Vai trò của công nghệ sinh học trong bảo vệ môi trường

Chia sẻ: Hoang Thuy | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:18

Thêm vào BST

Báo xấu

147
lượt xem 37
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

CNSH đại phân tử là lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng sinh vật và vi sinh vật (VSV) ở mức độ nguyên trạng, tức là chưa đi sâu vào tìm hiểu và ứng dụng ở mức độ cấu trúc phân tử mà chỉ tận dụng những đặc tính kiểu gen (genotype) và kiểu hình (phenotype) của chúng để sử dụng và chọn lọc loại tối ưu cho mục đích đặt ra.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Vai trò của công nghệ sinh học trong bảo vệ môi trường

VAI TRÒ C A CÔNG NGH SINH H C TRONG B O V MÔI TRƯ NG 1. CÔNG NGH SINH H C VÀ NGUYÊN LÝ C A K THU T TÁI T H P GEN NG D NG TRONG CÔNG NGH SINH H C 1.1. Công ngh sinh h c c i n (hay CNSH i phân t ) và công ngh sinh h c hi n i (hay CNSH phân t ) CNSH i phân t là lĩnh v c nghiên c u và ng d ng sinh v t và vi sinh v t (VSV) m c nguyên tr ng, t c là chưa i sâu vào tìm hi u và ng d ng mc c u trúc phân t mà ch t n d ng nh ng c tính ki u gen (genotype) và ki u hình (phenotype) c a chúng s d ng và ch n l c lo i t i ưu cho m c ích t ra. CNSH phân t (Molecular Biotechnology) là m t lĩnh v c t ng h p có liên quan r t l n n các ngành di truy n phân t , t bào h c, VSV h c, sinh hoá h c.... CNSH phân t có hai lĩnh v c chính là CNSH phân t cơ b n và CNSH phân t ng d ng. • CNSH phân t cơ b n: bao g m các thao tác DNA m c phân t như c t, n i, ghép, chuy n n p, d n truy n các lo i gen ngo i lai h u ích vào các dòng t bào ch thích h p duy trì gen ó. • CNSH phân t ng d ng: ch n l c, nhân lên, s n xu t...nh ng dòng t bào ã ư c tái t h p thu ư c nh ng s n ph m có ích cho con ngư i. CNSH phân t cơ b n và CNSH ng d ng là hai bư c k ti p nhau ưa nguyên lý tái t h p gen thành hi n th c, s n xu t các thành ph m h u ích theo công ngh m i- Công ngh sinh h c. 1.2. Nguyên lý cơ b n c a k thu t tái t h p gen ng d ng trong CNSH 1.2.1. M u và khái ni m: Năm 1970, l n u tiên, Baltimore và Temin c l p phát hi n lo i enzyme có tác d ng sao chép ngư c (reverse transcriptase) có tác d ng tham gia ho t hoá cho quá trình t ng h p ngư c DNA t khuôn RNA (reverse transcription). i u này cho phép m t khi ã có m t RNA thông tin (mRNA) c a m t gen d ng s i ơn, chúng ta có th chuy n i thành 1 gen hoàn toàn ( d ng DNA chu i xo n kép) theo cơ ch b sung sao chép ngư c, có s tham gia c a enzyme nói trên. ây chính là nguyên lý t o DNA b sung (complementary DNA-cDNA) t mRNA. Cũng trong năm 1970, Smith và Wilcon công b ã tách chi t ư c m t lo i enzyme n i bào t vi khu n Haemophills influenzae, có kh năng c t DNA nh ng i m nh t nh, t o nên nhi u o n DNA r i nhau, ã m hư ng cho m t k thu t thao tác m i m c phân t , ó là có th c t và n i các o n DNA thích h p t o nên các h n h p lai DNA khác nhau. V sau m t lo t các
lo i enzyme có ho t tính như trên ã ư c phân l p, ngư i ta g i ó là các enzyme h n ch (restriction enzyme) Cũng trong nh ng năm 70 ti p theo, song song v i s phát tri n và hoàn thi n nh ng k thu t thao tác v t li u thông tin di truy n, vi c phát hi n và s d ng m t s th c th vi sinh s ng c ng sinh trong các lo i t bào vi sinh v t như n m men, vi khu n...có m t ý nghĩa ng d ng h t s c to l n. ó chính là các lo i plasmid. Chúng óng vai trò quan tr ng trong vi c d n truy n các gen ngo i lai ã ư c tái t h p vào t bào vi sinh v t ch tương ng c a chúng. G n ây, trong nh ng năm 80, ph n ng nhân b n gen (Polymerase Chain Raction-PCR) ã ư c phát hi n trên nguyên lý: deoxyribonucleic acid (DNA) có c u trúc chu i xo n kép, g m hai m ch nucleotide b sung cho nhau theo quy lu t A-T và G-C b ng các m i liên k t hydro. Gi a A-T có 2 và G-C có 3 m i liên k t hydro. Liên k t này không ph i là liên k t hoá h c b n v ng, cao trên 90oC, g n n 100oC) do ó dư i m t tác d ng nào ó (ví d nhi t thì hai m ch nucleotide s tách nhau ra, nhưng khi h nhi t thì hai m ch l xo n tr l i. S phát hi n này ã nâng cao hơn n a k thu t tái t h p DNA và ng d ng thành qu c a k thu t ó. Như v y, b ng enzyme h n ch , ta có th c t m t chu i DNA nào ó thành nhi u o n, r i ghép m t o n nào ó vào plasmid cũng ã b c t b ng m t enzyme tương t t o nên m t plasmid m i mang o n DNA ngo i lai. N u o n DNA ó là m t gen hoàn ch nh chúng ta có m t plasmid m i mang gen ngo i lai. K thu t c t-n i-ghép và t o nên m t th c th vi sinh m i, mang m t hay nhi u o n DNA ngo i lai, ư c g i là k thu t tái t h p DNA (recombinant DNA technology). Plasmid mang DNA ngo i lai ó ư c g i là plasmid tái t h p (recombinant plasmid). Khi pla smid ó ư c ưa vào t bào vi sinh v t ch , quá trình ó ư c g i là quá trình chuy n n p (transformation). Plasmid mang DNA ngo i lai óng vai trò chuy n DNA vào trong t bào ch ư c g i là vector d n truy n (cloning vector). Vector d n truy n có th là plasmid hay b t kỳ m t lo i th c th vi sinh khác, như virus ch ng h n. Khi m t vi sinh v t ch (n m men hay vi khu n...) ã ti p nh n vector d n truy n th c hi n nh ng quá trình sinh h c ti p theo v i DNA ngo i lai ã ư c chuy n n p, thì dòng VSV ó ư c g i là VSV tái t h p (recombinant microorganism). Khi nuôi c y VSV tái t h p, n u DNA ngo i lai là m t gen hoàn ch nh, ư c b trí trong i u ki n có c u trúc vector d n truy n thích h p, thì gen ó có th t ng h p ư c protein trong t bào v t ch . Vector d n truy n có c u trúc c bi t này ư c g i là vector bi u th gen (expression vector). 1.2.2. Các thành ph n tham gia vào k thu t tái t h p gen K thu t tái t h p gen bao g m nhi u công o n khác nhau,có th ư c tóm t t như sau: • C t DNA b ng enzyme h n ch (RE) • Phân l p o n DNA ã ư c c t • C t plasmid tương ng b ng enzyme h n ch thích h p
