Tách chiết và tinh sạch Protein hiệu quả nhất

e



Các phng pháp chit rút tinh sch và xác nh protein

I. Khái nim

Trong các t chc ca c th sng, protein có th  dưi dng t do trong các dch

sinh vt hoc dưi dng kt hp, hoc b cm trong các t bào. Hn na, trong t

bào có cha hàng nghìn loi protein khác nhau, nu ta cn nghiên cu tng loi

protein, trưc ht phi chit rút và tinh sch chúng. Chính vì vy, các k thut chit

rút, tinh sch và nghiên cu protein luôn  v trí trung tâm ca các nghiên cu hóa

sinh và luôn ưc cp nht và hin i hóa.

II. Các bin pháp cn thit  nhn protein nguyên th

Các phưng pháp chit rút và tinh sch protein u da trên nhng tính cht hóa lý

ca protein như  tích in, kích thưc phân t,  hòa tan... ca protein cn chit

rút. Nhiu protein còn liên kt vi các phân t sinh hc khác nên vic chit rút các

protein này còn ph thuc vào bn cht ca các liên kt.

Mun thu nhn ưc các protein nguyên th tc là protein có tt c tính cht t

nhiên c trưng ca nó, cn s dng các bin pháp khác nhau.

2.1. Nhit 

 tách các protein khác nhau da trên kt ta ca chúng, ngưi ta có th s dng

phưng pháp bin tính chn lc nh tác dng ca nhit. Mt iu cn lưu ý là ch

nên dùng i vi trưng hp các protein enzyme bn vi nhit. Dch protein

enzyme ưc gi  50 - 700C trong thi gian xác nh, sau ó

protein tp ã b bin tính ưc loi b! b"ng cách lc hoc ly tâm. Như vy, dch

chit protein thô bn vi nhit có th ưc thu nhn b"ng cách cho kt ta không

thun nghch phn ln các protein tp.

 thu nhn ch ph#m protein theo phưng pháp kt ta thun nghch b"ng các

mui trung tính, cn tin hành  nhit  thp, i vi dung môi hu c cn tin

hành  nhit  dưi 00C tránh bin tính c bit là protein

enzyme.

2.2. Nng  proton (pH)

Protein là các cht lư$ng tính, vì vy, trong các dung dch acid và kim chúng s% b

phân ly như sau:

<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office"

/><o:p></o:p>

<?xml:namespace prefix = v ns = "urn:schemas-microsoft-com:vml"

/><v:shapetype id=_x0000_t75 stroked="f" filled="f"

path="m@4@5l@4@11@9@11@9@5xe" o:preferrelative="t" o:spt="75"

coordsize="21600,21600"><v:stroke

joinstyle="miter"></v:stroke><v:formulas><v:f eqn="if lineDrawn

pixelLineWidth 0"></v:f><v:f eqn="sum @0 1 0"></v:f><v:f eqn="sum 0 0

@1"></v:f><v:f eqn="prod @2 1 2"></v:f><v:f eqn="prod @3 21600

pixelWidth"></v:f><v:f eqn="prod @3 21600 pixelHeight"></v:f><v:f eqn="sum

@0 0 1"></v:f><v:f eqn="prod @6 1 2"></v:f><v:f eqn="prod @7 21600

pixelWidth"></v:f><v:f eqn="sum @8 21600 0"></v:f><v:f eqn="prod @7 21600

pixelHeight"></v:f><v:f eqn="sum @10 21600 0"></v:f></v:formulas><v:path

o:connecttype="rect" gradientshapeok="t" o:extrusionok="f"></v:path><o:lock

aspectratio="t" v:ext="edit"></o:lock></v:shapetype><v:shape id=_x0000_i1025

&'()*+,-./01234567'8319.:1023;<7',3=)'+,0>?@A3BC('3D=3E@3DF3'A3GAH@I3AJ3

tr hin th hình này." type="#_x0000_t75"><v:imagedata

o:href="http://mail.google.com/mail/?name=fc223c3299645a16.jpg&attid=0.3&di

sp=vahi&vie w=att&th=11d94e949413c887"

src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_

image001.jpg"></v:imagedata></v:shape><o:p></o:p>

Do các acid amin trong chuJi polypeptide còn tKn ti nhiu nhóm chc t do dưi

dng các ion hóa là nguyên nhân to ra tính a in ca protein. Phân t protein rt

dài nên nhóm ion t do tn cùng ca chuJi polypeptide không áng k, ch yu các

nhóm chc t do khác ca chuJi bên (R) quyt nh tính cht tích in ca phân t

protein (nhóm cacboxyl ca amino acid, OH ca Tyrosine, ε - NH2

ca lysine, guamidin ca Arginine, inidazol ca histidine)

Mc  ion hóa ca các nhóm này ph thuc vào giá tr pH. Các nhóm acid  dng

anion trong môi trưng kim, các nhóm kim tKn ti  dng cation trong môi

trưng acid.

Như vy,  mt giá tr pH xác nh, mJi phân t protein có mt in tích tng s

nào y mà  ln ca nó ph thuc vào s lưng các nhóm tích in dưng và

tích in âm. Kt qu là  giá tr nKng  ion hydro c nh, các protein khác nhau

trong hJn hp s% có tng in tích khác nhau. Nhiu phưng pháp dùng  tách các

hJn hp protein u da vào c tính này. Các phân t protein mang in tích tng

s (dưng hoc âm) cùng du #y nhau ra xa nên dL tan vào dung dch. MJi mt

protein có mt giá tr pH nht nh mà  ó tng s in tích âm và in tích

dưng trong phân t b"ng không. Giá tr ó gi là im Mng in ca protein.

im Mng in ca các acid amin trung tính có giá tr pH t 5,6 - 7,0; i vi các

acid amin có tính acid (dicarboxylic) là t 3,0 - 3,2; i vi các acid amin có tính

kim (diamino) là t 9,7 - 10,8. N im Mng in,  hòa tan ca protein là thp

nht, protein dL b kt ta. Da vào tính cht này, ngưi ta có th tách tng phn

các protein enzyme trong hJn hp.

COng ging như trưng hp tác dng ca nhit  trong vic tách chit protein, có

th dùng phưng pháp bin tính chn lc nh tác dng ca pH ca môi trưng.

Dch protein enzyme ưc gi  pH ≤ 5 trong thi gian xác nh. Protein tp b

bin tính cOng ưc loi b! b"ng cách lc hoc ly tâm. Ví d citochrom C cOng tan

trong acid trichloracetic trong khi ó acid này làm kt ta phn ln protein. Như

vy các protein bn vi acid có th ưc tách chit b"ng cách này.

2.3. Tác nhân hóa hc

Có th dùng mui trung tính hoc các dung môi hu c  tách chit các protein

enzyme. Phưng pháp này ưc tin hành da trn c s:  hòa tan ca protein

ph thuc vào s tưng tác ca các nhóm tích in trong phân t protein vi các

phân t nưc. S tưng tác ó (còn gi là s hydrate hóa) s% b gim xung khi

thêm vào dung dch protein enzyme các dung môi hu c hoc các mui trung

tính. Dung môi hu c thưng dùng là etanol, isopropanol, acetone hoc hJn hp

các loi rưu.

Khi s dng các dung môi hu c, cn chú ý tin hành  nhit  thp (t

50C tr xung). Dùng dung môi hu c có th tin hành tách phân

on dưi 00C và có th n -200C, như vy có tác

dng tt n  n nh ca protein enzyme.

Khi ã có kt ta, chú ý ly nhanh kt ta ra kh!i dung môi b"ng cách dùng máy ly

tâm lnh.

Các mui trung tính có th dùng là

(NH4)2SO4,

Na2SO4, MgSO4... Tuy nhiên,

ngưi ta ã nhn thy mui

(NH4)2SO4 là tt nht vì nó

không làm hi mà làm n nh (làm bn) hu ht các loi protein enzyme. Loi

mui này li r% tin và ph bin.  hòa tan ca nó li rt ln (bo hòa 767g/l 

250C)

Ngoài ra nKng  (NH4)2SO4 cn

thit  kt ta protein enzyme khác nhau thì khác nhau nhiu.

Ví d: Protease ca nm mc dL b kt ta  70% ca

(NH4)2SO4 bo hòa hoàn toàn,

còn amilase ca mm lúa b kt ta  50%  bo hòa ca dung dch mui này.

iu ó nói lên tính kt ta la chn ca

(NH4)2SO4 cao hn các mui

khác.

Có th dùng (NH4)2SO4  c 2

dng: dng bt và dng dung dch bo hòa. Khi dùng bt, ngưi ta cho tng ít mt

vào dch chit protein enzyme. Cách cho cOng nh hưng ln n lưng kt ta

ban u ca protein enzyme. Khi cho mui vào dch chit cn phi có máy khuy

t  m bo s hòa tan ca mui. Khi dùng dung dch bo hòa, trong nhiu sách

v phưng pháp nghiên cu, ngưi ta ưa ra bng tính s lưng mui cn thit 

pha các dung dch có  bão hòa khác nhau  nhng nhit  nht nh.

Khái nim v s phn trPm ca  bo hòa hoàn toàn ã ưc  cp n. Như ví

d trên thì protein enzyme có th b kt ta  50% (0,5) hoc 70% (0,7) ca  bão

hòa hoàn toàn ca (NH4)2SO4.

Khi cho dung dch (NH4)2SO4

bão hòa vào dch chit protein enzyme thì nKng 

(NH4)2SO4 không tPng t ngt.

Sau khi kt ta xong ngưi ta thưng  lQng khong 2 gi hoc qua êm, mc

ích là to kt ta hoàn toàn ( phưng pháp dùng dung môi hu c thì không cn

 lâu). Kt ta ưc ly ra b"ng cách ly tâm hoc lc qua phLu Buchner. Khi hòa

tan kt ta li ngưi ta thưng thêm ion Ca++  làm bn protein

enzyme (dùng CaCl2 hoc Ca(CH3

COO)2

 tin li, ngưi ta ưa ra công thc cách tính lưng

(NH4)2SO4 cho vào dch có 

bão hòa cho trưc (S1)  t n mt  bão hòa cn thit

(S2)

Tùy theo trng thái (NH4)2SO4

cho thêm vào dch chit protein enzyme mà có công thc tính toán khác nhau.

- i vi (NH4)2SO4  dng bt

x(g) = 

 !"#$%&'()*+,&)-./0&12$3

.&4%&&567891

o$;<<91oo1)o9<9<=&9"+7;7#++

>1?"??@?A#A#A#")7

$);<<<BCDBEF GC$$CHDBIHJGC9C9o9C

C)91>18<918<8

Trong ó V là th tích dung dch, S1, S2 là  bão

hòa cho trưc và  bão hòa cn t (ví d: S1 = 0,5;

S2 = 0,7 chMng hn).

Ngưi ta cOng có th dùng bn K toán (nomogram)  chiu và xác nh ưc

lưng (NH4)2SO4 thêm vào 

dch chit protein enzyme t ưc mt  bão hòa nht nh. Hoc có th i

chiu  bng có sRn. Lưng

(NH4)2SO4 ưa vào  dung dch

có  bão hòa nht nh có khác nhau tùy theo nhit  thí nghim.

- i vi (NH4)2SO4  dng dung

dch bão hòa.

Th tích (tính theo ml) ca dung dch bão hòa cn cho vào 100ml dung dch có 

bão hòa ban u S1  t n mt  bão hòa S2

cn thit ưc tính theo công thc sau:

V(ml) = 7

 !"$%&'()*+,&)-./0&12$3

.&4%&&567891

o$;<<91oo1)o9<9<=&9AA)A;

>1?"??@?A#A#A#")7

$);<<<BCDBEF GC$$CHDBIHJGC9C9o9C

C)91">18<918<8

Như vy, nu thêm tng phn các dung môi hu c hoc tng phn mui

(NH4)2SO4 (có nKng  bão hòa

khác nhau) thì ta có th tách tng phn hJn hp protein enzyme. Tuy nhiên, 

phân chia hoàn toàn nhng hJn hp phc tp, phưng pháp này không cho kt qu

tt vì  hòa tan ca mt s protein b tPng lên. Mc du vy, cách kt ta tng

phn này cOng rt có li, c bit là i vi giai on u ca vic tách chit và

làm sch protein emzyme, vì phưng pháp khá n gin.

Ngoài ra, các tác ng khác như c hc, sóng siêu âm... có nh hưng n quá

trình tách chit protein emzyme.

III. Phá v t bào và chit rút protein

3.1. Phá v t bào

Protein enzyme có trong tt c các c th ng vt, thc vt và vi sinh vt. Sau khi

ưc tng hp nó có th ưc tit ra ngoài t bào tKn ti trong các dch c th, dch

môi trưng (gi là protein enzyme ngoi bào) hoc ưc gi li bên trong t bào

(protein enzyme ni bào). Các protein enzyme ni bào có th tKn ti  dng hòa tan

trong t bào cht và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v...) ca t

bào. T bào ưc bao bc b"ng mt lp màng.Lp màng này  vi khu#n ôi khi rt

bn và dày. Ngưi ta còn thy nhiu protein enzyme liên kt rt cht ch% vi các

bào quan ca t bào. Các phân t protein enzyme không có kh nPng i qua màng

ca t bào và màng ca các bào quan ca t bào. Do ó  có th chit rút các

protein enzyme ni bào, bưc u tiên là phi phá v$ cu trúc ca các t bào có

cha protein enzyme và chuyn chúng vào dung dch.

Có th phá v$ cu trúc ca t bào b"ng các bin pháp c hc như nghin vi bt

thy tinh hoc cát thch anh, làm Kng hóa b"ng thit b nghiên Kng th

(homogenizator). Thit b này có chày thy tinh gQn vi mt môt quay và có th

iu ch nh ưc tc  quay theo yêu cu. Các t bào gia chày thùy tinh và thành

ci s% b phá hy.

 vic phá v$ có hiu qu,  mô thc vt, trưc khi nghin, ngưi ta thưng thái

nh! mSu  vào ngPn á hoc cho trưng nưc. (ví d như i vi mSu ht khô).

Còn  các mô ca ng vt như gan hoc thn, khi chit protein enzyme ngưi ta

cn cQt b! các mô liên kt.

Mun tách ưc các protein trong các cu t ca t bào, ngưi ta còn phi dùng

Tách chiết và tinh sạch Protein

Chủ đề:

Tài liệu liên quan

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Hỗ trợ

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi