TR NG Đ I H C BÁCH KHOA HÀ N IƯỜ Ạ Ọ Ộ
VI N ĐÀO T O SAU Đ I H CỆ Ạ Ạ Ọ
-----------*&*-----------
TI U LU N MÔN H CỂ Ậ Ọ
Tên ti u lu nể ậ
Ph ng pháp xác đ nh d l ng aflatoxinươ ị ư ượ
trong th y s n b ng s c ký l ng cao ápủ ả ằ ắ ỏ HPLC
H và tên HV: Đào Th Hiênọ ị
Mã s : CB101151ố
L p : CHTP2010ớ
Hà n i 2011ộ
I. M Đ UỞ Ầ
Th y s n là m t ngành kinh t mũi nh n và r t có ti m năng xu t kh uủ ả ộ ế ọ ấ ề ấ ẩ
c a Vi t Nam.Theo báo cáo t i H i th o do B Nông nghi p và Phát tri n nôngủ ệ ạ ộ ả ộ ệ ể
thôn ph i h p v i t ch c Nông l ng Liên Hi p Qu c (FAO) t ch c ngày 8-ố ợ ớ ổ ứ ươ ệ ố ổ ứ
9/6 t i C n Th , hi n Vi t Nam đ c coi là m t trong nh ng n c có t c đạ ầ ơ ệ ệ ượ ộ ữ ướ ố ộ
tăng tr ng xu t kh u th y s n nhanh nh t th gi i v i t c đ tăng giá tr trungưở ấ ẩ ủ ả ấ ế ớ ớ ố ộ ị
bình giai đo n 1998-2008 đ t 18%/năm.ạ ạ
Đ i di n c a FAO cho bi t, Vi t Nam đang đ ng th 6 th gi i vạ ệ ủ ế ệ ứ ứ ế ớ ề
xu t kh u th y s n, th 5 v s n l ng nuôi tr ng và th 12 v s n l ng khaiấ ẩ ủ ả ứ ề ả ượ ồ ứ ề ả ượ
thác.
Đ n nay, tuy xu t kh u tôm v n tăng nh ng t tr ng gi m. Các nhómế ấ ẩ ẫ ư ỷ ọ ả
hàng khác nh cá l i có t c đ tăng nhanh, trong đó cá tra là hi n t ng đ c bi tư ạ ố ộ ệ ượ ặ ệ
có s tăng tr ng bùng n k t sau năm 2000.ự ưở ổ ể ừ
Tính riêng trong năm 2008, kh i l ng cá xu t kh u đ t h n 825ố ượ ấ ẩ ạ ơ
t n, t tr ng đ t 66,7% kh i l ng th y s n xu t kh u, trong đó riêng cá tra đ tấ ỷ ọ ạ ố ượ ủ ả ấ ẩ ạ
h n 640 t n, chi m h n 51% t tr ng kh i l ng th y s n xu t kh u.ơ ấ ế ơ ỷ ọ ố ượ ủ ả ấ ẩ
Đ c bi t, vi c xu t kh u cá tra tr l i th tr ng Nga, m t thặ ệ ệ ấ ẩ ở ạ ị ườ ộ ị
tr ng l n và quan tr ng, đã tác đ ng đ n các th tr ng khác. Nga đang xem xétườ ớ ọ ộ ế ị ườ
ch n Vi t Nam là mô hình đ u tiên trong qu n lý đi u hành, ch bi n xu t kh uọ ệ ầ ả ề ế ế ấ ẩ
th y s n.ủ ả
Tuy nhiên, đáp ng đ c nhu c u c a th tr ng th gi i là m t v n đứ ượ ầ ủ ị ườ ế ớ ọ ấ ề
r t l n, đ c bi t là ch t l ng. S n ph m xu t kh u nh t thi t ph i đ t đ cấ ớ ặ ệ ấ ượ ả ẩ ấ ẩ ấ ế ả ạ ượ
các tiêu chu n c a th tr ng qu c t . Hi n nay v n đ an toàn v sinh th cẩ ủ ị ườ ố ế ệ ấ ề ệ ự
ph m là ch tiêu hang đ u đ i v i ch t l ng th c ph m, trong đó n i b t h nẩ ỉ ầ ố ớ ấ ượ ự ẩ ổ ậ ơ
c là d l ng đ c t có trong s n ph m th y h i s n c a n c ta còn r t cao.ả ư ượ ộ ố ả ẩ ủ ả ả ủ ướ ấ
Đi n hình là d l ng aflatoxin trong th y s n, nguy c này ph n l n b t ngu nể ư ượ ủ ả ơ ầ ớ ắ ồ
t ngu n th c ăn ch bi n s n. ừ ồ ứ ế ế ẵ Nhi t đ và đ m cao vùng nhi t đ i làệ ộ ộ ẩ ở ệ ớ
