Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở E. coli

Protein nguyên thể (native)

• Đoạn gene mã hóa 2 hoặc nhiều protein.

Protein dung hợp (fusion protein)

• Trình tự ori tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ. • Gene chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo

duy trì vector trong tế bào.

• Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các gene được tạo dòng.

• Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết ribosome (rbs) được bố trí thích hợp và codon khởi đầu AUG.

• Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào theo hướng

chính xác với promoter.

Vector biểu hiện

Hệ thống biểu hiện ở prokaryote

1.

lacZ promotor: pUC, M13 vector, vector lamda hoặc Bluescript - Điều hòa bởi lacI repressor

2. Lambda PL promotor 3. T7 promotor 4. araBAD promotor

Promotor

Hệ thống điều hòa bởi 2 promotor

Vector biểu hiện với lacZ

Vector biểu hiện với lacZ

Trình tự gắn với ribosome (ribosomal binding site)

• Cần thiết để khởi đầu dịch mã • ở E. coli thường có trình tự -GAGG- đứng

trước codon khởi đầu dịch mã.

• Trình tự Shine-Dalgarno ở E. coli: AGGAGGU • Trình tự Kozak ở Eukaryote: (gcc)gccRccAUGG

• Không cần thiết kế rbs và codon khởi đầu dịch

mã nếu dung hợp ở đầu N-ter

• Tăng sự ổn định, khả năng hòa tan, gấp cuộn,

tạo cầu nối disulphide

• Sự sẵn có của các kháng thể của protein dung hợp dùng trong western blot/đánh giá sự biểu hiện của protein

• Giúp tăng khả năng thu nhận tinh sạch

Lợi thế của protein dung hợp

• GST (glutathion-S-transferase):

– Kết hợp và bảo vệ protein – Giúp dễ dàng tinh sạch bằng sắc ký ái lực

• Maltose binding protein

– Kết hợp với protein và vận chuyển ra ngoài

periplasmic giúp dễ dàng tinh sạch

– Tinh sạch bằng amylose (1 loại maltose)

• Thioredoxin: • Histidin tag: 6H, tinh sạch bằng cột nickel

Các thẻ (tag) đánh dấu

• Sàng lọc dòng vi khuẩn bằng enzyme cắt và điện

di trên gel.

• Sàng lọc dòng vi khuẩn biểu hiện protein dung

hợp – Nuôi dòng vi khuẩn – Kích ứng biểu hiện (IPTG hoặc nhiệt độ) – Tách chiết dịch bằng SDS – Biến tính và điện di trên gel polyacrylamide (SDS

PAGE)

– Nhận biết bằng nhuộm màu hoặc Western blotting

Phát hiện protein dung hợp

Protein Ladder

1

2

3

4

Western blot (anti-His tag conjunged HRP)

SP1

SP2

C o 4

C o 4

C o 6 1

C o 0 3

C o 6 1

C o 0 3

-

-

70kD

40kD

1. Thể vùi (inclusion) 2. Hòa tan thể vùi - Phá tế bào - Tinh sạch thể vùi - Hòa tan thể vùi 3. Thu nhận protein

Tinh sạch protein

Tinh sạch protein