Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio

Chia sẻ: Ngô Thị Thảo Ngân | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

140
lượt xem 35
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tài liệu Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio có nội dung giới thiệu về Vibrio, quy trình phân tích và nguyên tắc xác định, trường hợp cụ thể cho Vibrio parahaemolyticus và các nội dung khác.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio

Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Trang 1
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio 1. Giới thiệu chung Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Đặc điểm chung các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0.30.5 x 1.42.6 μm. Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh. Vibrio là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, di động, sống kị khí tuỳ ý, có các phản ứng catalase và oxidase (+), lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S, nhạy cảm với Vibriostaticum O/129. Trừ V. cholera hiện diện ở vùng nước ngọt, tất cả các loài Vibrio khác đều cần muối để tăng trưởng và thường xuyên được phân lập được từ các vùng nước ven biển. Giống này có 4 loài là tác nhân gây bệnh cho người gồm: V. cholera, V. parahaemolyticus, V.vulnificus, V. alginolyticus. Người ta đã xác định được 21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm: V. cholera, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus. Vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) là vi khuẩn hình cong dấu phẩy (do đó được gọi là phẩy khuẩn) không bắt mầu gram, không sinh nha bào, di động nhanh nhờ có một lông. Phẩy khuẩn tả dễ nuôi cấy trong môi trường nghèo dinh dưỡng, pH kiềm (pH từ 8,59,0) và mặn. Phẩy khuẩn tả có khoảng 140 nhóm huyết thanh đã được xác nhận, Trang 2
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio nhưng chỉ có nhóm huyết thanh O là gây được bệnh tả. Phẩy khuẩn tả được chia thành V. cholerae O1 và không O1 (Vibrio cholera không ngưng kết với O1 còn được gọi là chủng NAG). Vibrio cholerae gồm 2 tuýp sinh học (biotype) là vi khuẩn tả cổ điển và tả El Tor. Mỗi tuýp sinh học lại được chia thành các tuýp huyết thanh như Ogawa, Inaba và Hikojima. Phẩy khuẩn tả gây bệnh bằng độc tố ruột. Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng AMP vòng, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl và nước gây tiêu chảy cấp tính. Phẩy khuẩn tả có thể chuyển hóa trong thiên nhiên, thay đổi tính di truyền do đột biến từ chủng không gây dịch có thể thành chủng gây dịch và kháng nhiều loại kháng sinh. Phẩy khuẩn tả dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ (800C/5 phút), bởi hóa chất (Clo 1 mg/lít) và môi trường axit. Khô hanh, ánh nắng mặt trời cũng làm chết phẩy khuẩn tả. Nó có thể tồn tại lâu trong phân, đất ẩm, nước, thực phẩm. Trong đất, phẩy khuẩn có thể sống 60 ngày, trong phân 150 ngày, trên bề mặt thân thể 30 ngày, trong sữa 610 ngày, trên rau quả 78 ngày, trong nước 20 ngày. Nhiệt độ 250C 370C, nồng độ muối 0,5 đến 3%, độ pH kiềm (7 8,5) và giàu chất dinh dưỡng hữu cơ trong nước là những điều kiện tối ưu cho phẩy khuẩn tả tồn tại. Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae có khả năng gây bệnh đường ruột. Vibrio vulnificus có thể vào cơ thể thông qua vết thương hở hoặc do bệnh nhân uống nước biển chứa vi khuẩn. Triệu chứng nhiễm khuẩn thường xảy ra là nôn, sốt, tiêu chảy và hạ huyết áp. Những người có hệ miễn dịch hoạt động yếu như bệnh nhân ung thư, rối loạn thận, bệnh gan mạn tính, hoặc nhiễm HIV dễ có nguy cơ nhiễm vi khuẩn này. Trang 3
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio V. V. cholerae V. parahaemolyticus V. vulnificus alginolyticus Phản ứng oxidase (+) Phản ứng oxidase (+) Không lên Không lên Tăng trưởng được trong Phát triển được trong men sucrose men sucrose môi trường canh trypton ở canh trypton ở 24oC Không tăng Phát triển 42oC Phản ứng ADH (), LDC trưởng được được trong Arginine dehydrolase () (+) trong môi môi trường Lysine decarboxylase (+) Khử nitrate thành nitrite trường chứa đến Lên men được sucrose Không lên men sucrose không có 10% muối. Khử nitrate thành nitrite Không sinh hơi muối, ức chế Có thể tăng trưởng trong Tăng trưởng trong môi trong môi môi trường chứa 03% trường chứa 8% muối, trường có 8 NaCl, không phát triển ức chế trong môi trường 10% muối. được trong môi trường chứa 10% muối. chứa 6,810% muối. o Có thể phát hiện các loài Vibrio dựa trên nguyên tắc sau: Một lượng mẫu xác định được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng. Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng. Các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng định bằng các thí nghiệm sinh hoá và huyết thanh lọc. Môi trường tăng sinh chọn lọc cho V. cholera, V. alginolyticus và V. vulnificus là nước pepton kiềm. Trong khi đó môi trường Clistine Polymicine Broth thường được dung để tăng sinh V. parahaemolyticus. Môi trường thường Trang 4
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio dùng để phân lập Vibrio là TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar). Các vi sinh vật lên men được sucrose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm acid hoá môi trường bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật không lên men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh. 2. Quy trình phân tích và nguyên tắc xác định 2.1 Tăng sinh chọn lọc: Rất khó phát hiện Vibrio trong mẫu, vì vậy ta sử dụng lượng mẫu lớn. Và cũng chính vì khó phát hiện nên phải tạo điều thuận lợi để Vibrio sinh trưởng bằng cách tăng sinh trong môi trường pepton kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường hợp V. cholera, V. alginolyticus và V. vulnificus; canh Colistine cho trường hợp V. parahaemolyticus. Mẫu lỏng: cho vào nước peptone kiềm, ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ Mẫu rắn: cho vào túi PE vô trùng chứa nước peptone kiềm và đồng nhất trong máy dập mẫu rồi ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ. 2.2 Phân lập: Trang 5
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Phân lập từ phần váng của dịch tăng sinh lên môi trường TCBS agar. Ủ ở 370C/24h. Cấy khuẩn lạc đặc trưng sang môi trường TSA hay thạch máu. Ủ 370C để lấy sinh khối cho bước tiếp theo là thử nghiệm sinh hóa.  Nhận diện khuẩn lạc điển hình : Trang 6
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio 2.3 Thử nghiệm sinh hóa + Quan sát tính di động và hình thái trên kính hiển vi Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X. Ghi nhận kết quả: di động hay bất động, hình dạng tế bào. Lam kính 1: Hoà mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ 1 giọt lên lam kính, đậy phiến kính mỏng (lamen) lên trên.Soi tiêu bản trực tiếp trên kính hiển vi thấy vi khuẩn tả di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường. Lam kính 2: Nhỏ 1 giọt huyền dịch phân lên lam kính, nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh tả đa giá. Nếu là vi khuẩn tả thì vi khuẩn sẽ bị bất hoạt, không di động nữa. Soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen, vi khuẩn tả di động như sao đổi ngôi . + Thử nghiệm khả năng lên men đường Môi trường: Phenol red broth base pH 7.4 Chỉ thị pH: đỏ phenol, màu đỏ chuyển sang vàng khi pH dưới 6.8 Kiểm nghiệm khả năng lên men: lactose, sucrose, mannose Bổ sung đường vào môi trường rồi khử trùng Sau đó cấy và ủ 370C trong 18 – 20 giờ Trang 7
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Đánh giá dựa vào sinh acid (làm đổi màu chỉ thị) và sinh hơi (CO 2 tạo thành được bẫy lại trong ống Durham). Kết quả: o Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng o Phản ứng (): môi trường có màu đỏ + Thử nghiệm Decarboxylase Enzyme carboxylase do VK tạo ra loại nhóm carboxyl của acid amin tạo amin hay diamin và CO2 Môi trường: Decarboxylase Basal Medium Chỉ thị: Bromothymol purple pH 6.0, vùng chuyển màu pH 5.2 – 6.8 thay đổi từ vàng thành tím Kiểm nghiệm: ADH, LDC Hấp khử trùng môi trường rồi cấy Bổ sung dầu khoáng hay parafin rồi ủ 370C trong 1 đến 4 ngày Trang 8
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Kết quả: (+) Môi trường đục, màu tím (CO2 sinh ra làm thay đổi pH, đổi màu chỉ thị). () Môi trường trong, màu vàng + Thử nghiệm khả năng sinh Indol Môi trường: Trypton Thuốc thử: Kovac’s Cho thêm eter để chiết Indol Ủ 44.50C trong 24 giờ Kết quả: (+) Bề mặt môi trường màu đỏ () Bề mặt môi trường có màu vàng của thuốc thử (đôi khi có màu cam do Skatol là tiền chất Methyl hóa của Indol tạo ra) + Thử nghiệm H2S Enzym desulfohydrase do VK tổng hợp sẽ xúc tác sự chuyển hóa acid amin chứa lưu huỳnh (cystein, cystin, methionin) và phóng thích H2S. Trang 9
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Môi trường: Thạch nghiêng: KIA, TSI Thạch đứng: SIM, PIA Đĩa petri: BSA Cấy vào môi trường rồi ủ 370C trong 24 – 48 giờ hoặc đến 7 ngày nếu cần. Kết quả: (+) Môi trường xuất hiện màu đen do H2S tạo tủa đen với sulfide trong môi trường. () Môi trường không có sự xuất hiện hay chuyển màu đen. + Thử nghiệm Oxidase Xác định sự hiện diện của enzym oxidase ở VSV. Enzym quan trọng nhất của hệ enzym này là cytochrome oxydase trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp hiếu khí. Thuốc thử: p – phenylenediamine Cấy lên ống thạch nghiêng rồi ủ 24 – 48 giờ Tiếp tục tiến hành theo 1 trong 2 cách: Nhúng giấy lọc vào tetramethyl – p – phenylenediamine dihydrochloride 1%, dùng que cấy dàn đều sinh khối lên tấm giấy lọc đó. Nhỏ lên sinh khối vài giọt p – aminophenylenediamine oxalate 1% và α – napthol 1% trong ethanol. Trang 10
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Kết quả: (+) Xuất hiện màu xanh dương đậm do có sự hiện diện của cytochrom khử trong tế bào làm thuốc thử oxy hóa thành indolphenol. () Không xuất hiện màu xanh dương + Thử nghiệm ONPG Các VK lên men lactose tổng hợp trong tế bào tạo enzym β – galactosidase. Enzym này xúc tác thủy phân lactose và permease có vai trò vận chuyển lactose vào trong tế bào Môi trường: ONPG broth 0.6% (o – nitrophenyl – D – galactopyranoside) trong dung dịch Na2HPO4 1mM. Khử trùng môi trường, cấy và ủ 370C trong 24 giờ Kết quả: Trang 11