nguyên nhân làm cho th c ăn th y s n d b n m m c phát tri n. Tr ng i chínhứ ủ ả ễ ị ấ ố ể ở ạ
cho vi c ch bi n th c ăn th y s n là s phát tri n c a n m m c ệ ế ế ứ ủ ả ự ể ủ ấ ố Aspergillus
flavus, n m m c này s n xu t ra đ c ch t Aflatoxin, m t lo i đ c t nguy hi mấ ố ả ấ ộ ấ ộ ạ ộ ố ể
cho đ ng v t th y s n. N m này th ng phát tri n các lo i h t có d u. b pộ ậ ủ ả ấ ườ ể ở ạ ạ ầ ắ
và khoai c …ủ
D l ng aflatoxin còn l i trong s n ph m th y s n là ch tiêu quan tr ngư ượ ạ ả ẩ ủ ả ỉ ọ
c n đ c kh ng ch , ki m tra và ki m soát nghiêm ng t đ đ m b o ch tầ ượ ố ế ể ể ặ ể ả ả ấ
l ng cho xu t kh u.ượ ấ ẩ
Hi n nay có r t nhi u ph ng pháp xác đ nh d l ng aflatoxin nhệ ấ ề ươ ị ư ượ ư
ph ng pháp s c ký b n m ng (TLC), Ph ng pháp ELISA, Ph ng pháp s cươ ắ ả ỏ ươ ươ ắ
ký l ng cao áp (HLC), Ph ng pháp vi sinh, ph ng pháp áp d ng k thu t sinhỏ ươ ươ ụ ỹ ậ
h c phân t PCR…ọ ử
Trong ph m vi c a ti u lu n tôi ti n hành tìm hi u v ạ ủ ể ậ ế ể ề ph ng pháp xácươ
đ nh d l ng aflatoxin b ng s c ký l ng cap áp (HPLC).ị ư ượ ằ ắ ỏ
II. PH NG PHÁP XÁC Đ NH D L NG AFLATOXINƯƠ Ị Ư ƯỢ
B NG S C KÝ L NG CAO ÁP (HPLC – High PerformanceẰ Ắ Ỏ
Liquid Chromatography)
1. Ph m vi áp d ngạ ụ
Ph ng pháp này áp d ng xác đ nh hàm l ng đ c t aflatoxin (B1, B2, G1, G2)ươ ụ ị ượ ộ ố
trong th y s n và s n ph m th y s n b ng s c ký l ng cao áp (HPLC). Gi i h nủ ả ả ẩ ủ ả ằ ắ ỏ ớ ạ
phát hi n c a ph ng pháp là 1,5 mg/kg.ệ ủ ươ
2. Nguyên t cắ
Aflatoxin có trong m u th y s n bao g m các nhóm B1, B2, G1 và G2 đ cẫ ủ ả ồ ượ
chi t tách ra b ng clorofom. D ch chi t đ c làm s ch b ng ph ng pháp chi tế ằ ị ế ựơ ạ ằ ươ ế
pha r n (SPE) trên silicagel. Hàm l ng aflatoxin có trong d ch chi t đ c xácắ ượ ị ế ượ
đ nh trên h th ng HPLC v i đ u dò huỳnh quang theo ph ng pháp ngo iị ệ ố ớ ầ ươ ạ
chu n.ẩ
3. Thi t b , d ng c , hóa ch t, ch t chu n và dung d ch thế ị ụ ụ ấ ấ ẩ ị ử
3.1. Thi t b , d ng cế ị ụ ụ
3.1.1 H th ng HPLC v i đ u dò huỳnh quang.ệ ố ớ ầ
3.1.2 C t s c ký pha đ o LC18 kích th c L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đ ng kínhộ ắ ả ướ ườ
h t t 5 đ n 10 [NAD1]mm.ạ ừ ế
3.1.3 Màng l c mao qu n kích th c 0,4 mm.ọ ả ướ
3.1.4 Máy nghi n đ ng th t c đ 10 000 vòng/ phút.ề ồ ể ố ộ
3.1.5 Cân phân tích có đ chính xác 0,0001 g.ộ
3.1.6 Máy ly tâm t c đ 5 000 vòng/phút.ố ộ
.1.7 B siêu âm.ể
3.1.8 H th ng cô quay chân không.ệ ố
3.1.9 C t th y tinh có khóa teflon, kích th c L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8 ộ ủ ướ
mm.
