Đ I H C BÁCH KHOA HÀ N IẠ Ọ Ộ
VI N CÔNG NGH SINH H C VÀ CÔNGỆ Ệ Ọ
NGH TH C PH MỆ Ự Ẩ
TI U LU N:Ể Ậ
XÁC Đ NH D L NG CARBAMATEỊ Ư ƯỢ
TRONG M U RAU VÀ G NG B NGẪ Ừ Ằ
PH NG PHÁP S C KÝ L NG CAOƯƠ Ắ Ỏ
ÁP (HPLC).
H C VIÊN:ỌNGUY N TH H NG GIANGỄ Ị ƯƠ
MÃ HV: CB101191
L P: ỚCHTP 2010 – 2012
Năm 2011
I. GIỚI THIỆU
Th i gian g n đây tình trờ ầ ạng thực phẩm nhiễm d ưlượng thuốc bảo vệ
thực vật quá mức cho phép vẫn đang diễn ra hết sức nghiêm trọng. Nhiều vụ
ng độ ộc thực phẩm xảy ra hàng loạt, được xác định có liên quan đến dư
lượng thuốc bảo v ệthực vật có trong rau, củ, quả. Không ch d ng l i m cỉ ừ ạ ở ứ
đ gây ng đ c, d l ng thu c b o v th c v t còn l i trong rau qu cònộ ộ ộ ư ượ ố ả ệ ự ậ ạ ả
đ c nghi ng là có nh ng m i nguy l n nh kh năng gây ung th hay đ tượ ờ ữ ố ớ ư ả ư ộ
bi n gen. Do đó, vi c xác đ nh d l ng thu c tr sâu còn l i trong rau qu làế ệ ị ư ượ ố ừ ạ ả
vi c làm h t s c c n thi t đ xác đ nh m c đ an toàn c a rau và đ ngănệ ế ứ ầ ế ể ị ứ ộ ủ ể
ch n nh h ng trên ng i, đ ng v t và môi tr ng s ng. M t trong nh ngặ ả ưở ườ ộ ậ ườ ố ộ ữ
nhóm thu c b o v th c v t đ c s d ng r t ph bi n hi n nay là thu c trố ả ệ ự ậ ượ ử ụ ấ ổ ế ệ ố ừ
sâu h Carbamate (CBM).ọ
Thu c tr sâu h Carbamate là lo i thu c tr sâu th ng m i có hi uố ừ ọ ạ ố ừ ươ ạ ệ
qu cao, ảđược dùng nhiều trong nông nghiệp nh ưlà thuốc tr ừsâu, tr ừcỏ, trừ
nấm,.... Có hơn 50 loại CBM được biết tới phần lớn là t ừtổng hợp, được sử
dụng khá ph ổbiến trong nông nghiệp t nh ng năm 1960 nh tác d ng đ cừ ữ ờ ụ ộ
trên côn trùng cao. Nh ng thu c tr sâu h Carbamate đ c s d ng thay thữ ố ừ ọ ượ ử ụ ế
cho nh ng lo i thu c tr sâu ch a Clo nh DDT hay ch a phosphor, b i ữ ạ ố ừ ứ ư ứ ở CBM
không bền, d ễb ịphân hủy dưới tác động của môi trường. Tuy nhiên, thu cố
tr sâu h c Carbamate đ c nghi ng là có kh năng gây ung th và đ t bi nừ ọ ượ ờ ả ư ộ ế
gen b i chúng cũng là nh ng ch t gây c ch enzyme acetylcholinesterase.ở ữ ấ ứ ế
CBM đa s ốlà những chất độc đối với con người được xếp vào nhóm độc I
hoặc II là những chất độc và cực độc theo tiêu chuẩn Việt Nam. Vi c tăng sệ ử
d ng thu c tr sâu h Carbamate đ t ra v n đ v nguy c đ i v i nghụ ố ừ ọ ặ ấ ề ề ơ ố ớ ề
tr ng rau mà môi tr ng s ng c a con ng i.ồ ườ ố ủ ườ
Carbamate (CBM) là nhóm thuốc bảo v ệthực vật có công thức chung :
O
||
R1NH - C - OR2
Trong đó R1 và R2 là aryl hoặc ankyl.
Các nghiên cứu trước đây đã công b ốnhiều phương pháp phân tích d ưlượng
CBM trong nước, thực phẩm như: Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ
(GC/MS), phương pháp sắc ký khí đầu dò bắt gi đữiện t ử(GC/ECD). Tuy
nhiên, cho đến nay những phương pháp này không thông dụng do gặp một số
tr ởngại, đó là tính khó bay hơi và không bền nhiệt của CBM.
Ph ng pháp s cươ ắ ký lỏng cao áp (HPLC) đầu dò huỳnh quang (FD) có
tạo dẫn xuất sau cột đ c coi là m t ph ng pháp có tính u vi t, đ c sượ ộ ươ ư ệ ượ ử
d ng hi n nay đ xác đ nh 10 lụ ệ ể ị ọai carbamate ph ổbiến thường dùng làm thuốc
bảo v ệthực vật: Aldicard Sulfoxide; Aldicarb sulfone; Oxamyl; Methomyl; 3-
Hydroxycarbofuran; Aldicarb; Propoxur; Carbofuran; Carbaryl; Methiocarb.
Nguyên tắc của phương pháp HPLC tạo dẫn xuất sau cột là dựa vào
đặc tính không bền của nhóm CBM trong môi trường kiềm. Sau khi từng loại
CBM tách trên cột sắc ký pha đảo, được thủy phân trong môi trường bazơ
sinh ra methyl amin, sau đó methyl amin phản ứng với thuốc th ửO –
phthalaldehyde (OPA) và 2 – mercaptoethanol tạo ra dẫn xuất huỳnh quang 1 –
hydroxytylthio – 2 – metylisoindol.
Phản ứng phân hủy CBM trong môi trường baz ơ(phản ứng xảy ra nhanh hơn
dưới tác dụng của nhiệt độ).
Phản ứng của methyl amin với thuốc th ửsinh ra hợp chất huỳnh quang 1-
hydroxytylthio – 2 – metylisoindol. Chất này có cực đại hấp thu khoảng 340
nm và cực đại phát x ạ440-460 nm.
Do đó, HPLC được công nhận là phương pháp rất nhạy và khá chọn lọc với
CBM và tr ởthành phương pháp tiêu chuẩn của t ổchức môi trường th ếgiới
phân tích CBM trong đất, nước, thực phẩm...
II. KH O SÁT QUY TRÌNH XÁC Đ NH D L NGẢ Ị Ư ƯỢ
CBM TRONG RAU VÀ G NGỪ.
2.1. Thiết bị
H ệthống HPLC Shimadzu với h ệphản ứng sau cột, đầu dò huỳnh quang
(FD), cột phân tích C18, máy lọc nước và trao đổi ion millipore.
H ệthống tiêm mẫu t đự ộng SIL – 20A Shimadzu, đầu dò huỳnh quang RF -
10 Axl có tạo dẫn xuất sau cột.
Cột phân tích HRC - ODS AS0678 Kích thước 20 cm x 4.6 mm x 5 μm
Cột bảo v ệGHRC - ODS FU3445
Injector tiêm t đự ộng SIL - 20A
B độiều nhiệt CRB - 6A
Một s ốthiết b ịkhác
Hình 1: Máy HPLC
2.2 Hóa chất
Hỗn hợp chuẩn 10 loại CBM 100 ppm được pha trong methanol do
Supelco cung cấp. Tất c ảcác dung môi và nước đều đạt tiêu chuẩn s ửdụng
cho HPLC và được lọc qua màng lọc 0.45 μm.
2.3 Các thông s ốcủa h ệHPLC
- Tiêm 10 μl mẫu, pha động MeOH và nước, tốc đ ộ1.000 ml/phút, chế
đ độ ẳng dòng không th ểphân tích 10 loại CBM vì th ếphải dùng ch đế ộ
gradient dòng nh ưsau:
- Bước sóng kích thích: 340 nm; Bước sóng phát xạ: 445 nm; Nhiệt đ ộlò
phản ứng: 95 – 1020C; VOPA: 0.15 ml/phút; VNaOH: 0.2 ml/phút;Nồng độ
OPA: 0.25 mM; Nồng đ β ộ– mercapropionic: 125 ppm; Nồng đ ộNaOH : 50
mM; Nồng đ độ ệm 80 – 100 mM.
- Tổng thời gian chạy là 60 phút đ ểlàm sạch cột.
2.4 Chẩn b ịmẫu
Mẫu rau và g ng sau khi ừđược l y t n i c n kh o sát đ c bấ ừ ơ ầ ả ượ ảo quản
trong t ủlạnh. Nhặt b ỏhết lá rau vàng úa, g ng g t v . Sau ừ ọ ỏ đó tiến hành chiết
tách và làm giàu mẫu bằng hai phương pháp chiết pha rắn (SPE) và chiết lỏng
lỏng (LLS) nh ưquy trình 1 và quy trình 2. Cột SPE C18 - 500 mg của Varian.
Dung môi dùng cho chiết lỏng lỏng là dichloromethane (CH2Cl2) (b.p 40oC).
Tiến hành chiết 3 lần làm sạch bằng silica. Đuổi dung môi bằng khí N2 khan
tinh khiết 99.99% sau đó lọc qua màng lọc 0.2 μm trước khi phân tích. Thêm
chuẩn lần lượt 100 ppb, 500 ppb, 1500 ppb đ đểánh giá đ độúng và đ ộtin cậy
của phương pháp.