Bài giảng định lượng protein và đánh giá độ tinh sạch chế phẩm protein

ĐĐịịnh lưnh lượợng vng vàà đ đáánh gi

tinh nh giáá đ độộ tinh m protein ssạạch cch củủa cha chếế phphẩẩm protein

CCáác phương ph

c phương phááp xp xáác đc địịnh nh

ng protein hhààm lưm lượợng protein

ch chiếết vt vàà llààm sm sạạch cch cóó

ng đượợc. Nc. Nếếu protein nghiên c

u protein nghiên cứứu lu làà ng thông qua xáác đc địịnh nh

quy ướớc quc quốốc tc tếế: : 1 1 đơn v đơn vịị hohoạạt đt độộ enzyme l enzyme làà

ng enzyme lààm chuy m chuyểển hon hoáá 1 1 mol cơ ch mol cơ chấất t

Protein sau khi đã đượợc tc táách chi Protein sau khi đã đư ththểể đ địịnh lưnh lượợng đư enzyme thìì viviệệc đc địịnh lưnh lượợng thông qua x enzyme th hohoạạt đt độộ ccủủa enzyme a enzyme (theo quy ư (theo lưlượợng enzyme l trong 1 phúút t ởở ccáác đic điềều kiu kiệện tiêu chu trong 1 ph n tiêu chuẩẩnn). ).

CCáác phương ph

c phương phááp xp xáác đc địịnh nh

ng protein hhààm lưm lượợng protein

sau cáác bưc bướớc tc táách chi i ta thấấy ty tổổng lưng lượợng protein gi ch chiếết vt vàà llààm sm sạạch ch ng protein giảảm m

riêng enzyme tăng nghĩĩa la làà hohoạạt đt độộ riêng

ch chiếết t

c coi làà ssạạch nch nếếu nhu nhữững bư không lààm tăng

ng bướớc tc táách chi riêng củủa a m tăng hohoạạt đt độộ riêng c nh việệc c khi đóó ta mta mớới hoi hoààn thn thàành vi

Như vNhư vậậy cy cứứ sau c protein ngườời ta th protein ngư nhưng hoạạt đt độộ enzyme tăng ngh nhưng ho t cao. tăng rấất cao. tăng r Protein đượợc coi l Protein đư ch sau không l vvàà llààm sm sạạch sau chchúúng nng nữữa, va, vàà chchỉỉ khi đ ttáách chi ch protein ch chiếết vt vàà llààm sm sạạch protein

CCáác phương ph

c phương phááp xp xáác đc địịnh nh

ng protein hhààm lưm lượợng protein

enzyme thìì ta cta cóó ththểể đ địịnh nh

u protein không phảải li làà enzyme th c phương phááp khp kháác. c. ng chúúng bng bằằng cng cáác phương ph u protein ta nghiên cứứu lu làà hormon ho

ng đượợc xc xáác đc địịnh qua hi nh qua hiệệu u ứứng sinh h hormon hoặặc cc cáác đc độộc tc tốố ng sinh họọc mc màà

ng gây ra; víí ddụụ như hormon sinh trư

ch thíích sch sựự sinh trư ng (growth như hormon sinh trưởởng (growth sinh trưởởng cng củủa ca cáác tc tếế bbàào o

NNếếu protein không ph lưlượợng ch NNếếu protein ta nghiên c ththìì chchúúng đư chchúúng gây ra; v hormone) sẽẽ kkíích th hormone) s ch nuôi cấấy. y. đđíích nuôi c NNếếu lu làà protein v thông qua nồồng đng độộ chchấất mt màà chchúúng vng vậận chuy thông qua n

protein vậận chuy n chuyểển thn thìì ccóó ththểể xxáác đc địịnh ch nh chúúng ng

n chuyểển n

ng nitrogen theo ĐĐịịnh lưnh lượợng nitrogen theo p Kjeldahl phương phááp Kjeldahl phương ph

nh protein c phương phááp gip giáán tin tiếếp xp xáác đc địịnh protein

ng nitrogen. a trên cơ sởở xxáác đc địịnh lưnh lượợng nitrogen.

trong cáác protein l ng nitrogen cóó trong c c protein làà ggầần gin giốống ng

PhPhầần ln lớớn cn cáác phương ph đđềều du dựựa trên cơ s LưLượợng nitrogen c nhau không phụụ thuthuộộc vc vàào cho chấất lưt lượợng vng vàà ngunguồồn n nhau không ph Đương nhiên trên cơ sởở lư lượợng nitrogen c protein. Đương nhiên trên cơ s protein. nh chỉỉ ccáác protein đã đư xxáác đc địịnh ch protein củủa ca cáác mc mẫẫu nghiên c protein c không chứứa nha nhữững ch không ch

c protein đã đượợc tinh s c tinh sạạch ho

ng nitrogen cóó ththểể ch hoặặc lưc lượợng ng u nghiên cứứu mu màà ngongoàài protein ra i protein ra a nitrogen kháác. c. ng chấất cht chứứa nitrogen kh

ng nitrogen theo ĐĐịịnh lưnh lượợng nitrogen theo p Kjeldahl phương phááp Kjeldahl phương ph

công nghiệệp thp thựực phc phẩẩm, m,

nhân ng nitrogen toààn phn phầần vn vàà kkếết qut quảả nhân

coi protein luôn luôn chứứa a

Trong nông nghiệệp vp vàà công nghi Trong nông nghi protein thô đượợc đc địịnh lưnh lượợng bng bằằng cng cáách xch xáác c protein thô đư đđịịnh lưnh lượợng nitrogen to vvớới i 6,256,25, , nghnghĩĩa la làà coi protein luôn luôn ch 16% nitrgen. 16% nitrgen.

ng nitrogen theo ĐĐịịnh lưnh lượợng nitrogen theo p Kjeldahl phương phááp Kjeldahl phương ph

nh protein m, bên cạạnh protein

nhưng ởở protein th p hơn 16%. H

ThThựực tc tếế, trong th , trong thựực phc phẩẩm, bên c u cơ kháác cc cóó chchứứa a ng chấất ht hữữu cơ kh còn cóó nhnhữững ch còn c , alcaloid, ammonia (víí ddụụ nitrogen như amid, alcaloid, ammonia (v nitrogen như amid acid nitric... do ... do m lên men) acid nitric như trong thựực phc phẩẩm lên men) như trong th nh thứức c ng nitrogen toààn phn phầần chn chíính th đđóó hhààm lưm lượợng nitrogen to protein thựực c 17%) nhưng 16% (16--17%) cao hơn 16% (16 cao hơn vvậật tht thìì hhààm lưm lượợng nng nàày ly lạại thi thấấp hơn 16%. Hệệ ssốố 6,25 làà hhệệ ssốố trung b 6,25 l

nh thô. trung bìình thô.

ng nitrogen theo ĐĐịịnh lưnh lượợng nitrogen theo p Kjeldahl phương phááp Kjeldahl phương ph

vô cơ hoáá a phương phááp np nàày ly làà vô cơ ho

ch acid cóó nnồồng đng độộ xxáác đc địịnh. Snh. Sau au

o dung dịịch acid c

ng kiềềm cm cóó nnồồng đng độộ xxáác đc địịnh đnh đểể chuchuẩẩn đn độộ

ng nitrogen cóó nh đượợc lưc lượợng nitrogen c

Nguyên lý củủa phương ph Nguyên lý c mmẫẫu bu bằằng Hng H22SOSO44 đ đậậm đm đặặc vc vàà chchấất xt xúúc tc táác. c. nh (NaOH hoặặc KOH) t kiềềm mm mạạnh (NaOH ho DDùùng mng mộột ki c KOH) đ đẩẩy y NHNH33 ttừừ mumuốối (NHi (NH44))22SOSO44. S. Sau đau đóó hhứứng NH ng NH33 vvàào dung d đđóó ddùùng ki acid dư. T. Từừ đ đóó ttíính đư acid dư trong nguyên liệệu u trong nguyên li

ng protein theo ĐĐịịnh lưnh lượợng protein theo p Lowry phương phááp Lowry phương ph

protein. Phứức mc mààu xanh t

n protein (thông thư

t thanh bò) ta cóó ththểể ttíính đư nh đượợc hc hààm lưm lượợng ng

a trên cơ sởở ddùùng mng mááy đo my đo mààu đu đểể Phương phááp np nàày dy dựựa trên cơ s Phương ph a phosphomolipden -- n phẩẩm khm khửử ccủủa phosphomolipden xxáác đc địịnh mnh mààu su sảản ph Ciocalteau) ) Folin -- Ciocalteau phosphowolframate (thuthuốốc thc thửử Folin phosphowolframate ( u xanh tạạo tho thàành nh vvớới phi phứức hc hợợp đp đồồng ng -- protein. Ph 5nm. CưCườờng đng độộ mmààu cu củủa ha hỗỗn n ng 675nm. đo ởở bư bướớc sc sóóng 67 ccóó ththểể đo hhợợp php phảản n ứứng tng tỷỷ llệệ thuthuậận vn vớới ni nồồng đng độộ protein. D protein. Dựựa va vàào o ng tinh thểể thông thườờng dng dùùng tinh th đđồồ ththịị chuchuẩẩn protein ( albumin huyếết thanh bò) ta c albumin huy protein trong mẫẫu nghiên c protein trong m u nghiên cứứu.u.

ng protein theo ĐĐịịnh lưnh lượợng protein theo p Lowry phương phááp Lowry phương ph

ng rãi đểể xxáác đc địịnh nhi

Phương phááp np nàày cy cóó đ độộ nhnhạạy cao, cho ph

c protein trong dung dịịch ch ởở nnồồng đng độộ 1

p Lowry đượợc dc dùùng rng rộộng rãi đ c nhau. Phương ph t hiệện đưn đượợc protein trong dung d

nh nhiềều lou loạại i y cao, cho phéép p g/ml. Tuy Tuy 1 g/ml. i protein. c nhiềều vu vàào loo loạại protein.

u còn tuỳỳ thuthuộộc nhi

, dung dịịch trypsin cho cư

ch trypsin cho cườờng đng độộ mmààu u

n gelatin, hemoglobin cho cư

p hơn hemoglobin cho cườờng đng độộ mmààu thu thấấp hơn

i ra, nhiềều chu chấất kht kháác cc cóó ththểể llààm tăng hay gi

y phương phááp np nàày cho k

ng, vìì vvậậy phương ph

m tăng hay giảảm cưm cườờng đng độộ mmààu u c khi xáác c y cho kếết qut quảả chchíính xnh xáác khi x

Phương phááp Lowry đư Phương ph protein kháác nhau. protein kh phpháát hi nhiên cườờng đng độộ mmààu còn tu nhiên cư VVíí ddụụ, , ởở ccùùng mng mộột nt nồồng đng độộ, dung d p 3 lầần gelatin, cao gấấp 3 l cao g trypsin nhưng cao hơn gelatin.. trypsin nhưng cao hơn gelatin NgoNgoàài ra, nhi phphảản n ứứng, v đđịịnh protein đã đư

nh protein đã đượợc tinh s

c tinh sạạch.ch.

1010

ĐĐịịnh lưnh lượợng protein b ng protein bằằng ng p quang phổổ phương phááp quang ph phương ph

p đơn giảản nhn nhấất đt đểể đo n

tia cựực tc tíím m

u protein tinh sạạch th

ch thìì nnồồng đng độộ tuytuyệệt đt đốối ci củủa a

đo đượợc. c.

nh theo giáá trtrịị đo đư u protein không tinh sạạch (v

c ký) thìì nnồồng đng độộ ccủủa protein t

ch (víí ddụụ, d, dịịch chi a protein tổổng đư

ch chiếết tt từừ ng đượợc c

1111

đo nồồng đng độộ Phương phááp đơn gi Phương ph protein trong dung dịịch lch làà đ độộ hhấấp thp thụụ tia c protein trong dung d ccủủa na nóó. . NNếếu protein tinh s nnóó đư đượợc tc tíính theo gi NNếếu protein không tinh s mmộột st sắắc ký) th ttíính tương đ

nh tương đốối ti từừ đ độộ hhấấp thp thụụ

ĐĐịịnh lưnh lượợng protein b ng protein bằằng ng p quang phổổ phương phááp quang ph phương ph

c protein a phương phááp np nàày ly làà ccáác protein

phenylalanine. . ĐĐộộ hhấấp p i protein nhưng hệệ nm thay đổổi tui tuỳỳ loloạại protein nhưng h c (nghĩĩa la làà đ độộ hhấấp thp thụụ ccủủa dung d

a dung dịịch ch n qua 1cm) cho ng truyềền qua 1cm) cho a protein i protein cho phéép tp tíính nnh nồồng đng độộ ccủủa protein

Nguyên tắắc cc củủa phương ph Nguyên t hhấấp thp thụụ tia c tia cựực tc tíím cm cựực đc đạại i ởở bư bướớc sc sóóng ng c acid amin thơm như 280nm do cáác acid amin thơm như 280nm do c tryptophan, tyrosine vàà phenylalanine tryptophan, tyrosine v 280nm thay đ ththụụ ởở 280 t đo đượợc (ngh ssốố ttắắt đo đư protein 1% vớới đưi đườờng sng sóóng truy protein 1% v mmỗỗi protein cho ph tinh sạạch. ch. tinh s

1212

ĐĐịịnh lưnh lượợng protein b ng protein bằằng ng p quang phổổ phương phááp quang ph phương ph

c protein hoặặc vc vớới bi bấất ct cứứ mmộột t không biếết ht hệệ ssốố ttắắt tht thìì nnồồng ng