3.1.10 ng ly tâm th y tinh dung tích 250 ml.ố ủ
3.1.11 Bình c u th y tinh dung tích 100 ml và 250 ml.ầ ủ
3.1.12 Bình đ nh m c dung tích 5 ml và 10 ml.ị ứ
3.2 Hóa ch tấ
3.2.1 N c c t lo i dùng cho HPLC.ướ ấ ạ
3.2.2 Metanol lo i dùng cho HPLC.ạ
3.2.3 Clorofom lo i dùng cho HPLC.ạ
3.2.4 Axetonitril lo i dùng cho HPLC.ạ
3.2.5 n-hexan tinh khi t lo i dùng cho phân tích.ế ạ
3.2.6 Ete etylic tinh khi t.ế
3.2.7 Sulfat natri khan.
3.2.8 Silicagel c h t t 60 đ n 200 mesh.ỡ ạ ừ ế
3.2.9 Silicagel đã đ c ho t hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khi t (4.2.8) đ vào tượ ạ ế ể ủ
s y trong 2 gi nhi t đ 110oC. Sau đó đ ngu i v nhi t đ c a phòng trongấ ờ ở ệ ộ ể ộ ề ệ ộ ủ
bình hút m và ngâm trong clorofom 15 phút tr c khi nh i c t.ẩ ướ ồ ộ
3.3 Dung d ch chu n và dung d ch thị ẩ ị ử
3.3.1 Dung d ch chu n g c h n h p g m: B1 (n ng đ 100,0mg/l), B2 (n ng đị ẩ ố ỗ ợ ồ ồ ộ ồ ộ
20,0 mg/l), G1 (n ng đ 100 mg/l) và G2 (n ng đ 20 mg/l).ồ ộ ồ ộ
3.3.2 Chu n b dung d ch chu n g c h n h p aflatoxin có n ng đ (nh Ði uẩ ị ị ẩ ố ỗ ợ ồ ộ ư ề
3.3.1) trong metanol t các ng chu n. Tùy theo n ng đ các aflatoxin có trongừ ố ẩ ồ ộ
ng chu n, dùng bình đ nh m c và l ng metanol thích h p.ố ẩ ị ứ ượ ợ
3.3.3 Dung d ch chu n trung gian có n ng đ là B1 (10,0mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1ị ẩ ồ ộ
(10,0 mg/l) và G2 (2,0 mg/l): hút chính xác 1,0 ml dung d ch chu n g c h n h pị ẩ ố ỗ ợ
(3.3.1) vào bình đ nh m c 10 ml (3.1.12) r i đ nh m c t i v ch b ng metanolị ứ ồ ị ứ ớ ạ ằ
(3.2.2).
3.3.4 Dung d ch chu n: hút chính xác l n l t 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0ị ẩ ầ ượ
ml và 10,0 ml dung d ch chu n trung gian (3.3.3) vào các bình đ nh m c 10 mlị ẩ ị ứ
(3.1.12) r i đ nh m c t i v ch b ng metanol. Các dung d ch chu n thu đ c cóồ ị ứ ớ ạ ằ ị ẩ ượ
n ng đ aflatoxin l n l t nh sau:ồ ộ ầ ượ ư