Vai trò công nghệ sinh học trong bảo vệ môi trường: Ứng dụng và tiềm năng

VAI TRÒ CA CÔNG NGH SINH HC TRONG BO

V MÔI TRNG

1. CÔNG NGH SINH HC VÀ NGUYÊN LÝ CA K THUT TÁI T

HP GEN NG DNG TRONG CÔNG NGH SINH HC

1.1. Công ngh sinh hc c in (hay CNSH i phân t) và công ngh sinh hc

hin i (hay CNSH phân t)

CNSH i phân t là lnh vc nghiên cu và ng dng sinh vt và vi sinh

vt (VSV)  mc  nguyên trng, tc là chưa i sâu vào tìm hiu và ng dng

 mc  cu trúc phân t mà ch tn dng nhng c tính kiu gen (genotype)

và kiu hình (phenotype) ca chúng  s dng và chn lc loi ti ưu cho mc

ích t ra.

CNSH phân t (Molecular Biotechnology) là mt lnh vc tng hp có

liên quan rt l n !n các ngành di truy"n phân t, t! bào hc, VSV hc, sinh

hoá hc....

CNSH phân t có hai lnh vc chính là CNSH phân t cơ b$n và CNSH

phân t ng dng.

• CNSH phân t c bn: bao g%m các thao tác DNA  mc  phân t như

c&t, ni, ghép, chuyn np, d'n truy"n các loi gen ngoi lai hu ích vào

các dòng t! bào ch thích hp  duy trì gen ó.

• CNSH phân t ng dng: chn lc, nhân lên, s$n xut...nhng dòng t! bào

ã ưc tái t hp  thu ưc nhng s$n ph(m có ích cho con ngư)i.

CNSH phân t cơ b$n và CNSH ng dng là hai bư c k! ti!p nhau  ưa

nguyên lý tái t hp gen thành hin thc, s$n xut các thành ph(m hu ích theo

công ngh m i- Công ngh sinh hc.

1.2. Nguyên lý cơ b$n ca k* thut tái t hp gen ng dng trong CNSH

1.2.1. M +u và khái nim:

N,m 1970, l+n +u tiên, Baltimore và Temin c lp phát hin loi

enzyme có tác dng sao chép ngưc (reverse transcriptase) có tác dng tham gia

hot hoá cho quá trình tng hp ngưc DNA t- khuôn RNA (reverse

transcription). .i"u này cho phép mt khi ã có mt RNA thông tin (mRNA)

ca mt gen  dng si ơn, chúng ta có th chuyn i thành 1 gen hoàn toàn

( dng DNA chu/i xo&n kép) theo cơ ch! b sung sao chép ngưc, có s tham

gia ca enzyme nói trên. .ây chính là nguyên lý to DNA b sung

(complementary DNA-cDNA) t- mRNA.

C0ng trong n,m 1970, Smith và Wilcon công b ã tách chi!t ưc mt

loi enzyme ni bào t- vi khu(n Haemophills influenzae, có kh$ n,ng c&t DNA

 nhng im nht 1nh, to nên nhi"u on DNA r)i nhau, ã m hư ng cho

mt k* thut thao tác m i  mc  phân t, ó là có th c&t và ni các on

DNA thích hp  to nên các h/n hp lai DNA khác nhau. V" sau mt lot các

loi enzyme có hot tính như trên ã ưc phân lp, ngư)i ta gi ó là các

enzyme hn ch! (restriction enzyme)

C0ng trong nhng n,m 70 ti!p theo, song song v i s phát trin và hoàn

thin nhng k* thut thao tác vt liu thông tin di truy"n, vic phát hin và s

dng mt s thc th vi sinh sng cng sinh trong các loi t! bào vi sinh vt như

nm men, vi khu(n...có mt ý ngha ng dng h!t sc to l n. .ó chính là các

loi plasmid. Chúng óng vai trò quan trng trong vic d'n truy"n các gen

ngoi lai ã ưc tái t hp vào t! bào vi sinh vt ch tương ng ca chúng.

G+n ây, trong nhng n,m 80, ph$n ng nhân b$n gen (Polymerase

Chain Raction-PCR) ã ưc phát hin trên nguyên lý: deoxyribonucleic acid

(DNA) có cu trúc chu/i xo&n kép, g%m hai mch nucleotide b sung cho nhau

theo quy lut A-T và G-C b2ng các mi liên k!t hydro. Gia A-T có 2 và G-C

có 3 mi liên k!t hydro. Liên k!t này không ph$i là liên k!t hoá hc b"n vng,

do ó dư i mt tác dng nào ó (ví d nhit  cao trên 90

C, g+n !n 100

thì hai mch nucleotide s3 tách nhau ra, nhưng khi h nhit thì hai mch l xo&n

tr li. S phát hin này ã nâng cao hơn na k* thut tái t hp DNA và ng

dng thành qu$ ca k* thut ó.

Như vy, b2ng enzyme hn ch!, ta có th c&t mt chu/i DNA nào ó

thành nhi"u on, r%i ghép mt on nào ó vào plasmid c0ng ã b1 c&t b2ng

mt enzyme tương t  to nên mt plasmid m i mang on DNA ngoi lai.

N!u on DNA ó là mt gen hoàn chnh chúng ta có mt plasmid m i mang

gen ngoi lai. K* thut c&t-ni-ghép và to nên mt thc th vi sinh m i, mang

mt hay nhi"u on DNA ngoi lai, ưc gi là k* thut tái t hp DNA

(recombinant DNA technology). Plasmid mang DNA ngoi lai ó ưc gi là

plasmid tái t hp (recombinant plasmid). Khi pla smid ó ưc ưa vào t! bào

vi sinh vt ch, quá trình ó ưc gi là quá trình chuyn np (transformation).

Plasmid mang DNA ngoi lai óng vai trò chuyn DNA vào trong t! bào ch

ưc gi là vector d'n truy"n (cloning vector).

Vector d'n truy"n có th là plasmid hay bt k4 mt loi thc th vi sinh

khác, như virus ch5ng hn. Khi mt vi sinh vt ch (nm men hay vi khu(n...)

ã ti!p nhn vector d'n truy"n  thc hin nhng quá trình sinh hc ti!p theo

v i DNA ngoi lai ã ưc chuyn np, thì dòng VSV ó ưc gi là VSV tái

t hp (recombinant microorganism).

Khi nuôi cy VSV tái t hp, n!u DNA ngoi lai là mt gen hoàn chnh,

ưc b trí trong i"u kin có cu trúc vector d'n truy"n thích hp, thì gen ó

có th tng hp ưc protein  trong t! bào vt ch. Vector d'n truy"n có cu

trúc c bit này ưc gi là vector biu th1 gen (expression vector).

1.2.2. Các thành ph+n tham gia vào k* thut tái t hp gen

K* thut tái t hp gen bao g%m nhi"u công on khác nhau,có th ưc tóm

t&t như sau:

• C&t DNA b2ng enzyme hn ch! (RE)

• Phân lp on DNA ã ưc c&t

• C&t plasmid tương ng b2ng enzyme hn ch! thích hp

• Ni ghép on DNA ngoi lai vào plasmid

• Chuyn np vào t! bào VSV ch thích ng

• Chn lc dòng ã ưc tái t hp theo nguyên t&c kháng kháng sinh

• Nhân dòng ã chn lc

• Kim tra xác 1nh k!t qu$

Vì vy, các thành ph+n tham gia vào k* thut tái t hp gen rõ ràng có liên

quan !n:

a) Ngu%n cung cp DNA

Ngu%n cung cp DNA bao g%m tt c$ các loi hình có cha DNA ca vi

sinh vt, nm men, thc vt, ng vt bc cao. Các loi DNA này c+n

ph$i ưc làm sch kh6i các thành ph+n khác ca t! bào và b$o qu$n 

nhit  -20

C. C0ng có th là mRNA nhưng ph$i ưc chuyn sang

dng cDNA. Ngoài ra, ngu%n cung cp DNA cho k* thut tái t hp gen

có th là s$n ph(m PCR tinh khi!t. Mi quan tâm hàng +u ca các k*

thut tách chi!t nucleic acid là thu nhn các phân t này  trng thái

nguyên v7n ti a không b1 phân hu8 bi các tác nhân cơ hc (phân t b1

gãy do nghi"n, l&c mnh) hay hoá hc (phân t b1 thu8 gi$i bi các

enzyme ni bào gi$i phóng ra môi trư)ng khi t! bào b1 phá v9). Các

nucleic acid c+n ưc tách chi!t trong i"u kin nhit  thp  c ch!

hot ng ca các enzyme ni bào (desoxyribonuclease-DNase và

ribonuclease-RNase)

- Phưng pháp tách chit DNA: g%m 3 bư c cơ b$n sau:

§ Bư c 1: Phá màng t! bào và màng nhân (t! bào eucaryote). Thông

thư)ng, t! bào, mô ưc nghi"n trong mt h/n hp cht t(y (detergent

như SDS, sarcosyl) và proteinase (proteinase K). H/n hp này s3 phá v9

màng t! bào và màng nhân, gi$i phóng DNA ra môi trư)ng %ng th)i

phân hu8 các protein liên k!t v i DNA.

§ Bư c 2: Loi b6 các thành ph+n không mong mun trong m'u, ch

y!u là các protein. M'u ưc l&c tht mnh trong mt dung d1ch phenol

và chloroform. Dung d1ch phenol và chloroform có tác dng làm bi!n

tính protein %ng th)i không hoà tan nucleic acid. Protein khi bi!n tính

s3 không còn hoà tan trong pha nư c có cha nucleic acid và sau khi ly

tâm s3 ta thành mt l p n2m gia pha nư c và pha phenol:chloroform.

Pha nư c có cha nucleic acid ưc thu nhn li.

§ Bư c 3: Ta các nucleic acid. Mc ích ca vic ta là nh2m thu nhn

nucleic acid dư i dng cô c, mt mt nh2m b$o v chúng kh6i s phân

hu8 ca các enzyme, mt khác  có th hoà tan chúng tr li trong dung

d1ch theo n%ng  mong mun. Phương pháp thông dng là ta trong

isopropanol v i t l th tích isopropanol/th tích m'u là 1/1. Các DNA

có TLPT thp không b1 ta, do ó có th loi chúng ra khi dùng cách ta

trong isopropanol. Sau ó, nucleic acid s3 ưc thu nhn li b2ng ly tâm.

Ti!p theo, cn ta ph$i ưc ra trong ethanol 70%  loi b6 các du

v!t ca isopropanol còn dính li trên m'u. B$o qu$n  nhit  -20

- Phưng pháp tách chit RNA toàn phn và mRNA

Các phân t RNA không b"n, d: b1 phân hu8 bi các enzyme

ribonuclease (RNase). Phương pháp tách chi!t RNA toàn ph+n c0ng bao g%m

các bư c cơ b$n như i v i DNA:

T! bào, mô ưc nghi"n trong mt dung d1ch g%m mt cht t(y

mnh (SDS, sarcosyl)  n%ng  cao, mt tác nhân gây bi!n tính

protein bi!n tính mnh (guanidinium thiocyanate), mt cht kh (2-

mercaptoethanol). Hai loi cht sau có tác dng c ch! hot ng

ca các Rnase ni bào và tách các protein liên k!t kh6i phân t

RNA.

Các protein ưc loi b6 kh6i m'u qua x lý phenol:chloroform

và li tâm.

RNA hoà tan trong pha nư c ưc k!t ta b2ng ethanol và ưc

thu nhn li qua li tâm. RNA có th ưc b$o qu$n trên mt n,m

dư i dng ta trong dung d1ch ethanol hoc ông lnh  -70

C trong

nư c có cha RNasine (mt cht c ch! RNase)

Sau khi mt mRNA ưc phân lp kh6i t! bào,  có th ưa chúng tham

gia vào k* thut tái t hp gen, trư c h!t chúng ph$i ưc chuyn sang dng

cDNA b2ng k* thut DNA b sung. Ch  dng DNA m i có th c&t ni b2ng

enzyme hn ch! và ghép vào plasmid ưc.

- Phn ng nhân bn gen PCR (Polymerase Chain Reation)

Như ã nói  trên, ngu%n cung cp DNA cho k* thut tái t hp gen còn có

th là s$n ph(m PCR tinh khi!t.

Ph$n ng PCR là mt ph$n ng nhân to thc hin trong PTN v i s tham

gia ca các thành ph+n sau:

DNA làm khuôn

Oligonucleotide (hay còn gi là primer): là hai chu/i nucleotide

ng&n, ưc tng hp nhân to, có th bám vào nhng vùng c hiu trên

si DNA làm khuôn và trưt theo chi"u ti!n li g+n nhau.

Taq DNA polymerase: là loi enzyme rt b"n và hot ng tt !n

nhit  96

C, ưc chi!t xut t- Thermus aquaticus (Taq)- mt loi vi

khu(n sng trong sui nư c nóng.

H/n hp deoxyribo-nucleotide triphosphate (dNTP): bao g%m các

thành ph+n deoxyribo-adenine triphosphate (dATP), deoxyribo- thymine

triphosphate (dTTP), deoxyribo-guanine nucleotide triphosphate (dGTP),

deoxyribo-cytosine triphosphate (dCTP) ưc h/n hp theo mt t8 l

thích hp. H/n hp này có nhim v cung cp ngu%n nucleotide cho quá

trình tng hp DNA x$y ra trong PCR.

Môi trư)ng m (buffer): $m b$o  pH c+n thi!t.

Mg

v i hp cht cung cp là MgCl

v i n%ng  1.5-2.0 mM trong

ph$n ng PCR.

Ph$n ng PCR là mt chu/i nhi"u chu k4 (cycle) ni ti!p nhau. M/i chu k4

g%m 3 bư c:

Bư c 1: trong mt dung d1ch ph$n ng bao g%m tt c$ các thành ph+n

c+n thi!t cho s sao chép, phân t DNA ưc bi!n tính  nhit  cao

hơn Tm ca phân t, thư)ng là 94-95

C trong vòng 30 giây !n 1-2 phút.

Chu/i DNA b1 bung mi liên k!t hydro và to nên hai si DNA làm

khuôn. .ây là giai on bin tính (denaturation)

Bư c 2: Nhit  ưc h thp xung kho$ng 37-65

C (thp hơn Tm

ca các primer), thông thư)ng là 45-55

C (mà cho phép các primer b&t

cp v i các si DNA làm khuôn  nhng v1 trí thích hp ca chúng ),

trong kho$ng t- 30 giây !n 1 phút. .ây là giai on lai (hybridization)

hay gn (annealing)

Bư c 3: Nhit  ưc t,ng lên !n 72

C giúp cho DNA polymerase

hot hoá các primer  chúng trưt trên các si khuôn, ly các dNTP

trong môi trư)ng b sung vào si m i và to nên DNA m i. Th)i gian

ca bư c này tu4 thuc vào  dài ca trình t DNA c+n khu!ch i,

thư)ng kép dài t- 30 giây !n nhi"u phút. .ây là giai on tng hp hay

kéo dài (elongation)

Mt chu k4 g%m 3 bư c trên s3 ưc lp i lp li nhi"u l+n, thư)ng sau 25-

35 chu k4 là tt nht.

S$n ph(m PCR là mt on DNA có  dài t- vài chc !n vài chc nghìn

nucleotide, thông thư)ng !n 3000. Vì l'n tp nhi"u thành ph+n khác tham gia

ph$n ng PCR, nên sau khi ưc s$n ph(m PCR, trư c h!t c+n kim tra  dài

ca on DNA trong s$n ph(m có úng v i on ư c 1nh c+n có không b2ng

phương pháp in di khu!ch tán trên thch (agarose gel electrophoresis). Sau

ó, c+n thi!t ph$i ưc tinh khi!t trư c khi s dng làm vt liu DNA cho k*

thut tái t hp gen.

- Phưng pháp in di:

Sau quá trình tách chi!t, các nucleic acid có th ưc tinh sch nh) mt

s k* thut như siêu ly tâm, s&c ký, hay in di.

Phương pháp in di ưc s dng c$ trong phân tích 1nh tính và thu

nhn m'u nucleic acid. Nguyên t&c ca phương pháp in di là da vào c tính

cu trúc ca các nucleic acid. .ó là các i phân t tích in âm %ng "u trên

kh&p b" mt, nên khi ch1u tác ng ca in trư)ng, chúng s3 di chuyn v" cc

dương ca in trư)ng. Tính linh ng ca phân t trong b$n thch (gel) dư i

tác ng ca in trư)ng ưc tính theo công thc:

Log u = Log u

- K

Trong ó: Log u

là tính linh ng ca phân t trong môi trư)ng l6ng, K

là h2ng s làm chm do cu trúc gel %ng th)i c0ng ph thuc vào khi lưng

ca phân t nucleic acid, C là n%ng  ca gel.

Vì vy, tính linh ng ca phân t ph thuc vào hai y!u t: khi lưng

phân t tc là s lưng nucleotide hay cp nucleotide (DNA mch ôi) và n%ng

 các cht cu thành gel. Hai loi gel ưc s dng trong nghiên cu nucleic

acid là gel polyacrylamide và gel agarose. Vic chn loi gel c0ng như n%ng 

Vai trò của công nghệ sinh học trong bảo vệ môi trường

Chủ đề:

Tài liệu liên quan

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Hỗ trợ

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi