TRẦN QUỐC VIỆT - Phân lập , tuyển chọn và đánh giá ….
1
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA
MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT HỮU ÍCH ĐỂ SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM
PROBIOTIC DÙNG TRONG CHĂN NUÔI
Trần Quốc Việt1, Bùi Thị Thu Huyền1, Dương Văn Hợp2 và Vũ Thµnh L©m2
1Viện Chăn nuôi - Thụy Phượng - Từ Liêm - Hà Nội
2 Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia - Hà Nội.
*Tác giả liên hệ: Trần Quốc Việt - Bộ môn Dinh Dưỡng, Thức ăn và Đ
ồng cỏ
Viện Chăn nuôi - Thụy Phương - Từ Liêm - Hà Nội
Tel: (04) 38.386.126 / 0982.011.584; Fax: (04) 38.389.775; Email: hainiah2008@gmail.com
ABSTRACT
Isolation, selection and evaluation of probiotic characteristics of some kinds of useful microorganism
for probiotic producton
Sixty four strains of microorganism were isolated from the intestinal content of pigs, chickens and from
commercial probiotics. Amongs them, 4 strains including two strains of lactic bacteria and two strains of yeast
were selected for futher investigation of their characteristics. Based on metabolic characteristics and taxonomic
key of Bergey and frequency of rADR 16S analysis, two strains of lactic bacteria were belong to Lactbacillus
fermentum named NC1 and Lactobacillus casei named NC2 and two strains of yeast were classed as
Saccharomyces cerevisiae-SC and Saccharomyces boulardii-SB. All of strains selected were useful
microorganisms with a high toleran to low and high pH environments and to a high level of bile salt. These
strains were also highly compatible with some active components commonly used in diets for pigs and chickens
such as some kinds of antibiotics (BMD, colistin, chlotetracylin ..), acidifiers, CuSO4, ZnSO4..etc. It was
concluded that these strains could be considered as useful microorganisms for the probiotic production.
Key words: Microorganism, probiotics, lactic bacteria, yeast, compatibility.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ thời cổ đại con người đã biết sử dụng các Vi sinh vật (VSV) để chế biến và bảo quản thực
phẩm, nhưng ý tưởng tạo ra những sản phẩm VSV sống hữu ích để bổ sung vào thức ăn hoặc
nước uống nhằm cải thiện sức khoẻ và nâng cao năng suất của vật nuôi chỉ được quan tâm
nhiều trong vài thập kỷ trở lại đây.
Năm 1974 Paker đã đưa ra khái niệm probiotic để chỉ những VSV và những chất làm cân
bằng hệ VSV trong đường ruột của người và vật nuôi, kể từ đó đã có rất nhiều những phát
hiện mới về vai trò, tác dụng của các VSV sống như: tăng cường sức khoẻ của hệ tiêu hoá
thông qua cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột (Fuller, 1989), tăng đáp ứng miễn dịch, phòng
chống ung thư đường tiêu hoá (FAO/WHO, 2001), giảm colesterol máu (Pereira và Gibson,
2002)... Các (VSV) probiotic nhất thiết phải là các VSV sống hữu ích, chúng có thể là các vi
khuẩn (VK) (thường là các VK khuẩn lactic, một số chủng Bacillus) và nấm men (chủ yếu là
các chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces bouladii).
Trong tự nhiên, các VSV hữu ích rất phong phú, đa dạng nhưng chúng chỉ có thể là các VSV
probiotic khi chúng thoả mãn được một số điều kiện: (i) có sức sống cao; (ii) tồn tại được
trong môi trường đường tiêu hoá (pH thấp, muối mật, có khả năng bám dính vào niêm mạc
đường tiêu hoá), (iii) phát triển và cạnh tranh được với các vi sinh vật có hại trong đường ruột,
(iv) có khả năng sản sinh các bacteriocin và hoặc enzyme tiêu hóa; (v) có khả năng làm tăng
đáp ứng miễn dịch.
Vì những đặc điểm này mà việc phân lập, tuyển chọn các vi sinh vật probiotic trở nên rất khó
khăn, phức tạp. Hầu như rất hiếm có những chủng VSV hội đủ các điều kiện trên. Bởi vậy, để
VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 16-Tháng 2-2009
2
có chất lượng cao, sản phẩm probiotic thường gồm nhiều loại VSV thuộc các loài khác nhau
(Multispecies Probiotic) (Timmerman và cs, 2006). Nghiên cứu này được tiến hành nhằm
phân lập, đánh giá, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có các đặc tính probiotic phục vụ cho
việc sản xuất các chế phẩm Probiotic dùng trong chăn nuôi.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Các vật liệu phục vụ cho việc phân lập tuyển chọn các vi sinh vật probiotic: Phân, chất chứa
đường tiêu hoá (ruột non, manh tràng) của lợn và gia cầm (gà, ngan, vịt). Một số sản phẩm
probiotic thương mại (Lacto-Sac của hãng Alltech-Canada; EM của Nhật; E-Lac của Hàn
quốc…vv).
Các vi sinh vật kiểm định (Salmonella enteritidis, E. coli và Shigella flexneri); các vi sinh vật
probiotic đã được phân lập, tuyển chọn và đánh giá đặc tính probiotic1 được bảo quản tại bảo
tàng giống chuẩn vi sinh vật thuộc Viện Vi Sinh Vật và Công nghệ sinh học-Đại học Quốc gia
Hà nội.
Các hóa chất: dùng để tách ADN và phân giải trình tự: EDTA, Tris- SDS, chlorofom-isoamyl
alcohol, dNTP, Taq polymeraza, Ethidium Bromit, kit QIAgen...vv.
Các vật liệu khác: Giá đỗ, đường gluco, K2HPO4, MgSO4, natri glutamat, pepton, cao nấm
men; dextrin, tinh bột sắn, bột sữa whey.
Phương pháp nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích
Mẫu được pha loãng ở nồng độ từ 10-3-10-5 và cấy gạt trên môi trường MRS (đối với vi khuẩn
Lactic) và YM (đối với nấm men). Sau khi cấy các mẫu được giữ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC
cho vi khuẩn (VK) và 30oC cho nấm men trong 48 giờ. Sau 48 giờ trên môi trường MRS chọn
các khuẩn lạc tạo vòng phân giải CaCO3; trên môi trường (Yeast Malt- YM) chọn các khuẩn
lạc nấm men tròn đều, trơn nhẵn soi kính có hình trứng và nảy chồi.
Đánh giá đặc điểm hình thái, phân loại và định danh các chủng VSV hữu ích
Hình thái tế bào được quan sát sau khi nuôi cấy từ 24 đến 48 giờ trên các môi trường MRS
(với VK Lactic) và YM (với nấm men). Hoạt tính catalaza và sinh khí CO2 từ các nguồn
đường khác nhau có nồng độ 1% (raffinoza = 2%) được xác định bằng phương pháp của
Kozaki và cs, (1992).
Ngoài ra, các chủng nấm men còn được thử phản ứng DBB và hoạt tính Ureaza. Việc phân
loại các chủng vi khuẩn được thực hiện dựa trên cơ sở khoá phân loại của Bergeys (Holt và
cs, 2000) (theo các chỉ tiêu chủ yếu như: hình thái tế bào, khuẩn lạc, nhuộm Gram, phản ứng
catalaza và lên men một số loại đường) và phân tích, giải trình tự 16S rARN theo phương
pháp được giới thiệu bởi Lane (1991).
Xác định trình tự rADN 16s của các chủng vi khuẩn lactic theo phương pháp của Saito và
Miura (1963) và trình tự rADN ITS1, ITS4 của các chủng nấm men theo phương pháp của
Manitis và cs (1982).
Đánh giá một số đặc tính probiotic của các chủng VSV hữu ích
Đánh giá khả năng chịu nhiệt: Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường MRS
TRẦN QUỐC VIỆT - Phân lập , tuyển chọn và đánh giá ….
3
dịch thể (VK Lactic) và môi trường YM (nấm men) (pH =7.0), trong các máy lắc ổn nhiệt
(200 vòng/phút) với các giải nhiệt độ khác nhau 30; 37; 45; 55oC.
Đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường có độ pH khác nhau
Tương tự như trên, các chủng vi khuẩn và nấm men cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch
thể trong đệm acetat có pH khác nhau (2,2; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0), trên máy lắc ổn nhiệt (200
vòng/ phút tại 37oC cho vi khuẩn Lactic và 30oC cho nấm men).
Đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối mật khác nhau
Các chủng nghiên cứu cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch thể như trên có nồng độ muối
mật (0,2; 0,5; 1;1,5; 2; 3%). Nuôi cấy lắc (200 vòng/phút tại 37oC đối với vi khuẩn và 30oC
đối với nấm men). Đếm mật độ tế bào sau 48h nuôi cấy gạt trên đĩa Petri có chứa môi trường
thích hợp. Sau 48 giờ, tốc độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được đánh giá thông qua số
lượng VSV tính bằng cfu/ml và khả năng sản sinh axit lactic. Khả năng sản sinh axit lactic
của các VK Lactic được đánh giá theo phương pháp Therner và cs (1894). Khả năng kháng
các vi khuẩn kiểm định (Salmonella enteritidis, E. coli, Shigella flexneri): được tiến hành theo
phương pháp đo vòng kháng khuẩn.Tính đối kháng của các vi sinh vật: Được thử bằng kỹ
thuật cấy vạch trên đĩa thạch.
Đánh giá khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa
Chuẩn bị vi sinh vật và vật liệu bám dính: Vi sinh vật (vi khuẩn và nấm men) được nuôi cấy
thuần khiết trong môi trường thích hợp cho từng chủng. Chuẩn bị các mẫu ruột gà tươi: Rửa
các đoạn ruột non (từ gà broiler mạnh khỏe) 3 lần với đệm PBS sao cho tất cả các vi sinh vật
không còn trên bề mặt niêm mạc ruột. Rửa 1 lần với môi trường (MRS cho vi khuẩn và YM
cho nấm men). Tiến hành thử bám dính: Phủ dịch tế bào đã chuẩn bị ở trên lên trên bề mặt
niêm mạc ruột. Ủ 90 phút trong tủ ấm (37oC). Rửa mẫu ruột lần 1 bằng nước muối sinh lý1%.
Rửa mẫu ruột 3 lần bằng đệm PBS. Thu lấy dịch rửa của cả 3 lần và trộn đều. Đếm số lượng
VSV trong dịch rửa để xác định khả năng bám dính của các VSV nghiên cứu.
Đánh giá tính tương thích của các chủng vi sinh vật với các thành phần có hoạt tính trong
khẩu phần ăn cho lợn và gia cầm: Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường dịch
thể tương ứng (MRS cho VK Lactic; thạch thường cho VK Bacillus và YM cho nấm men)
nhưng có bổ sung các thành phần có hoạt tính thường có trong các khẩu phần ăn cho lợn và
gia cầm gồm một số loại kháng sinh: Bacitracin Methylene Disalicylate (BMD) (50 ppm);
Saigon Nox (100 ppm), Colistine 98% (100 ppm), chlotetracyclin (CTC) 15% (100 ppm); một
số loại khoáng CuSO4 (250 ppm Cu); ZnSO4 (100 ppm Zn) và hỗn hợp axit hữu cơ (gồm axit
lactic axit, axit formic, axit citric...) với liều 200mg/lít.. Nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) trong tủ
ấm (37oC). Đếm mật độ tế bào trên môi trường đĩa thạch sau 48h.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân lập, tuyển chọn, phân loại và định danh các chủng vi sinh vật hữu ích
Từ các nguồn khác nhau (chất chứa đường ruột của lợn, gà và các mẫu sản phẩm probiotic
thương mại), 64 chủng vi sinh vật đã được phân lập, trong đó có 27 chủng vi khuẩn lactic
(42,2%) và 39 chủng nấm men (57,8%) (Bảng 1).
Trong đó từ chất chứa đường ruột của lợn và gia cầm đã phân lập được 25 chủng vi khuẩn
lactic, 32 chủng nấm men. Từ một số chế phẩm probiotic hiện đang lưu hành trên thị trường,
đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn lactic và 7 chủng nấm men.
VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 16-Tháng 2-2009
4
Bảng 1: Kết quả phân lập các vi sinh vật từ các nguồn khác nhau
Vi sinh vật
Nguồn phân lập
VK Lactic Nấm men
Chất chứa ruột non và ruột già của lợn. 10 4
Chất chứa ruột non, ruột già của gà 15 28
Bốn (4) mẫu sản phẩm probiotic thương mại 2 7
Cổng 27 39
Tổng số 64
Kết quả phân lập các mẫu sản phẩm probiotic thương mại cho thấy, tất cả các sản phẩm này
đều là các sản phẩm probiotic đa chủng. Để làm cơ sở cho việc tuyển chọn, các chủng VSV
trên tiếp tục được thuần khiết trên môi trường đĩa thạch và chọn được 4 chủng (2 chủng VK
lactic và 2 chủng nấm men) để đánh giá các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa quan trọng
làm cơ sở cho việc phân loại. Kết quả được trình bày ở Bảng 2 và 3.
Bảng 2: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của 2 chủng vi khuẩn lactic
Kí hiệu chủng
TT Đặc điểm
NC1 NC2
1 Hình dạng tế bào Que ngắn Que ngắn
2 Nhuộm Gram Gram + Gram +
3 Phản ứng catalaza - -
Khả năng đồng hoá nguồn cacbohydrat
4 Riboza - +
5 Xyloza - +
6 Arabinoza + +
7 Rhamnoza + +
8 Trehaloza + ++
9 Lactoza +++ ++
10 Mannitol ++ ++
11 Sucroza +++ +++
12 Cellobioza +++ +++
13 Raffinoza ++ ++
14 Galactoza + ++
15 Tinh bột + -
16 Gluconat ++ +++
17 Fructoza + ++
18 Thành tế bào có meso-DAP + +
Hai chủng vi khuẩn Lactic được lựa chọn (NC1 và NC2) đều là những VK hình que ngắn,
Gram dương và phảm ứng katalaza âm tính. Đây là những đặc điểm đặc trưng của các VK
Lactic.
Tuy nhiên, khả năng đồng hoá các nguồn carbohydrate của 2 chủng này có những khác biệt,
Chủng NC2 có khả năng đồng hóa hầu hết các nguồn carbohydrate nghiên cứu trừ tinh bột,
trong đó chủng NC1 có khả năng đồng hóa tinh bột ở mức thấp, nhưng lại không có khả năng
đồng hóa riboza và xyloza. Cả 2 chủng đều có khả năng đồng hoá tốt 2 nguồn carbohydrate cơ
bản là Sucroza và Cellobioza, hai chủng nấm men đều có hình trứng, elip, nhưng SC nảy chồi
TRẦN QUỐC VIỆT - Phân lập , tuyển chọn và đánh giá ….
5
1,2,3 phía, trong khi đó SB chỉ nảy chồi 1 phía. Cả 2 chủng đều có hình thái khuẩn lạc như
nhau (trắng sữa, tròn nhẵn bóng và có vòng đồng tâm) kết quả ở Bảng 3.
Nhìn chung, đặc điểm đồng hóa và lên men các nguồn carbohydrate của 2 chủng nấm men
tương tự nhau, cả hai đều có phản ứng âm tính với DBB và thuỷ phân urê. Căn cứ vào khoá
phân loại của Bergeys và các dữ liệu ở các bảng 2 và 3 thì chủng NC1 thuộc nhóm
Lactobacillus fermentum, chủng NC2 thuộc nhóm Lactobacillus casei, chủng SC thuộc
Saccharomyces cerevisiae và chủng SB thuộc nhóm Saccharomyces nhưng chưa rõ loài.
Bảng 3: Một số đặc tính hình thái và sinh lý sinh hoá của hai chủng nấm men SC và SB
STT Đặc điểm Chủng nấm men
SC SB
1 Hình dạng tế
bào
Hình trứng, elíp,
nảy chồi 1,2,3 phía
Hình trứng, elíp,
nảy chồi 1 phía
Trắng sữa tròn nhẵn bóng lồi
có vòng đồng tâm
Trắng sữa tròn nhẵn bóng lồi
có vòng đồng tâm
2
Hình thái
khuẩn lạc Kh/năng đồng
hoá nguồn
cacbohydrat
KN lên men
nguồn
cacbohydrat
KN đồng hoá
nguồn
Cacbohydrat
KN lên men
nguồn
cacbohydrat
3 Sorboza - - - -
4 Riboza - -
5 Xyloza - - - -
6 Arabinoza - - - -
7 Rhamnoza - - - -
8 Trehaloza + + + +
9 Lactoza - - - -
10 Sucroza + + + +
11 Cellobioza - - - -
12 Raffinoza + + + +
13 Galactoza + + + +
14 Tinh bột - - - -
15 Melibioza - - _ _
16 Glucoza + + + +
17 Sinh axit - -
18 Phản ứng DBB - -
19 Phản ứng thuỷ
phân urê
- -
Tuy nhiên, để gọi tên chính xác, các chủng trên đã được giải trình tự ARN và ADN 16S. Các
kết quả định danh được trình bày như sau:
Trình tự rADN 16S của chủng NC1
>NC1
GCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTT
GGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTC
GCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGA
TGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTAC
GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTG
AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATA
CGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT