Bài giảng Điều hòa hoạt động gen vi khuẩn - TS. Nguyễn Trọng Hiệp

TS. Nguyễn trọng Hiệp

Muïc tieâu

- Toùm löôïc caùc phöông thöùc ñieàu hoøa hoaït ñoäng gen ôû

nhaân nguyeân thuûy

- Moâ taû söï ñieàu hoøa cô cheá teá baøo cuûa vi khuaån ñeå ñaùp

öùng vôùi caùc thay ñoåi trong moâi tröôøng soáng

- Giaûi thích ñöôïc caùch thöùc töông taùc giöõa caùc protein

11

vaø caùc trình töï ADN ñaëc bieät vaø caùc phaân töû khaùc trong

quaù trình ñieàu hoøa hoaït ñoäng gen

Môû ñaàu

• Ñieàu hoøa hoaït ñoäng gen: bieåu hieän baèng söï ñieàu hoøa trao

ñoåi chaát bao goàm 2 höôùng:

(cid:1) Ñieàu khieån toác ñoä cuûa caùc quaù trình sinh hoùa baèng caùch thay ñoåi thuaän nghòch löôïng caùc enzym xuùc taùc (chaát coù baûn chaát protein) tham gia vaøo caùc quaù trình(cid:2) ñieàu hoøa sinh toång hôïp protein noùi chung vaø enym noùi rieâng (cid:3)Thöôøng gaëp nhaát ôû TB nhaân nguyeân thuûy (Prokaryote) ví duï

22

vi khuaån (cid:1) Hoaëc laø ñieàu hoøa hoaït tính cuûa chuùng trong quùa trình thöïc hieän chöùc naêng(cid:2) taêng hoaëc giaûm hoïat tính. (cid:3)ÔÛ Teá baøo nhaân thaät (Eukaryote) goàm thöïc vaät, ñoäng vaät goàm

caû 2 höôùng treân

(cid:4)Trong ña soá caùc quaù trình sinh hoùa, caùc enzym laø nhöõng chaát xuùc taùc caùc quaù trình sinh hoïc

33

(cid:4)Quaù trình vaän chuyeån chuû ñoäng qua maøng sinh hoïc ñöôïc thöïc hieän bôûi protein nhöng chuùng ñoùng vai troø "nhaän bieát" söï vaän chuyeån (translocation) cô chaát nhö permease (di, tri, oligopeptid).

Enzym và họat hóa enzym

Môû ñaàu

Maøng ngoaøi

Periplasma

oppA

oppA

oppB

oppC

Maøng teá baøo chaát

oppD

oppF

Teá baøo chaát

ATP

ADP

44

Opp A,B,C,D: oligopeptid permease

Ñieàu hoøa quaù trình sao cheùp

55

(cid:5)Ở TB nhân nguyên thủy có các enzym DNA polymerase I, II, III, ligase chịu trách nhiệm sao chép DNA (cid:5)Ở TB nhân thật có 5 loại DNA polymerase được biết là α, β, γ, δ, và ε (cid:5)Ngoài ra, để lơi xoắn và tháo xoắn có enzym helicase và topoisomerase I, phục hồi dạng siêu xoắn có topoisomerase II (DNA-gyrase) (cid:5)Nhóm gen Dna mã hóa cho 1 protein cần thiết cho sao chép (ví dụ DnaA, DnaC ngòai ra còn có thể kể đến DnaB, DnaI, DnaP)các gen này chịu sự kiểm sóat Dương và Âm của các protein điều hòa

Ñieàu hoøa quaù trình sao cheùp

6

(cid:5)Kieåm soaùt döông: laø söï tích luõy chaát hoaït hoùa cho ñeán ngöôõng ñuû ñeå khôûi ñoäng moät chu trình sao cheùp môùi, caàn thieát cho söï caân baèng vôùi vieäc nhaân ñoâi cuûa sinh khoái teá baøo. (cid:5)Kieåm soaùt aâm: khi chaát kieàm haõm caàn ñöôïc toång hôïp moät caùch giôùi haïn tieáp ngay khi baét ñaàu chu trình sao cheùp tröôùc (vì coù theå laø saûn phaåm cuûa gen ñieàu hoøa naèm gaàn vò trí baét ñaàu sao cheùp(cid:2)phieân maõ theo söï sao cheùp)

