Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (SH3014)

BM CNSH TV – Khoa CNSH

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)

1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen 3. Các phương pháp lai phân tử 4. Phương pháp PCR, ứng dụng 5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA

BM CNSH TV – Khoa CNSH

PCR Polymerase Chain Reaction

Sự phát minh ra kỹ thuật PCR

• Kỹ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase được Kary Mullis phát minh vào năm 1983.

• Hai năm sau (1985), phát minh này được chính

thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế.

• Với công trình này, Kary Mullis được tặng giải

thưởng Nobel hóa học năm 1993.

“Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng được coi là một bước ngoặt hay một kỹ thuật mang tính cách mạng thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ sinh học hiện đại” (J. Watson)

Khái niệm

Kỹ thuật PCR là một phương pháp cho phép

nhân nhanh số lượng lớn một đoạn DNA

Phương pháp này có độ nhạy rất cao và ngày nay đã trở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong phần lớn các phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và DNA thuộc các lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi trường, y tế, dược phẩm, pháp y …

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

• Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để nhân bản một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide (primer) tương hợp với hai đầu 3’ ở hai mạch đơn của đoạn DNA.

Kỹ thuật này được phát minh nhờ sự phát hiện ra Taq polymerase, là một DNA polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng

Sự tái bản DNA trong cơ thể sống

Thành phần của PCR

• DNA khuôn: mang trình tự cần nhân

lên

(mồi xuôi và mồi ngược)

• 2 mồi tổng hợp oligonucleotide • dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP • Polymerase chịu nhiệt • Mg2+: cofactor của enzyme • Dung dịch đệm: ổn định pH và lực ion của dung dịch phản ứng cho phù hợp với hoạt động của enzyme

Các giai đoạn trong phản ứng PCR

Có 3 giai đoạn chính trong một phản ứng PCR và chúng được lặp lại từ 20-40 lần. Việc này được tự động hóa nhờ Thermo cycler, là thiết bị có khả năng tăng và giảm nhiệt độ của ống phản ứng trong thời gian ngắn.

1. Biến tính (denaturation): hai sợi của chuỗi xoắn kép được duỗi xoắn và tách nhau rnhờ nhiệt cao (94-95oC). 2. Gắn mồi (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng được giảm xuống (55-50oC) để các mồi gắn vào các sợi DNA tương ứng theo nguyên tắc bổ sung của các base. 3. Kéo dài (extension): Phản ứng trùng hợp phân tử DNA được thực hiện nhờ enzyme DNA polymerase (65- 75oC) để kéo dài mạch tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn từ đầu 3’ – 5.

Chu kỳ phản ứng PCR

B¾t ®Çu chu kú míi (2)

Hçn hîp ph¶n øng PCR

Nh¾c ®i nh¾c l¹i n chu kú

G§ 1

) C o (

é ® t Ö i h N

G§ 3

G§ 2

Chu kỳ nhiệt: Bước 1: 94o C, 30 giây Bước 2: 94o C, 15 giây Bước 3: 55o C, 30 giây Bước 4: 72o C, 1.5 phút Bước 5: lặp lại từ bước 2-4 trong 35 lần Bước 6: 72o C, 10 min Bước 7: 4o C f- bảo quản Bước 8: Kết thúc

Thêi gian (phót)

Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước được lặp đi lặp lại nhiều lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu được hàng triệu bản copy của một đoạn DNA nào đó, đủ cho các mục đích thí nghiệm khác nhau

Thực hiện phản ứng

THERMOCYCLER

ống phản ứng PCR

Biến t ính

Gắn mồi

K éo dài

Số bản copy DNA và số chu kỳ nhiệt

(2n - 2n)x

n = số chu kỳ x = số bản sao của DNA khuôn

A N D y p o c n ả b ố S

Số chu kỳ

1 0

2 0

3 2

4

Khuôn DNA được biến đổi thành 2 sợi đơn (94oC, 5 phút

5 8

6 16

7

32

8 64

9 128

10 256

11 512

Gắn mồi vào chuỗi DNA (30-65oC) 30 giây

12 1024

13 2048

14 4096

15 8192

16 16.384

Chu trình PCR

17 32.768

18

65.536

19 131.072

20 265.144

21 524.288

Tách thành sợi đơn DNA (94oC, 30 giây)

Tổng hợp chuỗi mới (65-75oC, 2-5 phút)

22 1.048.576

23 2.097.152

24 4.194.304

25 8.388.608

26

16.777.216

27 33.544.432

PCR animation

Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

 Ảnh hưởng của thành phần phản ứng

 Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

 Ảnh hưởng của thiết bị và dụng cụ thực hiện PCR

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng

• DNA khuôn • Mồi • Enzyme • dNTPs • Mg2+

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của DNA khuôn

 Độ tinh sạch của DNA khuôn Không cần tinh sạch lắm Cần tránh các chất gây ức chế phản ứng

 Hàm lượng sử dụng: 0.1 – 1 mg cho 100 mL phản

ứng Hàm lượng ít: không đủ cho phản ứng khuếch đại Hàm lượng cao: sản phẩm không đặc hiệu

 Độ dài của trình tự mục tiêu: quá dài có thể dẫn đến

sai sót, hoặc không thực hiện được phản ứng

 Hàm lượng GC của DNA khuôn: liên quan đến sự

hình thành cấu trúc thứ cấp

https://www.soils.org/publications/cs/articles/46/3/1064

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi

• Đặc điểm của mồi • Nồng độ mồi • Độ tinh sạch

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi

 Đặc trưng của mồi

 Đặc điểm của mồi thiết kế

 Tính đặc hiệu: Dặc hiệu cho trình tự mục tiêu cần nhân (tránh lai không đặc hiệu)

 Độ dài mồi  Hàm lượng GC  Nhiệt độ tách chuỗi (Tm)  Nhiệt độ gắn mồi  Chuỗi GC đầu 3’  Cấu trúc thứ cấp

 Tính

 Tính ổn định: Hình thành dạng sợi đôi bền vững với DNA khuôn trong PCR tương

 Cấu trúc kẹp tóc  Tự mồi  Tự mồi chéo

thích:Mồi được dùng như một cặp nên cần hoạt động được trong cùng điều kiện PCR

 Các chuỗi lặp  Độ ổn định đầu 3’  Vùng thiết kế mồi của khuôn

http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html

Công thức tính Tm của mồi:

Đối với mồi  20bazơ thì nhiệt độ gắn mồi Tm = [2 x (tổng số A + T) + 4 x (tổng số G + C)]0C VD: CAGCAAATATCTGTCCTTAC ==> Tm = 2x12+4 x 8

= 560C

Đối với mồi  20 - 35bazơ thì nhiệt độ gắn mồi



Tm = 22 + 1,46 [2 (tổng số G+C) + (tổng số A + T)]0C

Đối với mồi  35 – 70 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi



Tm = 81,5 + 16,6lgC+ + 0,41 (%tổng số G+C) - 600/L  C: nồng độ cation hoá trị một (Na+) tính theo M, L: chiều

dài mồi.

 Cần xác định Tm lý thuyết rồi thử nghiệm tìm Tm tối ưu. *Các mồi có kích thước ít khác nhau, có Tm gần giống nhau  tăng hiệu quả của PCR

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi

Độ dài mồi:

Mồi thường có kích thước 18-25 nts. Kích thước quá ngắn  không đặc hiệu Kích thước quá dài  giảm hiệu quả lai

Nhiệt độ gắn mồi (Tm)

Tm quá cao  mồi khó gắn vào khuôn Tm quá thấp  mồi bám không đặc hiệu Tm của mồi xuôi và mồi ngược nên tương đương Cần xác định Ta lý thuyết, sau đó chạy PCR với gradient nhiệt độ để tìm nhiệt độ gắn mồi tối ưu

Ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi đến kết quả PCR

http://www.qiagen.com/products/pcr/taqsystem/taqpcrcore.aspx#Tabs=t1

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi

 Hàm lượng GC:

 Nên nằm trong khoảng 40-60%  Không nên chứa polyG hoặc polyC  sự bắt cặp không đặc

hiệu của mồi.  Chuỗi GC đầu 3’:

 Đầu tận cùng 3’ nên là G hoặc C hoặc GC hoặc CG.  tăng khả năng bắt cặp chính xác (liên kết H của G và C lớn hơn)  Đầu tận cùng 3’ không nên có nhiều hơn 2 gốc liên tục G/C

 Độ ổn định đầu 3’ (khoảng 5nts đầu 3’)

 Không nên chứa toàn gốc G hoặc C vì giá trị DG cao   bắt cặp không đặc hiệu.  Nếu đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A  khó bắt cặp

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi

• Cấu trúc thứ cấp: mồi có cấu trúc thứ cấp  PCR

giảm hiệu quả, thậm chí không có sản phẩm

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi

• Các chuỗi lặp

– Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (VD: TATATATA) hoặc chuỗi lặp đơn (VD: TTTT)  tránh hiện tượng bắt cặp nhầm. – Trong một mồi, chỉ nên có tối đa 4 chuỗi lặp.

• Vùng thiết kế mồi của khuôn

– Vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa nhiều cấu trúc thứ cấp. Cấu trúc này mà ổn định ở nhiệt độ gắn mồi  mồi không bắt cặp được

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi

 Nồng độ mồi

 Nồng độ mồi quá thấp  khả năng gắn mồi vào khuôn không hiệu quả  ít hoặc không có sản phẩm.

 Nồng độ mồi quá cao  mồi bắt cặp không

đặc hiệu  sản phẩm không đặc hiệu.  Nồng độ mồi thường sử dụng 0.2 – 1 mM

 Độ tinh sạch

 Dung dịch mồi cần tránh có chứa các chất ức

chế PCR và các DNA tạp nhiễm khác.

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của enzyme DNA polymearase

• Loại enzyme: có nhiều loại enzyme DNA polymerase, tùy thuộc vào mục đích và điều kiện nghiên cứu mà lựa chọn các loại enzyme phù hợp • Nồng độ enzyme:

– Nồng độ quá thấp  lượng sản phẩm ít – Nống độ quá cao  sản phẩm không đặc hiệu – Thường sử dụng 1-2 đơn vị enzyme cho thể tích

phản ứng 25 mL

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của dNTPs, Mg2+

 dNTPs

 Nồng độ của mỗi loại dNTP trong hỗn hợp phản ứng

thường dùng là 200 mM.

 Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP có thể

làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.

 Mg2+

 Lượng Mg2+ quá ít  sản phẩm ít hoặc không có sản

phẩm.

 Lượng Mg2+ quá nhiều  sản phẩm không đặc hiệu,

tăng lỗi sao chép của DNA polymerase.

 Nồng độ thường sử dụng: 2mM (có thể thay đổi trong

khoảng 1-4 mM)

Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ đến kết quả PCR

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

 Số lượng chu kỳ phản ứng  Giai đoạn biến tính  Nhiệt độ biến tính  Thời gian biến tính  Giai đoạn gắn mồi  Nhiệt độ gắn mồi  Thời gian gắn mồi  Giai đoạn kéo dài

 Nhiệt độ phản ứng kéo dài mạch  Thời gian phản ứng kéo dài mạch

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng Ảnh hưởng của số lượng chu kỳ phản ứng

 Số lượng chu kỳ phản ứng phụ thuộc vào:

 Lượng DNA khuôn mẫu  Lượng sản phẩm mong muốn

 Trong thực tế thường không vượt quá 40 chu kỳ

cho một phản ứng PCR vì:  Trong giai đoạn đầu, số lượng bản sao sẽ tăng theo

cấp số nhân.

 Giai đoạn sau, hiệu quả khuếch đại giảm do:  Sự phân hủy và cạn kiệt thành phần phản ứng

 Sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng

 Các bản sao không bắt cặp với mồi mà bắt cặp với nhau

 …

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn biến tính

• Nhiệt độ biến tính:

– Nhiệt độ quá thấp  phân tử DNA không biến tính

hoàn toàn  hiệu quả khuếch đại thấp.

– Nhiệt độ quá cao  phân tử DNA bị phân hủy, DNA polymerase bị mất hoạt tính  phản ứng không đặc hiệu hoặc không xảy ra.

– Nhiệt độ biến tính thường sử dụng: 94 – 95oC

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn biến tính

• Thời gian biến tính:

– Thời gian quá ngắn  phân tử DNA không được

biến tính hoàn toàn  hiệu quả khuếch đại thấp.

– Thời gian quá dài  phân tử DNA bị phân hủy, DNA polymerase bị mất hoạt tính  phản ứng không đặc hiệu hoặc không xảy ra.

– Thời gian biến tính thường sử dụng: • Giai đoạn biến tính ban đầu: 3-5 phút

• Giai đoạn biến tính trong từng chu kỳ: 30-45 giây

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn gắn mồi

• Nhiệt độ gắn mồi

– Nhiệt độ quá thấp  mồi bám không đặc hiệu  sản

phẩm không đặc hiệu.

– Nhiệt độ quá cao  mồi khó bắt cặp với DNA khuôn

 sản phẩm ít, hoặc không có sản phẩm.

– Nhiệt độ gắn mồi sử dụng thường thấp hơn Tm của

mồi.

– Để tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, thường thiết lập phản ứng PCR theo thang nhiệt độ (các phản ứng chỉ khác nhau ở nhiệt độ gắn mồi).

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn gắn mồi

• Thời gian gắn mồi

– Thời gian quá ngắn  mồi không đủ thời gian gắn

vào khuôn

– Thời gian quá dài  tăng bắt cặp không chính xác – Thời gian gắn mồi thường sử dụng là 30 giây.

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn kéo dài

• Nhiệt độ phản ứng kéo dài

– Phụ thuộc vào loại enzyme và kích thước sản phẩm.

VD: khi sử dụng Taq DNA polymerase

• Đối với sản phẩm có kích thước <2kb  thường dùng

70-75oC (thường dùng 72oC)

• Đối với sản phẩm có kích thước >6 kb  thường dùng

68oC để tránh enzyme bị biến tính.

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn kéo dài

• Thời gian kéo dài

– Thời gian quá ngắn  trình tự mục tiêu nhân lên

không hoàn chỉnh

– Thời gian kéo dài mạch quá dài  tạo thành sản

phẩm không đặc hiệu

– Tùy vào kích thước sản phẩm mong muốn và loại enzyme sử dụng mà thiết lập thời gian kéo dài mạch phù hợp. VD: đối với enzyme Taq DNA polymerase thời gian kéo dài thường sử dụng là 1 phút/1kb

1 0

2 0

3 2

4

Khuôn DNA được biến tính thành 2 sợi đơn (94oC, 5 phút)

5 8

6 16

7

32

8 64

9 128

10 256

11 512

12 1024

13 2048

Gắn mồi vào chuỗi DNA (30-65oC) 30 giây

14 4096

15 8192

16 16.384

17 32.768

18

65.536 Chu trình PCR

19 131.072

20 265.144

21 524.288

22 1.048.576

Tách thành sợi đơn DNA (94oC, 30 giây)

Tổng hợp chuỗi mới (65-75oC, 2-5 phút)

23 2.097.152

24 4.194.304

25 8.388.608

26

16.777.216

27 33.544.432

Ảnh hưởng của thiết bị và dụng cụ thực hiện PCR

• Thiết bị tiến hành PCR cần đáp ứng được yêu

cầu thay đổi nhiệt độ nhanh và chính xác.

• Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm riêng nên mọi thí nghiệm trong cùng một nghiên cứu cần tiến hành trên cùng một loại thiết bị.

• Mọi dụng cụ, hóa chất sử dụng cho PCR cần phải

sạch, tránh tạp nhiễm.

Bài tập

• Nêu nguyên nhân và biện pháp khắc phục

cho các trường hợp sau:

1 2

Trường hợp không thấy tín hiệu vạch hoặc tín hiệu thấp

Trường hợp sản phẩm không đặc hiệu

1: không có vạch 2: vạch mờ

Trường hợp tạo ra các vệt tín hiệu

a: Xuất hiện vết chất có khối lượng phân tử nhỏ b: Xuất hiện vệt chất có khối lượng phân tử lớn

Các ứng dụng chủ yếu của PCR

• Sử dụng PCR để tách dòng các đoạn DNA • Chẩn đoán nhanh, nhạy các bệnh di truyền và nhiễm trùng (ung thư,

virus, vi khuẩn, nấm…)

• Giúp xác định giới tính của động vật và người ở giai đoạn phôi thai sớm qua phát hiện các đoạn gene đặc trưng của nhiễm sắc thể giới tính.

• Là kỹ thuật nền cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử quan trọng: xác định trình tự gene, xác định tính đa hình DNA, làm cơ sở cho việc phân tích các chỉ thị phân tử phục vụ công tác giống (cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật…), phát hiện các kiểu đột biến.

• Giúp xác định nguồn gốc hài cốt liệt sĩ vô danh, xác định nhanh với độ chính xác cao các thủ phạm hình sự từ những dấu vết rất nhỏ: máu, nước dãi, sợi tóc…

• Khôi phục các gen của nhiều loài sinh vật tồn tại cách đây hàng chục

triệu năm.