VVớới mi mộột ht hỗỗn hn hợợp cp cáác protein ho loai protein nàào mo màà không bi loai protein n nh như sau:: protein đượợc tc tíính như sau đđộộ protein đư 0,77xA260 (mg/ml)=1,55xA280--0,77xA260 protein (mg/ml)=1,55xA280 NNồồng đng độộ protein ng 280nm0nm Trong đóó: A: A280: 280: đ độộ hhấấp thp thụụ ởở bư bướớc sc sóóng 28 Trong đ ng 260nm A260: đ độộ hhấấp thp thụụ ởở bư bướớc sc sóóng 260nm A260:

1313

protein thấấp hơn không dùùngng đư đượợc cho c p hơn 0,1mg/ml 0,1mg/ml hohoặặc khi c

ch truyềền phn phùù chchứứ không ph , trong mààng ho

p hơn 0,60,6 nghnghĩĩa la làà dung d

ng phương phááp Lowry đ nên sửử ddụụng phương ph p Lowry đểể đo n

ĐĐịịnh lưnh lượợng protein b ng protein bằằng ng p quang phổổ phương phááp quang ph phương ph c dung dịịch ch c cho cáác dung d Phương phááp np nàày y không d Phương ph c khi cóó mmặặt t ccóó nnồồng đng độộ protein th nhinhiềều chu chấất kht kháác mc màà hhấấp thp thụụ ccùùng mng mộột vt vùùng cng cựực tc tíím (vm (víí c khi o), hoặặc khi m, acid nucleic vàà mmộột st sốố chchấất bt bééo), ho ddụụ, , đđệệm, acid nucleic v trong dịịch truy i trong không phảải trong protein ởở trong d protein ng hoặặc cc cáác phc phứức hc hợợp cp cóó ch. (Víí ddụụ, trong m dung dịịch. (V dung d ng phân tửử llớớn). Cn). Cũũng cng cầần chn chúú ý lý làà nnếếu tu tỷỷ llệệ trtrọọng lư ng lượợng phân t ch protein dung dịịch protein A280/A260 thấấp hơn A280/A260 th ch, bịị llẫẫn cn cáác chc chấất kht kháác,c, đ đặặc bic biệệt vt vớới acid nucleic i acid nucleic chưa sạạch, b chưa s ng độộ đo nồồng đ ththìì nên s protein. protein.

1414

ĐĐáánh gi

a protein nh giáá ttíính đnh đồồng thng thểể ccủủa protein

t protein enzyme ởở trtrạạng th

tinh khiếết hay t i ta phảải thi thửử llạại mi mứức đc độộ tinh khi

m tra bằằng mng mộột st sốố phương ph

ng nguyên lý kháác nhau. Trong m

p protein enzyme đượợc coi l

i phương phááp khp kháác nhau đ

hưng lạại ci cóó ththểể phân chia th ng phương phááp đip điệện di trên gel. Ch ng nhiềều lou loạại phương ph ch củủa protein m a protein màà kkếết qut quảả đ đềều cho l

1515

ng tháái ki kếết t t hay tíính nh ng thểể ccủủa cha chếế phphẩẩm protein m protein phương phááp p c nhau. Trong mộột st sốố ng thểể khi ly khi ly c coi làà đ đồồng th isoenzyme phân chia thàành mnh mộột st sốố isoenzyme n di trên gel. Chíính vnh vìì vvậậy, ny, nếếu u m tra độộ c nhau đểể kikiểểm tra đ ng thểể ththìì u cho làà đ đồồng th t. Nhữững ng tinh khiếết. Nh hay dùùng lng làà xây xây m tra tíính đnh đồồng th

Khi đã nhậận đưn đượợc mc mộột protein enzyme Khi đã nh tinh, ngưgườời ta ph tinh, n ng thểể ccủủa na nóó. . ĐĐộộ đ đồồng th đđồồng th c kiểểm tra b enzyme phảải đưi đượợc ki enzyme ph a trên nhữững nguyên lý kh ddựựa trên nh trưtrườờng hng hợợp protein enzyme đư tâm, nhưng l tâm, n bbằằng phương ph ddùùng nhi ssạạch c protein đóó ccóó ththểể đư đượợc công nh protein đ phương phááp đp đểể kikiểểm tra t phương ph ddựựng đng đồồ ththịị vvềề đ độộ hohoàà tan tan, , điđiệện di v c công nhậận ln làà tinh khi ng thểể hay d siêu ly tâm. n di vàà siêu ly tâm.