TUYỂN TẬP TIÊU CHUẨN PHÂN BÓN
TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 208 - 95
PHÂN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NI TƠ
Yêu cầu kỹ thuật, phương pháp kiểm tra,
nhãn, bao bì đóng gói
Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc xác định, kiểm tra phân vi sinh vật cố định ni tơ
1. Định nghĩa:
Phân vi sinh vật cố định ni tơ (Phân đạm vi sinh) là sản phẩm chứa một hoặc nhiều
chủng vi sinh vật cố định nitơ (VSVCĐN) tồn tại trên nền chất mang thanh trùng hay
không thanh trùng.
2. Tiêu chuẩn chất lượng:
2.1. Yêu cầu chung:
- Phân vi sinh vật cố định ni tơ phải có hiệu quả trên đồng ruộng như đã ghi trên nhãn
giới thiệu, gồm cả mức tăng năng xuất nông phẩm hay tiết kiệm phân bón hữu cơ và
vô cơ.
- Phân vi sinh vật cố định ni tơ không gây độc hại cho người, động vật, thực vật và
môi trường sinh thái.
2. 2. Yêu cầu kỹ thuật (chỉ tiêu chất lượng)
Các chỉ tiêu kỹ thuật của phân vi sinh vật cố định ni tơ phải phù hợp với các mức quy
định trong các bảng quy định sau:
Bảng 1: Phân vi sinh vật cố định ni tơ trên nền chất mang thanh trùng
Số
TT
Chỉ tiêu
Đơn vị đo
Mức
Sau khi
sản xuất
15 ngày
Cuối thời
hạn bảo
quản
1 Số lượng VSVCĐN
Dạng sinh dưỡng tiềm sinh Tế bào/gr hoặc ml
Trên 1. 108 Trên 1. 108
2 Số lượng vi sinh vật tạp Tế bào/gr hoặc ml
Dưới 1.10
6
Dưới 1.10
6
3 Độ ẩm (phân dạng rắn) % 40-55 trên 35
4 Thời hạn bảo quản trong điều kiện
bình thường kể từ ngày sản xuất
Tháng
6
TUYỂN TẬP TIÊU CHUẨN PHÂN BÓN
2
Bảng 2: Phân vi sinh cố định ni tơ trên nền chất mang không thanh trùng
Số
TT
Chỉ tiêu
Đơn vị đo
Mức
Sau khi sản
xuất 15 ngày
Cuối thời hạn
bảo quản
1 Số lượng VSVCĐN
(dạng sinh dưỡng tiềm sinh)
Tế bào/gr
hoặc ml
Trên 1. 10
7
Trên 1. 10
6
2 Thời hạn bảo quản trong điều kiện
bình thường kể từ ngày sản xuất
Tháng
6
3. Phương pháp kiểm tra:
3.1. Lấy mẫu:
Lấy ngẫu nhiên 10 gói, mỗi gói 25-30g hay 25-30ml đối với phân vi sinh vật cố định ni
tơ trên nền chất mang thanh trùng hoặc 500-600g phân vi sinh vật cố định ni tơ trên nền
chất mang không thanh trùng trong một đợt sản xuất của nhà máy hay các cửa hàng bán
lẻ, trong đó 5 gói dùng để kiểm tra chất lượng hiện tại và 5 gói khác được bảo quản
trong điều kiện bình thường dùng để kiểm tra chất lượng lúc cuối thời hạn sử dụng.
3.2. Kiểm tra:
3.2.1. Thiết bị dụng cụ kiểm tra:
- Bình tam giác 250ml.
- Ống nghiệm 15x 150mm, 18x 180mm.
- Pipét 1ml, 5ml, 10ml.
- Hộp lồng.
- Nồi hấp khử trùng, tủ sấy, tủ ấm.
- Buồng cấy vô trùng.
3.2.2. Chuẩn bị môi trường:
- Môi trường nuôi cấy VSVCĐN cộng sinh (môi trường YMA)
Manitol 10,0g
K2HPO4 0,5g
MgSO4. 7H2O 0,2g
NaCl 0,lg
Cao nấm men 1,0g
Nước cất vừa đủ l000ml
Thạch 20g
Congo đỏ 1% 2,5ml
pH 6,8
- Môi trường nuôi cấy VSVCĐN hội sinh và tự do (môi trường Ashby)
Manitol 20,0g
TUYỂN TẬP TIÊU CHUẨN PHÂN BÓN
3
K2HPO4 0,2g
MgSO4. 7H2O 0,2g
NaCl 0,2g
K2SO4 0,1g
CaCO3 5,0g
Nước cất vừa đủ l000ml
Thạch 20g
pH 6,5-7,0
- Môi trường Glucose peptone (môi trường GP)
Glucose 5,0g
Pepton 10,0g
Thạch 20,0g
Bromocresol 1% trong cồn 10,0ml
- Môi trường trồng cây chỉ thị (môi trường Jensen)
CaHPO4 1,0g
K2HPO4 0,2g
MgSO4.7H2O 0,2g
NaCl 0,2g
FeCl3 0,1 g
Nước cất vừa đủ l000ml
Thạch 8,0g
Dung dịch vi lượng * 1,0ml
pH 6,5-7,0
* Dung dịch vi lượng có thành phần như sau:
Bo-: 0,05% Mn-: 0,05%
Zn-: 0,005% Mo- : 0,05 %
Cu-: 0,02%
Cân và hoà tan các thành phần môi trường trong nước theo thứ tự như trên. Phân môi
trường vào các bình tam giác, làm nút bông đậy kín và đem khử trùng. Lấy ra để nguội
tới nhiệt độ 40-45oC rồi đổ vô trùng vào các hộp lồng đã khử trùng. Đối với môi trường
trồng cây chỉ thị cũng làm như trên nhưng đổ môi trường vào các ống nghiệm 18 x
180mm (khoảng 1/3 ống). Làm nút bông và khử trùng như trên, sau đó lấy ra và đặt
nghiêng ống thạch với góc 45o.
3.2.3. Tiến hành kiểm tra:
3.2.3.1. Xác định mật độ vi sinh vật cố định ni tơ sống tự do và hội sinh:
Mật độ VSVCĐN sống tự do và hội sinh được xác định theo phương pháp cấy trên
thạch đĩa với môi trường Ashby (Phương pháp Koch). Cách tiến hành như sau:
TUYỂN TẬP TIÊU CHUẨN PHÂN BÓN
4
Cân 10 g hay 10 ml phân cho vào bình tam giác 250ml chứa 90ml nước cất vô trùng, vô
đạm. Đậy kín nút bông rồi đưa lên máy lắc, lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời
gian 15 phút. Sau đó dùng pipét vô trùng lấy lml dung dịch cho vào 1 ống nghiệm chứa
9ml nước cất vô trùng, vô đạm lắc, khuấy ống nghiệm để trộn đều dung dịch. Dùng
pipét vô trùng khác lấy từ ống nghiệm này ra lml dung dịch và đưa vào ống nghiệm
khác cũng chứa 9ml nước cất vô trùng, vô đạm như trên. Trộn đều hỗn hợp. Quá trình
này được tiếp tục tiến hành đến ống nghiệm thứ 7. Từ ống nghiệm thứ 5, thứ 6 và thứ 7
lấy ra mỗi ống 3 giọt dung dịch (mỗi giọt tương đương với 0,04ml) cho vào 3 hộp lồng
chứa môi trường thạch đã chuẩn bị sẵn, mỗi hộp lồng 1 giọt. Dùng que gạt thuỷ tinh vô
trùng dàn đều dung dịch trên bề mặt đĩa thạch. Để hộp lồng vào tủ ấm ở nhiệt độ 28oC
và tiến hành nuôi trong thời gian 48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy lấy hộp lồng ra và tiến
hành đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch (chú ý chỉ đếm hộp lồng có chứa số khuẩn
lạc từ 30-300).
Số lượng VSVCĐN được tính theo công thức sau:
N: Số lượng VSVCĐN/g hay ml
a: Số lượng khuẩn lạc trung bình/ hộp lồng
n: Số thứ tự ống nghiệm pha loãng
* Đối với loại phân vi sinh vật cố định ni tơ dạng tiềm sinh trước tiên cần hoạt hoá tế
bào trong môi trường Ashby lỏng chứa 2% rỉ đường trong thời gian 2 giờ, sau đó tiến
hành kiểm tra bình thường như trên.
3.2.3.2. Xác định số lượng VSVCĐN sống cộng sinh với cây họ đậu (Rhizobium)
Đối với tất cả VSVCĐN sống cộng sinh có thể dùng phương pháp cấy pha loãng trên
môi trường YMA. Phương pháp được tiến hành như phần 3.2.3.1. Riêng đối với phân
VSVCĐN dùng cho cây đậu đen, đậu xanh, lạc và đậu tương có thể dùng phương pháp
nhiễm lên cây chỉ thị, trong đó dùng hạt Sirato (Macroptiliumatropurpureus) cho cây
đậu xanh, đậu đen, lạc và hạt đậu tương dại (Glycine ussurieusis) dùng cho đậu tương.
Phương pháp được tiến hành như sau:
Pha loãng phân như phần 3.2.3.1
Hạt Sirato ngâm trong H2SO4 đặc trong 4 phút sau đó rửa sạch nhanh bằng nước cất 4-5
lần. Hạt cây chỉ thị khác được thanh trùng 3-4 phút trong dung dịch HgCl2 1/1000 hay
cồn etylic 90oC trong 2 phút và rửa sạch bằng nước cất vô trùng nhiều lần. Ngâm hạt
trong nước cất vô trùng cho đến khi bắt đầu nẩy mầm (khoảng 24-36 giờ) rồi đặt vào
ống thạch đã được chuẩn bị với môi trường Jensen như phần 3.2.3. Rót lml dịch kiểm
tra có độ pha loãng 106, l07, l08, l09 vào mỗi ống thạch. Mỗi độ pha loãng làm 3 ống.
Đậy kín nút bông và đặt vào phòng sinh trưởng có nhiệt độ 280C. Sau 10-15 ngày kiểm
040
10 1
,
.a
N
n
TUYỂN TẬP TIÊU CHUẨN PHÂN BÓN
5
tra sự hình thành nốt sần và xác định mật độ tế bào có trong phân bằng cách kiểm tra
như bảng 3 (trang bên).
3.2.3.3. Xác định vi sinh vật tạp:
Số lượng vi sinh vật tạp được xác định bằng phương pháp nuôi cấy trên thạch đĩa với
môi trường GP. Phương pháp được tiến hành như phần 3.2.3.1.
3.2.3.4. Xác định độ ẩm:
Độ ẩm của phân được xác định bằng phương pháp sấy khô ở nhiệt độ l050C tới khi
trọng lượng mẫu không thay đổi (cân 3 lần).
4. Bao bì, ghi nhãn:
Phân VSVCĐN phải được bảo quản trong các bao gói tốt chống được các ảnh hưởng
bất lợi bên ngoài. Nhãn hiệu phải có đầy đủ các nội dung sau:
- Đối tượng sử dụng
- Tên vi sinh vật hữu ích có chứa trong sản phẩm
- Mật độ VSVCĐN
- Khối lượng tịnh, khối lượng bao
- Phương pháp, kỹ thuật sử dụng và bảo quản
- Người và ngày kiểm tra chất lượng xuất xưởng
- Ngày và địa điểm sản xuất
- Thời hạn sử dụng
Bảng 3: Xác định mật độ vi khuẩn nốt sần bằng cây chỉ thị:
Số TT
Số lượng ống có nốt sần ở các độ pha loãng Mật độ tế bào triệu tb/g)
10
6
10
7
10
8
10
9
1.
3 3 3 3 2300,0
2.
3 3 3 2 919,0
3.
3 3 3 1 424,0
4.
3 3 3 0 230,0
5.
3 3 2 1 147,0
6.
3 3 2 0 91,8
7.
3 3 1 0 42,8
8.
3 3 0 0 23,0
9.
3 2 1 0 14,7
10.
3 2 0 0 9,2
11.
3 1 0 0 4,2
12. 3 0 0 0 2,3
13.
2 1 0 0 1,5
14.
2 0 0 0 0,9
15.
1 0 0 0 0,4