Bài giảng Công nghệ sinh học: Công nghệ DNA tổ hợp

3/3/2015

Lịch sử hình thành

• 1972 – 1973: DNA tái tổ hợp in vitro từ 3 nguồn vật liệu di truyền khác nhau. (Berg, Boyer và Cohen) • 1973 – 1974: DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học (Cohen, Henlinski, Boyer).

Công nghệ DNA tái tổ hợp

Nguyễn Vũ Phong

Tên gọi: • Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology) • Kỹ thuật gene (Gene engineering) hay công nghệ gene (Genetic technology) • Thao tác gene (Gene manipulation) • Tạo dòng phân tử (Molecular cloning) • Kỹ thuật di truyền (Genetic engineering): thao tác với những phần lớn hơn của bộ gene.

QUY TRÌNH TIẾN HÀNH

1. Enzyme

1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn

Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ.

1.1. Enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease enzyme, RE) • Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế bào cho • Bước 2: Tách DNA plasmid và DNA tế bào cho

Restriction enzyme.swf

• Bước 3: Cắt DNA plasmid và DNA mục tiêu bằng 1 loại enzyme cắt giới hạn

• Bước 4: Trộn và nối 2 loại DNA bằng enzyme nối tạo DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh • Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (E. coli, nấm men) • Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng tế bào mang gene tái tổ hợp • Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra sản phẩm

1. Enzyme

Trình tự nhận biết: gồm 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom)

Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) .

1.2. Enzyme nối (Ligase) 1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE)

Khoảng 3000 RE với 230 trình tự nhận biết khác nhau.

EcoRI:

Escherichia coli R: dòng vi khuẩn I: thứ tự tìm ra (I: đầu tiên)

Hình thành cầu phosphodiester gắn các nucleotid kề cận hay chụm cầu với nhau

1 3/3/2015

1. Enzyme

1.3. Enzyme phiên mã ngược 1.4. Các enzyme khác (reverse transcriptase) • Enzyme Chức năng

DNaseI Phân hủy DNA mạch kép bằng phản ứng thủy phân nội liên kết phosphodiester (Endonuclease) Tổng hợp sợi DNA bổ sung (complementary c-DNA DNA) từ một sợi mRNA hoặc từ polyribonucleotide tổng hợp Nuclase BAL31 • Phân hủy 2 đầu mút 3’ và 5’ của DNA (Exon nuclease) S1 nuclease Cắt DNA mạch đơn nhờ

cDNA.swf

Đoạn Klenow c-DNA có thể tổng hợp thành c-DNA kép (c-DNA DNA duplex) polymerase. c-DNA kép được dùng trong việc tạo dòng c-DNA DNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease 3’-5’ Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus

2. Các vector chuyển gene

Yêu cầu tối thiểu đối với vector chuyển gene. Plasmid: - DNA vòng tròn - Có trình tự khởi đầu sao chép (ori) để tự sao chép mà tồn tại độc lập - Sao chép độc lập trong tế bào - Trình tự nhận biết cho RE tạo vết cắt để chèn gene lạ - Có khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành protein Vector: - Phân tử DNA có khả năng tự tái bản - Trình tự điều hòa (promoter) tạo điều kiện thuận lợi phiên mã gene lạ - Tồn tại độc lập trong tế bào - Đảm bảo sự di truyền bền vững - Mang được gene mong muốn của DNA tái tổ hợp - Có gene đánh dấu (marker) để dễ dàng nhận biết các gene lạ.

2. Các vector chuyển gene

Các loại vector chuyển gene Ứng dụng của vector chuyển gene

Vector

Đặc điểm

Ứng dụng

- Tạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA (nhiều bản sao)

Khả năng chèn

Plasmid

0,1 – 10kb

Procaryote

Dạng vòng

15 – 23 Kb

Phage λ

Lập ngân hàng gene

Tự động xâm nhiễm và sinh sản trong TB vi khuẩn

45kb

Cosmid

Lập thư viện gene

Plasmid + đoạn cos của phage λ

DNA mạch đơn

Phage M13

Xác định trình tự nu Sản xuất mẫu dò Gây đột biến điểm định hướng

BAC

50 – 300kb

NST nhân tạo vi khuẩn

YAC

100-2000kb

Vòng tròn 2 micrometre cải tiến

MAC

>2000kb

NST nhân tạo động vật có vú

- Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn DNA - Chuyển gene - Sản xuất RNA - Sản xuất protein từ gene được tạo dòng. Hệ thống vector chuyển gen được hoàn thiện không ngừng.

2 3/3/2015

2. Các vector chuyển gene

3. Hệ thống tế bào chủ (Host)

Plasmid Ti - 200Kb - Agrobacterium tumefaciens - Chuyển gen ở thực vật - Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào Mục đích: - Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng. - Biểu hiện gene, đặc biệt ở Eukaryote - Sản xuất protein tái tổ hợp.

3. Hệ thống tế bào chủ (Host)

3.1. Escherichia coli (E.coli) 3.3. Hệ thống tế bào thực vật - Dễ nuôi cấy và nhân dòng 3.4. Hệ thống tế bào động vật - Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau. - Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) - Vi khuẩn Gram-, hình que, - Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney) - Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base - Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney - Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary) 3.2. Saccharomyces cerevisiae - Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người - Eukaryote đơn bào - Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans - Dễ dàng nuôi cấy và thu sinh khối - Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh - Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có đủ hoạt tính sinh học. - Sản xuất protein tái tổ hợp dễ dàng - Sinh vật an toàn

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

1. Lai nucleic acid

2. Thu nhận gene

Đặc tính biến tính và hồi tính có thể lai giữa DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA

- Thu nhận DNA từ bộ gene

toàn bộ * Shotgun: DNA của sinh vật được cắt đoạn nhỏ bằng cơ học hay RE và gắn vào vector tạo dòng

Southern Blot.swf

* Ngân hàng/thư viện bộ gene DNA (Bank/Library of genomic DNA)

3 3/3/2015

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

2. Thu nhận gene

- - Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học Lập ngân hàng c-DNA

* Tạo gene từ các mRNA thông tin nhờ enzyme phiên mã ngược Ưu điểm

- Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (không chứa đoạn intron)

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

3. Tạo plasmid tái tổ hợp a)

3. Tạo plasmid tái tổ hợp a) b)

Dùng đầu so le Dùng đầu so le Dùng các đoạn nối (linkers)

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào a) Hóa biến nạp

3. Tạo plasmid tái tổ hợp a) b) c)

Dùng đầu so le Dùng các đoạn nối (linkers) Dùng enzyme terminal transferase

4 3/3/2015

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào c) Vi tiêm

4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào b) Điện biến nạp

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

Tạo cây chuyển gene

4. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào d) Bắn gene

Cell’s DNA DNA coated golden particles

Plant cell Gene gun

A plant cell with the new gene Cell division Transgenic plant

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp

5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene b) Sự biểu hiện của gene thành protein

Screening.swf

5 3/3/2015

Polymerase Chain Reaction, PCR

Phản ứng tạo chuỗi nucleotide (Polymerase Chain Reaction, PCR)

PCR dựa trên 3 bước ở nhiệt độ khác nhau.

1. Biến tính: tạo dây đơn DNA với nhiệt độ 94 oC 2. Bắt cặp: lai giữa primers và DNA đơn. Nhiệt độ khoảng 50 oC 3. Kéo dài : tạo dây DNA bổ sung với tác động của polymerase và

dNTPs: 72 oC.

Lặp lại chu kỳ khoảng 30-40 lần sẽ tạo ra số lượng DNA cần

khuếch đại đủ quan sát trên gel qua quá trình điện di

PCR.swf

1985, Kary Mullis 1. Nguyên tắc

2. Thành phần phản ứng - - - - - - Primer Polymerase chịu nhiệt dNTP Dung dịch đệm Mẫu Dung dịch đệm

Sequencing

1. Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert 1. 2. Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert Phương pháp didesoxy của F. Sanger

Ứng dụng công nghệ gene

2. Công nghệ protein tái tổ hợp - Sản xuất r-protein

Khai thác DNA các bộ gene

STT Sản phẩm

Các bệnh điều trị

Năm hết patent

1 Insulin

2001

Tiểu đường

Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúng Phát hiện, bảo tồn sự đa dạng sinh học, sử dụng chúng.

2 Interferon alpha

2002

Viêm gan siêu vi B, ung thư, ..

1. 1.1. Genomics: - - 1.2. Proteomics -

3 Interferon beta

2003

Xơ cứng

4 2003

Hormon tăng tưởng người

Thiểu năng tăng trưởng

Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến đổi (modification), sự tương tác (interactions), chức năng (function) Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh.

5 Erythropoetin

2004

Thiếu máu

6 2005

Nhồi máu cơ tim

T-PA (tissu plasminogen activator)

7 2006

G-CSF (granulocyte – COLONY Stimulating Factor

Chemotherapy-induced neutropenia

- 1.3. Human Genome Projet 1.4. Các ngành học khác - - - Cellomics Metabolomics Ionomics

6 3/3/2015

Ứng dụng công nghệ gene

4. Vi sinh vật chuyển gene 3. Chẩn đoán phân tử - Genomics vi sinh vật: giải trình tự hơn 200 loài vsv. - Dựa trên phương pháp lai DNA: đặc hiệu, nhạy, chính xác, đơn giản - Sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp. - - Công nghệ bề mặt tế bào nấm men. DNA marker: chuỗi DNA dùng để phân biệt giữa 2 cá thể, 2 dòng hoặc 2 giống khác nhau. - Biomarker: dấu chuẩn sinh học - DNA fingerprinting: dấu vân tay di truyền Microarray và Biochips: -

Ứng dụng công nghệ gene

5. Thực vật chuyển gene 6. Động vật chuyển gene - - Cải thiện giống cây trồng: kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh, Động vật mang gene người làm mô hình thí nghiệm (bệnh di truyền, ung thư,, thoái hóa cơ, viêm khớp,…) - Tạo giống chống chịu điều kiện khí hậu bất lợi, già hóa - Sản xuất protein tái tổ hợp - Tạo sắc tố ở các thực vật chuyển gene - Chăn nuôi gene (gene farming) - Biến đổi chất lượng thực phẩm cây trồng - Thực vật sản xuất vaccine, protein trị liệu - Sản xuất dầu nhờn công nghiệp - Sản xuất plastid