Khaùi nieäm ñieàu hoøa quaù trình phieân maõ

Kieåm soùat caûm öùng, döông

Cô cheá kieåm soùat döông (positive control): kích thích sự phiên mã gene trong Operon

Protein activator Kieåm soùat öùc cheá, döông

cheá

Kieåm soùat caûm öùng, aâm

Cô cheá kieåm soùat aâm (negative control): öùc sự phiên mã gene trong Operon

Kieåm soùat öùc chế, aâm

77

Protein repressor

Ñieàu hoøa quaù trình phieân maõ

(cid:5)Operon laø ñôn vò phieân maõ bao goàm toái thieåu laø vuøng khôûi ñoäng (promoter) vaø caùc gen maõ hoùa mARN cho moät hay

moät vaøi chuoãi polypeptid vaø terminator

(cid:3)Moät operon coù theå chöùa moät hay nhieàu vò trí ñieàu hoøa (operator) hôn so vôùi soá promoter.

Prokaryote

88

Eukaryote

3'

5'

Promoter

Operator

Gene 1

Gene 2

Gene 3

ARN polymerase

ARN polymerase

6.3. Ñieàu hoøa quaù trình phieân maõ

Repressor

Vò trí khôûi ñaàu toång hôïp mARN

3' Vuøng-35

Vuøng-10

5’

TTGACA TTTTACCTCTGGCGGT TATAAT GGTTGC ATGTA

(hoäp Pribnow)

Promoter

mARN

Operator

operator cuûa λ - phage phuû leân moät vuøng cuûa promoter

99

Repressor: protein öùc cheá

6.3.1. Kieåm soaùt caûm öùng, aâm

Lac Operon

1010

lacZ và lacY có vai trò cần thiết cho việc chuyển hóa

Gồm promoter, operator, gen cấu trúc, terminator. Gen cấu trúc gồm: lacZ, lacY, và lacA. •lacZ: gen mã hóa enzym β-galactosidase, một enzym nội bào chức năng chính là thủy phân disaccharide lactose (cid:2) glucose+ galactose. Chức năng phụ là biến lactose(cid:2)allolactose. •lacY: gen mã hóa β-galactoside permease, một protein chuyên chở đóng vai trò bơm lactose qua màng tế bào. •lacA: gen mã hóa β-galactoside transacetylase, một enzym gắn nhóm acetyl từ acetyl-CoA vào β-galactosides. Chỉ lactose.

L actose op e ron

V ò trí g aén C A P -c A M P

V ò trí g aén R N A p o ly m e r ase O pe ra to r lo c u s (lac O )

G e n e s c aáu tru ùc

L o c u s ñ ie àu h o øa c u ûa lac o p e ro n

Các yếu tố chính kiểm sóat Lac Operon

G enes

i

la c z

la c y

la c a

P i

L a c pro m o t e r (lac p )

m R N A s

là

Gaén vaøo lac O

Không có chất cảm ứng

Pe rm e ase

P r oteins

(cid:5)Lactose cấu trúc galactose-(β1->4)- glucose, dễ chuyển thành Allolactose là galactose- (β1->6)-glucose.

Repressor

T ran s- ac e ty lase

Gaén vaøo Allolactose

e s a d i s o t c a l a g - β

Inactive repressor

?

Allolactose (chaát caûm öùng)

Glucose vaø Galactose

M aøn g teá b aøo

Quá cảm ứng được kích ứng dây chuyền

1111

Lactose

6.3.1. Kieåm soaùt caûm öùng, aâm

Quaù trình caûm öùng enzym trong Kieåm soaùt caûm öùng, aâm

3'

5'

Promoter

Operator

Gene 1

Gene 2

Gene 3

Repressor

ARN polymerase

Söï phieân maõ bò phong beá

3'

5'

Promoter

Gene 1

Gene 2

Gene 3

Operator Repressor

ARN polymerase

mARN

mARN

mARN Söï phieân maõ (cid:2)(cid:2)(cid:2)(cid:2) tieán-haønh

Induce

1212

1313

Caûm öùng söï toång hôïp enzym trên Lac operon

Allolactose

Những chất cảm ứng mạnh Lac operon

• Chủ yếu là có cấu trúc tương đồng với Lactose (Lactose

analogues)

(cid:5) Allolactose: isomer của lactose, cảm ứng Lac operon. Lactose cấu trúc là galactose-(β1->4)-glucose, trong khi đó allolactose là galactose-(β1->6)-glucose. Lactose có thể được đổi sang allolactose dưới tác động của β- galactosidase.

(cid:5) IPTG:Isopropyl-β-D-thio-galactoside gắn vào repressor và bất họat chất này nhưng IPTG không phải là cơ chất của β-galactosidase.

(cid:5) X-gal: (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) là cơ chất của β-galactosidase nhưng không bất họat repressor và sẽ chuyển màu xanh

(cid:3)Hỗn hợp 2 chất trên cảm ứng mạnh Lac operon hàng

ngàn lần và khóm vi khuẩn sản xuất β-galactosidase sẽ có màu xanh. 1414

Cấu trúc những chất cảm ứng mạnh Lac operon

1515

Regulator genes

Tryptophan

Dö thöøa Trôû neân chaát ñoàng öùc cheá (corepressor)

Aporepressor ÖÙc cheá goác

Repressor

Caùc enzyme

Caùc gene

Caùc chaát chuyeån hoùa gồm 5 bước

g5

6.3.2. Kieåm soaùt öùc cheá, aâm: Tryp Operon điều hòa sinh tổng hợp acid amin Tryptophan

X

e5

5

g4

X

e4

4

e1(cid:2)(cid:2)(cid:2)(cid:2)e3

g1 → g3

1

1616

X

Thieáu Tryptophan

Dö thöøa Tryptophan

= Co-repressor

17

6.3.2. Minh họa kieåm soaùt öùc cheá, aâm: Tryp Operon

Arginine dö thöøa

1818

Kieåm soùat öùc cheá aâm tương tự (Vd öùÙc cheá söï toång hôïp acid amin arginine)

Ñoaïn che phuû

Promoter

Söï phaân boá gen cuûa tryptophan operon

3'

5'

ADN

Leader sequence Gen1 Gen2 Gen3 Gen4 Gen5

Operator

6.3.3. Đieàu hoøa suy giaûm

1919

Vuøng daãn

Saép xeáp caùc vuøng nucleotid trong trình töï daãn

2 codon maõ hoùa cho Tryptophan (UGG-UGG)

Phaàn maõ hoùa 7-uracyl

3'

B

C

D

A XX

Tryp operon

Code for ribosome binding site

Transcription pause site

Attenuator

Terminator sequence

trình töï daãn Leader sequence

2020

6.3.2. Ñieàu hoøa suy giaûm

6.3.2. Ñieàu hoøa suy giaûm

UGA (codon stop

2 codon maõ hoùa cho Tryptophan (UGG-UGG)

Saép xeáp caùc vuøng nucleotid trong trình töï daãn

Vùng A

Vùng B

21

Vùng C

Vùng D

5’

3’

Trp. operon

ARN polymerase

ADN coù nghóa

Ribosome

Peptid

5’

N R A m

6.3.3. Cô cheá ñieàu hoøa suy giaûm

2222

Söï chuyeån dòch cuûa ribosom treân mARN

ù

5’

(b)

H ö ô n g

Trình töï daãn

Dö Tryptophan: ngöng phieân maõ

N D A

p h i eâ n m a õ

5’

N D A

(a)

G e n e

B

C

ù

D

5’

A

7u

Khi gặp codon stop cuối vùng A, ribosom tách ra C

mARN

ARN polymerase

D

Höôùng dòch maõ

c aá u t r u c t r y p t o p h 5’ a n

A B

mARN

3’

Thieáu Tryptophan: tieáp tuïc phieân maõ

3’

6.3.3. Cô cheá ñieàu hoøa suy giaûm

Peptid dẫn ngăn vùng B nối với vùng C(cid:2)(cid:2)(cid:2)(cid:2)C bắt cặp với D

Phieân maõ ngöøng

23 23

Moâ hình phieân maõ suy giaûm cuûa operon tryptophan E. coli

Dö Tryptophan: ngöng phieân maõ

Thieáu Tryptophan: tieáp tuïc phieân maõ

2424

Ñieàu hoøa suy giaûm

Vùng dẫn của cơ chế điều hòa suy giảm trên quá trình sinh tổng hợp một số acid amin

