634
XÉT NGHIỆM FISH
I. ĐẠI CƢƠNG
Xét nghiệm FISH gọi là lai tại chỗ gắn huỳnh quang là xét nghiệm để xác định
khuyếch đại gen Her-2/neu.
II. CHỈ ĐỊNH
Theo chỉ định của Bác sĩ lâm sàng: chủ yếu các định tình trạng khuyếch đại gen
trong ung thư vú, ung thư dạ dày và một số loại để điều trị đích.
III. H A CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ
- Bộ kít PathVysion
- Máy ThermoBrite
- Kính hiển vi huỳnh quang
IV. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị mẫu
- Mẫu mô được cắt mỏng 4 micromet, gắn lên tiêu bản đã được tráng silan
- Tiêu bản được ủ qua đêm ở nhiệt độ 560C
- Đánh dấu vùng tế bào u xâm lấn băng bút kim cương.
2. Khử paraffin của tiêu bản
- Nhúng tiêu bản vào xylen 3 lần, mỗi lần 5 phút
- Khử nước bằng cồn 900, 2 lần, mỗi lần 5 phút
- Làm khô tiêu bản ở 450C: 2-5 phút
- Rửa nước cất 1 lần: 3 phút
- Rửa tiêu bản bằng dung dịch buffer 1 lần: 3 phút
- Nhúng tiêu bản trong dung dịch rửa buffer nhiệt độ 800C: 30 phút
- Rửa nước cất 1 lần: 1 phút
- Tửa tiêu bản bằng dung dịch rửa buffer nhiệt độ phòng 2 lần, mỗi lần 5 phút.
3. Xử trí protease
- Tiêu bản được lau khô các vùng nước đọng
-
Ngâm lam trong dung dịch protease: 10-60 phút nhiệt độ 370C
-
Rửa lam bằng dung dịch rửa buffer 2 lần mỗi lần 5 phút.
635
- Làm khô tiêu bản ở 450C: 2-5 phút
4. Khử nƣớc
- Cồn 700: 1 phút nhiệt độ phòng
- Cồn 850: 1 phút nhiệt độ phòng
- Cồn 1000: 1 phút nhiệt độ phòng
- Làm khô tiêu bản 450C: 2-5 phút
5. Tách DNA và lai đồng thời
- Dùng máy ThermoBite, thực hiện công đoạn trong buồng tối
- Làm ấm lọ chứa đoạn đầu dò bằng máy lắc
- Lấy 5 àl đoạn dò nhỏ lên vùng ung thư xâm nhập đã được đánh dấu
- Gắn lamen kích thước 22 mm x 22 mm, phủ mép lamen bằng nhựa cao su
- Kích hoạt chương trình
- Tách DNA 750C: 5 phút
- Lai đoạn dò DNA đích 370C: 18 giờ đảm bảo buồng lai tối
- Tạo môi trường ấm, đạy nắp và bắt đầu
- Rửa sau khi lai (thực hiện công việc trong buồng tối)
- Làm nóng dung dịch rửa sau lai ở 720C
- Chuẩn bị một lọ dung dịch rửa sau lai ở nhiệt độ phòng
- Nhúng tiêu bản vào lọ dung dịch sau lai ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ để lamen rời ra
- Lau những giọt nước đọng trên tiêu bản
- Nhúng tiêu bản vào dung dịch sau lai ở nhiệt độ 720C: 2 phút
- Lau khô tiêu bản trong buồng tối.
6. Nhuộm màu tƣơng phản nhân
- Nhỏ 5 àl DAPI vào vùng đã chọn
- Dán lamen
7. Khảo sát tiêu bản
- Bảo quản tiêu bản vào hộp giấy bạc, giữ ở -200C, ít nhất 30 phút trước khi khảo
sát;
- Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang có nhiều kính lọc các bước
huỳnh quang.
636
8. Đánh giá kết quả
Đánh giá kết quả dựa vào tín hiệu màu vàng và tín hiệu màu xanh. Đếm 20 nhân tế
bào vùng xâm nhập, không chống lên nhau
- T lệ Her-2/CEP17 < 1,8: không khuyếch đại
- T lệ Her-2/CEP17 ≥ 2,2: có khuyếch đại
- T lệ 1,8 ≤ Her-2/CEP17 < 2,2: khuyếch đại giáp biên cần khảo sát lại
- T lệ 2,5 < Her-2/CEP17 ≤ 5: khuyếch đại thấp
- T lệ Her-2/CEP17 > 5: khuyếch đại cao
Số lượng tín hiệu màu xanh lá cây sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo
số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội
và đa bội.