TR ƯỜ NG Đ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ộ Ạ Ọ
VI N ĐÀO T O SAU Đ I H C Ạ Ọ Ạ Ệ
-----------*&*-----------
TI U LU N MÔN H C
Ọ
Ậ
Ể
Tên ti u lu n ể
ậ
Ph
ng pháp xác đ nh d l
ng aflatoxin
ươ
ư ượ
ị
trong th y s n b ng s c ký l ng cao áp
HPLC
ủ ả ằ
ỏ
ắ
H và tên HV: Đào Th Hiên
ọ
ị
Mã s : CB101151
ố
L p : CHTP2010
ớ
Hà n i 2011 ộ
I. M Đ U
Ở Ầ
Th y s n là m t ngành kinh t ộ ủ ả ế ẩ mũi nh n và r t có ti m năng xu t kh u ề ấ ấ ọ
t Nam.Theo báo cáo t i H i th o do B Nông nghi p và Phát tri n nông c a Vi ủ ệ ạ ệ ể ả ộ ộ
ch c Nông l ng Liên Hi p Qu c (FAO) t ch c ngày 8- thôn ph i h p v i t ố ợ ớ ổ ứ ươ ệ ố ổ ứ
9/6 t t Nam đ c coi là m t trong nh ng n c có t c đ ạ i C n Th , hi n Vi ơ ệ ầ ệ ượ ữ ộ ướ ố ộ
tăng tr ng xu t kh u th y s n nhanh nh t th gi i v i t c đ tăng giá tr trung ưở ủ ả ế ớ ớ ố ộ ấ ẩ ấ ị
bình giai đo n 1998-2008 đ t 18%/năm. ạ ạ
Đ i di n c a FAO cho bi t, Vi i v ệ ủ ạ ế ệ t Nam đang đ ng th 6 th gi ứ ế ớ ề ứ
xu t kh u th y s n, th 5 v s n l ng nuôi tr ng và th 12 v s n l ng khai ề ả ượ ủ ả ứ ẩ ấ ề ả ượ ứ ồ
thác.
Đ n nay, tuy xu t kh u tôm v n tăng nh ng t tr ng gi m. Các nhóm ư ế ấ ẩ ẫ ỷ ọ ả
hàng khác nh cá l i có t c đ tăng nhanh, trong đó cá tra là hi n t ư ạ ố ộ ệ ượ ng đ c bi ặ ệ t
có s tăng tr ng bùng n k t sau năm 2000. ự ưở ổ ể ừ
Tính riêng trong năm 2008, kh i l ố ượ ng cá xu t kh u đ t h n 825 ẩ ạ ơ ấ
tr ng đ t 66,7% kh i l t n, t ấ ỷ ọ ố ượ ạ ạ ng th y s n xu t kh u, trong đó riêng cá tra đ t ủ ả ấ ẩ
tr ng kh i l ng th y s n xu t kh u. h n 640 t n, chi m h n 51% t ơ ế ấ ơ ỷ ọ ố ượ ủ ả ấ ẩ
t, vi c xu t kh u cá tra tr i th tr ng Nga, m t th Đ c bi ặ ệ ệ ấ ẩ l ở ạ ị ườ ộ ị
tr ng l n và quan tr ng, đã tác đ ng đ n các th tr ng khác. Nga đang xem xét ườ ị ườ ế ớ ọ ộ
ch n Vi ọ ệ ẩ t Nam là mô hình đ u tiên trong qu n lý đi u hành, ch bi n xu t kh u ả ế ế ề ầ ấ
th y s n. ủ ả
Tuy nhiên, đáp ng đ c nhu c u c a th tr ng th gi i là m t v n đ ứ ượ ị ườ ủ ầ ế ớ ọ ấ ề
t là ch t l ng. S n ph m xu t kh u nh t thi t ph i đ t đ r t l n, đ c bi ấ ớ ặ ệ ấ ượ ả ẩ ấ ẩ ấ ế ả ạ ượ c
ng qu c t các tiêu chu n c a th tr ẩ ị ườ ủ ố ế ự . Hi n nay v n đ an toàn v sinh th c ệ ề ệ ấ
ph m là ch tiêu hang đ u đ i v i ch t l ố ớ ấ ượ ầ ẩ ỉ ổ ậ ơ ng th c ph m, trong đó n i b t h n ự ẩ
ng đ c t có trong s n ph m th y h i s n c a n c ta còn r t cao. c là d l ả ư ượ ộ ố ả ả ủ ướ ủ ả ẩ ấ
Đi n hình là d l ư ượ ể ồ ng aflatoxin trong th y s n, nguy c này ph n l n b t ngu n ủ ả ầ ớ ắ ơ
ngu n th c ăn ch bi n s n. t đ và đ m cao vùng nhi t đ i là t ừ ế ế ẵ Nhi ứ ồ ệ ộ ộ ẩ ở ệ ớ
