Sinh học phân tử Southern blot
www.themegallery.com
LOGO
Thực hiện: Đỗ Đức Anh Ng.Thị Điểm Ng.Phan Thị Hoàng Kim Hồng Vĩnh Thành Mai Hoàng Yến
N i dung seminar
ộ
I Giới thiệu về phương pháp Southern Blot
Khái niệm 1
II 2 Lai phân tử Các kiểu lai phân tử
3 Các yếu tố ảnh hưởng
1 Nguyên lí và điều kiện
Mẫu dò III Southern blot 2
3 Qui trình
IV Ứng dụng
LOGO
www.themegall
ery.com
i thi u chung v ph
ớ
ề
ươ
I. Gi -
ự ự
ượ ượ
ặ ủ ặ ủ
ộ ộ
ữ ữ
ng pháp cho phép xác đ nh đ ng pháp cho phép xác đ nh đ ự ự
ng pháp Southern blot. c s có m t c a ị c s có m t c a ị nucleotide trên m t đo n ADN nào đó, trong ạ nucleotide trên m t đo n ADN nào đó, trong ạ
ỗ ỗ
ạ ạ
-
i đ i h c
ấ
ề
ạ ạ ọ
-
ậ ề ả
ượ
ủ
ố
ờ nh : ư ử t gen. ế
• • •
acid nucleotide lên màng lai
ử
ệ Đây là ph ươ Đây là ph ươ nh ng trình t nh ng trình t h n h p các đo n ADN khác nhau ợ h n h p các đo n ADN khác nhau ợ Do E.M.Southern đ xu t vào năm 1975, t Edingburd. Đ c tri n khai nh 1 s kĩ thu t n n t ng c a công ngh ệ ể sinh h c phân t ọ Tách chi PCR Th m tích các phân t ẩ (blot). Lai phân t
( lai v i m u dò đ c hi u)
ử
ệ
ẫ
ặ
ớ
• • …
Southern blot
LOGO
www.themegall
ery.com
II. Lai phân tử
ạ i v i nhau ệ , k t h p v i đi u ki n thí nghi m thích ệ
ng 2 m ch DNA sau khi đã tách r i, s ẽ ờ t đ đ c làm ệ ộ ượ ệ
đi u ki n nhi ở ề ề ớ
ừ ừ ế ợ
ể
– Đ c hi u tuy t đ i: s b t c p ch x y ra
ự ắ ặ
ỉ ả
ệ gi a 2 trình t
1. Khái ni mệ Là hi n t ệ ượ k t h p l ế ợ ạ ớ t gi m t ả h p.ợ Đ c đi m: ặ ặ ữ
– Các trình t
ổ ể
ệ ố hoàn toàn b sung cho nhau. ự b sung có th là DNA hay RNA ự ổ lai
DNA-DNA, RNA-RNA, các phân t
ử
pt ử DNA-RNA
LOGO
www.themegall
ery.com
Southern blot
Các kiểu lai phân tử
Lai tại chỗ
Lai trong pha lỏng
Lai trên pha rắn
LOGO
www.themegall
ery.com
LAI TRÊN PHA RẮN
Nguyên tắc
-1 trình tự bổ sung. 1 trình tự cần biết được gắn trên gía thể
Sự lai phân tử xảy ra do: Chuyển động nhiệt. Nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ
LOGO
www.themegall
ery.com
Màng nylon được sử dụng phổ biến:
CÁC YẾU TỐ KĨ THUẬT TRONG LAI TRÊN PHA RẮN
Màng Nitrocellulose: được sử dụng đầu tiên, nay ít dùng, do:
Có thể tiếp nhận 500µg/cm2.
giữ DNA chắc hơn.
Ít đứt gãy
Độ bền cơ học kémkhó thao tác. Không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lai với một mẫu dò khác.
Cho phép lai nhiều lần với mẫu dò khác nhau
LOGO
www.themegall
ery.com
Diagram
Lai trên màng rắn
Southern blot
Thuận lợi:
Khó khăn:
Dễ dàng trong thao tác. Dễ dàng tách trình tự không lai ra khỏi phân tử lai. Ngăn cản sự tái bắt cặp giữa 2 mạch đơn của cùng một phân tử.
Định lượng phân tử kém chính xác Hiệu quả lai thấp (vận tốc lai chậm đi 10 lần so với vận tốc lai trên pha lỏng).
LOGO
www.themegall
ery.com
III. PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT
Diagram
Nguyên lí Nguyên lí
- dựa trên nguyên tắc biến tính và hồi tính của phân tử DNA
- Dựa vào nguyên tắc bổ sung giữa các cặp mucleotide: AT, GC (các đoạn polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung)
LOGO
www.themegall
ery.com
Phản ứng lai cần nhiệt độ cao hoặc hóa chất gây biến tính DNA (NaOH, Formaldehyt).
Southern blot
Nguyên tắc
Đòi hỏi một đoạn DNA (RNA) đã biết được sử dụng làm mồi “Probe” được đánh dấu
Các vật liệu, trang thiết bị máy móc chính xác: màng lai, máy Blotting, buồng lai, máy PCR
LOGO
www.themegall
ery.com
TẠO MẪU DÒ
Diagram
Tạo mẫu dò nhờ Plasmid
Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR Thiết lập mồi và đánh dấu phóng xạ vào các mồi. Biến tính mẫu ADN thành các sợi đơn. Gắn mồi vào các sợi đơn. Tổng hợp các sợi ADN mới. Biến tính để tách chuỗi mới vừa tổng hợp thành các sợi đơn. Tiếp tục quay về gắn mồi vào các sợi đơn.
Cắt Plasmid và ADN đã tách chiết từ tế bào bởi cùng một loại Enzym. Gắn ADN vào Plasmid trong điều kiện môi trường phù hợp. Thực hiện biến nạp vào trong tế bào vi khuẩn. Nhân các tế bào vi khuẩn và chọn lọc. Tách plasmid từ các tế bào chọn lọc. Tách mẫu dò (đoạn ADN). Đánh dấu mẫu dò
LOGO
www.themegall
ery.com
đồng vị phóng xạ (P32)
…
Phát quang sinh học
Southern blot
Đánh dấu probe
Kéo dài mồi
Enzyme polynucleotide kinase
Phương pháp hóa học
LOGO
www.themegall
ery.com
ĐÁNH DẤU ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ DNA dùng để tạo mẫu dò DNA dùng để tạo mẫu dò
Tạo ra các vết khía sau đó bổ xung các Tạo ra các vết khía sau đó bổ xung các nucleotide tự do trong đó có các nucleotide, nucleotide tự do trong đó có các nucleotide, đã được đánh dấu phóng xạ. đã được đánh dấu phóng xạ.
DNA polymerase I được cho vào ống và DNA polymerase I được cho vào ống và bám vào các vết cắt. bám vào các vết cắt.
Polymerase bắt đầu sửa chữa DNA theo chiều 5' 3'.
DNA này sau đó được bằng nhiệt độ DNA này sau đó được bằng nhiệt độ làm biến tính sợi kép thành hai sợi đơn. làm biến tính sợi kép thành hai sợi đơn.
LOGO
www.themegall
ery.com
ĐÁNH DẤU BẰNG PHÁT QUANG SINH HỌC
c đánh d u b ng enzyme ằ
ấ
- M u dò đ ẫ
ượ peroxidase.
c
ẫ
ớ
ượ
ấ
ọ
ơ
ị ế c in trên phim
thu nh n đ
- Sau khi cho màng lai ti p xúc v i m u dò (đ ế đánh d u phát quang sinh h c), c ch t c a ấ ủ perpxidase b bi n đ i, ánh sáng phát ra s ẽ ổ c k t qu đ ả ế
ượ
ượ
ậ
LOGO
www.themegall
ery.com
QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT
Giai đoạn 3
Giai đoạn 2
Giai đoạn 1
Chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai
Lai với probe và kiểm tra bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi
Tách chiết và làm biến tính DNA thành các sợi đơn
LOGO
www.themegall
ery.com
LOGO
www.themegall
ery.com
LOGO
www.themegall
ery.com
Giai đo n 1ạ
Tách chiết DNA cần nghiên cứu
Cắt DNA nghiên cứu bằng enzyme cắt giới hạn
Tiến hành điện di hỗn hợp DNA vừa được cắt, trên gel agarose
Làm biến tính các dải băng DNA trên gel agarpose dd NAOH 0,4M thành các sợi đơn
LOGO
www.themegall
ery.com
LOGO
www.themegall
ery.com
GIAI ĐOẠN II
c s d ng là màng nitocellulose ho c
ượ ử ụ
ặ
- Màng đ
màng nylon.
• Đ m t ệ
ắ c th m m t cách t ộ
ừ
ự phía d ể
ừ
ng
- Nguyên t c: ắ d a vào nguyên t c mao d n ẫ nhiên lên i đ ự ướ ượ gel lên màng và bám ả ươ ể ự ờ
ặ
ấ trên chuy n các m nh DNA t ch t vào màng ( th i gian chuy n d a vào các ph pháp chuy n khác nhau).
ể
- Cách ti n hành: ế ặ ặ
ể ể
ể ể
ể ể
ẹ ẹ
ế ế
c đ nh các đo n ADN đ c đ nh các đo n ADN đ
c chuy n c chuy n
ể ể ẽ ữ ố ị ẽ ữ ố ị
ượ ượ
ạ ạ
ể ể
• Đ t gel lên giá chuy n máy Blotting đ chuy n Đ t gel lên giá chuy n máy Blotting đ chuy n nguyên v n các s i ADN bi n tính. ợ nguyên v n các s i ADN bi n tính. ợ • dung d ch d n chuy n là NaOH 0,4M. dung d ch d n chuy n là NaOH 0,4M. ẫ ị ẫ ị • màng lai s gi màng lai s gi gel đi n di lên t ệ ừ gel đi n di lên t ừ ệ
LOGO
www.themegall
ery.com
Máy bloting
LOGO
www.themegall
ery.com
LOGO
www.themegall
ery.com
GIAI ĐOẠN III
DNA có định trên màng lai kết hợp với probe(đã được đánh dấu) theo nguyen tắc bổ sung
Rửa và loại bỏ mẫu không tham gia phản ứng lai trên màng lai
Phát hiện vị trí lai nhờ phóng xạ tự ghi
Đặt phim lên tấm lọc
Tráng phim để thu các vạch đen tại nơi phát xạ
LOGO
www.themegall
ery.com
LAI VỚI MẪU DÒ KẾT QUẢ
LOGO
www.themegall
ery.com
LOGO
www.themegall
ery.com
LAI TRÊN MÀNG ĐẶT PHIM LÊN TẤM LỌC TRÁNG PHIM
LOGO
www.themegall
ery.com
ứng dụng southern blot ứng dụng southern blot
KĨ THUẬT RFLP
Nghiên cứu mối quan hệ họ hàng của nhiều nhóm loài thực vật, động vật. Phát hiện sự có mặt của gen cần tìm trong hệ genome sinh vật nghiên cứu Phát hiện sự đa dạng DNA qua các cá thể khác nhau của 1 loài Phát hiện các thể đột biến gen.
LOGO
www.themegall
ery.com
Kĩ thuật RFLP
là kĩ thuật phân tích sự đa hình VỀ CHIỀU DÀI, của các mảnh DNA bị cắt đoạn.
Nguyên lí:
Dựa trên sự sai khác của phổ băng điện di và độ dài của các phân đoạn bị cắt bởi RE. Số lượng đoạn cắt khác nhau được phân biệt bằng điện di đồ nên còn được gọi là dấu vân tay (finger printing) đặc trưng cho từng phân tử DNA.
LOGO
www.themegall
ery.com
Các b
c ti n hành:
Kỹ thuật RFLP ế
ướ
Tách chiết và tinh sạch DNA. Cắt các mẫu DNA bằng một cặp RE Điện di sản phẩm DNA sau khi đã xử lí Làm biến tính DNA bằng nhiệt độ cao. Chuyển lên màng lai nitrocellulose, hoặc màng
nilon
Ủ màng lai với mẫu dò đã đánh dấu bằng P32. Rửa màng lai Hiển thị bằng phim phóng xạ tự ghi.
LOGO
www.themegall
ery.com
LOGO
www.themegall
ery.com
LOGO
www.themegall
ery.com
DNA FINGERPRINTING
LOGO
www.themegall
ery.com
SO SÁNH 2 MẪU TÌM RA THỦ PHẠM
LOGO
www.themegall
ery.com
Tài liệu tham khảo
ị
ọ
ậ
ệ
. NXB
ồ
ọ
ử
ậ
ổ
ẻ
ọ
- Tr nh Đình Đ t. Công ngh sinh h c. T p 4. ạ NXB Giáo d c .ụ - H Huỳnh Thuỳ D ng. Sinh h c phân t ươ Giáo d c.ụ - Ph m Thành H . 2005. Nh p môn CNSH. NXB ạ Giáo d c.ụ - Di n dàn nhà sinh h c tr : nhasinhhoctre.com ễ - youtube.com - báck khoa toàn th m : vi.wikipedia.org
ư ở
LOGO
www.themegall
ery.com
Click to edit subtitle style
www.themegallery.com