• N i ghép o n DNA ngo i lai vào plasmid • Chuy n n p vào t bào VSV ch thích ng • Ch n l c dòng ã ư c tái t h p theo nguyên t c kháng kháng sinh • Nhân dòng ã ch n l c • Ki m tra xác nh k t qu Vì v y, các thành ph n tham gia vào k thu t tái t h p gen rõ ràng có liên quan n: a) Ngu n cung c p DNA Ngu n cung c p DNA bao g m t t c các lo i hình có ch a DNA c a vi sinh v t, n m men, th c v t, ng v t b c cao. Các lo i DNA này c n ph i ư c làm s ch kh i các thành ph n khác c a t bào và b o qu n -20oC. Cũng có th là mRNA nhưng ph i ư c chuy n sang nhi t d ng cDNA. Ngoài ra, ngu n cung c p DNA cho k thu t tái t h p gen có th là s n ph m PCR tinh khi t. M i quan tâm hàng u c a các k thu t tách chi t nucleic acid là thu nh n các phân t này tr ng thái nguyên v n t i a không b phân hu b i các tác nhân cơ h c (phân t b gãy do nghi n, l c m nh) hay hoá h c (phân t b thu gi i b i các enzyme n i bào gi i phóng ra môi trư ng khi t bào b phá v ). Các nucleic acid c n ư c tách chi t trong i u ki n nhi t th p c ch ho t ng c a các enzyme n i bào (desoxyribonuclease-DNase và ribonuclease-RNase) - Phương pháp tách chi t DNA: g m 3 bư c cơ b n sau: § Bư c 1: Phá màng t bào và màng nhân (t bào eucaryote). Thông thư ng, t bào, mô ư c nghi n trong m t h n h p ch t t y (detergent như SDS, sarcosyl) và proteinase (proteinase K). H n h p này s phá v màng t bào và màng nhân, gi i phóng DNA ra môi trư ng ng th i phân hu các protein liên k t v i DNA. § Bư c 2: Lo i b các thành ph n không mong mu n trong m u, ch y u là các protein. M u ư c l c th t m nh trong m t dung d ch phenol và chloroform. Dung d ch phenol và chloroform có tác d ng làm bi n tính protein ng th i không hoà tan nucleic acid. Protein khi bi n tính s không còn hoà tan trong pha nư c có ch a nucleic acid và sau khi ly tâm s t a thành m t l p n m gi a pha nư c và pha phenol:chloroform. Pha nư c có ch a nucleic acid ư c thu nh n l i. § Bư c 3: T a các nucleic acid. M c ích c a vi c t a là nh m thu nh n nucleic acid dư i d ng cô c, m t m t nh m b o v chúng kh i s phân hu c a các enzyme, m t khác có th hoà tan chúng tr l i trong dung d ch theo n ng mong mu n. Phương pháp thông d ng là t a trong isopropanol v i t l th tích isopropanol/th tích m u là 1/1. Các DNA có TLPT th p không b t a, do ó có th lo i chúng ra khi dùng cách t a trong isopropanol. Sau ó, nucleic acid s ư c thu nh n l i b ng ly tâm. Ti p theo, c n t a ph i ư c r a trong ethanol 70% lo i b các d u -20oC. v t c a isopropanol còn dính l i trên m u. B o qu n nhi t
- Phương pháp tách chi t RNA toàn ph n và mRNA Các phân t RNA không b n, d b phân hu b i các enzyme ribonuclease (RNase). Phương pháp tách chi t RNA toàn ph n cũng bao g m các bư c cơ b n như i v i DNA: T bào, mô ư c nghi n trong m t dung d ch g m m t ch t t y m nh (SDS, sarcosyl) n ng cao, m t tác nhân gây bi n tính protein bi n tính m nh (guanidinium thiocyanate), m t ch t kh (2- mercaptoethanol). Hai lo i ch t sau có tác d ng c ch ho t ng c a các Rnase n i bào và tách các protein liên k t kh i phân t RNA. Các protein ư c lo i b kh i m u qua x lý phenol:chloroform và li tâm. RNA hoà tan trong pha nư c ư c k t t a b ng ethanol và ư c thu nh n l i qua li tâm. RNA có th ư c b o qu n trên m t năm dư i d ng t a trong dung d ch ethanol ho c ông l nh -70oC trong nư c có ch a RNasine (m t ch t c ch RNase) Sau khi m t mRNA ư c phân l p kh i t bào, có th ưa chúng tham gia vào k thu t tái t h p gen, trư c h t chúng ph i ư c chuy n sang d ng cDNA b ng k thu t DNA b sung. Ch d ng DNA m i có th c t n i b ng enzyme h n ch và ghép vào plasmid ư c. - Ph n ng nhân b n gen PCR (Polymerase Chain Reation) Như ã nói trên, ngu n cung c p DNA cho k thu t tái t h p gen còn có th là s n ph m PCR tinh khi t. Ph n ng PCR là m t ph n ng nhân t o th c hi n trong PTN v i s tham gia c a các thành ph n sau: DNA làm khuôn Oligonucleotide (hay còn g i là primer): là hai chu i nucleotide ng n, ư c t ng h p nhân t o, có th bám vào nh ng vùng c hi u trên s i DNA làm khuôn và trư t theo chi u ti n l i g n nhau. Taq DNA polymerase: là lo i enzyme r t b n và ho t ng t t n 96oC, ư c chi t xu t t Thermus aquaticus (Taq)- m t lo i vi nhi t khu n s ng trong su i nư c nóng. H n h p deoxyribo-nucleotide triphosphate (dNTP): bao g m các thành ph n deoxyribo-adenine triphosphate (dATP), deoxyribo- thymine triphosphate (dTTP), deoxyribo-guanine nucleotide triphosphate (dGTP), deoxyribo-cytosine triphosphate (dCTP) ư c h n h p theo m t t l thích h p. H n h p này có nhi m v cung c p ngu n nucleotide cho quá trình t ng h p DNA x y ra trong PCR. Môi trư ng m (buffer): m b o pH c n thi t. Mg2+ v i h p ch t cung c p là MgCl2 v i n ng 1.5-2.0 mM trong ph n ng PCR. Ph n ng PCR là m t chu i nhi u chu kỳ (cycle) n i ti p nhau. M i chu kỳ g m 3 bư c:
Bư c 1: trong m t dung d ch ph n ng bao g m t t c các thành ph n c n thi t cho s sao chép, phân t DNA ư c bi n tính nhi t cao o hơn Tm c a phân t , thư ng là 94-95 C trong vòng 30 giây n 1-2 phút. Chu i DNA b bung m i liên k t hydro và t o nên hai s i DNA làm khuôn. ây là giai o n bi n tính (denaturation) ư c h th p xu ng kho ng 37-65oC (th p hơn Tm Bư c 2: Nhi t c a các primer), thông thư ng là 45-55oC (mà cho phép các primer b t c p v i các s i DNA làm khuôn nh ng v trí thích h p c a chúng ), trong kho ng t 30 giây n 1 phút. ây là giai o n lai (hybridization) hay g n (annealing) ư c tăng lên n 72oC giúp cho DNA polymerase Bư c 3: Nhi t ho t hoá các primer chúng trư t trên các s i khuôn, l y các dNTP trong môi trư ng b sung vào s i m i và t o nên DNA m i. Th i gian c a bư c này tuỳ thu c vào dài c a trình t DNA c n khu ch i, thư ng kép dài t 30 giây n nhi u phút. ây là giai o n t ng h p hay kéo dài (elongation) M t chu kỳ g m 3 bư c trên s ư c l p i l p l i nhi u l n, thư ng sau 25- 35 chu kỳ là t t nh t. S n ph m PCR là m t o n DNA có dài t vài ch c n vài ch c nghìn nucleotide, thông thư ng n 3000. Vì l n t p nhi u thành ph n khác tham gia ph n ng PCR, nên sau khi ư c s n ph m PCR, trư c h t c n ki m tra dài c a o n DNA trong s n ph m có úng v i o n ư c nh c n có không b ng phương pháp i n di khu ch tán trên th ch (agarose gel electrophoresis). Sau ó, c n thi t ph i ư c tinh khi t trư c khi s d ng làm v t li u DNA cho k thu t tái t h p gen. - Phương pháp i n di: Sau quá trình tách chi t, các nucleic acid có th ư c tinh s ch nh m t s k thu t như siêu ly tâm, s c ký, hay i n di. Phương pháp i n di ư c s d ng c trong phân tích nh tính và thu nh n m u nucleic acid. Nguyên t c c a phương pháp i n di là d a vào c tính c u trúc c a các nucleic acid. ó là các i phân t tích i n âm ng u trên kh p b m t, nên khi ch u tác ng c a i n trư ng, chúng s di chuy n v c c dương c a i n trư ng. Tính linh ng c a phân t trong b n th ch (gel) dư i tác ng c a i n trư ng ư c tính theo công th c: Log u = Log uo- KrC Trong ó: Log uo là tính linh ng c a phân t trong môi trư ng l ng, Kr là h ng s làm ch m do c u trúc gel ng th i cũng ph thu c vào kh i lư ng c a phân t nucleic acid, C là n ng c a gel. Vì v y, tính linh ng c a phân t ph thu c vào hai y u t : kh i lư ng phân t t c là s lư ng nucleotide hay c p nucleotide (DNA m ch ôi) và n ng các ch t c u thành gel. Hai lo i gel ư c s d ng trong nghiên c u nucleic acid là gel polyacrylamide và gel agarose. Vi c ch n lo i gel cũng như n ng
các ch t t o thành gel tuỳ thu c kích thư c trung bình c a các o n nucleic acid c n phân tách. B ng 1. Tương quan gi a n ng gel và kích thư c các o n c n phân tách % acrylamide Kích thư c các o n c n phân tách (c p nucleotide) 200-800 80-200 4 40-100 5 10-50 8 11 % agarose Kích thư c các o n c n phân tách (kb) 1-20 0.5-7 0.6-0.8 0.2-5 0.9-1.2 1.2-1.5 § Gel agarose: Là lo i gel thông d ng nh t b i thao tác ơn gi n, thư ng dùng phân tách nh ng o n có kích thư c 0.5-20 kb. Gel ư c trên m t giá th n m ngang và i n di ư c th c hi n thep phương n m ngang. Sau i n di, các nucleic acid trong gel agarose s hi n hình d ng nh ng v ch màu cam dư i tia t ngo i (UV có λ=300 nm) nh s có m t c a ethidium bromide ( ư c cho vào gel trư c khi )-có kh năng g n xen vào gi a các base c a nucleic acid và dư i tác d ng c a tia t ngo i s phát huỳnh quang. Bên c nh ó, ư c lư ng kích thư c c a các trình t nucleic acid trong gel agarose, thư ng dùng m t y u t ánh d u tr ng lư ng phân t (molecular weight marker). ây là m t t p h p nhi u trình t DNA có kích thư c ã bi t trư c ư c g i là thang DNA (DNA ladder), thông thư ng s d ng thang DNA là th c khu n th λ ư c thu gi i b i enzyme gi i h n Hind III. § Gel acrylamide: ư c dùng tách các o n kích thư c nh (dư i 1000 c p base. Thao tác v i gel polyacrylamide ph c t p hơn v i gel agarose, nên ch ư c s d ng cho nh ng m c ích c hi u như: - Tinh s ch các oligonucleotide t ng h p - Xác nh trình t DNA - Tách các o n DNA nh có chi u dài dư i 500 c p base. Gel ư c gi a 2 t m thu tinh và phương c a i n di là phương th ng ng. Nguyên t c c a lo i i n di này là d a vào s thay i hư ng i n trư ng trong quá trình i n di. M i l n hư ng i n trư ng thay i thì phân t DNA
ph i t nh hư ng l i. Phân t có kích thư c càng l n thì th i gian t inh hư ng càng l n khi n cho nó di chuy n ch m hơn m t phân t kích thư c nh . M t DNA ơn gi n có th t o ra ch m t ít băng. N u DNA ban u là r t l n và ph c t p, vi c nhu m gel s cho th y m t băng i di n cho s bi n thiên h u như là liên t c v kích thư c c a o n. Băng hay là ph n ch a o n mong mu n s ư c nh v v i k thu t Southern blotting và ư c chuy n ra. B i vì m t m t băng có th i di n cho m t h n h p vài o n, nó ư c i n di trên m t gel v i m t n ng khác nhau tách các o n có kích thư c tương t . - Thu nh n acid nucleic: i n di trên gel agarose còn ư c s d ng thu nh n m u. Sau khi i n di, các v ch tương ng v i DNA c n tinh s ch ư c phát hi n và thu nh n l i theo m t trong các phương pháp sau: Phương pháp 1: ph n agarose ch a các v ch ó ư c c t ra và DNA ư c thu nh n sau khi ã khu ch tán t gel agarose vào m t dung d ch m thích h p. Phương pháp 2: M t gi ng nh ư c khoét trong agarose ngay trư c v ch DNA. Gi ng này ư c bơm d y dung d ch m và i n trư ng ư c tái l p. DNA di chuy n vào gi ng ch a y dung d ch m và ư c thu nh n l i. Phương pháp 3: i n di ư c th c hi n trong m t gel agarose c bi t có i m nóng ch y r t th p (65oC). Sau i n di, v ch DNA ư c c t 65oC. Khi agarose ã hoàn ra, trong m t dung d ch m nhi t toàn tan ch y, DNA ư c thu nh n l i sau nhi u công o n tách chi t và t a. b) Các enzyme thông d ng trong k thu t di truy n Các enzyme gi i h n (Restriction enzyme-RE) Các th c khu n th (phage) xâm nhi m vào t bào vi khu n và sinh sôi nh b máy sinh t ng h p c a vi khu n. Khi s lu ng phage tăng lên n hàng tri u b n sao, chúng s phá v t bào vi khu n. Tuy nhiên trong m t s trư ng h p, t bào vi khu n v n nguyên v n mà phage cũng không sinh sôi. Hiên tư ng này có th là do DNA c a phage b m t h th ng b o v c a vi khu n tiêu di t khi v a m i xâm nh p. H th ng b o v này là các RE. DNA vi khu n không b chính các RE c a chúng c t là nh cơ ch g n nhóm methyl vào A hay C các v trí c t c a các RE b i enzyme methylase . Khi ó RE không còn nh n bi t ư c các v trí c t. ây chính là hi n tư ng gi i h n và các RE h p thành h th ng b o v t bào procaryote. Các RE là các endonuclease có kh năng nh n bi t và c t DNA m ch ôi m t cách l p l i nh ng v trí (trình t ) xác nh, và ư c ng d ng ch y u trong phương pháp t o dòng. •....... Ví d v RE: EcoRI là enzyme u tiên ư c tìm th y E.coli
↓ EcoRI 5’G A ATT C3’ 3’C TTA A G5’ ↑ (D u mũi tên th ng ng ch v trí c t) Các enzyme thông d ng khác: - Các polymerase: g m 2 nhóm: Các DNA polymerase xúc tác cho s t ng h p DNA theo chi u 5’-3’. Ph n l n các DNA polymerase dùng DNA làm khuôn m u cho s t ng h p DNA (DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase). M t DNA polymerase c bi t là enzyme phiên mã ngư c (Reverse transcriptase) la s d ng khuôn là RNA t ng h p DNA. Cu i cùng là Terminal transferase)- m t DNA polymerase không t ng h p m ch m i t khuôn mà ch thêm các nucleotide vào u c a m t phân t DNA ã có s n. Các DNA polymerase, ho t ng, ph i c n m t m i (primer). M i là m t o n oligonucleotide b t c p b sung v i ph n u c a khuôn, t ó các polymerase m i n i dài t o c p b sung. Các RNA polymerase tham gia t ng h p RNA, thông d ng nh t là SP6, T7 và T3 RNA polymerase. C hai nhóm này ư c s d ng khi c n t o m t s lư ng l n b n sao c a nucleic acid (t o m u dò, xác nh trình t nucleotide,...). - Các ligase ây là các enzyme xúc tác s hình thành liên k t n i hai o n DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase) và thư ng ư c s d ng trong lĩnh v c t o dòng. - Các nuclease ây là nhóm các enzyme phân c t DNA (DNase) và RNA (RNase)n m t cách không chuyên bi t. Trong khi các RE ã ư c c p ph n trên cũng là nh ng nuclease nhưng mang tính chuyên bi t trình t cao hơn. c) Plasmid vector: Plasmid là m t th c th vi sinh ơn gi n nh t, có c u trúc DNA khép kín t o thành vòng tròn, dài c a plasmid có th thay i t vài nghìn nucleotide n vài trăm nghìn nucleotide, n m ngoài h gen c a m t vi khu n hay VSV, nhưng có liên h ch t ch v i t bào v t ch theo l i c ng sinh, nhân lên cùng v i s nhân lên c a NST. Plasmid ư c s d ng làm vector (v t có kh năng t i và truy n nh ng s n ph m sinh h c t cá th này sang cá th khác) trong k thu t tái t h p gen nh trong c u trúc c a chúng có m t vùng c bi t g i là vùng ori. Vùng này là m t chu i ng n nucleotide, n m m t nơi nào ó trong vòng tròn DNA c a plasmid, có ch c năng quan tr ng trong quá trình t nhân lên t o nhi u plasmid m i. ây là nơi mà DNA polymerase và các lo i protein bám vào, m u cho chu kỳ nhân lên. Ngoài ra, nh vào c tính c a m t s plasmid mang gen kháng kháng sinh (antibiotics) quy nh kh năng s n xu t enzyme kháng kháng
sinh. ó cũng là nguyên lý ch n l c d a trên kh năng kháng kháng sinh trong k thu t tái t h p gen. t o ư c m t plasmid v a có kh năng d n truy n (cloning plasmid vector), t plasmid t tiên, trư c tiên ngư i ta ti p t c ưa vào nh ng vùng m i, c bi t là vùng ch a t h p gen ch th nào ó (ch ng h n gen ch th là gen kháng tetracyclin hay t h p gen s n xu t các lo i protein nh t nh), mà thông thư ng trong gen ó l i có m t dãy các v trí c t c a RE (dãy này ư c g i là polylinker hay multiple cutting site-MCS). ó là nơi th c hi n các thao tác c t, n i, ghép DNA, hay còn g i là tái t h p DNA. Nguyên lý ch n l c ư c dòng t bào ch ti p nh n plasmid tái t h p ư c d a trên nguyên lý kháng kháng sinh hay c tính hình thành màu khu n l c do không có s t ng h p lo i protein ch th trên... d) T bào ch thích ng cho plasmid (host cell) Trong k thu t tái t h p gen, t bào ch ph i là lo i có kh năng thu nh n plasmid d dàng, lưu gi b n v ng và t o i u ki n cho plasmid nhân lên nhi u và s n xu t t t các s n ph m tái t h p. Hi n nay có nhi u dòng t bào E. coli như JM 101, JM 102, JM 109... ư c s d ng làm t bào ch trong k thu t tái t h p gen (còn g i là t bào thu n dư ng-competent cell). Quá trình xâm nh p vào t bào E. coli thu n dư ng ư c g i là quá trình bi n n p (transformation). N u s n xu t theo l i công ngh vi sinh, plasmid trong vi khu n s t ng h p ra m t hay nhi u s n ph m ư c mong mu n. Lai phân t - Lai trên pha r n 1. Nguyên t c Hai trình t b sung (thư ng là trình t ích- trình t c n tìm) ư c c nh trên m t giá th r n. 2. Các y u t k thu t Giá th r n dùng c nh nucleic acid là các màng lai. Có hai lo i màng lai: - Màng lai b ng n tro-cellulose: là lo i giá th ư c s d ng u tiên- hi n nay không còn thông d ng do hai như c i m là b n cơ h c kém nên thao thác khó khăn, không th tách r i các phân t lai trên màng lai lai tr l i v i m t m u dò (probe) khác. - Màng lai b ng nylon, có b n cơ h c cao và cho phép lai nhi u l n v i nhi u m u dò khác nhau (c n lo i b m u dò cũ trư c khi lai v i m u dò m i) 3. Phương pháp Southern blot Phương pháp này ư c s d ng nh v nh ng trình t c bi t trên DNA b gen, hay nh ng DNA kích thư c nh như DNA plasmid... Cơ s c a phương pháp là k thu t chuy n (transfer) DNA t gel lên màng lai do Southern mô t năm 1975.
- Các o n DNA ư c phân tách và ư c làm bi n tính (bi n thành hai m ch ơn ) ngay trên gel r i ư c chuy n lên màng lai và theo các bư c sau: T b n ch a, dung d ch m ư c hút b i gi y th m dày, di chuy n theo l c mao d n lên phía trên. Khi i qua gel, dung d ch m s kéo theo các acid nucleic và chuy n chúng lên màng lai. Ngoài k thu t chuy n nh l c mao d n, hi n nay ngư i ta còn s d ng k thu t chuy n nh dòng i n và chuy n trong chân không cho hi u qu cao hơn tuy òi h i m t s i u ki n k thu t c bi t. - DNA ư c c nh trên màng lai ư c em lai v i m u dò có ánh d u phóng x . V t n ng t trên cùng giúp nén sát các thành ph n tham gia vào quá trình này. Sau quá trình lai, ngư i ta r a màng lai lo i b các m u dò không b t c p chuyên bi t v i DNA c nh trên màng. - Cu i cùng, dùng k thu t phóng x t ghi (autoradiography) hay s d ng m t film nh y c m v i tia x áp sát màng lai nh v các phân t lai (DNA b gen: m u dò) Sanger Dideoxy Sequencing S n ph m kéo dài ư c phát tri n b i s hình thành m t c u n i phosphodiester gi a nhóm 3´-hydroxyl t i u cu i ang kéo dài c a primer và nhóm 5´- phosphate c a deoxynucleotide s p g n. S kéo dài ư c ti n hành theo hư ng 5´-3´. i u áng lưu ý là DNA polymerases cũng có th g n nh ng ch t tương t v i các nucleotide bases. Phương pháp dideoxy trong sequencing DNA ã ư c phát hi n b i Sanger (1977) ã l i d ng kh năng này b ng vi c s d ng 2´,3´-dideoxynucleotides như là cơ ch t. Khi m t dideoxynucleotide ư c g n vào v trí 3´ t n cùng c a chu i ang kéo dài, s kéo dài chu i ư c k t thúc m t cách ch n l c t i A, C, G, hay T b i chu i thi u m t nhóm 3´-OH t n cùng c a chu i ang kéo dài. Fluorescent Sequencing Các nhãn ư c g n vào các s n ph m DNA kéo dài b ng cách s d ng dideoxynucleotide triphosphates ư c dán nhãn thu c nhu m u 3´. Applied Biosystems DNA sequencers phát hi n các hùynh quang t 4 lo i thu c nhu m khác nhau mà ư c s d ng xác nh các ph n ng kéo dài A, C, G, and T. M i thu c nhu m s phát sáng t i m t bư c sóng khác nhau khi chi u b i m t argon ion laser. Vì v y, t t c 4 màu và 4 bases có th ư c phát hi n và phân bi t. trong m t b n gel ơn hay ư c truy n mao d n. 2.1. PH C H I SINH H C (BIOREMEDIATION) Bioremediation ư c s d ng cho các h th ng sinh h c làm gi m ô nhi m t không khí hay t nư c hay các h th ng t ai. Các vi sinh v t và th c v t là các h th ng sinh h c mà thư ng ư c s d ng. S phân hu sinh h c b i các vi sinh v t xu t hi n thư ng xuyên nh t trong bioremediation. Vi sinh v t có th phân gi i h u h t các h p ch t s d ng cho sinh trư ng, phát tri n và/ho c nhu c u năng lư ng c a chúng. Các quá trình phân hu sinh h c
này có th c n hay không c n không khí. Trong m t s trư ng h p, các con ư ng ng hoá mà các cơ th thư ng s d ng cho s sinh trư ng, phát tri n và ngu n năng lư ng cũng có th ư c s d ng phân gi i các phân t gây ô nhi m. Trong các trư ng h p này mà ư c bi t như là ng- ng hoá (co- metabolism), vi sinh v t không em l i l i ích tr c ti p. Các nhà nghiên c u t n d ng hi n tư ng này và s d ng nó cho các m c ích ph c h i sinh h c. M t quá trình phân hu sinh h c hoàn toàn s ưa n vi c kh c t b i vi c khoáng hoá các ch t gây ô nhi m thành CO2, nư c và các mu i vô cơ vô h i. Quá trình phân hu không hoàn toàn s t o ra các s n ph m b phân gi i mà có th (hay không th ) là ít c h i hơn so v i ch t ô nhi m ban u. Ví d , quá trình phân hu không hoàn toàn tri- hay tetrachloroethylene có th t o ra vinylchloride mà là c và có tính năng gây ung thư cao hơn so v i các h p ch t ban u. Phân hu sinh h c có th xu t hi n m t cách t phát mà trong trư ng h p y các thành ng “ph c h i sinh h c c h u- intrinsic bioremediation” hay “phân gi i t nhiên- natural attenuation” thư ng ư c s d ng. Tuy nhiên, trong nhi u trư ng h p các hoàn c nh t nhiên là không thu n l i cho i u này x y ra do s thi u h t các ch t dinh dư ng, oxygen hay vi khu n thích h p. Tình tr ng như v y có th ư c c i thi n b ng cách b sung m t hay nhi u hơn các i u ki n tiên quy t này. Ví d , các ch t thêm vào ã ư c s d ng y nhanh t c phân gi i d u b tràn trên 1000 miles ư ng b bi n Alaska vào 1989. Xu hư ng tương lai trong ph c h i sinh h c là nhìn vào t c phân hu sinh h c không ư c h tr trư c tiên và ch th c hi n n u có ho t ng không thích h p cho vi c lo i b ch t gây ô nhi m m t cách nhanh chóng ngăn ch n b t kỳ nguy cơ ư c lư ng trư c nào c a ch t gây ô nhi m. Các k thu t ph c h i sinh h c có th ư c s d ng gi m thi u hay lo i b ch t th i c h i gây ô nhi m môi trư ng. Chúng cũng có th ư c s d ng x lý các dòng ch t th i trư c khi chúng ư c th i ra kh i nhà máy. M t s các ng d ng c a ph c h i sinh h c ư c bàn lu n sau ây. 2.1.1 Nư c th i và ch t th i công nghi p: Vi sinh v t trong các nhà máy x lý nư c th i ã lo i b các ch t gây ô nhi m thông thư ng t nư c th i trư c khi nó ư c th i vào các con sông hay bi n. S ô nhi m do các ho t ng công nghi p và nông nghi p càng ngày càng tăng d n n m t nhu c u l n hơn v các quá trình lo i b các ch t gây ô nhi m c bi t, như là các h p ch t nitrogen và phosphore, các kim lo i n ng và các h p ch t chlorine. Các phương pháp m i bao g m các quá trình hi u khí, k khí và hoá- lý trong các h th ng l c c nh (fixed-bed filters) trong các b ph n ng sinh h c (bioreactors) mà ó các v t li u và các vi sinh v t ư c lưu gi trong d ng d ch huy n phù. Các chi phí x lý nư c th i có th ư c gi m b i s chuy n hoá các ch t th i thành các s n ph m h u ích. Ví d , các kim lo i n ng và các h p ch t sulphur có th ư c lo i b t các các dòng ch t th i c a công nghi p m k n b i các vi khu n ng hoá sulphur và tái s d ng. M t ví d khác là s n xu t th c ăn ng v t t sinh kh i n m mà còn l i sau khi s n
xu t penicillin. H u h t các h th ng x lý nư c th i k khí s n xu t khí sinh h c (biogas) có ích. 2.1.2. Nư c u ng: M t phương di n r t quan tr ng c a công ngh sinh h c là ti m năng c a nó trong vi c ph c h i và tinh s ch nư c th i cho s tái s d ng. S quan tâm c a c ng ng v ch t lư ng nư c u ng cũng tăng lên. Không ch nư c c n ư c quay vòng trong s phát tri n c a vi c s d ng b n v ng các ngu n tài nguyên mà ch t lư ng toàn di n cũng ph i ư c c i thi n tho mãn ngư i tiêu dùng. Trong nhi u vùng nông nghi p trên th gi i, ch t th i ng v t và phân bón dư th a d n n n ng cao c a nitrate trong nư c u ng. Công ngh sinh h c ã cung c p các phương pháp thành công mà trong ó các h p ch t này có th ư c lo i b kh i nư c ã ư c s d ng trư c khi nó ư c phân ph i n ngư i tiêu dùng. 2.1.3. Không khí và khí th i: Ban u, các h th ng x lý khí th i công nghi p ã ư c d a trên các b ph n l c r ti n ư c ch a y phân h u cơ (compost) mà ã lo i b ư c các mùi. Các h th ng như th v n t n t i. Tuy nhiên, t c th c hi n ch m và th i h n s d ng c a các b ph n l c là ng n ã ưa các nghiên c u tìm ra các phương pháp t t hơn như là bioscrubbers mà trong ó các ch t gây ô nhi m ư c r a s ch b ng cách s d ng m t d ch huy n phù t bào và các b l c nh gi t sinh h c (biotrickling) mà trong ó ch t gây ô nhi m ư c phân hu b i các vi sinh v t ư c c nh trên m t giá th c nh và ư c cung c p v i m t l p m ng ch t dinh dư ng l ng mà nh gi t qua thi t b . S ch n l a vi sinh v t mà có hi u qu hơn trong vi c ng hoá các ch t gây ô nhi m cũng ã t o ra các b l c sinh h c làm s ch không khí và khí th i t t hơn. Ví d là m t bioscrubber d a trên h th ng lo i b ng th i nitrogen và sulphur oxides t khí ng khói c a lò cao mà ã ư c phát tri n như là m t l a ch n cho quá trình nung vôi truy n th ng, và s lo i b styrene t khí th i c a các ngành công nghi p s n xu t polystyrene b i m t b l c sinh h c ch a n m. 2.1.4. X lý t và m t t: C hai phương pháp in-situ (t i chính v trí ban u c a nó) và ex-situ (m t nơi nào khác) ư c khai thác m t cách thương m i cho m c ích làm s ch t và nư c ng m k t h p. Vi c x lý t i ch (in-situ treatment) có th bao g m vi c b sung các vi sinh v t (bioaugmentation), thông khí và/ho c thêm các sung d ch dinh dư ng (biostimulation). Vi c x lý khác ch phát hi n (ex-situ treatment) liên quan n vi c di chuy n t và nư c ng m và x lý nó trên m t t. t có th ư c x lý như là phân bón h u cơ (compost), trong các ng t hay trong các lò ph n ng bùn chuyên d ng. Nu c ng m ư c x lý trong các lò ph n ng bùn và ho c ư c bơm tr l i vào t hay ư c tháo vào nư c b m t. Ph c h i sinh h c thư ng là r hơn phương pháp lý h c và các s n ph m c a nó là vô h i n u quá trình khoáng hoá hoàn toàn x y ra. Tuy nhiên, ho t ng c a nó có th là tiêu t n th i gian, chi m d ng m t th i gian dài v n u tư và t ai. Ph c h i sinh h c t i ch (in-situ bioremediation) t n m
dư i các tr m xăng d u gi ây ã tr nên ph bi n, nhưng i v i các dung môi ch a clo như là tri- và tetrachloroethylene, vi c ph c h i sinh h c t i ch cũng là có th . Kh năng ng d ng vi c ph c h i sinh h c có th s ph thu c vào các thông s lý h c c a t, ch y u là các c i m v n chuy n c a nó. Ph c h i sinh h c s d ng th c v t ư c g i là phytoremediation. K thu t này hi n nay ư c s d ng lo i b các kim lo i t các t và nư c ng m b ô nhi m và tương lai s ư c ng d ng cho vi c x lý các ch t ô nhi m khác. Vi c s d ng k t h p th c v t và vi khu n cũng là có th . Các vi khu n c ng sinh v i r th c v t và ph thu c vào các ch t ư c ti t ra b i r cây. Các vi khu n vùng r (rhizobacteria) như th , mà s lư ng c a chúng là l n hơn nhi u so v i s lư ng c a các vi khu n t khác, có th ư c bi n i di truy n phá v các ch t ô nhi m. Nghiên c u ang ư c ti n hành ki m tra gi thuy t này. 2.1.5. Ch t th i r n (Solid waste): các ch t th i r n n i a là m t v n chính trong xã h i tiêu dùng c a chúng ta. Vi c lo i b chúng ư c theo dõi thư ng xuyên b i liên quan n ô nhi m nư c ng m và không khí. Tuy nhiên, chúng bao g m m t ph n l n là các ch t h u cơ d phân hu sinh h c. Vì v y, ngu n ư c phân bi t là ch t th i sinh h c có th ư c chuy n thành m t ngu n tài nguyên có giá tr b i vi c và phân gi i k khí. Trong nh ng năm g n ây, quá trình này ã có nh ng bư c phát tri n áng ghi nh n v c thi t k và i u ch nh quá trình. C th là, s phân gi i k khí các ch t th i r n trong các b phân gi i k khí t c cao ã t ư c s ch p nh n ngày càng tăng c a công chúng b i nó cho phép ph c h i m t s lư ng l n khí sinh h c có giá tr cao cùng v i các c n bã h u cơ n nh có ch t lư ng cao và i u này không làm tăng s khó ch u cho môi trư ng. Hơn th n a, s phân gi i k khí c a các ch t th i r n h n h p ang ư c t p trung phát tri n b i vì trong tương lai g n, nó có th là m t bư c quan tr ng trong vòng tu n hoàn c a ch t th i r n và là m t gi i pháp ư c ch n l a cho s phân hu rác. 2.2. NGĂN CH N (PREVENTION) Càng ngày càng có nhi u nhà máy công nghi p phát tri n các quy trình v i kh năng tác ng n môi trư ng ã ư c gi m thi u áp ng v i l i kêu g i toàn c u v s phát tri n c a m t xã h i b n v ng. Có m t khuynh hư ng r ng kh p v các s n ph m và các quy trình ít gây h i; cách xa vi c x lý “end- of-pipe” c a các dòng th i. Công ngh sinh h c là thích h p hơn h n óng góp vào khuynh hư ng này trong nhi u trư ng h p, c vi c c i thi n các quy trình ang t n t i và phát tri n các quy trình m i. 2.2.1. C i ti n quy trình: Nhi u quy trình công nghi p ã ư c thi t k sao cho thân thi n hơn v i môi trư ng b i vi c s d ng các enzymes. Enzymes là nh ng ch t xúc tác sinh h c mà có hi u qu cao và có ưu i m hơn nhi u so v i các ch t xúc tác không ph i là sinh h c. Chúng không c và có th ư c phân gi i sinh h c, ho t ng t t nh t các nhi t v a ph i và trong các i u ki n ôn hoà, và có các ph n ng ph ít hơn so v i các phương pháp truy n th ng b i vì chúng có tính c
hi u cao. Các phương pháp s n xu t mà ng d ng các enzymes nói chung không ch là s ch hơn và an toàn hơn so v i các phương pháp khác, mà h u như cũng kinh t hơn v năng lư ng và tiêu dùng tài nguyên. Tuy nhiên, tính c hi u c a chúng ng ý là thư ng không d dàng tìm th y enzyme thích h p cho m t ng d ng c n thi t. Các enzymes ã ư c ng d ng r ng rãi trong công nghi p nhi u năm qua. Các k thu t m i và các hư ng ti p c n liên quan n thi t k protein và mô hình phân t ang t o i u ki n cho các nhà nghiên c u có th phát tri n các enzyme mong mu n ho t ng ư c t i các nhi t cao, trong các dung môi không l ng và dư i d ng các ch t r n. 2.2.2. i m i s n ph m (Product innovation): Công ngh sinh h c cũng có th giúp cho vi c s n xu t các s n ph m m i mà ít tác ng n môi trư ng hơn là các ti n nhi m c a chúng. Vi c s n xu t các v t li u sinh h c m i như là nh a sinh h c tránh vi c s d ng các ngu n tài nguyên không th tái t o ư c như các năng lư ng hoá th ch. Khoai tây bình thư ng ch a 80% amylopectin nhưng cũng ch a kho ng 20% amylose mà không ư c mong mu n trong nhi u ng d ng. phân l p amylopectin tinh khi t, m t lư ng l n nư c và năng lư ng ư c tiêu th . M t công ty Hà Lan ã phát tri n m t gi ng khoai tây ư c bi n i di truy n mà không ch a amylose và vì v y có th có quy trình ho t ng v i ít tác ng n môi trư ng hơn. Vi c s d ng các gi ng th c v t ư c bi n i gen mà có kh năng kháng côn trùng và/ho c d ch b nh có th ư c h n ch áng k vi c s d ng thu c tr sâu mà không ch ngăn ch n vi c s d ng các v t li u thô h u như không th tái t o ư c, năng lư ng và nhu c u lao ng cho vi c s n xu t chúng, mà cũng s làm gi m các tác ng có h i c a vi c tích lu chúng. Có nhi u hơn các gi pháp công ngh sinh h c này cho s ô nhi m ã và ang ư c phát tri n. Ch ng h n, l n và gà không th s d ng phosphate t phytate có trong th c ăn c a chúng, vì v y s hi n di n trong phân c a chúng. B ng vi c thêm enzyme phytase vào th c ăn c a chúng, lư ng phosphate mà ư c th i ra b i các ng v t này có th ư c gi m g n hơn 30 %. Nam Phi, các vi khu n ư c s d ng phân l p vàng t qu ng vàng. i u này cũng ư c g i là biomining ti t ki m m t s lư ng l n năng lư ng gây nóng ch y và t o ra ch t th i ít hơn nhi u. Vi c s n xu t hoá ch t indigo, là thu c nhu m mà ư c s d ng cho qu n jean xanh và ti n hành qua 8 bư c, vi c s d ng các hoá ch t r t c và quy nh b o v c bi t cho ngư i v n hành quy trinh và môi trư ng. Vi c s n xu t indigo b ng công ngh sinh h c mà s d ng m t vi khu n ư c bi n i di truy n ch a các enzymes phù h p, ch ti n hành trong 3 bư c, proceeds trong nư c, s d ng các v t li u thô ơn gi n như ư ng và mu i và ch t o ra indigo, carbon dioxide và sinh kh i mà có th ư c phân gi i sinh h c. Các phát tri n trong tương lai có th liên quan n nhi u i u mà t i th i i m này dư ng như là khoa h c vi n tư ng i v i h u h t ngư i dân như là s thay th các siêu s i ư c s n xu t b ng phương pháp hoá h c b i s i tơ m ng nh n ư c s n xu t b ng phương pháp vi sinh v t. Tuy nhiên, m t i u mà không nên b quên là vi c s d ng gia tăng các h th ng sinh h c trong công
nghi p nên ư c kèm theo b i s t p hu n và s b o v thích h p cho các công nhân làm vi c v i nh ng h th ng này, như là trong các b ph n khác c a công ngh . 2.3. PHÁT HI N VÀ GIÁM SÁT (DETECTION AND MONITORING) 2.3.1. Phát hi n và giám sát các ch t ô nhi m (Detection and monitoring of pollutants): M t ph m vi r ng c a các phương pháp sinh h c rõ ràng ư c s d ng phát hi n các bi n c ô nhi m và giám sát m t cách liên t c các ch t gây ô nhi m. Các thư c o ã ư c thi t l p t lâu bao g m: m s lư ng các loài th c v t, ng v t và vi sinh v t, m s lư ng các cá nhân trong nh ng loài ó hay phân tích n ng oxygen, methane hay các ph c h p khác trong nư c. G n ây hơn, các phương pháp phát hi n sinh h c s d ng các c m bi n sinh h c (biosensors) và các xét nghi m mi n d ch (immunoassays) ã ư c phát tri n và bây gi ang ư c thương m i hoá. H u h t các biosensors là m t s k t h p c a các thi t b sinh h c và i n t -thư ng hay ư c xây d ng trên m t microchip. H p ph n sinh h c có th ơn gi n là là m t enzyme hay kháng th , ho c th m chí là m t khu n l c vi khu n, m t màng, i m nh n th n kinh, hay m t cơ th toàn v n. ư c c nh trên m t cơ ch t, các c tính c a chúng thay i tương ng v i m t s nh hư ng môi trư ng trong m t cách mà có th ư c phát hi n b ng i n hay quang h c. Sau ó s lư ng c a ch t gây ô nhi m có th ư c xác nh v i m t s chính xác h t s c hay s nhay c m r t cao. Các c m bi n có th ư c thi t k có ch n l a k lư ng, hay nh y c m i v i m t ph r ng các ph c ch t. Ví d , m t ph r ng các ch t di t c có th ư c phát hi n trong nư c sông b ng cách s d ng các biosensors t t o; nh ng áp l c tác ng lên các cơ th ư c ánh giá d a vào s thay i trong các c tính quang h c c a chlorophyll c a th c v t. Các biosensors vi sinh v t là các vi sinh v t mà sinh ra m t ph n ng khi ti p xúc v i ch t ư c nh n bi t. Thông thư ng chúng phát sáng nhưng ng ng l i th c hi n ph n ng khi ti p xúc v i các ch t mà là c i v i chúng. C hai lo i vi sinh v t phát sáng xu t hi n m t cách t nhiên cũng như là vi sinh v t ư c phát tri n m t cách c bi t u ư c s d ng. Các biosensors vi khu n ho t ng m t cách ch c ch n ã ư c t o ra mà b t u phát sáng khi ti p xúc (và sau ó là ph n ng) v i m t ch t gây ô nhi m c hi u. M , m t vi khu n phát sáng như th ã ư c ch p nh n cho m c ích phát hi n các polyhalogenated aromatic hydrocarbons trong các test th c a. Các xét nghi m mi n d ch s d ng các kháng th ã ư c dán nhãn (các protein ph c t p ư c s n xu t ra trong áp ng sinh h c v i các tác nhân c hi u) và các enzymes o các n ng c a ch t gây ô nhi m. N u m t ch t gây ô nhi m hi n di n, kháng th s g n vào nó; nhãn làm cho nó có th ư c phát hi n ho c là thông qua s thay i màu s c, phát huỳnh quang ho c là ho t ng phóng x . Các xét nghi m mi n d ch c a các d ng khác nhau ã ư c phát tri n cho vi c qu n lý thu c tr sâu như là dieldrin và parathion m t cách liên t c, t ng và không t. B n ch t c a nh ng k thu t này, mà nh ng k t qu
c a chúng có th ơn gi n như là m t s thay i màu s c, khi n cho chúng c bi t thích h p cho các test th c a có nh y c m cao, nơi mà th i gian và các trang thi t b l n là ư c c n cho vi c ki m tra truy n th ng hơn là không th c t . Tuy nhiên vi c s d ng chúng b gi i h n i v i các ch t gây ô nhi m mà có th phá v các kháng th sinh h c. N u các ch t ô nhi m là ph n ng quá m nh, chúng ho c là s tàn phá kháng th ho c là ki m ch ho t ng c a nó và vì v y cũng ki m ch s hi u qu c a vi c ki m tra. 2.3.3. Phát hi n và giám sát các vi sinh v t ư c s d ng cho ph c h i sinh h c: Khi các vi sinh v t ư c nuôi c y trong phòng thí nghi m ư c gây c y vào m t v trí ph c h i sinh h c (bioaugmentation), thư ng c n giám sát s hi n di n c a chúng và/ho c s tăng s lư ng ki m tra ti n trình c a quá trình. i u này là c bi t úng và th m chí ư c yêu c u khi liên quan n các vi sinh v t ư c bi n i di truy n. Các k thu t truy n th ng nh m phát hi n s hi n di n c a các vi sinh v t trong t là t tr c ti p trên các ĩa ch a các môi trư ng c hi u (selective media). i u này là thu n l i l n n u cơ th ch a m t d u hi u (marker) mà có th ư c tuy n ch n. Các k thu t m i hơn bao g m các k thu t thi t b c m bi n sinh h c d a vào mi n d ch và ánh sáng như ã ưc c p trên ây. S phân b v m t không gian c a các vi sinh v t c bi t trong m t m u v t có th ư c xác nh b ng kính hi n vi và b ng non- invasively b i vi c s d ng fluorescent in situ hybridisation (FISH) c a vi sinh v t. K thu t nh y c m và c hi u nh t là phân l p tr c ti p và khu ch i DNA t t, mà càng ngày càng ư c s d ng r ng rãi. 2.3.4. Phát hi n và giám sát các nh hư ng sinh thái h c: Ph c h i sinh h c t ra m c ích c i thi n ch t lư ng môi trư ng b ng vi c lo i b ch t gây ô nhi m. Tuy nhiên, s bi n m t c a ch t gây ô nhi m ban u không ph i là tiêu chu n duy nh t mà nh ó s thành công c a m t quá trình ph c h i sinh h c ư c xác nh. Các s n ph m chuy n hoá là c (th m chí còn c hơn) có th ư c sinh ra t ch t ô nhi m hay m t vi khu n có kh năng phân hu sinh h c có th gây ra các b nh hay sinh ra các ch t mà là c h i cho các vi sinh v t có ích, th c v t, ng v t hay con ngư i. T t c các nh hư ng tiêu c c này t t nhiên là ư c lo i tr trư c nhi u như có th b ng cách thu th p thông tin liên quan v i cơ th thông qua các nghiên c u t ng quan l n và các nghiên c u nh mà trong ó quá trình ph c h i sinh h c ư c tái hi n trong phòng thí nghi m. tránh các nh hư ng không mong i, c bi t là sau khi b sung thành viên m i c a h sinh thái như là m t cơ th ư c bi n i di truy n, vi c giám sát các nh hư ng sinh thái c a m t quá trình ph c h i sinh h c có th ư c yêu c u. V n c a vi c giám sát các nh hư ng sinh thái là cái gì ư c giám sát . Các nh hư ng sinh thái có th là r t phong phú, nhưng không ph i t t c chúng có th liên quan n hay th m chí là k t qu c a s v n hành quá trình ph c h i sinh h c. Các thông s ư c giám sát thông thư ng ư c xác nh tt trư ng h p này sang trư ng h p khác (case-by-case). Các k thu t giám sát có th bao g m t t c các k thu t ã ư c c p n trong hai ti u ph n trư c ây v phát hi n và giám sát.
2.4. K THU T DI TRUY N (GENETIC ENGINEERING) K thu t DNA tái t h p ã có nh ng nh hư ng áng ng c nhiên trong vài năm qua. Các nhà sinh h c phân t ã l p b n toàn b b gen, nhi u phương thu c m i ã ư c phát tri n và ư c gi i thi u, và các nhà nông nghi p ang t o ra các gi ng cây tr ng có kh năng kháng b nh mà không th có ư c thông qua vi c t o gi ng truy n th ng. M t vài ví d ã ư c c p trư c ây như khoai tây không ch a amylose và các vi khu n s n xu t indigo (thu c nhu m chàm) cũng liên quan n vi c s d ng các cơ th ư c bi n i di truy n b ng k thu t DNA tái t h p . Nhi u enzymes thư ng cũng ư c s n xu t b i các cơ th bi n i di truy n. Trư c s a d ng r t l n c a loài, các phân t sinh h c và các con ư ng ng hoá trên hành tinh này, k thu t di truy n v nguyên t c có th là công c c l c trong vi c t o ra các l a ch n thân thi n hơn v i môi trư ng cho các s n ph m và các quy trình mà hi n t i gây ô nhi m môi trư ng hay s d ng c n ki t các ngu n tài nguyên không tái t o. Chính tr , kinh t và xã h i cu i cùng s xác nh các kh năng nào c a khoa h c s tr thành hi n th c. Ngày nay, các cơ th cũng có th ư c b sung v i nh ng c i m di truy n thêm vào cho kh năng phân hu sinh h c c a các ch t gây ô nhi m c bi t n u các cơ th xu t hi n m t cách t nhiên là không th làm ư c công vi c ó m t cách thích h p hay không nhanh. B ng vi c k t h p các kh năng ng hoá khác trong cùng m t vi sinh v t, các c chai trong s làm s ch môi trư ng có th ư c. Cho n bây gi i u này v n chưa ư c th c hi n trên b t kỳ m t quy mô áng k nào. Nguyên nhân chính c a s th t này là trong h u h t các trư ng h p, các vi sinh v t xu t hi n m t cách t nhiên có th ư c phát hi n hay tuy n ch n, mà có th làm s ch m t v trí b ô nhi m. các ví d ã ư c phát hi n t i nơi mà các vi khu n t ã phát tri n các c tính m i áp ng v i s ưa vào các ch t ngo i lai xenobiotics ( ó là các hoá ch t nhân t o mà thông thư ng không ư c phát hi n trong t nhiên). Trong m t vài trư ng h p chúng th m chí dư ng như có các c tính ư c òi h i t các loài khác nhau. M , m t vài vi khu n ư c bi n i di truy n ã ư c ch p nh n cho các m c ích ph c h i sinh h c nhưng các ng d ng quy mô l n v n chưa ư c báo cáo. Châu Âu ch các test th c a ư c ư c kh ng ch là ư c công nh n. B i vì các cơ th m i có th ư c t o ra b i k thu t di truy n mà có th chưa bao gi ư c t o ra do ch n l c t nhiên d n n s ti n hoá, t n t i nh ng quan tâm v vi c không th tiên oán ư c các m i quan h qua l i có th có c a chúng v i h sinh thái. Các cơ th bi n i di truy n mà ư c gi m t cách thích h p trong các confines of their approved production facilities là ít ư c quan tâm hơn nhi u so v i các cơ th ư c bi n i di truy n mà ư c th nào trong môi trư ng như các cây kháng b nh hay các vi khu n t cho s ph c h i sinh h c. Các nh hư ng sinh thái h c có th có c a v n sau th m chí là khó khăn hơn ánh giá do s th t là các vi khu n t ư c bi t rõ r ng thư ng xuyên trao i v t li u di truy n (cũng x y ra gi a các loài khác nhau). i u này cùng v i s th t r ng chúng ta ít ư c bi t n ph n r t l n c a các loài vi khu n s ng trong t, khi n cho h u như không th tiên oán ư c s ph n c a m i b n sao
DNA c a m t c tính di truy n m i ư c ưa vào trong m t vi khu n t. N u DNA thêm vào có ngu n g c t m t vi khu n t khác, là h p lý tranh cãi r ng m t ngày nào ó vi khu n ư c bi n i di truy n cũng có th ti n hoá ng th i do s trao i thư ng xuyên v t li u di truy n trong t.