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio (+) Xuất hiện màu vàng trong dịch cấy do quá trình thủy phân phóng thích o – nitrophenol có màu vàng. () Không xuất hiện màu vàng + Thử nghiệm khả năng oxi hóa – lên men Nhằm xác định VSV biến dưỡng carbohydrate theo phương thức oxi hóa hay lên men, quá trình lên men tạo môi trường có tính acid cao hơn quá trình oxi hóa => làm đổi màu chỉ thị. Môi trường: Hugh – Leifson chứa glucose là nguồn carbon duy nhất Chỉ thị: Bromothymol Blue Cấy VSV vào 2 ống môi trường, sau đó chỉ có 1 ống phủ lên bề mặt lớp dầu khoáng parafin để cản sự tiếp xúc với oxi không khí. Ủ 2 ống ở 370C trong 24 – 48 giờ Trang 12
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio + Thử nghiệm kháng huyết thanh Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực hiện. Một số phương pháp nhanh: + Test kit: Thường được dùng để sàng lọc ở một phạm vi lớn, một số sản phẩm cũng đã được thương mại. Trang 13
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio + Phương pháp miễn dịch: như EIA, ELISA cũng được phát triển, tuy nhiên các bộ kit được thương mại hoá thì không phổ biến khiến phương pháp này không được thịnh hành. + Phương pháp sinh học phân tử: Ngày nay một số phương pháp phân tử đã được phát triển,đáng chú ý là kỹ thuật PCR. Hiện nay đã có bộ sinh phẩm dùng xác định cả 3 loài: V. cholerae, V. parahaemolyticus và V. vulnificus chỉ trong vòng 24h bằng kỹ thuật real time PCR (Labelled DNA probes ) từ m ẫu th ực phẩm, hơn nữa còn có thể xác định độc tố của V.cholerae mà bằng phương pháp phân tích từ các chủng V.cholerae rất khó khăn. Quy trình phát hiện và định danh V. cholera và V. parahaemolyticus Trang 14
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio 3. Trường hợp cụ thể cho Vibrio parahaemolyticus THƯỜNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG THỰC PHẨM (Ban hành kèm theo Quyết định số 3349/2001 QĐBYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế) Trang 15
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio I. NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP Vibrio parahaemolyticus phát triển được trong môi trường có nồng độ muối cao. Lựa chọn khuẩn lạc V. parahaemolyticus xác định tính chất sinh vật hoá học theo thường quy. II. PHẠM VI ÁP DỤNG Phát hiện các ô nhiễm do Vibrio parahaemolyticus trong sản phẩm thuỷ sản và thức ăn chế biến sẵn. III. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ 1. Dụng cụ thiết bị Các dụng cụ và thiết bị thông thường trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật. 2. Môi trường, thuốc thử Thạch TCBS (Thiosunfat Citrat Bile Salt Sucroza) Thạch Tryple sugar iron (TSI) Thạch Wagatsuma Môi trường Clark lubs Canh thang Trypticase Soy (TSB) Thạch Trypticase Soy (TSA) Canh thang muối glucoza (GSTB) Canh thang Glucose Hugh Leifson (HLGB) Môi trường di động Trang 16
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Môi trường đường có chỉ thị màu bromocresol (Các đường manitol, lactoza, sacaroza, arabinoza) Môi trường decarboxylaza (ADH, LDC, ODC) Thuốc thử hoặc giấy thử Oxidaza KOH, α naphton Dầu parafin vô trùng Thuốc nhuộm Gram Chú ý: tất cả các loại môi trường phải có ít nhất 3% muối NaCl IV. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ 1. Chuẩn bị môi trường Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút). 2. Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử 2.1. Chuẩn bị mẫu Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. Lưu ý: Cá: Thịt cá, ruột và mang cá. Sò, hến: Toàn bộ cơ quan nội tạng. Trang 17
