TRẦN QUỐC VIT - Pn lập , tuyển chọn và đánh giá ….
1
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA
MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT HỮU ÍCH ĐỂ SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM
PROBIOTIC DÙNG TRONG CHĂN NUÔI
Trần Quốc Việt1, Bùi Thị Thu Huyền1, Dương Văn Hợp2 và Vũ Thµnh L©m2
1Viện Chăn nuôi - Thy Phưng - Từ Liêm - Hà Ni
2 Viện Vi sinh vật và Công ngh sinh học - Đại học Quốc gia - Hà Ni.
*Tác giả liên hệ: Trần Quốc Việt - Bộ môn Dinh Dưỡng, Thức ăn và Đ
ồng cỏ
Viện Chăn nuôi - Thy Phương - T Liêm - Nội
Tel: (04) 38.386.126 / 0982.011.584; Fax: (04) 38.389.775; Email: hainiah2008@gmail.com
ABSTRACT
Isolation, selection and evaluation of probiotic characteristics of some kinds of useful microorganism
for probiotic producton
Sixty four strains of microorganism were isolated from the intestinal content of pigs, chickens and from
commercial probiotics. Amongs them, 4 strains including two strains of lactic bacteria and two strains of yeast
were selected for futher investigation of their characteristics. Based on metabolic characteristics and taxonomic
key of Bergey and frequency of rADR 16S analysis, two strains of lactic bacteria were belong to Lactbacillus
fermentum named NC1 and Lactobacillus casei named NC2 and two strains of yeast were classed as
Saccharomyces cerevisiae-SC and Saccharomyces boulardii-SB. All of strains selected were useful
microorganisms with a high toleran to low and high pH environments and to a high level of bile salt. These
strains were also highly compatible with some active components commonly used in diets for pigs and chickens
such as some kinds of antibiotics (BMD, colistin, chlotetracylin ..), acidifiers, CuSO4, ZnSO4..etc. It was
concluded that these strains could be considered as useful microorganisms for the probiotic production.
Key words: Microorganism, probiotics, lactic bacteria, yeast, compatibility.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ thời cổ đại con người đã biết sử dụng các Vi sinh vật (VSV) để chế biến và bảo quản thực
phm, nhưng ý tưởng tạo ra những sản phẩm VSV sống hữu ích để bổ sung vào thức ăn hoặc
nước ung nhằm cải thiện sức khovà nâng cao năng suất của vật nuôi chđược quan tâm
nhiều trong vài thập kỷ trở lại đây.
Năm 1974 Paker đã đưa ra khái niệm probiotic để chỉ nhng VSV những chất làm cân
bằng hVSV trong đường rut của người và vt nuôi, kể tđó đã rất nhiu những phát
hiện mới về vai trò, tác dụng của các VSV sống như: tăng cường sức khocủa hệ tiêu hoá
thông qua cải thin cân bằng hệ vi sinh vật rut (Fuller, 1989), tăng đáp ng miễn dịch, phòng
chống ung thư đường tiêu hoá (FAO/WHO, 2001), giảm colesterol máu (Pereira Gibson,
2002)... Các (VSV) probiotic nhất thiết phải là các VSV sng hữu ích, chúng thlà các vi
khuẩn (VK) (thường là các VK khuẩn lactic, một s chng Bacillus) và nấm men (chủ yếu là
các chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces bouladii).
Trong t nhiên, các VSV hữu ích rất phong phú, đa dạng nhưng chúng chỉ có thể là các VSV
probiotic khi chúng thomãn được một số điều kiện: (i) sức sống cao; (ii) tồn tại được
trong i trường đường tiêu hoá (pH thp, mui mật, có khả ng bám dính o niêm mạc
đường tiêu hoá), (iii) phát triển và cạnh tranh được vi các vi sinh vật có hại trong đường ruột,
(iv) khng sản sinh các bacteriocin và hoặc enzyme tiêu hóa; (v) khng m tăng
đáp ứng miễn dịch.
những đặc đim này mà việc phân lập, tuyn chọn các vi sinh vật probiotic trở nên rất khó
khăn, phc tạp. Hầu như rất hiếm những chng VSV hội đcác điều kiện trên. Bi vậy, đ
VIN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 16-Tháng 2-2009
2
chất lượng cao, sản phẩm probiotic thường gồm nhiều loại VSV thuộc c loài khác nhau
(Multispecies Probiotic) (Timmerman cs, 2006). Nghiên cứu này được tiến hành nhm
phân lp, đánh giá, tuyển chn c chủng vi sinh vật các đặc tính probiotic phục vụ cho
việc sản xuất các chế phẩm Probiotic dùng trong chăn nuôi.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vt liệu nghiên cứu
Các vật liệu phục v cho việc phân lập tuyn chọn các vi sinh vật probiotic: Phân, chất chứa
đường tiêu hoá (ruột non, manh tràng) ca ln và gia cầm (gà, ngan, vịt). Một số sản phẩm
probiotic thương mi (Lacto-Sac ca hãng Alltech-Canada; EM của Nhật; E-Lac ca Hàn
quc…vv).
Các vi sinh vật kiểm định (Salmonella enteritidis, E. coli Shigella flexneri); các vi sinh vt
probiotic đã được phân lập, tuyn chọn và đánh giá đc tính probiotic1 được bảo quản tại bảo
tàng ging chuẩn vi sinh vật thuộc Vin Vi Sinh Vật và Công nghệ sinh học-Đại hc Quốc gia
Hà nội.
c hóa chất:ng để tách ADN và phân giải trình t: EDTA, Tris- SDS, chlorofom-isoamyl
alcohol, dNTP, Taq polymeraza, Ethidium Bromit, kit QIAgen...vv.
c vt liệu khác: Giá đỗ, đường gluco, K2HPO4, MgSO4, natri glutamat, pepton, cao nấm
men; dextrin, tinh bt sn, bột sữa whey.
Phương pháp nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích
Mẫu được pha loãng ở nồng đ từ 10-3-10-5 và cy gạt trên môi trường MRS (đối với vi khuẩn
Lactic) và YM (đối với nấm men). Sau khi cấy các mẫu được giữ trong tủ ấm ở nhiệt đ 37oC
cho vi khuẩn (VK) và 30oC cho nấm men trong 48 giờ. Sau 48 gitrên môi trường MRS chọn
các khuẩn lạc tạo vòng phân giải CaCO3; trên i trường (Yeast Malt- YM) chọn các khuẩn
lạc nấm men tròn đều, trơn nhẵn soi kính có hình trứng và ny chồi.
Đánh giá đặc điểm hình thái, phân loại và định danh các chủng VSV hữu ích
Hình thái tế bào được quan sát sau khi nuôi cấy từ 24 đến 48 gitrên các môi trường MRS
(với VK Lactic) YM (với nấm men). Hoạt tính catalaza và sinh khí CO2 t các nguồn
đường khác nhau nồng đ 1% (raffinoza = 2%) được xác định bằng phương pháp của
Kozaki và cs, (1992).
Ngoài ra, các chủng nấm men còn được thử phản ứng DBB và hoạt nh Ureaza. Việc phân
loại các chng vi khuẩn được thực hiện dựa trên sở khoá phân loại của Bergeys (Holt và
cs, 2000) (theo các chtiêu ch yếu như: hình thái tế bào, khuẩn lạc, nhuộm Gram, phản ứng
catalaza lên men mt số loại đường) và phân tích, giải trình t 16S rARN theo phương
pháp được giới thiệu bởi Lane (1991).
Xác định trình t rADN 16s của các chng vi khuẩn lactic theo phương pháp của Saito và
Miura (1963) trình trADN ITS1, ITS4 ca các chng nấm men theo phương pháp của
Manitis và cs (1982).
Đánh giá một số đặc tính probiotic của các chủng VSV hữu ích
Đánh giá khả ng chịu nhiệt: Các chủng vi sinh vật được nuôi cy trên i trường MRS
TRẦN QUỐC VIT - Pn lập , tuyển chọn và đánh giá ….
3
dịch thể (VK Lactic) i trường YM (nấm men) (pH =7.0), trong các máy lắc ổn nhiệt
(200 vòng/phút) với các giải nhiệt độ khác nhau 30; 37; 45; 55oC.
Đánh giá khả năng sinh trưởng trongi trường có độ pH khác nhau
Tương tự như trên, các chủng vi khuẩn và nm men cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch
thể trong đệm acetat pH khác nhau (2,2; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0), trên máy lc n nhit (200
vòng/ phút tại 37oC cho vi khuẩn Lactic và 30oC cho nấm men).
