Thử nghiệm LAL phát hiện Endotoxin (limulus amebocytes lysate)

Chia sẻ: Lê Thị Thảo | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Thêm vào BST

Báo xấu

195
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thử nghiệm LAL phát hiện Endotoxin (limulus amebocytes lysate) nhằm giúp các bạn hiểu được nguyên tắc của thử nghiệm LAL phát hiện endotoxin và các chỉ định áp dụng để có thể đưa vào thành một phương tiện chẩn đoán vi sinh lâm sàng giúp chẩn đoán phát hiện nhanh nhiễm trùng trong một số trường hợp cần thiết; làm được thử nghiệm LAL định tính và định lượng một cách chính xác, không sơ sót... Mời các bạn tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thử nghiệm LAL phát hiện Endotoxin (limulus amebocytes lysate)

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau THÖÛ NGHIEÄM LAL PHAÙT HIEÄN ENDOTOXIN (limulus amebocytes lysate) Muïc tieâu · Hieåu ñöôïc nguyeân taéc cuûa thöû nghieäm LAL phaùt hieän endotoxin vaø caùc chæ ñònh aùp duïng ñeå coù theå ñöa vaøo thaønh moät phöông tieän chaån ñoaùn vi sinh laâm saøng giuùp chaån ñoaùn phaùt hieän nhanh nhieãm truøng trong moät soá tröôøng hôïp caàn thieát. · Thöïc hieän ñöôïc xeùt nghieäm LAL vôùi keát quaû chính xaùc khoâng bò aâm tính hay döông tính giaû nhôø bieát ñöôïc caùc ñoøi hoûi ñaëc bieät veà vaät lieäu khi tieán haønh laáy, chöùa beänh phaåm, cuõng nhö khi tieán haønh laøm xeùt nghieäm. · Laøm ñöôïc thöû nghieäm LAL ñònh tính vaø ñònh löôïng moät caùch chính xaùc, khoâng sô soùt. Nguyeân taéc Endotoxin laø lipopolysaccharide coù nguoàn goác töø vaùch teá baøo cuûa vi khuaån Gram [-], coù moät tính chaát raát ñaëc tröng laø ly giaûi teá baøo amebocyte tuaàn hoaøn trong maùu con sam (horseshoes = Limulus polyphemus). Dòch ly giaûi amebocytes seõ bò ñuïc ñi cuõng nhö bò ñoâng laïi thaønh gel do ñoä nhôùt bò gia taêng, vaø ñoä ñuïc cuõng nhö ñoä ñoâng cöùng seõ tuøy thuoäc vaøo löôïng endotoxin coù trong maãu thöû. Cô cheá cuûa hieän töôïng naøy thaät ra chöa roõ, coù theå gioáng nhö hieän töôïng ñoâng maùu ôû ngöôøi trong ñoù coù hai quaù trình xaõy ra: (1) Endotoxin vôùi söï hieän dieän cuûa ion calcium kích hoaït moät heä thoáng men tieàn ñoâng gioáng trypsin. (2) Heä thoáng men bò kích hoaït naày seõ laøm bieán ñoåi chaát gaây ñoâng (coagulogen) baèng moät quaù trình ly giaûi protein coù giôùi haïn ñeå saûn sinh ra caùc protein coù theå ñoâng ñaëc ñöôïc. Ñeå ñoïc ñöôïc keát quaû cuûa thöû nghieäm LAL, coù theå coù hai phöông phaùp: 1. Phöông phaùp phaùt hieän dung dòch thöû nghieäm bò taêng ñoä nhôùt, keát quaû laø ñoä ñuïc taêng leân vaø bò ñoâng ñaëc laïi (ñoïc baèng maét thöôøng, hay ñoïc baèng maùy ño ñoä ñuïc) 2. Phöông phaùp sinh maøu döïa treân nguyeân taéc protein bò ly giaûi seõ laøm moät protein khaùc (coù maõ soá S-2423) trong dung dòch sinh maøu sinh ra maøu, ñoä ñaäm nhaït cuûa maøu seõ tuøy 136
Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau thuoäc vaøo haøm löôïng endotoxin thöû nghieäm vaø chính nhôø vaäy coù theå ñònh löôïng ñöôïc endotoxin. Chæ ñònh aùp duïng Thöû nghieäm LAL ñöôïc chæ ñònh ñeå phaùt hieän vaø ñònh löôïng endotoxin trong caùc maãu dòch truyeàn hay thuoác tieâm trong saûn xuaát döôïc phaåm vì coù ñoä nhaïy cao hôn thöû nghieäm phaùt hieän chí nhieät toá thöïc hieän treân thoû. Thöû nghieäm LAL cuõng coù theå aùp duïng taïi caùc phoøng thí nghieäm vi sinh laâm saøng ñeå phaùt hieän moät caùch giaùn tieáp nhieãm truøng vi khuaån Gram [-] trong caùc dòch khoâng taïp nhieãm cuûa cô theå nhö : Dòch naõo tuyû, dòch maøng phoåi, dòch maät, dòch oå buïng. Phöông phaùp coù lôïi ñieåm laø coù keát quaû nhanh chæ vaøi giôø sau khi göûi maãi ñi laøm xeùt nghieäm. Tuy nhieân phöông phaùp naøy khoâng theå thay theá nuoâi caáy vì khoâng cho bieát vi khuaån gaây nhieãm truøng laø vi khuaån gì, vaø khoâng theå cho bieát ñöôïc keát quaû khaùng sinh ñoà. Ñeå coù theå coù keát quûa khoâng bò döông tính giaû vì maãu bò taïp nhieãm endotoxin trong laáy vaø chöùa maãu, caùc vaät lieäu duøng ñeå laáy vaø chöùa maãu phaûi thaät söï tinh saïch vaø khoâng coù endotoxin. Toát nhaát laø duøng caùc vaät lieäu baèng nhöïa polystyrene voâ truøng baèng gamma ñeå chöùa maãu (loï voâ truøng naép ñoû cuûa coâng ty Nam Khoa), vaø laáy maãu baèng oáng chích thuyû tinh voâ truøng (ñaõ xöû lyù nhö höôùng daãn ôû muïc tieáp theo). Ñeå keát quaû khoâng bò aâm tính giaû thì caùc vaät lieäu ñeå laáy vaø chöùa maãu cuõng khoâng coù ñaëc tính haáp phuï endotoxin, nghóa laø chuùng ta phaûi traùnh duøng caùc vaät lieäu baèng nhöïa polypropylene (nhöïa PP). Chuaån bò vaät lieäu Vaät lieäu thuûy tinh Toát nhaát laø neân duøng caùc vaät lieäu thuûy tinh môùi. Vôùi caùc vaät lieäu thuûy tinh môùi, caàn boïc giaáy nhoâm roài haáp khöû truøng 121oC trong 1 giôø, sau ñoù saáy khoâ 175oC trong 3 giôø. Vôùi caùc vaät lieäu thuûy tinh ñaõ duøng roài, caàn phaûi ngaâm trong dung dòch 1% taåy kieàm, vd dung dòch 1% E-TOXA-CLEANâ cuûa Sigma (Catalog No. 210-3), thôøi gian ngaâm toát nhaát laø qua ñeâm. Khi ngaâm coù theå duøng choåi ñeå chaø saïch. Sau khi ngaâm röûa 8-10 laàn döôùi voøi nöôùc noùng ñang chaûy, sau ñoù röûa 5 laàn döôùi voøi nöôùc caát hay nöôùc khöû ion. Cuoái cuøng traùng laïi moät laàn vôùi nöôùc ñaõ khöû endotoxin. Saáy khoâ duïng cuï trong tuû saáy, sau ñoù boïc giaáy nhoâm roài khöû truøng gioáng nhö treân. 137
Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Vaät lieäu nhöïa Chæ duøng caùc vaät lieäu nhöïa voâ truøng, khoâng nhieãm endotoxin ñeå pha caùc thuoác thöû. Chæ duøng moät laàn, khoâng duøng laïi. ÔÛ ñaây chuùng toâi khuyeân duøng caùc pipette Pasteur nhöïa voâ truøng, caùc ñaàu type nhöïa voâ truøng duøng trong caùc phoøng thí nghieäm thao taùc voâ truøng. Rieâng vaät lieäu duøng pha gam chuaån endotoxin hay pha beänh phaåm thì caàn phaûi baèng polystyrene chöù khoâng theå baèng polypropylene vì polypropylene haáp phuï ñöôïc endotoxin. ÔÛ ñaây chuùng toâi khuyeân duøng caùc pipette voâ truøng coù chia ñoä, baèng polystyrene, voâ truøng (loaïi ñoùng goùi rieâng leõ, duøng moät laàn ). Tieán haønh thöû nghieäm ÔÛ ñaây trình baøy phöông phaùp thöû nghieäm duøng thuoác thöû E-toxate cuûa Sigma. Phöông phaùp naøy coù theå duøng vôùi soá löôïng maãu nhoû. Pha gam endotoxin chuaån Duøng micropipette vôùi tip voâ truøng vaø khoâng nhieãm endotoxin huùt moät theå tích nöôùc caát khoâng nhieãm endotoxin (Sigma, catalog No 210-7) cho vaøo chai chöùa endotoxin ñoâng khoâ (Sigma, catalog No 210-SE) ñeå ñaït noàng ñoä endotoxin 4000 EU/ml (n. ộ gốc). Vortex ñeå troän ñeàu trong voøng ít nhaát 2 phuùt. Sau ñoù vortex theâm 3 laàn trong voøng 30 phuùt (moãi laàn 30 giaây, nghó 10 phuùt). Sau khi ñaõ pha, dung dòch endotoxin chuaån naày ñöôïc giöõ trong tuû laïnh, beàn hôn 2 tuaàn neáu khoâng bò taïp nhieãm. Traùnh giöõ trong tuû ñoâng. Moãi laàn duøng thì phaûi vortex troän ñeàu nhö treân. Pha gam endotoxin chuaån trong tube polystyrene voâ truøng, khoâng nhieãm endotoxin, vaø coù naép ñaäy. Neáu khoâng coù tube polystyrene thì phaûi duøng caùc tube thuûy tinh ñaõ khöû truøng vaø khöû endotoxin. Pha nhö trình baøy trong baûng 6. Cöù moãi ñoä pha loaõng, caàn phaûi vortex khoaûng 30-60 giaây tröôùc khi pha moät ñoä pha loaõng keá. Baát cöù moät ñoä pha loaõng naøo neáu ñeå laâu quaù 30 phuùt thì phaûi vortex trôû laïi nhö treân tröôùc khi duøng. Endotoxin vôùi noàng ñoä töø 400 EU/ml trôû leân thì coù theå beàn ñeán hôn 1 tuaàn neáu giöõ trong tuû laïnh (khoâng giöõ ñoâng ñaù). 138
Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Baûng 6: Caùch pha dung dòch endotoxin chuaån Ống số Theå tích dung dòch Endotoxin ñöôïc laáy Nöôùckhoâng Nồng ñộ endotoxin endotoxin 1 0.2 ml n. ộ gốc 1.8 ml 400 EU 2 0.2 ml töø oáng 1 1.8 ml 40 EU 2 0.2 ml töø oáng 2 1.8 ml 4 EU 2 0.3 ml töø oáng 3 2.1 ml 0.5 EU 2 1 ml töø oáng 4 1 ml 0.25 EU 2 1 ml töø oáng 5 1 ml 0.125 EU 2 1 ml töø oáng 6 1 ml 0.06 EU 2 1 ml töø oáng 7 1 ml 0.03 EU 3 1 ml töø oáng 8 1 ml 0.015 EU Tieán haønh thöû nghieäm Tröôùc heát moãi maãu thöû nghieäm phaûi ñöôïc chænh pH ñaït töø 6-8 (thích hôïp nhaát laø 6.8 ñeán 7.5). Chænh pH vôùi dung dòch HCl 0.1M khoâng laãn endotoxin, vaø duøng giaáy thöû pH chöù khoâng duøng pH keá. Voå nheï chai chöùa E-TOXATE (Sigma, catalog No 210-20) xuoáng maët baøn ñeå E-TOXATE khoâng dính treân naép cao su. Duøng micropipette vôùi tip voâ truøng vaø khoâng nhieãm endotoxin huùt 2 ml nöôùc caát khoâng nhieãm endotoxin cho vaøo chai. Khoâng ñöôïc laéc maïnh, chæ laên troøn chai ñeå hoøa tan. Ngay sau khi hoøa tan, cho loï vaøo trong ñaù baøo. Phaân phoái vaøo caùc tube thuûy tinh voâ truøng ñaõ khöû endotoxin vaø coù ñaäy mieäng tube baèng giaáy nhoâm, moãi tube 0.1 ml. Caùc tube E-TOXATE naày phaûi luoân giöõ trong ñaù baøo. Dung dòch E-TOXATE ñaõ pha xong neân ñöôïc duøng ngay trong ngaøy. Caùc tube dung dòch E-TOXATE chöa duøng thì phaûi giöõ trong tuû ñoâng vaø khi ñoù ñoä nhaïy seõ giaûm ñi raát ít. Traùnh raõ ñoâng nhieàu laàn vì nhö vaäy thì ñoä nhaïy seõ giaûm ñi raát nhanh. Phöông phaùp ñònh löôïng: Ñoù laø tröôøng hôïp kieåm tra chaát löôïng phaùt hieän endotoxin trong thuoác tieâm, dòch truyeàn; moãi maãu thöû nghieäm rieâng leõ phaûi duøng 6 tube E-TOXATE ñaùnh 139
Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau soá töø 1 ñeán 6 vaø cho vaøo tube maãu thöû, chöùng [-], chöùng öùc cheá (ÖC), cuõng nhö caùc noàng ñoä endotoxin chuaån theo höôùng daãn trình baøy trong baûng 7. Phöông phaùp ñònh tính: Ñoù laø tröôøng hôïp phaùt hieän endotoxin trong caùc beänh phaåm nhö maùu, huyeát thanh, dòch naõo tuyû, dòch maät...ñeå tìm baèng chöùng sôùm phaùt nhieän coù vi khuaån Gram [-] trong maãu. Trong muïc ñích naøy, caùc maãu thöû phaûi laáy voâ truøng baèng caùc duïng cuï khoâng chöùa endotoxin vaø khoâng coù tính chaát haáp phuï endotoxin. Moãi maãu thöû nghieäm rieâng leõ phaûi duøng 4 tube E-TOXATE ñaùnh soá töø 1 ñeán 4 vaø cho vaøo tube maãu thöû, chöùng [-], chöùng [+], chöùng öùc cheá (ÖC) theo höôùng daãn trình baøy baûng 8. Sau ñoù, ñaäy mieäng tube laïi baèng giaáy nhoâm. UÛ ngay caùc tube trong maùy caùch thuûy 37oC, khoâng ñöôïc dao ñoäng oáng nghieäm trong suoát quaù trình uû vì nhö vaäy duø thöû nghieäm [+] thì dung dòch trong tube cuõng khoâng theå ñoâng laïi ñöôïc maø chæ taêng ñoä nhôùt maø thoâi. Baûng 7: Caùch chuaån bò caùc tube thöû nghieäm trong phöông phaùp ñònh löôïng Tube Ñeå phaùt hieän Maãu thöû Nöôùc khoâng endotoxin Endotoxin chuaån 1 Endotoxin 0 ml 0.1 ml ddòch 0.03 0.03 EU/ml EU/ml 2 Endotoxin 0.06 EU/ml 0 ml 0.1 ml ddòch 0.06 EU/ml 3 Endotoxin 0.125 EU/ml 0 ml 0.1 ml ddòch 0.125 EU/ml 4 Chöùng [-] 0 ml 0.1 ml 0.0 ml 5 Chöùng ÖC 0.1 ml 0.0 ml 0.01ml ddòch 4EU/ml 6 Endotoxin 0.1 ml 0.0 ml 0.0 ml maãu thöû 140
Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Baûng 8: Caùch chuaån bò caùc tube thöû nghieäm trong phöông phaùp ñònh tính Tube Ñeå phaùt hieän Maãu thöû Nöôùc khoâng endotoxin Endotoxin chuaån 1 Chöùng [+] 0 ml 0.1 ml ddòch 4 EU/ml 2 Chöùng [-] 0 ml 0.1 ml 0.0 ml 3 Chöùng ÖC 0.1 ml 0.0 ml 0.01ml ddòch 4 EU/ml 4 Endotoxin 0.1 ml 0.0 ml 0.0 ml maãu thöû Ñoïc keát quaû Sau khi uû 37oC trong moät giôø, caån thaän laáy töøng tube ra khoûi maùy caùch thuûy vaø nghieâng nheï töø töø ñeán moät goùc 180o, vöøa nghieâng vöøa quan saùt gel neáu ñaõ hình thaønh trong oáng nghieäm. Keát quaû ñöôïc ñoïc laø [+] khi dung dòch trong oáng hoaøn toaøn thaønh gel cöùng cho pheùp nghieâng hoaøn toaøn oáng nghieäm maø gel khoâng vôõ ra. Neáu khoâng coù gel cöùng thì keát quaû phaûi ñoïc laø [-]. Löu yù laø ñoäng taùc nghieâng oáng thöû nghieäm ñeå ñoïc keát quaû chæ laøm moät laàn vì neáu laøm laïi thì gel seõ bò vôõ ngay. Ñoái vôùi phöông phaùp ñònh löôïng, keát quaû ñònh löôïng bieän luaän nhö ví duï trình baøy trong baûng 9. Ñoái vôùi phöông phaùp ñònh tính, keát quaû maãu thöû coù endotoxin khi chöùng [+] cho keát quaû [+], chöùng [-] cho keát quaû [-], khoâng coù öùc cheá (keát quaû chöùng öùc cheá [+]), vaø maãu thöû cho keát quaû [+]. Maãu thöû khoâng coù endotoxin khi chöùng [+] cho keát quaû [+], chöùng [-] cho keát quaû [-], khoâng coù öùc cheá (chöùng öùc cheá [+]), vaø maãu thöû cho keát quaû [-]. Keát quaû khoâng ñoïc ñöôïc khi coù öùc cheá (töùc laø keát quaû chöùng öùc cheá laø [-]). Maãu coù keát quaû [+] laø maãu coù nhieãm vi khuaån Gram [-] vì endotoxin laø thaønh phaàn lipopolysaccharide cuûa vaùch vi khuaån Gram [-]. 141
Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Baûng 9: Caùch bieän luaän keát quaû trong phöông phaùp ñònh löôïng Tube Keát quaû Tube Keát quaû 1 [-] 1 [-] 2 [+] 2 [+] 3 [+] 3 [+] 4 [-] 4 [-] 5 [+] 5 [-] 6 [+] 6 [-] Maãu coù chöùa Maãu coù chöùa chaát endotoxin ³ 0.06 IU/ml öùc cheá thöû nghieäm Caâu hoûi oân taäp 1. Cho bieát nguyeân taéc cuûa thöû nghieäm LAL. 2. Cho bieát caùc aùp duïng cuûa thöû nghieäm LAL, ñaëc bieät laø trong xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng. 3. Ñeå coù theå coù keát quaû chính xaùc, haõy cho bieát caùc vaät lieäu duøng ñeå laáy vaø chöùa beänh phaåm phaûi ñaùp öùng ñöôïc caùc ñieàu kieän gì? Vaø muoán ñaùp öùng caùc ñieàu kieän naøy thì phaûi duøng caùc vaät lieäu gì? 4. Caùc vaät lieäu nhöïa vaø thuyû tinh duøng trong thí nghieäm LAL phaûi ñaùp öùng ñöôïc caùc ñieàu kieän gì? Vaø muoán ñaùp öùng caùc ñieàu kieän naøy thì phaûi duøng caùc vaät lieäu gì? 5. Haõy trình baøy caùch laøm moät thí nghieäm LAL vaø caùch ñoïc – phaân tích keát quaû. 142