3.4. Đĩa nấm khi cấy đồng thời Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. ........... 44

Hình 3.5. Dịch nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường. (A: Môi

trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường

SDAY3). ..................................................................................................................... 45

Hình 3.6. Mật độ bào tử tính theo logarit trên bốn loại môi trường lỏng. ................ 48

Hình 3.7. Hình nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên 4 loại môi trường rắn(A:

môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường

cám) ............................................................................................................................ 50

Hình 3.8. Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn trên 4 loại môi trường. .............. 51

Hình 3.9. Nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay. ............................................. 52

Hình 3.10. Tỷ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị chết ở các ngày sau khi lây

nhiễm. ........................................................................ Error! Bookmark not defined.

Hình 3.11. Nấm Paecilomyces sp. tấn công con cái và trứng tuyến trùng

Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái

tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái

viii

mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces sp. soi dưới kính hiển

vi sau khi nhuộm Methylene blue). ............................................................................ 54

Hình 3.12. Người dân pha chế phẩm Paecilomyces sp. tưới vào gốc cây hồ tiêu .... 56

Hình 3.13. Trước khi tưới. ......................................................................................... 57

Hình 3.14. Sau khi tưới. ............................................................................................. 57

ix

Đồ án tốt nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực chính của Việt Nam.

Hồ tiêu (piper nigrumL.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sản

phẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam. Năm 2015, mặc dù chưa có thống

kê đầy đủ, nhưng dự báo diện tích hồ tiêu cả nước đã vượt con số 100.000 ha (Theo

số liệu Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015). Tuy nhiên, cũng như các ngành nông

nghiệp khác, ngành hồ tiêu cũng phải đối mặt với các vấn đề về thiệt hại năng suất

gây nên do dịch hại. Do đó, bảo vệ thực vật là một trong những phần rất quan trọng

trong việc nâng cao năng suất hồ tiêu vì dịch hại được xem như nguyên nhân chính

làm giảm năng suất và chất lượng hồ tiêu (Trịnh Thị Thu Thủy và ctv, 2012). Bên

cạn các loại bệnh hại, tuyến trùng là dịch hại nguy hiểm trên cây hồ tiêu. Theo kết

quả điều tra của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam thì tuyến trùng

xuất hiện phổ biến ở tất cả các vùng trồng tiêu trong cả nước với mức độ gây hại

cao. Việc tìm ra giải pháp để kiếm soát tác nhân tuyến trùng gây hại rất quan trọng.

Hiện nay, đa số nông dân thường sử dụng các loại thuốc hóa học để phòng trừ. Tuy

có tác dụng nhanh và hiệu quả nhưng các loại thuốc hóa học lại gây ra tác động xấu

đối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tính kháng của sâu bệnh làm

cho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay, các tác nhân sinh học là

một trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu.

Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để

phòng trừ tuyến trùng. Đặc biệt, nấm Paecilomyces sp. được xem là một trong

những loài nấm diệt tuyến trùng giệu quả cao nhất (Burges H. D., 1998; Butt T. M

và Copping L., 2000). Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm Paecilomyces

vẫn còn hạn chế. Năm 2014, Phùng Lê Kim Yến thuộc trường đại học Công nghệ

thành phố Hồ Chí Minh, phân lập được chủng nấm Paecilomyces sp. và đã chứng

minh chủng nấm này có hiệu lực trừ tuyến trùng tốt. Tuy nhiên, tác giả chưa đưa ra

được môi trường sản xuất thích hợp đối với chủng nấm này để ứng dụng trên đồng

ruộng. Vì vậy, sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng

trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu”.

1

Đồ án tốt nghiệp

MỤC ĐÍCH

Chọn môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm

Paecilomyces sp. và đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng của chế phẩm nấm

Paecilomyces sp.

NỘI DUNG

❖ Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp.

❖ Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của

nấm Paecilomyces sp.

❖ Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm

Paecilomyces sp.

❖ Đáng giá khả năng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu trong điều kiện in vitro và trên

đồng ruộng.

2

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp.

1.1.1. Phân loại khoa học

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Eurotiomycetes

Bộ: Eurotiales

Họ: Trichocomaceace

Chi: Paecylomyces

Chi Paecilomyces do Bainier mô tả năm 1907, sau đó được nhiều tác giả

chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Paecilomyces lilacinum đã được

phân loại trong phần Isarioidea, mà trạng thái hoàn hảo vẫn chưa được tìm thấy.

Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và phân bố

trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus, Paecilomyces

fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces

tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (Dilip K. Arora, P. D.

Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004).

Nấm Paecilomyces sp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh tuyến trùng rất rộng,

cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp. dễ

dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực

vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Một số

loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:

- Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết tuyến trùng

- Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất

- Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, tuyến trùng.

- Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở tuyến trùng

chết, rừng cao su, đất trồng tiêu... (Crop Protection Compennium, 2002).

3

Đồ án tốt nghiệp

1.1.2. Đặc điểm hình thái

Paecilomyces sp. là loài nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác tuyến

trùng. Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá

chậm, có dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đố khi

bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên

thường được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài. Cũng có loài màu nâu hay vàng

sẫm. Sợi nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Cuống

bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces sp. thường

lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium, gốc cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và

uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều. Bào tử

phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc

có gai (Trần Văn Mão, 2002). Khuẩn lạc mọc theo đường tròn đồng tâm. Có thể

phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces thông qua hình thái đại thể và vi thể.

(Phùng Lê Kim Yến, 2014)

Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường PDA.

(Nguồn:http://galleryhip.com/scopulariopsis.htm)

Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu như một cái cổ.

Bào tử trong chuỗi có nhiều dạng từ elip đến hình thoi. Bào tử có thành trơn hoặc

hơi nhám, không có bào tử chống chịu.

4

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi

(Nguồn: http://www.wikiwand.com/de/Paecilomyces_variotii)

1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces

Khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách được hoạt chất sinh học có

tên gọi là leucinostatins (còn gọi là paecilitoxin). Leucinostatins là một peptide

trung tính với cấu trúc gồm: α - aminoisobutyric acid, L-leucine, β - alanine và theo

sau bởi 3 acid amin bất thường (L – threo – β - hydroxy leucine, 2 – amino – 2 –

hydroxy – 4 – methyl – 8 oxodecanoicacid và cis – 4 – methyl – L - proline (theo

Mori et al. 1982). Leucinostatins có 6 loại đã được mô tả là A, B, C, D, E, F.

Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và nhiều

loại nấm (theo Fukushima et al. 1983 a,b). Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến

trùng không có sự tham gia của loại độc tố này. Tùy từng loài Paecilomyces khác

nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriunbin,

viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hóa thứ

cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng.

5

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin)

1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến

trùng

Nhiều loài vi nấm được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và

West, 1991). Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus và

Paecilomyces chalmydosporia, chúng được xem là có khả năng ký sinh tuyến trùng

hiệu quả nhất, có thể kí sinh cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood, 1996).

Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp

biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng. Một trong những yếu tố quan trọng ảnh

hưởng đến quá trình xâm nhiễm là khả năng tiết enzyme protease và chitinase, bởi

vì vỏ trứng được cấu tạo bởi 3 lớp riêng biệt: lớp vitelline bên ngoài, một lớp chitin

và một lớp lipoprotein bên trong. Theo Llorca và Claugher (1990), trong quá trình

xâm nhiễm, ở giai đoạn đầu, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh tiếp xúc với vỏ

trứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng dẫn đến sự tan rã của lớp

vitellin, sự phân hủy lớp chitin và lipoprotein (Morton et al., 2004).

Các loài nấm khác nhau có khả năng xâm nhiễm tuyến trùng và trứng theo

các phương thức khác nhau. Ban đầu, các bào tử và sợi nấm tiếp xúc với vỏ trứng.

Nấm kí sinh tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (tiết enzyme) và cơ học.

Nấm tiết ra các enzyme làm mềm vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử

mộc mầm, thông qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong

6

Đồ án tốt nghiệp

trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009). Khả năng tiết enzyme chitinase và protease

đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập trứng tuyến trùng của các loài

nấm (Tikhonov et al., 20002) do vỏ trứng được cấu tạo từ chitin và protein tạo

thành một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980). Sau khi xâm nhập vào

bên trong chúng hoạt động, tiết ra các độc tố làm tê liệt và phá hủy bên trong cơ thể

tuyến trùng, hút dinh dưỡng để sinh sản, tiêu diệt trứng, ấu trùng, làm thay đổi sự

trao đổi chất, hoạt động sinh lý, dẫn đến cái chết của tuyến trùng.

1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp.

Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp. khi tấn công

vào cơ thể tuyến trùng nếu gặp những điều kiện không thích hợp về nhiệt độ và ẩm

độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên những thể chịu đựng (resistant structures) để đối

phó lại với môi trường (Penland, 1982).

1.1.5.1 Nguồn dinh dưỡng

Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces sp. cần nhiều dưỡng chất, nếu

thiếu dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với tuyến trùng

(theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Carbon và Nitơ cùng với sự cân bằng

giữa chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển cũng như sự hình thành

bào tử của nấm Paecilomyces sp. (theo trích dẫn của Rayati và ctv, 2001). Các

nghiên cứu cho biết, việc bổ sung nguồn đường có ảnh hưởng đến khả năng sinh

enzyme của nấm (dẫn theo Rayati và ctv, 2001). Các tác giả còn cho biết sucrose là

cơ chất tốt nhất (8,725 cm) cho sự tăng trưởng, tiếp theo là glucose (5,625 cm).

Liang, K. (1981) đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động

vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt (Hill, K. L, 1999, trích dẫn bởi Trần Văn Mão,

2002).

1.1.5.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ và độ ẩm tương đối được coi là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự

phát triển, hình thành bào tử và lây nhiễm của các loài nấm kí sinh tuyến trùng

0C, nhưng ở 25 0C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999). Gần đây, Stather và

(Ayyasamy và Baskaran, 2005). Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 – 25

7

Đồ án tốt nghiệp

ctv đã công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát

triển của nấm Paecilomyces sp. và xác định nấm Paecilomyces sp. thích hợp ở nhiệt

độ 28 0C. Nếu nhiệt độ cao bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành, khi tấn công

tuyến trùng nếu gặp điều kiện nhiệt độ, ẩm độ hay ánh sáng không thích hợp thì

nấm Paecilomyces sp. sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường

(theo Penland, 1982). Khi nuôi nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt

độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 15 0C có lợi cho sự hình thành bào tử hơn là nhiệt

0C, nhưng ở nhiệt độ 18 0C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18 % so với nhiệt độ 25 0C.

độ 24 0C. Khi nuôi nấm Paecilomyces papillata, nhiệt độ thích hợp nhất là 24 - 26

Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình, dị hóa, làm tăng

quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão, 2002). Julio

J. D và ctv. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo

nên ở các nhiệt độ 12 0C, 16 0C và 30 0C.

1.1.5.3 Ẩm độ

Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ 80 – 90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Ẩm độ

cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm

độthấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm

Paecilomyces sp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34 % hơn là khi

ẩm độ 75 %.

1.1.5.4 pH

pH môi trường được quyết định bởi nồng độ ion H+, chính nồng độ ion H+

có ảnh hưởng đến hệ thống enzyme của tế bào và ảnh hưởng việc hấp thu khoáng,

acid hữu cơ của tế bào nấm cho quá trình phát triển cũng như hình thành bào tử

(Dasrupta, 1994). Nấm thường sống trong phạm vi pH = 3,5 – 8. Nhưng nấm tuyến

trùng ưa pH hơi acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 – 6. Theo nghiên cứu

của Sung Mi Shim et al., (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P.

fumosoroseus nằm trong khoảng 6 – 9, còn P. japonica phát triển tối ưu ở pH 7

(Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003).

1.1.5.5 Ánh sáng

8

Đồ án tốt nghiệp

Các loài nấm ký sinh tuyến trùng, tuyến trùng rất cần ánh sáng cho sự phát

triển và tạo bào tử. Ánh sáng là nhân tố không thể thiếu cho việc hình thành bào tử

(theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình

sinh bào tử của nấm Paecilomyces spp. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces

spp. sẽ không tạo nhiều bào tử.

1.1.5.6 Độ thoáng khí

Nấm tuyến trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí. Khi nấm phát triển chúng đòi

hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của

không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt.

1.1.5.7 Môi trường nuôi cấy

Năm 1986, tác giả Jeanne M. M. I. và CS. (1986) đã thử nghiệm nuôi cấy

nấm Paecilomyces sp. bằng phương pháp lên men chìm. Tác giả đã tiến hành thử

nghiệm các điều kiện nhân sinh khối tạo bào tử chồi (Blastospore) bằng các nguồn

nitơ và cacbon khác nhau. Kết quả cho thấy trong các nguồn nitơ thử nghiệm thì

(NH4)2SO4 thích hợp nhất cho nấm Paecilomyces sp. phát triển, tạo bào tử chồi.

nhiều nghiên cứu về sản xuất nấm Paecilomyces sp. trong điều kiện nuôi cấy lỏng

đã chỉ ra rằng để tối ưu hóa cho sản xuất tối đa sinh khối sợi nấm và exo –

polysaccharide của nấm Paecilomyces japonica. Kết quả cho thấy với thành phần

glucose 30g, 20 g cao nấm men, 0,5g KH2PO4 và 0,1 g CuCl2.2H2O và 1 lít nước

cất được cho là môi trường tối ưu để sản xuất nấm Paecilomyces japonica ở nhiệt

độ 27 0C sẽ cho sinh khối sợi nấm và lượng polysaccharide lần lượt là 23,1 g / l và

2,5 g / l (Lee JS, Iung WC, Park SJ, Lee KE, Shin WC, Hong Ex, 2012). Nghiên

cứu của Li Gao (2015) báo cáo về tác động của các yếu tố dinh dưỡng và môi

trường ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối và bào tử nấm Paecilomyces lilacunus IPC

– P. Các yếu tố này bao gồm nguồn carbon và nitơ, tỷ lệ C / N, các khoáng chất và

vitamin cùng với nguồn nước, nhiệt độ, chu kỳ sáng / tối và độ pH. Các bào tử đã

được cấy trên môi trường cơ bản (sucrose 19.00 g / l, peptone đậu nành 4.06 g / l,

K2HPO4 1,00 g / l, KCl 0.50 g / l, MgSO4 0.50 g / l, FeSO4 0,01 g / l, agar 13,00 g /

l) trong 4 ngày, trước khi được cấy chuyền qua môi trường hình thành bào tử

9

Đồ án tốt nghiệp

(dextrin 2.27 g / l, urê 2.13 g / l, CaCl2 3,00 g / l, ZnSO4 · 7H2O 0,01 g / l, agar

13.00 g / l) cho thêm 4 ngày theo các điều kiện môi trường sau đây: -3,9 MPa / pH 7

/ ánh sáng 24 h / nhiệt độ 29 °C; những điều kiện đã được thay đổi để -0,3 MPa / pH

6 / ánh sáng 24 h / nhiệt độ 23 ° C để có được số lượng sinh khối tốt hơn. Số liệu

cung cấp thông tin về nhu cầu dinh dưỡng và môi trường của loại nấm này, đó sẽ là

điều cần thiết cho việc sản xuất chế phẩm thương mại của nó. Môi trường nuôi cấy

lỏng với nồng độ carbon khác nhau và tỷ lệ C / N đã được thử nghiệm để sản xuất

bào tử chịu khô hạn của Paecilomyces fumosoroseus. Trong khi tất cả các môi

trường được thử nghiệm hỗ trợ hình thành bào tử trong môi trường lỏng, nồng độ

bào tử cao (5,8 × 108 bào tử / ml) được sản xuất trong môi trường có chứa 80 g

glucose.l-1 và 13,2 g Casamino axit.l-1 (môi trường MS) và một tỷ lệ cao hơn đáng

kể (79 %) của các bào tử sống sót không khí khô. có chứa nồng độ glucose trong

môi trường lớn hơn 20 g / l và axit Casamino nồng độ từ 13,2 và 40 g / l hỗ trợ sản

xuất tối đa của bào tử chịu khô hạn. Tất cả 23 chủng nấm P. fumosoroseus phân lập

trong trong môi trường MS được sản xuất cho nồng độ cao của bào tử chịu khô hạn.

Khi bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, hơn 60 % số bào tử đông khô được sản xuất trong

môi trường MS vẫn còn hoạt tính sau khi bảo quản 7 tháng trong khi ít hơn 25 %

của bào tử khô trong không khí sống sót sau 90 ngày lưu trữ.

Hàng loạt các nghiên cứu về các loại cơ chất, thành phần môi trường để sản

xuất sinh khối nấm Paecilomyces sp. đã được thực hiện. S. Prabhu, S.Kumar và S.

Subranmanian (2008) nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus

trên môi trường lỏng để trừ trứng tuyến trùng. Thí nghiệm được thực hiện trên 4

loại môi trường Potato dextrose broth (PDB), môi trường Richards; 10 % Molasses

và môi trường Semi chọn lọc. Kết quả thí nghiệm cho thấy khối lượng sợi nấm đạt

cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (19,82g), tiếp theo là môi trường 10 %

Molasses (16.85 g). Khối lượng sợi nấm đạt ít nhất ở môi trường PDB (10.5g). Sinh

khối sợi nấm đạt cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (32.8 x 107 bào tử / g), tiếp

theo là môi trường 10% Molasses (28.8 x 107 bào tử / g). Bào tử đạt ít nhất ở môi

trường PDB (10.3 x 107 bào tử / g). Năm 2015, Zhen Yu, You – chi Zhang, Xiang

10

Đồ án tốt nghiệp

Zhang và Yin Wang đã thực hiện nghiên cứu lên men nấm Paecilomyces lilacinus

bằng chất thải thực phẩm kiểm soát sinh học tuyến trùng sần rễ. Điều kiện môi

trường nuôi cấy nấm P. lilacinus được tối ưu hóa thông qua phương pháp lên men

bề mặt. Kết quả chỉ ra rằng thời gian lên men, lượng chất thải thực phẩm, độ pH ban

đầu và nhiệt độ là các yếu tố quna trọng ảnh hưởng đến sản xuất P. lilacinus. Sinh

khối nấm Paecilomyces lilacinus phát triển ở điều kiện tối ưu cho 109,6±0,3 bào tử /

ml. Sau khi lên men, nhu cầu oxy hóa của chất thải thực phẩm giảm một cách hiệu

quả với 81,92 %. Hoạt tính enzyme protease và khả năng kiểm soát tuyến trùng sần

rễ của P. lilacinus nuôi bằng chất thải thực phẩm được đánh giá cao hơn khi nuôi

bằng môi trường PDA lần lượt là 10,8 % và 27 %.

Lê Hữu Phước và cộng sự (2009) đã thực hiện nghiên cứu nhân sinh khối

nấm Paecilomyces spp. trên bốn loại môi trường CDB, CMB, SDAY1 và SDAY3

qua các thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày. Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng Khả

năng tạo bào tử ở 4 môi trường dinh dưỡng cao nhất ở 6 NSKL. Mật số bào tử cao

nhất ở môi trường SDAY3 (5,6 x 108 bào tử / ml) và thấp nhất là môi trường CDB,

chỉ có 0,6 x 108 bào tử / ml. Hai môi trường SDAY1 và CAM cho mật số bào tử lần

lượt là 5,0 x 108 bào tử / ml và 4,8 x 108 bào tử / ml, tuy nhiên giữa chúng không có

sự khác biệt về mặt thống kê.

Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh bướu rễ trên cây hồ

tiêu

1.2.1. Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật

Tuyến trùng ký sinh thực vậy có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những

vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997). Tổn hại về

mặt kinh tế từ 40-50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn

công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry,

1997).

Vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng nên người

nông dân thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt hại

về cây trồng do tuyến trùng gây ra hậu quả cao đặc biệt vào mùa mưa, trong đó bao

11

Đồ án tốt nghiệp

gồm các loại cây thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua bị ảnh hưởng nhiều

nhất. Ở Việt Nam, sản lượng tiêu giảm đáng kể do tuyến trùng Meloidogyne spp.

gây ra bệnh sần rễ. Chúng phá hoại bộ rễ, tạo nhiều vết thương làm cho các loài vi

nấm, vi khuẩn có khả năng xâm nhập và gây bệnh dễ dàng hơn. Khi tuyến trùng gây

hại, cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém. Đặc biệt, khi quan sát

dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện, nếu bệnh quá nặng cây sẽ chết. Bệnh

sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây lá vàng mà còn cả những cây xanh tươi do

bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, rễ vẫn vận chuyển nước và khoáng chất được.

Tuyến trùng ký sinh trên hồ tiêu gồm tuyến trùng ngoại ký sinh và nội ký

sinh, chích hút dinh dưỡng từ rễ làm suy giảm sức khỏe của cây, gây tổn thương rễ,

ngăn cản sự hấp thu dinh dưỡng và nước, gây vàng lá cục bộ hoặc vàng toàn bộ cây,

gây héo tạm thời vào mùa khô khi thiếu nướcvà có nhiều u bướu rễ, vết thâm đen

tại bướu, hoặc bướu bị mục nát, có rất ít rễ non được hình thành. Hội chứng vàng lá

cây tiêu có liên quan đến mức độ rễ bị tổn thương do sự ký sinh của tuyến trùng.

Triệu chứng sưng rễ thường do tuyến trùng nội ký sinh gây ra, hoặc chỉ là vết thâm

nâu, nâu đen trên rễ do tuyến trùng ngoại ký sinh tạo ra.

Tuyến trùng luôn hiện diện trong vùng rễ hồ tiêu và tập trung nhiều từ độ sâu

5 đến 40 cm, vì rễ là nơi cung cấp dinh dưỡng cho tuyến trùng. Cây càng tốt, rễ hút

dinh dưỡng càng nhiều, tuyến trùng càng phát triển nhanh về số lượng. Mật độ

tuyến trùng trên một đơn vị khối lượng đất (50g, 100g) hoặc khối lượng rễ (1g, 5g),

số bướu trên đơn vị khối lượng đất hay khối lượng rễ (1g), số tuyến trùng cái trong

1 bướu rễ, là các chỉ tiêu dùng để đánh giá mức độ nhiễm tuyến trùng của đất trồng

và cây ký chủ. Vì vây, biện pháp kiểm soát số lượng tuyến trùng cần thực hiện vào

thời điểm cây hồ tiêu có tốc độ phát triển cao nhất và lúc tuyến trùng tập trung vào

vùng rễ nhiều nhất.

Tuyến trùng nhanh chóng tiếp cận và xâm nhiễm vào rễ non sau khi cây

được trồng và thiết lập quần thể với nhiều thế hệ cùng tồn tại. Tuy nhiên cơ cấu đất,

nguồn hữu cơ, vi sinh vật đối kháng hoặc ký sinh có ảnh hưởng đến số lượng tuyến

trùng. Tuyến trùng rễ cây hồ tiêu ít định cư ở tầng đât sâu hơn 60 cm, vì vậy kỹ

12

Đồ án tốt nghiệp

thuật trồng và chăm sóc cho hệ rễ phát triển theo chiều sâu sẽ giúp cây “thoát” sự

xâm nhiễm tuyến trùng.

Tuyến trùng phát tán theo nước mưa, nước tưới, động vật đi lại trong vườn,

cây giống nhiễm tuyến trùng, hoặc do con người đi lại vô tình mang đất nhiễm

tuyến trùng. Tàn dư rễ có tuyến trùng định cư, cây ký chủ, mảng trứng trong đất là

nơi lưu tồn nguồn tuyến trùng trên vườn hồ tiêu hằng năm.

Sự phát triển của bệnh trải qua 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: tuyến trùng mới xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, lúc này

rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều, rễ vẫn còn màu trắng.

- Giai đoạn 2: rễ bị đổi màu, chức năng vận chuyển nước và chất dinh

dưỡng bị ảnh hưởng. Rễ bị tổn thương và tạo cơ hội cho các vi sinh vật tấn công

gây nhiều bệnh khác cho cây.

- Giai đoạn 3: rễ bị đổi màu đen và chức năng vận chuyển đã không

còn.

Theo Trịnh Thị Thu Thủy và cộng sự (2007), có 29 loài tuyến trùng thuộc

các họ khác nhau có mặt trong vùng đất trồng tiêu của Việt Nam, phổ biến nhất là

chi Meloidogyne. Chúng hiện diện tương đối nhiều nơi trên thế giới, chúng ký sinh

bắt buộc với rễ của hàng ngàn loài thực vật.

Meloidogyne gồm hơn 60 loài, 4 loài gây hại chính là Meloidogyne javanica,

Meloidogyne arenaria, Meloidogyne incognita và Meloidogyne halpa. Chúng có

mặt ở 23 trong số 43 loài cây chính yếu, từ các cây lương thực, đồng cỏ đến các loài

cây cảnh.

Việc kiểm soát tuyến trùng sẽ rất khó khăn nếu chúng tấn công vào các loài

cây lâu năm vì các loài cây lâu năm có rễ ăn sâu vào đất.

Meloidogyne spp. được Neal phát hiện đầu tiên ở cây sắn vào năm 1889. Rễ

bị tuyến trùng xâm hại sẽ hấp thu nước và các khoáng chất yếu đi so với bình

thường, làm giảm sự tăng trưởng, chất lượng, năng suất cây trồng, từ đó kéo theo sự

suy giảm sức đề kháng của cây trồng với sự tác động của các yếu tố ngoại cảnh như

hạn hán, dịch bệnh,...

13

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2. Phân loại khoa học

Giới: Animalia

Ngành: Nematoda

Lớp: Secernentea

Bộ: Tylenchida

Họ: Heteroderidae

Loài: Meloidogyne

1.2.3. Đặc điểm sinh thái

Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne

spp. có đặc điểm sau:

Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn tới dạng quả lê, màu trắng, ít

vận động. Không có giai đoạn u nang. Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ

12–15 μm. Lỗ bài tiết nằm trước tới khoang giữa khối tròn, thường chỉ sau kim

chích. Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chất đặc sệt để bảo quản trứng, đẻ trứng ra

ngoài.

Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn và

tròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ. Có kinh chích nhỏ nhưng mảnh, dài

18–25 μm. Tuyến hầu chủ yếu nằm ở phần bụng đến ruột. Gai nhỏ và mảnh, thường

dài 25–33 μm, ống dẫn dài từ 7–11 μm. Có tinh hoàn duy nhất.

Ấu trùng: trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra trong một bọc

gelatin (còn gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ. Ấu trùng cảm nhiễm tuổi

2 (J2) có dạng cân đối hình giun, dài khoảng 0,4 – 0,5 mm. Kim chích và vùng đầu

kitin hóa yếu, đuôi hình chóp.

14

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.4. Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật

(Nguồn: thesoilhuggersjourney.wordpress.com)

1.2.4. Hình thức sinh sản

Tuyến trùng phần lớn sinh sản hữu tính là chủ yếu. Tỷ lệ đực, cái phụ thuộc

vào nhiều yếu tố. Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến quá trình sinh sản và phát

triển qua các giai đoạn từ tuyến trùng non lên tuyến trùng trưởng thành để phân giới

đực cái.

Tuyến trùng đẻ trứng là chủ yếu, trứng được hình thành trong cơ thể mẹ và

phát triển trong tế bào trứng. Một trứng đã thụ tinh là trứng có một nhân với các

nhiễm sắc thể, sau đó thực hiện quá trình phân chia nhân tế bào.Trứng sau khi thụ

tinh, một số phát triển trong vỏ trứng, vỏ cơ thể mẹ chuyển thành nang và tuyến

trùng non phát triển trong đó, sau đó chui ra ngoài ở tuổi 2 trong điều kiện ngoại

cảnh phù hợp.

1.2.5. Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp.

Con cái đẻ trứng trong một khối chất đặc sệt chứa chất nền glycoprotein,

được tiết bởi bởi sáu tuyến lớn trong ruột thông qua hậu môn (Sharon và Spiegel,

1993). Các khối trứng thường được tìm thấy trên bề mặt của sần rễ, đôi khi các bọc

trứng này có thể nằm trong sần rễ. Khối trứng ban đầu mềm, dính và trong vắt như

pha lê nhưng lúc sau lại cứng và có màu nâu xẫm.

15

Đồ án tốt nghiệp

Sau quá trình phát triển phôi thai, lần lột xác thứ nhất xảy ra bên trong trứng

và phát triển thành ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm (J2). J2 dễ bị tổn thương, do đó

chúng cần xâm nhiễm và định cư vào kí chủ càng nhanh càng tốt. Ấu trùng J2 có

thể xâm nhập vào rễ ngay cạnh nốt sần hoặc có thể xâm nhập vào rễ mới, ở đó

chúng tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, tiết các hợp chất (ascorbic acid,

gibberellin hay glutamic acid) và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương (Bird và Loveys,

1975).

Sau khi J2 xâm nhập, đỉnh rễ phình ra và sự phát triển của rễ dừng lại trong

một thời gian ngắn. Tuyến trùng hút dinh dưỡng tại các tế bào mô mạch của rễ, tiết

men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hình thành

các điểm dinh dưỡng của tuyến trùng (vùng dinh dưỡng này gồm 5–6 tế bào khổng

lồ). Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng

ký sinh cũng phình to tạo ra các bướu rễ.

Sau khi xâm nhập vào rễ, J2 cũng nhanh chóng thay đổi về hình thái: cơ thể

phình ra và các cơ quan cũng dần phát triển. Quá trình phát triển của tuyến trùng

trong rễ từ J2 trải qua 3 lần lột xác và đạt đến trưởng thành. Lần lột xác cuối cùng là

sự biến thái thật sự đối với con đực, từ dạng cuộn gấp khúc trong J2 chúng được nở

ra và có dạng hình giun, trong khi con cái có dạng hình tròn như quả lê hay quả

chanh.

16

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.5. Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp.

(Nguồn: extension.umn.edu)

1.2.6. Cơ chế xâm nhiễm của tuyến trùng Meloidogyne sp. lên rễ cây

Khi chuẩn bị xâm nhập vào rễ, J2 tập trung dọc theo các tế bào non gần hay

ngay tại vùng dính rễ. J2 thường tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, nơi các

rễ bên mọc ra tạo nan điểm xâm nhập cho các J2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn

thương. Khi J2 tiếp xúc với bề mặt rễ, chúng thường dùng kim chích và xâm nhập

ngay vào trong rễ. Sự xâm nhập của chúng có thể xảy ra ở bất kỳ phía nào của rễ.