Đánh giá khả năng sinh trưởng trongi trường có nồng độ muối mt khác nhau
Các chng nghiên cứu ng được nuôi cấy trên môi trường dch thể như trên có nồng độ mui
mật (0,2; 0,5; 1;1,5; 2; 3%). Nuôi cấy lắc (200 vòng/phút tại 37oC đối vi vi khuẩn và 30oC
đối vi nấm men). Đếm mật đtế bào sau 48h nuôi cấy gạt trên đĩa Petri có chứa môi trường
thích hp. Sau 48 giờ, tốc đsinh trưởng của các chủng vi khuẩn được đánh giá thông qua s
lượng VSV tính bằng cfu/ml và khnăng sản sinh axit lactic. Khnăng sản sinh axit lactic
ca các VK Lactic được đánh giá theo phương pháp Therner cs (1894). Khnăng kháng
các vi khuẩn kiểm định (Salmonella enteritidis, E. coli, Shigella flexneri): được tiến hành theo
phương pháp đo vòng kháng khun.Tính đối kháng của các vi sinh vật: Được thử bằng k
thuật cấy vạch trên đĩa thạch.
Đánh giá khng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa
Chuẩn bị vi sinh vt và vật liệu bám dính: Vi sinh vật (vi khuẩn và nấm men) đưc nuôi cy
thuần khiết trong môi trường thích hợp cho từng chủng. Chun bc mẫu ruột tươi: Rửa
các đoạn ruột non (từ gà broiler mạnh khỏe) 3 lần với đệm PBS sao cho tất cả c vi sinh vật
không n trên bmặt niêm mạc ruột. Rửa 1 lần vi môi trường (MRS cho vi khuẩn và YM
cho nm men). Tiến hành th bám dính: Ph dịch tế bào đã chun btrên lên trên bmặt
niêm mc ruột. Ủ 90 phút trong tủ ấm (37oC). Rửa mẫu ruột lần 1 bằng nước muối sinh lý1%.
Rửa mẫu ruột 3 lần bằng đệm PBS. Thu lấy dịch rửa của cả 3 ln và trộn đều. Đếm số lượng
VSV trong dịch rửa để xác đnh khả năng bám dính ca các VSV nghiên cứu.
Đánh gtính tương thích của các chủng vi sinh vật với các thành phn hoạt tính trong
khẩu phần ăn cho lợn và gia cầm: Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường dịch
thtương ng (MRS cho VK Lactic; thạch thường cho VK Bacillus và YM cho nấm men)
nhưng bsung các thành phần hoạt nh thường trong các khẩu phần ăn cho lợn và
gia cầm gồm một số loại kháng sinh: Bacitracin Methylene Disalicylate (BMD) (50 ppm);
Saigon Nox (100 ppm), Colistine 98% (100 ppm), chlotetracyclin (CTC) 15% (100 ppm); mt
s loại khoáng CuSO4 (250 ppm Cu); ZnSO4 (100 ppm Zn) và hn hợp axit hữu cơ (gồm axit
lactic axit, axit formic, axit citric...) với liều 200mg/lít.. Nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) trong t
ấm (37oC). Đếm mật độ tế bào trên môi trường đĩa thạch sau 48h.
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
Phân lập, tuyển chọn, phân loi và định danh các chủng vi sinh vt hữu ích
Tcác nguồn khác nhau (chất chứa đường rut của ln, gà các mẫu sản phẩm probiotic
thương mại), 64 chủng vi sinh vật đã được phân lập, trong đó có 27 chủng vi khuẩn lactic
(42,2%) và 39 chng nấm men (57,8%) (Bảng 1).
Trong đó từ chất chứa đường rut của lợn và gia cầm đã phân lập được 25 chng vi khuẩn
lactic, 32 chủng nấm men. Từ một số chế phẩm probiotic hiện đang lưu hành trên thị trường,
đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn lactic và 7 chủng nấm men.
VIN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 16-Tháng 2-2009
4
Bảng 1: Kết quả phân lập các vi sinh vật từ các nguồn khác nhau
Vi sinh vật
Ngun phân lập
VK Lactic Nấm men
Chất chứa ruột non và ruột già của lợn. 10 4
Chất chứa ruột non, ruột già ca gà 15 28
Bốn (4) mẫu sản phẩm probiotic thương mại 2 7
Cng 27 39
Tng số 64
Kết quphân lập các mẫu sản phẩm probiotic thương mại cho thấy, tất cả các sản phẩm này
đều là c sn phẩm probiotic đa chủng. Để làm sở cho việc tuyn chọn, các chủng VSV
trên tiếp tục được thuần khiết trên môi trường đĩa thạch và chọn được 4 chng (2 chủng VK
lactic và 2 chủng nấm men) đđánh giá các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa quan trng
làm cơ sở cho việc phân loại. Kết quả được trình bày Bảng 2 và 3.
Bảng 2: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá ca 2 chng vi khuẩn lactic
hiu chủng
TT Đặc điểm
NC1 NC2
1 Hình dạng tế bào Que ngắn Que ngắn
2 Nhuộm Gram Gram + Gram +
3 Phản ứng catalaza - -
Khnăng đồng hoá nguồn cacbohydrat
4 Riboza - +
5 Xyloza - +
6 Arabinoza + +
7 Rhamnoza + +
8 Trehaloza + ++
9 Lactoza +++ ++
10 Mannitol ++ ++
11 Sucroza +++ +++
12 Cellobioza +++ +++
13 Raffinoza ++ ++
14 Galactoza + ++
15 Tinh bột + -
16 Gluconat ++ +++
17 Fructoza + ++
18 Thành tế bào có meso-DAP + +
Hai chng vi khun Lactic được lựa chọn (NC1 NC2) đều là nhng VK hình que ngn,
Gram dương phảm ứng katalaza âm tính. Đây là nhng đặc điểm đặc trưng ca các VK
Lactic.
Tuy nhiên, khnăng đồng hoá các ngun carbohydrate của 2 chủng này nhng khác biệt,
Chủng NC2 có khnăng đng hóa hầu hết các nguồn carbohydrate nghiên cứu trừ tinh bột,
trong đó chủng NC1 khnăng đồng hóa tinh bột mức thấp, nhưng lại không khả năng
đồng hóa riboza và xyloza. Cả 2 chủng đều có khnăng đồng hoá tốt 2 nguồn carbohydrate cơ
bản là Sucroza và Cellobioza, hai chủng nấm men đuhình trứng, elip, nhưng SC nảy chồi
TRẦN QUỐC VIT - Pn lập , tuyển chọn và đánh giá ….
5
1,2,3 phía, trong khi đó SB chnảy chi 1 phía. Cả 2 chủng đều hình thái khuẩn lạc như
nhau (trắng sữa, tròn nhẵn bóng và có vòng đồng tâm) kết quả ở Bảng 3.
Nhìn chung, đc điểm đồng hóa và lên men các ngun carbohydrate ca 2 chủng nấm men
tương tnhau, cả hai đều phản ứng âm tính với DBB và thuphân urê. n cứ vào khoá
phân loại của Bergeys và các d liệu các bảng 2 và 3 thì chng NC1 thuộc nhóm
Lactobacillus fermentum, chủng NC2 thuộc nhóm Lactobacillus casei, chủng SC thuc
Saccharomyces cerevisiae và chủng SB thuộc nhóm Saccharomyces nhưng chưa rõ loài.
Bảng 3: Một số đặc tính hình thái và sinh lý sinh hoá của hai chủng nấm men SC và SB
STT Đặc điểm Chủng nấm men
SC SB
1 Hình dng tế
bào
Hình trứng, elíp,
ny chồi 1,2,3 phía
Hình trứng, elíp,
ny chồi 1 phía
Trắng sữa tròn nhẵn bóng lồi
có vòng đồng tâm
Trắng sữa tròn nhẵn bóng lồi
vòng đồng tâm
2
Hình thái
khuẩn lạc Kh/năng đồng
hoá nguồn
cacbohydrat
KN lên men
ngun
cacbohydrat
KN đồng hoá
ngun
Cacbohydrat
KN lên men
ngun
cacbohydrat
3 Sorboza - - - -
4 Riboza - -
5 Xyloza - - - -
6 Arabinoza - - - -
7 Rhamnoza - - - -
8 Trehaloza + + + +
9 Lactoza - - - -
10 Sucroza + + + +
11 Cellobioza - - - -
12 Raffinoza + + + +
13 Galactoza + + + +
14 Tinh bt - - - -
15 Melibioza - - _ _
16 Glucoza + + + +
17 Sinh axit - -
18 Phản ứng DBB - -
19 Phản ng thu
phân urê
- -
Tuy nhiên, đgọi tên chính xác, các chủng trên đã được giải trình tự ARN và ADN 16S. Các
kết quả định danh được trình bày như sau:
Trình t rADN 16S của chủng NC1
>NC1
GCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTT
GGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTC
GCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGA
TGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTAC
GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTG
AAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATA
CGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT