Ạ Ọ Ệ
Ệ
Đ I H C BÁCH KHOA HÀ N I Ộ VI N CÔNG NGH SINH H C VÀ CÔNG NGH TH C PH M Ự
Ọ Ẩ
Ệ
TI U LU N:
Ậ
Ể
Ị
Ư ƯỢ
Ừ
Ẫ
Ỏ
NG CARBAMATE XÁC Đ NH D L Ằ TRONG M U RAU VÀ G NG B NG PH NG PHÁP S C KÝ L NG CAO Ắ ƯƠ ÁP (HPLC).
NG GIANG
Ọ
Ị ƯƠ
NGUY N TH H Ễ CB101191 CHTP 2010 – 2012
H C VIÊN: MÃ HV: L P: Ớ
Năm 2011
I. GIỚI THIỆU
ờ Th i gian g n đây tình tr ầ
i ỉ ừ ả ạ ộ ộ ờ ố ố
ạ ủ ể ố c s d ng r t ph bi n hi n nay là thu c tr ệ ự ậ ượ ử ụ ổ ế ệ ấ ố ạng thực phẩm nhiễm d ư lượng thuốc bảo vệ thực vật quá mức cho phép vẫn đang diễn ra hết sức nghiêm trọng. Nhiều vụ ng độ ộc thực phẩm xảy ra hàng loạt, được xác định có liên quan đến dư ạ ở ứ m c lượng thuốc bảo v ệ thực vật có trong rau, củ, quả. Không ch d ng l i trong rau qu còn ng thu c b o v th c v t còn l đ gây ng đ c, d l ệ ự ậ ả ư ượ ộ c nghi ng là có nh ng m i nguy l n nh kh năng gây ung th hay đ t đ ộ ư ượ ư ả ớ ữ ả ng thu c tr sâu còn l i trong rau qu là bi n gen. Do đó, vi c xác đ nh d l ệ ừ ố ư ượ ị ế t đ xác đ nh m c đ an toàn c a rau và đ ngăn vi c làm h t s c c n thi ộ ị ế ể ệ ứ ế ứ ầ ng s ng. M t trong nh ng ch n nh h ữ i, đ ng v t và môi tr ng trên ng ộ ườ ậ ộ ườ ưở ặ ả nhóm thu c b o v th c v t đ ừ ố ả sâu h Carbamate (CBM). ọ ố ọ ố ạ ừ ừ ả ươ ạ ừ sâu, tr Thu c tr sâu h Carbamate là lo i thu c tr sâu th được dùng nhiều trong nông nghiệp nh ư là thuốc tr
ữ ừ ụ ờ c s d ng thay th ố ừ ữ ố ạ ữ ừ ứ
ừ ư ọ ờ ộ ả ế ứ ấ ở
ệ ơ ố ớ ề ề ừ ấ i. ọ ng s ng c a con ng ủ ườ ố ng m i có hi u ệ ừ cỏ, trừ qu cao, ừ tổng hợp, được sử nấm,.... Có hơn 50 loại CBM được biết tới phần lớn là t nh ng năm 1960 nh tác d ng đ c ộ dụng khá ph ổ biến trong nông nghiệp t ế trên côn trùng cao. Nh ng thu c tr sâu h Carbamate đ ọ ượ ử ụ ở CBM cho nh ng lo i thu c tr sâu ch a Clo nh DDT hay ch a phosphor, b i ư ứ không bền, d ễ b ị phân hủy dưới tác động của môi trường. Tuy nhiên, thu cố ế c nghi ng là có kh năng gây ung th và đ t bi n tr sâu h c Carbamate đ ượ gen b i chúng cũng là nh ng ch t gây c ch enzyme acetylcholinesterase. ữ CBM đa s ố là những chất độc đối với con người được xếp vào nhóm độc I ử hoặc II là những chất độc và cực độc theo tiêu chuẩn Việt Nam. Vi c tăng s d ng thu c tr ề sâu h Carbamate đ t ra v n đ v nguy c đ i v i ngh ụ ặ ố tr ng rau mà môi tr ồ ườ Carbamate (CBM) là nhóm thuốc bảo v ệ thực vật có công thức chung :
O || R1NH - C - OR2
đữ iện t
Trong đó R1 và R2 là aryl hoặc ankyl. Các nghiên cứu trước đây đã công b ố nhiều phương pháp phân tích d ư lượng CBM trong nước, thực phẩm như: Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS), phương pháp sắc ký khí đầu dò bắt gi ử (GC/ECD). Tuy nhiên, cho đến nay những phương pháp này không thông dụng do gặp một số tr ở ngại, đó là tính khó bay hơi và không bền nhiệt của CBM. Ph c coi là m t ph t, đ ươ ư ệ ộ ượ ị ệ ể
ắ ký lỏng cao áp (HPLC) đầu dò huỳnh quang (FD) có ng pháp s c ươ ượ ử c s ng pháp có tính u vi tạo dẫn xuất sau cột đ ọai carbamate ph ổ biến thường dùng làm thuốc d ng hi n nay đ xác đ nh 10 l ụ bảo v ệ thực vật: Aldicard Sulfoxide; Aldicarb sulfone; Oxamyl; Methomyl; 3- Hydroxycarbofuran; Aldicarb; Propoxur; Carbofuran; Carbaryl; Methiocarb.
Nguyên tắc của phương pháp HPLC tạo dẫn xuất sau cột là dựa vào đặc tính không bền của nhóm CBM trong môi trường kiềm. Sau khi từng loại CBM tách trên cột sắc ký pha đảo, được thủy phân trong môi trường bazơ
sinh ra methyl amin, sau đó methyl amin phản ứng với thuốc th ử O – phthalaldehyde (OPA) và 2 – mercaptoethanol tạo ra dẫn xuất huỳnh quang 1 – hydroxytylthio – 2 – metylisoindol. Phản ứng phân hủy CBM trong môi trường baz ơ (phản ứng xảy ra nhanh hơn dưới tác dụng của nhiệt độ).
Phản ứng của methyl amin với thuốc th ử sinh ra hợp chất huỳnh quang 1- hydroxytylthio – 2 – metylisoindol. Chất này có cực đại hấp thu khoảng 340 nm và cực đại phát x ạ 440-460 nm.
ở thành phương pháp tiêu chuẩn của t Do đó, HPLC được công nhận là phương pháp rất nhạy và khá chọn lọc với CBM và tr ổ chức môi trường th ế giới phân tích CBM trong đất, nước, thực phẩm...
Ả
Ị
Ư ƯỢ NG
II. KH O SÁT QUY TRÌNH XÁC Đ NH D L CBM TRONG RAU VÀ G NGỪ .
đự ộng SIL – 20A Shimadzu, đầu dò huỳnh quang RF -
đự ộng SIL - 20A
2.1. Thiết bị H ệ thống HPLC Shimadzu với h ệ phản ứng sau cột, đầu dò huỳnh quang (FD), cột phân tích C18, máy lọc nước và trao đổi ion millipore. H ệ thống tiêm mẫu t 10 Axl có tạo dẫn xuất sau cột. Cột phân tích HRC - ODS AS0678 Kích thước 20 cm x 4.6 mm x 5 μm Cột bảo v ệ GHRC - ODS FU3445 Injector tiêm t B độ iều nhiệt CRB - 6A Một s ố thiết b ị khác
Hình 1: Máy HPLC
2.2 Hóa chất
Hỗn hợp chuẩn 10 loại CBM 100 ppm được pha trong methanol do Supelco cung cấp. Tất c ả các dung môi và nước đều đạt tiêu chuẩn s ử dụng cho HPLC và được lọc qua màng lọc 0.45 μm.
2.3 Các thông s ố của h ệ HPLC - Tiêm 10 μl mẫu, pha động MeOH và nước, tốc đ ộ 1.000 ml/phút, chế đ độ ẳng dòng không th ể phân tích 10 loại CBM vì th ế phải dùng ch đế ộ gradient dòng nh ư sau:
Bước sóng kích thích: 340 nm; Bước sóng phát xạ: 445 nm; Nhiệt đ ộ lò - phản ứng: 95 – 1020C; VOPA: 0.15 ml/phút; VNaOH: 0.2 ml/phút;Nồng độ OPA: 0.25 mM; Nồng đ β ộ – mercapropionic: 125 ppm; Nồng đ ộ NaOH : 50 mM; Nồng đ độ ệm 80 – 100 mM. - Tổng thời gian chạy là 60 phút đ ể làm sạch cột.
n i c n kh o sát đ
2.4 Chẩn b ị mẫu ừ
ả được l y t ấ ừ ơ ầ ừ ọ ỏ Mẫu rau và g ng sau khi ủ lạnh. Nhặt b ỏ hết lá rau vàng úa, g ng g t v . Sau
c b ượ ảo quản trong t đó tiến hành chiết tách và làm giàu mẫu bằng hai phương pháp chiết pha rắn (SPE) và chiết lỏng lỏng (LLS) nh ư quy trình 1 và quy trình 2. Cột SPE C18 - 500 mg của Varian. Dung môi dùng cho chiết lỏng lỏng là dichloromethane (CH2Cl2) (b.p 40oC). Tiến hành chiết 3 lần làm sạch bằng silica. Đuổi dung môi bằng khí N2 khan tinh khiết 99.99% sau đó lọc qua màng lọc 0.2 μm trước khi phân tích. Thêm chuẩn lần lượt 100 ppb, 500 ppb, 1500 ppb đ để ánh giá đ độ úng và đ ộ tin cậy của phương pháp.
Khi cô quay MeOH bay hơi, dung dịch b đị ục là do một s ố chất ít phân cực tan tốt trong MeOH hơn trong nước. Dung dịch sau khi cô quay đối với mẫu rau còn khoảng 30 ml, đối với mẫu gừng khoảng 15 ml đ để ảm bảo t ỉ l ệ MeOH: ệ MeOH:H2O khoảng 1 : 2 thì hiệu suất của quá H2O khoảng 1: 2. Ứng với t ỉ l trình chiết lỏng-lỏng đạt cao nhất.
Đối với quy trình này thì dung dịch sau khi cô quay phải đuổi được gần như hoàn toàn MeOH. Nếu lượng MeOH còn lại nhiều thì s ẽ làm tăng kh ả năng rửa giải của dung dịch, khi cho qua cột C18 thì một s ố CBM tương đối phân cực s ẽ b ị rửa giải ra khỏi cột gây mất mẫu là cho hiệu suất thu hồi thấp.
III. KẾT QUẢ
Đầu dò FD chọn lọc với CBM, đ ộ nhạy cao, giới hạn định lượng chỉ
3.1.Đánh giá đ ộ nhạy và đ ộ tin cậy của phương pháp - vài ppb. -
Đ ộ tuyến tính 0.9980 – 0.9995.
Bảng 1. Giới hạn phát hiện của phương pháp
Hình 2. Sắc kí đ ồ chuẩn 100 ppb
Ghi chú: 1: Aldicard Sulfoxide; 2: Aldicarb sulfone; 3: Oxamyl; 4: Methomyl; 5: 3 – Hydroxycarbofuran; 6: Aldicarb; 7: Propoxur; 8: Carbofuran; 9: Carbaryl; 10: Methiocarb
3.2. Đánh giá hi u su t thu h i ồ ệ Hi u su t thu h i t 75 – 95%. ồ ươ ấ
ấ ng đ i cao t ố
ừ ệ
ấ ệ Ch t phân tích Hi u su t thu h i TB (%) ± RSD ồ ( n = 3) ấ
M u rau ± RSD M u g ng ± RSD ẫ ẫ ừ
Aldicard Sulfoxide Aldicarb sulfone Oxamyl Methomyl 3-Hydroxycarbofuran Aldicarb Propoxur Carbofuran Sevin (carbaryl) Methiocarb 72.8 ± 1.7 91.5 ± 1.0 92.1 ± 0.6 108.6 ± 1.7 93.2 ± 0.8 91.8 ± 1.1 89.6 ± 1.2 92.7 ± 1.3 93.7 ± 1.2 96.6 ± 1.9 77.7 ± 3.1 91.7 ± 1.2 93.4 ± 1.8 93.5 ± 1.1 89.9 ± 2.4 93.4 ± 2.2 92.4 ± 1.1 94.5 ± 1.1 110.7 ± 1.5 95.9 ± 3.1
: Hi u su t thu h i m u rau, m u g ng thêm chu n 100 ppb. B ng 2ả ẫ ừ ệ ẫ ẩ ấ ồ
-1 nên nó phân b trong n t th p. ấ
ấ ồ ủ ầ ế ộ ấ ướ ề ố Hi u su t thu h i c a các ch t khá cao, h u h t trên 80%. Riêng hi u su t thu ệ ấ ấ ệ ng đ i l n h i c a Aldicarb Sulfoxide khá th p vì nó có đ tan trong n ố ớ c t ướ ươ ồ ủ kho ng 10g L ấ ủ c khá nhi u làm cho hi u su t c a ệ ả quá trình chi ế
ng pháp HPLC ươ
Ứng với quy trình làm giàu mẫu, ta có th ể phân tích mẫu
3.3. Kết luận đầu dò huỳnh quang đ ể phân tích d ư lượng CBM Ph - đ c ượ ứng dụng tốt đối với một s ố mẫu trên thực tế. Giới hạn phát hiện với mỗi chất khác nhau khoảng vài chục ppb trên mẫu thật Aldicard Sulfoxide 19.7 ppb; Adicarb sulfone 17.4 ppb; Oxamyl 23.5 ppb; Methomyl 29.8 ppb; 3- Hydroxy carbofuran 35.8 ppb; Aldicarb 24.0 ppb; Propoxur 23.1 ppb; Carbofuran 31.3 ppb; Sevin (carbaryl) 42.0 ppb; Methiocarb 46.9 ppb. ở hàm lượng - vài ppb. Tất c ả các chất trên đều có giới hạn định lượng thấp hơn quy định cho phép của Việt Nam, Nhật, Mỹ. C ả 2 quy trình trên đều áp dụng tốt đ ể phân tích d ư lượng CBM. Quy - trình clean – up bằng silica có nhiễu nền lớn hơn C18 và thao tác lean – up bằng C18 ít tốn công sức hơn khi dùng silica . Đối với mẫu rau quả, thực phẩm do mẫu rất đa dạng và thành phần nền mẫu khá phức tạp, vì vậy nên chọn quy trình x ử lý mẫu dùng C18 đ ể clean-up và làm giàu. Đầu dò huỳnh quang rất nhạy đối với CBM, giới hạn phát hiện một s ố CBM có th để ạt tới hàm lượng ppt trong mẫu tương ứng với phương pháp làm giàu phù hợp. Chính vì chọn lọc cho CBM nên phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang được các tổ chức trên th ế giới công nhận là phương pháp tiêu chuẩn phân tích d ư lượng CBM trong đất, nước, thực phẩm.
1. Ph
TÀI LI U THAM KH O: Ả Ệ
2. Determination of Aldicarb, Propoxur, Carbofuran, Carbaryl and Methiocarb Residues in Honey by HPLC. Jounal of Food and Drug Analysis. Vol 16, No. 3, 2008
ươ ọ ng pháp xác đ nh Carbamate trong rau. T p chí phát tri n khoa h c ể ạ ị công ngh .T p 12 – S 9/2009 ệ ậ ố