Sau khi xâm nhập vào trong rễ, tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ làm cho

các tế bào bị tách dọc ra, sau đó tuyến trùng định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ

và bắt đầu quá trình hấp thu dinh dưỡng. Khi hút dinh dưỡng, tuyến trùng cắm phần

đầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh

hóa của mô rễ thay đổi và hình thành các vùng dinh dưỡng cho tuyến trùng. Vùng

này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào có nhiều nhân) được tại thành trong vùng nhu

mô hoặc vùng mô libe. Tế bào khổng lồ phát triển từ một tế bào ban đầu duy nhất.

Các tế bào khổng lồ thường chứa nhiều nhân (có thể lê đến 80 nhân trong mỗi tế

17

Đồ án tốt nghiệp

bào) và các nhân bên trong tế bào khổng lồ thường là đa bội (Huang và Maggenti,

1969; Wiggers và công sự, 1990). Đây là sự thích nghi chuyên hóa cao của tế bào

được tạo ra và duy trì do tuyến trùng ký sinh. Cùng với sự hình thành tế bào khổng

lồ, các mô rễ xung qunah nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to ra tạo thành sần rễ.

Sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi tuyến trùng xâm nhập.

Kích thước của nốt sần liên quan đến cây chủ, số lượng J2 xâm nhập và loài tuyến

trùng ký sinh.

Khi tế bào khổng lồ được hình thành, tuyến trùng J2 trở nên ít vận động và

lớn dần, hình thành dạng “xúc xích”. Dưới những điều kiện thuận lợi, J2 sẽ biến

thái thành ấu trùng tuổi 3 (J3) sau 14 ngày, sau đó đến giai đoạn ấu trùng tuổi 4

(J4), và cuối cùng đến giai đoạn trưởng thành. Tổng cộng thời gian ấu trùng ở giai

đoạn tuổi 3 và 4 là ngắn hơn so với giai đoạn ấu trùng tuổi 2 hoặc tươnrg thành,

thường là từ 4-6 ngày. J3 và J4 thiếu kiêm chích và do đó không hút thức ăn được.

Con đực, khi đã được hình thành, giống hình con giun và không có bằng chứng nào

cho thấy chúng hút chất dinh dưỡng. Các con đực có thể được tìm thấy nhiều trong

các loài có khả năng di chuyển không giao hợp khi các điều kiện không thuận lợi

cho sự phát triển của con cái, như khi mật độ tuyến trùng quá cao và có sự giới hạn

về nguồn thức ăn (Perry và Starr, 2009).

1.2.7. Một số biện pháp phòng trừ

Ở Việt Nam, việc kiểm soát tuyến trùng chủ yếu dựa vào các phương pháp

vật lý (cày ải, luân canh cây trồng,.. ) hay hóa học. Hoạt chất sinh học được nghiên

cứu nhiều nhất có thể phòng trừ tuyến trùng là chitosan và azzadiractin được chiết

xuất từ cây neem (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 1996). Có rất ít

nghiên cứu sử dụng vi sinh vật (nấm, vi khuẩn) để kiểm soát tuyến trùng hại thực

vật. Gần đây, viện sinh học nhiệt đới đã sử dụng phân ủ có chứ T. harzianum và

bánh dầu neem để phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên tiêu và cho thấy sự giảm mật độ

tuyến trùng từ 2-4 lần so với đối chứng (Dương Đức Hiếu và cộng sự, 2010).

Từ những năm 1970 trở lại đây các loại thuốc hóa học khác nhau đã được sử

dụng rộng rãi để phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật như các loại thuốc xông

18

Đồ án tốt nghiệp

hơi, các loại thuốc không xông hơi. Tuy nhiên biện pháp này lại gây hậu quả xấu

đến môi trường và sức khỏe cộng đồng, đặc biệt thuốc hóa học cũng làm cho nhiều

loại tuyến trùng trở nên kháng thuốc. Do đó cũng chỉ nên dùng thuốc hóa học trong

trường hợp cần thiết và phải sử dụng chúng một cách hợp lý. Đưa thuốc vào độ sâu

35 – 40 cm đã cày bừa kỹ, ẩm độ 75 % và nhiệt độ phải phù hợp trong thời điểm

cần xử lý với từng loại thuốc. Dùng thuốc vào đúng giai đoạn mẫn cảm nhất của

tuyến trùng, có thể thực hiện trước khi trồng, sau khi thu hoạch và trong bảo quản.

Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp.

trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng

Nấm gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng là một tác nhân sinh học quan

trọng trong việc khống chế tuyến trùng và tuyến trùng gây hại. Vai trò trấn áp

những trận dịch lớn do tuyến trùng gây hại của các chủng nấm ký sinh được trình

bày rất rõ trong nhiều công trình của các tác giả trên thế giới: V.P. Paspelop (1932-

1940), Dusky S.R. (1959), Tanada I. (1959 -1964), Hall I. M. (1964)…(dẫn theo

Nguyễn Ngọc Tú, 1997). Đây là một nhân tố hữu dụng trong hệ thống quản lý sâu

hại tổng hợp IPM (Gillespie; Rombach và CS., 1986). Trên thế giới, việc sử dụng

nấm ký sinh gây bệnh để phòng trừ sinh học đối với các loài tuyến trùng và tuyến

trùng đã được quan tâm nghiên cứu từ đầu thế kỷ 19. Nhiều loài nấm có khả năng

nhiễm và tiêu diệt trứng tuyến trùng. Hầu hết các loài nấm này có cơ chế hoạt động

là hoại sinh và xâm nhập vào trứng gây chết. Các loài nấm ký sinh trứng tuyến

trùng bao gồm Paecilomyces, Pochonia và Verticilium. Paecilomyces lilacinus và

Pochonia chlamydosporiaare cho hiệu quả ký sinh trứng tuyến trùng tốt nhất.

Paecilomyces lilacinus được chứng minh kiểm soát thành công tuyến trùng sần rễ,

M. javanica và M. incognita trên cà chua, cà tím và các loài rau khác (Cayrol et al,

1989; Verdejo – Lucas et al, 2003; Goswami và Mittal, 2004; Van Damme et al,

2005; Goswami et al., 2006; Haseeb và Kumar, 2006). Huma Abbas , Nazir Javed ,

Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran , Muhammad Atiq (2016) thực hiện

nghiên cứu sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên

cây cà tím. Thí nghiệm này được thực hiện trong điều kiện nhà lưới vào 7 ngày đã

19

Đồ án tốt nghiệp

chứng minh được rằng, Paecilomyces lilacinus có khả năng làm giảm số lượng lớn

tuyến trùng và có khả năng thay thế cho các loài thuốc hóa học phòng trừ tuyến

trùng.

Trong những thập kỷ 60 đến 80 của thể kỷ trước, việc nghiên cứu nuôi cấy

các nấm ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng hại đã được phát triển rất

mạnh mẽ nhưng chủ yếu là nấm Metarhizium và Beauveria. Trong đó phải kể đến

các công trình nghiên cứu của Muller Cogler E. (1961), Hall I. M. (1963- 1964),

Camera J. W., Mac Bain (1963- 1967), Madelin M. F. (1965- 1966), Ignoffo C. M.

(1977), H.D Burges và CS. (1982), N. K. Maniania và CS. (1984) (theo Nguyễn

Ngọc Tú và CS.,1997), Ferron P. (1978). Các công trình đã tập trung nghiên cứu rất

tỷ mỷ về phương pháp để nhân giống, các môi trường dinh dưỡng, các thiết bị nuôi

cấy, phương pháp thu bào tử từ sinh khối nấm, tạo chế phẩm sinh học và sử dụng

chúng để phòng trừ sâu hại và tuyến trùng trên đồng ruộng.

Trong những năm gần đây, một số các công trình nghiên cứu sản xuất và ứng

dụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm kí sinh tuyến trùng. Các chế phẩm sinh

học từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việc phòng chống sâu

hại cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người (Noris và CS.,

2002). Alamgir Khan, Kleith L. Williams, Helena K.M. Nevalainen (2004) thực

hiện nghiên cứu về ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase từ nấm

Paecilomyces lilacinus trên cấu trúc vỏ và sự nở của tuyến trùng Meloidogyne

javanica. Một serine protease và một enzyme được chuẩn bị từ 6 chitinase, được

tách chiết và tinh sạch từ môi trường nuôi cấy lỏng chủng nấm Paecilomyces

lilacinus 251, tấn công vào các trứng tuyến trùng Meloidogyne javanica để nghiên

cứu hiệu quả của các loại enzyme đến cấu trúc vỏ trứng. Quan sát bằng kính hiển vi

điện tử chứng minh rằng enzyme protease và chitinase đã làm thay đổi lớn cấu trúc

của vỏ trứng khi chúng tấn công riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau. Dưới tác động

protease lên vỏ trứng, lớp lipid biến mất và lớp chitin mỏng hơn. Khi sử dụng

chitinase có lớp không bào lớn, lớp viteline bị chia ra và mất đi tính toàn vẹn của

nó. Những thay đổi lớn trên lớp vỏ trứng xảy ra do ảnh hưởng khi kết hợp enzyme

20

Đồ án tốt nghiệp

protease và chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. Lớp chitin bị thủy phân và

lớp vitelline mất đi tính vẹn toàn. Hiệu lực của enzyme chitinase và protease từ nấm

Paecilomyces lilacinus khi sử dụng riêng rẻ hoặc kết hợp cũng cho kết quả làm

giảm sự nở của con cái tuyến trùng M. javanica. Nghiên cứu chỉ ra rằng một số

tuyến trùng đã nở khi được tiếp xúc với enzyme của nấm sẽ có sự hiện diện của

enzyme chitinase từ nấm Paecilomyces lilacinus giữ lại hoạt động của chúng dưới

sự hiện diện của protease nội sinh.

Mendoza A. R., R. A. Sikora, và S. Kiewnick. (2007) đã thực hiện nghiên

cứu về sự ảnh hưởng của Paecilomyces lilacinus chủng 251 lên kiểm soát sinh học

tuyến trùng Radopholus similis ở cây chuối. Khả năng nâng cao hiệu quả diệt tuyến

trùng của chủng nấm đã được chứng minh. Sự tương quan đáng kể giữa liều dùng

và nồng độ để kiềm hãm R. similis đã được xác định. Ở nồng độ 6 × 106 cfu /g đất

khô được xem là liều dùng tối ưu của P. lilacinus. Tác giả chứng minh rằng P.

lilacinus là tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả chống lại R. similis và cũng là

nhân tố quan trọng trong việc kiểm soát tuyến trùng trên cây chuối.

Năm 2006, M. Nasr Esfahani và B. Ansari Pour nghiên cứu hiệu quả của

nấm Paecilomyces lilacinus trong kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne Javanica và

ảnh hưởng của nấm đến sự phát triển của cây cà chua trong điều kiện nhà kính. Kết

quả chứng minh rằng P. lilacinus cải thiện sự phát triển cây trồng và làm giảm đáng

kể số lượng tuyến trùng và trứng tuyến trùng khi bị nhiễm M. Javanica như tác

nhân gây bệnh làm rễ sần to. Nấm sẽ đạt hiệu quả cao nhất khi nấm và tuyến trùng

được nhiễm đồng thời hoặc nấm được nhiễm trước và tuyến trùng nhiễm sau. Tuyến

trùng đã trưởng thành bị tấn công hoặc bị chết đều có sự hiện diện của sợi nấm trên

cơ thể chúng. Cheu Guan Pau và cộng sự (2012) đã phân lập được 10 chủng nấm

Paecilomyces lilacinus từ đất vườn trồng 2 loại tiêu đen ở Sarawark có thể phòng

trừ tuyến trùng gây sần rễ. Sau quá trình nghiên cứu, thí nghiệm đã chỉ ra rằng cả 10

chủng nấm nêu trên đều có khả năng phòng trừ tuyến trùng với mật độ bào tử 105

bào tử / ml.

21

Đồ án tốt nghiệp

Hiện nay, có rất nhiều nơi trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm

từ nấm Paecilomyces spp. vào trong thực tiễn đời sống. Một số sản phẩm phòng trừ

tuyến trùng đã được thương mại hóa như nemaxxion biol do công ty

Greencorp,2014 sản xuất lên men lỏng, bao gồm các loại vi khuẩn và nấm (Bacillus

subtilis, Trichoderma spp. và Paecilomyces spp.) hay REM G cũng là một sản phẩm

phòng trừ tuyến trùng bao gồm các chủng nấm Arthrobotrys spp., Mycorrhia

(Glomus spp.), Dactyllela spp., Paecilomyces spp., và các loại vi khuẩn (B. spp) và

(Pseudomonas spp.), sản phẩm được bổ sung enzyme chitinolytic, protease và

enzyme lipolytic nhằm phá vỏ thành tế bào của tuyến trùng. Các sản phẩm này có

hiệu lực cao trên cây cà chua ở vùng Souss – Massa Draa ở Morocco.

Hình 1.6. Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. phòng trừ tuyến trùng.

Các nghiên cứu trong nước về nhân nuôi và sử dụng Paecilomyces sp.

trong phòng trừ tuyến trùng hại cây

Ở Việt Nam, kiểm soát tuyến trùng chủ yếu dựa vào các phương pháp vật lý

(cày ải, luân canh cây trồng,...) hay hóa học. Hoạt chất sinh học được nghiên cứu

nhiều nhất để phòng trừ tuyến trùng là chitosan và azadiractin được chiết xuất từ

cây neem (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 1996). Có rất ít nghiên cứu sử

dụng vi sinh vậy (vi nấm, vi khuẩn) để kiểm soát tuyến trùng hại thực vật. Gần đây,

Viện sinh học nhiệt đới đã sử dụng phân ủ chứa T. harzianum và bánh dầu neem để

22

Đồ án tốt nghiệp

phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên tiêu và cho thấy có sự giảm mật độ tuyến trùng từ

2 – 4 lần so với đối chứng (Dương Đức Hiểu và cộng sự, 2010).

Trần Thị Tho và cộng sự (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh

dưỡng đến sự phát triển của nấm tím Paecilomyces javanicus; khả năng hình thành

bào tử của các chủng nấm P. javanicus và ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ nấm

đến sự phát triển của nấm này. Kết quả cho thấy môi trường có bổ sung pepton và

cao nấm men là môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm P.

javanicus. Sau 14 ngày nuôi cấy nấm P. javanicus cho mật số bào tử 108 cfu / cm2.

Nghiên cứu do nhóm tác giả Lê Thị Mai Linh, Nguyễn Thị Duyên, Trịnh Quang

Pháp, Nguyễn Thị Phương Anh, Phạm Văn Ty ( Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh

vật, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường Đại học Khoa học

tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) thực hiện nghiên cứu khả năng ức chế tuyến

trùng Meloidogyne Incognita trên cà phê của nấm Paecilomyces Javanicus. Kết quả

nghiên cứu cho thấy dịch nuôi cây nấm P. javannicus với nồng độ 5, 10, 20% có

ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng nở trứng và gây chết đối với tuyến trùng M.

incognita. Với nồng độ 20% dịch nuôi cấy nấm tương ứng với 106 bào tử / ml thì

hiệu lực là cao nhất, có thể ức chế nở trứng đến 96% và khả năng gây chết cao nhất

đối với ấu trùng M. incognita là 75% so với đối chứng. Do vậy, nguồn nấm P.

javannicus có khả năng được phát triển trong phòng trừ sinh học đối với tuyến trùng

M. incognita trên đồng ruộng.

23

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ ngày đến ngày tại phòng thí nghiệm trường Đại học

Công nghệ Tp.HCM.

Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất

2.2.1. Vật liệu nghiên cứu

Chủng nấm Paecilomyces sp. được phân lập bởi Phùng lê Kim Yến (2014)

tại phòng thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM.

Chủng nấm Trichoderma sp. được phân lập bởi Lê Nhật Đăng (2015) tại

phòng thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM.

Mẫu rễ tiêu nghi nhiễm tuyến trùng thu nhận tại vườn tiêu thuộc tỉnh Bình

Phước.

2.2.2. Thiết bị

Nồi hấp khử trùng

Que cấy trang

Đèn cồn

Ống nghiệm

Kính hiển vi quang học

Dao cấy

Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm

Đĩa Petri

Micropipet

Erlen

Máy đo quang

Bếp từ

Cốc thủy tinh

Máy đo pH

Hóa chất

24

Đồ án tốt nghiệp

2.2.3. Các loại môi trường sử dụng

2.2.3.2. Môi trường PDA (Potato D-glucose Agar)

D-glucose 20g

Agar 20g

Khoai tây 200g

Nước cất 1000ml

2.2.3.3. Môi trường CDB (Czapeck-Dox)

Saccharose 40g

NaNO3 3g

MgSO4.7H2O 0,5g

K2HPO4 1g

Khoai tây 200g

Nước 1000ml

2.2.3.3. Môi trường CMB (Complete Media)

KH2PO4 0,4g

MgSO4 1g

KCl 1 g

Na2HPO4 1,4 g

NH4NO3 0,7 g

Glucose 10 g

Yeast extract 5 g

Nước cất 1000ml

2.2.3.4. Môi trường SDAY1 (Sabourand dextrose Yeast)

Glucose 40g

Pepton 10g

Yeast extract 2g

Nước cất 1000ml

2.2.3.5. Môi trường SDAY3 (Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng)

NaNO3 2g

25

Đồ án tốt nghiệp

KH2PO4 1g

MgSO4.7H2O 0,5g

Glucose 40g

Pepton 10g

Yeast extract 2g

Phương pháp nghiên cứu

Ống giống (Phòng thí nghiệm trường ĐH Công nghệ Tp. HCM)

Lây nghiễm

Tuyến trùng cái

Phân lập (từ tuyến trùng bị chết)

Làm thuần Giữ giống Bảo quản

Nhân giống

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp.

Trong phòng thí nghiệm.

Chọn môi trường nhân sinh khối tốt nhất

Thử nghiệm hiệu lực diệt tuyến trùng. Trên đồng ruộng

Hình 2. 1. Sơ đồ nghiên cứu

26

Đồ án tốt nghiệp

2.3.1. Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp.

❖ Phương pháp lây nhiễm vi nấm với tuyến trùng

Chuẩn bị môi trường WA có bổ sung 0,1 g / l chloramphenicol, hấp khử

trùng rồi phân phối đều ra các đĩa Petri vô trùng. Cấy nấm vào giữa đĩa Petri môi

trường, dùng kim hút đặt 8 tuyến trùng cái (trứng) xung quanh vị trí cấy nấm, cách

tâm đĩa 2cm. Đặt đĩa Petri trong tủ ủ với nhiệt độ 25 ± 2 0C. Theo dõi sự xâm nhiễm

của nấm vào cơ thể tuyến trùng sau 2, 4, 6, 8, 10, 12 ngày cấy nấm (Khan và cộng

sự, 2009).

❖ Phân lập lại: tiến hành thu con cái tuyến trùng chết trong đĩa nấm nghi

nhiễm Paecilomyces sp. Dùng đũa thủy tinh vô trùng nghiền mẫu với 10 ml nước

cất vô trùng. Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6.

Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-6 và tiến hành trãi

đĩa trên môi trường PDA.

❖ Làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử

Chuẩn bị đĩa petri có chứa sẵn 1 lớp mỏng môi trường thạch nước cất WA.

Tạo dung dịch bào tử bằng cách dùng que cấy đã khử trùng lấy bào tử từ ổ bào tử

(chú ý không lấy quá nhiều bào tử) khoảng 1 - 10 bào tử trên quang trường vật kín

x10. Hòa bào tử vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng. Lắc đều tay để bào

tử hòa loãng đều trong ống nghiệm trong vòng 15 – 20 phút. Đổ dịch bào tử vào đĩa

petri có chứa 1 lớp mỏng môi trường thạch nước cất và tráng qua toàn bộ đĩa rồi lắc

nhẹ cho dịch tràn đều trên toàn bộ bề mặt môi trường trong thời gian từ 30 giây đến

1 phút. Trút bỏ toàn bộ dung dịch trong đĩa môi trường. Dán đĩa bằng paraffin và

đặt đĩa môi tường nghiêng khoảng 30 – 400 cho ráo nước trong điều kiện tối từ 18 –

20 giờ. Quan sát đĩa môi trường dưới kính lúp để tìm bào tử nẩy mầm. Dùng que

cấy dẹt, sắt để cắt xung quanh bào tử (cắt toàn bộ môi trường phía dưới của bào tử)

và chuyển miếng thạch có bào tử đó sang đĩa môi trường mới. Ủ đĩa trong điều kiện

phòng thí nghiệm và quan sát hình thái tản nấm sau 2 ngày.

27

Đồ án tốt nghiệp

2.3.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường PDA tiến hành hấp khử trùng.

Sau khi hấp khử trùng xong để nghiêng một góc 45 0C các ống thạch này trên giá

gỗ.

Tiến hành cấy truyền giữ giống nấm trên bề mặt thạch nghiêng. Sau đó bảo

quản các ống giống này trong điều kiện lạnh. (3 – 5 0C)

2.3.3. Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật

2.3.3.1. Phương pháp đổ/trải đĩa đếm khuẩn lạc

❖ Chuẩn bị đĩa petri vô trùng

Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng và được bảo quản mát ở 45 0C

trong bể điều nhiệt. Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ thích hợp). Đổ vào

đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc đều. Để nguội môi trường và đem ủ.

❖ Đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường

Thường chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 30 –300. •

Dùng bút để đếm các khuẩn lạc đã đếm. •

Tính toán kết quả (dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để •

tính ra số khuẩn lạc vsv trong dung dịch ban đầu).

2.3.3.2. Phương pháp đếm trực tiếp tế bào trong buồng đếm hồng cầu

Phương pháp này thường áp dụng để đếm tế bào nấm men hoặc bào tử nấm

mốc.

❖ Chuẩn bị nước muối sinh lý và 0,1% Tween 80.

❖ Chuyển khoảng 10ml nước muối sinh lý này sang đĩa petri chứa bào

tử (đường kính 9 cm), dùng que cấy vòng cào bào tử trên bề mặt đĩa, chuyển bào tử

sang bình định mức 100 ml bằng pipet Pastuer, lặp lại các bước này tối thiểu ba lần

bảo đảm chuyển hết bào tử sang bình định mức 100 ml.

❖ Lắc đều, pha loãng đến nồng độ 10-1, 10-2,... (sao cho mỗi ô nhỏ chứa

5-10 tế bào)

❖ Đếm trong buồng đếm hồng cầu.

❖ Đậy buồng đếm bằng một phiến kính mỏng.

28

Đồ án tốt nghiệp

❖ Nhẹ nhàng dùng đầu pipet (chứa 1 giọt huyền phù vi sinh vật), đặt vào

cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng). Dịch huyền phù sẽ đi vào

buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có cùng

không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được phủ bởi dịch huyền phù tế bào,

còn các rãnh chung quanh thì không bị dính ướt.

❖ Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các

khoang. Khi đó, dịch nằm trong khoang có độ dày khoảng 0,1 mm.

❖ Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x4 để tìm buồng

đếm. Chỉnh thật rõ, sau đó chuyển qua vât kính x10 hoặc x40 để đếm.

❖ Điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa sập để có thể quan sát rõ ràng

cả tế bào lẫn các đường kẻ. Tùy vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm tất cả

các tế bào có trong ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong một số ô vuông lớn

đại diện. Đếm bào tử trong vùng có chữ W (vùng đếm bạch cầu).

❖ Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3-5 phút; phải đếm các tế

bào nằm trên 2 đường kẻ kề nhau được chọn của từng ô.

𝐵 1𝑚𝑚2.0,1 𝑚𝑚

• Mật độ bào tử trong mẫu là: Bào tử / 1mm3 = = 𝐵 10

Bào tử / 1ml = B.1000.10 (B là số bào tử

trung bình đếm được)

• Số bào tử trong dung dịch gốc:

Bào tử / ml = B.1000.10.F (F là hệ số pha loãng)

• Số bào tử trên 1 đĩa Petri 9 cm = B.104.F

2.3.4. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm,

2014)

❖ Trứng và con cái Meloidogyne spp. được tách ra từ rễ cây hồ tiêu thu

được ở tỉnh Bình Phước. Mẫu rễ lấy về được rửa sạch dưới vòi nước chảy, để khô tự

nhiên, cân khối lượng và đánh giá mức độ nguy hại trước khi tách tuyế trùng. Các

cấp đô nguy hại của rễ được đánh giá dựa vào sự hiện diện của các nốt sần.

❖ Mẫu rễ lấy về được rửa sạch dưới vòi nước chảy, để trên giấy thấm

khô tự nhiên. Sau đó, dùng dao cấy nhọn tách từ từ phần rễ dưới ánh đèn sáng và

29

Đồ án tốt nghiệp

bắt con cái, túi trứng trong nốt sần. Con cái có màu trắng đục, hình quả lê, kích

thước tùy vào con to nhỏ khác nhau, thường dài khoảng 600 - 700 nm, rộng 400 -

500 nm. Túi trứng có màu hơi vàng nâu, hình bầu dục với kích thước tương đương

với kích thước con cái.

2.3.5. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các loại môi

trường nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009)

❖ Thí nghiệm được bố trí như sau

 NT1: môi trường Czapeck- Dox

 NT2: môi trường CMB

 NT3: môi trường SDAY1

 NT4: môi trường SDAY3

❖ Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng

với 4 loại môi trường CDB, CMB, SDAY1, SDAY3 và 3 lần lặp lại. Mỗi đơn vị thí

nghiệm tương ứng với 1 bình tam giác 500ml (chứa 250ml môi trường thử nghiệm).

0C trong 15 phút. Ở mỗi bình tam giác, chủng 25 ml huyền phù bào tử nấm có mật

Các bình tam giác chứa môi trường này đã được thanh trùng bằng autoclave ở 121

số 4,72.106 bào tử / ml. Các đơn vị thí nghiệm (bình chứa môi trường) được đặt trên

máy lắc tốc độ 120 vòng / phút ở nhiệt độ phòng, thời gian 12 giờ sáng / 12 giờ tối.

❖ Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng bào tử quan sát và đếm được vào các thời

điểm: 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc cho tất cả các thí nghiệm. Ở mỗi thời

điểm, tiến hành pha loãng dung dịch huyền phù bào tử nấm trong mỗi bình môi

trường. Đếm mật số bào tử / ml cho từng nghiệm thức.

2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của

nấm Paecilomyces sp.

30

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm

Nghiệm thức Khối lượng Cơ chất

Lúa 100g NT1

Gạo Tấm 100g NT2

Cám trấu 100g NT3

Ngô mảnh 100g NT4

Cấy giống có mật độ 9,44 x 106 bào tử / ml. Bố trí thí nghiệm hoàn toàn

ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại môi trường cám, gạo tấm, lúa,

ngô mảnh và 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được thực hiện trên chai thủy tinh.

❖ Chỉ tiêu đánh giá:

Số lượng bào tử quan sát và đếm được vào thời điểm 14 ngày sau khi lắc. Ở

thời điểm 14 ngày, tiến hành pha loãng dung dịch huyền phù bào tử nấm trong mỗi

bình môi trường theo nồng độ 10-7 10-8 10-9. Đếm mật số bào tử / ml cho từng

nghiệm thức.

Số liệu mật số bào tử / ml được đổi sang logarit thập phân để xử lý trên phần

mềm SAS và excel.

2.3.7. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm

Paecilomyces sp.

2.3.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của các loài thuốc trừ sâu đến sự phát triển của nấm

Paecilomyces sp.

31

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2. 2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu

Nghiệm thức Thuốc trừ nấm Liều lượng Hoạt chất

NT 1 Đối chứng Nước cất -

NT 2 Sherpa 25EC Cypermethrin 0,125%

NT 3 Plutel 1,8 EC Abamectin 1,8% 0,75%

NT 4 Oshin 20WP Dinotefuran 0,6%

NT 5 Actara 25WG Thiamethoxam 0,6%

❖ Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm và môi trường nuôi cấy

Nguồn nấm Paecilomyces: Chủng Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên môi

trường PDA và ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Môi trường nuôi cấy: Mỗi chai

môi trường PDA sau khi được hấp khử trùng ở 121 0C, 1 atm trong 15 phút sẽ được

để nguội đến 50 0C rồi bổ sung từng loại thuốc bảo vệ thực vật (ứng với từng

nghiệm thức) theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất.

❖ Tiến hành nuôi cấy: Đổ đĩa và để nguội cho đến khi môi trường đông

lại trong đĩa petri rồi dùng khoanh thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng

thạch có chứa nấm Paecilomyces sp. từ đĩa nấm đã chuẩn bị và đặt vào vị trí tâm đĩa

môi trường vừa chuẩn bị xong. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1

đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng.

❖ Các chỉ tiêu theo dõi:

• Đo đường kính khuẩn lạc (cm) trong 3, 5 và 7 ngày sau cấy

• Tỷ lệ (%) ức chế được tính theo công thức:

x100 U = 𝐷−𝑋 𝐷

Trong đó:

• U: % khuẩn lạc bị ức chế.

• D: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng.

• X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc.

Chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ

(Hassan, 1989):

32

Đồ án tốt nghiệp

 Cấp 1: không ảnh hưởng (<50% )

 Cấp 2: ảnh hưởng yếu (50 – 79%)

 Cấp 3: ảnh hưởng vừa (80 – 90%)

 Cấp 4: ảnh hưởng cao (>90%)

2.3.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm

Paecilomyces sp.

Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm

Nghiệm thức Thuốc trừ sâu Liều lượng Hoạt chất

Đối chứng Nước cất - NT1

Saizole 5SC Hexaconazole 0,2% NT2

Carbenzim 500FL Carbendazim 0,2% NT3

Antracol propineb 2,5% NT4

Cup 2,9SL Nano đồng 0,25% NT5

❖ Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm và môi trường nuôi cấy

Chủng Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ

phòng trong 14 ngày.

Môi trường nuôi cấy: Mỗi chai môi trường PDA sau khi được hấp khử trùng

ở 121 0C, 1atm trong 15 phút được để nguội đến 50 0C rồi bổ sung từng loại thuốc

bảo vệ thực vật (ứng với từng nghiệm thức) theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản

xuất.

❖ Tiến hành nuôi cấy: Đổ đĩa và để nguội cho đến khi môi trường đông

lại trong đĩa petri rồi dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng

thạch có chứa nấm Paecilomyces sp. từ đĩa nấm đã chuẩn bị và đặt vào vị trí tâm đĩa

môi trường vừa chuẩn bị xong. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1

đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phòng.

❖ Các chỉ tiêu theo dõi:

• Đường kính khuẩn lạc (cm)

• Tỷ lệ ức chế:

33

Đồ án tốt nghiệp

x100 U = 𝐷−𝑋 𝐷

Trong đó:

• U: % khuẩn lạc bị ức chế.

• D: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng.

• X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc.

❖ Chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ

(Hassan, 1989):

 Cấp 1: không ảnh hưởng (<50% )

 Cấp 2: ảnh hưởng yếu (50 – 79%)

 Cấp 3: ảnh hưởng vừa (80 – 90%)

 Cấp 4: ảnh hưởng cao (>90%)

2.3.7.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. và nấm

Trichoderma sp.

❖ Chuẩn bị: Chủng Trichoderma sp. được nuôi cấy trong môi trường

PDA sau 7 ngày và chủng Paecilomyces sp. được nuôi cấy trong môi trường PDA

sau 14 ngày được cấy truyền để quan sát khả năng đồng sinh trưởng. Môi trường

PDA được hấp khử trùng ở 121 0C, 1 atm trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng,

nhiệt độ môi trường giảm xuống còn 50 – 60 0C, rót 20 ml môi trường vào các đĩa

petri đã hấp khử trùng, đặt đĩa trên mặt phẳng cho đến khi thạch đông hoàn toàn.

❖ Tiến hành: Đĩa đối chứng dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5

mm đục một miếng thạch trên có nấm Paecilomyces sp. Dùng dao cất chuyển miếng

thạch đặt cách mép đĩa petri 1 cm. Đĩa đối kháng dùng khoan thạch hình trụ, đường

kính 5 mm đục một miếng thạch trên đĩa môi trường PDA có nấm Paecilomyces sp.

Dùng dao cấy chuyển miếng thạch này đặt vào đĩa môi trường mới (đặt cách mép

đĩa 1 cm). Sau đó, dùng một khoan thạch khác đục một miếng thạch của nấm

Trichoderma sp. đặt vào vị trí đối xứng qua tâm đường kính đĩa thạch (đặt cách

mép đĩa 1 cm giống như cách đặt nấm Paecilomyces sp.) Các thao tác trên đều được

tiến hành trong tủ cấy vi sinh dưới ngon lửa đèn cồn. Nuôi ủ các đĩa ở nhiệt độ

phòng, điều kiện ánh sáng 12 giờ sáng / 12 giờ tối. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

34

Đồ án tốt nghiệp

Sau 3, 5 và 7 ngày, tiến hành đo đường kính khuẩn lạc của các tản nấm ở hai đĩa và

tính tỷ lệ phần trăm ức chế của hai loại nấm.

Bảng 2. 4. Bố trí thí nghiệm khả năng đồng sinh trưởng của Trichoderma

sp. và Paecilomyces sp.

Nghiệm thức Bố trí thí nghiệm Lặp lại

Nghiệm thức 1 Đối chứng Paecilomyces sp. 3

Nghiệm thức 2 Trichoderma sp. + Paecilomyces sp. 3

❖ Chỉ tiêu theo dõi: quan sát hình thái của cả ai chủng nấm sau 3, 5, 7

ngày nuôi cấy. Ở mỗi thời điểm, tiến hành đo đường kính tản nấm của hai loại nấm

Trichoderma sp., Paecilomyces sp. và tỷ lệ ức chế sự phát triển được tính theo công

thức (Fokkema, 1973)

𝑥 100 X= 𝑅1−𝑅2 𝑅1

Trong đó:

• X là phần trăm ức chế;

• R1 là đường kính khuẩn lạc nấm bệnh phát triển trong đĩa đối chứng

khi không có chủng đối kháng (mm);

• R2 là đường kính khuẩn lạc nấm phát triển trong đĩa đối kháng khi có

chủng đối kháng (mm);

Mức độ ức chế sự phát triển được phân thành 4 cấp độ và đánh giá mức độ

ức chế (Nguyễn Thị Thuần và cộng sự, 1996; Trần Kim Loang và cộng sự, 2009):

• Cấp độ 1: ức chế cao: nấm Trichoderma ức chế trên 60 %;

• Cấp độ 2: đối kháng trung bình: nấm Trichoderma ức chế bệnh từ 40

đến 59 %;

• Cấp độ 3: đối kháng yếu: nấm Trichoderma ức chế từ 20 đến 40 %;

• Cấp độ 4: không đối kháng: nấm Trichoderma ức chế dưới 19 %.

2.3.8. Khảo sát khả năng kí sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm

Paecilomyces sp.

Tiến hành nuôi cấy huyền phù bào tử nấm Paecilomyces sp. trên các đĩa Petri

môi trường PDA. Sau 5 ngày nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA

35

Đồ án tốt nghiệp

tiến hành cấy tuyến trùng cái Meloidogyne sp. (8 tuyến trùng cái/ 1 đĩa PDA) vào

mép khuẩn lạc nấm Paecilomyces sp. Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 4 ngày.

Bố trí thí nghiệm gồm 4 đĩa và lặp lại 3 lần.

Sau mỗi ngày, thu kết quả thí nghiệm bằng cách dùng nước cất vô trùng cho

vào các đĩa Petri rồi dùng kim mũi mác thu tuyến trùng cái. Quan sát sự lây nhiễm

nấm Paecilomyces sp. trên tuyến trùng cái bằng cách làm tiêu bản nhuộm với

methylene blue và soi dưới kính hiển vi.

2.3.9. Đánh giá tác động của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. trong việc phòng

trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây hồ tiêu

❖ Mục đích: xác định hiệu quả phòng trị tuyến trùng hại hồ tiêu trên

đồng ruộng của chủng nấm Paecilomyces sp.

❖ Bố trí thí nghiệm:

• Địa điểm trên vườn tiêu bị tuyến trùng gây hại tại xã Đa Kia, huyện

Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước.

• Vườn tiêu được chia thành 2 lô thí nghiệm: Lô đối chứng do nông dân

tự phòng trị. Lô thí nghiệm tưới nấm Paecilomyces sp., liều lượng 106 bào tử / ml,

mỗi trụ tiêu tưới 1 lít dung dịch nấm sau khi pha.

❖ Mỗi công thức chọn 12 cây có tỷ lệ bị hại ở cấp 2 (Theo QCVN 01 -

172 : 2014/BNNPTNT)

36

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2. 5. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces sp.

Nghiệm thức Công thức Liều dùng

NT1 Phun thuốc hóa học phòng Tưới nước, bón phân và phun

trừ tuyến trùng thuốc hóa học VIFU-SUPER 5G

(Hoạt chất: Carbosulfan), cách

dùng: pha từ 20 - 30 kg/ha.

NT2 Phun chế phẩm nấm Chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp.

Paecilomyces sp. có mật độ ban đầu là 1010 bào tử / g

được pha loãng với nước nồng độ

106 bào tử / ml, tưới đều vào các

gốc tiêu.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bị hại trước và sau khi tưới nấm.

Cấp hại Tỷ lệ (%) bị hại được đánh giá theo QCVN 01 - 172 :

2014/BNNPTNT

• Cấp 1 (nhẹ): ≤1/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị

khô.

• Cấp 2 (trung bình): >1/3 -<2/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị

vàng, cành bị khô.

• Cấp 3 (nặng): ≥2/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng, cành bị

chết khô hại trước và sau khi tưới nấm.

2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Excel và SAS để xử lý số liệu.

37

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp.

Sử dụng nguồn nấm Paecilomyces sp. của Phùng Lê Kim Yến (2014) và Lê

Trần Quang Huy (2015), sinh viên tiến hành nhiễm lại trên con cái và trứng tuyến

trùng, theo dõi trong phòng thí nghiệm.. Từ những cá thể con cái và trứng bị nghi

ngờ bị chết do nhiễm nấm Paecilomyces sp,, sinh viên đã tiến hành phân lập lại và

sau 7 ngày nuôi cấy, trên môi trường PDA đã xuất hiện tản nấm có màu trắng xốp

sau sang màu hồng rồi màu hồng tím như hình 3.1.

Hình 3.1. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA.

Tản nấm có hình tròn đồng tâm, dạng thảm nhung khi nuôi cấy trên môi

trường PDA. Ban đầu sợi tơ nấm có màu trắng, mềm, mịn. Sau 4 ngày nuôi cấy sợi

nấm bắt đầu chuyển sang màu hồng nhạt và chuyển sang màu tím ở 14 ngày nuôi

cấy. Khi quan sát dưới kính hiển vi có thể thấy cuốn bào tử dài, cong mọc phân

nhánh từ các sợi nấm, các thể bình có dạng hình chai nước ở gốc phồng to, ở cổ thì

nhỏ dần và mộc vươn thẳng. Các bào tử hình oval, dài khoảng 1,5 – 2,5 μm, mọc

thưa thớt trên các thể bình liên kết với nhau thành chuỗi dài, hay bị đứt đoạn.

38

Đồ án tốt nghiệp

Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến sự phát triển của

Paecilomyces sp.

3.2.1. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu đến sự phát triển của

Paecilomyces sp.

Tiến hành thí nghiệm như mục 2.3.7.2 để khảo sát sự phát triển của nấm

Paecilomyces sp. trên các môi trường thuốc trừ nấm, sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy

trên các loại môi trường, thu được kết quả như hình 3.2.

E

B

A

D

C

Hình 3.2. Tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học. (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Oshin 20WP; D: Plutel 1,8 EC; E: đối chứng)

39

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3. 1. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường trừ nấm.

Đường kính tán nấm (cm) qua các ngày nuôi cấy Nghiệm thức 3 NSC 5 NSC 7 NSC

Đối chứng 2,46a ± 0,05 3,18a ± 0,07 3,80a ± 0,17

Sherpa 25EC 1,70b ± 0,00 2,23b ± 0,05 2,80b ± 0,10

Plutel 1,8 EC 1,30c ± 0,17 1,78c ± 0,07 2,13c ± 0,15

Oshin 20WP 1,97b ± 0,11 3,03a ± 0,03 3,63a ± 0,37

Actara 25WG 2,33a ± 0,11 3,1a ± 0,10 3,77a ± 0,05

CV (%) 5,60 3,28 6,48

Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp.

Tỷ lệ (%) khuẩn lạc bị ức chế ở Cấp độ ức chế nấm của các Nghiệm thức các ngày sau cấy loại thuốc hóa học

5 NSC 7 NSC 5 NSC 7 NSC

Đối chứng - - - -

Sherpa 25EC 28,80c 26,11b 1 1

Plutel 1,8 EC 43,96b 40,08b 1 1

Oshin 20WP 4,70d 5,98c 1 1

Actara 25WG 2,60d 2,56c 1 1

CV (%) 7,72 19,42

Số liệu ở bảng 3.2 cho thấy, vào thời điểm 5NSC và 7 NSC, cả 4 loại thuốc

trừ sâu đều có tác động đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp.,

tuy nhiên các loại thuốc thử nghiệm nêu trên chỉ có tác động thấp (chỉ bị ảnh hưởng

ở cấp 1, cấp thấp nhất, theo Hassan (1999). Trong 4 loại thuốc hóa học, thuốc

Actara 25WG có ảnh hưởng thấp nhất (ở 5 NSC là 2,6 % và ở 7 NSC là 2, 56 %),

tiếp theo là Oshin 20WP (ở 5 NSC là 4,7 % và 7 NSC là 5,98 %), Sherpa 25EC xếp

thứ ba (5 NSC là 28,8 và 7 NSC là 26,11 %). Plutel 1,8 EC có tác động nhiều nhất

40

Đồ án tốt nghiệp

trong 4 loại thuốc (ở 5 NSC là 43,96% và ở 7 NSC là 40,08%). Kết quả trên cho

thấy, khi sử dụng chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng từ nấm Paecilomyces

sp. trong trường hợp cần thiết có thể kết hợp sử dụng chung với cả bốn loại thuốc

hóa học trên.

3.2.2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của

Paecilomyces sp.

Bảng 3. 3. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp.

Đường kính tán nấm (cm) qua các ngày nuôi cấy Nghiệm thức 3 NSC 5 NSC 7 NSC

Đối chứng 2,37a ± 0,15 3,18a ± 0,07 3,8a ± 0,17

Carbenzim 50WP 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00

Cup 2,9 SL 1,95b ± 0,38 2,1b ± 0,1 3,03b ± 0,06

Saizole 5SC 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00

Antracol 70WP 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00 0,00c ± 0,00

CV (%) 21,83 5,33 5,97

Bảng 3. 4. Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế

Tỷ lệ (%) khuẩn lạc bị ức chế ở Cấp độ ức chế nấm của các Nghiệm thức các ngày sau cấy loại thuốc hóa học

5 NSC 7 NSC 5 NSC 7 NSC

Đối chứng - - - -

Carbenzim 100,00a 100,00a 4 4 50WP

Cup 2,9 SL 33,99b 20,09b 1 1

Saizole 5SC 100,00a 100,00a 4 4

Antracol 100,00a 100,00a 4 4 70WP

CV (%) 2,61 2,25

41

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả ở bảng 3.3 và bảng 3.4 cho thấy có 3 loại thuốc trừ bệnh ức chế hoàn

toàn 100 % sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. là Saizole 5SC, Antracol 70WP

và Carbenzin 50WP. Riêng thuốc Cup 2,9 SL có tỷ lệ ức chế khuẩn lạc thấp nhất là

33.9% sau 5 NSC và 20,09 % ở thời điểm 7 NSC, chỉ ức chế ở cấp 1 (theo Hassan,

1989). Vì vậy, khi phun chế phẩm nấm Paecilomyces sp. cần lưu ý không phun

đồng thời cùng với các loại thuốc hóa học là Carbenzin 50 WP, Saizole 5SC và

Antracol 70WP. Còn thuốc hóa học Cup 2,9 SL có tác động ức chế thấp đối với

nấm Paecilomyces sp. nên có thể sử dụng chung khi phun trên đồng ruộng.

A

E

B

D

C

Hình 3.3. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học.. (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin 50WP; E: đối chứng)

42

Đồ án tốt nghiệp

3.2.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Trichoderma sp. và

Paecilomyces sp.

Tiến hành thí nghiệm như ở mục 2.3.8 và lần lượt đo đường kính khuẩn lạc

của nấm Paecilomyces sp. sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy.

Bảng 3. 5. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp.

Đường kính tản nấm Tỷ lệ ức chế Mức độ đối Công thức sau 7 ngày nuôi cấy (%) kháng

Đối chứng - - 2,80 ± 0,36

Nấm Paecilomyces Đối kháng yếu 24,33 2,10 ± 0,30 sp. nuôi cấy (-)

Bảng 3. 6. Đường kính tản nấm Trichoderma sp. khi cấy đồng thời với

nấm Paecilomyces sp.

Đường kính tản nấm Tỷ lệ ức chế Mức độ đối Công thức (%) kháng sau 7 ngày nuôi cấy

- - Đối chứng 8,3 ± 0,26

Đối kháng yếu Nấm Trichoderma sp. 32,93 5,57 ± 0,66 (-) nuôi cấy

Theo như kết quả thu nhận được, khi nuôi cấy đồng thời hai loại nấm

Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. trên môi trường PDA, nấm Trichoderma sp.

có ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp., tuy nhiên chỉ có ảnh

hưởng yếu. Ở thời điểm 7 NSC, tỷ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp. và nấm

Trichoderma sp. lần lượt là 24,33 % và 32,93 %, nấm Trichoderma sp. đối kháng

yếu với nấm Paecilomyces sp., theo hình chụp được từ kính hiển vi, hai loại nấm

này chỉ cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian sống. Vì vậy, khi sử dụng chế

phẩm Paecilomyces sp. có thể kết hợp sử dụng Trichoderma sp. nhưng cần lưu ý sử

dụng liều lượng hợp lý.

43

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.4. Đĩa nấm khi cấy đồng thời Trichoderma sp. và Paecilomyces sp.

Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình

thành và phát triển của nấm Pacilomyces sp. (môi trường lỏng)

3.3.1. Khảo sát môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm

Paecilomyces sp.

Bảng 3. 7. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. sau thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc.

Thời điểm nuôi cấy (x108 cfu)

2 ngày 4 ngày 6 ngày 9 ngày 12 ngày 14 ngày

CDB 2,14b 2,57c 10,40bc 6,45c 2,87c 1,14b

CMB 1,45b 1,95c 3,60c 2,18d 2,45c 0,80b

SDAY1 7,25a 20,95b 21,35b 15,65b 7,11b 5,49a

44

Đồ án tốt nghiệp

SDAY3 5,49ab 37,24a 45,30a 33,70a 11,57a 3,73ab

CV (%) 22,37 20,69 18,82 8,22 25,28 23,89

Nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy lỏng lắc trên 4 loại môi trường thí

nghiệm trong 14 ngày, ở mỗi thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày tiến hành lấy dịch

sinh khối.

A

B

D

C

Hình 3.5. Dịch nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường. (A:

Môi trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường SDAY3).

45

Đồ án tốt nghiệp

Mật độ bào tử tính theo logarit

2 ngày

4 ngày

6 ngày

9 ngày

12 ngày

14 ngày

CDB

8,32a ± 0,15

8,79bc ± 0,49

8,99bc ± 0,20

8,80ab ± 0,07

8,45b ± 0,08

8,06b ± 0,00

CMB

7,93a ± 0,70

8,28c ±0,16

8,55c ± 0,05

7,97b ± 0,92

8,39b ± 0,06

7,90b ± 0,07

SDAY1

8,86a ± 0,00

9,31ab ± 0,13

9,32ab ±0,11

9,19ab ± 0,05

8,85a ± 0,07

8,74a ± 0,01

SDAY3

8,74a ± 0,00

9,57a ± 0,01

9,65a ± 0,02

9,53a ± 0,01

9,06a ± 0,10

8,56a ± 0,16

CV(%)

4,23

2,96

1,28

5,19

0,91

1,03

Bảng 3. 8. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. tính theo logarit

Qua kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, ở các thời điểm đều có sự gia tăng về sinh

khối nấm so với lượng sinh khối nấm cấy vào ban đầu.

Ở thời điểm 2 ngày sau cấy, môi trường SDAY1 có ưu thế tạo nhiều bào tử

hơn (mật độ bào tử là 7,25.108 bào tử / ml), tiếp đến là môi trường SDAY3 với mật

độ bào tử là 5,49.108 bào tử / ml. Tuy nhiên, cả 2 môi trường này đều tạo ra số

lượng bào tử tương đối như nhau, không có sự sai khác có nghĩa về mặt thống kê

với mức ý nghĩa 5 %. Ở thời điểm 4 ngày sau khi cấy, môi trường SDAY3 cho

lượng bào tử cao nhất, đạt 37,24.108 bào tử / ml, tiếp đến là môi trường SDAY1 là

20,95.108 bào tử / ml. Cả hai môi trường CDB (2,57.108 bào tử / ml) và CMB

(1,95.108 bào tử / ml) cho lượng bào tử thấp hơn nhiều so với 2 loại môi trường

trên.

Ở thời điểm 6, 9 và 12 ngày sau khi cấy, môi trường SDAY3 vẫn trội hơn ba

loại môi trường còn lại. Mật độ bào tử lần lượt sau 6, 9 và 12 ngày sau cấy là

45,30.108 bào tử / ml, 33,70.108 bào tử / ml, 11,57.108 bào tử / ml. Tiếp theo là môi

trường SDAY1 với mật độ bào tử lần lượt là 21,35.108 bào tử / ml, 15,65.108 bào tử

/ ml, 7,11.108 bào tử / ml. Môi trường CDB đạt lượng bào tử thấp hơn là 10,40.108

bào tử / ml, 6,45.108bào tử / ml và 2,87.108 bào tử / ml.Môi trường CMB cho lượng

bào tử thấp nhất là 3,60.108 bào tử / ml; 2,18.108 bào tử / ml; 2,45.108 bào tử / ml.

Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Lê Hữu Phước (2009), tác giả đã khẳng

46

Đồ án tốt nghiệp

định rằng ở thời điểm 6 NSC là thời điểm thu mật độ bào tử cao nhất cho nấm

Paecilomyces sp.

Ở thời điểm 14 ngày sau cấy, hai môi trường SDAY1 và SDAY3 đều cho

lượng bào tử (5,49.108 bào tử / ml và 3,73.108 bào tử / ml) cao hơn so với hai loại

môi trường CDB, CMB. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có nghĩa ở hai môi

trường SDAY1 và SDAY3 với mức ý nghĩa 1%. Điều này cũng trùng khớp với các

nghiên cứu của Trần Thị Tho (2014), trong các loại môi trường trên, môi trường

SDAY3 là loại môi trường thích hợp để nhân nuôi nấm Paecilomyces sp. Kết quả

này cũng hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Boucias và Pendland (1998), các

tác giả nhận định rằng nấm Paecilomyces có thể dễ dàng nuôi cấy trên môi trường

Sabouraud dextrose. Ngoài ra, các nghiên cứu được tiến hành trongnước cũng có

kết quả tương tự, Phạm Thị Thùy và ctv. (1995) đã xác định môi trường Sabouraud

bổ sung thêm khoáng chất là môi trường nhân giống nấm Paecilomyces sp. tốt nhất.

47

Đồ án tốt nghiệp

Mật độ bào tử tính theo logarit

12.00

10.00

9.53 9.19 8.81

9.66 9.32 9.00 8.55

9.06 8.85 8.45 8.39

9.57 9.31 8.79 8.28

8.00

7.97

8.86 8.74 8.32 7.93

8.74 8.56 8.06 7.90

6.00

4.00

2.00

0.00

2 ngày

4 ngày

6 ngày

9 ngày

12 ngày

14 ngày

CDA

CMA

SDAY1

SDAY3

Hình 3.6. Mật độ bào tử tính theo logarit trên bốn loại môi trường lỏng.

48

Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào biểu đồ về khả năng sinh bào tử sau 14 ngày nuôi cấy, tất cả 4 loại

môi trường đều làm tăng mật độ bào tử. Hai môi trường SDAY1 và SDAY3 cho

mật số bào tử cao hơn so với CDB và CMB ở thời điểm 2 ngày, tuy giữa chúng

không khác biệt nhau về mặt thống kê.

Có thể thấy rằng, bắt đầu từ thời điểm 6 ngày sau cấy, mật độ bào tử đạt cao

nhất và bắt đầu giảm xuống ở thời điểm 9 ngày, 12 ngày và 14 ngày. Khả năng tạo

bào tử ở 4 môi trường dinh dưỡng cao nhất ở 6 ngày. Mật độ bào tử cao nhất ở môi

trường SDAY3 (45,30 x108 bào tử / ml) và thấp nhất là môi trường CMB, chỉ có

3,60 x108 bào tử / ml. Hai môi trường SDAY1 và CDB cho mật số bào tử lần lượt là

21,45 x108 bào tử / ml và 10,40 x108 bào tử / ml. Vì vậy, khi lên men thu sinh khối

nấm Paecilomyces sp. trên môi trường lỏng, lắc 150 vòng/ phút, thời điểm thu sinh

khối để cho lượng sinh khối đạt cao nhất là 6 ngày sau khi cấy.

3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình

thành và phát triển của nấm Paecilomyces sp. (môi trường rắn)

Chủng nấm Paecilomyces sp. đã được nhân giống cấp 1 trên môi trường

PDA. Tiến hành thí nghiệm xác định môi trường nhân sinh khối nấm cấp 2 trong

chai trên các nguồn cơ chất như trấu, ngô mảnh , lúa và gạo tấm sau 14 ngày.

49

Đồ án tốt nghiệp

A

B

C

D

Hình 3.7. Hình nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên 4 loại môi

trường rắn(A: môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường cám)

Sau 14 ngày, tiến hành lấy sinh khối nấm pha loãng đến nồng độ 109 và cấy

trang trên môi trường PDA. Kết quả xác định môi trường tối ưu nhân sinh khối nấm

được thể hiện trong bảng 3.9.

50

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3. 9. Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy

Số lượng bào tử Mật độ tế bào Nghiệm thức (*1010 bào tử / g) theo logarit

Lúa 0,55c 9,74c ± 0,02

Cám trấu 0,21c 9,32d ± 0,05

Gạo tấm 2,34b 10,37b ± 0,06

Ngô mảnh 3,64a 10,55a ± 0,09

CV (%) 22,84 0,60

Ghi chú: lượng cấy giống ban đầu là 9,44x106 bào tử / g cơ chất.

11

10.5

10

Mật độ tế bào theo logarit

9.5

9

8.5

Gạo

Bắp

Lúa

Cám

Mật độ tế bào trên 4 loại môi trường rắn theo logarit.

Hình 3.8. Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn trên 4 loại môi trường.

Kết quả cho thấy rằng, sau 14 ngày nuôi cấy, mật độ bào tử đạt cao nhất khi

nuôi cấy trên môi trường ngô mảnh (3,643 x 1010 bào tử / g), tiếp theo là môi trường

gạo tấm (2, 343 x 1010 bào tử / g), nuôi cấy cho sinh khối thấp nhất ở môi trường lúa

(0,500 x 1010 bào tử / g) và cám trấu (0,21 x 1010 bào tử / g). Vì vậy, khi đưa vào

sản xuất chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. nên sử dụng ngô mảnh hoặc gạo tấm

làm chất mang. Vì vậy, sinh viên quyết định chọn ngô mảnh và gạo tấm lên men

theo mẻ số lượng lớn.

Thử nghiệm nhân sinh khối nấm Paecilomyces sp. trên khay nhựa

Thử nghiệm nhân sinh khối nấm Paecilomyces sp. trên môi trường gạo tấm

với dụng cụ là các khay có kích thước 50 x 50 cm. Mỗi khay gồm 1 kg gạo tấm

51

Đồ án tốt nghiệp

ngâm nở, hấp tiệt trùng 121 0C, 1 atm trong 15 phút. Mật độ cấy giống ban đầu là

5.106 bào tử / ml, lên men ở nhiệt độ phòng trong thời gian 14 ngày.

Bảng 3. 10. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay

ngô mảnh và gạo tấm.

Mật độ bào tử (bào tử / g)

Ngô mảnh Gạo tấm

2,41.1010 1,68. 1010 Lần 1

4,44.1010 2,33.1010 Lần 2

4,08.1010 3,02.1010 Lần 3

3,64.1010 2,34.1010 Trung bình

Kết quả ở bảng 3.10 và hình 3.9 cho thấy nấm Paecilomyces sp. phát triển tốt

trên cả hai loại môi trường ngô mảnh và gạo tấm. Sau 14 ngày nuôi cấy, cả hai loại

môi trường đều cho số lượng mật độ lớn tương đương với nhau.

Hình 3.9. Nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay.

Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm

nấm Paecilomyces sp.

3.4.1. Trong điều kiện phòng thí nghiệm

Tiến hành khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp. ký

sinh trên rễ cây hồ tiêu theo phương pháp nêu ở mục 2.3.8 trong thời gian 4 ngày

52

Đồ án tốt nghiệp

trong môi trừơng thạch đĩa PDA với nấm Paecilomyces sp. nuôi cấy 5 ngày tuổi.

Tiến hành thu kết quả sau từng ngày lây nhiễm.

Bảng 3. 11. Tỷ lệ phần trăm số tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị nấm

Paecilomyces sp. ký sinh.

Tỷ lệ tuyến trùng cái bị lây nhiễm nấm Paecilomyces sp.

sau 3 lần thí nghiệm (%)

(%) Tỷ lệ trung bình

Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3

Thời gian sau lây nhiễm (ngày) 1 37,5 ± 12,5 33,33 ± 7,22 59,72 ± 7,22 37,5 ± 8,84

2 54,17 ± 7,22 58,33 ± 14,43 54 ± 19,09 55,56 ± 12,67

3 58,33 ± 19,10 58,33 ± 26,02 68,75 ± 25 59,72 ± 20,52

4 79,17 ± 19,10 95,83 ± 7,22 71,88 ± 12,5 82,29 ± 12,94

Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.11 cho thấy chủng nấm Paecilomyces sp. có khả

năng ký sinh con cái tuyến trùng cao. Tỷ lệ nấm Paecilomyces sp. ký sinh con cái

tuyến trùng cao nhất ở thời điểm 4 ngày sau khi cho lây nhiễm (đạt 82,29 %).

53

Đồ án tốt nghiệp

A

B

D

C

F

E Hình 3.10. Nấm Paecilomyces sp. tấn công con cái và trứng tuyến trùng

Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces sp. soi dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Methylene blue).

Qua kết quả quan sát sự lây nhiễm của tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bởi

nấm Paecilomyces sp. cho thấy sợi nấm Paecilomyces sp. ký sinh bao phủ khắp các

phần cơ thể tuyến trùng cái. Sự xâm nhập của nấm Paecilomyces sp. đã được ghi

nhận trong bài báo của tác giả Morgan-Jone et.al (1984), nấm Paecilomyces sp. tấn

công tuyến trùng cái qua các phần bị trầy xướt, qua hậu môn hoặc âm đạo của tuyến

trùng cái. Tuy nhiên một số tác giả khác như Jatala (1986) lại giải thích rằng nấm

Paecilomyces sp. tấn công cơ thể tuyến trùng cái Meloidogyne sp. chỉ qua những

chổ mở của cơ thể.

Khi quan sát sự lây nhiễm trên trứng tuyến trùng, nấm Paecilomyces sp. cho

thấy mạng lưới sợi nấm phân nhánh đến nhiều trứng. Phần cuối của hệ sợi có 1 cấu

trúc sợi sắt nhọn được xem như là giác bám giúp bám vào vỏ trứng tuyến trùng.

54

Đồ án tốt nghiệp

Những trứng bị nấm Paecilomyces sp. tấn công có biểu hiện bị teo lại (do áp lực của

mạng lưới sợi nấm). Đây là phương pháp xâm nhập vật chủ bằng cơ học (theo giải

thích của tác giả Holland et al., 1999). Khi sợi nấm chạm vào bề mặt trứng, nó phản

ứng tiếp xúc bằng cách hình thành những giác bám. Sau đó, dùng chất dính kết giúp

cho việc kết nối nấm và vật chủ. (Lopez-Llorea et. al, 2002)

3.4.2. Trên đồng ruộng

Chế phẩm Paecilomyces sp. lên men có mật độ 1010 bào tử / ml được chuyển

đến vườn trồng tiêu thuộc xã Đa Kia, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước để thử

nghiệm. Sau 15 ngày thử nghiệm, quan sát đặc điểm hình thái cây trong vườn hồ

tiêu ở các nghiệm thức thí nghiệm và nhận xét kết quả.

Số liệu ở bảng 3.12 cho thấy, các trụ tiêu thí nghiệm ở các công thức đối

chứng của nông dân và công thức tưới nấm đều bị tuyến trùng gây hại khá nặng,

hơn 1/3 số lá bị vàng (hình 3.13), theo QCVN 01 – 172 : 2014/BNNPTNT, toàn bộ

các cây thí nghiệm đều bị hại ở cấp 2 (< 1 / 3 - < 2 / 3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán

cây bị vàng.

Sau 15 ngày thí nghiệm, các cây tiêu của công thức phun nấm không có biểu

hiện vàng thêm và cấp hai cũng chỉ ở mức cấp 2. Trong khi đó, công thức đốichứng

đã có 3 cây bị chết.

Tuy chưa đủ thời gian để đánh giá đầy đủ hiệu quả của thí nghiệm, nhưng kết

quả bước đầu cho thấy, trên điều kiện đồng ruộng, nấm Paecilomyces sp. cho hiệu

quả khống chế tuyến trùng gây hại hồ tiêu có chiều hướng tốt hơn so với đối chứng

phun thuốc hóa học của nông dân (bảng 3.12)

Bảng 3. 12. Đánh giá cấp hại của tuyến trùng trên cây hồ tiêu.

Cấp hại của cây tiêu Cấp hại của cây tiêu sau tưới Công thức trước tưới 15 ngày

Đối chứng 2 2,25 (đã có 3 cây bị chết)

Tưới nấm 2 2

55

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.11. Người dân pha chế phẩm Paecilomyces sp. tưới vào gốc cây hồ tiêu

56

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.12. Trước khi tưới.

Hình 3.13. Sau khi tưới.

57

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4:

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Trong bốn loại môi trường lỏng, môi trường SDAY3 cho mật độ bào -

tử cao nhất, thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp.

Môi trường ngô mảnh và gạo tấm thích hợp nhất để nhân giống sản -

xuất chủng nấm Paecilomyces sp.

Trong các loại thuốc BVTV khảo nghiệm, các loại thuộc trừ sâu -

Sherpa 25EC, Plutel 1,8 EC, Oshin 20WP và Actara 25WG đều có ảnh hưởng nhẹ

đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Trong các loại thuốc trừ nấm, Cup 2,9

SL có ảnh hưởng nhẹ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp., còn các loại

thuốc Carbenzim 50WP, Saizole 5SC và Antracol 70 WP đều có tác động mạnh

(cấp độ 4).

Nấm Paecilomyces sp. có khả năng kí sinh tuyến trùng cái -

Meloidogyne sp. hại cây hồ tiêu với tỷ lệ 82,29 % sau 4 ngày.

Trên đồng ruộng, nấm Paecilomyces sp. có khả năng làm giảm triệu -

chứng bệnh do tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu ở thời điểm 15

ngày sau khi tưới.

Kiến nghị

Định danh chủng nấm Paecilomyces sp. để có kết luận chính xác hơn -

và phù hợp hơn với các nghiên cứu khoa học khác.

- Xác định LD50 và LC50 của nấm Paecilomyces sp. trên tuyến trùng,

xác định liều lượng sử dụng trong công tác BVTV sao cho hiệu quả và tiết kiệm.

Tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chế -

phẩm từ nấm Paecilomyces sp. như độ ẩm, các loại khoáng chất, nhiệt độ,... và thời

gian bảo quản chế phẩm.

- Tiến hành đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng của chế phẩm

Paecilomyces sp. ở quy mô lớn hơn.

58

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

Lê Thị Mai Châm (2014). Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ

tuyến trùng Meloidogyne spp. trên cây hồ tiêu.

Ngô Thị Thu Hà (2013). Nghiên cứu phân lập nấm Purpureocillium

lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.

Nguyễn Hoài Hương (2014). Công nghệ lên men. Đại học Công Nghệ Tp.

HCM.

Lê Trần Quang Huy (2015). Đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng

Meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm Paecilomyces sp.

Lê Hữu Phước (2009). Phân lập và chọn môi trường nhân sinh khối ba loài

nấm ký sinh tuyến trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok, Beauveria

bassiana (Bals.) Vuill và Paecilomyces spp. trên nhóm rau ăn lá ở Đồng Bằng Sông

Cửu Long.

Bùi Cách Tuyến – Lê Đình Đôn. Cây hồ tiêu Bệnh hại và biện pháp phòng

trừ. Nhà xuất bản nông nghiệp.

Trần Thị Tho, Trần Văn Hai, Trịnh Thị Xuân (2014). Khảo sát đặc tính sinh

học của các chủng nấm tím Paecilomyces javanicus ký sinh rệp sáp giả tại Đồng

Bằng Sông Cửu Long.

Phùng Lê Kim Yến (2014). Phân lập nấm Paecilomyces spp. và xác định một

số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng

thu nhận được.

Tài liệu tiếng anh

A. Usman and M.A. Siddiqui (2012). Effect of some fungal strains for the

management of rootknot nematode (Meloidogyne incognita) on eggplant (Solanum

melongena). Journal of Agricultural Technology 8(1): 213-218.

Abhishek Sharma & Satyawati Sharma & Aditya Mittal & Satya Narayan

Naik, 2012. Statistical optimization of growth media for Paecilomyces lilacinus

6029 using non-edible oil cakes.

59

Đồ án tốt nghiệp

Huma Abbas , Nazir Javed , Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran ,

Muhammad Atiq, 2016. Exploitation of Nematicidal Potential of Paecilomyces

lilacinus against Root Knot Nematode on Eggplant.

Juan Morales – Ramos, Guadalupe Rojas, David I. Shapiro-Ilan, 2014. Mass

production of benefical organisms.

Lee JS, Iung WC, Park SJ, Lee KE, Shin WC, Hong Ex, 2012. Culture

conditions and medium components for the production of mycelial biomass and

exo-polysaccharides with Paecilomyces japonica in liquid culture.

Li Gao, 2014. Optimization of Culture Medium for Sporulation and Biomass

Production of a Nematophagous Fungus: Consideration of Nutritional and

Environmental Conditions.

M. Nars Esfahani and B. Ansari Pour, 2006. The effects of Paecilomyces

lilacinus on the Pathogenesis of Meloidogyne Javanica and Tomato plant growth

parameters.

Marie-Stéphane Tranier, Johan Pognant-Gros, Reynaldo De la Cruz Quiroz,

Cristóbal Noé Aguilar González , Thierry Mateille , Sevastianos Roussos, 2014.

Commerical biological control agents targeted against plant-parasitic root – knot

namatodes.

Mark A. Jackson, Micheal R. Macguire, Lawrence A. Lacey and Stephen P.

Wraight, 1997. Liquid culture production of desiccation tolerant blastospores of the

bioinsecticidal fungus Paecilomyces fumosoroseus

Mendoza A. R., R. A. Sikora, và S. Kiewnick ,2007. Effects of

Paecilomyces lilacinus protease and chitinase on the eggshell structures and

hatching of Meloidogyne javanica juveniles.

Mendoza A. R., R. A. Sikora, and S. Kiewnick. 2007. Influence of

Paecilomyces lilacinus strain 251 on the biological control of the burrowing

nematode Radopholus similisin banana. Nematropica 37:203-213.

60

Đồ án tốt nghiệp

Pau, C.G., C.T.S. Leong, S.K. Wong, L. Eng, M. Jiwan, F.R. Kundat,

Z.F.B.A. Aziz, O.H. Ahmed and N.M. Majid, 2012. Isolation of Indigenous Strains

of Paecilomyces lilacinus with Antagonistic Activity against Meloidogyne incognita

Poornima Sharma1 and Rakesh Pandey, 2009. Biological control of root-

knot nematode; Meloidogyne incognita in the medicinal plant; Withania somnifera

and the effect of biocontrol agents on plant growth.

R. P. Esser and N. E. El-Gholl, 1993. Paecilomyces lilacinus, a fungus that

parasitizes nematode eggs.

S. Prabhu, S. Kumar and S. Subramanian, 2008. Mass production and

commercial formulation of Paecilomyces lilacinus.

Zhen Yu, You – chi Zhang, Xiang Zhang và Yin Wang, 2015. Conversion of

food waste into biofertilizer for the biocontrol of root - knot nematode by

Paecilomyces lilacinus.

Tài liệu từ internet

https://translate.google.com.vn/translate?hl=vi&sl=en&u=https://en.wikipedia.org/

wiki/Purpureocillium&prev=search

https://en.wikipedia.org/wiki/Paecilomyces

https://en.wikipedia.org/wiki/Purpureocillium

https://www.google.com.vn/search?q=N%E1%BA%A5m+Paecilomyces+sp+chuy

%E1%BB%83n+th%C3%A0nh+n%E1%BA%A5m+purple&oq=N%E1%BA%A5

m+Paecilomyces+sp+chuy%E1%BB%83n+th%C3%A0nh+n%E1%BA%A5m+pur

ple&aqs=chrome..69i57.21784j0j7&sourceid=chrome&ie=UTF-

8#q=n%E1%BA%A5m+Paecilomyces+sp+wiki

http://iasvn.org/homepage/Nghien-cuu-kha-nang-uc-che-tuyen-trung-Meloidogyne-

Incognita-tren-ca-phe-cua-nam-Paecilomyces-Javanicus-8655.html

http://www.giatieu.com/loi-cua-cay-ho-tieu/6696/

61

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

A. XỬ LÝ THỐNG KÊ

A.1. ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ BỆNH ĐẾN ĐƯỜNG KÍNH KHUẨN

LẠC NẤM PAECILOMYCES SP.

Đường kính tản nấm ở thời điểm 3NSC

14:48 Wednesday, January 7, 2004 1

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NT 5 Actara 25WG Oshin 20WP Plutel Sherpa 25EC

ĐC

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 2.69733333 0.67433333 56.19 <.0001

Error 10 0.12000000 0.01200000

Corrected Total 14 2.81733333

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.957407 5.608081 0.109545 1.953333

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 4 2.69733333 0.67433333 56.19 <.0001

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for KQ

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.012

Critical Value of t 2.22814

Least Significant Difference 0.1993

Means with the same letter are not significantly different.

1

Đồ án tốt nghiệp

t Grouping Mean N NT

A 2.46667 3 ĐC

A 2.33333 3 Actara 25WG

B 1.96667 3 Oshin 20WP

C 1.70000 3 Sherpa 25EC

D 1.30000 3 Plutel

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.012

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 0.2835

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NT

A 2.46667 3 ĐC

A 2.33333 3 Actara 25WG

B 1.96667 3 Oshin 20WP

B 1.70000 3 Sherpa 25EC

C 1.30000 3 Plutel

Đường kính tản nấm ở thời điểm 5NSC

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 4.67166667 1.16791667 152.34 <.0001

Error 10 0.07666667 0.00766667

Corrected Total 14 4.74833333

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.983854 3.283481 0.087560 2.666667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 4 4.67166667 1.16791667 152.34 <.0001

Alpha 0.01

2

Đồ án tốt nghiệp

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.007667

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 0.2266

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NT

A 3.18333 3 ĐC

A 3.10000 3 Actara 25WG

A 3.03333 3 Oshin 20WP

B 2.23333 3 Sherpa 25EC

C 1.78333 3 Plutel

Đường kính khuẩn lạc ở thời điểm 7NSC

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 6.48933333 1.62233333 38.63 <.0001

Error 10 0.42000000 0.04200000

Corrected Total 14 6.90933333

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.939213 6.351416 0.204939 3.226667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 4 6.48933333 1.62233333 38.63 <.0001

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.042

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 0.5303

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NT

A 3.8000 3 ĐC

3

Đồ án tốt nghiệp

A 3.7667 3 Actara 25WG

A 3.6333 3 Oshin 20WP

B 2.8000 3 Sherpa 25EC

C 2.1333 3 Plutel

A.2. TỶ LỆ (%) ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM PAECILOMYCES SP.

Ở thời điểm 3NSC

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 17413.20603 4353.30151 95.16 <.0001

Error 10 457.45727 45.74573

Corrected Total 14 17870.66329

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.974402 17.59083 6.763559 38.44933

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 4 17413.20603 4353.30151 95.16 <.0001

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 45.74573

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 17.502

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NT

A 100.000 3 ĐC

B 46.500 3 Plutel

C B 29.480 3 Sherpa 25EC

C D 12.167 3 Oshin 20WP

D 4.100 3 Actara 25WG

Ở thời điểm 5NSC

Sum of

4

Đồ án tốt nghiệp

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 18880.65776 4720.16444 603.40 <.0001

Error 10 78.22593 7.82259

Corrected Total 14 18958.88369

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.995874 7.723513 2.796890 36.21267

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 4 18880.65776 4720.16444 603.40 <.0001

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 7.822593

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 7.2375

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NT

A 100.000 3 ĐC

B 43.960 3 Plutel

C 29.820 3 Sherpa 25EC

D 4.667 3 Oshin 20WP

D 2.617 3 Actara 25WG

Ở thời điểm 7NSC

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 18682.77103 4670.69276 101.59 <.0001

Error 10 459.74507 45.97451

Corrected Total 14 19142.51609

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.975983 19.42414 6.780450 34.90733

5

Đồ án tốt nghiệp

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 4 18682.77103 4670.69276 101.59 <.0001

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 45.97451

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 17.546

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NT

A 100.000 3 ĐC

B 40.083 3 Plutel

B 25.907 3 Sherpa 25EC

C 5.983 3 Oshin 20WP

C 2.563 3 Actara 25WG

A.3. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LOẠI THUỐC TRỪ NẤM LÊN NẤM

PAECILOMYCES SP.

Ở thời điểm 3 ngày

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 16.01066667 4.00266667 121.91 <.0001

Error 10 0.32833333 0.03283333

Corrected Total 14 16.33900000

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.979905 21.83129 0.181200 0.830000

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 4 16.01066667 4.00266667 121.91 <.0001

anh huong tren MT khang benh 3N 4

6

Đồ án tốt nghiệp

02:59 Saturday, January 17, 2004

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for KQ

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.032833

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 0.4689

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NT

A 2.3667 3 ĐC

B 1.7833 3 Cup

C 0.0000 3 Carbenzi

C 0.0000 3 Saizole

C 0.0000 3 Antracol

Ở thời điểm 5 ngày

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 26.88266667 6.72066667 2122.32 <.0001

Error 10 0.03166667 0.00316667

Corrected Total 14 26.91433333

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.998823 5.325534 0.056273 1.056667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 4 26.88266667 6.72066667 2122.32 <.0001

The ANOVA Procedure

7

Đồ án tốt nghiệp

t Tests (LSD) for KQ

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.003167

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 0.1456

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NT

A 3.18333 3 ĐC

B 2.10000 3 Cup

C 0.00000 3 Carbenzi

C 0.00000 3 Saizole

C 0.00000 3 Antracol

A.4. SỐ LƯỢNG BÀO TỬ NẤM PAECILOMYCES SP.

Ở thời điểm 2 ngày

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 45.42430000 15.14143333 18.12 0.0086

Error 4 3.34190000 0.83547500

Corrected Total 7 48.76620000

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.931471 22.37560 0.914043 4.085000

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 3 45.42430000 15.14143333 18.12 0.0086

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.835475

Critical Value of t 4.60409

Least Significant Difference 4.2083

8

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NT

A 7.2500 2 SDAY1

B A 5.4950 2 SDAY3

B 2.1450 2 CDB

B 1.4500 2 CMB

Ở thời điểm 4 ngày

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 1.7064142E19 5.6880475E18 54.04 0.0011

Error 4 4.210045E17 1.0525113E17

Corrected Total 7 1.7485147E19

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.975922 20.69197 324424298 1567875000

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 3 1.7064142E19 5.6880475E18 54.04 0.0011

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 1.053E17

Number of Means 2 3 4

Critical Range 1493677775 1531787379 1546129321

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N NT

A 3724500000 2 SDAY3

B 2095000000 2 SDAY1

C 257000000 2 CDB

C 195000000 2 CMB

Ở thời điểm 6 ngày

9

Đồ án tốt nghiệp

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 2.0058538E19 6.6861792E18 46.40 0.0014

Error 4 5.7645E17 1.441125E17

Corrected Total 7 2.0634988E19

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.972064 18.82810 379621522 2016250000

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 3 2.0058538E19 6.6861792E18 46.40 0.0014

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 1.441E17

Critical Value of t 4.60409

Least Significant Difference 1.75E9

t Grouping Mean N NT

A 4530000000 2 SDAY3

B 2135000000 2 SDAY1

C B 1040000000 2 CDB

C 360000000 2 CMB

Ở thời điểm 9 ngày

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 1270.167459 423.389153 317.90 <.0001

Error 4 5.327263 1.331816

Corrected Total 7 1275.494722

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.995823 8.225906 1.154043 14.02938

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 3 1270.167459 423.389153 317.90 <.0001

10

Đồ án tốt nghiệp

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 1.331816

Critical Value of t 4.60409

Least Significant Difference 5.3133

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NT

A 33.700 2 SDAY3

B 15.650 2 SDAY1

C 6.455 2 CDB

D 0.313 2 CMB

Ở thời điểm 12 ngày

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 1.093128E18 3.64376E17 15.83 0.0110

Error 4 9.21E16 2.3025E16

Corrected Total 7 1.185228E18

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.922293 25.28998 151739909 600000000

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 3 1.093128E18 3.64376E17 15.83 0.0110

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 2.303E16

Critical Value of t 2.77645

Least Significant Difference 4.21E8

t Grouping Mean N NT

A 1157000000 2 SDAY3

B 711000000 2 SDAY1

11

Đồ án tốt nghiệp

C 287000000 2 CDB

C 245000000 2 CMB

Ở thời điểm 14 ngày

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 2.9682316E17 9.8941053E16 22.22 0.0059

Error 4 1.7809E16 4.45225E15

Corrected Total 7 3.1463216E17

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.943397 23.89015 66725183 279300000

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 3 2.9682316E17 9.8941053E16 22.22 0.0059

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 4.452E15

Number of Means 2 3 4

Critical Range 307208563 315046664 317996408

Duncan Grouping Mean N NT

A 549000000 2 SDAY1

B A 373500000 2 SDAY3

B 114500000 2 CDB

B 80200000 2 CMB

A.5. MẬT ĐỘ BÀO TỬ TRONG CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG RẮN

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 2.3150298E21 7.7167661E20 52.06 <.0001

Error 8 1.1857867E20 1.4822333E19

Corrected Total 11 2.4336085E21

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

12

Đồ án tốt nghiệp

0.951275 22.84063 3849978355 1.68558E10

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NT 3 2.3150298E21 7.7167661E20 52.06 <.0001

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 8

Error Mean Square 1.482E19

Critical Value of t 3.35539

Least Significant Difference 105E8

t Grouping Mean N NT

A 3.64E10 3 BAP

B 2.342E10 3 GAO

C 5503333333 3 LUA

C 2100000000 3 CAM

A.6. MẬT ĐỘ BÀO TỬ TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG TÍNH THEO LOGARIT

16:55 Tuesday, January 6, 2004 1

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

MTLONG 4 CDB CMB SDAY1 SDAY3

Ở thời điểm 2 ngày

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 1.08911056 0.36303685 2.83 0.1700

Error 4 0.51223482 0.12805870

Corrected Total 7 1.60134538

13

Đồ án tốt nghiệp

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.680122 4.229408 0.357853 8.461065

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MTLONG 3 1.08911056 0.36303685 2.83 0.1700

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.128059

Number of Means 2 3 4

Critical Range 0.994 1.015 1.021

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MTLONG

A 8.8606 2 SDAY1

A 8.7400 2 SDAY3

A 8.3180 2 CDB

A 7.9257 2 CMB

Ở thời điểm 4 ngày

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 2.07463299 0.69154433 9.76 0.0260

Error 4 0.28354698 0.07088674

Corrected Total 7 2.35817996

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.879760 2.959605 0.266246 8.995986

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MTLONG 3 2.07463299 0.69154433 9.76 0.0260

Mat do tren MT long 16:55 Tuesday, January 6, 2004 3

14

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for KQ

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.070887

Number of Means 2 3 4

Critical Range .7392 .7554 .7593

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MTLONG

A 9.6090 2 SDAY3

B A 9.3109 2 SDAY1

B C 8.7888 2 CDB

C 8.2753 2 CMB

Ở thời điểm 6 ngày

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

MTLONG 4 CDB CMB SDAY1 SDAY3

Number of observations 8

Mat do tren MT long 6N 16:55 Tuesday, January 6, 2004 14

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 1.32443510 0.44147837 32.39 0.0029

Error 4 0.05452325 0.01363081

Corrected Total 7 1.37895835

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

15

Đồ án tốt nghiệp

0.960461 1.278488 0.116751 9.131963

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MTLONG 3 1.32443510 0.44147837 32.39 0.0029

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for KQ

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.013631

Number of Means 2 3 4

Critical Range .5375 .5512 .5564

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MTLONG

A 9.6558 2 SDAY3

B A 9.3218 2 SDAY1

B C 8.9954 2 CDB

C 8.5548 2 CMB

Ở thời điểm 9 ngày

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 2.70089446 0.90029815 4.25 0.0980

Error 4 0.84765622 0.21191406

Corrected Total 7 3.54855068

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.761126 5.187303 0.460341 8.874384

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MTLONG 3 2.70089446 0.90029815 4.25 0.0980

16

Đồ án tốt nghiệp

Mat do tren MT long 9N 16:55 Tuesday, January 6, 2004 23

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for KQ

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the

experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.211914

Number of Means 2 3 4

Critical Range 1.278 1.306 1.313

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MTLONG

A 9.5275 2 SDAY3

B A 9.1931 2 SDAY1

B A 8.8067 2 CDB

B 7.9701 2 CMB

Ở thời điểm 12 ngày

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 0.61438049 0.20479350 32.58 0.0029

Error 4 0.02514549 0.00628637

Corrected Total 7 0.63952598

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.960681 0.912709 0.079287 8.686956

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MTLONG 3 0.61438049 0.20479350 32.58 0.0029

Mat do tren MT long 12N 16:55 Tuesday, January 6, 2004 28

17

Đồ án tốt nghiệp

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for KQ

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.006286

Number of Means 2 3 4

Critical Range .3650 .3744 .3779

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MTLONG

A 9.05714 2 SDAY3

A 8.84903 2 SDAY1

B 8.45424 2 CDB

B 8.38741 2 CMB

Ở thời điểm 14 ngày

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 0.95211943 0.31737314 42.92 0.0017

Error 4 0.02957659 0.00739415

Corrected Total 7 0.98169602

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.969872 1.034209 0.085989 8.314494

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MTLONG 3 0.95211943 0.31737314 42.92 0.0017

Mat do tren MT long 14N 16:55 Tuesday, January 6, 2004 32

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for KQ

18

Đồ án tốt nghiệp

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.007394

Number of Means 2 3 4

Critical Range .3959 .4060 .4098

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N MTLONG

A 8.73951 2 SDAY1

A 8.55824 2 SDAY3

B 8.05880 2 CDB

B 7.90142 2 CMB

A.7. MẬT ĐỘ BÀO TỬ NẤM TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN TÍNH THEO

LOGARIT

Mat do 16:44 Tuesday, January 6, 2004 1

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

MT 4 Bap Cam Gao Lua

Number of observations 12

Mat do 16:44 Tuesday, January 6, 2004 2

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 2.91698572 0.97232857 269.93 <.0001

Error 8 0.02881762 0.00360220

Corrected Total 11 2.94580334

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

19

Đồ án tốt nghiệp

0.990217 0.600442 0.060018 9.995691

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

MT 3 2.91698572 0.97232857 269.93 <.0001

Mat do 16:44 Tuesday, January 6, 2004 4

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for KQ

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 8

Error Mean Square 0.003602

Critical Value of t 3.35539

Least Significant Difference 0.1644

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N MT

A 10.55529 3 Bap

B 10.36684 3 Gao

C 9.74043 3 Lua

D 9.32021 3 Cam

A.8. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỒNG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM

PAECILOMYCES SP. VÀ NẤM TRICHODERMA SP.

Ở thời điểm 3 ngày

The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 5

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

DK 2 DC Tricho

Number of observations 6

The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 6

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

20

Đồ án tốt nghiệp

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 1 0.48166667 0.48166667 6.28 0.0663

Error 4 0.30666667 0.07666667

Corrected Total 5 0.78833333

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.610994 5.870406 0.276887 4.716667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

DK 1 0.48166667 0.48166667 6.28 0.0663

The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 7

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for KQ

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.076667

Number of Means 2

Critical Range .6277

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N DK

A 5.0000 3 DC

A 4.4333 3 Tricho

Ở thời điểm 5 ngày

Number of observations 6

The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 10

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 1 4.50666667 4.50666667 22.92 0.0087

21

Đồ án tốt nghiệp

Error 4 0.78666667 0.19666667

Corrected Total 5 5.29333333

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.851385 7.825962 0.443471 5.666667

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

DK 1 4.50666667 4.50666667 22.92 0.0087

The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 12

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for KQ

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.196667

Number of Means 2

Critical Range 1.667

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N DK

A 6.5333 3 DC

B 4.8000 3 Tricho

Ở thời điểm 7 ngày

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: KQ

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 1 11.20666667 11.20666667 43.66 0.0027

Error 4 1.02666667 0.25666667

Corrected Total 5 12.23333333

R-Square Coeff Var Root MSE KQ Mean

0.916076 7.307060 0.506623 6.933333

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

22

Đồ án tốt nghiệp

DK 1 11.20666667 11.20666667 43.66 0.0027

The SAS System 18:36 Friday, January 16, 2004 16

The ANOVA Procedure

Duncan's Multiple Range Test for KQ

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 4

Error Mean Square 0.256667

Number of Means 2

Critical Range 1.905

Means with the same letter are not significantly different.

Duncan Grouping Mean N DK

A 8.3000 3 DC

B 5.5667 3 Tricho

B. XỬ LÝ EXCEL

B.1. ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU

Tỷ lệ ức chế (%)

3NSC 5NSC 7NSC

100 ĐC 100 100

29,17 Sherpa 29,03 30,07

25EC

37,5 Plutel 41,93 41,03

12,5 Oshin 0 0

20WP

8,3 Actara 3,23 5,13

25WG

100 ĐC 100 100

32 Sherpa 32,3 28,21

25EC

52 Plutel 43,08 48,72

23

Đồ án tốt nghiệp

17,95 Oshin 24 4,62

20WP

2,56 Actara 4 4,62

25WG

100 ĐC 100 100

19,44 Sherpa 27,27 28,13

25EC

30,5 Plutel 50 46,87

0 Oshin 0 9,38

20WP

0 Actara 0 0

25WG

B.2. ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC TRỪ SÂU

Tỷ lệ ức chế (%)

5 NSC 7 NSC 3 NSC

ĐC 0 0 0

Carbenzin 50WP 100 100 100

Cup 2,9 SL 43,75 38,46 23,08

Saizole 5SC 100 100 100

Antracol 70WP 100 100 100

ĐC 0 0 0

Carbenzin 50WP 100 100 100

Cup 2,9 SL 20 31,25 20,51

Saizole 5SC 100 100 100

Antracol 70WP 100 100 100

ĐC 0 0 0

Carbenzin 50WP 100 100 100

24

Đồ án tốt nghiệp

Cup 2,9 SL 9,09 32,26 16,67

Saizole 5SC 100 100 100

Antracol 70WP 100 100 100

B.3. KHẢ NĂNG ĐỒNG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM PAECILOMYCES SP. VÀ

TRICHODERMA SP.

Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. (cm)

3 ngày 5 ngày 7 ngày

2,90 1,60 2,60 ĐC Pae

1,80 1,20 1,30 Pae

3,10 1,70 2,10 ĐC Pae

2,40 1,60 1,30 Pae

2,40 1,50 2,20 ĐC Pae

2,10 1,40 1,90 Pae

Đường kính tản nấm Trichoderma sp. (cm)

3 NSC 5 NSC 7 NSC

8,00 5,10 6,40 DC

4,80 4,00 4,10 Tricho

8,50 4,90 6,70 DC

5,90 4,70 5,10 Tricho

8,40 5,00 6,50 DC

6,00 4,60 5,20 Tricho

B.4. MẬT ĐỘ BÀO TỬ NẤM PAECILOMYCES SP. TRÊN MÔI TRƯỜNG

LỎNG THEO LOGARIT

2 ngày 4 ngày 6 ngày 9 ngày

CDB 8,21 8,44 8,86 8,86

25

Đồ án tốt nghiệp

CMB 7,43 8,16 8,59 8,62

SDAY1 8,86 9,22 9,24 9,16

SDAY3 8,74 9,56 9,64 9,52

CDB 8,43 9,13 9,13 8,75

CMB 8,42 8,39 8,52 7,32

SDAY1 8,86 9,41 9,40 9,23

SDAY3 8,74 9,58 9,67 9,54

B.5. MẬT ĐỘ BÀO TỬ NẤM PAECILOMYCES SP. TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN

Gao 20260000000

Bap 28400000000

Lua 5640000000

Cam 2300000000

Gao 23300000000

Bap 41300000000

Lua 5270000000

Cam 2170000000

Gao 26700000000

Bap 39500000000

Lua 5600000000

Cam 1830000000

B.6. SỐ LƯỢNG TUYẾN TRÙNG CÁI LÂY NHIỄM NẤM PAECILOMYCES

SP.

Lần 1 Lần 3 Lần 2

1 ngày 2 3 4 3 2 3 3 4 3

2 ngày 5 4 4 6 4 3 6 4 4

26

Đồ án tốt nghiệp

3 ngày 6 5 3 4 3 7 5 7 3

4 ngày 8 6 5 7 8 8 6 5 4

C. HÌNH ẢNH

27

Đồ án tốt nghiệp

28

Đồ án tốt nghiệp

29