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Tôm, cua : Thịt và cơ quan nội tạng. Nếu cần có thể tách riêng xét nghiệm các bộ phận của chúng (ruột, mang, gạch...). Trước khi xét nghiệm, phải làm tan băng. 2.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 101 Cân chính xác 50 g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút chính xác 50ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón chứa sẵn 450 ml nước đệm muối 3%. Lắc đều 2 3 phút. Thu được dung dịch mẫu thử 101. 2.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 102,103,10 4... Hút chính xác 50ml dung dịch mẫu thử 10 1 cho sang bình nón chứa sẵn 450ml nước đệm muối 3%. Lắc đều trong 2 3phút. Thu được dung dịch 102. Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10 3, 104, 105.... (theo sơ đồ ) 3. Phương pháp tiến hành Bước 1: Lấy 10ml dung dịch mẫu thử 101 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 10 ml canh thang glucoza muối (GSTB) đậm đặc gấp 2 lần và 1ml vào GSTB đậm độ thường. Mỗi đậm độ cấy 3 ống. Lấy 1ml dung dịch mẫu thử từ 10 2, 103, 104 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 10ml GSTB đậm độ thường. Mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 3 ống. ủ ấm ở 350C/1824 giờ. Trang 18
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio V. parahaemolyticus hiếu khí tuyệt đối, phát triển tạo thành màng trên bề mặt ống canh thang, chuyển mầu môi trường sang mầu vàng. Bước 2: Lấy canh trùng từ ống canh thang có đậm độ pha loãng thấp nhất vẫn có vi khuẩn phát triển cấy sang các đĩa thạch TCBS. Ria cấy để tạo được các khuẩn lạc riêng rẽ. Ủ ở 350C/18 24 giờ. Bước 3: Quan sát và nhận định khuẩn lạc trên thạch TCBS. V. parahaemolyticus có khuẩn lạc tròn, lồi, bờ đều, đường kính 2 3mm trung tâm khuẩn lạc có màu xanh hoặc xanh lá cây. Bước 4: Tăng sinh thuần chủng và xác định hình thể, tính chất bắt mầu a) Tăng sinh thuần chủng Trích khuẩn lạc điển hình từ thạch TCBS cấy vào môi trường canh thang TSB hoặc canh thang thường có NaCl 3% và ủ ấm 18 24 giờ/ 35 0C, thu được canh trùng thuần nhất. Từ canh trùng thuần nhất cấy vào Thạch TSI, TSA nghiêng có NaCl 3%; ủ ấm 18 24 giờ/ 350C. Thử nghiệm Oxidaza: Lấy khuẩn lạc trên môi trường TSA làm phản ứng oxidaza trên giấy thử hoặc thuốc thử, oxidaza (+). b) Hình thể và tính chất bắt mầu Trang 19
Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Từ canh trùng thuần nhất, nhuộm Gram xem hình thể: hình phẩy khuẩn, cong hoặc hình trụ, đầu tròn, không bắt mầu thuốc nhuộm Gram, Gr (). Canh trùng được soi tươi trên lam kính: phẩy khuẩn di động nhanh. Bước 5: Tính chất sinh vật hoá học a) Tính chất lên men các loại đường Thử tính chất lên men đường glucoza, lactoza, sacaroza, khả năng sinh hơi, sinh H2S trên môi trường TSI. Lên men đường sacaroza, manitol, arabinoza. Dùng canh thang có chỉ thị màu bromocresol để xác định tính chất lên men các loại đường. Để tủ ấm 350C/ 4 5 ngày rồi đọc kết quả. b) Tính chất ưa muối Từ canh trùng thuần nhất cấy vi khuẩn vào ống canh thang muối (STB) có NaCl từ: 0%; 6%; 8%, 10%. ủ ấm ở 350C/24 giờ. c) Thử nghiệm VP Từ canh thang TSB cấy vào canh thang Clarklubs, ủ ấm ở 350C/48 giờ. Nhỏ thuốc thử 0,2ml KOH 40% và 0,6ml α napton. Để ở nhiệt độ thường trong 1 giờ. Đọc kết quả. d) Test ADH, LDC, ODC Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ thạch TSA cho vào 3 ống ADH, LDC, ODC (Các ống môi trường đã có parafin vô trùng phủ dày 10mm). Nới lỏng nút bông, để ở nhiệt độ 350C/ 24 giờ, kiểm tra hàng ngày, trong 4 ngày. Trang 20