25

6.3.4. Kieåm soaùt caûm öùng döông Ara Operon: vừa kiểm sóat cảm ứng, dương và âm

cAMP-CAP

A

D

I

araA

araB

araD

araC

B P

O

Initiator

Ngöng phieân maõKieåm soùat aâm

C

O Thieáu arabinose thì Crep gaén vaøo Operator(cid:2)(cid:2)(cid:2)(cid:2) daïng loop

Crep: Protein ñieàu hoøa (regulator) ARN polymerase C rep

cAMP-CAP

araA

araB

araD

araC

P

O Initiator

Caûm öùng phieân maõKieåm soùat döông

mARN

C rep

ARN polymerase

Kinase

Iso merase

Epimerase

C rep

Coù arabinose vaø khoâng coù glucose

26

araC araB araA araD P

2727

Các sản phẩm chuyển hóa của Ara Operon

Ara Operon

Substrate

Protein(s)

Function

Product

Reversi ble

L-arabinose

AraA

isomerase

yes

L-ribulose

L-ribulose-

L-ribulose

AraB

ribulokinase

no

phosphate

L-ribulose-

D-xylulose-

AraD

epimerase

yes

phosphate

phosphate

2828

Kieåm soaùt caûm öùng döông trong chuyeån hoùa ñöôøng Maltose

Khoâng coù söï phieân maõ

RNA polymerase vaø activator protein ôû traïng thaùi töï do

Kích hoïatù söï phieân maõ

RNA polymerase vaø activator protein ôû traïng thaùi keát hôïp döôùi taùc duïng chaát caûm öùng

2929

3030

Vai trò chung của caûm öùng söï toång hôïp enzym

3.5. Ña kieåm soaùt (cid:5)Khi có mặt glucose thì vi khuẩn E. coli không cần thiết phải phân giải một loại đường nào khác, và các gen mã hóa cho các enzym phân giải các đường ấy cũng đóng lại. (cid:5)Hiệu ứng glucose (glucose effect): không có glucose nhưng có lactose (cid:2) lac operon được cảm ứng. Nếu có glucose thì sự cảm ứng của lac operon sẽ không xảy ra (tương tự như ở ara operon). (cid:5)Hiện tượng này là ức chế dị hóa (catabolite repression)

Sugar(s) in Growth Medium

3131

glucose glucose + lactose lactose Relative Amount of ββββ- galactosidase 1 50 2500

Lactose operon

Vò trí gaén CAP-cAMP

Vò trí gaén RNA polymerase

Phöùc hôïp cAMP-Catabolite Activator Protein hoã trôï vieäc gaén RNA polymerase

Operato r locus (lac O) Genes caáu truùc

Locus ñieàu hoøa cuûa lac operon

Genes

i

lac z

lac y

lac a

Pi

Lac promo ter (lac p)

Khi coù Glucose seõ ít coù cAMP(cid:2) ít phöùc hôïp cAMP-CAP

mRNAs

Khoâng coù chaát caûm öùng

Permease

Proteins

Repressor

Tr ans- acetylase

e s a d i s o t c a l a g - β

Inactive repressor

?

RNA polymerase khoâng gaén ñöôïc nhieàu(cid:2)(cid:2)(cid:2)(cid:2) Lac operon seõ ít ñöôïc hoïat hoùa

Maøng teá baøo

3232 CAP gắn vào Lac promoter

3.5. Ña kieåm soaùt

Minh họa họat động của Lac operon dưới tác động Lactose và Glucose

3333

Xem D:\regulation\Lac-Operon.avi

6.4. Kieåm soaùt sau dòch maõ

Isoleucin gắn vào vị trí điều hòa của e1(cid:2)(cid:2)(cid:2)(cid:2)thay đổi cấu trúc bậc 3, bậc 4(cid:2)(cid:2)(cid:2)(cid:2)bất họat vị trí xúc tác

1 = threonin

2 = α-ketobutyrate

e2

Söï dö thöøa gaây kieàm haõm ngöôïc

g1

g2

3

Teá baøo söû duïng

g5

g3

e3

isoleucine e5

g4

5

4

e4

34 34

X e1 = threonin deaminase

Sô ñoà kìm haõm ngöôïc vòeâc toång hôïp Isoleucine ôû E. coli

3535

Kìm haõm ngöôïc vòeâc toång hôïp Isoleucine ôû E. coli