nguyên nhân làm cho th c ăn th y s n d b n m m c phát tri n. Tr ng i chính ễ ị ấ ủ ả ứ ể ạ ố ở
cho vi c ch bi n th c ăn th y s n là s phát tri n c a n m m c ủ ả ế ế ố Aspergillus ự ủ ứ ể ệ ấ
flavus, n m m c này s n xu t ra đ c ch t Aflatoxin, m t lo i đ c t ạ ộ ố ấ ả ấ ấ ố ộ ộ ể nguy hi m
ng phát tri n cho đ ng v t th y s n. N m này th ủ ả ậ ấ ộ ườ ể ở ắ các lo i h t có d u. b p ạ ạ ầ
và khoai c …ủ
D l ng aflatoxin còn l ư ượ ạ ọ i trong s n ph m th y s n là ch tiêu quan tr ng ủ ả ả ẩ ỉ
c n đ ầ ượ ấ c kh ng ch , ki m tra và ki m soát nghiêm ng t đ đ m b o ch t ặ ể ả ế ể ể ả ố
ng cho xu t kh u. l ượ ấ ẩ
Hi n nay có r t nhi u ph ng pháp xác đ nh d l ng aflatoxin nh ệ ề ấ ươ ư ượ ị ư
ph ng pháp ELISA, Ph ươ ng pháp s c ký b n m ng (TLC), Ph ả ắ ỏ ươ ươ ắ ng pháp s c
ký l ng cao áp (HLC), Ph ng pháp vi sinh, ph ng pháp áp d ng k thu t sinh ỏ ươ ươ ụ ậ ỹ
PCR… h c phân t ọ ử
ng pháp xác Trong ph m vi c a ti u lu n tôi ti n hành tìm hi u v ậ ề ph ủ ể ế ể ạ ươ
đ nh d l ng aflatoxin b ng s c ký l ng cap áp (HPLC). ư ượ ị ỏ ằ ắ
II. PH
NG PHÁP XÁC Đ NH D L
NG AFLATOXIN
ƯƠ
Ư ƯỢ
Ị
B NG S C KÝ L NG CAO ÁP (HPLC – High Performance
Ỏ
Ằ
Ắ
Liquid
Chromatography)
1. Ph m vi áp d ng ụ ạ
Ph ng đ c t aflatoxin (B1, B2, G1, G2) ươ ng pháp này áp d ng xác đ nh hàm l ụ ị ượ ộ ố
trong th y s n và s n ph m th y s n b ng s c ký l ng cao áp (HPLC). Gi ủ ả ủ ả ả ẩ ằ ắ ỏ ớ ạ i h n
phát hi n c a ph ng pháp là 1,5 mg/kg. ệ ủ ươ
2. Nguyên t cắ
Aflatoxin có trong m u th y s n bao g m các nhóm B1, B2, G1 và G2 đ ủ ẫ ả ồ ượ c
chi t tách ra b ng clorofom. D ch chi c làm s ch b ng ph ng pháp chi ế ằ ị t đ ế ựơ ằ ạ ươ ế t
pha r n (SPE) trên silicagel. Hàm l ng aflatoxin có trong d ch chi c xác ắ ượ ị t đ ế ượ
đ nh trên h th ng HPLC v i đ u dò huỳnh quang theo ph ị ệ ầ ố ớ ươ ạ ng pháp ngo i
chu n.ẩ
3. Thi t b , d ng c , hóa ch t, ch t chu n và dung d ch th ế ụ ụ ấ ấ ẩ ị ị ử
3.1. Thi t b , d ng c ế ị ụ ụ
3.1.1 H th ng HPLC v i đ u dò huỳnh quang. ớ ầ ệ ố
3.1.2 C t s c ký pha đ o LC18 kích th c L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đ ng kính ộ ắ ả ướ ườ
5 đ n 10 [NAD1]mm. h t t ạ ừ ế
3.1.3 Màng l c mao qu n kích th c 0,4 mm. ả ọ ướ
3.1.4 Máy nghi n đ ng th t c đ 10 000 vòng/ phút. ể ố ộ ề ồ
3.1.5 Cân phân tích có đ chính xác 0,0001 g. ộ
3.1.6 Máy ly tâm t c đ 5 000 vòng/phút. ố ộ
.1.7 B siêu âm. ể
3.1.8 H th ng cô quay chân không. ệ ố
3.1.9 C t th y tinh có khóa teflon, kích th c L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8 ủ ộ ướ
mm.
3.1.10 ng ly tâm th y tinh dung tích 250 ml. ủ ố
3.1.11 Bình c u th y tinh dung tích 100 ml và 250 ml. ủ ầ
3.1.12 Bình đ nh m c dung tích 5 ml và 10 ml. ứ ị
3.2 Hóa ch tấ
3.2.1 N c c t lo i dùng cho HPLC. ạ ướ ấ
3.2.2 Metanol lo i dùng cho HPLC. ạ
3.2.3 Clorofom lo i dùng cho HPLC. ạ
3.2.4 Axetonitril lo i dùng cho HPLC. ạ
3.2.5 n-hexan tinh khi t lo i dùng cho phân tích. ế ạ
3.2.6 Ete etylic tinh khi t.ế
3.2.7 Sulfat natri khan.
3.2.8 Silicagel c h t t 60 đ n 200 mesh. ỡ ạ ừ ế
3.2.9 Silicagel đã đ c ho t hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khi t (4.2.8) đ vào t ượ ạ ế ể ủ
nhi t đ 110oC. Sau đó đ ngu i v nhi t đ c a phòng trong s y trong 2 gi ấ ờ ở ệ ộ ộ ề ể ệ ộ ủ
bình hút m và ngâm trong clorofom 15 phút tr c khi nh i c t. ẩ ướ ồ ộ
3.3 Dung d ch chu n và dung d ch th ẩ ị ị ử
3.3.1 Dung d ch chu n g c h n h p g m: B1 (n ng đ 100,0mg/l), B2 (n ng đ ồ ẩ ố ỗ ợ ồ ộ ồ ị ộ
20,0 mg/l), G1 (n ng đ 100 mg/l) và G2 (n ng đ 20 mg/l). ồ ộ ồ ộ
ề 3.3.2 Chu n b dung d ch chu n g c h n h p aflatoxin có n ng đ (nh Ði u ỗ ư ẩ ẩ ố ợ ồ ộ ị ị
3.3.1) trong metanol t ừ các ng chu n. Tùy theo n ng đ các aflatoxin có trong ồ ẩ ố ộ
ng chu n, dùng bình đ nh m c và l ng metanol thích h p. ố ứ ẩ ị ượ ợ
3.3.3 Dung d ch chu n trung gian có n ng đ là B1 (10,0mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 ẩ ồ ộ ị
ợ (10,0 mg/l) và G2 (2,0 mg/l): hút chính xác 1,0 ml dung d ch chu n g c h n h p ẩ ố ỗ ị
(3.3.1) vào bình đ nh m c 10 ml (3.1.12) r i đ nh m c t ồ ị ứ ớ ạ i v ch b ng metanol ằ ứ ị
(3.2.2).
t 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 3.3.4 Dung d ch chu n: hút chính xác l n l ẩ ầ ượ ị
ml và 10,0 ml dung d ch chu n trung gian (3.3.3) vào các bình đ nh m c 10 ml ứ ẩ ị ị
i v ch b ng metanol. Các dung d ch chu n thu đ c có (3.1.12) r i đ nh m c t ồ ị ứ ớ ạ ằ ẩ ị ượ
n ng đ aflatoxin l n l ồ ầ ượ ộ t nh sau: ư
a. Chu n 1 : B1 (0,0 mg/l), B2 (0,0 mg/l), G1 (0,0mg/l), G2 (0,0 mg/l). ẩ
b. Chu n 2 : B1 (1,0 mg/l), B2 (0,2 mg/l), G1 (1,0mg/l), G2 (0,2 mg/l). ẩ
c. Chu n 3 : B1 (2,0 mg/l), B2 (0,4 mg/l), G1 (2,0mg/l), G2 (0,4 mg/l). ẩ
d. Chu n 4 : B1 (4,0 mg/l), B2 (0,8 mg/l), G1 (4,0mg/l), G2 (0,8 mg/l). ẩ
đ. Chu n 5 : B1 (8,0 mg/l), B2 (1,6 mg/l), G1 (8,0mg/l), G2 (1,6 mg/l). ẩ
e. Chu n 6 : B1 (10,0 mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 (10,0mg/l), G2 (2,0 mg/l). ẩ
3.3.5 Dung d ch pha đ ng: pha h n h p các dung môi axetonitril, metanol và n ộ ỗ ợ ị ướ c
v th tích là 2 : 2 : 6. c t lo i dùng cho HPLC theo t l ấ ỉ ệ ề ể ạ
4. Ph ng pháp ti n hành ươ ế
4.1 Chu n b m u th ẩ ị ẫ ử
4.1.1 Dùng cân phân tích (4.1.5) cân chính xác 50,0 g m u (m) đã đ c băm ẫ ượ
nhuy n cho vào ng ly tâm thu tinh dung tích 250 ml (3.1.10). ỷ ễ ố
4.1.2 Thêm 100 ml Clorofom (3.2.3) vào ng r i tr n đ u trong kho ng 2 phút ề ả ố ồ ộ
b ng máy nghi n đ ng th (3.1.4). Sau đó ly tâm b ng máy li tâm (3.1.6) trong ằ ề ể ằ ồ
kho ng 5 phút t c đ 5000 vòng/phút. Ti n hành l c d ch chi t và r a ph n bã ả ở ố ộ ọ ị ế ế ử ầ
t c d ch thu đ b ng clorofom r i cho t ằ ồ ấ ả ị ượ c vào bình c u th y tinh dung tích 250 ủ ầ
(3.1.11) ml
ắ 4.2 Chu n b m u tr ng ẩ ị ẫ
M u tr ng đ c xác đ nh không có ẫ ắ ượ c đ nh nghĩa là m u th y s n đã đ ẫ ủ ả ị ượ ị
aflatoxin. Ti n hành chu n b m u tr ng gi ng nh chu n b v i m u th theo ị ẫ ị ớ ư ử ế ẩ ắ ẩ ẫ ố
qui đ nh t ị ạ i Ði u4.1. ề
ồ 4.3 Chu n b m u đ xác đ nh đ thu h i ẩ ị ẫ ể ộ ị
ẫ Thêm 2,0ml dung d ch chu n (3.3.4c) vào 10,0g m u tr ng đ ng nh t m u ẩ ẫ ắ ấ ồ ị
b ng máy nghi n đ ng th (3.1.4) ti n hành chu n b m u gi ng nh chu n b ằ ị ẫ ư ể ế ề ẩ ẩ ồ ố ị
m u th theo quy đ nh t ử ẫ ị ạ ồ ồ i đi u 4.1 ph i chu n b m u xác đ nh đ thu h i đ ng ị ẫ ề ả ẩ ồ ị
th i v i chu n b m u th và m u tr ng. ờ ớ ị ẫ ử ẩ ẫ ắ
4.4 Làm s ch d ch chi ạ ị t ế
4.4.1 Chu n b c t ị ộ ẩ
Ð t 1 l p bông th y tinh vào đáy c t th y tinh có khóa teflon (3.1.9). Ðóng khóa ủ ủ ặ ớ ộ
và cho clorofom t i kho ng 2/3 c t r i thêm l n l t 5,0 g sulfat natri khan ớ ộ ồ ầ ượ ả
(3.2.7), 20,0g silicagel đã ho t hóa (3.2.8), 15 g sulfat natri khan (3.2.7). ạ
Chú thích: đ tránh khô c t luôn gi m c clorofom cao h n l p sulfat natri khan ể ộ ữ ự ơ ớ
trên cùng kho ng 1,5 cm. ả
4.4.2 Làm s ch d ch chi ạ ị t ế
t thu đ c (4.1.2) trên h th ng cô quay chân không (3.1.8) * Cô d ch chi ị ế ượ ệ ố
oC. Dùng pipet chuy n dung d ch t
còn kho ng 5,0 ml nhi t đ 40 ả ở ệ ộ ể ị ừ ầ bình c u
(4.1.2) vào c t làm s ch đã chu n b (4.4.1) và tráng r a bình c u b ng clorofom. ử ạ ẩ ầ ằ ộ ị
Ði u ch nh khoá đ t c đ ch y c a dung d ch ra kh i c t kho ng t ể ố ộ ả ủ ỏ ộ ề ả ỉ ị ừ 1,0 đ n 1,5 ế
ml/phút. Trong giai đo n này, aflatoxin s h p ph lên các h t silicagel. ạ ẽ ấ ụ ạ
*Thêm vào c t l n l t 50,0 ml n-hexan (3.2.5), 50,0 ml ete etylic (3.2.6). ộ ầ ượ
Ði u ch nh t c đ dung môi ch y qua c t 1,0 ml/phút. Sau đó lo i b d ch ộ ở ề ả ố ộ ỉ ạ ỏ ị
ch y ra kh i c t. ỏ ộ ả
* Gi ả ợ i h p các aflatoxin kh i c t làm s ch b ng 50,0 ml h n h p ấ ạ ằ ỗ ỏ ộ
clorofom và metanol theo t l ỉ ệ ề ể ứ v th tích là 97: 3 v i t c d 1,0 ml/phút. H ng ớ ố ộ
dung d ch ch y ra kh i c t vào bình c u dung tích 100 ml (3.1.11). Cô d ch thu ầ ỏ ộ ả ị ị
đ c trên h th ng cô quay chân không (3.1.8) nhi t đ 40o C cho đ n khô ượ ệ ố ở ệ ộ ế
hoàn toàn. Hoà tan c n b ng 5,0 ml (V) dung d ch pha đ ng (3.3.5) trong bình ặ ằ ộ ị
ng các aflatoxin trên HPLC đ nh m c 5 ml (3.1.12). Ti n hành phân tích hàm l ị ứ ế ượ
theo qui t 4.5. đ nh ị i ạ Ði u ề
* Ti n hành làm s ch m u tr ng (4.2) và m u đ xác đ nh đ thu h i (4.3) ế ể ạ ẫ ắ ẫ ồ ộ ị
gi ng nh v i m u th (4.1) theo qui đ nh trên ử ư ớ ẫ ố ị
4.5 Ti n hành phân tích trên HPLC ế
4.5.1 Ði u ki n phân tích ệ ề
a. C t s c ký : RP-LC 18, kích th c L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đ ộ ắ ướ ườ ạ ng kính h t 5
–
0 [NAD2]mm.
oC.
b. Nhi t đ c t : 35 ệ ộ ộ
c c t (3.3.5.) c. Pha đ ng : H n h p g m: axetonitril, metanol và n ồ ộ ợ ỗ ướ ấ
d. T c đ dòng: 1,0 ml/phút. ố ộ
đ. B c sóng cài đ t cho đ u dò huỳnh quang là: (kích ho t) E x 365 nm, (phát ướ ặ ầ ạ
x ) Em 455 nm. ạ
e. Th tích tiêm : 20 ml. ể
4.5.2 Tiêm các dung d ch chu n n ng đ t ẩ (3.3.4) vào máy HPLC theo th t ứ ự ồ ộ ừ ị
ự th p đ n cao. M i dung d ch tiêm 2 l n, tính di n tích pic trung bình. D ng ầ ệ ế ấ ỗ ị
đ ng chu n bi u th m i quan h gi a các di n tích pic thu đ ườ ệ ữ ị ố ể ệ ẩ ượ c và n ng đ ồ ộ
ng trình y = ax + b). t ng lo i aflatoxin theo quan h tuy n tính b c 1 (ph ừ ệ ế ạ ậ ươ
4.5.3 Tiêm dung d ch m u th ẫ ị ử, dung d ch m u tr ng và dung d ch xác đ nh đ thu ắ ẫ ộ ị ị ị
h i vào h th ng HPLC. M i dung d ch m u tiêm 2 l n. Tính giá tr trung bình. ồ ệ ố ẫ ầ ỗ ị ị
4.6 Yêu c u v đ tin c y c a phép phân tích ầ ề ộ ậ ủ
4.6.1 Ð l p l ộ ặ ạ ủ i c a 2 l n tiêm ầ
Ð l ch chu n (CVs) tính theo di n tích pic s c ký c a 2 l n tiêm cùng m t dung ộ ệ ủ ệ ẩ ắ ầ ộ
d ch chu n ph i nh h n 0,5 %. ị ỏ ơ ẩ ả
4.6.2 Ð thu h i (R) ồ ộ
Ð thu h i đ ồ ượ ộ ộ c xác đ nh b ng cách s d ng 10 m u tr ng đã cho vào m t ử ụ ằ ẫ ắ ị
ng dung d ch aflatoxin chu n đã bi t hàm l l ượ ẩ ị ế ượ ồ ng chính xác (4.3). Ð thu h i ộ
tính đ c ph i n m trong kho ng t ượ ả ằ ả ừ ả 85 % đ n 115 %, đ thu h i trung bình ph i ế ộ ồ
90 %. l n ớ h n ơ
4.6.3 Ð ng chu n ph i có đ tuy n tính t t ườ ế ẩ ả ộ ố , h s t ệ ố ươ ế ng quan quy h i tuy n ồ
tính (R2) ph i l n h n ho c b ng 0,99. ơ ặ ằ ả ớ
5. Tính k t quế ả
Hàm l ng các aflatoxin có trong m u đ c tính trên c s đ ượ ẫ ượ ơ ở ườ ng chu n thu ẩ
đ c (4.5.2). V i đ ng chu n d ng y = ax +b, hàm l ng các aflatoxin có ượ ớ ườ ẩ ở ạ ượ
trong m u đ c tính theo công th c sau: ẫ ượ ứ
(Y - b)
C (mg/kg) = ------------ x F
a
Trong đó:
- C là n ng đ aflatoxin có trong m u, tính theomg/kg ồ ộ ẫ
t và di n tích pic có trong - Y là hi u s gi a di n tích pic c a d ch chi ệ ệ ố ữ ủ ị ế ệ
-
m u tr ng tiêm vào HPLC, tính theo đ n v di n tích ị ệ ắ ẫ ơ
- a, b là các thông s c a đ ng chu n y = ax + b, đ ố ủ ườ ẩ ượ c xác đ nh theo ị
4.5.2. Ði u ề
- F là h s pha loãng m u và có giá tr b ng t s gi a th tích d ch chi ỉ ố ữ ệ ố ị ằ ể ẫ ị ế t
thu đ c sau khi làm s ch V (4.4.2) và kh i l ng m u m (4.1.1) s ượ ố ượ ạ ẫ ử
d ng.ụ
TÀI LI U THAM KH O
Ả
Ệ
ố 1. Lu n văn th c s : Đánh giá m c đ nhi m m c chung và m c ứ
ạ ỹ
ễ
ậ
ộ
ố
sinh aflatoxin trên h t ngô trong quá trình b o qu n v i s h tr
ớ ự ỗ ợ
ả
ạ
ả
Nguy n Th H ng Ph
ng
c a k thu t PCR, ủ ỹ
ậ
ị ằ
ễ
ươ , 2007
2. TCN 179:2002 Hàm l
ng aflatoxin – Ph
ng pháp đ nh l
ượ
ươ
ị
ượ ng
băng s c kí l ng cao áp.
ắ
ỏ
3. http://vietbao.vn/Kinh-te/Tang-truong-xuat-khau-thuy-san-Viet-
Nam-nhanh-nhat-the-gioi
4. Lê Ng c Tú và c ng s
h c và an toàn th c ph m, NXB
ọ
ộ
ự, Đ c t
ộ ố ọ
ự
ẩ
Khoa h c k thu t ậ ọ ỹ
